JP2002516384A - ポリヒドロキシアルカノエートバイオポリマー組成物 - Google Patents
ポリヒドロキシアルカノエートバイオポリマー組成物Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
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- C08G63/06—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from hydroxycarboxylic acids
-
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- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
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Abstract
(57)【要約】
生物学的系を使用して生成されたいくつかの新規なＰＨＡポリマー組成物としては、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシプロピオネート、２−ヒドロキシブチラート、３−ヒドロキシバレレート、４−ヒドロキシブチラート、４−ヒドロキシバレレート、および５−ヒドロキシバレレートのようなモノマーが挙げられる。これらのＰＨＡ組成物は、例えば、３−ヒドロキシヘキサノエート、４−ヒドロキシヘキサノエート、６−ヒドロキシヘキサノエート、または７以上の炭素を含む、他のより長鎖の３−ヒドロキシ酸を含むさらなるモノマーを組込むように容易に伸長され得る。これは、天然のＰＨＡ生成者を取得し、そして化学的変異またはトランスポゾン変異を介して変異を与え、所望しない活性をコードする遺伝子を欠失または不活性化することによって達成され得る。あるいは、その株は、所望のポリマー組成物の生成に必要とされるこれらの酵素のみを発現するよう遺伝子操作され得る。ＰＨＡ生成微生物を遺伝子操作するための方法は、当該分野で広く公知である（ＨｕｉｓｍａｎおよびＭａｄｉｓｏｎ，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３）。これらのポリマーは、医用領域、産業領域および他の商業的領域において種々の使用を有する。
Description
【０００１】 （発明の背景） 本出願は、米国特許出願第６０／０８６，３９６号（１９９８年５月２２日出
願）に対する優先権を主張する。
願）に対する優先権を主張する。
【０００２】 多くの微生物が、ＰＨＡポリマーの細胞内貯蔵を蓄積する能力を有する。ポリ
［（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノエート］（ＰＨＡ）は、再生可能な供給源か
ら生成される、生分解性かつ生体適合性熱可塑性材料であり、広範な産業上の適
用および生体医学適用を有する（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９
９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６、３８−４４）。文献（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ
およびＶａｌｅｎｔｉｎ，１９９５，ＦＥＭＳ Ｍｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．
１２８；２１９−２２８）で報告されるように、約１００の異なるモノマーが、
ＰＨＡポリマーに組込まれ、そしてそれらの代謝の生物学および遺伝学が、最近
総説されている（ＨｕｉｓｍａｎおよびＭａｄｉｓｏｎ，１９９８，Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ
ｓ，６３：２１−５３）。
［（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノエート］（ＰＨＡ）は、再生可能な供給源か
ら生成される、生分解性かつ生体適合性熱可塑性材料であり、広範な産業上の適
用および生体医学適用を有する（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ，１９
９６，ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６、３８−４４）。文献（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ
およびＶａｌｅｎｔｉｎ，１９９５，ＦＥＭＳ Ｍｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．
１２８；２１９−２２８）で報告されるように、約１００の異なるモノマーが、
ＰＨＡポリマーに組込まれ、そしてそれらの代謝の生物学および遺伝学が、最近
総説されている（ＨｕｉｓｍａｎおよびＭａｄｉｓｏｎ，１９９８，Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ
ｓ，６３：２１−５３）。
【０００３】 今日まで、ＰＨＡは、開発量で利用可能である、コポリマーであるポリ（２−
ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢＶ）のみに、
限定された商業的利用能が見い出されてきた。このコポリマーは、細菌Ｒａｌｓ
ｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａの発酵によって生成されてきた。他のＰＨＡ型に
ついての発酵および回収工程もまた、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅならび
に遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａを含む範囲の細菌
を利用して開発され、そして最近総説されている（Ｂｒａｕｎｅｇｇら、１９９
８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６５：１２７−１６
１；ＣｈｏｉおよびＬｅｅ，１９９９．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．５１：１３−２１）。より伝統的なポリマー合成アプローチも
また試験されており、これらには、対応するラクトンの直接縮合および開環重合
が挙げられる（ＪｅｓｕｄａｓｏｎおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ、１９９４
、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２７：２５９５−２６０２）。
ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢＶ）のみに、
限定された商業的利用能が見い出されてきた。このコポリマーは、細菌Ｒａｌｓ
ｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａの発酵によって生成されてきた。他のＰＨＡ型に
ついての発酵および回収工程もまた、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅならび
に遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａを含む範囲の細菌
を利用して開発され、そして最近総説されている（Ｂｒａｕｎｅｇｇら、１９９
８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６５：１２７−１６
１；ＣｈｏｉおよびＬｅｅ，１９９９．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．５１：１３−２１）。より伝統的なポリマー合成アプローチも
また試験されており、これらには、対応するラクトンの直接縮合および開環重合
が挙げられる（ＪｅｓｕｄａｓｏｎおよびＭａｒｃｈｅｓｓａｕｌｔ、１９９４
、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２７：２５９５−２６０２）。
【０００４】 モノマー４−ヒドロキシブチレートを含むＰＨＡポリマー（ＰＨＢ４ＨＢ、Ｄ
ｏｉ，Ｙ．１９９５，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８，５８５−５９９）ま
たは４−ヒドロキシバレレートおよび４−ヒドロキシヘキサノエート含有ＰＨＡ
ポリエステルの合成は記載されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２、Ａｐｐ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，５０７−５１４、なら
びにＶａｌｅｎｔｉｎら、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．４０，７１０−７１６）。これらのポリエステルは、ＰＨＢＶに
ついて元来記載された方法に類似する方法を使用して製造され、この方法は、微
生物にモノマーのＰＨＡポリマー内への組み込みを強制するように、比較的広範
な非炭水化物供給源を摂食させる。ＰＨＢ４ＨＢコポリマーは、再度広範なポリ
マーを提供する広範なモノマー組成物を用いて生成される（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．Ｎ
ａｋａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｈｉｒａｍｉｔｓｕ，Ｍ．およびＤｏｉ，Ｙ．，１９９
６，Ｐｏｌｙｍ．Ｉｎｔ．３９：１６９）。
ｏｉ，Ｙ．１９９５，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８，５８５−５９９）ま
たは４−ヒドロキシバレレートおよび４−ヒドロキシヘキサノエート含有ＰＨＡ
ポリエステルの合成は記載されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２、Ａｐｐ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，５０７−５１４、なら
びにＶａｌｅｎｔｉｎら、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．４０，７１０−７１６）。これらのポリエステルは、ＰＨＢＶに
ついて元来記載された方法に類似する方法を使用して製造され、この方法は、微
生物にモノマーのＰＨＡポリマー内への組み込みを強制するように、比較的広範
な非炭水化物供給源を摂食させる。ＰＨＢ４ＨＢコポリマーは、再度広範なポリ
マーを提供する広範なモノマー組成物を用いて生成される（Ｓａｉｔｏ，Ｙ．Ｎ
ａｋａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｈｉｒａｍｉｔｓｕ，Ｍ．およびＤｏｉ，Ｙ．，１９９
６，Ｐｏｌｙｍ．Ｉｎｔ．３９：１６９）。
【０００５】 ３−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシプロピオネートのＰＨＡコポ
リマーもまた、記載されている（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、１９９４、Ｍａｃｒｏ
ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２７：４４２９−４４３５；Ｃａｏら、１９９７、Ｍａｃ
ｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９８：３５３９−３５５７）。高レベルの
３−ヒドロキシプロピオネートは、これらのコポリマーに８８モル％で組み込ま
れる（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、１９９４、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２７
：４４２９−４４３５）。
リマーもまた、記載されている（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、１９９４、Ｍａｃｒｏ
ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２７：４４２９−４４３５；Ｃａｏら、１９９７、Ｍａｃ
ｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９８：３５３９−３５５７）。高レベルの
３−ヒドロキシプロピオネートは、これらのコポリマーに８８モル％で組み込ま
れる（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、１９９４、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２７
：４４２９−４４３５）。
【０００６】 ４−ヒドロキシバレレートを含むＰＨＡターポリマーは、４−ヒドロキシバレ
レートまたはレブリン酸上で遺伝子操作したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉ
ｄａ株を摂食させ、この株に３成分のＰＨＡ、ポリ（３−ヒドロキシブチレート
−コ−３−ヒドロキシバレレート−４−ヒドロキシバレレート）が生じることに
よって生成されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−５１４；Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈ
ｅｌおよびＧｒｅｎｆｌｏ，１９９７，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．１２３：
６１−６６）。４−ヒドロキシバレレートを含む２成分のポリマーまたはポリ（
４−ヒドロキシバレレート）のホモポリマーを生成するために生物学的系を開発
することが望ましい。ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＧｏｒｅｎｆｌｏ（１９９
７、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．１２３：６１−６６）の結果は、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａがレブリン酸を４−ヒドロキシバレレートへ変換す
る能力を有することを示す。
レートまたはレブリン酸上で遺伝子操作したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉ
ｄａ株を摂食させ、この株に３成分のＰＨＡ、ポリ（３−ヒドロキシブチレート
−コ−３−ヒドロキシバレレート−４−ヒドロキシバレレート）が生じることに
よって生成されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎら、１９９２、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：５０７−５１４；Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈ
ｅｌおよびＧｒｅｎｆｌｏ，１９９７，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．１２３：
６１−６６）。４−ヒドロキシバレレートを含む２成分のポリマーまたはポリ（
４−ヒドロキシバレレート）のホモポリマーを生成するために生物学的系を開発
することが望ましい。ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌおよびＧｏｒｅｎｆｌｏ（１９９
７、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．１２３：６１−６６）の結果は、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａがレブリン酸を４−ヒドロキシバレレートへ変換す
る能力を有することを示す。
【０００７】 Ｈｅｉｎら（１９９７）は、トランスジェニックＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを使用してポリ−４ＨＶを合成することを試みたが、
成功しなかった。これらの細胞は、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＡシンターゼ
およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉの４−ヒドロキシブチリル−
ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするプラスミドを保持した。こ
のトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉに４ＨＶ、□−バレロラクトン（□−ｖａｌ
ｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、またはレブリン酸を摂食させた場合、これらは、少量
のＰＨＢホモポリマーのみを生成した。
ｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを使用してポリ−４ＨＶを合成することを試みたが、
成功しなかった。これらの細胞は、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＡシンターゼ
およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉの４−ヒドロキシブチリル−
ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするプラスミドを保持した。こ
のトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉに４ＨＶ、□−バレロラクトン（□−ｖａｌ
ｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、またはレブリン酸を摂食させた場合、これらは、少量
のＰＨＢホモポリマーのみを生成した。
【０００８】 産業上の理由のために、ある範囲の定義されたＰＨＡホモポリマー、コポリマ
ーおよびターポリマー組成物を生成することが可能であることが明らかに望まし
い。このことを達成するために、個々の酵素の対応するＰＨＡ生合成経路の利用
能を制御することが可能であることが望ましい。
ーおよびターポリマー組成物を生成することが可能であることが明らかに望まし
い。このことを達成するために、個々の酵素の対応するＰＨＡ生合成経路の利用
能を制御することが可能であることが望ましい。
【０００９】 従って、ある範囲の定義されたＰＨＡホモポリマー、コポリマーおよびターポ
リマー組成物を提供することが本発明の目的である。
リマー組成物を提供することが本発明の目的である。
【００１０】 個々の酵素の対応するＰＨＡ生合成経路の利用能を制御するための方法および
材料を提供することは、本発明の別の目的である。
材料を提供することは、本発明の別の目的である。
【００１１】 （発明の要旨） 生物学的系を使用して生成されたいくつかの新規なＰＨＡポリマー組成物とし
ては、３−ヒドロキシブチレート（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、３−ヒ
ドロキシプロピオネート（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、２−ヒドロ
キシブチレート、３−ヒドロキシバレレート（ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ
）、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、および５−ヒドロ
キシバレレートのようなモノマーが挙げられる。これらのＰＨＡ組成物は、例え
ば、３−ヒドロキシヘキサノエート（ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ）、４
−ヒドロキシヘキサノエート、６−ヒドロキシヘキサノエート、または７以上の
炭素を含む、他のより長鎖の３−ヒドロキシ酸を含むさらなるモノマーを組込む
ように容易に伸長され得る。これは、天然のＰＨＡ生成者を取得し、そして化学
的変異またはトランスポゾン変異を介して変異を与え、所望しない活性をコード
する遺伝子を欠失または不活性化することによって達成され得る。あるいは、そ
の株は、所望のポリマー組成物の生成に必要とされるこれらの酵素のみを発現す
るよう遺伝子操作され得る。ＰＨＡ生成微生物を遺伝子操作するための方法は、
当該分野で広く公知である（ＨｕｉｓｍａｎおよびＭａｄｉｓｏｎ，１９９８，
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒ
ｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３）。これらのポリマーは、医用領域、産業領域
および他の商業的領域において種々の使用を有する。
ては、３−ヒドロキシブチレート（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、３−ヒ
ドロキシプロピオネート（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、２−ヒドロ
キシブチレート、３−ヒドロキシバレレート（ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ
）、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、および５−ヒドロ
キシバレレートのようなモノマーが挙げられる。これらのＰＨＡ組成物は、例え
ば、３−ヒドロキシヘキサノエート（ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏａｔｅ）、４
−ヒドロキシヘキサノエート、６−ヒドロキシヘキサノエート、または７以上の
炭素を含む、他のより長鎖の３−ヒドロキシ酸を含むさらなるモノマーを組込む
ように容易に伸長され得る。これは、天然のＰＨＡ生成者を取得し、そして化学
的変異またはトランスポゾン変異を介して変異を与え、所望しない活性をコード
する遺伝子を欠失または不活性化することによって達成され得る。あるいは、そ
の株は、所望のポリマー組成物の生成に必要とされるこれらの酵素のみを発現す
るよう遺伝子操作され得る。ＰＨＡ生成微生物を遺伝子操作するための方法は、
当該分野で広く公知である（ＨｕｉｓｍａｎおよびＭａｄｉｓｏｎ，１９９８，
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒ
ｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３）。これらのポリマーは、医用領域、産業領域
および他の商業的領域において種々の使用を有する。
【００１２】 （発明の詳細な説明） いくつかの新規なＰＨＡポリマー組成物が、３−ヒドロキシブチレート、３−
ヒドロキシプロピオネート、２−ヒドロキシブチラート、３−ヒドロキシバレレ
ート、４−ヒドロキシブチラート、４−ヒドロキシバレレート、および５−ヒド
ロキシバレレートのようなモノマーを組込むように、生物学的系を使用して生成
されている。これらのＰＨＡ組成物は、例えば、３−ヒドロキシヘキサノエート
、４−ヒドロキシヘキサノエート、６−ヒドロキシヘキサノエート、または７以
上の炭素を含む、他のより長鎖の３−ヒドロキシ酸を含むさらなるモノマーを組
込むように容易に伸長され得る。単一の構成物かまたはコモノマーのいずれかと
してこれらのモノマーの１以上を含むＰＨＡを合成するトランスジェニック生物
体を操作するための技術および手順が開発されている。これらの系において、こ
のトランスジェニック生物体は、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（正
式には、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ｌａｔｕｓ、またはＰＨＡを合成し得る他の微生物）、あるいは高等植物
または植物の構成要素（例えば、油料穀物（Ｂｒａｓｓｉｃａ、ヒマワリ、ダイ
ズ、コーン、ベニバナ、アマ、ヤシまたはココナッツ）あるいはデンプン蓄積植
物（ジャガイモ、タピオカ、カサバ）の種子）のいずれかである。
ヒドロキシプロピオネート、２−ヒドロキシブチラート、３−ヒドロキシバレレ
ート、４−ヒドロキシブチラート、４−ヒドロキシバレレート、および５−ヒド
ロキシバレレートのようなモノマーを組込むように、生物学的系を使用して生成
されている。これらのＰＨＡ組成物は、例えば、３−ヒドロキシヘキサノエート
、４−ヒドロキシヘキサノエート、６−ヒドロキシヘキサノエート、または７以
上の炭素を含む、他のより長鎖の３−ヒドロキシ酸を含むさらなるモノマーを組
込むように容易に伸長され得る。単一の構成物かまたはコモノマーのいずれかと
してこれらのモノマーの１以上を含むＰＨＡを合成するトランスジェニック生物
体を操作するための技術および手順が開発されている。これらの系において、こ
のトランスジェニック生物体は、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（正
式には、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ｌａｔｕｓ、またはＰＨＡを合成し得る他の微生物）、あるいは高等植物
または植物の構成要素（例えば、油料穀物（Ｂｒａｓｓｉｃａ、ヒマワリ、ダイ
ズ、コーン、ベニバナ、アマ、ヤシまたはココナッツ）あるいはデンプン蓄積植
物（ジャガイモ、タピオカ、カサバ）の種子）のいずれかである。
【００１３】 組換えＥ．ｃｏｌｉ株における効果的なＰＨＡ合成のために、この経路に関与
する全ての遺伝子の発現が十分であることが重要である。この目的のために、目
的の遺伝子は、染色体外ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）から発現され得、こ
の染色体外ＤＮＡ分子は、コピー数の効果およびその結果の高い発現レベルを内
因的に生じるか、または、より好ましくは、目的の遺伝子は、染色体から発現さ
れ得る。汎用型産物の大規模の発酵については、プラスミドベースの系が、プラ
スミドの維持の過負荷および安定的な発現の問題に起因して十分なものでないこ
とが、一般的に公知である。これらの欠点は、発現が十分かつ安定であるように
、目的の遺伝子に先行する転写シグナルおよび翻訳シグナルを改善することによ
って染色体にコードされる酵素を使用して克服され得る。
する全ての遺伝子の発現が十分であることが重要である。この目的のために、目
的の遺伝子は、染色体外ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）から発現され得、こ
の染色体外ＤＮＡ分子は、コピー数の効果およびその結果の高い発現レベルを内
因的に生じるか、または、より好ましくは、目的の遺伝子は、染色体から発現さ
れ得る。汎用型産物の大規模の発酵については、プラスミドベースの系が、プラ
スミドの維持の過負荷および安定的な発現の問題に起因して十分なものでないこ
とが、一般的に公知である。これらの欠点は、発現が十分かつ安定であるように
、目的の遺伝子に先行する転写シグナルおよび翻訳シグナルを改善することによ
って染色体にコードされる酵素を使用して克服され得る。
【００１４】 生物学的系は、モノマーをポリマーに変換するために、必要な場合１以上の酵
素を発現しなければならない。適切な基質としては、３−ヒドロキシブチラート
、３−ヒドロキシプロピオネート、２−ヒドロキシブチラート、３−ヒドロキシ
バレレート、４−ヒドロキシブチラート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒド
ロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、４−ヒドロキシヘキサノエ
ート、６−ヒドロキシヘキサノエート、および７以上の炭素を含む、他のより長
鎖の３−ヒドロキシ酸が挙げられる。これらの酵素としては、ポリヒドロキシア
ルカノエートシンターゼ、アシルＣｏＡトランスフェラーゼおよびヒドロキシア
シルＣｏＡトランスフェラーゼ、ならびにヒドロキシアシルＣｏＡシンターゼが
挙げられる。これらの酵素は、生物学的系（例えば、細菌、酵母、真菌または植
物）においてポリマー（例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−４−ヒ
ドロキシバレレート）、ポリ（４−ヒドロキシバレレート）、ポリ（３−ヒドロ
キシプロピオネート−コ−５−ヒドロキシバレレート）、ポリ（２−ヒドロキシ
ブチレート）、ポリ（２−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシブチレー
ト）、およびポリ（３−ヒドロキシプロピオネート））を生成するために、これ
らの基質と共に使用され得る。
素を発現しなければならない。適切な基質としては、３−ヒドロキシブチラート
、３−ヒドロキシプロピオネート、２−ヒドロキシブチラート、３−ヒドロキシ
バレレート、４−ヒドロキシブチラート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒド
ロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、４−ヒドロキシヘキサノエ
ート、６−ヒドロキシヘキサノエート、および７以上の炭素を含む、他のより長
鎖の３−ヒドロキシ酸が挙げられる。これらの酵素としては、ポリヒドロキシア
ルカノエートシンターゼ、アシルＣｏＡトランスフェラーゼおよびヒドロキシア
シルＣｏＡトランスフェラーゼ、ならびにヒドロキシアシルＣｏＡシンターゼが
挙げられる。これらの酵素は、生物学的系（例えば、細菌、酵母、真菌または植
物）においてポリマー（例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−コ−４−ヒ
ドロキシバレレート）、ポリ（４−ヒドロキシバレレート）、ポリ（３−ヒドロ
キシプロピオネート−コ−５−ヒドロキシバレレート）、ポリ（２−ヒドロキシ
ブチレート）、ポリ（２−ヒドロキシブチレート−コ−３−ヒドロキシブチレー
ト）、およびポリ（３−ヒドロキシプロピオネート））を生成するために、これ
らの基質と共に使用され得る。
【００１５】 必要とされる酵素をコードする遺伝子は、複数の供給源から獲得され得る。Ｐ
ｅｏｐｌｅｓらに対する、米国特許第５，７９８，２３５号および同第５，５３
４，４３２号は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、レダクターゼおよ
びチオラーゼを記載する。Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来の４−ヒドロ
キシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼが、ＷｉｌｌａｄｓｅｎおよびＢｕｃｋ
ｅｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）７０：１８７−
１９２に記載されるか、またはＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチ
リルＣｏＡトランスフェラーゼが、ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ
，１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，８７１−８８０に記載される。
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来のアシル補酵素Ａシンターゼは、Ｈｉ
ｉおよびＣｏｕｒｔｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８２．１５０（
２），９８１−９８３に記載される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ由来のヒドロキシ
アシルトランスフェラーゼは、ＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒおよびＢｕｃｋｅｒ，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２，２０６（２）、５４７−５５２によって記
載される。
ｅｏｐｌｅｓらに対する、米国特許第５，７９８，２３５号および同第５，５３
４，４３２号は、ポリヒドロキシアルカノエートシンターゼ、レダクターゼおよ
びチオラーゼを記載する。Ｃ．ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来の４−ヒドロ
キシブチリルＣｏＡトランスフェラーゼが、ＷｉｌｌａｄｓｅｎおよびＢｕｃｋ
ｅｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）７０：１８７−
１９２に記載されるか、またはＣ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来の４−ヒドロキシブチ
リルＣｏＡトランスフェラーゼが、ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ
，１９９６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，８７１−８８０に記載される。
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来のアシル補酵素Ａシンターゼは、Ｈｉ
ｉおよびＣｏｕｒｔｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８２．１５０（
２），９８１−９８３に記載される。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ由来のヒドロキシ
アシルトランスフェラーゼは、ＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒおよびＢｕｃｋｅｒ，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２，２０６（２）、５４７−５５２によって記
載される。
【００１６】 効果的なＰＨＡ生成のために、種菌生育および生成過程の継続時間中にバイオ
ポリマーを合成する能力を損失しないことが重要である。任意のｐｈａ遺伝子の
損失は、産物の損失を生じる。両方が望ましくなく、従って、株の安定した増殖
が必要とされる。トランスフェラーゼまたはシンターゼをコードする遺伝子を単
に組込むことは、有意なポリマー生成を生じないかもしれない。酵素の発現は、
プロモーター領域の改変または変異あるいは他の公知の技術を経て増強され、そ
の後ポリマー生成についてスクリーニングされ得る。これらの組換えＰＨＡ生成
者の増殖および形態は、染色体上のｐｈａ遺伝子の存在によって解決されない。
ポリマーを合成する能力を損失しないことが重要である。任意のｐｈａ遺伝子の
損失は、産物の損失を生じる。両方が望ましくなく、従って、株の安定した増殖
が必要とされる。トランスフェラーゼまたはシンターゼをコードする遺伝子を単
に組込むことは、有意なポリマー生成を生じないかもしれない。酵素の発現は、
プロモーター領域の改変または変異あるいは他の公知の技術を経て増強され、そ
の後ポリマー生成についてスクリーニングされ得る。これらの組換えＰＨＡ生成
者の増殖および形態は、染色体上のｐｈａ遺伝子の存在によって解決されない。
【００１７】 本発明は、以下の制限されない実施例を参照することによってさらに理解され
る。
る。
【００１８】 （実施例１ Ｅ．ｃｏｌｉにおける４−ヒドロキシバレレートおよびグルコー
スからのポリ（３ＨＢ−コ−４ＨＶ）） （ｐＦＳ１６の構築） プラスミドｐＴｒｃＮは、ｐＴｒｃ９９ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｓａ
ｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の誘導体であり；ｐＴｒｃＮと区別するその改変は、Ｎｃ
ｏＩでの消化、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでの処理、および自己連結による、Ｎ
ｃｏＩ制限部位の除去である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来
の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードするｏｒｆＺ遺
伝子は、標的ＤＮＡとしてプラスミドｐＣＫ３（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔ
ｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０）お
よび以下のオリゴヌクレオチドプライマー： ５’−ＴＣＣＣＣＴＡＧＧＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＧＡＧＴＧＧ
ＧＡＡＧＡＧＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧ−３’ （ｏｒｆＺ ５’ ＡｖｒＩＩ） ５’−ＣＣＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＴＴＡ
ＡＡＴＴＣ−３’ （ｏｒｆＺ ３’ ＳａｌＩ） を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（
Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からのキットを使用して増幅した。
スからのポリ（３ＨＢ−コ−４ＨＶ）） （ｐＦＳ１６の構築） プラスミドｐＴｒｃＮは、ｐＴｒｃ９９ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｓａ
ｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の誘導体であり；ｐＴｒｃＮと区別するその改変は、Ｎｃ
ｏＩでの消化、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでの処理、および自己連結による、Ｎ
ｃｏＩ制限部位の除去である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来
の４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードするｏｒｆＺ遺
伝子は、標的ＤＮＡとしてプラスミドｐＣＫ３（ＳｏｈｌｉｎｇおよびＧｏｔｔ
ｓｃｈａｌｋ，１９９６，Ｊ．Ｂａｃｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０）お
よび以下のオリゴヌクレオチドプライマー： ５’−ＴＣＣＣＣＴＡＧＧＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＧＡＧＴＧＧ
ＧＡＡＧＡＧＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧ−３’ （ｏｒｆＺ ５’ ＡｖｒＩＩ） ５’−ＣＣＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＴＴＡ
ＡＡＴＴＣ−３’ （ｏｒｆＺ ３’ ＳａｌＩ） を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（
Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からのキットを使用して増幅した。
【００１９】 生じたＰＣＲ産物を、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼが
ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−グルコピラノシド）誘導性ｔｒｃプロモータ
ーから発現され得るように、ＡｖｒＩＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、そして
ＸｂａＩ（これらはＡｖｒＩＩに適合可能である）およびＳａｌＩで消化したｐ
ＴｒｃＮに連結し、プラスミドｐＦＳ１６を形成した。 （ｐＦＳ３０の構築） プラスミドｐＦＳ３０を、（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ３３：９３１１−９３２０）に記載されるような強力なＥ．ｃｏ
ｌｉリボソーム結合部位を付加することによって改変された、Ｒａｌｓｔｏｎｉ
ａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）遺伝子（Ｐｅｏｐｌｅｓ
およびＳｉｎｓｋｅｙ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９
８−１５３０３）を付加することによってｐＦＳ１６から誘導した。プラスミド
ｐＡｅＴ４１４を、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａプロモーターおよびｐｈａＣ構造遺伝
子が、１つのフラグメント上に存在するように、ＸｍａＩおよびＳｔｕＩで消化
した。ｐＦＳ１６をＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して
平滑末端を作製し、次いで、ＸｍａＩで切断した。従って、得られた２つのＤＮ
Ａフラグメントを共に連結して、ｐＦＳを形成した。この構築物において、ＰＨ
Ｂシンターゼおよび４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、Ａ
．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのｐｈｂＣプロモーター（ＰｅｏｐｌｅｓおよびおよびＳ
ｉｎｓｋｅｙ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−１５
３０３）から発現される。ＰＨＢシンターゼおよび４−ヒドロキシブチリル−Ｃ
ｏＡトランスフェラーゼを発現する他の適切なプラスミドは、（Ｈｅｉｎら、１
９９７、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５３：４１１−４１８；
ＶａｌｅｎｔｉｎおよびＤｅｎｎｉｓ，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
５８：３３−３８）に記載されている。
ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−グルコピラノシド）誘導性ｔｒｃプロモータ
ーから発現され得るように、ＡｖｒＩＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、そして
ＸｂａＩ（これらはＡｖｒＩＩに適合可能である）およびＳａｌＩで消化したｐ
ＴｒｃＮに連結し、プラスミドｐＦＳ１６を形成した。 （ｐＦＳ３０の構築） プラスミドｐＦＳ３０を、（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ３３：９３１１−９３２０）に記載されるような強力なＥ．ｃｏ
ｌｉリボソーム結合部位を付加することによって改変された、Ｒａｌｓｔｏｎｉ
ａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＡシンターゼ（ｐｈａＣ）遺伝子（Ｐｅｏｐｌｅｓ
およびＳｉｎｓｋｅｙ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９
８−１５３０３）を付加することによってｐＦＳ１６から誘導した。プラスミド
ｐＡｅＴ４１４を、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａプロモーターおよびｐｈａＣ構造遺伝
子が、１つのフラグメント上に存在するように、ＸｍａＩおよびＳｔｕＩで消化
した。ｐＦＳ１６をＢａｍＨＩで切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して
平滑末端を作製し、次いで、ＸｍａＩで切断した。従って、得られた２つのＤＮ
Ａフラグメントを共に連結して、ｐＦＳを形成した。この構築物において、ＰＨ
Ｂシンターゼおよび４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼは、Ａ
．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのｐｈｂＣプロモーター（ＰｅｏｐｌｅｓおよびおよびＳ
ｉｎｓｋｅｙ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−１５
３０３）から発現される。ＰＨＢシンターゼおよび４−ヒドロキシブチリル−Ｃ
ｏＡトランスフェラーゼを発現する他の適切なプラスミドは、（Ｈｅｉｎら、１
９９７、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５３：４１１−４１８；
ＶａｌｅｎｔｉｎおよびＤｅｎｎｉｓ，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
５８：３３−３８）に記載されている。
【００２０】 Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ７６９は、その染色体内に組込まれたＰＨＡシンターゼ
を有する。この株は、染色体外遺伝子の存在なしに、グルコースからポリ（３−
ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を合成し得る。ＭＢＸ７６９はまた、ｆａｄ
Ｒ（脂肪酸分解経路のリプレッサーおよび多くの他の細胞機能のエフェクター）
を欠損し、ｒｐｏＳ（定常期の遺伝子発現のレギュレーター）を欠損し、そして
ａｔｏＡ（アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼの１つのサブユニット）
を欠損している。ＭＢＸ７６９はまた、ａｔｏＣ（アセトアセテート系のポジテ
ィブレギュレーター）を構成的に発現する。
を有する。この株は、染色体外遺伝子の存在なしに、グルコースからポリ（３−
ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を合成し得る。ＭＢＸ７６９はまた、ｆａｄ
Ｒ（脂肪酸分解経路のリプレッサーおよび多くの他の細胞機能のエフェクター）
を欠損し、ｒｐｏＳ（定常期の遺伝子発現のレギュレーター）を欠損し、そして
ａｔｏＡ（アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼの１つのサブユニット）
を欠損している。ＭＢＸ７６９はまた、ａｔｏＣ（アセトアセテート系のポジテ
ィブレギュレーター）を構成的に発現する。
【００２１】 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉの４−ヒドロキシブチリル−Ｃｏ
Ａトランスフェラーゼの発現を可能にするプラスミドｐＦＳ１６（図２）を保持
するＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ７６９を、２５０ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラス
コにおいて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する１００ｍＬの
ＬＢ培地中で、３７℃、２００ｒｐｍで振盪して前培養した。１６時間後、細胞
を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを回収し、そして
これらを、１リットルあたり、以下：４．１または１２．４ｇの４−ヒドロキシ
バレレート（４ＨＶ）ナトリウム；５ｇ／Ｌの４−ヒドロキシブチレート（４Ｈ
Ｂ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末（Ｄｉｆｃｏ；
Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１０
０μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有する１００ｍＬの培地中
に再懸濁した。４−ヒドロキシバレレートナトリウムは、水酸化ナトリウム溶液
中でγ−バレロラクトンの加水分解によって得た。これらの細胞を、この培地中
で３日間、これらの細胞を前培養した同じフラスコで３２℃、２００ｒｐｍで振
盪して培養した。４．１ｇ／Ｌの４−ヒドロキシバレレートナトリウムが最初に
存在する場合、この細胞は、乾燥細胞重量の５２．６％までポリマーを蓄積し、
このポリマーは、６３．４％の３ＨＢユニットおよび３６．６％の４ＨＢユニッ
トからなり、４ＨＶユニットを含まなかった。
Ａトランスフェラーゼの発現を可能にするプラスミドｐＦＳ１６（図２）を保持
するＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ７６９を、２５０ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラス
コにおいて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する１００ｍＬの
ＬＢ培地中で、３７℃、２００ｒｐｍで振盪して前培養した。１６時間後、細胞
を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを回収し、そして
これらを、１リットルあたり、以下：４．１または１２．４ｇの４−ヒドロキシ
バレレート（４ＨＶ）ナトリウム；５ｇ／Ｌの４−ヒドロキシブチレート（４Ｈ
Ｂ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末（Ｄｉｆｃｏ；
Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１０
０μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有する１００ｍＬの培地中
に再懸濁した。４−ヒドロキシバレレートナトリウムは、水酸化ナトリウム溶液
中でγ−バレロラクトンの加水分解によって得た。これらの細胞を、この培地中
で３日間、これらの細胞を前培養した同じフラスコで３２℃、２００ｒｐｍで振
盪して培養した。４．１ｇ／Ｌの４−ヒドロキシバレレートナトリウムが最初に
存在する場合、この細胞は、乾燥細胞重量の５２．６％までポリマーを蓄積し、
このポリマーは、６３．４％の３ＨＢユニットおよび３６．６％の４ＨＢユニッ
トからなり、４ＨＶユニットを含まなかった。
【００２２】 １２．４ｇ／Ｌの４ＨＶナトリウムが最初に存在する場合、この細胞は、乾燥
細胞重量の４５．９％までポリマーを蓄積し、このポリマーは、９５．５％の３
ＨＢユニットおよび４．５％の４ＨＶユニットからなるが、検出可能な４ＨＢユ
ニットは含まなかった。ＰＨＢ−コ−４ＨＶポリマーの正体を、全細胞のクロロ
ホルム抽出、続いて、濾過、濾過物からのポリマーのエタノール沈殿、およびこ
のポリマーの水での洗浄によって得られた固体産物の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析
によって検証した。このポリマーをまた、以下のように行う、ガスクロマトグラ
フィー（ＧＣ）分析によって検証した。抽出したポリマー（１〜２０ｍｇ）また
は凍結乾燥全細胞（１５〜５０ｍｇ）を、５０％の１，２−ジクロロエタン、４
０％の１−プロパノール、および１０％の濃塩酸からなる３ｍＬのプロパノール
溶解（ｐｒｏｐａｎｏｌｙｓｉｓ）溶液中、１００℃で５時間インキュベートし
た。生じた混合物の水溶性成分を、３ｍＬの水での抽出によって除去した。有機
相（２ｍｌ／分の全体流速で、１：５０のスプリット比で１μＬ）を、ＳＰＢ−
１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；０．３２ｍｍ ＩＤ；０．２５
μｍフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ）上で、以下の温
度プロフィールで分析した：８０℃、２分；２５０℃まで、１０℃／分；２５０
℃、２分。ポリマー中の４ＨＶユニットの存在について試験するために使用され
るスタンダードは、γ−バレロラクトンであり、これは４−ヒドロキシバレレー
ト酸のように、プロパノール溶解（ｐｒｏｐａｎｏｌｙｚｅｄ）の際にプロピル
４−ヒドロキシバレレートを形成する。ポリマー中の３ＨＢユニットについて試
験するために使用されるスタンダードは、ＰＨＢであった。
細胞重量の４５．９％までポリマーを蓄積し、このポリマーは、９５．５％の３
ＨＢユニットおよび４．５％の４ＨＶユニットからなるが、検出可能な４ＨＢユ
ニットは含まなかった。ＰＨＢ−コ−４ＨＶポリマーの正体を、全細胞のクロロ
ホルム抽出、続いて、濾過、濾過物からのポリマーのエタノール沈殿、およびこ
のポリマーの水での洗浄によって得られた固体産物の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析
によって検証した。このポリマーをまた、以下のように行う、ガスクロマトグラ
フィー（ＧＣ）分析によって検証した。抽出したポリマー（１〜２０ｍｇ）また
は凍結乾燥全細胞（１５〜５０ｍｇ）を、５０％の１，２−ジクロロエタン、４
０％の１−プロパノール、および１０％の濃塩酸からなる３ｍＬのプロパノール
溶解（ｐｒｏｐａｎｏｌｙｓｉｓ）溶液中、１００℃で５時間インキュベートし
た。生じた混合物の水溶性成分を、３ｍＬの水での抽出によって除去した。有機
相（２ｍｌ／分の全体流速で、１：５０のスプリット比で１μＬ）を、ＳＰＢ−
１融合シリカキャピラリーＧＣカラム（３０ｍ；０．３２ｍｍ ＩＤ；０．２５
μｍフィルム；Ｓｕｐｅｌｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，Ｐａ）上で、以下の温
度プロフィールで分析した：８０℃、２分；２５０℃まで、１０℃／分；２５０
℃、２分。ポリマー中の４ＨＶユニットの存在について試験するために使用され
るスタンダードは、γ−バレロラクトンであり、これは４−ヒドロキシバレレー
ト酸のように、プロパノール溶解（ｐｒｏｐａｎｏｌｙｚｅｄ）の際にプロピル
４−ヒドロキシバレレートを形成する。ポリマー中の３ＨＢユニットについて試
験するために使用されるスタンダードは、ＰＨＢであった。
【００２３】 （実施例２ Ｅ．ｃｏｌｉにおける４−ヒドロキシバレレートからのポリ（４
ＨＶ）） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＢＸ１１７７は、グルコースからポリ
（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を合成し得ない。ＭＢＸ１１７７は、
ＤＨ５□株の自発性変異体であり、炭素源として４−ヒドロキシブチレート酸を
使用し得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉの４ＨＢ−ＣｏＡトラ
ンスフェラーゼおよびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＡシンター
ゼの発現を可能にするプラスミドｐＦＳ３０（図２）を保持するＭＢＸ１１７７
を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する１００ｍＬのＬＢ培
地中で、３７℃で振盪して前培養した。
ＨＶ）） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＢＸ１１７７は、グルコースからポリ
（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を合成し得ない。ＭＢＸ１１７７は、
ＤＨ５□株の自発性変異体であり、炭素源として４−ヒドロキシブチレート酸を
使用し得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉの４ＨＢ−ＣｏＡトラ
ンスフェラーゼおよびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＡシンター
ゼの発現を可能にするプラスミドｐＦＳ３０（図２）を保持するＭＢＸ１１７７
を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する１００ｍＬのＬＢ培
地中で、３７℃で振盪して前培養した。
【００２４】 １６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれ
らを回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：５ｇの４−ヒドロキシ
バレレート（４ＨＶ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉
末；１００ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリ
ンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地中
に再懸濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養し
た同じフラスコで３０℃、２００ｒｐｍで振盪して培養した。
らを回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：５ｇの４−ヒドロキシ
バレレート（４ＨＶ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉
末；１００ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリ
ンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地中
に再懸濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養し
た同じフラスコで３０℃、２００ｒｐｍで振盪して培養した。
【００２５】 この細胞は、乾燥細胞重量の０．２５％までポリマーを蓄積し、このポリマー
は、１００％の４ＨＶユニットからなった。このポリ（４ＨＶ）ポリマーの正体
を、水で洗浄し、そして５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパ
ノール、および１０％の濃塩酸の混合物中で、１００℃で５時間プロパノール溶
解した全細胞のＧＣ分析によって、スタンダードとしてγ−バレロラクトンを用
いて検証した。
は、１００％の４ＨＶユニットからなった。このポリ（４ＨＶ）ポリマーの正体
を、水で洗浄し、そして５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパ
ノール、および１０％の濃塩酸の混合物中で、１００℃で５時間プロパノール溶
解した全細胞のＧＣ分析によって、スタンダードとしてγ−バレロラクトンを用
いて検証した。
【００２６】 （実施例３ Ｅ．ｃｏｌｉにおける２−ヒドロキシブチラートおよびグルコー
スからのポリ（３ＨＢ−コ−２ＨＢ）） プラスミドｐＦＳ１６を保持するＭＢＸ７６９を、２５０ｍＬのＥｒｌｅｎｍ
ｅｙｅｒフラスコにおいて１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含有す
る１００ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃、２００ｒｐｍで振盪して前培養した。１
６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを
回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：５ｇの２−ヒドロキシブチ
レート（２ＨＢ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末；
５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナト
リウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地中に再懸
濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養した同じ
フラスコで３３℃、１５０ｒｐｍで振盪して培養した。この細胞は、乾燥細胞重
量の１９．０％までポリマーを蓄積し、このポリマーは、９９．７％の３ＨＢユ
ニットおよび０．３％の２ＨＢユニットからなった。このポリ（３ＨＢ−コ−２
ＨＢ）ポリマーの正体を、全細胞のクロロホルム抽出、続いて、濾過、濾液から
のポリマーエタノール沈殿、およびこのポリマーの水での洗浄によって得られた
固体産物のＧＣ分析によって検証した。このポリマーをまた、水で洗浄し、そし
て５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノール、および１０％
の濃塩酸の混合物中、１００℃で５時間、プロパノール溶解させた全細胞のＧＣ
分析により、スタンダードとしてＰＨＢおよび２−ヒドロキシブチラートナトリ
ウムを用いて検証した。
スからのポリ（３ＨＢ−コ−２ＨＢ）） プラスミドｐＦＳ１６を保持するＭＢＸ７６９を、２５０ｍＬのＥｒｌｅｎｍ
ｅｙｅｒフラスコにおいて１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含有す
る１００ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃、２００ｒｐｍで振盪して前培養した。１
６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを
回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：５ｇの２−ヒドロキシブチ
レート（２ＨＢ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末；
５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナト
リウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地中に再懸
濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養した同じ
フラスコで３３℃、１５０ｒｐｍで振盪して培養した。この細胞は、乾燥細胞重
量の１９．０％までポリマーを蓄積し、このポリマーは、９９．７％の３ＨＢユ
ニットおよび０．３％の２ＨＢユニットからなった。このポリ（３ＨＢ−コ−２
ＨＢ）ポリマーの正体を、全細胞のクロロホルム抽出、続いて、濾過、濾液から
のポリマーエタノール沈殿、およびこのポリマーの水での洗浄によって得られた
固体産物のＧＣ分析によって検証した。このポリマーをまた、水で洗浄し、そし
て５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノール、および１０％
の濃塩酸の混合物中、１００℃で５時間、プロパノール溶解させた全細胞のＧＣ
分析により、スタンダードとしてＰＨＢおよび２−ヒドロキシブチラートナトリ
ウムを用いて検証した。
【００２７】 （実施例４ Ｅ．ｃｏｌｉにおける２−ヒドロキシブチラートからのポリ（２
ＨＢ）） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＢＸ１８４は、グルコースからポリ（
３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を合成し得ない。ＭＢＸ１８４は、ｆａ
ｄＲを欠損し、そしてａｔｏＣを構成的に発現する。
ＨＢ）） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＢＸ１８４は、グルコースからポリ（
３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）を合成し得ない。ＭＢＸ１８４は、ｆａ
ｄＲを欠損し、そしてａｔｏＣを構成的に発現する。
【００２８】 プラスミドｐＦＳ３０を保持するＭＢＸ１８４を、１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンナトリウムを含有する１００ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃で前培養した。
１６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれら
を回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：５ｇの２−ヒドロキシブ
チレート（２ＨＢ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末
；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナ
トリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地中に再
懸濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養した同
じフラスコで３３℃、１５０ｒｐｍで振盪して培養した。
シリンナトリウムを含有する１００ｍＬのＬＢ培地中で、３７℃で前培養した。
１６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して、ＬＢ培地からこれら
を回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：５ｇの２−ヒドロキシブ
チレート（２ＨＢ）ナトリウム；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロス粉末
；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナ
トリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地中に再
懸濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養した同
じフラスコで３３℃、１５０ｒｐｍで振盪して培養した。
【００２９】 この細胞は、乾燥細胞重量の１．０％までポリマーを蓄積し、このポリマーは
、１００％の２ＨＢユニットからなった。このポリ（２ＨＢ）ポリマーの正体を
、水で洗浄し、そして５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノ
ール、および１０％の濃塩酸の混合物中、１００℃で５時間プロパノール溶解し
た全細胞のＧＣ分析により、スタンダードとして２−ヒドロキシブチラートを用
いて検証した。
、１００％の２ＨＢユニットからなった。このポリ（２ＨＢ）ポリマーの正体を
、水で洗浄し、そして５０％の１，２−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノ
ール、および１０％の濃塩酸の混合物中、１００℃で５時間プロパノール溶解し
た全細胞のＧＣ分析により、スタンダードとして２−ヒドロキシブチラートを用
いて検証した。
【００３０】 （実施例５ １，３−プロパンジオールから、および１．５−ペンタンジオー
ルからのポリ−３ＨＰおよびポリ−３ＨＰ−コ−５ＨＶ） プラスミドｐＦＳ３０を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＢＸ
１８４を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する１００ｍＬの
ＬＢ培地中で、３７℃で前培養した。１６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分
間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを回収し、そしてこれらを、１リットルあ
たり、以下：１０ｇの１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）または１，５
−ペンタンジオール（１，５−ＰＤ）；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロ
ス粉末；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシ
リンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地
中に再懸濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養
した同じフラスコで３０℃、２００ｒｐｍで振盪して培養した。ジオール基質が
１，３−ＰＤであった場合、この細胞は、乾燥細胞重量の７．０％までポリマー
を蓄積し、このポリマーは、全体的に３ＨＢユニットからなった。ジオール基質
が１，５−ＰＤであった場合、この細胞は、乾燥細胞重量の２２．１％までポリ
マーを蓄積し、９０％を超える３−ヒドロキシプロピオネートユニットおよび１
０％未満の５−ヒドロキシバレレートユニットからなった。このポリ（３−ヒド
ロキシプロピオネート）ポリマーの正体を、全細胞の次亜塩素酸ナトリウム抽出
、続いて、遠心分離およびこのポリマーの水での洗浄によって得られた固体産物
のＮＭＲ分析によって検証した。この両方のポリマーの正体を、５０％の１，２
−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノール、および１０％の濃塩酸の混合物
中、１００℃で５時間、プロパノール溶解させた次亜塩素酸ナトリウム抽出した
ポリマーのＧＣ分析により、スタンダードとしてβ−プロピオラクトンおよびδ
−バレロラクトンを用いて検証した。
ルからのポリ−３ＨＰおよびポリ−３ＨＰ−コ−５ＨＶ） プラスミドｐＦＳ３０を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＢＸ
１８４を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する１００ｍＬの
ＬＢ培地中で、３７℃で前培養した。１６時間後、細胞を、５０００ｇで１０分
間遠心分離して、ＬＢ培地からこれらを回収し、そしてこれらを、１リットルあ
たり、以下：１０ｇの１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）または１，５
−ペンタンジオール（１，５−ＰＤ）；２ｇのグルコース；２．５ｇのＬＢブロ
ス粉末；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ／ｍＬのアンピシ
リンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの培地
中に再懸濁した。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培養
した同じフラスコで３０℃、２００ｒｐｍで振盪して培養した。ジオール基質が
１，３−ＰＤであった場合、この細胞は、乾燥細胞重量の７．０％までポリマー
を蓄積し、このポリマーは、全体的に３ＨＢユニットからなった。ジオール基質
が１，５−ＰＤであった場合、この細胞は、乾燥細胞重量の２２．１％までポリ
マーを蓄積し、９０％を超える３−ヒドロキシプロピオネートユニットおよび１
０％未満の５−ヒドロキシバレレートユニットからなった。このポリ（３−ヒド
ロキシプロピオネート）ポリマーの正体を、全細胞の次亜塩素酸ナトリウム抽出
、続いて、遠心分離およびこのポリマーの水での洗浄によって得られた固体産物
のＮＭＲ分析によって検証した。この両方のポリマーの正体を、５０％の１，２
−ジクロロエタン、４０％の１−プロパノール、および１０％の濃塩酸の混合物
中、１００℃で５時間、プロパノール溶解させた次亜塩素酸ナトリウム抽出した
ポリマーのＧＣ分析により、スタンダードとしてβ−プロピオラクトンおよびδ
−バレロラクトンを用いて検証した。
【００３１】 （実施例６ ５−ヒドロキシバレレートからのポリ−５ＨＶ） ｐＦＳ３０を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＭＢＸ１１７７を、
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する５０ｍＬのＬＢ培地中で
、３７℃で前培養した。８時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して
、ＬＢ培地からこれらを回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：１
０ｇの５−ヒドロキシバレレート（５ＨＶ）ナトリウム；５ｇのグルコース；２
．５ｇのＬＢブロス粉末；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ
／ｍＬのアンピシリンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する
１００ｍＬの培地中に再懸濁した。５ＨＶナトリウムをδ−バレロラクトンのけ
ん化によって得た。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培
養した同じフラスコで３０℃、２００ｒｐｍで振盪して培養した。９０％の１−
ブタノール、および１０％の濃塩酸の混合物中、１１０℃で５時間ブタノール溶
解（ｂｕｔａｎｏｌｙｚｅｄ）した凍結乾燥全細胞を用いて、ＧＣ分析を実行し
た；スタンダードは、５−ヒドロキシバレレートナトリウムであった。この分析
物は、この細胞が乾燥細胞重量の１３．９％までポリ（５ＨＶ）を蓄積したこと
を示した。このポリ（５−ヒドロキシバレレート）ポリマーの正体を、全細胞の
１，２−ジクロロエタン抽出、続いて、遠心分離およびこのポリマーの水での洗
浄によって得られた固体産物のＮＭＲ分析によって検証した。
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含有する５０ｍＬのＬＢ培地中で
、３７℃で前培養した。８時間後、細胞を、５０００ｇで１０分間遠心分離して
、ＬＢ培地からこれらを回収し、そしてこれらを、１リットルあたり、以下：１
０ｇの５−ヒドロキシバレレート（５ＨＶ）ナトリウム；５ｇのグルコース；２
．５ｇのＬＢブロス粉末；５０ｍｍｏｌのリン酸カリウム、ｐＨ７；１００μｇ
／ｍＬのアンピシリンナトリウム；および０．１ｍｍｏｌのＩＰＴＧを含有する
１００ｍＬの培地中に再懸濁した。５ＨＶナトリウムをδ−バレロラクトンのけ
ん化によって得た。これらの細胞を、この培地中で３日間、これらの細胞を前培
養した同じフラスコで３０℃、２００ｒｐｍで振盪して培養した。９０％の１−
ブタノール、および１０％の濃塩酸の混合物中、１１０℃で５時間ブタノール溶
解（ｂｕｔａｎｏｌｙｚｅｄ）した凍結乾燥全細胞を用いて、ＧＣ分析を実行し
た；スタンダードは、５−ヒドロキシバレレートナトリウムであった。この分析
物は、この細胞が乾燥細胞重量の１３．９％までポリ（５ＨＶ）を蓄積したこと
を示した。このポリ（５−ヒドロキシバレレート）ポリマーの正体を、全細胞の
１，２−ジクロロエタン抽出、続いて、遠心分離およびこのポリマーの水での洗
浄によって得られた固体産物のＮＭＲ分析によって検証した。
【配列表】
【図１】 図１は、レブリン酸からポリ−４−ヒドロキシバレレートへの経路の概略図で
ある。
ある。
【図２】 図２は、ＩａｃＩ（誘導物質）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびｈｂ
ｃＴ遺伝子を含む、プラスミドｐＦＳ１６の構築物の概略図である。
ｃＴ遺伝子を含む、プラスミドｐＦＳ１６の構築物の概略図である。
【図３】 図３は、ＩａｃＩ（誘導物質）遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ポリヒドロ
キシアルカノエートポリメラーゼ（ｐｈｃＣ）遺伝子、およびｈｂｃＴ遺伝子を
含む、プラスミドｐＦＳ３０の構築物の概略図である。
キシアルカノエートポリメラーゼ（ｐｈｃＣ）遺伝子、およびｈｂｃＴ遺伝子を
含む、プラスミドｐＦＳ３０の構築物の概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 BA07 BA10 BA80 CA02 DA01 DA06 DA12 EA04 GA11 4B064 AD64 AG01 CA02 CA06 CA11 CA19 CB24 CC24 CD07 DA01 DA20 4B065 AA26X AA72X AA88X AB01 AC14 BA02 CA12 CA27 CA29 CA44 4J029 AA02 AB01 AB04 AC01 AC02 AD10 AE01 AE06 EA05 HA01 HB01 KD01 KE03 【要約の続き】 ｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，６３：２１−５３）。これらの ポリマーは、医用領域、産業領域および他の商業的領域 において種々の使用を有する。
Claims (11)
- 【請求項１】 細菌、酵母、真菌および植物を含む群より選択される生物学
的系において、２−ヒドロキシ酸を含む、１以上の物質を提供することによって
生成されるポリマーであって、 ここで、該生物学的系は、該ポリマーが蓄積するように、ポリヒドロキシアル
カノエートシンターゼ、アシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシアシルＣ
ｏＡトランスフェラーゼ、およびヒドロキシアシルＣｏＡシンターゼからなる群
より選択される酵素を発現する、 ポリマー。 - 【請求項２】 前記２−ヒドロキシ酸が、２−ヒドロキシブチレートである
、請求項１に記載のポリマー。 - 【請求項３】 ポリ（２−ヒドロキシブチレート）およびポリ（２−ヒドロ
キシブチレートコ−３−ヒドロキシブチレート）からなる群より選択される、請
求項１に記載のポリマー。 - 【請求項４】 ２−ヒドロキシブチレート、ならびに３−ヒドロキシプロピ
オネート、３−ヒドロキシブチラート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロ
キシヘキサノエート、４−ヒドロキシブチラート、４−ヒドロキシバレレート、
５−ヒドロキシバレレート、および６−ヒドロキシヘキサノエートからなる群よ
り選択される１以上の物質を提供することによって生成される、請求項２に記載
のポリマー。 - 【請求項５】 コモノマーとして２−ヒドロキシブチレートを含む、ポリヒ
ドロキシアルカノエートポリマーであって、ここで、該ポリマーは、細菌、酵母
、真菌および植物を含む群より選択される生物学的系において生成されるポリマ
ーであって、 ここで、該生物学的系は、該ポリマーが蓄積するように、ポリヒドロキシアル
カノエートシンターゼ、アシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシアシルＣ
ｏＡトランスフェラーゼ、およびヒドロキシアシルＣｏＡシンターゼからなる群
より選択される酵素を発現する、 ポリマー。 - 【請求項６】 前記ポリマーが、ポリ（２−ヒドロキシブチレート）である
、請求項５に記載のポリマー。 - 【請求項７】 前記ポリマーが、ポリ（２−ヒドロキシブチレート−コ−３
−ヒドロキシブチレート）である、請求項５に記載のポリマー。 - 【請求項８】 生物学的系においてポリマーを作製するための方法であって
、該方法は、２−ヒドロキシ酸を含む、１以上の物質を提供する工程を包含し、 ここで、該生物学的系は、該ポリマーが蓄積するように、ポリヒドロキシアル
カノエートシンターゼ、アシルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシアシルＣ
ｏＡトランスフェラーゼ、およびヒドロキシアシルＣｏＡシンターゼからなる群
より選択される酵素を発現する、 方法。 - 【請求項９】 前記生物体が、前記酵素をコードする１以上の異種遺伝子を
発現する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記２−ヒドロキシ酸が、２−ヒドロキシブチラートであ
る、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 ２−ヒドロキシブチラートと共に、３−ヒドロキシプロピ
オネート、３−ヒドロキシブチラート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロ
キシヘキサノエート、４−ヒドロキシブチラート、４−ヒドロキシバレレート、
５−ヒドロキシバレレート、および６−ヒドロキシヘキサノエートからなる群よ
り選択される１以上の物質を提供する工程をさらに包含する、請求項８に記載の
方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| US60/086,396 | 1998-05-22 | ||
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2000551008A Pending JP2002516384A (ja) | 1998-05-22 | 1999-05-21 | ポリヒドロキシアルカノエートバイオポリマー組成物 |
| JP2010060249A Pending JP2010213700A (ja) | 1998-05-22 | 2010-03-17 | ポリヒドロキシアルカノエートバイオポリマー組成物 |
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|---|---|---|---|---|
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| US20020164729A1 (en) * | 2000-07-21 | 2002-11-07 | Skraly Frank A. | Production of polyhydroxyalkanoates from polyols |
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