JP2002507412A

JP2002507412A - フィターゼ変異体

Info

Publication number: JP2002507412A
Application number: JP2000537983A
Authority: JP
Inventors: スベンセン，アラン; コストレバ，ディルク; レーマン，マーティン; パサモンテス，ルイス; トムシー，アンドレア; ローン，アドルフュースファン; フォーゲル，クルト; ビーシュ，マルクス; フレンステッドラッセン，セレン
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1998-03-23
Filing date: 1999-03-22
Publication date: 2002-03-12
Also published as: KR20010042138A; ES2321047T3; WO1999049022A1; CA2323639A1; EP1066373A1; AU3326699A; AU765477B2; WO1999049022A9; DK1066373T3; DE69940306D1; BR9909010A; CN1309699A; EP1066373B1

Abstract

(57)【要約】図１に従って整列される場合、多くの位置中の少なくとも１つの位置で、モデル・フィターゼに比較して、修飾されているフィターゼ変異体類、それらの調製及び使用に関する。好ましいモデル・フィターゼは、担子菌網及びフィターゼ、たとえばペニオポラフィターゼ及びアスペルギラスフィターゼである。好ましいフィターゼ変異体は、修飾された活性特徴、たとえば改良された比活性及び/又は改良された熟安定性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、フイターゼの変異体、特に子嚢菌網（Ascomycete）のフィターゼの
変異体及び担子菌網（Basidiomycete）のフィターゼ変異体、それらの対応するクローン化されたDNA配列、そのようなフィターゼ変異体を生成するための方法、及び多くの産業用途のためへのそれらの使用に関する。

【０００２】発明の背景フィチン酸又はmyo−イノシトール1, 2, 3, 4, 5, 6−ヘキサキス二水素ホスフェート（又は短かく表現すればmyo−イノシトールヘキサキスホスフェート）は、イノシトールの主要源、及び植物種子におけるホスフェートの主要貯蔵形で
ある。フィチンはイノシトールの混合されたカリウム、マグネシウム及びカルシ
ウム塩である。フェチン酸のホスフェート成分は二価カチオン、たとえば金属イオン、すなわ
ちカルシウム、鉄、亜鉛及びマグネシウム、並びに微量鉱物、たとえばマンガン
、銅及びモリブデンの栄養学的に必須のイオンをキレート化する。

【０００３】フェチン酸及びその塩、すなわちフェチン酸塩は、しばしば代謝されず、すな
わちそのリン含有物形でも又はキレート化された金属イオン形でも、栄養学的に
利用できない。従って、食品及び飼料調製物は、無機ホスフェートにより補充される必要があ
り、そして、しばしばまた、栄養学的に必須のイオン、たとえばカルシウムが補
充されるべきである。

【０００４】さらに、フィチン酸塩リンは、そのような動物の胃腸管を通過し、そして排泄
物と共に排泄され、たとえば水性環境の栄養汚染及び藻類の多量の増殖をもたら
す環境の所望しないホスフェート汚染をもたらす。フィチン酸又はフィチン酸塩、すなわち本明細書において類義語的に又はラン
ダムに使用されるそれらのものは、特に断らない限り、フィターゼにより分解で
きる。植物及び微生物によるフィターゼの生成は報告されている。微生物の中でも、
フィターゼ生成細菌及びフィターゼ生成菌類は知られている。

【０００５】子嚢菌類（Ascomycota)(子嚢菌網（Ascomycetes)）の菌類門に属するフィター
ゼ生産性糸状菌のいくつかの記載が存在する。特に、アスペルギラス属、たとえ
ばアスペルギラス・テレウスのフィターゼ生成子嚢菌網に関するいくつかの文献
が存在する（Yamada など., 1986, Agric. Biol. Chem. 322: 1275-1282）。また、アスペルギラス・ニガー Var. アワモリからのフィターゼ遺伝子のクローニ
ング及び発現が記載されている（Piddingtonなど., 1993, Gene133: 55-62）。ヨーロッパ特許第0420358号は、アスペルギラス・フィカム（ニガー）のフィターゼのクローニング及び発現を記載する。

【０００６】ヨーロッパ特許第0684313号は、子嚢菌網アスペルギラス・ニガー、ミセリオプソラ・サーモフィラス、アスペルギラス・テレウスのフィターゼのクローニン
グ及び発現を記載する。されに、アスペルギラス・ニジュランス、タラロミセス
・サーモフィラス、アスペルギラス・フミガタス及びアスペルギラス・テリウス
のもう１つの株のフィターゼのいくつかの部分配列が与えられている。サーモミセス・ラヌギノサスのフィターゼのクローニング及び発現がWO97/350
17号に記載されている。

【０００７】改良された性質又は特徴のフィターゼ、たとえば高められた熱安定性、変更さ
れたpH最適性（高いpH最適性は、インビトロプロセッシングのために所望され、
低いpH最適性は胃腸管におけるインビボプロセッシングのために所望される）、
及び/又はより高い比活性のフィターゼについての必要性が現在、存在する。

【０００８】発明の要約：第１の観点においては、本発明は、いわゆるモデル・フィターゼ（model phyt
ase)に比較して、その特徴が修飾されているフィターゼ変異体を提供する。 13種の本明細書に特別に開示されるモデル・フィターゼに対して一定の類似性
を有するいずれかのモデル・フィターゼが、そのような変異体のモデルから製造
され得る。もう１つの観点においては、本発明は、クラドリニウム・フォエカンジウム（
Cladorrhinum foecundissium）に由来する新規フィターゼに関する。

【０００９】さらにもう1つの観点においては、本発明は、それらのフィターゼ変異体及びこのフィターゼをコードするDNA配列、及びそれらの製造方法を提供する。最終的に、本発明はまた、一般的には、いずれかのフィターゼ基質からのリン
含有物、特にフィチン酸塩又はフィチン酸からの無機リン酸塩の生成のためへの
フィターゼ及びフィターゼ変異体の使用に関する。発明の特定の開示：

【００１０】フィターゼ：本明細書においては、フィターゼは、フィテート（phytate)（myo−イノシトールヘキサキスホスフェート）の、（１）myo−イノシトール及び/又は（２）そ
のモノ−、ジ−、テトラ−及び/又はペンタ−ホスフェート、及び（３）無機ホスフェートへの加水分解を触媒する酵素である。次に、上記化合物は、略して、
時々それぞれIP6, I, IP1, IP2, IP3, IP4, IP5及びPとして言及される。これは
、フィターゼの作用により、IP6がP＋１又は複数の成分IP5, IP4, IP3, IP2, IP
1及びIに分解されることを意味する。他方では、位置p, q, r,...に結合される合計n個のホスフェート基を担持するmyo−イノシトールは、Ins（p, q, r, ... ）Pnとして示される。便利には、Ins（1, 2, 3, 4, 5, 6）P6 (フィチン酸) は、PAとして略書される。

【００１１】酵素命名法データベースExPASｙ（EC（Enzyme Commission）番号が提供されて
いる個々のタイプの特徴化された酵素を説明するNomenclature Committee of th
e International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)の推薦に主に基づいての酵素の命名法に関する情報の貯蔵所）によれば、次の２種の
異なったタイプのフィターゼが知られている：いわゆる、３−フィターゼ（myo −イノシトールヘキサホスフェート３−ホスホヒドロラーゼ、EC 3. 1. 3. 8）及びいわゆる、６−フィターゼ（myo−イノシトールヘキサホスフェート）６− ホスホヒドロラーゼ、EC 3. 1. 3. 26)。３−フィターゼはD−３−位置でのエス
テル結合をまず加水分解し、そして６−フィターゼはD−６−又はL−６−位置で
のエステル結合をまず加水分解する。

【００１２】表現法、“フィターゼ”あるいは“フィターゼ活性を示すポリペプチド又は酵
素”とは、種々のmyo−イノシトールホスフェートからの無機ホスフェート又はリン含有物の生成をもたらすことができるいずれかの酵素を包含することを意図
する。そのようなmyo−イノシトールホスフェート（ファターゼ基質）の例は、フィチン酸及びそのいずれかの塩、たとえばフィチン酸ナトリウム又はフィチン
酸カリウム、又は混合された塩である。また、myo−イノシトールのモノ−、ジ −、トリ−、テトラ−又はペンタ−ホスフェートのいずれかの立体異性体も、フ
ィターゼ基質として作用することができる。好ましいフィターゼ基質は、フィチ
ン酸又はその塩である。

【００１３】上記の定義によれば、フィターゼ活性は、それらの基質の１つが使用されるい
ずれかのアッセイを用いて決定され得る。本明細書においては（特にことわらな
い限り）、フィターゼ活性は、FYTの単位で決定され、１FYTは、次の条件下で、
１分当たり１μモルの無機オルト−ホスフェートを生成する酵素の量である：pH
5.5；温度37℃；基質：0.0050モル/lの濃度でのフィチン酸ナトリウム（C₆H₆O₂₄ P₆Na₁₂）。適切なフィターゼアッセイは、実験部分において記載される。本発明は、請求の範囲に記載されるような遺伝子的に構築されたフィターゼを
提供する。

【００１４】遺伝子的に構築されたフィターゼは、モデル・フィターゼ、たとえば野生型フ
ィターゼとは異なる天然において存在しないフィターゼである。遺伝子的に構築
されたフィターゼは、特定部位の突然変異誘発、遺伝子シャフリング、ランダム
突然変異誘発、等により調製されたフィターゼを包含するが、但しそれらだけに
は限定されない。本発明はまた、DNA構造体、ベクター、宿主細胞、及びそれらの遺伝子的に構築されたフィターゼ及びフィターゼ変異体の生成方法、並びにそれらの使用を提
供する。

【００１５】フィターゼ変異体は、フィターゼ活性を示し、そしてモデル・フィターゼに比
較して修飾されている。ポリペプチド又は酵素又はそれらのフラグメントである
。修飾されたとは、１又は複数のアミノ酸又はペプチドの置換、欠失、挿入及び
/又は付加（個々の場合、１又は複数のアミノ酸による）により変更されることを意味する。そのような置換、欠失、挿入、付加は、当業者において知られてい
るいずれかの方法、たとえば遺伝子シャフリング、ランダム突然変異誘発、特定
の部位の突然変異誘発、等により達成され得る。

【００１６】フィターゼ変異体が由来するモデル又は親フィターゼは、いずれかのフィター
ゼ、たとえば野生型フィターゼ又はその誘導体、変異株又は変異体、たとえば対
立遺伝子及び種変異体、並びに、特定部位の突然変異誘発、ランダム突然変異誘
発、シャフリング等により調製され得る遺伝子的に構築されたそれらの変異体で
あり得る。いずれかのハイブリッド又はキメラフィターゼ、すなわち少なくとも２種のフ
ィターゼに由来する部分アミノ酸配列の組み合わせを含んで成るフィターゼもま
た、モデル・フィターゼの概念に包含される。

【００１７】ハイブリッドフィターゼは、少なくとも２種の子嚢菌網フィターゼ、少なくと
も２種の担子菌網フィターゼ、又は少なくとも1つの子嚢菌網及び少なくとも1つ
の担子菌網フィターゼに由来する部分アミノ酸配列の組み合わせを含んで成る。
部分アミノ酸配列が由来するそれらの子嚢菌網及び担子菌網フィターゼは、本明
細書に言及されるそれらの特定のフィターゼのいずれかであり得る。

【００１８】本明細書においては、ハイブリッドの、シャフリングされた、ランダム突然変
異誘発された、部位特定突然変異誘発された又はこれに代り、遺伝子的に構築さ
れた、子嚢菌網フィターゼ由来のフィターゼは単にまた、子嚢菌網フィターゼで
あり；そしてハイブリッドの、シャフリングされた、ランダム突然変異誘発され
た、部位特定突然変異誘発された又はこれらに代って、遺伝子的に構築された、
モデル担子菌網フィターゼ由来のフィターゼは単に、また、担子菌網ファターゼ
である。少なくとも１つの子嚢菌網フィターゼ及び少なくとも１つの担子菌網フ
ィターゼに由来するいずれかのハイブリッドは、混合された子嚢菌網/担子菌網フィターゼと呼ばれ、そしてそのようなフィターゼはまた、本明細書におけるモ
デル・フィターゼでもある。

【００１９】同様に、ハイブリッドの、シャフリングされた、ランダム突然変異誘発された
、部位特定突然変異誘発された又は他方では、遺伝子的に構築された、１又は複
数のアスペルギラスフィターゼ由来のフィターゼはまた、アスペルギラス由来の
フィターゼであり；そしてハイブリッドの、シャフリングされた、ランダム突然
変異誘発された、部位特定突然変異誘発された又はこれらに代って、遺伝子的に
構築された、本明細書に言及されるいずれか他の分類学的サブグルーピングに由
来するフィターゼはまた、この分類学的サブグルーピングに由来するフィターゼ
を表示する。

【００２０】さらに、本明細書において、“由来する”とは、問題の生物の株により生成さ
れるか又は生成できるフィターゼのみならず、また、そのような株から単離され
たDNA配列によりコードされ、そして前記DNA配列により形質転換された宿主生物
において生成されるフィターゼを示すことが意図される。最終的に、その用語は
、合成及び/又はcDNA起原のDNA配列によりコードされ、そして問題のフィターゼ
の同じ特徴を有するフィターゼを示すことが意図される。好ましくは、モデル・フィターゼは、図１の13種のフィターゼ（特に好ましい
モデル・フィターゼである）のいずれかに対して、下記のようにして整列され得
るフィターゼである。

【００２１】好ましくは野生型モデル・フィターゼ（すなわち、組換え、又はシャフリング
された又は他方では、遺伝子的に構築されたフィターゼのいずれでもない）は、
少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なく
とも60％、特に少なくとも70％、特別には少なくとも80％、及び最も好ましい態
様においては、少なくとも90％のそれらの１３種のフィターゼのいずれかのアミ
ノ酸配列番号38〜403（ペニオポラ番号）に対しての類似性又は相同性、好ましくは同一性の程度を有する。

【００２２】好ましい組換えの、又はシャフリングされた、又はこれに代って、遺伝子的に
構築されたモデル・フィターゼは、少なくとも60％、より好ましくは少なくとも
70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％のそれらの13
種のフィターゼのいずれかの部分配列番号38〜49、63〜77、274〜291、281〜300
及び389〜403（ペニオポラ（Peniophora）番号）に対しての類似性又は相同性、
好ましくは同一性の程度を有する。好ましい態様においては、類似性の程度は、13種のフィターゼのいずれかの完
全なアミノ酸配列との比較に基づかれる。

【００２３】類似性又は相同性、他方では同一性の程度は、当業界において知られているい
ずれかの整列プログラムを用いて決定され得る。好ましい整列プログラムは、GC
Gバージョン８プログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Pack
age, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive,
Madison, Wisconsin, USA 53711）(また、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D
., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453も参照のこと)に提供されるGAPである。ポリペプチド配列比較のために次の設定値を有するGAPを用い
た：3.000のGapWeight 及び0.100のGaplengthWeight。

【００２４】また、図１の13種の特定のフィターゼ配列をコードするDNA配列のいずれかのアミノ酸38−403（ペニオポラ番号）をコードするDNA配列に対してハイブリダイ
ズするDNA配列によりコードされるアミノ酸を含んで成る野生型モデル・フィターゼもまた好ましい。

【００２５】さらなる好ましいモデル・フィターゼは、図１の13種の特定のフィターゼ配列
をコードするDNA配列のいずれかのアミノ酸配列38−49をコードするDNA配列、及
びアミノ酸配列63−77をコードするDNA配列、及びアミノ酸配列274−291をコードするDNA配列、及びアミノ酸配列281−300をコードするDNA配列、及びアミノ酸
配列389−403（ペニオポラ番号）をコードするDNA配列に対してハイブリダイズするDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含んで成る、遺伝子的に構築されたフィターゼである。好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションは、13種のフィターゼのい
ずれかの部分をコードする完全なフィターゼに対してである。

【００２６】所定のDNA又はRNA配列が特定されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドプロ
ーブに“ハイブリダイズする”かどうかを決定するための適切な実験条件は、５
×SSC（塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム）における10分間のハイブリダイゼ
ーション（J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular C
loning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cokd Spring Harbor, New York）
について試験するために、DNAフラグメント又はRNAを含むフィルターのプレソー
キング、および５×SSC、５×Denhardt's 溶液（Sambrookなど., 1989）、0.5％
のSDS及び100μg/mlの変性され、音波処理されたサケ精子DNA（Sambrookなど. 1
989）の溶液におけるフィルターのプレハイブリダイゼーション、続いて、10ng/
mlの濃度のランダム−感作された（Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983
) Anal. Biochem. 132: 6-13）、³²P−dCTP−ラベルされた（１×10⁹cpm/μg以上の比活性）プローブを含む同じ溶液における、約45℃で12時間ハイブリダイゼ
ーションを包含する。

【００２７】次に、フィルターは、２×SSC、５％のSDSにおいて、少なくとも55℃で（低い
緊縮性）、少なくとも60℃で（中位の緊縮性）、少なくとも65℃で（中位/高い緊縮性）、少なくとも70℃で（高い緊縮性）、又は少なくとも75℃で（非常に高
い緊縮性）、30分間、２度洗浄される。オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、
X線フィルムを用いて検出される。

【００２８】ある特定のフィターゼ変異体は、特定のモデル・フィターゼが本明細書におい
て“モデル・フィターゼ”として限定されるためには、その特定のモデル・フィ
ターゼから実際調製される必要はないことが注目されるべきである。変異体は、
それがモデル・フィターゼと比較される場合、本明細書に示される修飾の少なく
とも１つの修飾を示す。

【００２９】図１の整列が、3.000のGapWeight及び0.100のGaplengthWeight で、プログラムPileUp（Program Manual for the Wisconsin Package Version 8, August 199
4, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 5
3711）を用いて製造された。新規のモデル・フィターゼ又は新規のフィターゼ変
異体を整列する場合、すべての13種の配列は、複数の整列において新規フィター
ゼ（変異体）と共に包含され得、又は他方では、図１の13種の配列の少なくとも
１つが整列においてその新規フィターゼ（変異体）と共に包含される。

【００３０】新規モデル・フィターゼ（又はフィターゼ変異体）を、図１に従って整列する
ための好ましい方法は次の通りである：新規モデル・フィターゼが、その新規モ
デル・フィターゼが最高の程度の相同性を有する、図１の13種の配列のその特定
の配列と整列される。相同性の程度を計算し、そして２種の配列の“図１に従っ
ての整列”を行うためには、下記に言及されるプログラムGAPが好ましくは使用される。２種の配列を整列した後、新規モデル・フィターゼ（又はフィターゼ変
異体）が、最初の整列（その整列により指図されるように、お互い上に同一及び
相同のアミノ酸残基を配置する）の結果を用いて、図１での整列に付加され（貼
り付けられている）、これに続いて、対応する位置が容易に同定できる。

【００３１】例７は、図１の整列に新規モデル・フィターゼをいかにして付加するか、そし
て対応するそのフィターゼ変異体をいかにして推定するかの例を示す。他のモデル・フィターゼが整列され、そして変異体が例７に類似して推定され
得る。これは特に、次のモデル・フィターゼのためである：アスペルギラスニガ
ーvar.アワモリのフィターゼ（アメリカ特許第5,830,733号）；WO98/06558号のバチルスフィターゼ；WO98/20139号の大豆フィターゼ；WO98/05785号のトウモロ
コシフィターゼ；WO97/38096号のアスペルギラスフィターゼ；WO98/13480号のモ
ナスカス・アンカ（Monascus anka）のフィターゼ；ヨーロッパ特許第0699762号
のスキワンニオミセス・オキシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）からのフィターゼ、等。

【００３２】本明細書に記載されるような整列を用いて、モデル・フィターゼ及び提案され
たフィターゼ変異体を比較する場合、対応するアミノ酸位置が同定され得、すな
わちモデル・フィターゼのモデル位置及び変異体の変異体位置−その対応するモ
デル位置及び変異体位置が単純に、整列においてお互い重ねられる。修飾は、モ
デル位置のモデルアミノ酸及び変異体位置の変異体アミノ酸が異なる場合、所定
の位置に生じたと言われる。それらの位置の好ましい修飾は、アミノ酸置換、欠
失又は付加として現れる。

【００３３】少なくとも１つの位置において修飾されたとは、１又は複数の位置において、
すなわち1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 等〜列挙されるすべてのN位
置までにおいて修飾されたことを意味する。この定義は、いずれかの可能性ある
その副組み合わせ、たとえばいずれかの組みの２つの置換、いずれかの組の3, 4
, 等の置換〜いずれかの組の（N−１）位置の置換を包含する。

【００３４】本明細書において、すべての配列は、図１の13種の配列を包含する。どんなモ
デル・フィターゼでも、フィターゼP#リシイに対応する番号付けを用いて、番号
付けられる。それらの“ペニオポラ番号”は、“整列番号”と共に、図１で示さ
れる。P#リシイの番号付けは、M1で開始し、そしてE439で終わる。上記に説明されるように、整列は、P#リシイ以外の種々のフィターゼ配列にお
ける位置が所定のP.リシイ位置に等しいか又は対応することを示す。

【００３５】アミノ酸の置換は、たとえば“３S”として本明細書において示され、これは、位置３でのアミノ酸Sが“元の”又はモデル位置３のアミノ酸に代わって置換されるべきであることを示す。従って、置換は、その対応する変異体位置でのS をもたらすべきである。現在、図１での整列を考慮すれば、たとえば“３S”のような置換は、示されるそれぞれのフィターゼに関して、次の通りに解釈される
（最初に示されるアミノ酸は、“ペニオポラ位置”３における“元の”又はモデ
ルアミノ酸である）：

【００３６】 P#インボルタス#A1： F3S (Sにより置換される番号３F) P#インボルタス#A2： L3S T#プベスセンス： M1S A#ペジアデス： MIS P#リシイ：冗長性（すでにS） A#フミガタス： T5S コンスピイA： V5S A#ニジュランス： T5S A#フィカム#NRRL3135： A5S A#テレウス： A5S T#サーモ： L5S T#ラヌギノサ： V11S M#サーモフィラ G5S

【００３７】しかしながら、次においては、上記の特定の置換が次の通りに企画されるであ
ろう（常に、ペニオポラ番号付けを用いて）： P#インボルタス#A1： F3S P#インボルタス#A2： L3S T#プベスセンス： M3S A#ペジアデス： M3S P#リシイ：冗長性（すでにS） A#フミガタス： T3S コンスピイA： V3S A#ニジュランス： T3S A#フィカム#NRRL3135： A3S A#テレウス： A3S T#サーモ： L3S T#ラヌギノサ： V3S M#サーモフィラ G3S

【００３８】さらに、たとえば“3S, F, G”のような表示は、問題のモデル・フィターゼの
位置３（ペニオポラ番号）におけるアミノ酸は、S, F又はGのいずれかにより置換され、すなわち表示“3S, F, G”は、表示“3G, 3F, 3G”に十分に等しいと思
われる。（）３Sのような表示は、アミノ酸Sがペニオポラ番号３に対応する位置におい
て、問題の配列（実際の配列におけるギャップで）に付加されることを意味し、
そして逆に欠失（S3（））に関しても同じである。

【００３９】ペニオポラ・フィターゼ配列が、図１において、たとえば位置201〜202（ペニ
オポラ番号）間での領域において、他のフィターゼの欠失よりも大きな欠失を有
する領域の場合、中間位置（他の配列におけるアミノ酸残基）は、最後のペニオ
ポラ位置番号に、小文字のa, b, c, d, 等を付加することによって番号付けされ
、たとえばフィターゼM#サーモフィラに関しては、次の通りである：E201; G201
a; P201b; Y201c; S201d; T201e; I201f; G202; D203等。

【００４０】本出願の優先権出願の１つにおいては、２つのマイナーな位置番号付けの誤り
が存在する。すなわち、上記定義によれば、204及び205（ペニオポラ番号）とし
て最初の優先権出願に言及される位置は誤って示され；それらはそれぞれ、203a
及び204として番号付けされるべきである。従って、本出願を通して、204は、20
3aにより置換され、そして205は204により置換されている。本発明の好ましいフィターゼ変異体は、１又は複数の次のアミノ酸置換を含ん
で成り、好ましくは含むアミノ酸配列を含んで成る：

【００４１】

【化８】

【００４２】好ましい態様においては、これは、モデル・フィターゼが示される位置で、上
記に提案されたアミノ酸置換、又は付加、又は欠失をすでに含まない場合に存在
する。また、個々の位置に関して、モデルアミノ酸がすでに存在しない場合、そ
れによる変異体アミノ酸が提案される。しかし、空らの条件は、“修飾された”
発現のために、実際、上記の言い方によれば、すでに固有のものであると言われ
得る。

【００４３】請求項16〜34の種々の好ましいフィターゼ変異体は、それぞれの請求項に列挙
される、１又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失を含んで成るか又は含むアミ
ノ酸配列を含んで成り、好ましくは含むか又は有する。好ましい態様においては、種々のフィターゼ変異体は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 又は10のそれらの置換；又は10〜15, 15〜20, 20〜30又は30〜50の多くの置換；結局、60, 70, 80又は90までの置換を含んで成る。

【００４４】もう１つの好ましい態様においては、種々のフィターゼ変異体のアミノ酸配列
は、この後に列挙される置換サブグループの１又は複数の置換；又は複数のサブ
グループに分類される置換の組み合わせを含んで成る。一般的に、“含んで成る”、“含む”、又は“有する”の代わりに、好ましい
変異体のアミノ酸配列は、本明細書に記載される１又は複数の置換により修飾さ
れるように、図１の特定のモデル・フィターゼ“から実質的に成り”又は“から
成る”。

【００４５】本明細書においては、担子菌網は、担子菌網の微生物を意味する。担子菌類の
この門は、たとえば子嚢菌門（“子嚢菌網”）と共に、菌類界に含まれる。分類学上の問題は、下記に列挙される文献を調べることによって、又は次のア
ドレス： HYPERLINK http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Toxonomy/tax.html.でのIn
ternet http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Toxonomy/tax.html.でのInternet on Wo
rld Wide Web を通して入手できる菌類の分類データベース（NIH Data Base (En
trez)）を調べることによって明確に得られる。

【００４６】担子菌網の定義のために、Julich, 1981, Higher Taxa of Basidiomycetes; A
insworth & Bisby's (eds.) Dictionary of the Fungi, 1995, Hawksworth, D.L
., P. M. Kirk, B. C. Sutton & D. N. Pegler; 又はHansen & Knudsen (Eds.),
Nordic Macromycetes, vol. 2 (1992) and 3 (1997) を参照のこと。好ましい文献は、Hansen & Knudsenである。一般的に、データベースを包含する上記文献において、担子菌網/子嚢菌網として分類される微生物は、本明細書における担子菌網/子嚢菌網である。

【００４７】いくつかのアスペルギラス株は、それらがアナモルフ性であるので、分類する
のには困難であり、そして従って、それらは不完全菌（Fungi Imperfecti）に分
類され得る。しかしながら、テレモルフ相対物が見出されたので、それは分類学
的に再分類される。たとえば、A. ニジュランスのテレモルフは、エメリセラ・ニジュランス（Emericella nidulans）[アスコミコタ門（Ascomycota）のトリコ
コマセアエ科（Trichocomaceae）、ユーロチアレス目（Eurotiales）、プレクト
ミセテス網（Plectomycetes）]である。アスコミコタのそれらのサブグループが
、アスコミコタ門のラシオスファエリアセアエ科（Lasiosphaeriaceae）、ソルダリアレス（Sordariales）、ピレノミセテス網（Pyrenomycetes）と共に好まし
い。

【００４８】本明細書において使用される場合、用語“子嚢菌網”及びその類似体は、アナ
モルフ性であるアスペルギラス、サーモミセス、ミセリオプソラ、タラロミセス
のいずれかの株を包含し、そして従って、不完全菌（Fungi Imperfecti）に分類
されるであろう。好ましい担子菌網フィターゼは、WO98/28409号の“発明の特定の記載”のセク
ションの開始部分に列挙されるそれらのフィターゼである。 13種の特別に列挙されるモデル・フィターゼ及び他のモデル・フィターゼをコ
ードするDNA配列は、図面の簡単な説明下に列挙される個々の資料の教授に従って調製され得る。

【００４９】モデル・フィターゼをコードするDNA配列は、当業界においてよく知られている種々の方法を用いて、問題のフィターゼを生成するいずれかの細胞又は微生物
から単離され得る。最初に、ゲノムDNA及び/又はcDNAライブラリーが、フィター
ゼを生成する生物からの染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構成されるべ
きである。

【００５０】次に、フィターゼのアミノ酸配列が知られている場合、ラベルされた相同のオ
リゴヌクレオチドプローブが合成され、そして問題の生物から調製されたゲノム
ライブラリーからフィターゼ−コードのクローンを同定するために使用され得る
。他方では、既知のフィターゼ遺伝子に対して相同の配列を含む、ラベルされた
オリゴヌクレオチドプローブが、ハイブリダイゼーション及び低い緊縮性の洗浄
条件を用いて、フィターゼ−コードのクローンを同定するためにプローブとして
使用され得る。

【００５１】フィターゼ−コードのクローンと同定するためのさらにもう１つの方法は、ゲ
ノムDNAのフラグメントを、発現ベクター、たとえばプラスミド中に挿入し、その得られるゲノムDNAライブラリーによりフィターゼ−陰性細菌を形質転換し、そして次に、フィターゼのための基質を含む寒天上に前記形質転換された細菌を
プレ−トし、それにより、同定されるフィターゼのクローンによる発現を可能に
することを包含する。

【００５２】他方では、前記酵素をコードするDNA配列は、確立された標準の方法、たとえばS. L. Beaucage and M. H. Caruthers (1981) により記載されるホスホロアミ
ジット方法、又はMatthesなど. (1984) により記載される方法により合成的に調
製され得る。ホスホロアミジット方法においては、オリゴヌクレオチドが、たと
えば自動DNA合成機により合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切なベクターによりクローン化される。

【００５３】最後に、DNA配列は、合成、ゲノム又はcDNA起原のフラグメント（適切な場合、完全なDNA配列の種々の部分に対応するフラグメント）を、標準の技法に従って連結することによって調製される、混合されたゲノム及び合成起原、混合され
た合成及びcDNA起原、又は混合されたゲノム及びcDNA起原のものであり得る。DN
A配列はまた、たとえばアメリカ特許第4,683,202号又はR. K. Saiki など. (198
8) に記載のようにして、特定のプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（PCR
）により調製され得る。

【００５４】本発明のフィターゼ変異体をコードするDNAは、当業者において知られている方法、たとえば部位特定突然変異誘発により調製され得る。興味あるモデル・フ
ィターゼをコードするDNA配列が単離され、そして突然変異のための所望する部位が同定されると、突然変異が合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。
それらのオリゴヌクレオチドは、所望する突然変異部位を端に有するヌクレオチ
ド配列を含み；変異体ヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド合成の間、挿入され
る。特定の方法においては、フィターゼ−コードの配列を架橋する、DNAの一本鎖ギャップが、そのフィターゼ−コードの遺伝子を担持するベクターに創造され
る。

【００５５】次に、所望する突然変異を担持する合成ヌクレオチドが、一本鎖DNAの相同部分にアニーリングされる。次に、残るギャップがDNAポリメラーゼI（クレノウフ
ラグメント）によりフィルインされ、そして構造体がT4リガーゼを用いて連結さ
れる。この方法の特定の例は、Morinaga など.(1984)に記載される。アメリカ特
許第4,760,025号は、カセットのマイナーな変更を行うことによって複数の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、さらに
多数の種類の突然変異が、種々の長さの複数のオリゴヌクレオチドが導入され得
るので、Morinaga の方法により一度に導入され得る。

【００５６】所望のモデル・フィターゼをコードするDNA配列中への突然変異を導入するもう１つの方法は、Nelson and Long (1989)に記載される。それは、PCR反応においてプライマーの1つとして、化学的に合成されたDNA鎖を用いることによって導
入された所望する突然変異を含むPCRフラグメントの３段階生成を包含する。PCR
−生成されたフラグメントから、突然変異を担持するDNAフラグメントが、制限エンドヌクレオチドによる切断により単離され、そして発現プラスミド中に再挿
入され得る。

【００５７】モデル・フィターゼをコードするDNA配列を突然変異誘発するためのさらにもう１つの方法は、ランダム突然変異誘発である。ランダム突然変異誘発は、問題
の示されるアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも３種の部分において、局
在化されているか又は領域特異的ランダム突然変異誘発として、又は完全な遺伝
子内で適切には行われる。モデル・フィターゼをコードするDNA配列のランダム突然変異誘発は、便利には、当業界において知られているいずれかの方法の使用により行われ得る。

【００５８】上記に関して、本発明のさらなる観点は、下記のような修飾された特徴を好ま
しくは示す、モデル・フィターゼの変異体を生成するための方法に関し、ここで
前記方法は、（a）モデル・フィターゼをコードするDNA配列を、部位特定突然変異誘発、Nel
son and Long PCR突然変異誘発方法、又はランダム突然変異誘発にゆだね、（b）段階（a）で得られた突然変異誘発されたDNA配列を、宿主細胞において発
現せしめ、そして（c）モデル・フィターゼに対して変更された性質を有するフィターゼ変異体を
発現する宿主細胞についてスクリーンすることを含んで成る。

【００５９】ランダム突然変異誘発が使用される場合、本発明の上記方法の段階（a）は好ましくは、ドーピングされたプライマーを用いて行われる。たとえば、ランダム突然変異誘発は、適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤
の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はDNA配列をPCR生成
された突然変異誘発にゆだねることによって行われ得る。さらにランダム突然変
異誘導は、それらの突然変異誘発剤のいずれかの組み合わせの使用により行われ
得る。突然変異誘発剤は、たとえばトランジション、トランスバーション、逆位
、スクランブリング、欠失及び/又は挿入を誘発する剤であり得る。

【００６０】本発明のために適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（UV）
照射、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトルソグラニジン（
MNNG）、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（E
MS）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。そのよ
うな剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、突然変異誘発が起こる適
切な条件下で、選択の突然変異誘発剤の存在下で、突然変異誘発されるべき親酵
素をコードするDNA配列をインキュベートし、そして所望する性質を有する突然変異誘発されたDNAについて選択することによって行われる。

【００６１】突然変異誘発がオリゴヌクレオチドの使用により行われる場合、オリゴヌクレ
オチドは、変更される予定である位置でのオリゴヌクレオチドの合成の間、３種
の非親ヌクレオチドによりドーピングされるか又はスパイキングされ得る。ドー
ピング又はスパイキングは、所望しないアミノ酸のためのコドンが回避されるよ
う行われ得る。ドーピング又はスパイキングされたオリゴヌクレオチドは、たと
えばPCR、LCR又はいずれかのDNAポメラーゼ及びリガーゼを用いて、いずれかの公開された技法により、フィターゼ酵素をコードするDNA中に組み込まれ得る。

【００６２】好ましくは、ドーピングは、個々の位置における野生型及び突然変異の百分率
があらかじめ決定されている“一定のランダムドーピング”を用いて行われる。
さらに、ドーピングは一定のヌクレオチドの導入のための選択、及びそれにより
、１又は複数の特定のアミノ酸残基の導入のための選択、及びそれにより、１又
は複数の特定のアミノ酸残基の導入のための選択に向けられ得る。ドーピングは
、個々の位置における90％の野生型の導入及び10％の突然変異を可能にするため
に行われ得る。ドーピングスキームの選択においての追加の考慮は、遺伝子及び
タンパク質−構造強制に基づかれている。ドーピングスキームは、中でも停止コ
ドンの導入が回避されることを確保するDOPEプログラムを用いて行われ得る。

【００６３】 PCR−生成される突然変異誘発が用いられる場合、モデル・フィターゼをコードする、化学的に処理されているか又は処理されていない遺伝子が、ヌクレオチ
ドの誤った組み込みを高める条件下でPCRにゆだねられる（Deshler 1992; Leung
nado ., Technigue Vol.1, 1989, pp.11-15）。

【００６４】 E.コリ（Flowler など., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191）、S
.セレビシアエ又はいずれか他の微生物のミューテーター（mutator）株が、たと
えば親グリコシラーゼを含むプラスミドにより、ミューテーター株を形質転換し
、前記プラスミドを有するミューテーター株を増殖し、そしてそのミューテータ
ー株から突然変異誘発されたプラスミドを単離することによって、モデル・フィ
ターゼをコードするDNAのランダム突然変異誘発のために使用され得る。従って、突然変異誘発されたプラスミドを用いて、発現生物を形質転換することができ
る。

【００６５】突然変異誘発されるべきDNA配列は便利には、モデル・フィターゼを発現する生物から調製されるゲノム又はcDNAライブラリーに存在することができる。他方
では、DNA配列は、それ自体、突然変異誘発剤と共にインキュベーションされ、又は他方では、その剤に暴露され得る、適切なベクター、たとえばプラスミド又
はバクテリオファージ上に存在することができる。

【００６６】突然変異誘発されるべきDNAはまた、宿主細胞のゲノムに組み込まれることによって、又は前記細胞に含まれる宿主細胞のゲノムに組み込まれることによって
、又は前記細胞に含まれるベクター上に存在することによって、前記宿主細胞に
存在することができる。最終的に、突然変異誘発されるべきDNAは、単離された形で存在することができる。ランダム突然変異誘発にゆだねられるべきDNA配列が好ましくは、cDNA又はゲノム配列であることは、理解されるであろう。

【００６７】いくつかの場合、発現段階 b) 又はスクリーニング段階 c)を行う前、突然変異誘発されたDNA配列を増幅することは便利である。そのような増幅は当業界において知られている方法に従って行われ得、ここで現在好ましい方法は、親酵素
のDNA又はアミノ酸配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR−生成された増幅である。

【００６８】突然変異誘発剤と共にインキュベートし、又はその剤に暴露した後、突然変異
誘発されたDNAは、発現の発生を可能にする条件下でDNA配列を担持する適切な宿
主細胞を培養することによって発現される。この目的のために使用される宿主細
胞は、任意には、ベクター上に存在する突然変異誘発されたDNA配列により形質転換された宿主細胞、又は突然変異誘発処理の間、親酵素をコードするDNA配列を担持している宿主細胞であり得る。

【００６９】適切な宿主細胞の例は、次のものである：グラム陽性細菌、たとえばバチルス
・スブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus li
cheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス
（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearoth
ermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コ
ーグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus Cir
culans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringien
sis）、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプ
トミセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）；及びグラム陰性細菌、たとえば
E.コリ。

【００７０】突然変異誘発されたDNA配列はさらに、その突然変異誘発されたDNA配列の発現
を可能にする機能をコードするDNA配列を含んで成ることができる。ランダム突然変異誘発は好都合には、局在化されたランダム突然変異誘発を用
いて、問題のモデル・フィターゼの一部に局在化され得る。それは、たとえば、
酵素の一定の領域が酵素の所定の性質のために重要であることが同定される場合
、好都合であり、そして修飾される場合、改良された性質を有する変異体をもた
らすことが予測される。そのような領域は通常、親酵素の三次構造が解明され、
そして酵素の機能に関連している場合に同定され得る。

【００７１】局在化にされた、又は領域−特異的ランダム突然変異誘発は便利には、上記の
ようなPCR生成された突然変異誘発技法、又は当業界において知られているいずれか他の適切な技法の使用により行われる。他方では、修飾されるべきDNA配列の一部をコードするDNA配列は、たとえば適切なベクター中への挿入により単離され得、そして前記部分は、続いて、上記で論じられた突然変異誘発方法のいず
れかの使用により突然変異誘発にゆだねられ得る。

【００７２】モデル・フィターゼの比活性の修飾に関しての領域−特異的ランダム突然変異
誘発のためには、図１に示されるアミノ酸配列からの次のアミノ酸残基に対応す
るコドン位置が適切に標的化され得る：残基：41-47, 68-80, 83-84, 115-118, 120-126, 128, 149-163, 184-185, 19
1-193, 198-201e, 202-203, 205, 235-236, 238-239, 242-243, 270-279, 285,
288, 332-343, 364-367, 369-375, 394; 領域：41-47, 68-80, 120-128, 149-163, 270-279, 332-343, 364-375。

【００７３】ランダム突然変異誘発は、次の段階により行われ得る：１．親酵素における修飾のための興味ある領域の選択；２．選択された領域における突然変異部位及び突然変異誘発されない部位の決
定；３．構成される変異体の所望する安定性及び/又は性能に関して、どの種類の突然変異が実施されるべきであるかの決定；４．構造的に適切な突然変異の選択；５．段階４に関して、段階３により選択された残基の調整；６．ヌクレオチド分布の適切なドープアルゴリズムの使用による分析；

【００７４】７．必要なら、たとえば停止コドンの導入を回避するために、遺伝子コードに
起因する強制を考慮して、遺伝子コードリアリズムへの所望する残基の調整；当
業者は、いくつかのコドンの組み合わせが実際、使用され得、そして適合される
必要があることを気づくであろう；８．プライマーの製造；９．プライマーの使用によるランダム突然変異誘発の実施；１０．所望する改良された性質についてスクリーニングすることによる、得ら
れたフィターゼ変異体の選択。

【００７５】段階６における使用のための適切なドープアルゴリズムは、当業界において良
く知られている。１つのそのようなアルゴリズムは、Tomandl, D.など., 1997,
Journal of Computer-Aided Molecular Design 11: 29-38により記載されている
。もう１つのアルゴリズムは、DOPE（Jensen, LJ, Andersen, KV, Svendse, A a
nd Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids Research 26: 697-702）である。

【００７６】本発明のモデル・フィターゼ又はフィターゼ変異体をコードするDNA配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグ
ナル及び任意には、リプレッサー遺伝子又は種々の活性化遺伝子をコードする制
御配列を包含する、発現ベクター、すなわち組換え発現ベクターを用いて発現さ
れ得る。

【００７７】組換え発現ベクターは、便利には、組換えDNA方法にゆだねられ得るいずれかのベクターであり得、そしてそのベクターの選択はしばしば、それが導入される
予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自主的に複製す
るベクター、たとえばプラスミド、バクテリオファージ染色体外要素であり得る
。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組
み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターであ
り得る。

【００７８】ベクターにおいては、そのDNA配列は、適切なプロモーター配列に操作可能的に連結されるべきである。プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を
示すいずれかのDNAであり、そして宿主細胞に対して相同であるか又は非相同であるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。特に、細胞宿主に
おいて、本発明のフィターゼ変異体をコードするDNA配列の転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、E.コリのlacオペロンのプロモーターである。菌類宿主における転写に関して、有用なプロモーターの例は、A.オリザエ（A. o
ryzae）TAKAアミラーゼをコードする遺伝子に由来するそれらのプロモーターである。

【００７９】本発明の発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター、及び真核生物にお
いては、本発明のフィターゼ変異体をコードするDNA配列に操作可能的に連結されるポリアデニル化配列を含むことができる。停止及びポリアデニル化配列は、
プロモーターと同じ源に由来することができる。ベクターはさらに、問題の宿主細胞においてベクター複製を可能にするDNA配列を含むことができる。そのような配列の例は、プラスミドpUC19, pACYC177, p
UB110, pE194, pAMB1及びpIJ702の複製起点である。

【００８０】ベクターはまた、選択マーカー、たとえばその生成物が宿主細胞において欠損
を補足する遺伝子、たとえばB.スブチリス又はB.リケニホルミスからのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、たとえばアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含むこと
ができる。さらに、ベクターは、アスペルギラス選択マーカー、たとえばamdS,
argB, niaD及びsCを含むことができ、又は選択は、たとえばWO91/17243号に記載
されるように、同時形質転換により達成され得る。それぞれ、フィターゼ変異体をコードする本発明のDNA構造体、プロモーター、ターミネーター及び他の要素を連結し、そしてそれらを、複製のために必要な
情報を含む適切なベクター中に挿入するために使用される方法は、当業者に良く
知られている（たとえば、Sambrook など. (1989)を参照のこと）。

【００８１】上記に定義されるような本発明のDNA構造体又は発現ベクターのいずれかを含んで成る本発明の細胞は好都合には、本発明のフィターゼ変異体の組換え生成に
おいて宿主細胞として使用される。細胞は、便利には、宿主染色体にDNA構造体（１又は複製のコピーで）を組み込むことによって、前記変異体をコードする本
発明のDNA構造体により形質転換され得る。この組み込みは、一般的には、DNA配
列は細胞において安定して維持されるので、好都合であると思われる。宿主染色
体中へのDNA構造体の組み込みは、従来の方法に従って、たとえば相同又は非相同組換えにより行われ得る。他方では、細胞は、異なったタイプの宿主細胞に関
して、上記のように発現ベクターにより形質転換され得る。

【００８２】単離されたDNA分子、又は他方では、“クローン化されたDNA配列”、“DNA構造体”、“DNAセグメント”又は“単離されたDNA配列”とは、それが複製される
であろう異なった部位にその天然の位置からDNAセグメントを再配置するために、遺伝子工学に使用される標準のクローニング方法に従ってクローン化され得る
DNA分子又は配列を言及する。前記用語は一般的に、他の核酸配列を実質的に有さない核酸配列、たとえばアガロースゲル電気泳動により決定される場合、少な
くとも約20％純粋な、好ましくは少なくとも40％純粋な、より好ましくは約60％
純粋な、さらにより好ましくは約80％純粋な、最も好ましくは約90％純粋な核酸
配列を言及する。

【００８３】クローニング方法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の
核酸フラグメントの切除及び単離、ベクター分子中への前記フラグメントの挿入
、及び核酸配列の複数のコピー又はクローンが複製されるであろう宿主細胞中へ
の組換えベクターの組み込みを包含することができる。核酸配列は、ゲノム、cD
NA, RNA, 半合成、合成起原のもの、又はそれらのいずれかの組み合わせのものであり得る。

【００８４】用語“ベクター”とは、“核酸構造体”、“DNA構造体”、“発現ベクター” 、又は“組換えベクター”としてそのような用語/目的物を包含することを意味する。核酸構造体は、制御配列と適合する条件下で、適切な宿主細胞においてコード
配列の発現を方向づけることができる１又は複数の制御配列に操作可能的に連結
される本発明の核酸配列を含んで成る。

【００８５】 “核酸構造体”は、天然に存在する遺伝子から単離されるが、又は他方では、
天然に存在しない態様で組み合わされ、そして並置される核酸のセグメントを含
むよう修飾されている、一本鎖又は二本鎖の核酸分子として、本明細書において
定義される。用語“核酸構造体”は、その核酸構造体が本発明のコード配列の発現のために
必要とされるすべての制御配列を含む場合、用語“発現カセット”と同じ意味を
表す。

【００８６】用語“コード配列”とは、本明細書において定義される場合、mRNAに転写され
、そして上記に制御配列下に配置される場合、本発明のポリペプチドに翻訳され
る配列を主に含んで成る。コード配列の境界は一般的に、5'−末端で翻訳開始コ
ドンはATG、及び3'−末端で翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、D
NA、cDNA及び組換え核酸配列を包含することができるが、但しそれらだけには限
定されない。

【００８７】用語“制御配列”とは、核酸配列のコード配列の発現のために必要であるか又
は好都合であるすべての成分を含むよう本明細書において定義される。個々の制
御配列は、ポレペプチドをコードする核酸配列に対して生来か又は外来性のもの
であり得る。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプ
チド配列、プロモーター、シグナル配列、及び転写ターミネーターを包含するが
、但しそれらだけには限定されない。最小では、制御配列は、プロモーター、及
び転写及び翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核
酸配列のコード領域を有する制御配列の連結を促進する特定の制限部位を導入す
るためのリンカーを提供され得る。

【００８８】 “宿主細胞”又は“組換え宿主細胞”は、複製の間に生じる突然変異のために
、親細胞に対して同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。 “形質転換”とは、ベクターが染色体組み込み体として、又は自己複製する染
色体ベクターとして維持されるよう、宿主細胞中に、本発明の核酸配列を含んで
成るベクターを導入することを意味する。組み込みは一般的に、核酸配列が細胞
において安定して維持されるので、好都合であると思われる。宿主染色体中への
ベクターの組み込みは、上記のように、相同又は非相同組換えにより生じること
ができる。

【００８９】宿主細胞は、単細胞微生物、たとえば原核生物、又は非単細胞微生物、たとえ
ば真核生物であり得る。真核細胞の例は、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞又は
菌類細胞である。有用な哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、子供ハムスター腎（BHK）細胞、COS細胞、又はたとえばAmerican
Type Culture Collectionから入手できるいずれかの数の他の不滅化された細胞
系を包含する。好ましい態様においては、宿主細胞は菌類細胞である。

【００９０】菌類細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及びそれ自体
知られている態様での細胞壁の再性を包含する方法により形質転換され得る。本発明はまた、本発明のフィターゼを発現し、又は生成するために、前記酵素
をコードするDNA配列により形質転換されている、トランスジェニック植物、植物の一部、たとえば植物種子又は植物細胞にも関する。また、組成物及びそのよ
うな植物又は植物の一部の使用、特に本発明の使用及び食品/飼料に請求の範囲の系統と共に、飼料及び食品又はそのための添加剤としてのその使用は、本発明
の範囲内である。

【００９１】トランスジェニック植物は、双子葉類又は単子葉類であり得る。特に興味ある
ものとしては、可能性ある食品又は飼料成分であり、そしてフィチン酸を含んで
成るそのような植物を列挙することができる。飼料成分中の通常のフィチン酸レ
ベルは、0.1−100g/kg, 又はより通常には0.5−50g/kg, 最も通常には0.5−20g/
kgである。単子葉植物の例は、草、たとえば草本（イチゴツナギ属の草、イチゴ
ツナギ・スズメノカタビラ）、飼草、たとえばウシノゲグサ・トボシガラ、ドグ
ムギ、温帯性草、たとえばヌカボ、及び穀類、たとえば小麦、オート麦、ライ麦
、大麦、イネ、モロコシ、及びトウモロコシである。

【００９２】双子葉植物の例は、マメ科植物、たとえばハウチワマメ、エンドウ、インゲン
及び大豆、及びアブラナ科（ブラシカセアエ科（brassicaceae））、たとえばハ
ナヤサイ、ナタネ及び密接に関連するモデル生物アラビドプシス・タリアナ（Ar
abidopsisi thaliana）である。そのようなトランスジェニック植物等は、それ自体のフィチン酸を分解するこ
とができ、そして従って、そのような植物を含んで成る食品又は飼料にそのよう
な酵素を添加するための必要性が緩和される。好ましくは、植物又は植物の一部
、たとえば種子は、粉末化され、又は粉砕され、そしてたぶんまた、食品又は飼
料に添加される前、又はその使用、たとえば実際の使用への酵素分解の速度を適
合せしめる観点から、その摂取の前、ソーキングされる。

【００９３】所望により、植物から生成された酵素はまた、植物からも回収され得る。ある
場合、植物からの回収は、可能性ある続くペレット化工程において、熱安定性配
合物の確保の観点から好ましい。植物の一部の例は、茎、カルス、葉、根、果物、種子、塊茎、等である。しか
し、いずれの植物組織でもまたこの定義に包含される。いずれの植物細胞でも、その組織起原が何であれ、上記植物細胞の定義に包含
される。また、そのような植物、植物の一部及び植物細胞の子孫も、本発明の範囲内に
包含される。

【００９４】当業者は、酵素が組織特異的手段で排泄されるべきであるかどうかを考慮しな
がら、問題の植物中への挿入のためのDNA発現構造体をいかにして構成するかを知っているであろう。植物の発現区画におけるフィターゼの安定性（pH安定性、
内因性プロテアーゼによる分解性、等）が、この評価のために適切である。本発
明者はまた、適切な調節配列、たとえばプロモーター及びターミネーター配列、
及び必要なら、シグナル又はトランジット配列を選択することができるであろう
（Tague など, plant, phys., 86, 506, 1988）。

【００９５】植物、植物の一部、等は、いずれかの既知方法を用いて、このDNA構造体により形質転換され得る。そのような方法の例は、ウィルス又は細菌ベクター、たと
えば本発明のフィターゼをコードする遺伝子を含むよう遺伝子的に構築されたア
グロバクテリウム属の細菌種による形質転換である。また、植物細胞又は植物中
にフィターゼDNAを直接的に導入するための方法、たとえばマイクロインジェクション及びエレクトロポレーションは、当業界において知られている（Gasser など, Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/techn. 8, 535, 1990; Shimamotoな
ど, Nature, 338, 274, 1989）。

【００９６】形質転換に続いて、形質転換体が、当業者に知られているいずれかの方法を用
いてスクリーンされ、これに続いて、それらは完全な植物に再生される。次に、それらの植物、等、並びにそれらの子孫は、それらの遺伝子手段の一部
として、フィダーゼコードのDNAを担持する。一般的に、WO9114782A号及びWO9114772A号を参照のこと。

【００９７】アグロバクテリウム・ツメファシエンス介在性遺伝子トランスファーは、トラ
ンスジェニック双子葉類を生成するための選択方法であるが（再考のためには、
Hooykas & Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38を参照のこと）、
しかしながら、それはまた、単子葉類を形質転換するためにも使用され得る。宿
主範囲限定のために、一般的に、A.ツメファシエンスの助けにより単子葉類を形
質転換することは不可能である。ここで、他の方法が使用されるべきである。ト
ランスジェニック単子葉類を生成するための選択の方法は、胚カルス又は成長胚
の粒子衝撃（形質転換DNAにより被覆された微小金又はタングステン粒子）である（Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Bi
otechnol. 5: 158-162; Vasilなど., 1992. Bio/Technology 10: 667-674）。

【００９８】また、それらの植物中への遊離DNA、たとえばウィルスベクターの供給のための他のシステム（Joshi & Joshi, 1991, FEBS Lett. 281: 1-8）、ポリエチレン
グリコール又はエレクトロポレーションを通してのプロトプラスト形質転換（再
考のためには、Potyrkus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
42: 205-225）、葉肉プロトプラスト中へのDNAのマイクロインジェクション（C
rosswafなど., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 79-85）、及び穀物植物の若木中へのDNAのマイクロインジェクション（de la Pena など., 1987, Nature 325: 2
74-276）が、好ましい方法である。

【００９９】一般的に、本発明のフィターゼ変異体をコードするcDNA又は遺伝子が、標的植
物において活性的な適切なプロモーター及び適切なターミネーター（転写の終結
）から成る発現カセットに配置される（たとえば、Pietrzakなど., 1986, Nucle
ic Acids Res. 14: 5857-5868）。このカセット（もちろん、適切な選択マーカーを包含する；下記を参照のこと）を用いて、植物を形質転換することができ、
単子葉類の場合、粒子衝撃法が使用される。

【０１００】双子葉類の場合、発現カセットがまず、アグロバクテリウム・ツメファシエン
スを形質転換する、T−DNA境界部分及び適切な選択マーカーを提供する適切なベ
クター中に配置される双子葉類が、発現カセット、及びT−DNAを端に有する選択
マーカーを有するアグロバクテリウムを通して、標準のプロトコールに従って、
形質転換されるであろう（たとえば、Akamaなど., 1992, Plant Cell Reports 1
2: 7-11）。

【０１０１】植物細胞へのアグロバクテリウムからのT−DNAのトランスファーは、最近、再
考されている（Zupan & Zambryski, 1995, Plant Physiol. 107: 1041-1047）。
アグロバクテリウムを通しての植物形質転換のためのベクターは、市販されてお
り、又はそのようなベクターを構成する多くの実験から得られる（たとえば、De
blaere など., 1985, Nucleic Acids Res. 13: 4777-4788; 再考のためには、Kl
ee など., 1987, Annu. Rev. Plant Physiol. 38: 467-486を参照のこと）。

【０１０２】入手できる植物プロモーター：操作下での方法に依存して、器官−及び/又は細胞−特異的発現及び適切な発生学的及び環境的制御が必要とされる。たとえば
、トウモロコシ内生精子、等にフィターゼcDNAを発現することが所望される。最
も通常使用されるプロモーターは、構成35S−CaMWプロモーターである（Franck など., 1980, Cell 21: 285-294）。発現は、多かれ少なかれ、完全な植物を通して等しいであろう。

【０１０３】このプロモーターは、殺菌−及び病原体−耐性植物を構築するために都合良く
使用されて来た（再考のためには、Stitt & Sonnewald, 1995, Annu. Rev. Plan
t Physiol. Plant Mol. Biol. 46: 341-368を参照のこと）。器官−特異的プロモーターが、貯蔵シンク（sink）組織、たとえば種子、トマト塊茎及び果物のた
めに（Edward & Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24: 275-303）、及び代謝シンク組織、たとえば分裂組織のために（Itoなど., 1994, Plant Mol. Biol. 2
4: 863-878）、報告されている。

【０１０４】形質転換された宿主細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞
を増殖するために適切ないずれかの従来の培地であり得る。発現されたフィター
ゼは便利には、培養培地中に分泌され得、そしてそれから、良く知られている方
法、たとえば遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離し、塩、たとえば硫酸
アンモニウムにより培地のタンパク質性成分を沈殿せしめ、続いて、クロマトグ
ラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様の手段により処理することによっ
て、回収され得る。

【０１０５】好ましい宿主細胞は、フサリウム（Fusarium）、ハンセヌラ（Hansenula）、トリコダーマ（Trichoderma）又はアスペルギラス（Aspergillus）の株、特にフ
サリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フサリウム・ベネナタム
（Fusarium venenatum）、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、PCT
/US/95/07743号にさらに記載されるような、フサリウムATCC 20334号の同一の特
徴を有するフサリウムsp. ハンセヌラ・ポリモーファ（Hansenula polymorpha）
、トリコダーマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）又はトリコダーマ・リセイ（Trichoderma reesei）、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・
オリザエの株である。

【０１０６】ハンセヌラ・ポリモーファにおける発現についての文献は次のものである：Ge
llissen, G., Piontek, M., Dahlems, U., Senzelewski, V., Gavagan, J. E.,
DiCosimo, R., Anton, D. I. & Janowicx, Z. A. (1996) Recombinant Hansenul
a Polymorpha as a biocatalyst: coexpression of the spinach glycolate oxi
dase (GO) and the S. cerevisiae catalase T(CTT1) gene. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 46. 46-54。本発明のフィダーゼ変異体のいくつかのより特定の使用は、PCT/DK97/00568号
、すなわち、発明のセクションの特定の記載の最後のページから明白である。

【０１０７】好ましい態様においては、本発明のフィターゼ変異体は、他の非フィターゼポ
リペプチドを実質的に有さず、たとえばSDS−PAGEにより決定される場合、少なくとも約20％純粋、好ましくは少なくとも約40％純粋、より好ましくは約60％純
粋、さらにより好ましくは約80％純粋、最も好ましくは約90％純粋、及びさらに
最も好ましくは約95％純粋である。時々、そのようなポリペプチドは、他方では
、“精製された”及び/又は“単離された”フィターゼとして言及される。

【０１０８】本発明のフィターゼ変異体を含んで成るフィターゼポリペプチドは、もう１つ
のポリペプチドがポリペプチド又はそのフラグメントのN−末端又はC−末端で融
合される、融合されたポリペプチド又は切断できる融合ポリペプチドを包含する
。融合されたポリペプチドは、本発明のフィターゼ変異体をコードする核酸配列
（又はその一部）に、もう１つのポリペプチドをコードする核酸配列（又はその
一部）を融合せしめることによって生成される。融合ポリペプチドを生成するた
めの技法は、当業界において知られており、そしてポリペプチドをコードするコ
ード配列が読み取り枠を整合して存在し、そして融合されたポリペプチドの発現
が同じプロモーター及びターミネーターの制御下に存在するよう、それらのコー
ド配列を連結することを包含する。

【０１０９】それぞれ、“飼料”及び“食品”とは、いずれかの天然又は人工的な食物、食
事又は同様のもの、又はそれぞれ動物及びヒトにより食べられ、摂取され、消化
されるために意図された又は適切なそのような食事の成分を意味する。本発明のフィターゼ変異体は、インビトロ又はインビボで、すなわちそれぞれ
、摂取する前、又は個人の胃において、その効果を発揮することができる。また
、組み合わされた作用が可能である。本発明のフィターゼ組成物の常に、本発明の少なくとも１つのフィターゼを含
んで成る。

【０１１０】一般的に、フィターゼ組成物は、液体又は乾燥形で存在する。液体組成物は好ましくは、高く精製された形で、フィターゼ酵素以外の何も含
む必要はない。しかしながら、通常、安定剤、たとえばグリセロール、ソルビト
ール又はモノプロピレングリコールがまた添加される。液体組織物はまた、他の
添加剤、たとえば塩、砂糖、保存剤、pH−調整剤、タンパク質、フィチン酸塩（
フィターゼ基質）を含むことができる。典型的な液体組成物は、水性又は油−基
材のスラリーである。液体組成物は、その任意のペレット化の後、食品又は飼料
に添加され得る。

【０１１１】乾燥組成物は、噴霧−乾燥された組成物であり得、この場合、組成物は乾燥形
で酵素以外の何も含む必要はない。しかしながら、通常、乾燥組成物は、たとえ
ば食品又は飼料成分と共に容易に混合され得、又はより好ましくは、プレ混合物
の成分を形成する、いわゆる粒質物である。酵素粒質物の粒子サイズは好ましく
は、混合物中の他の成分の粒子サイズと適合する。これは、たとえば動物飼料中
への酵素の導入の安全且つ便利な手段を提供する。

【０１１２】凝集粒質物は、剪断ミキサー（たとえば、Lodige）により凝集技法を用いて調
製され、この間、充填材料及び酵素が粒質物を形成するために同時凝集される。
吸収性粒質物は、酵素を吸収し/酵素により被覆されるキャリヤー材料のコアを有することによって調製される。典型的な充填材料は、塩、たとえば硫酸二ナトリウムである。他の充填剤は、
カオリン、タルク、珪酸マグネシウムアルミニウム及びセルロース繊維である。
任意には、結合剤、たとえばデキストリンはまた、凝集粒質物に含まれる。典型的なキャリヤー材料は、スターチ、たとえばタピオカ、トウモロコシ、ジ
ャガイモ、米及び小麦の形で存在する。塩もまた使用され得る。

【０１１３】任意には、粒質物は、被覆混合物により被覆される。そのような混合物は、被
覆剤、好ましくは疎水性被覆剤、たとえば水素化されたヤシ油及び牛脂、及び所
望には、他の添加剤、たとえば炭酸カルシウム又はカオリンを含んで成る。さらに、フィターゼ組成物は、他の置換物、たとえば着色剤、芳香化合物、安
定剤、ビタミン、鉱物、他の飼料又は食品増強酵素、すなわち飼料/食品の栄養性質を増強する酵素、等を含むことができる。

【０１１４】 “食品又は飼料添加剤”は、食品又は飼料への添加のために意図されるか又は
そのために適切な、実質的に純粋な化合物又は多成分組成物である。特に、それ
は、その意図された使用により、食品又は飼料生成物の成分になり、又は食品又
は飼料生成物のいずれかの特徴に影響を及ぼす物質である。それは、上記フィタ
ーゼ組成物について示されるように構成される。典型的な添加剤は通常、１又は
複数の化合物、たとえばビタミン、鉱物又は飼料増強酵素及び適切なキャリヤー
及び/又は賦形剤を含んで成る。

【０１１５】好ましい態様においては、本発明のフィターゼ組成物はさらに、有効量の１又
は複数の飼料増強酵素、特に、下記酵素から成る群から選択された飼料増強酵素
を含んで成る：α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、特にラクターゼ
、他にフィターゼ、β−グルカナーゼ、特にエンド−β−1, 4−グルカナーゼ、
及びエンド−β−1, 3 (4)−グルカナーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、ガラ
クタナーゼ、特にアラビノガラクタン、エンド−1, 4−β−カラクトシダーゼ及
びアラビノガラクタン、エンド−1, 3−β−ガラクトシダーゼ、エンドグルカナ
ーゼ、特にエンド−1, 2−β−グルカナーゼ、エンド−1, 3−α−グルカナーゼ
、及びエンド−1,3−β−グルカナーゼ、

【０１１６】ペクチン分解酵素、特にペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリア
ーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラム
ノガラクツロナン、アセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナン−α−ラムノ
シダーゼ、ペクテートリアーゼ、及びα−ガラクツロニシダーゼ、マンナナーゼ
、β−マンノシダーゼ、マンナンアセチルエステラーゼ、キシランアセチルエス
テラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アラビノキシラナーゼ及び脂質分解酵
素、たとえばリパーゼ、ホスホリパーゼ及びクチナーゼ。

【０１１７】本発明の動物飼料添加剤は、食事の前又は同時に、単一の胃の動物に補充され
る。好ましくは、本発明の動物の飼料添加剤は、食事と同時に、単一の胃の動物
に補充される。より好ましくは態様においては、動物飼料添加剤は、粒質物又は
案的化された液体の形で食事に添加される。食品又は飼料におけるフィダーゼの有効量は、約10-20,000, 好ましくは約10-
15,000, より好ましくは約10-10,000, 特に約100-5,000, 特に約100-約2,000 FY
T/kg飼料又は食品である。

【０１１８】本発明のフィターゼの他の特定の使用の例は、大豆加工（soy processing）及
びイノシトール又はその誘導体の製造においてである。本発明はまた、動物排泄物におけるフィチン酸塩レベルを低めるための方法に
も関し、ここで動物は有効量の本発明のフィターゼを含んで成る飼料を供給され
る。

【０１１９】食品又は飼料調製物又は添加剤の調製の間、本発明のフィターゼの使用がまた
、本発明に包含され、すなわちフィターゼは単なるその製造の間、そのフィター
ゼ活性を発揮し、そして最終食品又は飼料生成物において活性的でない。この観
点は、ドウ製造及びベーキングにおいて適切である。本発明は、図１に従って整列される場合、P−リシンに対応する位置番号付けを用いれば、次の位置：

【０１２０】

【化９】の少なくとも１つにおいて、モデル・フィターゼに比較して、修飾されているフ
ィターゼ変異体に関する。

【０１２１】それらの変異体から、本発明者は、修飾された特徴、好ましくは修飾された活
性特徴を予測する。実際、いくつかの変異体に関して、そのような修飾された特
徴はすでに示されている（実験部分を参照のこと）。上記のように、“修飾され
た”とは、モデル・フィターゼに比較される場合を意味する。“修飾された活性
特徴”とは、次のものに関連する（非独占的な列挙）少なくとも１つのフィター
ゼ活性における修飾を意味する：pH安定性、温度安定性、pHプロフィール、温度
プロフィール、比活性（特に、pH及び温度に関して）、基質特異性、基質分解パ
ターン、基質結合、位置特異性、トウモロコシからのホスフェートの開放速度及
びレベル、反応速度、フィチン酸塩分解速度、及び開放されるホスフェートの達
成レベル。

【０１２２】好ましい修飾された活性特徴は、好ましくは高められた、及び好ましくはpH3,
4, 5又は6で高められた、修飾された比活性；修飾されたpH又は温度プロフィー
ル；及び/又は修飾された、好ましくは高められた熱安定性、たとえばDSCを用い
て測定される場合、高められた溶融温度である。

【０１２３】好ましいフィターゼ変異体は、図１に従って整列される場合、P#リシルに対応
する位置番号付けを用いれば、次の位置： 43; 44; 47; 51; 58; 62; 78; 80; 83; 88; 90; 102; 143; 148; 153; 154; 1
86; 187a; 195; 198; 201e; 204; 205; 211; 215; 220; 242; 244; 251e; 260;
264; 265； 267; 270; 273; 278; 302; 336; 337; 339; 352; 365; 373; 383k;
404; 417の少なくとも1つにおいて、モデル・フィターゼに比較して、修飾されているフィターゼ変異体である。

【０１２４】 A#フミガタスの次の変異体がサブグループを構成する：Q43L；Q270L; G273D,
K; N336S; A205E; Y278H; Q43L+Q270L; Q43L+Q270L+G273D; Q43L+Q270L+G273D+N
336S; G273K+A205E; G273K+A205E+Y278H（ヨーロッパ特許0897010号を参照のこと）。一般的に、本発明の変異体は、次の通りに推定され又は固定され得る：図１に
従って整列を調べ、２種の配列（その１つは改良された性質を有するモデル・フ
ィターゼである）を比較し、適切な位置/領域におけるアミノ酸差異を同定し、そして適切な位置におけるアミノ酸をモデル・フィターゼ配列からの他のフィタ
ーゼ配列にトランスファーする（位置する）。

【０１２５】本発明はまた、上記方法を包含し、そしてさらに、対応するDNA配列の推定及び合成、宿主細胞の形質転換、宿主細胞の培養、及びフィターゼ変異体の回収を
包含する、フィターゼ変異体の調製方法にも関する。適切な位置/領域は、重要なフィターゼ活性特徴、たとえば比活性、熱安定性、pH活性/安定性に関して下記に言及されるそれらを包含する。

【０１２６】本発明はまた、得ることができ、好ましくは上記に概略された方法により得ら
れ、そして修飾された特徴/性質を示すことが予測され、好ましくはそのような修飾された特徴、たとえば改良された比活性を示す、フィターゼ変異体（本明細
書において定義されるようなモデル・フィターゼに従って変更された）にも関す
る。少なくとも、担子菌網モデル・フィターゼP#リシイ及びT#プベスセンスは、高
い比活性（本明細書における例２の方法を用いて決定される場合）を示す。

【０１２７】これは、推定方法、たとえば上記に言及される１つの方法によれば、他のフィ
ターゼ、たとえば図１に列挙される他のフィターゼ、特にA#ペジアデスフィター
ゼ及び子嚢菌網フィターゼ、たとえばA#フミガタス、A#フィカム、コンスフィA フィターゼにトランスファーされ得る所望の性質の例である。従って、修飾された比活性、特に低いpH及び/又は高い温度での改良された比活性は、適切な領域、すなわち（i）活性部位割れ目に向けられるアミノ酸残基；又は（ii）それらの活性部位残基に密接に隣接するアミノ酸残基において修飾
されている変異体から予測される。好ましくは、密接に隣接するとは、活性部位
残基から10Å以内を意味する。

【０１２８】 pdbファイル1THP（Brookhaven Database entry of 18.03.98 re 1THP, Struct
ure of Phosphomonoesterase, D. Kostrewa; 又はNature Structural Biology,
4, 1997, P. 185-190 に公開される）から、活性部位領域が、Molecular Simula
tions MSI, San Diego, CaliforniaからのプログラムINSIGHTIIを用いて同定され得、そしてサブセットコマンドを用いてA.フィカムフィターゼにおけるH59, D
339及びR58（それぞれ、ペニオポラ番号H71, D335及びR70に対応する）として定
義される、触媒残基に隣接して存在するそれらのアミノ酸残基を含んで成る“活
性部位シェル”が定義され得る。“活性部位シェル（10Å）”は、上記触媒残基
から10Å以内に存在するそれらの残基を包含する。

【０１２９】 H71及びD335から10Å以内の残基は次のものである（ペニオポラ番号を用いて）：41-47, 68-77, 115-118, 120-126, 128, 149-163, 185, 191-193, 199, 243
, 270-271, 273-275, 277-279, 288, 332-343, 364-367, 369-375, 394（“活性
部位シェル（10Å）”）。好ましくは、基質結合部位に非常に接近して存在し、そして従って、基質と接
触して存在することが予測され得るそれらの残基を含んで成る“基質結合シェル
”がまた、定義され得る。

【０１３０】この情報は、活性部位割れ目（活性部位の表面を補足する残基）中に、フィチ
ンに対する糖類似体をドッキングすることによって、上記のようにして推定され
得る。いずれのホスフェート基も有さない糖、たとえばα−D−グルコース（いす型配座、ISNIGHTIIプログラムにより提供される構造）が、下記に示されるような固定された距離を用いて、活性部位割れ目中にドッキングされる場合、活性
部位割れ目に向けられる残基は、前記サブセットコマンドを用いて、及び残基類
似体から10Åの距離を用いて抽出され得る。他方では、化合物イノシトール−1,
4, 5−三リン酸（Brookhavenデータベースファイルldjx. イノシトール−1, 4,
5−三リン酸）が、活性部位割れ目中にドッキングされ得る。しかしながら、こ
の化合物及びグルコースは、多かれ少なかれ、重ね合わすことができる。

【０１３１】 α−D−グルコースの位置６における酵素原子から下記原子までの距離（Å）は次の通りである： H59の原子ND1： 5.84 R58の原子NH2： 6.77 R142の原子NH2： 5.09 N340の原子ND2： 3.00 H59の原子ND1： 7.76 R58の原子NH2： 8.58 （上記残基のペニオポラ番号は、それぞれH71, R70, R155, N336, H71及びR70で
ある）。

【０１３２】この手段においては、基質と接触する残基は次の通りに同定される（ペニオポ
ラ番号）：43-44; 70-80; 83-84; 115; 153; 155-156; 184; 191-192; 198-202;
205; 235; 238; 242; 270; 272-273; 275-277; 332-336; 338; 369; 371（“基
質結合シェル（10Å）”）。１又は複数の（１）活性部位シェル又は（２）基質結合シェルにおいて修飾さ
れる変異体は、修飾された比活性を有することが強く予測される。これは、次の
位置の連結グループを導く（ペニオポラ番号及び10Åのシェル）：41-47, 68-80
, 83-84, 115-118, 120-126, 128, 149-163, 184-185, 191-193, 198-201e, 202
-203, 205, 235-236, 238-239, 242-243, 270-279, 285, 288, 332-343, 364-36
7, 369-375, 394。

【０１３３】活性部位シェル及び基質結合シェルは図１の担子菌網モデル・フィターゼを用
いて、上記のようにして定義され、好ましくは、ペニオポラフィターゼが好まし
いモデルである。他のモデル・フィターゼの対応する変異体の推定は、図１の整
列を用いて可能である。好ましい態様においては、５Åの距離が前記サブセットコマンドに従って使用
され、従ってより限定されたサイズの活性部位及び基質結合シェルを定義し、た
とえば活性部位シェルは次の残基を含んで成る：43-44, 69-74, 117, 125, 155-
156, 159, 274, 332-340, 370-374（H71及びD335から5Å）、“活性部位シェル（５Å）”。

【０１３４】一般的に、活性部位シェル及び基質結合シェル領域は、ランダム突然変異誘発
領域を選択するための基礎を形成する。好ましいランダム突然変異誘発領域の例
は、次の通りである：領域69-74, 332-340, 370-374, 付加されるドーピング（５Åの接近）；及び領域57-62, 142-146, 337-343, 付加されるドーピング（10Åの接近）。それらの位置のいずれかの位置におけるいずれかの修飾が、たとえば修飾され
た比活性の修飾された特徴のフィターゼを導くであろうことが現在企画される。

【０１３５】上記表現、“それらの位置のいずれかの位置におけるいずれかの修飾”とは、
たとえば上記のサブグループ41-47に関して次の通りに、個々の位置及び個々の置換の列挙に十分に等しいと思われる：

【化１０】

【０１３６】好ましい態様においては、修飾された比活性は、次の変異体から予測される：

【化１１】

【０１３７】特に好ましい変異体は次の通りである：78S; 79G; 80A; 83I, Q; 84Q, V; 198
A, N; 200G, V; 201D; 1又は複数の201a, 201b, 201c, 201d, 201e, 201fの欠失
−好ましくは、すべての欠失；202S, 205Q, E; 235Y, L; 238L, M; 242P, 273D;
275F, Y。他の特に好ましい変異体は次の通りである：43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L
, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y; 特に43M, P; 75W, F; 80K; 153D; 184Q, S;
270Y, A; 332F; 369I, L。

【０１３８】次の変異体が特に好ましい：43L, G, N, V, A, I, T; 78D; 153Y; 154G; 270L
; 273D, K。二重及び三重変異体（43L/270L）; (43L/270L/273D); (43L/78D) 及
び（43L/153Y/154G）がまた特に好ましい。他の好ましい変異体は、205E; 278H;
336Sである。それらの特に好ましい単一、二重及び三重変異体は、好ましくは図１に整列さ
れ得るモデル・フィターゼの変異体、特に図１に列挙される特定モデル・フィタ
ーゼの変異体である。

【０１３９】少なくともコンスフィAは、高い熱安定性を有することが知られている。さらに、P#リシイの熱安定性がむしろ高い。これは、推定方法、たとえば上記に言及される１つの方法により、他のフィタ
ーゼ、たとえば図１に列挙される他のフィターゼ、特に担子菌網フィターゼ、た
とえばP#リシイ及びA#ペジアデスにトランスファーされ得る所望する性質の例で
ある。

【０１４０】修飾された熱安定性、特に改良された熱安定性が、次の変異体からこのバック
グラウンドに基づいて予測される：

【化１２】修飾された熱安定性の次の変異体が特に好ましい：39S; 40N; 47Y, F; 51A; 8
3A; 195T; 204V; 211L; 242P, 265A。

【０１４１】修飾された熱安定性のさらなる変異体は次のものである：

【化１３】フィターゼに改良された熱安定性を付与することが予測され得る本発明のほか
の概念は、次の通りである−（前に言及された１IHP構造を考慮し、そして本明細書に概略されるように図１に従っての整列を通してトランスファーする）：（A）プロリン特殊二面角が満たされ、そして水素網状結合が阻害されず、そして立体的クラッシュが観察されない、空間位置へのプロリン残基の導入；（B）孔の充填：内部キャビティーにおけるより大きな残基に代わる置換により、安定性の改良がしばしば得られる。

【０１４２】（C）シスチン架橋：シスチン架橋がしばしば、タンパク質をより硬質にし、そして変性のエネルギーを高めるであろう。修飾された熱安定性が（A）〜（C）のそれらの概念に従って予測されるさらな
る変異体は次の通りである：27P, 31Y, 132F, 132I, 132L, 184P, 186P, 190P,
280P, 343F, 343I, 343L, 349P, 362P及び（33C及び24C）。概念（A）：27P, 184P, 186P, 190P, 349P, 362P。概念（B）：343F, I, L; 31Y; 132F, I, L; 273F。概念（C）：33C/24C。

【０１４３】修飾された、特に改良されたpH活性又は安定性、好ましくは、特に低いpHでの
安定性が、図１に従って整列し、そして改良されたpHプロフィールのモデルから
ほかのフィターゼにトランスファーすることによって、トランスファーされ得る
もう１つの所望の性質である。低いpHでの改良された安定性をフィターゼに付与することが予測され得る本発
明のほかの概念は、次の通りである−（前に言及された１IHPを考慮し、そして本明細書に概略されるように図１に従っての整列を通してトランスファーする）
：

【０１４４】（D）表面電荷：負又は正のクラスターを回避し、そして密接し過ぎる同じ荷電された残基を回避するために、低いpHでの良好な分布。（E）脱アミノ反応の阻止：負の荷電された残基に密接して接触する表面暴露されたQ又はN。低いpHで改良されたpH安定性/活性を有するフィターゼ変異体は次のものであることが予測される：39H; 39Q; 80A; 203R; 271N; 51R; 154S; 185S; 194S, 19
4T; 288L; 288I; 288F; 360R; 173Q, S; 204Q, S; 303K, S; 81Q, E。概念（D）：203R, 271N, 51R, 185S, 360R; 173Q, S; 204Q, S; 303K, S; 81Q
, E。概念（E）：154S; 194S, T; 288L, I, F。

【０１４５】（D）及び（E）のそれらの概念のための好ましいモデル・フィターゼは、P#ピ
チイである。次のものが低められたpH最適性を有することが実験的に証明されている：子嚢
菌網フィターゼ、特にA#フミガタス及びコンスフィAの変異体80A。特に好ましい単一、二重、及び三重変異体は、34L; (43L/270L) 及び（43L/27
0L/273D）である。それらの変異体は、荷電されたpHプロフィールを有する。それらは好ましくは、図１に列挙される特定のモデル・フィターゼの変異体である
。

【０１４６】上記に列挙されるすべての好ましい変異体に関しては：安定性が好ましくは、高温で、すなわち50〜100℃、特に60〜90℃、より好ましくは70〜90℃の温度範囲で修飾され；活性が好ましくは、動物の胃腸系での使用のために適切な温度範囲、たとえば
30〜40℃、より好ましくは32〜38℃、最も好ましくは35〜38℃の範囲で修飾され
；安定性が好ましくは、低いpH、すなわちpH1.5〜７、好ましくはpH２〜６、より好ましくはpH３〜５のpH範囲で修飾され；活性が好ましくは、pH1.5〜5.5, より好ましくはpH2.5〜4.5, さらにより好ま
しくはpH３〜５のpH範囲で修飾される。

【０１４７】修飾されたフィターゼ特徴、たとえば上記に言及されるそれらの特徴について
の試験は、当業界において良く知られており、そしていずれかのそのような試験
が、フィターゼモデルとフィターゼ変異体との性能を比較するために使用され得
る。比活性についての好ましい試験は例２に与えられる。pH及び温度活性及び安定
性についての好ましい試験が、例３に与えられる。熱安定性についてのさらによ
り好ましい試験は、例４のDSC方法である。

【０１４８】 WO98/28409号は、種々の他のパラメーター、たとえば位置特異性についての試
験を開示する。WO98/28409号のすべての試験は、好ましい試験である。一般的に、もちろんすべてのそれらの試験は、所望するpH値及び温度で行われ
得る。従属クレイムにおいては、13種の本明細書に特異的に開示されるモデル・フィ
ターゼのうち５種のフィターゼに基づいてのいくつかの好ましいフィターゼ変異
体が特定される。

【０１４９】類似する手段で、残る８種の特異的に開示されるモデル・フィターゼに基づい
ての他の好ましい変異体は、提案された修飾と図１の個々の対応する配列とを組
合すことによって容易に推定され得る。それらの好ましい変異体は特に、本発明
において包含され、そしてそれらは容易に推定され、すなわち次のものを列挙す
ることができる：パキシラス、好ましくはパキシラス・インボルタスに由来する、好ましくはCB
S100231株に由来するモデル・フィターゼの変異体、好ましくはP#インボルタス#
A1の変異体（その配列は図２に示される）、前記変異体は、次の修飾の少なくと
も１つを含んで成る：

【０１５０】

【化１４】

【０１５１】パキシラス属の種、好ましくはパキシラス・インボルタス種に由来する、好ま
しくはCBS100231株に由来するモデル・フィターゼの変異体、好ましくはP#インボルタス#A2の変異体（その配列は図３に示される）、前記変異体は、次の修飾の少なくとも１つを含んで成る：

【０１５２】

【化１５】トラメテス属の種、好ましくはトレメテス・プベスセンス種に由来する、好ま
しくはCBS100232株に由来するモデル・フィターゼの変異体、好ましくはT#プベスセンスの変異体（その配列は図４に示される）、前記変異体は、次の修飾の少
なくとも1つを含んで成る：

【０１５３】

【化１６】

【０１５４】アスペルギラス属の種、好ましくはアスペルギラス・ニジュランス種に由来す
る、好ましくはDSM9743株に由来するモデル・フィターゼの変異体、好ましくはA
#ニジュランスの変異体（その配列は図10に示される）、前記変異体は、次の修飾の少なくとも１つを含んで成る：

【０１５５】

【化１７】

【０１５６】アスペルギラス属の種、好ましくはアスペルギラス・テレウス種に由来する、
好ましくはCBS220.95株に由来するモデル・フィターゼの変異体、好ましくはA# テレウスの変異体（その配列は図12に示される）、前記変異体は、次の修飾の少
なくとも１つを含んで成る：

【０１５７】

【化１８】

【０１５８】タラロミセス属の種、好ましくはタラロミセス・サーモフィラス種に由来する
、好ましくはATCC20186又はATCC74338株に由来するモデル・フィターゼの変異体
、好ましくはT#サーモの変異体（その配列は図13に示される）、前記変異体は、
次の修飾の少なくとも１つを含んで成る：

【０１５９】

【化１９】

【０１６０】サーモミセス属の種、好ましくはサーモミセス・ラヌギノサス種に由来する、
好ましくはDBS586.94株に由来するモデル・フィターゼの変異体、好ましくはT# ラヌギノサの変異体（その配列は図14に示される）、前記変異体は、次の修飾の
少なくとも１つを含んで成る：

【０１６１】

【化２０】

【０１６２】ミセリオプソラ属の種、好ましくはミセリオプソラ・サーモフィラ種に由来す
る、好ましくはATCC48102又はATCC74340株に由来するモデル・フィターゼ変異体
、好ましくはM#サーモフィラの変異体（その配列は図７に示される）、前記変異
体は、次の修飾の少なくとも１つを含んで成る：

【０１６３】

【化２１】

【０１６４】本発明はまた、グラドリニウム株、すなわちグラドリニウム・フォエカンジシ
ウムから誘導された新規フィターゼを提供する。従って、本発明はまた、フィタ
ーゼ活性を有し、そして配列番号２又はその成熟部分（アミノ酸番号16〜495）を含んで成るポリペプチド；又はそれに対して少なくとも70%, 80%, 85%, 90%,
95%相同であるポリペプチドに関し；相同性とは、類似性、好ましくは同一性を意味し、そして上記で定義されたようなプログラムGAP及び定説を用いて決定される。

【０１６５】また、本発明は、フィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA構造体に関し、前記DNA構造体は、配列番号１又はそのヌクレオチド番号20〜70及び2
07〜1560；又はそのヌクレオチド番号20〜70及び207〜1563；又はそのヌクレオチド番号65〜70及び207〜1560；又はそのヌクレオチド番号65〜70及び207〜1563
を含んで成るDNA部分；又はそれらのヌクレオチド配列に対して少なくとも70%,
75%, 80%, 85%, 90%, 95%相同であるDNA構造体又は分子を含んで成り；前記相同
性は類似性、好ましくは同一性を意味し、そして当業界において知られているコ
ンピュタープログラム、たとえばGCGプログラムパッケージ（Program Manual fo
r the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group
, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）(Needleman, S. B. an
d Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453)に提供されるGAPを用いて決定される。

【０１６６】 DNA配列比較のための次の設定と共にGAPを使用する：5.0のGAP創造ペナルティ
ー及び0.3のGAP延長ペナルティー。本発明はまた、上記に言及された条件下で、
上記DNA配列のいずれかとハイブリダイズするDNA構造体にも関する。

【０１６７】〔実施例〕例１．フィターゼ活性の測定（FYT）フィターゼ活性を次のアッセイを用いて測定することができる： 10μlの希釈された酵素サンプル（0.1Mの酢酸ナトリウム、0.01％のTween20、
pH5.5に希釈されている）を、0.1Mの酢酸ナトリウム、0.01％のTween20、pH5.5 （pHは、フィチン酸ナトリウムを溶解した後、調節され；基質は予備加熱される
）中、５mMのフィチン酸ナトリウム（Sigma）250μl中に添加し、そして37℃で3
0分間インキュベートする。

【０１６８】反応を、10％TCA250μlの添加により停止せしめ、そして遊離ホスフェートを、100mlのモリブデート試薬（250mlに希釈された８mlの硫酸中、2.5gの (NH₄)₆M
O₇O₂₄・4H₂O）中、7.3gのFeSO₄の溶液500μlを添加することによって測定する。
750nmでの吸光度を、96ウェルのマイクロタイタープレートにおける200μlのサンプルに対して測定する。基質および酵素ブランクが包含される。ホスフェート
標準曲線がまた包含される（0〜２mMのホスフェート）。１FYTは、所定の条件下
で１分当たり１μモルのホスフェートを開放する酵素の量に等しい。

【０１６９】例２．比活性についての試験比活性を次の通りにして決定することができる：フィターゼの高く精製されたサンプルを用いる（純度は、わずか１つの成分の
存在を示すSDSポリアクリルアミドゲル上であらかじめ調べられる）。

【０１７０】フィターゼサンプルにおけるタンパク質濃度を、次の通りにして、アミノ酸分
析により決定する：フィターゼサンプルのアリコートを、排気されたガラス管に
おいて、110℃で16時間、６NのHCl, 0.1%のフェノール溶液において加水分解する。得られるアミノ酸を、製造業者の説明書に従って、操作されるApplied Bios
ystems 420A アミノ酸分析を用いて定量化する。アミノ酸の量から、加水分解さ
れたアリコートにおけるタンパク質の合計質量（及び従ってまた、濃度）を計算
することができる。

【０１７１】活性を、FYTの単位で決定する。1 FYTは、37℃でpH5.5で、１分当たりフィチン酸塩（5mMのフィチン酸塩）から１μモルの無機ホスフェートを生成する酵素の量に等しく；アッセイは、たとえば例１に記載される。比活性は、mg酵素タンパク質当たりのFYTの値である。例３．温度及びpH活性及び安定性についての試験温度及びpH活性及び安定性を次の通りにして決定することができる：種々の温度（基質の予備加熱）での例１のFYTアッセイの実施による温度プロフィール（すなわち、温度活性関係）。残留活性を測定する前、種々の温度での0.1Mのリン酸ナトリウム（pH5.5）におけるフィターゼのプレインキュベーションによる温度安定性。

【０１７２】残留活性を測定する前、40℃で１時間、pH３（25mMのグリシン−HCl）、pH4−
5（25mMの酢酸ナトリウム）、pH6（25mMのMES）、pH7−9（25mMのトリス−HCl）
で酵素をインキュベートすることによるpH−安定性。同じ緩衝液システム（50mM、基質を溶解する場合、pH再調節される）を用いて
、種々のpHでアッセイを実施することによるpH−プロフィール（すなわち、pH活
性関係）。例４．熱安定性についての好ましい試験としてのDSC 熱安定性又は溶融温度（Tm）を次の通りにして決定することができる： DSCにおいては、サンプル−細胞において一定の温度上昇を維持するために消費される熱が、対照細胞に対して測定される。一定の過熱速度を維持する（たと
えば、90℃/時）。吸熱工程（熱消費工程−たとえば、酵素/タンパク質の変性）
が、一定の温度上昇を維持するために、細胞に移行される熱の上昇として観察さ
れる。 DSCを、MicroCalからのMC2−装置を用いて行うことができる。細胞を、90℃/ 時の走査速度で90℃まで走査する前、20℃で20分間、平衡化する。0.1Mの酢酸ナ
トリウム（pH5.5）中、約2.5mg/mlのフィターゼのサンプルを負荷する。例５．修飾された活性特徴のフィターゼ変異体アスペルギラス・フミガタスモデル・フィターゼ（ATCC13073株に由来する野生型フィターゼ）の変異体を、EP98104858.0（EP-A-0897010）、例２−３及び５
に記載のようにして調製し、そしてフィターゼ活性を、その例７に記載のように
して決定した。最適pH−及び温度及び融点を、EP98113176.6（EP-A-0897985）の
例９及び10に記載のようにして決定した。表１においては、pH5.0での改良された比活性の変異体を列挙する。表２は、p
H3.0での改良された相対的活性の変異体を列挙し、そして表３は改良された熱安
定性（たとえば、DSCにより決定された最適温度）の変異体を列挙する。

【０１７３】

【表１】

【０１７４】

【表２】

【０１７５】

【表３】

【０１７６】例６．図９の子嚢菌網コンセンサス配列“コンフィス”の変異体を、EP98113176.6（
EP-A-0897985）の例４−８に記載のようにして調製した。PH−及び温度最適及び
融点を包含するフィターゼ活性を、その例９及び10に記載のようにして決定した
。

【０１７７】下記表は、修飾された活性特徴の次の変異体を列挙する：表４：pH6.0での改良された比活性の変異体；表５；修飾されたpH最適の変異体（示されるpH−最適は、最大のフィターゼ活
性が得られるpH−値（pH4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5,及び7.0から成る群から
選択される）として決定されるおおよその値である）；表６：改良された熱安定性の変異体（示差走査熱量測定（DSC）により決定されるような融点により表される）；及び表７：修飾された熱安定性の変異体（温度最適性）；“＋”又は“−”は、1 ℃までの温度最適値に対する、それぞれ正又は負の効果を示し；そして“＋＋”
及び“−−”はそれぞれ、１〜３℃間の温度最適値に対する、それぞれ正又は負
の効果を意味する。

【０１７８】

【表４】

【０１７９】

【表５】

【０１８０】

【表６】

【０１８１】

【表７】

【０１８２】

【表８】

【０１８３】例７．クラドリニウム・フォエカンジウムのフィターゼのクローニンググラドリニウム・フォエカンジウムCBS427.97からのフィターゼをコードするD
NAを、クローン化し、そしてWO98/28409号に実質的に記載のようにして、酵素を
単離し、そして精製した。

【０１８４】図15は、pA2phy8におけるHindIII/XbaIクローン化されたPCR生成物のDNA配列を示す。クローン化されたPCR生成物を、クラドリニウム・フォエカンジウムCBS
427.97 phyA遺伝子をコードするゲノム領域から増幅する。推定上のイントロンは、GT−AG規則（R. Breathnach など. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978)
pp. 4853-4857）に従って、切断−連結点の二重下線により示される。クローニ
ングのために使用される制限部位は、下線が引かれている。

【０１８５】 Signal P V1.1 予測（Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Stren Brunak an
d Gunnar von Heijne: "Identification of prokaryotic and eukaryotic signa
l peptides and prediction of their cleavage sites", Protein Engineering
10, 1-6 (1997)）によれば、酵素のシグナルペプチド部分は、アミノ酸番号１−
15に対応し、従って、成熟酵素はアミノ酸番号16−495である。

【０１８６】前記酵素は、pH7.5まで有意な活性ではないが、低いpH（pH３）での活性を伴わないで、ほぼpH６でpH最適性を示し；従って、それは、アスペルギラス・フィ
カムフィターゼに比較して、よりアルカリ性のフィターゼである。 60℃近くでの温度最適性は、pH5.5で見出された。従って、このフィターゼは、A.フィカムフィターゼよりもより熱安定性である。例８．図１に従っての新規モデル・フィターゼの整列例７に開示されるようなグラドリニウム・フォエカンジウムのフィターゼ配列
を、3,000のGAP重量及び0.100のGAPの長さ重量での、上記に言及されるGAP Vers
ion8 を用いて、図１の13種のモデル・フィターゼと比較する。完全なアミノ酸配列を比較する。M#サーモフィラフィターゼ配列は、最も相同の配列であること
が判明し、これは70.86％のC.フォエカンジウム配列に対する類似性の程度を示す。

【０１８７】さらに、上記に言及されるGAPプログラム及びパラメーターを用いて、フィターゼ配列“C#フォエカンジウム”を、“M#サーモフィラ”フィターゼに対して整
列する−図16を参照のこと。平均適合性は0.540であり；平均ミスマッチは−0.3
96であり；品質は445.2であり：長さは505であり；割合は0.914であり；ギャップは9であり；％類似性は70.860であり；％同一性は53.878であり。

【０１８８】次の段階（図17を参照のこと）においては、C#フォエカンジウムを、低部列と
して図１の整列上に貼り付け（又はそれは単純には、書かれる）、図16での整列
に従って、同一であるか（垂直線により示される）、又は類似する（１点又は２
点により示される）それらのアミノ酸残基がお互い上に配置されることを確かめ
る。配列に沿っての５つの場所で、C#フォエカンジウム配列は、図１の整列が場
所を空けない、“過剰”のアミノ酸残基を含んでなり、それらの過剰の残基は次
の列上にトランスファーされるが、しかしそれらは複数の列に包含され、そして
位置番号付け関連の文節において、前で記載したようにして番号付けされ得る（
記号a, b, c 等を用いる）。

【０１８９】次に、C#フォエカンジウムのフィターゼの対応する変異体は、図17に基づいて
、容易に推定される。C#フォエカンジウムにおいて“80K, A”及び“43T”として一般的に命名される変異体は、それぞれ“K80A”及び“Q43T”に対応する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、13種の特定のフィターゼ配列の整列（プログラムPileUp； Gapweigh
t: 3.000; GapLengthweight: 0.100に従っての複数配列の整列）である。

【図２】図２は、1997年11月28日に寄託されたパキシラス・インボルタスのCBS 100231
株に由来する第１フィターゼ（“P#インボルタス#A1”）のアミノ酸及びDNA配列
を示し；十分な長さのcDNA配列を含んで成る発現プラスミドpYES2.0を用いて、1
997年11月12日に寄託されたE.コリ株DSM11842を形質転換した（WO98/28409号を参照のこと）。

【図３】図３は、1997年11月28日に寄託されたパキシラス・インボルタスのCBS 100231
株に由来する第２フィターゼ（“P#インボルタス#A1”）のアミノ酸及びDNA配列
を示し；十分な長さのcDNA配列を含んで成る発現プラスミドpYES2.0を用いて、1
997年11月12日に寄託されたE.コリ株DSM 11843を形質転換した（WO98/28409号を
参照のこと）。

【図４】図４は、1997年11月28日に寄託されたトラメテス・プベスセンスのCBS100232 株に由来するフィターゼ（“T#プベスセンス”）のアミノ酸及びDNA配列を示し；十分な長さのcDNA配列を含んで成る発現プラスミドpYES2.0を用いて、1997年1
1月12日に寄託されたE.コリ株DSM 11844を形質転換した（WO98/28409号を参照の
こと）。

【図５】図５は、1996年12月4日に寄託されたアグロシベ・ペジアデスのCBS 900.96株に由来するフィターゼ（“A#ペジアデス”）のアミノ酸及びDNA配列を示し；十分な長さのcDNA配列を含んで成る発現プラスミドpYES2.0を用いて、1996年12月2
日に寄託されたE.コリ株DSM 11313を形質転換した（WO98/28409号を参照のこと）。

【図６】図６は、1996年12月4日に寄託されたペニオポラ・リシイのCBS 686.96株に由来するフィターゼ（“P#リシイ”）のアミノ酸及びDNA配列を示し；十分な長さのcDNA配列を含んで成る発現プラスミドpYES2.0を用いて、1996年12月4日に寄託
されたE.コリ株DSM 11312を形質転換した（WO98/28409号を参照のこと）。

【図７】図７は、EP0684313号の図２に等しく、そして1997年３月14日に再寄託されたミセリオプソラ・サーモフィラのATCC 48102株（＝ATCC 74340）に由来するフィ
ターゼ（“M#サーモフィラ”）のアミノ酸及びDNA配列を示す。

【図８】図８は、アスペルギラル・フミガタスのATCC 13073株（EP0897985号を参照のこと）に由来するフィターゼ（“A#フミガタス”）のアミノ酸及びDNA配列を示す。

【図９】図９は、子嚢菌網コンセンサスフィターゼ（本明細書においては、“コンスフ
ィA”と呼ばれる）（EP0897985号を参照のこと）のアミノ酸（“コンフィス”）
及びDNA配列を示す。

【図１０】図10は、アスペルギラス・ニジュランスのDSM9743株（EP0897985号を参照のこ
と）に由来するフィターゼ（“A#ニジュランス”）のアミノ酸及びDNA配列を示す。

【図１１】図11は、EP0420358号の図８に等しく、そしてアスペルギラス・フィカムのNRR
L−3135株に由来するフィターゼ（“A#フィカム”）のアミノ酸及びDNA配列を示
す。

【図１２】図12は、EP0684313号の図１に等しく、そしてアスペルギラス・テレウスのCBS
220.95株に由来するフィターゼ（“A#テレウス”）のアミノ酸及びDNA配列を示す。

【図１３】図13は、1997年３月14日に再寄託されたタラロミセス・サーモフィラスのATCC
20186株（＝ATCC74338）(EP0897985号を参照のこと)に由来するフィターゼ（“T
#サーモ”）のアミノ酸及びDNA配列を示す。

【図１４】図14は、WO97/35017号の図２に等しく、そしてサーモミセス・ラヌギノサスの
CBS586.94株に由来するフィターゼ（“T#ラヌギノサス”）のアミノ酸及びDNA配
列を示し；十分な長さのcDNA配列を含んで成るプラスミドを用いて、1996年２月
23日にNRRLに寄託されたE.コリDH5α（pMWR46）株B−21527を形質転換した。

【図１５】図15は、1997年１月23日に寄託された、クラドリニウム・フォエカンジウムの
CBS427.97株に由来するフィターゼ（“C#フォエカンジウム”）のアミノ酸及びD
NA配列を示し；十分な長さのcDNA配列を含んで成る発現プラスミドpYES2.0を用いて、1999年３月17日に寄託されたE.コリDSM12742株を形質転換した。

【図１６】図16は、プログラムGAP gcg（Gap重量3.000; Gap 長さ重量0.100）を用いて、
フィターゼC#フォエカンジウムとモデル・フィターゼ#サーモフィラとの整列を示す。

【図１７】図17は、C#フォエカンジウムフィターゼが図１の整列上にいかにして貼り合わ
され得るかを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ４Ｂ０６５ (31)優先権主張番号ＰＡ１９９８０１１７６ (32)優先日平成10年９月18日(1998．9．18) (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号ＰＡ１９９９０００９１ (32)優先日平成11年１月22日(1999．1．22) (33)優先権主張国デンマーク（ＤＫ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者レーマン，マーティンアメリカ合衆国，ニュージャージー 08540，プリンストン，セイヤードライブ 258 (72)発明者パサモンテス，ルイスアメリカ合衆国，ニュージャージー 07043，モンクレア，ウォーフィールドストリート８ (72)発明者トムシー，アンドレアドイツ連邦共和国，デー−79639 グレンザッハ−ビーレン，クラフトベルクシュトラーセ 45 (72)発明者ファンローン，アドルフューススイス国，ツェーハー−4310 ラインフェルデン，バルトホフシュトラーセ 15 (72)発明者フォーゲル，クルトスイス国，ツェーハー−4051 バーゼル，ウーラーシュトラーセ 41 (72)発明者ビーシュ，マルクススイス国，ツェーハー−4410 リースタル，ロタッカーシュトラーセ (72)発明者ラッセン，セレンフレンステッドデンマーク国，デーコー−2100 コペンハーゲン，リュンビイバイ 19 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA06 CA17 CA19 CB02 CD12 CD13 CD14 CD17 2B150 AC16 AD04 BB10 DD12 DF11 4B024 AA05 AA07 BA11 DA01 HA01 4B035 LC05 LC09 LG50 LG51 LP41 4B050 CC03 DD03 DD05 LL02 LL10 4B065 AA58Y AA60Y AA62Y AA71Y AA88X AB01 BA12 BA16 CA31 CA41 CA43

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】図１に従って整列される場合、P#リシイ（P#lycii）に対応する位置番号付けを用いれば、次の位置：【化１】の少なくとも1つにおいて、モデル・フィターゼに比較して、修飾されているフィターゼ変異体。
【請求項２】図１に従って整列される場合、P#リシイのフィターゼに対応
する位置番号付けを用いれば、モデル・フィターゼに比較して、次の修飾：【化２】の少なくとも１つを含んで成るフィターゼ変異体。
【請求項３】子嚢菌網（Ascomycete）フィターゼに由来する請求項１又は
２記載のフィターゼ変異体。
【請求項４】アスペルギラス（Aspergillus）フィターゼに由来する請求項３記載のフィターゼ変異体。
【請求項５】前記モデル・フィターゼが、アスペルギラス・ニガー（Aspe
rgillus niger）、アスペルギラス・フィカム（Aspergillus ficuum）、アスペルギラス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギラス・フミガタ
ス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギラス・テレウス（Aspergillus terre
us）の株である請求項４記載のフィターゼ変異体。
【請求項６】前記モデル・フィターゼが、アスペルギラス・ニジュランス
DSM9743; 又はアスペルギラス・テレウスの次の株：CBS116.46, DSM9076, CBS22
0.95のいずれかである請求項5記載のフィターゼ変異体。
【請求項７】前記モデル・フィターゼが、図10に示されるアスペルギラス
・ニジュランスのフィターゼ配列；又は図12に示されるアスペルギラス・テレウ
スのフィターゼ配列である請求項６記載のフィターゼ変異体。
【請求項８】前記モデル・フィターゼが、サーモミセス・ラヌギノサス（
Thermomyces lanuginosus）、タラロミセス・サーモフィラス（Talaromyces the
rmophilus）、又はミセリオプソラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophil
a）の株である請求項３記載のフィターゼ変異体。
【請求項９】前記モデル・フィターゼが、サーモミセス・ラヌギノサスCB
S586.94; 又はタラロミセス・サーモフィラスの次の株：ATCC 20186, ATCC 7433
8のいずれか；又はミセリオプソラ・サーモフィラの次の株: ATTCC 34625, ATCC
74340のいずれかである請求項８記載のフィターゼ変異体。
【請求項１０】前記モデル・フィターゼが、図14に示されるサーモミセス
・ラヌギノサスのフィターゼ配列；又は図13に示されるタラロミセス・サーモフ
ィラスのフィターゼ配列；又は図７に示されるミセリオプソラ・サーモフィラの
フィターゼ配列である請求項９記載のフィターゼ変異体。
【請求項１１】前記モデル・フィターゼが、子嚢菌網（Ascomycete）のコ
ンセンサス・フィターゼ配列である請求項３記載のフィターゼ変異体。
【請求項１２】担子菌網（Basidiomycete）フィターゼに由来する請求項１又は２記載のフィターゼ変異体。
【請求項１３】前記モデル・フィターゼが、パキシラス・インボルタス（
Paxillus involutus）、トラメテス・プベスセンス（trametes pubescens）、ア
グロシベ・ペジアデス（Agrocybe pediades）、又はペニオポラ・リシイ（Penio
phora licii）の株である請求項１２記載のフィターゼ変異体。
【請求項１４】前記モデル・フィターゼが、トラメテス・プベスセンスCB
S 100232又はパキシラス・インボルタスCBS 100231である請求項１３記載のフィ
ターゼ変異体。
【請求項１５】前記モデル・フィターゼが、図４のトラメテス・プベスセ
ンスフィターゼの配列；又は図２及び３のパキシラス・インボルタスフィターゼ
の配列のいずれかである請求項１４記載のフィターゼ変異体。
【請求項１６】次の修飾：【化３】の少なくとも１つを含んで成る請求項１又は２記載のフィターゼ変異体。
【請求項１７】前記モデル・フィターゼが、アスペルギラス由来のフィタ
ーゼ、好ましくはアスペルギラス・フィカム又はアスペルギラス・ニガー由来の
フィターゼである請求項１６記載のフィターゼ変異体。
【請求項１８】前記モデル・フィターゼが、アスペルギラス・フィカム（
ニガー）NRRL 3135, アスペルギラス・ニガーATCC 9142, アスペルギラス・ニガ
ーATCC 74337のいずれかに由来するフィターゼである請求項１７記載のフィター
ゼ変異体。
【請求項１９】前記モデル・フィターゼが、図11のアスペルギラス・フィ
カムフィターゼの配列である請求項１８記載のフィターゼ変異体。
【請求項２０】前記フィターゼ変異体が、次の修飾：【化４】の少なくとも１つを含んで成る請求項１又は２記載のフィターゼ変異体。
【請求項２１】アスペルギラスフィターゼに由来し、好ましくはアスペル
ギラス・フミガタスに由来するモデル・フィターゼを使用する請求項２０記載の
フィターゼ変異体。
【請求項２２】前記モデル・フィターゼが、アスペルギラス・フミガタス
の次の株：ATCC13073, ATCC32722, ATCC58128, ATCC26906又はATCC32239のいずれかに由来するフィターゼである請求項２１記載のフィターゼ変異体。
【請求項２３】前記モデル・フィターゼが、図８のアスペルギラス・フミ
ガタスフィターゼ配列である請求項２２記載のフェターゼ変異体。
【請求項２４】前記フィターゼ変異体が、次の修飾：【化５】の少なくとも１つを含んで成る請求項１又は２記載のフィターゼ変異体。
【請求項２５】前記モデル・フィターゼが、子嚢菌網（Ascomycete）のコ
ンセンサス・フィターゼである請求項２４記載のフィターゼ変異体。
【請求項２６】前記モデル・フィターゼが、図９の子嚢菌網（Ascomycete
）のコンセンサス配列“コンフィス（conphys）”である請求項２５記載のフィターゼ変異体。
【請求項２７】前記フィターゼ変異体が、次の修飾：【化６】の少なくとも１つを含んで成る請求項１又は２記載のフィターゼ変異体。
【請求項２８】前記モデル・フィターゼが、アグロシベ・ペジアデスに由
来するフィターゼである請求項２７記載のフィターゼ変異体。
【請求項２９】前記モデル・フィターゼが、アグロシベ・ペジアデスCBS
900.96に由来するフィターゼである請求項２７記載のフィターゼ変異体。
【請求項３０】前記モデル・フィターゼが、図５のアグロシベ・ペジアデ
スフィターゼの配列である請求項２９記載のフィターゼ変異体。
【請求項３１】前記フィターゼ変異体が、次の修飾：【化７】の少なくとも１つを含んで成る請求項１又は２記載のフィターゼ変異体。
【請求項３２】前記モデル・フィターゼが、ペニオポラ・リシイに由来す
るフィターゼである請求項３１記載のフィターゼ変異体。
【請求項３３】前記モデル・フィターゼが、ペルオポラ・リシイCBS 686.
96に由来するフィターゼである請求項３２記載のフィターゼ変異体。
【請求項３４】前記モデル・フィターゼが、図６のペルオポラ・リシイフ
ィターゼ配列である請求項３３記載のフィターゼ変異体。
【請求項３５】請求項１〜３４のいずれか１項記載のフィターゼ変異体を
含んで成るフィターゼペリペプチド。
【請求項３６】請求項１〜３４のいずれか１項記載のフィターゼ変異体を
コードするDNA配列を含んで成るDNA構造体。
【請求項３７】請求項３６記載のDNA構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
【請求項３８】請求項３６記載のDNA構造体又は請求項３７記載のベクターにより形質転換される宿主細胞。
【請求項３９】フィターゼ変異体の製造方法であって、請求項３８記載の
宿主細胞を、前記フィターゼ変異体の生成を可能にする条件下で培養し、そして
その培養物ブイヨンからフィターゼを回収することを含んで成る方法。
【請求項４０】請求項１〜３４のいずれか１項記載のフィターゼ変異体の
少なくとも1つを含んで成る飼料又は食品。
【請求項４１】請求項４０記載の飼料又は食品の調製方法であって、少な
くとも1つのフィターゼ変異体が前記飼料又は食品成分に添加されることを含んで成る方法。
【請求項４２】請求項１〜３４のいずれか１項記載のフィターゼ変異体の
少なくとも1つを含んで成る組成物。
【請求項４３】飼料又は食品調製物への使用のために適切である請求項４
２記載の組成物。
【請求項４４】動物飼料用添加物である請求項４２〜４３のいずれか１項
記載の組成物。
【請求項４５】動物排泄物におけるフィターゼレベルを低めるための方法
であって、請求項４０記載の又は請求項４１記載の方法により得られる飼料の有
効を動物に与えることを含んで成る方法。
【請求項４６】フィターゼ基質からリン含有物を発生せしめるためへの、
請求項１〜３４のいずれか１項記載のフィターゼ変異体；又は請求項４２〜４３
のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項４７】請求項１〜３４のいずれか１項記載のフィターゼ変異体を
発現することができるトランスジェニック植物又は植物部分。