JP2002503444A - リガンドファミリー遺伝子 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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-
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Abstract
(57)【要約】
本発明は組換えＤＮＡ技術に関連する。特に本発明は、ＴＮＦリガンドファミリーの遺伝子、及び、それがコードするタンパク質に関係する。該リガンドに結合する化合物を同定する方法、及び哺乳動物における腫瘍疾病を処置する方法に関する。
Description
【０００１】 相互参照文献 本出願は、米国仮出願第６０／０６６,５７７号(1997年11月26日出願)、及び 、米国仮出願第６０／０９６,１７３号(1998年8月11日出願)の利益を主張するも
のである。
のである。
【０００２】 発明の背景 本発明は組換えＤＮＡ技術に関連する。特に本発明は、ＴＮＦリガンドファミ
リーの遺伝子、及び、それがコードするタンパク質に関係する。該リガンドに結
合する化合物を同定する方法、及び哺乳動物における腫瘍疾病を処置する方法も
企図する。
リーの遺伝子、及び、それがコードするタンパク質に関係する。該リガンドに結
合する化合物を同定する方法、及び哺乳動物における腫瘍疾病を処置する方法も
企図する。
【０００３】 アポトーシス(即ち、プログラム細胞死)は、多細胞生物の正常な成長及び恒常
性に必須の過程である。プログラム細胞死の脱制御により、癌、神経変性性疾患
及び後天性免疫不全症候群を含む多数のヒトの疾病が引き起こされる。細胞死の
機構にはエフェクター、活性化物質、及び、ネガティブ・レギュレーターが含ま れる。ＴＮＦＲ-１及びＦａｓ(Ａｐｏ-１またはＣＤ９５としても知られる)を含
む、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)リガンドファミリー及びその同種の受容体の或るサイ
トカインは、自殺応答の古典的引き金である。ＴＮＦはサイトカインの新たなフ
ァミリーの基本的な一員であり、免疫制御及び炎症応答の優れたメディエーター
として機能する。リンフォトキシン(Ｌｔα、ＴＮＦβ)、リンフォトキシンβ( ＬＴβ)、並びに、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４-１ＢＢ、及び
、Ｆａｓ(ＡＰＯ-１)に対するリガンドを含む、8つのその他のＴＮＦファミリー
が公知である。1つの例外を除いて、全てのＴＮＦリガンドはII型膜タンパク質 であり、Ｃ-末端において相同性を有する。例外であるＬＴαは分泌タンパク質 のようであり、細胞表面-結合部分としても存在しＬＴβと呼ばれる。さらに、 タンパク質分解により処理されたＴＮＦの溶解性形体のものも研究されてきた。
性に必須の過程である。プログラム細胞死の脱制御により、癌、神経変性性疾患
及び後天性免疫不全症候群を含む多数のヒトの疾病が引き起こされる。細胞死の
機構にはエフェクター、活性化物質、及び、ネガティブ・レギュレーターが含ま れる。ＴＮＦＲ-１及びＦａｓ(Ａｐｏ-１またはＣＤ９５としても知られる)を含
む、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)リガンドファミリー及びその同種の受容体の或るサイ
トカインは、自殺応答の古典的引き金である。ＴＮＦはサイトカインの新たなフ
ァミリーの基本的な一員であり、免疫制御及び炎症応答の優れたメディエーター
として機能する。リンフォトキシン(Ｌｔα、ＴＮＦβ)、リンフォトキシンβ( ＬＴβ)、並びに、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４-１ＢＢ、及び
、Ｆａｓ(ＡＰＯ-１)に対するリガンドを含む、8つのその他のＴＮＦファミリー
が公知である。1つの例外を除いて、全てのＴＮＦリガンドはII型膜タンパク質 であり、Ｃ-末端において相同性を有する。例外であるＬＴαは分泌タンパク質 のようであり、細胞表面-結合部分としても存在しＬＴβと呼ばれる。さらに、 タンパク質分解により処理されたＴＮＦの溶解性形体のものも研究されてきた。
【０００４】 細胞外領域に、システインに富む偽反復を有することによって特徴付けられる
約12の相同な受容体の相似している(parallel)ファミリーと、ＴＮＦリガンドは
相互作用する。ＴＮＦリガンドについてと同様に、ＴＮＦ受容体はＢ細胞、Ｔ細
胞、樹状細胞及びマクロファージを含む、様々な細胞型において不定に発現され
ている。
約12の相同な受容体の相似している(parallel)ファミリーと、ＴＮＦリガンドは
相互作用する。ＴＮＦリガンドについてと同様に、ＴＮＦ受容体はＢ細胞、Ｔ細
胞、樹状細胞及びマクロファージを含む、様々な細胞型において不定に発現され
ている。
【０００５】 ＴＮＡ及びＦａｓリガンド(Ａｐｏ-１ＬまたはＣＤ９５Ｌとしても知られる) は、受容体ＴＮＦＲ-１及びＦａｓに結合することによってアポトーシスを引き 起こす。これらの受容体は、シグナル複合体の集合を媒介するドメイン(「死亡 ドメイン(death domain)」と呼ばれる)を含み、前-アポトーシスプロテアーゼの
補充を誘発する。
補充を誘発する。
【０００６】 ＴＲＡＩＬ(Ａｐｏ-２Ｌとも呼ばれる)と呼ばれる別のＴＮＦリガンドファミ リーが同定された。Ｆａｓリガンド(ＦａｓＬ)と同様に、ＴＲＡＩＬは多様な起
源からの形質転換されたセルラインの迅速なアポトーシスを引き起こす。転写産
物の存在が活性なＴ細胞に主に限定されるＦａｓＬとは違って、ＴＲＡＩＬの発
現は多くの普通のヒト組織において検出される。これは、形質転換された細胞に
対して著しい前-アポトーシスポテンシャルを持つＴＮＦリガンドファミリーの 一員に、ＴＲＡＩＬが属することを示唆している。しかしながら、ＴＮＦＲ-１ 、Ｆａｓ、または、最近同定された死亡ドメインを含む受容体ＤＲ３(Ｗｓ１-１
、Ａｐｏ-３及びＴＲＡＭＰとも呼ばれる)と結合する能力をＴＲＡＩＬが有さな
いことから、ＴＲＡＩＬが現在までのところ未知のＴＮＦ-受容体ファミリーの 一員と相互作用するであろうことが示唆される。
源からの形質転換されたセルラインの迅速なアポトーシスを引き起こす。転写産
物の存在が活性なＴ細胞に主に限定されるＦａｓＬとは違って、ＴＲＡＩＬの発
現は多くの普通のヒト組織において検出される。これは、形質転換された細胞に
対して著しい前-アポトーシスポテンシャルを持つＴＮＦリガンドファミリーの 一員に、ＴＲＡＩＬが属することを示唆している。しかしながら、ＴＮＦＲ-１ 、Ｆａｓ、または、最近同定された死亡ドメインを含む受容体ＤＲ３(Ｗｓ１-１
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いことから、ＴＲＡＩＬが現在までのところ未知のＴＮＦ-受容体ファミリーの 一員と相互作用するであろうことが示唆される。
【０００７】 発明の簡単な概要 本発明は、単離された核酸分子、及び、本明細書において「ＴＲＡＩＬＬＫ- ２」と呼ばれるＴＮＦリガンドファミリーの新規一員を提供する。組換えタンパ
ク質の産生、他の生物からのそれに対応する(orthologous)遺伝子の単離、及び ／または同じ生物からの類似の(paralogous)遺伝子の単離、染色体マッピング研
究、並びに、その生物学的活性を調節する可能性を持つ医薬化合物を同定する手
段として、該受容体タンパク質に対して結合する化合物を同定する大規模スクリ
ーニング手法が、ＴＲＡＩＬＬＫ-２のクローン化された遺伝子により可能にな る。本明細書中に記載されるタンパク質及びペプチドはまた、それ自体が有用な
治療剤であり、そして、癌を処置するための新規化合物を開発するのに有用であ
り、そして、その他にも食品添加剤として有用である。
ク質の産生、他の生物からのそれに対応する(orthologous)遺伝子の単離、及び ／または同じ生物からの類似の(paralogous)遺伝子の単離、染色体マッピング研
究、並びに、その生物学的活性を調節する可能性を持つ医薬化合物を同定する手
段として、該受容体タンパク質に対して結合する化合物を同定する大規模スクリ
ーニング手法が、ＴＲＡＩＬＬＫ-２のクローン化された遺伝子により可能にな る。本明細書中に記載されるタンパク質及びペプチドはまた、それ自体が有用な
治療剤であり、そして、癌を処置するための新規化合物を開発するのに有用であ
り、そして、その他にも食品添加剤として有用である。
【０００８】 本発明は1つの態様として、ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質をコードする単離さ
れた核酸分子に関連する。
れた核酸分子に関連する。
【０００９】 別の態様において、本発明は、配列番号１として同定されるヌクレオチド配列
を含む核酸分子に関連する。
を含む核酸分子に関連する。
【００１０】 別の態様において、本発明は、配列番号２または、その断片をコードする核酸
に関連する。
に関連する。
【００１１】 別の態様において、本発明は、配列番号２またはその断片をコードする核酸に
対して少なくとも75％相同な核酸に関連する。
対して少なくとも75％相同な核酸に関連する。
【００１２】 別の態様において、本発明は、高いストリンジェンシー条件下で配列番号１に
対してハイブリダイズする核酸であって、アポトーシスを誘導する、及び／また
は癌を処置する、及び／または癌性の腫瘍の成長を予防若しくは抑制する、及び
／または癌性の腫瘍の縮小を起こす能力のあるタンパク質をコードする核酸に関
連する。
対してハイブリダイズする核酸であって、アポトーシスを誘導する、及び／また
は癌を処置する、及び／または癌性の腫瘍の成長を予防若しくは抑制する、及び
／または癌性の腫瘍の縮小を起こす能力のあるタンパク質をコードする核酸に関
連する。
【００１３】 別の態様において、本発明は、低いストリンジェンシー条件下で配列番号１に
対してハイブリダイズする核酸であって、アポトーシスを誘導する、及び／また
は癌を処置する、及び／または癌性の腫瘍の成長を予防若しくは抑制する、及び
／または癌性の腫瘍の縮小を起こす能力のあるタンパク質をコードする核酸に関
連する。
対してハイブリダイズする核酸であって、アポトーシスを誘導する、及び／また
は癌を処置する、及び／または癌性の腫瘍の成長を予防若しくは抑制する、及び
／または癌性の腫瘍の縮小を起こす能力のあるタンパク質をコードする核酸に関
連する。
【００１４】 別の態様において、本発明は単離されたタンパク質分子、または、その機能的
断片に関連し、該タンパク質分子は、配列番号２として同定される配列を含む。
断片に関連し、該タンパク質分子は、配列番号２として同定される配列を含む。
【００１５】 さらに別の態様において、本発明は、宿主細胞において遺伝子が転写及び翻訳
されるように、遺伝子発現配列に作動可能に連結されたＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝 子(配列番号１)を組み込んだ、組換えＤＮＡベクターに関連する。
されるように、遺伝子発現配列に作動可能に連結されたＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝 子(配列番号１)を組み込んだ、組換えＤＮＡベクターに関連する。
【００１６】 また、別の態様において、本発明は、クローン化されたＴＲＡＩＬＬＫ-２遺 伝子により、該遺伝子が宿主細胞において発現されるように形質転換またはトラ
ンスフェクトされた宿主細胞に関連する。
ンスフェクトされた宿主細胞に関連する。
【００１７】 本発明はまた、本発明の核酸配列またはその断片が核酸を含む試料中に存在す
るかどうかを決定する方法であって、試料を適当なハイブリダイゼーション条件
下で本発明の核酸プローブと接触させることを含む方法を提供する。
るかどうかを決定する方法であって、試料を適当なハイブリダイゼーション条件
下で本発明の核酸プローブと接触させることを含む方法を提供する。
【００１８】 またさらに別の態様において、本発明は、癌を処置する、及び／または癌性の
腫瘍の成長を予防若しくは抑制する、及び／または癌性の腫瘍の縮小する方法に
関連する。
腫瘍の成長を予防若しくは抑制する、及び／または癌性の腫瘍の縮小する方法に
関連する。
【００１９】 発明の詳細な説明 定義 「アポトーシス」は、多細胞生物の正常な成長及び恒常性に必須のプログラム
細胞死の現象を表す。プログラム細胞死の脱制御により、癌、神経変性性疾患及
びＡＩＤＳを含む多数のヒトの疾病が引き起こされる。ＴＮＦリガンドファミリ
ーの或るサイトカインは、アポトーシスの引き金である。
細胞死の現象を表す。プログラム細胞死の脱制御により、癌、神経変性性疾患及
びＡＩＤＳを含む多数のヒトの疾病が引き起こされる。ＴＮＦリガンドファミリ
ーの或るサイトカインは、アポトーシスの引き金である。
【００２０】 本明細書において使用する「相補的」または「相補性」という用語は、プリン
またはピリミジンヌクレオチドが水素結合により結合し、二重鎖核酸分子を形成
する能力を表す。以下の塩基が相補性により関連付けられる：グアニンとシトシ
ン；アデニンとチミジン；そして、アデニンとウラシル。本明細書中において使
用する「相補的」は、2本の一本鎖核酸分子を構成する、該分子の全長に渡って 、実質的に全ての塩基対に前述の関係が適用されることを示す。「部分的に相補
的」は、2本の一本鎖核酸分子のうちの1本がもう一方よりも短く、1本の分子の 一部が一本鎖のままである上述の関係を表す。
またはピリミジンヌクレオチドが水素結合により結合し、二重鎖核酸分子を形成
する能力を表す。以下の塩基が相補性により関連付けられる：グアニンとシトシ
ン；アデニンとチミジン；そして、アデニンとウラシル。本明細書中において使
用する「相補的」は、2本の一本鎖核酸分子を構成する、該分子の全長に渡って 、実質的に全ての塩基対に前述の関係が適用されることを示す。「部分的に相補
的」は、2本の一本鎖核酸分子のうちの1本がもう一方よりも短く、1本の分子の 一部が一本鎖のままである上述の関係を表す。
【００２１】 「同型的置換」または「同型的アミノ酸置換」は、表１に規定されるような、
タンパク質またはペプチド中のアミノ酸残基(群)の1若しくはそれ以上の置換を 表す。
タンパク質またはペプチド中のアミノ酸残基(群)の1若しくはそれ以上の置換を 表す。
【００２２】 「その断片」は、配列が本明細書中に開示される核酸またはタンパク質分子の
断片、一部若しくは亜領域(sub-region)を意味し、該断片は、親タンパク質また
は核酸分子において連続した5若しくはそれ以上のアミノ酸、または、10若しく はそれ以上のヌクレオチドを含む。その断片は、生物学的活性を保持していても
、いなくてもよい。例えば、本明細書において開示されるタンパク質の断片は、
親タンパク質分子に対して特異的な抗体を生じさせる抗原として使用し得る。核
酸分子の場合、「その断片」は、親核酸そしてまた、その遺伝子暗号に基づいた
相補鎖由来の10またはそれ以上の連続したヌクレオチドを表す。例えば、断片が
、5'-ＡＧＣＴＡＧ-3'という配列を含めば、「その断片」にはまた、3'-ＴＣＧ ＡＴＣ-5'という相補的な配列も含まれる。
断片、一部若しくは亜領域(sub-region)を意味し、該断片は、親タンパク質また
は核酸分子において連続した5若しくはそれ以上のアミノ酸、または、10若しく はそれ以上のヌクレオチドを含む。その断片は、生物学的活性を保持していても
、いなくてもよい。例えば、本明細書において開示されるタンパク質の断片は、
親タンパク質分子に対して特異的な抗体を生じさせる抗原として使用し得る。核
酸分子の場合、「その断片」は、親核酸そしてまた、その遺伝子暗号に基づいた
相補鎖由来の10またはそれ以上の連続したヌクレオチドを表す。例えば、断片が
、5'-ＡＧＣＴＡＧ-3'という配列を含めば、「その断片」にはまた、3'-ＴＣＧ ＡＴＣ-5'という相補的な配列も含まれる。
【００２３】 「融合タンパク質」という用語は、2若しくはそれ以上の異なるタンパク質ま たはその断片が、1本のポリペプチド鎖上に共有結合された翻訳による融合また は酵素的融合を含み、天然では見られない雑種タンパク質分子を意味する。
【００２４】 本明細書中において使用される「機能的断片」または「機能的に均等な断片」
は、例えば、活性部位若しくは生物学的機能に関するその他のいずれかの保存モ
チーフを含む、領域、または、全長タンパク質の断片、または、アミノ酸配列を
表す。機能的断片は、本明細書中で開示される全長タンパク質と実質的に似たよ
うな生物学的活性を、イン・ビボまたはイン・ヴィトロで提供する能力、即ち、ア
ポトーシスを促進する能力を持つ。機能的断片はクローニング技術によって、ま
たは、別のスプライシング機構による天然産物として製造され得る。
は、例えば、活性部位若しくは生物学的機能に関するその他のいずれかの保存モ
チーフを含む、領域、または、全長タンパク質の断片、または、アミノ酸配列を
表す。機能的断片は、本明細書中で開示される全長タンパク質と実質的に似たよ
うな生物学的活性を、イン・ビボまたはイン・ヴィトロで提供する能力、即ち、ア
ポトーシスを促進する能力を持つ。機能的断片はクローニング技術によって、ま
たは、別のスプライシング機構による天然産物として製造され得る。
【００２５】 「宿主細胞」は、例えば、形質転換若しくはトランスフェクション等により該
宿主細胞に導入されたベクター上に含まれるクローン化された遺伝子を増殖及び
／または発現するのに適する、いずれの真核または原核細胞をも表す。
宿主細胞に導入されたベクター上に含まれるクローン化された遺伝子を増殖及び
／または発現するのに適する、いずれの真核または原核細胞をも表す。
【００２６】 ＴＲＡＩＬＬＫ-２は、遺伝子(配列番号１)及び、それによりコードされるタ ンパク質(配列番号２)またはペプチドを表す。ＴＲＡＩＬＬＫ-２は、ＴＮＦリ ガンドのファミリーの一員である。このファミリーは、特に腫瘍細胞中でのアポ
トーシス、及び、免疫応答の誘導を含む多様な生物学的効果を媒介する。
トーシス、及び、免疫応答の誘導を含む多様な生物学的効果を媒介する。
【００２７】 「相同体」または「相同の」という用語は、異なる核酸分子またはアミノ酸配
列の、該分子または配列中の1またはそれ以上のブロック若しくは領域が、部分 的な同一性若しくは類似により、該配列または分子が関連しているという関係を
説明する。
列の、該分子または配列中の1またはそれ以上のブロック若しくは領域が、部分 的な同一性若しくは類似により、該配列または分子が関連しているという関係を
説明する。
【００２８】 本明細書において使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、一本
鎖核酸分子がヌクレオチド塩基対形成により相補的な鎖に結合する過程を表す。
「選択的ハイブリダイゼーション」は高いストリンジェンシー条件下でのハイブ
リダイゼーションを表す。ハイブリダイゼーションの程度は、例えば、ホモロジ
ーの程度、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、及びハイブリダイズ
させる鎖の長さに依存する。
鎖核酸分子がヌクレオチド塩基対形成により相補的な鎖に結合する過程を表す。
「選択的ハイブリダイゼーション」は高いストリンジェンシー条件下でのハイブ
リダイゼーションを表す。ハイブリダイゼーションの程度は、例えば、ホモロジ
ーの程度、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、及びハイブリダイズ
させる鎖の長さに依存する。
【００２９】 「単離された核酸化合物」は、どのように構築または合成されたか係わらず、
天然における存在部位と違う場所にある、いずれのＲＮＡまたはＤＮＡ配列をも
表す。
天然における存在部位と違う場所にある、いずれのＲＮＡまたはＤＮＡ配列をも
表す。
【００３０】 本明細書において使用される「核酸プローブ」または「プローブ」は、他の核
酸化合物とハイブリダイズする標識化された核酸化合物である。「核酸プローブ
」は、二本鎖分子を形成するよう、相補的または部分的に相補的な一本鎖標的核
酸配列と結合するであろう一本鎖核酸配列を意味する。核酸プローブは、オリゴ
ヌクレオチドまたはヌクレオチドポリマーで有り得る。プローブは、通常、プロ
ーブの終わり、または、プローブ配列に先立って結合された検出可能な部分を含
む。
酸化合物とハイブリダイズする標識化された核酸化合物である。「核酸プローブ
」は、二本鎖分子を形成するよう、相補的または部分的に相補的な一本鎖標的核
酸配列と結合するであろう一本鎖核酸配列を意味する。核酸プローブは、オリゴ
ヌクレオチドまたはヌクレオチドポリマーで有り得る。プローブは、通常、プロ
ーブの終わり、または、プローブ配列に先立って結合された検出可能な部分を含
む。
【００３１】 「対応物(orthologue)」または「対応する(orthologous)」という用語は、配 列相同性を示す、異なる生物からの2若しくはそれ以上の遺伝子、または、タン パク質を表す。
【００３２】 「類似物(paralogue)」または「類似の(paralogous)」という用語は、配列相 同性を示す、同一の生物内の2若しくはそれ以上の遺伝子、または、タンパク質 を表す。
【００３３】 「プラスミド」という用語は染色体外の遺伝的要素を表す。本明細書中に開示
されるプラスミドは、市販されているか、自由に一般に入手可能か、または、入
手可能なプラスミドから、公開された製法に従って構築し得る。
されるプラスミドは、市販されているか、自由に一般に入手可能か、または、入
手可能なプラスミドから、公開された製法に従って構築し得る。
【００３４】 「プライマー」は、例えば核酸分子の酵素的、または、合成による伸長におい
て、開始基質として機能する核酸断片である。
て、開始基質として機能する核酸断片である。
【００３５】 「プロモーター」という用語は、例えばＤＮＡからＲＮＡの転写を指示する核
酸配列を表す。誘導性プロモーターは、例えば炭素源、熱、または金属イオン等
の環境シグナルによって制御可能なプロモーターである。構成プロモーターは、
一般に定常レベルで作動し、制御不能である。
酸配列を表す。誘導性プロモーターは、例えば炭素源、熱、または金属イオン等
の環境シグナルによって制御可能なプロモーターである。構成プロモーターは、
一般に定常レベルで作動し、制御不能である。
【００３６】 本明細書中で使用される「組換えＤＮＡクローニングベクター」は、これらに
限定されるわけではないが、1若しくはそれ以上のＤＮＡ部分が挿入され得る、 または、挿入されたＤＮＡ分子を含む、プラスミド及びファージを含むいずれか
の自律複製するものである。
限定されるわけではないが、1若しくはそれ以上のＤＮＡ部分が挿入され得る、 または、挿入されたＤＮＡ分子を含む、プラスミド及びファージを含むいずれか
の自律複製するものである。
【００３７】 本明細書において使用する「組換えＤＮＡ発現ベクター」または「発現ベクタ
ー」という用語は、例えば、プロモーター及び他の制御因子が内在し、それによ
りタンパク質をコードし得る挿入されたＤＮＡの転写を可能にするプラスミドま
たはファージである、いずれの組換えＤＮＡクローニングベクターをも表す。
ー」という用語は、例えば、プロモーター及び他の制御因子が内在し、それによ
りタンパク質をコードし得る挿入されたＤＮＡの転写を可能にするプラスミドま
たはファージである、いずれの組換えＤＮＡクローニングベクターをも表す。
【００３８】 「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーション条件を表す。
高いストリンジェンシー条件では、非相同な塩基対形成が避けられる。低いスト
リンジェンシー条件は逆の効果を有する。ストリンジェンシーは、例えば温度、
及び、塩濃度により変化させ得る。
高いストリンジェンシー条件では、非相同な塩基対形成が避けられる。低いスト
リンジェンシー条件は逆の効果を有する。ストリンジェンシーは、例えば温度、
及び、塩濃度により変化させ得る。
【００３９】 「低いストリンジェンシー」条件は、例えば、約37℃若しくはそれより低い温
度、約50％より低いホルムアミド濃度、そして、並から低い塩(ＳＳＣ)濃度；ま
たは代りに、約50℃若しくはそれより低い温度、そして、例えば1Ｍ ＮａＣｌの
並から高い塩(ＳＳＰＥ)濃度を含む。
度、約50％より低いホルムアミド濃度、そして、並から低い塩(ＳＳＣ)濃度；ま
たは代りに、約50℃若しくはそれより低い温度、そして、例えば1Ｍ ＮａＣｌの
並から高い塩(ＳＳＰＥ)濃度を含む。
【００４０】 「高いストリンジェンシー」条件は、例えば、約42℃若しくはそれより低い温
度、約20％より低いホルムアミド濃度、そして、低い塩(ＳＳＣ)濃度；または代
りに、約65℃若しくはそれより低い温度、そして、低い塩(ＳＳＰＥ)濃度を含む
。例えば、高いストリンジェンシー条件は、0.5Ｍ ＮａＨＰＯ4、7％硫酸ドデシ
ルナトリウム(ＳＤＳ)、1ｍＭ ＥＤＴＡ中、65℃でのハイブリダイゼーションを
含む(Ausubel,F.M.ら、『Current Protocols in Molecular Biology』第1巻(198
9年);Green Inc.New York、2.10.3章）。
度、約20％より低いホルムアミド濃度、そして、低い塩(ＳＳＣ)濃度；または代
りに、約65℃若しくはそれより低い温度、そして、低い塩(ＳＳＰＥ)濃度を含む
。例えば、高いストリンジェンシー条件は、0.5Ｍ ＮａＨＰＯ4、7％硫酸ドデシ
ルナトリウム(ＳＤＳ)、1ｍＭ ＥＤＴＡ中、65℃でのハイブリダイゼーションを
含む(Ausubel,F.M.ら、『Current Protocols in Molecular Biology』第1巻(198
9年);Green Inc.New York、2.10.3章）。
【００４１】 核酸配列中の「Ｎ」という記号は、アデニン("Ａ")、グアニン("Ｇ")、シトシ
ン("Ｃ")、チミン("Ｔ")、または、ウラシル("Ｕ")を表す。
ン("Ｃ")、チミン("Ｔ")、または、ウラシル("Ｕ")を表す。
【００４２】 「ＳＳＣ」は、ハイブリダイゼーション及び洗浄溶液を含む。20×ＳＳＣ溶液
は、3Ｍ塩化ナトリウム、0.3Ｍクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ7.0である。
は、3Ｍ塩化ナトリウム、0.3Ｍクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ7.0である。
【００４３】 「ＳＳＰＥ」は、ハイブリダイゼーション及び洗浄溶液を含む。1×ＳＳＰＥ 溶液は、180ｍＭ ＮａＣｌ、9ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、0.9ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4及び1 ｍＭ ＥＤＴＡを含む、ｐＨ7.4である。
【００４４】 ペプチドまたはタンパク質に関して用いられる「実質的に純粋」とは、他のタ
ンパク質分子を含む他の細胞性及び非細胞性分子からの分離を示す。実質的に純
粋な調製品は、少なくとも約85％の純度、好ましくは少なくとも約95％の純度で
ある。「実質的に純粋な」タンパク質は、例えばＩＭＡＣタンパク質精製方法を
含む、当業者に周知の多様な技術により調製され得る。
ンパク質分子を含む他の細胞性及び非細胞性分子からの分離を示す。実質的に純
粋な調製品は、少なくとも約85％の純度、好ましくは少なくとも約95％の純度で
ある。「実質的に純粋な」タンパク質は、例えばＩＭＡＣタンパク質精製方法を
含む、当業者に周知の多様な技術により調製され得る。
【００４５】 本明細書中で使用される「処置する」とは、疾病、症状、または疾患と闘うこ
とを目的とした患者の治療及び介護を表し、症状若しくは合併症の開始を防ぐ、
症状若しくは合併症を緩和する、または、疾病、症状若しくは疾患を排除するた
めに本発明のタンパク質を投与することを含む。本明細書において使用する処置
には、美容目的のタンパク質の投与を含む。美容目的とは、例えば肉体的容姿を
改善するために哺乳動物の体重を調整することを目的とする。
とを目的とした患者の治療及び介護を表し、症状若しくは合併症の開始を防ぐ、
症状若しくは合併症を緩和する、または、疾病、症状若しくは疾患を排除するた
めに本発明のタンパク質を投与することを含む。本明細書において使用する処置
には、美容目的のタンパク質の投与を含む。美容目的とは、例えば肉体的容姿を
改善するために哺乳動物の体重を調整することを目的とする。
【００４６】 本明細書中で使用する「ベクター」という用語は、外来または内因性のＤＮＡ
を宿主細胞に導入するのに用いる核酸化合物を表す。ベクターは、1またはそれ 以上のタンパク質分子をコードし得るヌクレオチド配列を含む。天然のままの、
または、組換え工学技術を受けたプラスミド、コスミド、ウイルス、及びバクテ
リオファージが、一般に使用されるベクターの例である。
を宿主細胞に導入するのに用いる核酸化合物を表す。ベクターは、1またはそれ 以上のタンパク質分子をコードし得るヌクレオチド配列を含む。天然のままの、
または、組換え工学技術を受けたプラスミド、コスミド、ウイルス、及びバクテ
リオファージが、一般に使用されるベクターの例である。
【００４７】 本明細書中に開示、及び、記載される多様な制限酵素類は市販されており、反
応条件、コファクター、及び、活性の他の必要条件を含む該酵素の使用方法は当
業者に周知である。特定の酵素のための反応条件については、製造者の指示に従
った。
応条件、コファクター、及び、活性の他の必要条件を含む該酵素の使用方法は当
業者に周知である。特定の酵素のための反応条件については、製造者の指示に従
った。
【００４８】 ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子は、ＴＮＦファミリーと関連する新規な、膜結合タ ンパク質をコードする。ＴＲＡＩＬＬＫ-２ ｃＤＮＡは、本明細書中において配
列番号１に記載されるＤＮＡ配列を含む。コード領域は、配列番号１の第49塩基
対で開始し、配列番号１の第798塩基対まで延びている。遺伝子暗号の縮重によ り、コードされるアミノ酸(群)またはタンパク質産物の同一性を変化させること
なく、塩基対の無数の「表立たない(silent)」な置換が配列番号１として同定さ
れる配列中に導入され得ることが、当業者には理解される。このような置換全て
が本発明の範囲内に含まれる。
列番号１に記載されるＤＮＡ配列を含む。コード領域は、配列番号１の第49塩基
対で開始し、配列番号１の第798塩基対まで延びている。遺伝子暗号の縮重によ り、コードされるアミノ酸(群)またはタンパク質産物の同一性を変化させること
なく、塩基対の無数の「表立たない(silent)」な置換が配列番号１として同定さ
れる配列中に導入され得ることが、当業者には理解される。このような置換全て
が本発明の範囲内に含まれる。
【００４９】 関連するタンパク質、及び、例えば、代りのより小さくスプライスされた形体
を含む関連する機能性断片も本発明において意図される。関連するタンパク質に
は、1またはそれより多くのアミノ酸部位でＴＮＦリガンド機能が維持されるよ う置換、または交替、または欠失、または挿入されることにより配列番号２に記
載の一次配列のアミノ酸配列が変えられた種類を含む。
を含む関連する機能性断片も本発明において意図される。関連するタンパク質に
は、1またはそれより多くのアミノ酸部位でＴＮＦリガンド機能が維持されるよ う置換、または交替、または欠失、または挿入されることにより配列番号２に記
載の一次配列のアミノ酸配列が変えられた種類を含む。
【００５０】 機能性断片は、アポトーシスを誘導する能力を保持する、完全なＴＲＡＩＬＬ
Ｋ-２タンパク質の断片として、都合の良いことには同定される。
Ｋ-２タンパク質の断片として、都合の良いことには同定される。
【００５１】 アミノ酸置換による改良は、以下の表に従って行われ得る。
【表１】
【００５２】タンパク質の断片 本発明の1つの態様では、開示されるタンパク質の生物学的に活性であるか、 または活性でない断片が提供される。このような断片は、例えば、該タンパク質
に対する抗体を産生する抗原として有用である。
に対する抗体を産生する抗原として有用である。
【００５３】 本明細書中で開示されるタンパク質の断片は、配列番号２のいずれかの部分の
化学合成、配列番号２のタンパク質分解、または、最も好ましくは当業者に周知
の組換えＤＮＡ突然変異生成技術を含む、多数のいずれかの適当な技術により生
成し得る。K.Struhl、『Reverse biochemistry:Methods and applications for
synthesizing yeast proteins in vitro』Meth.Enzymol.,194,520-535、参照。 例えば、好ましい方法では、タンパク質分子のアミノ末端、または、カルボキシ
ル末端から異なる数のタンパク質をコードする領域が欠失されるよう、ＴＲＡＩ
ＬＫＫ-２をコードする完全長遺伝子(配列番号１)へ、一そろいの欠失変異が導 入される。この方法はまた、完全長タンパク質のカルボキシル及びアミノ末端の
両方が除去された内部断片を作るのにも用いることができる。例えば、Ｂａｌ３
１、または、一本鎖核酸分子の場合にはマングマメのヌクレアーゼである、数個
の適当なヌクレアーゼを、このような欠失体を作成するのに用いることができる
。簡単にするため、バクテリオファージＭ１３やその均等物等の一本鎖クローニ
ングベクター中にＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子をクローン化することが好ましい。 望ましい場合には、得られた遺伝子欠失断片を、該断片のいずれかの適当な宿主
細胞中での増殖及び発現のため、いずれかの適当なベクターにサブクローン化し
得る。
化学合成、配列番号２のタンパク質分解、または、最も好ましくは当業者に周知
の組換えＤＮＡ突然変異生成技術を含む、多数のいずれかの適当な技術により生
成し得る。K.Struhl、『Reverse biochemistry:Methods and applications for
synthesizing yeast proteins in vitro』Meth.Enzymol.,194,520-535、参照。 例えば、好ましい方法では、タンパク質分子のアミノ末端、または、カルボキシ
ル末端から異なる数のタンパク質をコードする領域が欠失されるよう、ＴＲＡＩ
ＬＫＫ-２をコードする完全長遺伝子(配列番号１)へ、一そろいの欠失変異が導 入される。この方法はまた、完全長タンパク質のカルボキシル及びアミノ末端の
両方が除去された内部断片を作るのにも用いることができる。例えば、Ｂａｌ３
１、または、一本鎖核酸分子の場合にはマングマメのヌクレアーゼである、数個
の適当なヌクレアーゼを、このような欠失体を作成するのに用いることができる
。簡単にするため、バクテリオファージＭ１３やその均等物等の一本鎖クローニ
ングベクター中にＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子をクローン化することが好ましい。 望ましい場合には、得られた遺伝子欠失断片を、該断片のいずれかの適当な宿主
細胞中での増殖及び発現のため、いずれかの適当なベクターにサブクローン化し
得る。
【００５４】 本発明はまた、本明細書中に開示されるタンパク質の断片であって、受容体活
性を保持する断片を提供する。本明細書中において使用する「機能性断片」は、
例えば、アポトーシスを誘導する能力等、測定可能な生物学的活性を適当な条件
下で保持または発現する配列番号２の断片を表す。
性を保持する断片を提供する。本明細書中において使用する「機能性断片」は、
例えば、アポトーシスを誘導する能力等、測定可能な生物学的活性を適当な条件
下で保持または発現する配列番号２の断片を表す。
【００５５】 本明細書中において開示されるタンパク質の機能性断片は、上述のように、好
ましくは、5'末端、3'末端、両端または内部の配列を欠く、完全長遺伝子より小
さなものを製造するためのクローニング技術により製造され得る。例えば、イン
・ビボまたはイン・ヴィトロにおいてアポトーシスを誘導するタンパク質断片の能
力等、いずれかの適当な分析法を用いて生物活性について断片を試験し得る。
ましくは、5'末端、3'末端、両端または内部の配列を欠く、完全長遺伝子より小
さなものを製造するためのクローニング技術により製造され得る。例えば、イン
・ビボまたはイン・ヴィトロにおいてアポトーシスを誘導するタンパク質断片の能
力等、いずれかの適当な分析法を用いて生物活性について断片を試験し得る。
【００５６】遺伝子分離法 例えば、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅、また
はディノーボ(de novo)ＤＮＡ合成を含む多数の組換えＤＮＡ技術によってＴＲ ＡＩＬＬＫ-２遺伝子が得られることが、当業者には理解される。(T.Maniatisら
、『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』第2版、第14章(1989)参照)。
はディノーボ(de novo)ＤＮＡ合成を含む多数の組換えＤＮＡ技術によってＴＲ ＡＩＬＬＫ-２遺伝子が得られることが、当業者には理解される。(T.Maniatisら
、『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』第2版、第14章(1989)参照)。
【００５７】 原核、または、真核細胞中での増幅のために、プラスミドまたはファージ等の
適当なベクター中にｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は、当業者には周知で
ある。(例えば、Maniatisら(上述)参照)。適当なクローニングベクターは周知で
あり、広く入手可能である。
適当なベクター中にｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は、当業者には周知で
ある。(例えば、Maniatisら(上述)参照)。適当なクローニングベクターは周知で
あり、広く入手可能である。
【００５８】 ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子またはその断片は、例えば胸部細胞である該遺伝子 が発現されている組織から単離し得る。1つの方法では、ｍＲＮＡが適当な組織 より単離され、そしてまずｃＤＮＡ鎖合成が行われる。第2鎖の製造のため、Ｄ ＮＡ合成の第2段階が行われ得る。望ましければ、例えばプラスミド等のいずれ かの適当なベクター中に二本鎖ｃＤＮＡをクローン化し、ｃＤＮＡライブラリー
を形成することができる。配列番号１のいずれかの適当な領域を標的とするオリ
ゴヌクレオチドプライマーを、ＴＲＡＩＬＬＫ-２のＰＣＲ増幅に用い得る。例 えば、『PCR Protocols:A Guide to Method and Application』M.Innisら編、Ac
ademic Press (1990年)参照。ＰＣＲ増幅は、鋳型ＤＮＡ、適当な酵素、プライ マー及び緩衝液を含み、そして、都合良くはＤＮＡ温度サイクラー(Perkin Elme
r Cetus,Norwalk,CT)中で行われる。断片の存在の確認は、アガロースゲル電気 泳動に続いて適当な大きさのＤＮＡ断片を検出することにより行われる。
を形成することができる。配列番号１のいずれかの適当な領域を標的とするオリ
ゴヌクレオチドプライマーを、ＴＲＡＩＬＬＫ-２のＰＣＲ増幅に用い得る。例 えば、『PCR Protocols:A Guide to Method and Application』M.Innisら編、Ac
ademic Press (1990年)参照。ＰＣＲ増幅は、鋳型ＤＮＡ、適当な酵素、プライ マー及び緩衝液を含み、そして、都合良くはＤＮＡ温度サイクラー(Perkin Elme
r Cetus,Norwalk,CT)中で行われる。断片の存在の確認は、アガロースゲル電気 泳動に続いて適当な大きさのＤＮＡ断片を検出することにより行われる。
【００５９】タンパク質産生法 本発明の1つの態様は、ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子によりコードされる、実質的
に精製されたタンパク質に関連する。
に精製されたタンパク質に関連する。
【００６０】 本発明のタンパク質が、液相ペプチド合成または組換え方法を含む、周知の化
学的方法等の多数の異なる方法によって合成され得ることが、当業者には理解さ
れる。どちらの方法も米国特許第4,617,149号に記載されている。該特許は本明 細書の一部を構成する。
学的方法等の多数の異なる方法によって合成され得ることが、当業者には理解さ
れる。どちらの方法も米国特許第4,617,149号に記載されている。該特許は本明 細書の一部を構成する。
【００６１】 ポリペプチドの液相化学合成の原理は周知であり、当分野の一般文献中で見つ
けることができる。例えば、H.Dugas及びC.Penney『Bioorganic Chemistry』(19
81年)Springer-Verlag,New York、第54〜92頁参照。例えば、ＡＰＰＬＩＥＤ Ｂ
ＩＯＳＹＳＴＥＭＳ ４３０Ａ ペプチド合成装置(Applied Biosystems, Foster
City,CA)及び、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳにより提供される合成サ イクルを用いた液相方法によりペプチドは合成され得る。
けることができる。例えば、H.Dugas及びC.Penney『Bioorganic Chemistry』(19
81年)Springer-Verlag,New York、第54〜92頁参照。例えば、ＡＰＰＬＩＥＤ Ｂ
ＩＯＳＹＳＴＥＭＳ ４３０Ａ ペプチド合成装置(Applied Biosystems, Foster
City,CA)及び、ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳにより提供される合成サ イクルを用いた液相方法によりペプチドは合成され得る。
【００６２】 本発明のタンパク質はまた、クローン化されたＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子を用 いた組換えＤＮＡ法により製造し得る。高収量が望まれる場合、組換え法が好ま
れる。クローン化された遺伝子の発現は、当業者に周知の多様な適当な宿主細胞
中で行われ得る。この目的のため、ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子が当業者に周知の いずれかの適当な方法で宿主細胞中に導入される。クローン化された遺伝子の染
色体への導入は本発明の範囲内であるが、ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子のコード領 域が構成または誘導性プロモーターに作動可能に連結されるよう遺伝子が染色体
外に維持される適当な発現ベクター中にクローン化されることが好ましい。
れる。クローン化された遺伝子の発現は、当業者に周知の多様な適当な宿主細胞
中で行われ得る。この目的のため、ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子が当業者に周知の いずれかの適当な方法で宿主細胞中に導入される。クローン化された遺伝子の染
色体への導入は本発明の範囲内であるが、ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子のコード領 域が構成または誘導性プロモーターに作動可能に連結されるよう遺伝子が染色体
外に維持される適当な発現ベクター中にクローン化されることが好ましい。
【００６３】 ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質の組換え産生の基本的な工程は、次の通りであ る： ａ) ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質をコードする天然、合成または 半合成ＤＮＡを構築する工程、 ｂ) ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質を単独で、または融合タンパク 質として発現するのに適当な方法で、該ＤＮＡを発現ベクターに導 入する工程、 ｃ)組換え宿主細胞を形成する適当な真核または原核宿主細胞に、 該ベクターを形質転換または別の方法で導入する工程、 ｄ)ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質を発現するように該組換え宿主細 胞を培養する工程、そして、 ｅ)当業者に周知のいずれかの適当な方法で、ＴＲＡＩＬＬＫ-２タン パク質を回収及び実質的に精製する工程。
【００６４】原核及び真核宿主細胞中での組換えＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質の発現 組換えＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質の産生に、原核生物を採用し得る。例え ば、大腸菌Ｋ１２株２９４(ATCC番号31446)は、特に外来タンパク質の原核生物 での発現に有用である。大腸菌のその他の株、枯草菌等のバチルス属、Salmonel la typhimurium またはSerratia marcescans等の腸内細菌、種々のシュードモナ ス属、及び、ストレプトマイセス属等の他の細菌も、本発明の組換えタンパク質
のクローニング及び発現のための宿主細胞として用い得る。
のクローニング及び発現のための宿主細胞として用い得る。
【００６５】 原核生物での遺伝子の発現を制御するのに適当なプロモーター配列には、ｂ- ラクタマーゼ(例えば、ベクターｐＧＸ２９０７(ATCC 39344)は、レプリコン及 びｂ-ラクタマーゼ遺伝子を含む)、ラクトース系(Changら、Nature(London),275 ,615(1978年);Goeddelら、Nature(London),281,544(1979年))、アルカリホスフ ァターゼ、及び、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーターの制御下でｔｒｐＥ融合
タンパク質としてオープンリーディングフレームの発現を容易にするよう設計さ
れたｔｒｐプロモーター系(ベクターｐＡＴＨ１(ATCC 37695)を含む。ｔａｃプ ロモーター(プラスミドｐＤＲ５４０(ATCC 37282)より分離可能)のようなハイブ
リッドプロモーターもまた適する。一般的に、そのヌクレオチド配列が公知の他
の細菌性プロモーターも、必要とされるいずれかの制限部位を提供するようリン
カーまたはアダプターを用いて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに対し
て連結され得る。細菌系で使用されるプロモーターも、所望のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン-ダルガノ配列を含むであろう 。これらの例は例示であって、制限を加えるものではない。
タンパク質としてオープンリーディングフレームの発現を容易にするよう設計さ
れたｔｒｐプロモーター系(ベクターｐＡＴＨ１(ATCC 37695)を含む。ｔａｃプ ロモーター(プラスミドｐＤＲ５４０(ATCC 37282)より分離可能)のようなハイブ
リッドプロモーターもまた適する。一般的に、そのヌクレオチド配列が公知の他
の細菌性プロモーターも、必要とされるいずれかの制限部位を提供するようリン
カーまたはアダプターを用いて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに対し
て連結され得る。細菌系で使用されるプロモーターも、所望のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン-ダルガノ配列を含むであろう 。これらの例は例示であって、制限を加えるものではない。
【００６６】 本発明のタンパク質は、直接的な発現により、または、酵素的若しくは化学的
切断により取り除くことができる別のタンパク質若しくはペプチドと、所望のタ
ンパク質を翻訳誘導体として含む融合タンパク質として、合成され得る。或るペ
プチドの組換え系での製造において、融合タンパク質としての発現により、寿命
を延ばされること、所望ペプチドの収量が上げられること、またはタンパク質を
精製するのに便利な手段が提供されることが、しばしば観察されている。これは
、哺乳動物タンパク質を原核宿主で発現する場合に、特に適切である。ペプチド
鎖の特定の部位でポリペプチドを切断、または、アミノ若しくはカルボキシル末
端からペプチドを消化する(例えば、ジアミノペプチダーゼ)、多様なペプチダー
ゼ(例えば、エンテロキナーゼ及びトロンビン)が公知である。さらに、特殊な化
学物質(例えば、臭化シアン)は特定の部位でポリペプチド鎖を切断する。部位特
異的内部切断部位を組み込むのに必要なアミノ酸配列(もし組換え技術が使用さ れていれば合成若しくは半合成コード配列)の変更を当業者であれば認識するで あろう。例えば、『Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Lar
ge Scale Processes』American Chemical Society,Washington,D.C.(1990年)中 の第13章、P.Carterの"Site Specific Proteolysis of Fusion Proteins"参照。
切断により取り除くことができる別のタンパク質若しくはペプチドと、所望のタ
ンパク質を翻訳誘導体として含む融合タンパク質として、合成され得る。或るペ
プチドの組換え系での製造において、融合タンパク質としての発現により、寿命
を延ばされること、所望ペプチドの収量が上げられること、またはタンパク質を
精製するのに便利な手段が提供されることが、しばしば観察されている。これは
、哺乳動物タンパク質を原核宿主で発現する場合に、特に適切である。ペプチド
鎖の特定の部位でポリペプチドを切断、または、アミノ若しくはカルボキシル末
端からペプチドを消化する(例えば、ジアミノペプチダーゼ)、多様なペプチダー
ゼ(例えば、エンテロキナーゼ及びトロンビン)が公知である。さらに、特殊な化
学物質(例えば、臭化シアン)は特定の部位でポリペプチド鎖を切断する。部位特
異的内部切断部位を組み込むのに必要なアミノ酸配列(もし組換え技術が使用さ れていれば合成若しくは半合成コード配列)の変更を当業者であれば認識するで あろう。例えば、『Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Lar
ge Scale Processes』American Chemical Society,Washington,D.C.(1990年)中 の第13章、P.Carterの"Site Specific Proteolysis of Fusion Proteins"参照。
【００６７】 原核生物に加えて、カエルの卵母細胞等の種々の両生類発現系、及び、哺乳動
物細胞系を用い得る。個々の宿主細胞の選択は、使用される個々の発現ベクター
にある程度依存する。本発明での使用に特に適当な典型的な哺乳動物細胞には、
例えば、ＨｅｐＧ-２(ATCC HB 8065)、ＣＶ-１(ATCC CCL 70)、ＬＣ-ＭＫ2(ATCC
CCL 7.1)、３Ｔ３(ATCC CCL 92)、ＣＨＯ-Ｋ１(ATCC CCL 61)、ＨｅＬａ(ATCC
CCL 2)、ＲＰＭＩ８２２６(ATCC CCL 155)、Ｈ４ＩＩＥＣ３(ATCC CCL 1600)、 Ｃ１２７Ｉ(ATCC CCL 1616)、ＨＳ-Ｓｕｌｔａｎ(ATCC CCL 1484)、及び、ＢＨ Ｋ-２１(ATCC CCL 10)が含まれる。
物細胞系を用い得る。個々の宿主細胞の選択は、使用される個々の発現ベクター
にある程度依存する。本発明での使用に特に適当な典型的な哺乳動物細胞には、
例えば、ＨｅｐＧ-２(ATCC HB 8065)、ＣＶ-１(ATCC CCL 70)、ＬＣ-ＭＫ2(ATCC
CCL 7.1)、３Ｔ３(ATCC CCL 92)、ＣＨＯ-Ｋ１(ATCC CCL 61)、ＨｅＬａ(ATCC
CCL 2)、ＲＰＭＩ８２２６(ATCC CCL 155)、Ｈ４ＩＩＥＣ３(ATCC CCL 1600)、 Ｃ１２７Ｉ(ATCC CCL 1616)、ＨＳ-Ｓｕｌｔａｎ(ATCC CCL 1484)、及び、ＢＨ Ｋ-２１(ATCC CCL 10)が含まれる。
【００６８】 哺乳動物宿主細胞を形質転換するのに、多様なベクターが適している。例えば
、ｐＳＶ２型ベクターは、転写及びポリアデニル化に必要とされるサルウイルス
４０(ＳＶ４０)ゲノムの部分を含む。ＳＶ４０が挿入された遺伝子の転写を制御
する、ｐＳＶ２-ｇｐｔ、ｐＳＶ２-ｎｅｏ、ｐＳＶ２-ｄｈｆｒ、ｐＳＶ２-ｈｙ
ｇ、及び、ｐＳＶ２-ｂ-グロブリン等のプラスミドｐＳＶ２型ベクターが多数、
構築されてきた。これらのベクターは、American Type Culture Collection(ATC
C)(12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland,20852)または、Northern Region
al Research Laboratory(NRRL)(1815 N.University Street,Peoria,Illinois,61
604)等から広く入手可能である。
、ｐＳＶ２型ベクターは、転写及びポリアデニル化に必要とされるサルウイルス
４０(ＳＶ４０)ゲノムの部分を含む。ＳＶ４０が挿入された遺伝子の転写を制御
する、ｐＳＶ２-ｇｐｔ、ｐＳＶ２-ｎｅｏ、ｐＳＶ２-ｄｈｆｒ、ｐＳＶ２-ｈｙ
ｇ、及び、ｐＳＶ２-ｂ-グロブリン等のプラスミドｐＳＶ２型ベクターが多数、
構築されてきた。これらのベクターは、American Type Culture Collection(ATC
C)(12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland,20852)または、Northern Region
al Research Laboratory(NRRL)(1815 N.University Street,Peoria,Illinois,61
604)等から広く入手可能である。
【００６９】 哺乳動物細胞での発現に適するプロモーターには、ＳＶ４０後期プロモーター
、例えば、エストロゲン誘導性ニワトリ卵白アルブミン遺伝子、インターフェロ
ン遺伝子、グルココルチコイド誘導性チロシン アミノトランスフェラーゼ遺伝 子等の真核遺伝子由来のプロモーター、チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、
並びに、メジャー初期、及び、後期アデノウイルス遺伝子のプロモーターが含ま
れる。
、例えば、エストロゲン誘導性ニワトリ卵白アルブミン遺伝子、インターフェロ
ン遺伝子、グルココルチコイド誘導性チロシン アミノトランスフェラーゼ遺伝 子等の真核遺伝子由来のプロモーター、チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、
並びに、メジャー初期、及び、後期アデノウイルス遺伝子のプロモーターが含ま
れる。
【００７０】 プラスミドｐＲＳＶｃａｔ(ATCC 37152)は、ニワトリ及び他の宿主細胞に感染
することが知られているラウス肉腫ウイルスの末端反復配列の一部を含む。この
末端反復配列は、本発明のベクターにおける使用に適するプロモーターを含んで
いる。(H.Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),79,6777(1982年))。プラスミド
ｐＭＳＶｉ(NRRL B-15929)は、マウス及び他の宿主細胞に感染することが知られ
ているマウス肉腫ウイルスの末端反復配列を含む。マウスメタロチオネインタン
パク質プロモーターも、哺乳動物宿主細胞での使用のために、よく特徴付けられ
ており、本発明での使用に適している。このプロモーターは、プラスミドｐｄＢ
ＰＶ-ＭＭＴｎｅｏ(ATCC 37224)中に存在し、本発明の他のプラスミドを構築す る出発材料として役立て得る。
することが知られているラウス肉腫ウイルスの末端反復配列の一部を含む。この
末端反復配列は、本発明のベクターにおける使用に適するプロモーターを含んで
いる。(H.Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),79,6777(1982年))。プラスミド
ｐＭＳＶｉ(NRRL B-15929)は、マウス及び他の宿主細胞に感染することが知られ
ているマウス肉腫ウイルスの末端反復配列を含む。マウスメタロチオネインタン
パク質プロモーターも、哺乳動物宿主細胞での使用のために、よく特徴付けられ
ており、本発明での使用に適している。このプロモーターは、プラスミドｐｄＢ
ＰＶ-ＭＭＴｎｅｏ(ATCC 37224)中に存在し、本発明の他のプラスミドを構築す る出発材料として役立て得る。
【００７１】 ベクターによる哺乳動物細胞のトランスフェクションは、それらに限定される
わけではないが、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム共沈、エレクトポレー
ション等を含む多数の周知の方法により行い得る。例えば、Maniatisら(前述)参
照。
わけではないが、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム共沈、エレクトポレー
ション等を含む多数の周知の方法により行い得る。例えば、Maniatisら(前述)参
照。
【００７２】 幾つかのウイルスもまた適当なベクターとなる。米国特許第4,775,624号に記 載される、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペ
スウイルス、バキュロウイルス、及び、ラウス肉腫ウイルス等が例として含まれ
る。該特許は本明細書の一部を構成する。
スウイルス、バキュロウイルス、及び、ラウス肉腫ウイルス等が例として含まれ
る。該特許は本明細書の一部を構成する。
【００７３】 酵母や他の菌類等の真核微生物もまた、適当な宿主細胞である。酵母Saccharo myces cerevisiae は、好ましい真核微生物である。Kluyveromyces lactis、及び
Pichia pastoris等の他の酵母も適当である。サッカロマイセス属での発現のた め、例えば、プラスミドＹＲｐ７(ATCC 40053)を用い得る。例えば、L.Stinchco
mbら、Nature,282,39(1979年)；J.Kingsmanら、Gene,7,141(1979年)；S.Tschemp
erら、Gene,10,157(1980年)参照。プラスミドＹＲｐ７は、ｔｒｐ１栄養要求性 変異体での選択的マーカーとして働くＴＲＰ１遺伝子を含む。
Pichia pastoris等の他の酵母も適当である。サッカロマイセス属での発現のた め、例えば、プラスミドＹＲｐ７(ATCC 40053)を用い得る。例えば、L.Stinchco
mbら、Nature,282,39(1979年)；J.Kingsmanら、Gene,7,141(1979年)；S.Tschemp
erら、Gene,10,157(1980年)参照。プラスミドＹＲｐ７は、ｔｒｐ１栄養要求性 変異体での選択的マーカーとして働くＴＲＰ１遺伝子を含む。
【００７４】組換えにより産生されたＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質の精製 クローン化されたＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子を運ぶ発現ベクターを、適当な宿 主細胞中に標準的な方法を用いて、形質転換またはトランスフェクトした。組換
えＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質の発現に適した条件下で、ベクターを含む細胞 を増殖させる。例えば、組換え遺伝子が誘導性プロモーターの制御下に置かれて
いる場合には、適当な生育条件は適当な誘導物質を含むであろう。組換えにより
産生されたタンパク質は、形質転換された細胞の細胞抽出物から、いずれかの適
した手段によって精製され得る。
えＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質の発現に適した条件下で、ベクターを含む細胞 を増殖させる。例えば、組換え遺伝子が誘導性プロモーターの制御下に置かれて
いる場合には、適当な生育条件は適当な誘導物質を含むであろう。組換えにより
産生されたタンパク質は、形質転換された細胞の細胞抽出物から、いずれかの適
した手段によって精製され得る。
【００７５】 タンパク質精製の好ましい工程では、ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子は、ＴＲＡＩ ＬＬＫ-２タンパク質のアミノ末端に幾つかのヒスチジン残基を含むように5'末 端が修飾されている。この「ヒスチジンタグ」により、「固定化金属イオンアフ
ィニティークロマトグラフィー」(ＩＭＡＣ)と呼ばれる、実質的に米国特許第4,
569,794号に記載の1段階タンパク質精製方法が可能になる。該特許文献は本明細
書の一部を構成する。ＩＭＡＣ方法により、上述の修飾組換えタンパク質を発現
する細胞の粗抽出物から始まる、実質的に純粋な組換えＴＲＡＩＬＬＫ-２タン パク質の迅速な単離が可能になる。
ィニティークロマトグラフィー」(ＩＭＡＣ)と呼ばれる、実質的に米国特許第4,
569,794号に記載の1段階タンパク質精製方法が可能になる。該特許文献は本明細
書の一部を構成する。ＩＭＡＣ方法により、上述の修飾組換えタンパク質を発現
する細胞の粗抽出物から始まる、実質的に純粋な組換えＴＲＡＩＬＬＫ-２タン パク質の迅速な単離が可能になる。
【００７６】抗体の産生 本発明のタンパク質及びそれらの断片は、抗体の産生に使用し得る。本明細書
において使用される「抗体」という用語は、抗体、抗体の断片(例えば、これら に限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ2'及びＦｖ断片)、及び
、それが由来する親抗体分子と類似の性質の抗原を結合できるキメラ、ヒト化、
結合化、表面を付け替えた(resurfaced)、または、ＣＤＲ融合抗体を表す。本発
明はまた、一本鎖ポリペプチド結合分子も内包する。
において使用される「抗体」という用語は、抗体、抗体の断片(例えば、これら に限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ2'及びＦｖ断片)、及び
、それが由来する親抗体分子と類似の性質の抗原を結合できるキメラ、ヒト化、
結合化、表面を付け替えた(resurfaced)、または、ＣＤＲ融合抗体を表す。本発
明はまた、一本鎖ポリペプチド結合分子も内包する。
【００７７】 特にマウスである動物におけるモノクローナル、及び、ポリクローナル抗体の
産生は周知である。例えば、C.Milstein、『Handbook of Experimental Immunol
ogy』(Blackwell Scientific Pub.(1986年))、J.Goding『Monoclonal Antibodie
s: Principles and Practice』(Academic Press(1983年))参照。モノクローナル
抗体の産生のための標準的な方法は、マウスまたはその他の適当な動物に免疫原
を注射することから始まる。マウスはその後殺され、その脾臓より取られた細胞
をミエローマ細胞と融合し、イン・ヴィトロで複製するハイブリドーマが得られ る。ハイブリドーマの集団を、それぞれ免疫原に特異的な単一の抗体種を分泌す
る個々のクローンを単離するためにスクリーニングする。この方法で得られた抗
体は、1個のＢ細胞のクローン産物である。
産生は周知である。例えば、C.Milstein、『Handbook of Experimental Immunol
ogy』(Blackwell Scientific Pub.(1986年))、J.Goding『Monoclonal Antibodie
s: Principles and Practice』(Academic Press(1983年))参照。モノクローナル
抗体の産生のための標準的な方法は、マウスまたはその他の適当な動物に免疫原
を注射することから始まる。マウスはその後殺され、その脾臓より取られた細胞
をミエローマ細胞と融合し、イン・ヴィトロで複製するハイブリドーマが得られ る。ハイブリドーマの集団を、それぞれ免疫原に特異的な単一の抗体種を分泌す
る個々のクローンを単離するためにスクリーニングする。この方法で得られた抗
体は、1個のＢ細胞のクローン産物である。
【００７８】 キメラ抗体は、米国特許第4,816,567号に記載されている。該特許は本明細書 の一部を構成する。この文献は、キメラ抗体の製造するための方法、及び、ベク
ターを開示している。代替方法が、米国特許第4,816,397号に記載されている。 該特許は本明細書の一部を構成する。この特許は、同一宿主細胞内における、抗
体の重鎖及び軽鎖の共発現を教示している。
ターを開示している。代替方法が、米国特許第4,816,397号に記載されている。 該特許は本明細書の一部を構成する。この特許は、同一宿主細胞内における、抗
体の重鎖及び軽鎖の共発現を教示している。
【００７９】 米国特許第4,816,397号の方法は、欧州特許公開第0 239 400号で詳細に論じら
れている。この欧州特許公開の教示は、モノクローナル抗体の遺伝子工学におけ
る好ましい形式である。この技術では、ヒト抗体の相補性決定領域(ＣＤＲｓ)が
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲｓと置換され、それによりヒト抗体の特異性
をマウス抗体の特異性へと変えている。
れている。この欧州特許公開の教示は、モノクローナル抗体の遺伝子工学におけ
る好ましい形式である。この技術では、ヒト抗体の相補性決定領域(ＣＤＲｓ)が
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲｓと置換され、それによりヒト抗体の特異性
をマウス抗体の特異性へと変えている。
【００８０】 一本鎖抗体及びそのライブラリーは、周知の、また別の種類の遺伝的工学によ
る抗体技術である。(例えば、R.E.Birdら、Science、242,423-426(1988年)；Ｐ ＣＴ公開第WO88/01649号、第WO90/14430号及び第WO91/10737号参照)。一本鎖抗 体技術には、一本鎖ポリペプチド鎖を作るために、重鎖及び軽鎖の結合領域を共
有結合させることを含む。内部抗体分子の結合特異性がそれによって、一本鎖ポ
リペプチド上に再形成される。
る抗体技術である。(例えば、R.E.Birdら、Science、242,423-426(1988年)；Ｐ ＣＴ公開第WO88/01649号、第WO90/14430号及び第WO91/10737号参照)。一本鎖抗 体技術には、一本鎖ポリペプチド鎖を作るために、重鎖及び軽鎖の結合領域を共
有結合させることを含む。内部抗体分子の結合特異性がそれによって、一本鎖ポ
リペプチド上に再形成される。
【００８１】 本発明により意図される抗体は、診断用、治療用、または、診断／治療用の配
合中で有用である。
合中で有用である。
【００８２】 本発明のタンパク質、または、その好ましい断片は、ポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体、及び、種間雑種、またはヒト化抗体、または抗体断片、また
は一本鎖抗体を作るのに用いることができる。抗体を産生する技術は、当業者に
周知である。(例えば、A.M.Campbell、『Monoclonal Antibody Technology: Lab
oratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology』(Elsevier Scie
nce Publishers,Amsterdam(1984年)；Kohler及びMilstein、Nature,256,495-497
(1975年)；『Monoclonal Antibodies: Principles & Applicaitons』J.R.Birch ＆E.S.Lennox編(Wiley−Liss,1995年)参照)。
ノクローナル抗体、及び、種間雑種、またはヒト化抗体、または抗体断片、また
は一本鎖抗体を作るのに用いることができる。抗体を産生する技術は、当業者に
周知である。(例えば、A.M.Campbell、『Monoclonal Antibody Technology: Lab
oratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology』(Elsevier Scie
nce Publishers,Amsterdam(1984年)；Kohler及びMilstein、Nature,256,495-497
(1975年)；『Monoclonal Antibodies: Principles & Applicaitons』J.R.Birch ＆E.S.Lennox編(Wiley−Liss,1995年)参照)。
【００８３】 免疫原として用いられるタンパク質は、修飾され得るか、または、例えばマウ
ス若しくはウサギに、皮下注射若しくは腹腔内注射によりアジュバンドと一緒に
投与され得る。モノクローナル抗体の産生のため、免疫化された動物の脾臓細胞
が取り出され、ＳＰ２／０-Ａｇ１４細胞等のミエローマ細胞と融合され、当業 者に公知の方法でモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞とされる。
所望の抗体分子を分泌するハイブリドーマは、例えばＥＬＩＳＡ分析、ウエスタ
ンブロット分析、または、放射免疫分析等の多様な周知の方法によりスクリーニ
ングされ得る(Lutzら、Exp.Cell Res.,175,109-124(1988年)；『Monoclonal Ant
ibodies: Principles & Applications』J.R.Birch＆E.S.Lennox編(Wiley−Liss,
1995年)）。
ス若しくはウサギに、皮下注射若しくは腹腔内注射によりアジュバンドと一緒に
投与され得る。モノクローナル抗体の産生のため、免疫化された動物の脾臓細胞
が取り出され、ＳＰ２／０-Ａｇ１４細胞等のミエローマ細胞と融合され、当業 者に公知の方法でモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞とされる。
所望の抗体分子を分泌するハイブリドーマは、例えばＥＬＩＳＡ分析、ウエスタ
ンブロット分析、または、放射免疫分析等の多様な周知の方法によりスクリーニ
ングされ得る(Lutzら、Exp.Cell Res.,175,109-124(1988年)；『Monoclonal Ant
ibodies: Principles & Applications』J.R.Birch＆E.S.Lennox編(Wiley−Liss,
1995年)）。
【００８４】 いくつかの適用では、標識化された抗体が望ましい。例えば、放射性同位体、
ビオチンまたはアビジン等の親和性標識、例えばセイヨウワサビぺルオキシダー
ゼ等の酵素標識、及び、ＦＩＴＣまたはロダミン等の蛍光標識の使用を含む抗体
分子を標識化する方法が広知である(例えば、『Enzyme-Mediated Immunoassay』
T.Ngo,H.Lenhoff編(Plenum Press,1985年)；『Principles of Immunology and I
mmunodiagnostics』R.M.Aloisi(Lea & Febiger,1988年))。
ビオチンまたはアビジン等の親和性標識、例えばセイヨウワサビぺルオキシダー
ゼ等の酵素標識、及び、ＦＩＴＣまたはロダミン等の蛍光標識の使用を含む抗体
分子を標識化する方法が広知である(例えば、『Enzyme-Mediated Immunoassay』
T.Ngo,H.Lenhoff編(Plenum Press,1985年)；『Principles of Immunology and I
mmunodiagnostics』R.M.Aloisi(Lea & Febiger,1988年))。
【００８５】 標識化された抗体は、多様な診断方法において有用である。1つの態様におい て、本発明はＴＲＡＩＬＬＫ-２の存在を検出するための標識化抗体の使用に関 連する。代りに、抗体はＴＲＡＩＬＬＫ-２の潜在的なモジュレーターを同定す るスクリーニングにおいても用い得る。例えば、競合的置換分析では、抗体若し
くは試験される化合物は、いずれかの適当な方法により標識される。試験化合物
-抗原複合体を形成するような、試験化合物による抗体-抗原複合体の抗体の競合
的置換により、ＴＲＡＩＬＬＫ-２に結合できる化合物を同定する方法が提供さ れる。
くは試験される化合物は、いずれかの適当な方法により標識される。試験化合物
-抗原複合体を形成するような、試験化合物による抗体-抗原複合体の抗体の競合
的置換により、ＴＲＡＩＬＬＫ-２に結合できる化合物を同定する方法が提供さ れる。
【００８６】 本発明の他の態様は、配列番号２をコードする単離された核酸配列、または、
配列番号１若しくはその相補鎖に対して少なくとも約75％相同な関連する核酸配
列、または、低いストリンジェンシー条件下で配列番号１に対してハイブリダイ
ズする核酸を含む。このような配列は、例えば、同一生物内または他の生物から
の遺伝子からの由来であり得る。
配列番号１若しくはその相補鎖に対して少なくとも約75％相同な関連する核酸配
列、または、低いストリンジェンシー条件下で配列番号１に対してハイブリダイ
ズする核酸を含む。このような配列は、例えば、同一生物内または他の生物から
の遺伝子からの由来であり得る。
【００８７】 ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子(即ち、配列番号１)、及び、配列番号２をコードす る関連の核酸分子、または、その機能断片は、化学的な合成方法により製造され
得る。核酸の合成方法は周知である。(例えば、E.L.Brown,R.Belａｇａｊｅ，Ｍ
．Ｊ．Ｒｙａｎ 及びH.G.H.Khorana、Methods in Enzymology,68,109-151(1979年))参照。ＴＲＡ
ＩＬＬＫ-２遺伝子に対応するＤＮＡ配列の断片は、リン酸アミド化学を用いる Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３８０Ａまたは３８０Ｂ Ｄ
ＮＡ合成装置(Applied Biosystems,Inc.,850 Lincoln Center Drive,Foster Cit
y,CA 94404)等の一般的なＤＮＡ合成装置を用い、その後、断片を結合し全遺伝 子を再構築することにより作り得る。代替方法として、リン酸トリエステル化学
を本発明の核酸を合成するのに用い得る。(例えば、M.J.Gait編『Oligonucleoti
de Synthesis, A Practical Approach』(1984年)参照)。
得る。核酸の合成方法は周知である。(例えば、E.L.Brown,R.Belａｇａｊｅ，Ｍ
．Ｊ．Ｒｙａｎ 及びH.G.H.Khorana、Methods in Enzymology,68,109-151(1979年))参照。ＴＲＡ
ＩＬＬＫ-２遺伝子に対応するＤＮＡ配列の断片は、リン酸アミド化学を用いる Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３８０Ａまたは３８０Ｂ Ｄ
ＮＡ合成装置(Applied Biosystems,Inc.,850 Lincoln Center Drive,Foster Cit
y,CA 94404)等の一般的なＤＮＡ合成装置を用い、その後、断片を結合し全遺伝 子を再構築することにより作り得る。代替方法として、リン酸トリエステル化学
を本発明の核酸を合成するのに用い得る。(例えば、M.J.Gait編『Oligonucleoti
de Synthesis, A Practical Approach』(1984年)参照)。
【００８８】 別の方法、即ちＰＣＲでは、例えば配列番号１の一部、若しくは全部を含む、
本明細書に開示され、記載されるＤＮＡ配列を多種の出発材料から製造し得る。
例えば、まずＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子を発現する組織由来のｃＤＮＡ調製物(即
ち、ｃＤＮＡライブラリー)、適当な配列番号１またはその中のいずれかの小領 域に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、米国特許第4,889,818号 に記載されるように製造される。該特許は本明細書の一部を構成する。その他の
ＰＣＲの適当な手法は、『PCR Protocols: A Guide to Method and Application
s』Michael A.Innisら編(Academic Press,Inc.(1990年))参照。ＰＣＲを用いれ ば、ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子内のいずれかの領域を増幅のターゲットとするこ とができ、全長または部分的な長さの遺伝子配列を製造し得る。
本明細書に開示され、記載されるＤＮＡ配列を多種の出発材料から製造し得る。
例えば、まずＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子を発現する組織由来のｃＤＮＡ調製物(即
ち、ｃＤＮＡライブラリー)、適当な配列番号１またはその中のいずれかの小領 域に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、米国特許第4,889,818号 に記載されるように製造される。該特許は本明細書の一部を構成する。その他の
ＰＣＲの適当な手法は、『PCR Protocols: A Guide to Method and Application
s』Michael A.Innisら編(Academic Press,Inc.(1990年))参照。ＰＣＲを用いれ ば、ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子内のいずれかの領域を増幅のターゲットとするこ とができ、全長または部分的な長さの遺伝子配列を製造し得る。
【００８９】 本発明のリボ核酸を、前述のポリヌクレオチド合成方法を用いて、または例え
ば、ＲＮＡポリメラーゼでＴＲＡＩＬＬＫ-２ 鋳型ＤＮＡを転写する等の酵素的
な方法により製造し得る。
ば、ＲＮＡポリメラーゼでＴＲＡＩＬＬＫ-２ 鋳型ＤＮＡを転写する等の酵素的
な方法により製造し得る。
【００９０】 本発明のリボ核酸を製造するのに最も好ましい系は、バクテリオファージＴ７
または、バクテリオファージＳＰ６由来のＲＮＡポリメラーゼを用いるものであ
る。これらのＲＮＡポリメラーゼは非常に特異的で、転写される鋳型の5'末端に
バクテリオファージ特異的な配列の挿入を必要とする。前述のManiatisら参照。
または、バクテリオファージＳＰ６由来のＲＮＡポリメラーゼを用いるものであ
る。これらのＲＮＡポリメラーゼは非常に特異的で、転写される鋳型の5'末端に
バクテリオファージ特異的な配列の挿入を必要とする。前述のManiatisら参照。
【００９１】 本発明はまた、配列番号１若しくは配列番号４またはそれらの断片に相補的な
核酸、ＲＮＡまたはＤＮＡを提供する。
核酸、ＲＮＡまたはＤＮＡを提供する。
【００９２】核酸プローブ 本発明はまた、例えば、ゲノム、サブゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのハ
イブリダイゼーションスクリーニング、同様に薬剤耐性腫瘍由来のセルラインま
たは組織からの核酸に対するハイブリダイゼーションを含む、多様な分子生物学
的技術に有用なプローブ及びプライマーを提供する。このようなハイブリダイゼ
ーションスクリーニングは、同じまたは異なる生物からの、相同及び／または機
能的に関連する配列を同定する方法として有用である。配列番号１を含む核酸化
合物若しくはその相補鎖、または、少なくとも長さが14塩基対以上でＴＲＡＩＬ
ＬＫ-２タンパク質若しくはその断片、若しくは機能的に関連するタンパク質を コードするヒトＤＮＡ若しくはｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズするその断片
が提供される。好ましくは、14またはそれ以上の塩基対からなる化合物はＤＮＡ
である。例えば、B.Wallace及びG.Miyada「Oligonucleotide Probes for the Sc
reening of Recombinant DNA Libraries」(Meth.Enzym.,152,432-442,Academic
Ｐｒｅｓｓ（１９８７年))参照。
イブリダイゼーションスクリーニング、同様に薬剤耐性腫瘍由来のセルラインま
たは組織からの核酸に対するハイブリダイゼーションを含む、多様な分子生物学
的技術に有用なプローブ及びプライマーを提供する。このようなハイブリダイゼ
ーションスクリーニングは、同じまたは異なる生物からの、相同及び／または機
能的に関連する配列を同定する方法として有用である。配列番号１を含む核酸化
合物若しくはその相補鎖、または、少なくとも長さが14塩基対以上でＴＲＡＩＬ
ＬＫ-２タンパク質若しくはその断片、若しくは機能的に関連するタンパク質を コードするヒトＤＮＡ若しくはｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズするその断片
が提供される。好ましくは、14またはそれ以上の塩基対からなる化合物はＤＮＡ
である。例えば、B.Wallace及びG.Miyada「Oligonucleotide Probes for the Sc
reening of Recombinant DNA Libraries」(Meth.Enzym.,152,432-442,Academic
Ｐｒｅｓｓ（１９８７年))参照。
【００９３】 プローブ及びプライマーは、当業者に周知の酵素的または組換え技術により、
製造され得る(例えば、前述のSambrookら参照)。プローブは、検出しようとする
核酸配列(「標的配列」)とある程度相補的である一本鎖核酸配列であり得る。プ
ローブは、放射性同位体、抗原または化学ルミネセンス部分等の検出可能な部分
により標識され得る。特定の核酸配列の検出のための核酸ハイブリダイゼーショ
ンの利用については、Kohneの『非ウイルス生物の検出、同定及び定量方法(Meth
od for Detection, Identification and Quantitation)』と題される米国特許第
4,851,330号に記載されている。
製造され得る(例えば、前述のSambrookら参照)。プローブは、検出しようとする
核酸配列(「標的配列」)とある程度相補的である一本鎖核酸配列であり得る。プ
ローブは、放射性同位体、抗原または化学ルミネセンス部分等の検出可能な部分
により標識され得る。特定の核酸配列の検出のための核酸ハイブリダイゼーショ
ンの利用については、Kohneの『非ウイルス生物の検出、同定及び定量方法(Meth
od for Detection, Identification and Quantitation)』と題される米国特許第
4,851,330号に記載されている。
【００９４】 本発明のＤＮＡ配列により、本明細書中の遺伝子配列に特異的にハイブリダイ
ズする能力を有する、比較的短いＤＮＡ(若しくはＲＮＡ)配列を製造し得る。こ
の態様では、適当な長さの核酸プローブが製造される。ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝 子または関連配列をコードするポリヌクレオチドに、特異的にハイブリダイズす
るこれらの核酸プローブの能力は、多様な態様で独特な有用性を与える。最も重
要なことは、与えられた試料中の相補的配列の存在を検出する様々な検定で該プ
ローブを用い得ることである。
ズする能力を有する、比較的短いＤＮＡ(若しくはＲＮＡ)配列を製造し得る。こ
の態様では、適当な長さの核酸プローブが製造される。ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝 子または関連配列をコードするポリヌクレオチドに、特異的にハイブリダイズす
るこれらの核酸プローブの能力は、多様な態様で独特な有用性を与える。最も重
要なことは、与えられた試料中の相補的配列の存在を検出する様々な検定で該プ
ローブを用い得ることである。
【００９５】 特定の態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーを使用することが有利
である。このようなプライマーの配列は、ＰＣＲ技術を用いてＴＲＡＩＬＬＫ- ２ポリペプチドをコードする遺伝子またはポリ核酸部分の限定された部分を検出
、増幅または変異させるのに用いるため、本発明のポりヌクレオチドを用いて設
計される。
である。このようなプライマーの配列は、ＰＣＲ技術を用いてＴＲＡＩＬＬＫ- ２ポリペプチドをコードする遺伝子またはポリ核酸部分の限定された部分を検出
、増幅または変異させるのに用いるため、本発明のポりヌクレオチドを用いて設
計される。
【００９６】 ハイブリダイゼーション試験、または分析に用いられる好ましい核酸配列には
配列番号１で表されるヌクレオチド塩基配列等のＴＲＡＩＬＬＫ-２ポリペプチ ドをコードする、少なくとも約14から約70ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチ
ドに対して相補的なプローブ分子を含む。断片が安定であると共に選択的である
二重分子を形成するのに十分な長さであるが、少なくとも14ヌクレオチドの長さ
により保証される。ハイブリッドの安定性と選択性を増すために、14塩基より長
い長さの相補的配列を有する分子が一般には好まれる。一般には、25〜40ヌクレ
オチド、55〜70ヌクレオチド、または、所望によりそれより長い遺伝子に相補性
の長さの核酸分子を設計することが好まれるであろう。そのような断片は例えば
、化学的な手法により直接断片を合成することによって、米国特許第4,603,102 号(該特許は本明細書の一部を構成する)に記載のＰＣＲ ＴＭ技術等の核酸複製 技術を適用することによって、または、適当な挿入及び適する制限酵素部位を含
む組換えプラスミドより選択したＤＮＡ断片を切り出すことにより容易に製造し
得る。
配列番号１で表されるヌクレオチド塩基配列等のＴＲＡＩＬＬＫ-２ポリペプチ ドをコードする、少なくとも約14から約70ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチ
ドに対して相補的なプローブ分子を含む。断片が安定であると共に選択的である
二重分子を形成するのに十分な長さであるが、少なくとも14ヌクレオチドの長さ
により保証される。ハイブリッドの安定性と選択性を増すために、14塩基より長
い長さの相補的配列を有する分子が一般には好まれる。一般には、25〜40ヌクレ
オチド、55〜70ヌクレオチド、または、所望によりそれより長い遺伝子に相補性
の長さの核酸分子を設計することが好まれるであろう。そのような断片は例えば
、化学的な手法により直接断片を合成することによって、米国特許第4,603,102 号(該特許は本明細書の一部を構成する)に記載のＰＣＲ ＴＭ技術等の核酸複製 技術を適用することによって、または、適当な挿入及び適する制限酵素部位を含
む組換えプラスミドより選択したＤＮＡ断片を切り出すことにより容易に製造し
得る。
【００９７】 以下の指針は、所望の性質のプローブを設計するのに有用である。標的に対し
て完全に相補性であるかどうか等、特定のプローブの感度及び特異性を決定する
多数の要因によって、ハイブリダイゼーション反応の程度及び特異性は影響され
る。種々の実験パラメーター及び条件による影響は、当業者には周知である。
て完全に相補性であるかどうか等、特定のプローブの感度及び特異性を決定する
多数の要因によって、ハイブリダイゼーション反応の程度及び特異性は影響され
る。種々の実験パラメーター及び条件による影響は、当業者には周知である。
【００９８】 第1に、プローブ：標的核酸ハイブリッドの安定性は、分析条件と適合するよ う選択されるべきである。これは、長いＡ及びＴに富む配列を避けること、Ｇ: Ｃ塩基対でハイブリッドを終結すること、及び適当なＴｍ(即ち融解温度)のプロ
ーブを設計することにより達成され得る。オリゴヌクレオチド及び標的配列を含
むハイブリッドの、Ｔｍを含む融解プロフィールは、ハイブリダイゼーション保
護分析を用いて決定され得る。最終分析が行われるであろう温度より約2〜10℃ 高いＴｍとなるような、プローブの長さと％ＧＣ含有量を選択すべきである。Ａ
-Ｔ塩基対に比べ、Ｇ-Ｃ塩基対はより大きい温度安定性を示すので、プローブの
塩基組成もまた重要な要因である。よって、より高いＧ-Ｃ含有量の相補核酸を 含むハイブリダイゼーションはより高い温度でより安定である。
ーブを設計することにより達成され得る。オリゴヌクレオチド及び標的配列を含
むハイブリッドの、Ｔｍを含む融解プロフィールは、ハイブリダイゼーション保
護分析を用いて決定され得る。最終分析が行われるであろう温度より約2〜10℃ 高いＴｍとなるような、プローブの長さと％ＧＣ含有量を選択すべきである。Ａ
-Ｔ塩基対に比べ、Ｇ-Ｃ塩基対はより大きい温度安定性を示すので、プローブの
塩基組成もまた重要な要因である。よって、より高いＧ-Ｃ含有量の相補核酸を 含むハイブリダイゼーションはより高い温度でより安定である。
【００９９】 プローブが使用されるイオン強度、及び、インキュベーション温度もまた考慮
されるべきである。反応混合物のイオン強度が増せばハイブリダイゼーションも
増強し、そして、イオン強度の増加と共にハイブリッド分子の温度安定性も増す
ことが知られている。他方、水素結合を破壊するホルムアミド、尿素、ＤＭＳＯ
及びアルコール等の化学試薬は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー
を増加する。このような試薬による水素結合の脱安定化は、Ｔｍを大きく減らし
得る。一般に、長さ約10〜50塩基の合成オリゴヌクレオチドプローブの至適ハイ
ブリダイゼーションは、所定の二重鎖の融解温度のおよそ5℃下で起こる。至適 温度よりも下の温度でのインキュベーションでは、ミスマッチ塩基配列のハイブ
リダイゼーションが起こり得、そのため特異性が下げられ得る。
されるべきである。反応混合物のイオン強度が増せばハイブリダイゼーションも
増強し、そして、イオン強度の増加と共にハイブリッド分子の温度安定性も増す
ことが知られている。他方、水素結合を破壊するホルムアミド、尿素、ＤＭＳＯ
及びアルコール等の化学試薬は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー
を増加する。このような試薬による水素結合の脱安定化は、Ｔｍを大きく減らし
得る。一般に、長さ約10〜50塩基の合成オリゴヌクレオチドプローブの至適ハイ
ブリダイゼーションは、所定の二重鎖の融解温度のおよそ5℃下で起こる。至適 温度よりも下の温度でのインキュベーションでは、ミスマッチ塩基配列のハイブ
リダイゼーションが起こり得、そのため特異性が下げられ得る。
【０１００】 標的核酸配列の長さ及び、それに応じてプローブ配列の長さもまた重要であり
得る。場合によっては、所望のハイブリダイゼーション特性を持つプローブが得
られる、特定の領域からの位置と長さの異なる複数の配列が存在し得る。別の場
合には、単に1塩基しか違っていないのに、ある配列がもう一方の配列より明ら かに良いこともある。最後に、もし十分な自己相補性があれば、プローブ内で、
分子内及び分子間ハイブリッドが形成され得る。このような構造は、慎重なプロ
ーブ設計によって避けることができる。このような相互作用を検索するコンピュ
ータープログラムが入手可能である。
得る。場合によっては、所望のハイブリダイゼーション特性を持つプローブが得
られる、特定の領域からの位置と長さの異なる複数の配列が存在し得る。別の場
合には、単に1塩基しか違っていないのに、ある配列がもう一方の配列より明ら かに良いこともある。最後に、もし十分な自己相補性があれば、プローブ内で、
分子内及び分子間ハイブリッドが形成され得る。このような構造は、慎重なプロ
ーブ設計によって避けることができる。このような相互作用を検索するコンピュ
ータープログラムが入手可能である。
【０１０１】 ＴＲＡＩＬＬＫ-２、または、ＴＲＡＩＬＬＫ-２関連核酸配列を有すると推測
される試料に対してハイブリダイズさせるのに、分子プローブを使用し得る。ハ
イブリダイゼーション反応は、適当なストリンジェンシー条件下で行われる。
される試料に対してハイブリダイズさせるのに、分子プローブを使用し得る。ハ
イブリダイゼーション反応は、適当なストリンジェンシー条件下で行われる。
【０１０２】 ほかに、このようなＤＮＡ分子は、以下のものを含む多数の技術において使用
され得る：(1)ヒトまたは他の哺乳動物由来のＤＮＡ試料中の多型を検出するた めの診断用ツールとして；(2)ＴＲＡＩＬＬＫ-２、及び、関連ポリペプチドの相
同体を含む可能性のあるＤＮＡライブラリーから、これらの配列を検出または分
離するための手段として;(3)関連する配列を増幅させることを目的とした、該配
列にハイブリダイズするプライマー；及び、(4)天然ＴＲＡＩＬＬＫ-２ ＤＮＡ 配列を変異させるためのプライマー；及び、ＤＮＡ配列と本明細書中に開示され
るＴＲＡＩＬＬＫ-２ ＤＮＡ部分の配列との相同性に依存した他の技術。
され得る：(1)ヒトまたは他の哺乳動物由来のＤＮＡ試料中の多型を検出するた めの診断用ツールとして；(2)ＴＲＡＩＬＬＫ-２、及び、関連ポリペプチドの相
同体を含む可能性のあるＤＮＡライブラリーから、これらの配列を検出または分
離するための手段として;(3)関連する配列を増幅させることを目的とした、該配
列にハイブリダイズするプライマー；及び、(4)天然ＴＲＡＩＬＬＫ-２ ＤＮＡ 配列を変異させるためのプライマー；及び、ＤＮＡ配列と本明細書中に開示され
るＴＲＡＩＬＬＫ-２ ＤＮＡ部分の配列との相同性に依存した他の技術。
【０１０３】 1度合成されれば、オリゴヌクレオチドプローブは幾つか周知のいずれかの方 法によって標識化され得る。例えば、Maniatisら、Molecular Cloning(第2版、1
989年)参照。有用な標識には、放射性同位体及び非放射活性の標識群が含まれる
。同位体標識には、Ｈ3、Ｓ35、Ｐ32、Ｉ125、コバルト及びＣ14が含まれる。同
位体標識のほとんどの方法は酵素の使用を含み、ニックトランスレーション、末
端標識、第2鎖合成、及び、逆転写等の方法を含む。放射標識プローブを使用す る場合には、ハイブリダイゼーションはオートラジオグラフィー、シンチレーシ
ョン計数、またはγ計数により検出し得る。選択される検出方法は、ハイブリダ
イゼーション条件及び、標識に用いられた特定の放射同位体に依存する。
989年)参照。有用な標識には、放射性同位体及び非放射活性の標識群が含まれる
。同位体標識には、Ｈ3、Ｓ35、Ｐ32、Ｉ125、コバルト及びＣ14が含まれる。同
位体標識のほとんどの方法は酵素の使用を含み、ニックトランスレーション、末
端標識、第2鎖合成、及び、逆転写等の方法を含む。放射標識プローブを使用す る場合には、ハイブリダイゼーションはオートラジオグラフィー、シンチレーシ
ョン計数、またはγ計数により検出し得る。選択される検出方法は、ハイブリダ
イゼーション条件及び、標識に用いられた特定の放射同位体に依存する。
【０１０４】 非同位体材料も標識に使用し得、配列内にまたは配列の末端に導入し得る。酵
素的に、または、化学的に修飾ヌクレオチドを結合し得、例えば、非ヌクレオチ
ド-リンカー群を用いてプローブの合成途中または合成後、プローブの化学的修 飾を行い得る。非同位体標識には、蛍光分子、化学蛍光分子、酵素、補酵素、酵
素基質、ハプテン及び他のリガンドが含まれる。本発明の好ましい態様において
、オリゴヌクレオチドプローブの長さは、約18ヌクレオチド以上で、そして、約
50ヌクレオチド以下である。本発明のオリゴヌクレオチドの標識化は、[32Ｐ]- 標識ＡＴＰ、及び、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて酵素的に行い得る。
素的に、または、化学的に修飾ヌクレオチドを結合し得、例えば、非ヌクレオチ
ド-リンカー群を用いてプローブの合成途中または合成後、プローブの化学的修 飾を行い得る。非同位体標識には、蛍光分子、化学蛍光分子、酵素、補酵素、酵
素基質、ハプテン及び他のリガンドが含まれる。本発明の好ましい態様において
、オリゴヌクレオチドプローブの長さは、約18ヌクレオチド以上で、そして、約
50ヌクレオチド以下である。本発明のオリゴヌクレオチドの標識化は、[32Ｐ]- 標識ＡＴＰ、及び、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて酵素的に行い得る。
【０１０５】ベクター 本発明の別の局面は、本発明の核酸を含む組換えＤＮＡクローニングベクター
及び、発現ベクターに関する。好ましい核酸ベクターは、ＤＮＡを含むものであ
る。最も好ましい組換えＤＮＡベクターは、配列番号１の単離されたＤＮＡ配列
を含むものである。
及び、発現ベクターに関する。好ましい核酸ベクターは、ＤＮＡを含むものであ
る。最も好ましい組換えＤＮＡベクターは、配列番号１の単離されたＤＮＡ配列
を含むものである。
【０１０６】 当業者であれば、最も適当なクローニングベクターまたは発現ベクターの選択
は、使用可能な制限酵素部位、ベクターがトランスフェクトまたは形質転換され
れる宿主細胞の型、トランスフェクションまたは形質転換の目的(例えば、染色 体外因子としての安定な形質転換、または宿主染色体への挿入)、分析可能な若 しくは選択可能な標識の存在または不在(例えば、1つの型または別の型の抗生物
質耐性及び代謝マーカー)、及び、宿主細胞中に所望される遺伝子のコピー数を 含む多数の要因に依存する。
は、使用可能な制限酵素部位、ベクターがトランスフェクトまたは形質転換され
れる宿主細胞の型、トランスフェクションまたは形質転換の目的(例えば、染色 体外因子としての安定な形質転換、または宿主染色体への挿入)、分析可能な若 しくは選択可能な標識の存在または不在(例えば、1つの型または別の型の抗生物
質耐性及び代謝マーカー)、及び、宿主細胞中に所望される遺伝子のコピー数を 含む多数の要因に依存する。
【０１０７】 本発明の核酸を運搬するのに適するベクターには、ＲＮＡウイルス、ＤＮＡウ
イルス、細胞溶解性のバクテリオファージ、溶原性バクテリオファージ、安定な
バクテリオファージ、プラスミド、ウイロイド等が含まれる。最も好ましいベク
ターはプラスミドである。
イルス、細胞溶解性のバクテリオファージ、溶原性バクテリオファージ、安定な
バクテリオファージ、プラスミド、ウイロイド等が含まれる。最も好ましいベク
ターはプラスミドである。
【０１０８】 発現ベクターを製造する場合、例えば、構成プロモーターまたは誘導性プロモ
ーターのどちらを使用するべきか等、多数の要因を考慮しなければならないこと
が当業者には理解される。また、製造されるべき核酸またはタンパク質の量が部
分的に、発現系の選択を決定することを当業者は理解する。プロモーター配列に
関して言えば、作動可能に連結された遺伝子の高レベルの制御可能な発現を可能
にするので、誘導性プロモーターが好ましい。例えば、炭素源、金属イオン、及
び熱等、多様なインデューサーに応答する、多数の適当なプロモーターを当業者
であれば認めるであろう。発現ベクターに関連する、その他の決定すべきことに
は、組換えタンパク質の存在位置を決定する配列を含むべきかどうかが含まれる
。例えば、遺伝子のコード領域の上流のシグナルペプチドをコードする配列は、
目的のポリペプチドの細胞外への運搬を指揮させるのに有用である。
ーターのどちらを使用するべきか等、多数の要因を考慮しなければならないこと
が当業者には理解される。また、製造されるべき核酸またはタンパク質の量が部
分的に、発現系の選択を決定することを当業者は理解する。プロモーター配列に
関して言えば、作動可能に連結された遺伝子の高レベルの制御可能な発現を可能
にするので、誘導性プロモーターが好ましい。例えば、炭素源、金属イオン、及
び熱等、多様なインデューサーに応答する、多数の適当なプロモーターを当業者
であれば認めるであろう。発現ベクターに関連する、その他の決定すべきことに
は、組換えタンパク質の存在位置を決定する配列を含むべきかどうかが含まれる
。例えば、遺伝子のコード領域の上流のシグナルペプチドをコードする配列は、
目的のポリペプチドの細胞外への運搬を指揮させるのに有用である。
【０１０９】 本発明はまた、配列番号２に記載のタンパク質を発現させることができる組換
え宿主細胞を構築する方法を提供し、該方法は、配列番号２をコードする単離さ
れたＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡベクターを、宿主細胞に形質転換または他の
方法により導入することを含む。適当な宿主細胞は、外から導入された遺伝子ま
たはタンパク質の高レベルの発現に適応することができ、そして該タンパク質を
、その膜構造中へ組み込むいずれかの真核細胞である。発現のためのベクターは
、配列番号１またはその断片を含むものである。形質転換された宿主細胞は、配
列番号２が発現され、組換え宿主細胞中に組換えＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質 が製造される当業者に周知の条件下で培養され得る。
え宿主細胞を構築する方法を提供し、該方法は、配列番号２をコードする単離さ
れたＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡベクターを、宿主細胞に形質転換または他の
方法により導入することを含む。適当な宿主細胞は、外から導入された遺伝子ま
たはタンパク質の高レベルの発現に適応することができ、そして該タンパク質を
、その膜構造中へ組み込むいずれかの真核細胞である。発現のためのベクターは
、配列番号１またはその断片を含むものである。形質転換された宿主細胞は、配
列番号２が発現され、組換え宿主細胞中に組換えＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質 が製造される当業者に周知の条件下で培養され得る。
【０１１０】 アポトーシスの改変剤としての用途を有する化合物を同定するために、ＴＲＡ
ＩＬＬＫ-２タンパク質に結合する、及び／または、その活性を変更する化合物 を同定することが望ましい。例えば本明細書中に開示されるタンパク質を活性化
若しくは阻害する、阻害剤または他の改変剤を同定または開発しようとする場合
、ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質に結合する化合物を同定することが望ましい。 ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質に結合する薬剤を決定する方法には、ＴＲＡＩＬ ＬＫ-２タンパク質を試験化合物と接触させ、いずれかの適当な手段により結合 をモニターすることを含む。
ＩＬＬＫ-２タンパク質に結合する、及び／または、その活性を変更する化合物 を同定することが望ましい。例えば本明細書中に開示されるタンパク質を活性化
若しくは阻害する、阻害剤または他の改変剤を同定または開発しようとする場合
、ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質に結合する化合物を同定することが望ましい。 ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質に結合する薬剤を決定する方法には、ＴＲＡＩＬ ＬＫ-２タンパク質を試験化合物と接触させ、いずれかの適当な手段により結合 をモニターすることを含む。
【０１１１】 本発明により、ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質に結合する化合物をスクリーニ ングする系が提供され、該スクリーニング系は以下の工程を含む： ａ)ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質を製造する； ｂ)該ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質を試験化合物に曝露する； ｃ)該化合物のＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質への結合を、いずれかの 適当な手段により定量する。
【０１１２】 上述のスクリーニング系の利用により、ＴＲＡＩＬＬＫ-２の生物学的機能を 変更し得る化合物を決定する手段が提供される。このスクリーニング法は、潜在
的な治療剤の有効な高容量のスクリーニングを可能にする、ＰＡＮＤＥＸ(登録 商標)(Baxter-Dade Diagnostics)系等の大規模の、自動化された方法に適用し得
る。
的な治療剤の有効な高容量のスクリーニングを可能にする、ＰＡＮＤＥＸ(登録 商標)(Baxter-Dade Diagnostics)系等の大規模の、自動化された方法に適用し得
る。
【０１１３】 このようなスクリーニングプロトコルでは、本明細書中に記載のように、好ま
しくは組換えＤＮＡ技術によりＴＲＡＩＬＬＫ-２は製造される。ＴＲＡＩＬＬ Ｋ-２タンパク質、または、その断片を含む反応容器に試験化合物を導入する。 ＴＲＡＩＬＬＫ-２の試験化合物による結合は、いずれかの適当な手段により決 定される。例えば、ある方法では、放射活性標識または化学標識された試験化合
物を用い得る。例えば、いずれかの適当な方法により、結合された標識に対する
、結合されなかった標識を定量することにより、タンパク質の化合物による結合
を評価する。試験化合物の結合はまた、米国特許第5,585,277号(該特許は本明細
書の一部を構成する)に記載の方法によっても行われ得る。この方法では、試験 化合物のタンパク質への結合は、例えば、該タンパク質のプロテアーゼに対する
感受性、または、折りたたまれた状態のタンパク質に対する特異的抗体の該タン
パク質への結合の影響をモニターすることによる、折りたたまれたタンパク質の
折りたたまれていないタンパク質に対する割合をモニターすることによって評価
される。
しくは組換えＤＮＡ技術によりＴＲＡＩＬＬＫ-２は製造される。ＴＲＡＩＬＬ Ｋ-２タンパク質、または、その断片を含む反応容器に試験化合物を導入する。 ＴＲＡＩＬＬＫ-２の試験化合物による結合は、いずれかの適当な手段により決 定される。例えば、ある方法では、放射活性標識または化学標識された試験化合
物を用い得る。例えば、いずれかの適当な方法により、結合された標識に対する
、結合されなかった標識を定量することにより、タンパク質の化合物による結合
を評価する。試験化合物の結合はまた、米国特許第5,585,277号(該特許は本明細
書の一部を構成する)に記載の方法によっても行われ得る。この方法では、試験 化合物のタンパク質への結合は、例えば、該タンパク質のプロテアーゼに対する
感受性、または、折りたたまれた状態のタンパク質に対する特異的抗体の該タン
パク質への結合の影響をモニターすることによる、折りたたまれたタンパク質の
折りたたまれていないタンパク質に対する割合をモニターすることによって評価
される。
【０１１４】 前述のスクリーニング方法は、アポトーシスを調節する医薬化合物に対するリ
ードとして、ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質のリガンドを同定するのに有用であ る。例えば、ある比の折りたたまれた状態、折りたたまれていない状態でタンパ
ク質が存在するような条件下で、ＴＲＡＩＬＬＫ-２を試験リガンドと一緒にす ることにより、ＴＲＡＩＬＬＫ-２または関連するその断片に結合するリガンド が同定される。もし試験リガンドが折りたたまれた状態のタンパク質と結合すれ
ば、折りたたまれたタンパク質の割合は、試験リガンドがタンパク質と結合しな
い場合と比べて多くなる。折りたたまれたタンパク質と折りたたまれていない状
態の割合は、例えば、プロテアーゼによる消化の感受性、または特異的抗体に対
する結合、またはシャペロニンタンパク質に対する結合、またはいずれかの適当
な表面への結合によって簡単に決定できる。
ードとして、ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質のリガンドを同定するのに有用であ る。例えば、ある比の折りたたまれた状態、折りたたまれていない状態でタンパ
ク質が存在するような条件下で、ＴＲＡＩＬＬＫ-２を試験リガンドと一緒にす ることにより、ＴＲＡＩＬＬＫ-２または関連するその断片に結合するリガンド が同定される。もし試験リガンドが折りたたまれた状態のタンパク質と結合すれ
ば、折りたたまれたタンパク質の割合は、試験リガンドがタンパク質と結合しな
い場合と比べて多くなる。折りたたまれたタンパク質と折りたたまれていない状
態の割合は、例えば、プロテアーゼによる消化の感受性、または特異的抗体に対
する結合、またはシャペロニンタンパク質に対する結合、またはいずれかの適当
な表面への結合によって簡単に決定できる。
【０１１５】 本発明はまた、活性成分として配列番号２に記載のポリペプチド化合物、また
はその医薬的に許容され得る非毒性の塩、及び、医薬的に許容され得る固体若し
くは液体担体を含む医薬的組成物を提供する。例えば、ＴＲＡＩＬＬＫ-２を含 む化合物を一般的な医薬担体及び賦形剤と予め混合し、錠剤、カプセル、エリキ
シル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤等の形体で使用し得る。ＴＲＡＩＬＬＫ
-２を含む組成物は、約0.1重量％から90重量％の活性化合物を含み、より一般的
には約10％から30％含む。組成物は、コーンスターチまたはゼラチン、ラクトー
ス、ショ糖、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸ジカルシウム
、塩化ナトリウム、及びアルギニン酸等の通常の担体及び賦形剤を含み得る。化
合物は、経口または非経口投与用に製剤し得る。
はその医薬的に許容され得る非毒性の塩、及び、医薬的に許容され得る固体若し
くは液体担体を含む医薬的組成物を提供する。例えば、ＴＲＡＩＬＬＫ-２を含 む化合物を一般的な医薬担体及び賦形剤と予め混合し、錠剤、カプセル、エリキ
シル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤等の形体で使用し得る。ＴＲＡＩＬＬＫ
-２を含む組成物は、約0.1重量％から90重量％の活性化合物を含み、より一般的
には約10％から30％含む。組成物は、コーンスターチまたはゼラチン、ラクトー
ス、ショ糖、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸ジカルシウム
、塩化ナトリウム、及びアルギニン酸等の通常の担体及び賦形剤を含み得る。化
合物は、経口または非経口投与用に製剤し得る。
【０１１６】 当業者であれば、ＩＣ50値が、試験された化合物の選択性に依存することを理
解するであろう。例えば、ＩＣ50が10ｎＭより少ない化合物は、薬物治療におけ
る非常によい候補と見なされる。しかしながら、より低い親和性を有するが、特
定の標的に選択性を有する化合物は、それよりもよい候補かもしれない。当業者
であれば、特定の化合物の結合ポテンシャル、阻害活性、または選択性に関する
いずれかの情報が、医薬産物を開発するのに有用であることを認識する。
解するであろう。例えば、ＩＣ50が10ｎＭより少ない化合物は、薬物治療におけ
る非常によい候補と見なされる。しかしながら、より低い親和性を有するが、特
定の標的に選択性を有する化合物は、それよりもよい候補かもしれない。当業者
であれば、特定の化合物の結合ポテンシャル、阻害活性、または選択性に関する
いずれかの情報が、医薬産物を開発するのに有用であることを認識する。
【０１１７】 以下の実施例により本発明はよりよく説明される。当業者は、記載の特定の試
薬、設備、及び方法が例示的なものであって、本発明をいかなる意味でも限定す
るものでないことを理解するであろう。
薬、設備、及び方法が例示的なものであって、本発明をいかなる意味でも限定す
るものでないことを理解するであろう。
【０１１８】 実施例１ ｍＲＮＡからのＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子のＲＴ-ＰＣＲ増幅 一般的な方法を用いて、ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子を逆転写酵素ＰＣＲ(ＲＴ- ＰＣＲ)により単離した。ＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子を発現する組織からの総ＲＮ
Ａを標準的な方法により調製した。一本鎖ｃＤＮＡ合成を市販のキット(SuperSc
ript(登録商標)系；Life Technologies)を、例えば第49塩基対のＡＴＧ開始部位
、及び、第798塩基対の後ろのＴＧＡ終止部位である、配列番号１のいずれかの 適当な領域に対する特異的プライマーと共に用いて、ＰＣＲによって達成される
。
Ａを標準的な方法により調製した。一本鎖ｃＤＮＡ合成を市販のキット(SuperSc
ript(登録商標)系；Life Technologies)を、例えば第49塩基対のＡＴＧ開始部位
、及び、第798塩基対の後ろのＴＧＡ終止部位である、配列番号１のいずれかの 適当な領域に対する特異的プライマーと共に用いて、ＰＣＲによって達成される
。
【０１１９】 増幅は、最初の鎖ｃＤＮＡ(真空下で乾燥)に、8μｌの10×合成緩衝液(200ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ8.4；500ｍＭ ＫＣｌ、25ｍＭ ＭｇＣｌ2、1ｕｇ／ｕ
ｌ ＢＳＡ)；68μｌ蒸留水；1μｌ各プライマーの10ｕＭ溶液；及び、１μｌ Ｔ
ａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ(2〜５Ｕ／μｌ)。ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを 変性するため、反応物を94℃で5分間加熱する。その後、いずれかの適当な温度 循環機器を用いて、15〜30サイクルのＰＣＲを行う。増幅された試料は、適当な
大きさの断片についてアガロースゲル電気泳動により分析し得る。
ｌ ＢＳＡ)；68μｌ蒸留水；1μｌ各プライマーの10ｕＭ溶液；及び、１μｌ Ｔ
ａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ(2〜５Ｕ／μｌ)。ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを 変性するため、反応物を94℃で5分間加熱する。その後、いずれかの適当な温度 循環機器を用いて、15〜30サイクルのＰＣＲを行う。増幅された試料は、適当な
大きさの断片についてアガロースゲル電気泳動により分析し得る。
【０１２０】 実施例２ 宿主細胞中でＴＲＡＩＬＬＫ-２を発現するためのベクターの製造 大腸菌等、多様な原核宿主細胞中でＴＲＡＩＬＬＫ-２、または、その断片を 発現するのに適した発現ベクターは簡単に作れる。ベクターは、複製起点(Ｏｒ ｉ)、及び、形質転換工程の後、ベクターの挿入された細胞を選択するのに有用 なアンピシリン耐性遺伝子(Ａｍｐ)を含み、そしてさらに、ＴＲＡＩＬＬＫ-２ コード領域に対して制御可能に連結されたＴ７プロモーター及びＴ７ターミネー
ター配列を含む。プラスミドｐＥＴ１１Ａ(Novogenより入手、Madison WI)は適 当な親プラスミドである。ｐＥＴ１１ＡはエンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａ
ｍＨＩによる制限により線状化される。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ粘着末端を内包
し、そして、配列番号１に記載のＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子のコード領域または その断片を含むＤＮＡ断片に、線状化ｐＥＴ１１Ａは結合される。
ター配列を含む。プラスミドｐＥＴ１１Ａ(Novogenより入手、Madison WI)は適 当な親プラスミドである。ｐＥＴ１１ＡはエンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａ
ｍＨＩによる制限により線状化される。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ粘着末端を内包
し、そして、配列番号１に記載のＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子のコード領域または その断片を含むＤＮＡ断片に、線状化ｐＥＴ１１Ａは結合される。
【０１２１】 この構築に使用されるＴＲＡＩＬＬＫ-２遺伝子は、コードされたタンパク質 産物の精製を容易にすることを目的として5'末端(コードされるタンパク質のア ミノ末端)を少し修飾し得る。この目的のため、8個のヒスチジン残基をコードす
るオリゴヌクレオチドが、ＡＴＧ開始コドンの後ろに挿入される。コードされる
タンパク質のアミノ末端へのヒスチジン残基の配置によりＩＭＡＣ1段階タンパ ク質精製方法が可能になる。
るオリゴヌクレオチドが、ＡＴＧ開始コドンの後ろに挿入される。コードされる
タンパク質のアミノ末端へのヒスチジン残基の配置によりＩＭＡＣ1段階タンパ ク質精製方法が可能になる。
【０１２２】 実施例３ ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質の組換え発現及び精製 ＴＲＡＩＬＬＫ-２またはその断片をコードするＯＲＦを運び、該ＯＲＦが発 現プロモーターに作動可能に連結された発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ ３)(ｈｓｄＳ ｇａｌ ｌｃＩｔｓ８５７ ｉｎｄ１Ｓａｍ７ｎｉｎ５ｌａｃＵＶ ５-Ｔ７遺伝子１)に標準的な方法を用いて形質転換する。アンピシリンに対する
耐性により選択された形質転換体をランダムに選び、ベクターの存在をアガロー
スゲル電気泳動により、迅速プラスミド調製を用いて試験した。ベクターを含有
するコロニーをＬブロス上で育て、ベクターに運ばれるＯＲＦによりコードされ
るタンパク質産物を、実質的に米国特許第4,569,794号に記載の固定化金属イオ ンアフィニティークロマトグラフィー(ＩＭＡＣ)により精製する。
耐性により選択された形質転換体をランダムに選び、ベクターの存在をアガロー
スゲル電気泳動により、迅速プラスミド調製を用いて試験した。ベクターを含有
するコロニーをＬブロス上で育て、ベクターに運ばれるＯＲＦによりコードされ
るタンパク質産物を、実質的に米国特許第4,569,794号に記載の固定化金属イオ ンアフィニティークロマトグラフィー(ＩＭＡＣ)により精製する。
【０１２３】 簡略化すると、ＩＭＡＣカラムは以下のように調整される。金属を含まないキ
レート樹脂(例えば、セファロース６Ｂ ＩＤＡ、Pharmacia)を保存剤を除くため
蒸留水中で洗浄し、50ｍＭ塩化金属または硫酸金属水溶液を、樹脂の約75％の間
隙が有色の金属イオンで飽和されるまで添加すことにより、適当な金属イオン( 例えば、Ｎｉ(II)、Ｃｏ(II)またはＣｕ(II))を注入する。それにより、このカ ラムは組換えタンパク質産物を含む粗細胞抽出物を受ける準備ができる。
レート樹脂(例えば、セファロース６Ｂ ＩＤＡ、Pharmacia)を保存剤を除くため
蒸留水中で洗浄し、50ｍＭ塩化金属または硫酸金属水溶液を、樹脂の約75％の間
隙が有色の金属イオンで飽和されるまで添加すことにより、適当な金属イオン( 例えば、Ｎｉ(II)、Ｃｏ(II)またはＣｕ(II))を注入する。それにより、このカ ラムは組換えタンパク質産物を含む粗細胞抽出物を受ける準備ができる。
【０１２４】 結合されていないタンパク質及び他の材料を、カラムを適当な緩衝液(ｐＨ7.5
)で洗浄して除いた後、結合しているタンパク質をｐＨ4.3のいずれかの適当な緩
衝液、または、好ましくはｐＨ7.5でイミダゾールを含む緩衝液で溶出する。
)で洗浄して除いた後、結合しているタンパク質をｐＨ4.3のいずれかの適当な緩
衝液、または、好ましくはｐＨ7.5でイミダゾールを含む緩衝液で溶出する。
【０１２５】 実施例４ ＴＲＡＩＬＬＫ-２ｍＲＮＡの組織分布 ＴＲＡＩＬＬＫ-２ ｍＲＮＡの、多様なヒト組織における存在をノーザン分析
により分析した。異なる組織または培養細胞からの総ＲＮＡを、標準塩化グアニ
ジン／フェノール抽出方法により単離し、オリゴ(ｄＴ)-セルロース型７(Pharma
cia)を用いてポリ-Ａ+ ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ試料の電気泳動をホルムアミ ド中で行い、続いて、Ｚｅｔａ-プローブ(登録商標)ナイロン膜(Bio-Rad,Hercul
es,Calif.)へのキャピラリー転移を行った。配列番号１は、ＭｕｌｔｉＰｒｉｍ
ｅ(登録商標)ランダムプライミングキット(Amersham,Arlington heights,Ill.) を用いたプローブの製造の鋳型であった。標識化反応の効率は、組み込まれる各
μｇの鋳型当り、およそ4×1010ｃｐｍであった。ハイブリダイゼーション緩衝 液は、0.5Ｍリン酸ナトリウム、7％ＳＤＳ(重量／容量)、1％ＢＳＡ(重量／容量
)及び、1ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいた。プレハイブリダイゼーションは、65℃の ハイブリダイゼーション緩衝液中で2時間行われ、そして、32Ｐ-標識化プローブ
を添加し、インキュベーションを一晩続けた。フィルターを緩衝液Ａ(40ｍＭリ ン酸ナトリウム(ｐＨ7.2)、5％ＳＤＳ(重量／容量)、0．５％ＢＳＡ(重量／容量
) 及び、1ｍＭ ＥＤＴＡ)中、65℃で1時間、その後、緩衝液Ｂ(40ｍＭリン酸ナト リウム(ｐＨ7.2)、1％ＳＤＳ(重量／容量)及び、1ｍＭ ＥＤＴＡ)中、65℃で20 分洗浄した。フィルターを風乾し、Ｋｏｄａｋ Ｘ-ＯＭＡＴ ＡＲフィルムに−8
0℃で補力スクリーンと共に曝露した。
により分析した。異なる組織または培養細胞からの総ＲＮＡを、標準塩化グアニ
ジン／フェノール抽出方法により単離し、オリゴ(ｄＴ)-セルロース型７(Pharma
cia)を用いてポリ-Ａ+ ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ試料の電気泳動をホルムアミ ド中で行い、続いて、Ｚｅｔａ-プローブ(登録商標)ナイロン膜(Bio-Rad,Hercul
es,Calif.)へのキャピラリー転移を行った。配列番号１は、ＭｕｌｔｉＰｒｉｍ
ｅ(登録商標)ランダムプライミングキット(Amersham,Arlington heights,Ill.) を用いたプローブの製造の鋳型であった。標識化反応の効率は、組み込まれる各
μｇの鋳型当り、およそ4×1010ｃｐｍであった。ハイブリダイゼーション緩衝 液は、0.5Ｍリン酸ナトリウム、7％ＳＤＳ(重量／容量)、1％ＢＳＡ(重量／容量
)及び、1ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいた。プレハイブリダイゼーションは、65℃の ハイブリダイゼーション緩衝液中で2時間行われ、そして、32Ｐ-標識化プローブ
を添加し、インキュベーションを一晩続けた。フィルターを緩衝液Ａ(40ｍＭリ ン酸ナトリウム(ｐＨ7.2)、5％ＳＤＳ(重量／容量)、0．５％ＢＳＡ(重量／容量
) 及び、1ｍＭ ＥＤＴＡ)中、65℃で1時間、その後、緩衝液Ｂ(40ｍＭリン酸ナト リウム(ｐＨ7.2)、1％ＳＤＳ(重量／容量)及び、1ｍＭ ＥＤＴＡ)中、65℃で20 分洗浄した。フィルターを風乾し、Ｋｏｄａｋ Ｘ-ＯＭＡＴ ＡＲフィルムに−8
0℃で補力スクリーンと共に曝露した。
【０１２６】 実施例５ ＴＲＡＩＬＬＫ-２を結合するリガンドをシャペロニンタンパク質 分析を用いて検出 ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、4ｕｇ／ｍｌのＴｒｉｓで緩衝化した塩水(Ｔ
ＢＳ：10ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ7.5)、0.2Ｍ ＮａＣｌ)中のタンパク質溶液
で数時間インキュベートすることによりシャペロニンでコートした。その後、プ
レートを3回、ＴＢＳを含む0.1％Ｔｗｅｅｎ-２０(ＴＢＳＴ)で洗浄する。その 後、約50μｌ容量のＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質の混合物(シャペロニンの約50
％の結合部位を飽和させるのに有効な量)及び試験化合物(10-9〜10-5Ｍ)を、プ レートの各ウェルに添加し、約60分インキュベートする。ウェル中の溶液標本を
新しいプレートのウェルに移し、室温で60分インキュベートした後、ＴＢＳＴで
3回洗浄する。次に、ＴＲＡＩＬＬＫ-２に特異的な抗体、及び、5％脱脂粉乳を5
０μｌ、各ウェルに添加し、30分室温でインキュベートする。洗浄後、約50μｌ
のＴＢＳＴ、及び、5％脱脂粉乳中に適当に溶解したヤギ抗ウサギＩｇＧアルカ リホスファターゼコンジュゲートを各ウェルに添加し、30分室温でインキュベー
トした。プレートを再びＴＢＳＴで洗浄し、0.1％ジエタノールアミン中の0.1ｍ
ｌの1ｍｇ／ｍｌ ｐ-リン酸ニトロフェニルを添加した。色素の形成(結合された
アルカリホスファターゼ抗体コンジュゲートに比例)をＥＬＩＳＡプレート読み 取り機によりモニターする。試験リガンドの結合が起これば、試験リガンドがな
い場合と比べて溶液中により高い濃度でＴＲＡＩＬＬＫ-２があることが、ＥＬ ＩＳＡ分析により示される。
ＢＳ：10ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ7.5)、0.2Ｍ ＮａＣｌ)中のタンパク質溶液
で数時間インキュベートすることによりシャペロニンでコートした。その後、プ
レートを3回、ＴＢＳを含む0.1％Ｔｗｅｅｎ-２０(ＴＢＳＴ)で洗浄する。その 後、約50μｌ容量のＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質の混合物(シャペロニンの約50
％の結合部位を飽和させるのに有効な量)及び試験化合物(10-9〜10-5Ｍ)を、プ レートの各ウェルに添加し、約60分インキュベートする。ウェル中の溶液標本を
新しいプレートのウェルに移し、室温で60分インキュベートした後、ＴＢＳＴで
3回洗浄する。次に、ＴＲＡＩＬＬＫ-２に特異的な抗体、及び、5％脱脂粉乳を5
０μｌ、各ウェルに添加し、30分室温でインキュベートする。洗浄後、約50μｌ
のＴＢＳＴ、及び、5％脱脂粉乳中に適当に溶解したヤギ抗ウサギＩｇＧアルカ リホスファターゼコンジュゲートを各ウェルに添加し、30分室温でインキュベー
トした。プレートを再びＴＢＳＴで洗浄し、0.1％ジエタノールアミン中の0.1ｍ
ｌの1ｍｇ／ｍｌ ｐ-リン酸ニトロフェニルを添加した。色素の形成(結合された
アルカリホスファターゼ抗体コンジュゲートに比例)をＥＬＩＳＡプレート読み 取り機によりモニターする。試験リガンドの結合が起これば、試験リガンドがな
い場合と比べて溶液中により高い濃度でＴＲＡＩＬＬＫ-２があることが、ＥＬ ＩＳＡ分析により示される。
【０１２７】 実施例６ ＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質に対する抗体の産生 実質的に純粋なＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質またはその断片を、周知のいず れかの方法、または、本明細書中に特に開示される方法によって、トランスフェ
クト若しくは形質転換された細胞から単離する。最終調製物におけるタンパク質
濃度は、例えば、レベルが約1〜5ｕｇ／ｍｌとなるようＡｍｉｃｏｎフィルター
装置を介した濾過により調節される。モノクローナルまたはポリクローナル抗体
は以下のように調製し得る。
クト若しくは形質転換された細胞から単離する。最終調製物におけるタンパク質
濃度は、例えば、レベルが約1〜5ｕｇ／ｍｌとなるようＡｍｉｃｏｎフィルター
装置を介した濾過により調節される。モノクローナルまたはポリクローナル抗体
は以下のように調製し得る。
【０１２８】 モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein(Nature,256,495(1975年))の方法
または、その修正された方法に従って、マウスハイブリドーマから調製し得る。
簡単に言うと、数週間にわたる期間、数マイクログラムのタンパク質、その断片
、または融合ペプチドによってマウスを繰り返し接種する。その後、マウスを殺
し、抗体を産生する脾臓の細胞を単離する。脾臓細胞を、ポリエチレングリコー
ルを用いてマウスのミエローマ細胞と融合する。抗体を産生する融合された細胞
は、例えばE.Engvall(Meth.Enzymol.,70,419(1980年))に記載のＥＬＩＳＡ等の いずれかの適当な免疫分析法により同定される。
または、その修正された方法に従って、マウスハイブリドーマから調製し得る。
簡単に言うと、数週間にわたる期間、数マイクログラムのタンパク質、その断片
、または融合ペプチドによってマウスを繰り返し接種する。その後、マウスを殺
し、抗体を産生する脾臓の細胞を単離する。脾臓細胞を、ポリエチレングリコー
ルを用いてマウスのミエローマ細胞と融合する。抗体を産生する融合された細胞
は、例えばE.Engvall(Meth.Enzymol.,70,419(1980年))に記載のＥＬＩＳＡ等の いずれかの適当な免疫分析法により同定される。
【０１２９】 ポリクローナル抗血清は、本明細書中に記載のタンパク質、その断片、または
その融合タンパク質で適当な動物を免疫化することを含む周知の方法(例えば、J
.Vaitukaitisら、Clin.Endocrinol.Metab.,33,988(1971年)参照)によって調製し
得る。少容量(例えば、ナノグラム量)の抗原を複数の皮内部位に投与する方法が
最も信頼できる方法である。
その融合タンパク質で適当な動物を免疫化することを含む周知の方法(例えば、J
.Vaitukaitisら、Clin.Endocrinol.Metab.,33,988(1971年)参照)によって調製し
得る。少容量(例えば、ナノグラム量)の抗原を複数の皮内部位に投与する方法が
最も信頼できる方法である。
【０１３０】
【表２】 配列表 配列番号１ GAAAGGGAGCAGTCACGCCTTACTTCTTGCCTTAAGAAAAGAGAAGAAATGAAACTGAA GGAGTGTGTTTCCATCCTCCCACGGAAGGAAAGCCCCTCTGTCCGATCCTCCAAAGACG GAAAGCTCCCACGCGTCCGGCTGGCTGCAACCTTGCTGCTGGCACTGCTGTCTTGCTG CCTCAANGGTGGTGTCTTTCTACCAGGTGGCCGCCCTGCAAGGGGACCTGGCCAGCCT CCGGGCAGAGCTGCAGGGCCACCACGCGGAGAAGCTGCCAGCAGGAGCAGGAGCCCC CCAAGGCCGGCCTGGAGGAAGCTCCCAGCTGTCACCGCGGGACTGAAAATCTTTGAAC CACCAGCTCCAGGAGAAGGCAACTCCAGTCAGAACAGCAGAAATAAGCGTGCCGTTCA GGGTCCAGAAGAAACAGGATCTTACACATTTGTTCCATGGCTTCTCAGCTTTAAAAGGGG AAGTGCCCTAGAAGAAAAAGAGAATAAAATATTGGTCAAAGAAACTGGTTACTTTTTTATA TATTGGTCAGGTTTTATATACTGATAAGACCTACGCCATGGGACATCTAATTCAGAGGAAG AAGGTCCATGTCTTTGGGGATGAATTGAGTCTGGTGACTTTGTTTCGATGTATTCAAAAT ATGCCTGAAACACTACCCAATAATTCCTGCTATTCAGCTGGCATTGCAAAACTGGAAGAA GGAGATGAACTCCAACTTGCAATACCAAGAGAAAATGCACAAATATCACTGGATGGAGAT GTCACATTTTTTGGTGCATTGAAACTGCTGTGACCTACTTACACCATGTCTGTAGCTATTT TCCTCCCTTTCTCTGTACCTCTAAGAAGAAAGAATCTAACTG 配列番号２ MKLKECVSILPRKESPSVRSSKDGKLPRVRLAATLLLALLSCCLXGGVFLPGGRPARGPGQP PGRAAGPPRGEAASRSRSPPRPAWRKLPAVTAGLKIFEPPAPGEGNSSQNSRNKRAVQGP EETGSYTFVPWLLSFKRGSALEEKENKILVKETGYFFIYGQVLYTDKTYAMGHLIQRKKVHVF GDELSLVTLFRCIQNMPETLPNNSCYSAGIAKLEEGDELQLAIPRENAQISLDGDVTFFGALKL L
【０１３１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８５ Ｃ０７Ｋ 14/525 1/19 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｒ 1:19） 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ， ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，Ｓ Ｎ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ， ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB02 FB08 4B024 AA01 AA11 BA53 BA80 CA04 CA09 DA06 FA02 FA07 FA10 GA03 GA11 4B064 AG01 AG27 CA02 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA92X AA93Y AB01 AB05 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA07 AA13 BA01 BA22 BA44 CA53 DA25 NA14 ZB262 4C085 AA13 AA14 DD62 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 DA76 EA28 EA50 FA72 FA73 FA74 GA26 HA05
Claims (18)
- 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なタンパク
質。 - 【請求項２】 配列番号２のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のタンパ
ク質をコードする単離された核酸化合物。 - 【請求項３】 配列番号１に対して相補的な、単離された核酸化合物。
- 【請求項４】 低いストリンジェンシー条件下で、配列番号１に対してハイ
ブリダイズする単離された核酸化合物。 - 【請求項５】 ＴＮＦファミリーリガンド活性を有するタンパク質をコード
し、高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１に対してハイブリダイズする
単離された核酸化合物。 - 【請求項６】 配列番号１を含む単離された核酸化合物を含むベクター。
- 【請求項７】 該単離された核酸化合物がプロモーター配列に対して作動可
能に連結されている、請求項６に記載のベクター。 - 【請求項８】 請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項９】 請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項１０】 配列番号２を発現する能力を有する組換え宿主細胞を構築
する方法であって、いずれかの適当な手段により該宿主細胞に請求項７に記載の
ベクターを導入することを含む方法。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の組換え宿主細胞中で配列番号２を発現
させる方法であって、該組換え宿主細胞を遺伝子発現に適する条件下で培養する
ことを含む方法。 - 【請求項１２】 配列番号２として同定されるタンパク質に結合する化合物
を同定する方法であって、 ａ)配列番号２を含む、実質的に精製されたタンパク質の調製品を 試験化合物と合す工程；そして、 ｂ)該タンパク質と該化合物の間の結合相互作用を、いずれかの適 当な手段によりモニターする工程、 を含む方法。 - 【請求項１３】 該断片は配列番号１からの少なくとも14の連続した塩基対
から成る、配列番号１の断片を含む核酸分子。 - 【請求項１４】 配列番号２として同定されるタンパク質に対して選択的に
結合する抗体。 - 【請求項１５】 活性成分としてＴＲＡＩＬＬＫ-２タンパク質を、1または
それ以上の医薬的に許容され得るそれらの担体、賦形剤、または希釈剤と共に含
む医薬製剤。 - 【請求項１６】 処置を必要とする患者において癌を処置するのに使用する
ための、ＴＲＡＩＬＬＫ-２またはそのアナログ。 - 【請求項１７】 処置を必要とする患者において癌を処置する方法であって
、活性成分としてＴＲＡＩＬＬＫ-２を含む組成物の有効量を投与することを含 む方法。 - 【請求項１８】 癌が乳癌である請求項１７に記載の方法。
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| US60/096,173 | 1998-08-11 | ||
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|---|---|
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ID=26746898
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000521688A Withdrawn JP2002503444A (ja) | 1997-11-26 | 1998-11-23 | リガンドファミリー遺伝子 |
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| JP (1) | JP2002503444A (ja) |
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