JP2002502600A - ヒトセリンプロテアーゼおよびセルピンポリペプチド - Google Patents
ヒトセリンプロテアーゼおよびセルピンポリペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、新規のヒト分泌タンパク質およびそのようなタンパク質をコードする遺伝子のコード領域を含む単離された核酸に関する。ヒト分泌タンパク質を産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法もまた提供される。本発明はさらに、これらの新規のヒト分泌タンパク質に関する障害を診断および処置するために有用な診断方法および治療方法に関する。
Description
【0001】 (発明の分野) 本発明は、新しく同定されたヒトポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレ
オチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの使用、ならびにそれらの産生に関する。より具体的には、本発明は
、新規なセリンプロテアーゼポリペプチド、セルピンポリペプチド、およびこの
ようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
オチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの使用、ならびにそれらの産生に関する。より具体的には、本発明は
、新規なセリンプロテアーゼポリペプチド、セルピンポリペプチド、およびこの
ようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0002】 (発明の背景) プロテアーゼの作用を通した局在化されたタンパク質分解性活性は、種々の重
要な生物学的プロセスにおいて重要な調節的な役割を果たす。例えば、プラスミ
ン酵素は、血流遮断、新脈管形成、腫瘍転移、細胞性遊走(cellular
migration)および排卵においてそのような役割を果たす。プラスミン
は、その前駆体であるチモーゲンプラスミノーゲンから、プラスミノーゲン活性
化因子(PA)(例えば、組織型PA(t−PA)およびウロキナーゼ型(u−
PA)、これらは両方ともセリンプロテアーゼである)の作用によって産生され
る。PAシステムの活性は、いくつかの機構によって正確に調節されており、そ
のうちの1つはt−PAおよびu−PAの特異的プラスミノーゲン活性化因子イ
ンヒビターとの相互作用に関する。これらのセリンプロテアーゼインヒビター(
すなわち、セルピン)の中で、1型プラスミノーゲン活性化因子インヒビター(
PAI−1)は、u−PA、ならびにt−PAの単鎖および二本鎖形態を効率的
に阻害する能力において独特である。高いPAI−1レベルは、血栓塞栓性疾患
の危険性増加と関連するが、PAI−1欠損は、遺伝される常染色体の劣性出血
障害を表し得る。例えば、Reilly,T.M.ら、Recombinant
plasminogen activator inhibitor typ
e 1:a review of structural,functiona
l,and bioligical aspects、Blood Coag.
And Fibrinolysis 5:73−81(1994)を参照のこと
。
要な生物学的プロセスにおいて重要な調節的な役割を果たす。例えば、プラスミ
ン酵素は、血流遮断、新脈管形成、腫瘍転移、細胞性遊走(cellular
migration)および排卵においてそのような役割を果たす。プラスミン
は、その前駆体であるチモーゲンプラスミノーゲンから、プラスミノーゲン活性
化因子(PA)(例えば、組織型PA(t−PA)およびウロキナーゼ型(u−
PA)、これらは両方ともセリンプロテアーゼである)の作用によって産生され
る。PAシステムの活性は、いくつかの機構によって正確に調節されており、そ
のうちの1つはt−PAおよびu−PAの特異的プラスミノーゲン活性化因子イ
ンヒビターとの相互作用に関する。これらのセリンプロテアーゼインヒビター(
すなわち、セルピン)の中で、1型プラスミノーゲン活性化因子インヒビター(
PAI−1)は、u−PA、ならびにt−PAの単鎖および二本鎖形態を効率的
に阻害する能力において独特である。高いPAI−1レベルは、血栓塞栓性疾患
の危険性増加と関連するが、PAI−1欠損は、遺伝される常染色体の劣性出血
障害を表し得る。例えば、Reilly,T.M.ら、Recombinant
plasminogen activator inhibitor typ
e 1:a review of structural,functiona
l,and bioligical aspects、Blood Coag.
And Fibrinolysis 5:73−81(1994)を参照のこと
。
【0003】 (セルピン機構) セルピンは、広範な種々のタンパク質産物を含む遺伝子ファミリーであり、こ
れには血漿におけるプロテイナーゼインヒビターの多くが含まれる(Huber
およびCarrell、1989;セルピン機構に関するこの章において引用さ
れる参考文献の完全な引用は、この章の結びに列挙される)。しかし、その名前
にも関わらず、全てのセルピンがプロテイナーゼインヒビターであるわけではな
い。それらは、ステロイド結合グロブリン、プロホルモンアンギオテンシノゲン
、卵白タンパク質オボアルブミン、およびオオムギタンパク質Z(ビールの主要
構成成分)を含む。セルピンは、共通の三次構造を共有し(Doolittle
.1983)、そして共通の祖先から進化してきたと考えられる(Huntおよ
びDayhoff.1980)。認識可能な配列相同性を有するタンパク質は、
脊椎動物、植物、昆虫、およびウイルスにおいて同定されているが、現在までに
原核生物においては同定されていない(HuberおよびCarrell.19
89;Sasaki.1991;Komiyama、Ray、Pickupら、
1994)。現在のセルピン構造のモデルは、このファミリーの1メンバーであ
るa−1−抗トリプシン(a1AT)(a−1プロテイナーゼインヒビターとも
呼ばれる)の精液X線結晶学的研究に大きく基づいている(HuberおよびC
arrell.1989)。その反応中心において切断された、a1ATの改変
形態の構造は、Loebermannおよび共同研究者によって1984年に解
明された(Loebermann、Tokuoka,Deisenhoferお
よびHuber.1984)。この構造の興味深い特徴は、通常反応中心を含む
2つの残基(Met−Ser)が、分子の反対の末端にほぼ70Å離れて見出さ
れることであった。Loebermannおよび共同研究者は、インヒビター構
造の大きな再配置よりもむしろ、反応中心のペプチド結合の切断の際に、緊張し
た立体構造の緩和が起こることを提案した。このモデルにおいて、ネイティブの
反応中心は、露出したループの部分(緊張したループ(strained lo
op)とも呼ばれる)である(Loebermann、Tokuoka、Dei
senhoferおよびHuber.1984;CarrellおよびBosw
ell.1986;Sprang.1992)。切断の際に、このループは移動
するかまたは「跳ね返り」、そして主要なb−シート構造(b−シートA)の中
央鎖(central strand)の1つになる。この変換は、熱安定性の
大きな増大によって達成される(CarrellおよびOwen.1985;G
ettinsおよびHarten.1988;Bruch,WeissおよびE
ngel.1988;Lawrence,Olson,Palaniappan
およびGinsburg.1994b)。
れには血漿におけるプロテイナーゼインヒビターの多くが含まれる(Huber
およびCarrell、1989;セルピン機構に関するこの章において引用さ
れる参考文献の完全な引用は、この章の結びに列挙される)。しかし、その名前
にも関わらず、全てのセルピンがプロテイナーゼインヒビターであるわけではな
い。それらは、ステロイド結合グロブリン、プロホルモンアンギオテンシノゲン
、卵白タンパク質オボアルブミン、およびオオムギタンパク質Z(ビールの主要
構成成分)を含む。セルピンは、共通の三次構造を共有し(Doolittle
.1983)、そして共通の祖先から進化してきたと考えられる(Huntおよ
びDayhoff.1980)。認識可能な配列相同性を有するタンパク質は、
脊椎動物、植物、昆虫、およびウイルスにおいて同定されているが、現在までに
原核生物においては同定されていない(HuberおよびCarrell.19
89;Sasaki.1991;Komiyama、Ray、Pickupら、
1994)。現在のセルピン構造のモデルは、このファミリーの1メンバーであ
るa−1−抗トリプシン(a1AT)(a−1プロテイナーゼインヒビターとも
呼ばれる)の精液X線結晶学的研究に大きく基づいている(HuberおよびC
arrell.1989)。その反応中心において切断された、a1ATの改変
形態の構造は、Loebermannおよび共同研究者によって1984年に解
明された(Loebermann、Tokuoka,Deisenhoferお
よびHuber.1984)。この構造の興味深い特徴は、通常反応中心を含む
2つの残基(Met−Ser)が、分子の反対の末端にほぼ70Å離れて見出さ
れることであった。Loebermannおよび共同研究者は、インヒビター構
造の大きな再配置よりもむしろ、反応中心のペプチド結合の切断の際に、緊張し
た立体構造の緩和が起こることを提案した。このモデルにおいて、ネイティブの
反応中心は、露出したループの部分(緊張したループ(strained lo
op)とも呼ばれる)である(Loebermann、Tokuoka、Dei
senhoferおよびHuber.1984;CarrellおよびBosw
ell.1986;Sprang.1992)。切断の際に、このループは移動
するかまたは「跳ね返り」、そして主要なb−シート構造(b−シートA)の中
央鎖(central strand)の1つになる。この変換は、熱安定性の
大きな増大によって達成される(CarrellおよびOwen.1985;G
ettinsおよびHarten.1988;Bruch,WeissおよびE
ngel.1988;Lawrence,Olson,Palaniappan
およびGinsburg.1994b)。
【0004】 インタクトな反応中心ループを有する、いくつかのネイティブのセルピンの近
年の結晶学的構造は、ネイティブのセルピン構造全体は、切断されたa1ATに
非常に類似するが、反応中心ループは分子の平面上に露出されるというLoeb
ermannの仮説を確証した(Schreuder、de Boer、Dij
kemaら、1994;Carrell、Stein、FermiおよびWar
dell.1994;Stein、Leslie、Finch、Turnell
、McLaughlinおよびCarrell.1990;Wei、Rubin
,CoopermanおよびChristianson.1994)。このモデ
ルのさらなる証拠は、a1ATの反応中心ループと相同な合成ペプチドである、
アンチトロンビンIII(AT III)またはPAI−1が、トランスに含め
られた場合に、それら個々の分子におそらくb−シートAの中央鎖として組み込
まれるという研究から得られた(Bjork、Ylinenjarvi、Ols
onおよびBock.1992;Bjork、Nordling、Larsso
nおよびOlson.1992;Schulze、Baumann、Knof、
Jaeger、HuberおよびLaurell.1990;Carrell、
EvansおよびStein.1991;Kvassman、Lawrence
およびShore.1995)。このことは、セルピンの反応中心でのセルピン
の切断に続いて観察された熱安定性の増大に類似する熱安定性の増大を導き、そ
してインヒビターからその標的プロテイナーゼの基質へセルピンを転換する。第
3のセルピン構造形態もまた同定されており、潜在性コンフォメーションと呼ば
れている。この構造において、反応中心ループはインタクトであるが、露出され
る代わりに、反応中心ループのアミノ末端全体が中央鎖としてb−シートA内へ
挿入される(Mottonen、Strand、Symerskyら、1992
)。これは、潜在的PAI−1の安定性の増大(Lawrence、Olson
、PalaniappanおよびGinsburg、1994a)、ならびに阻
害活性の欠如(HekmanおよびLoskutoff、1985)を説明する
。このコンフォメーションに適合する能力は、PAI−1に固有ではないが、現
在、AT IIIおよびa1ATについても示されている(Carrell、S
tein、FermiおよびWardell.1994;Lomas、Elli
ot、Chang、WardellおよびCarrell.1995)。総合し
て、これらのデータは、活性なセルピンが可動性の反応中心ループを有し、そし
てこの可動性がインヒビター機能に必須であるという仮説を導いた(Lawre
nce、Standberg、Ericson、およびNy.1990;Car
rell、EvansおよびStein.1991;CarrellおよびEv
ans.1992;Lawrence、Olson、Palaniappanお
よびGinsburg.1994b;Shore、Day、Francis−C
hmuraら、1994;Lawrence、Ginsburug、Dayら、
1995;Fa、Karolin、Aleshkov、Strandberg、
JohanssonおよびNy.1995;Olson、Bock、Kvass
manら、1995)。ループ挿入に伴って観察される熱安定性の大きな増大は
、5本鎖b−シートAの混合された平行−逆平行配置から、6本鎖の優勢に逆平
行なb−シートへの再構成におそらく起因する(CarrellおよびOwen
.1985;GettinsおよびHarten.1988;Bruch、We
issおよびEngel.1988;Lawrence、Olson、Pala
niappanおよびGinsburg.1994a)。この劇的な安定化は、
ネイティブの阻害性セルピンが、その最も安定な熱力学的状態よりも高い自由エ
ネルギーの状態に動力学的に捕捉された準安定性構造であり得るという示唆を導
いた(Lawrence、Ginsburg、Dayら、1995;Lee、P
arkおよびYu.1996)。そのようなエネルギー的に好ましくない構造は
、ほぼ確実にネガティブ選択にさらされる。従って、その全ての阻害性セルピン
が維持されていることは、それが機能的理由のために変換されたことを意味する
。
年の結晶学的構造は、ネイティブのセルピン構造全体は、切断されたa1ATに
非常に類似するが、反応中心ループは分子の平面上に露出されるというLoeb
ermannの仮説を確証した(Schreuder、de Boer、Dij
kemaら、1994;Carrell、Stein、FermiおよびWar
dell.1994;Stein、Leslie、Finch、Turnell
、McLaughlinおよびCarrell.1990;Wei、Rubin
,CoopermanおよびChristianson.1994)。このモデ
ルのさらなる証拠は、a1ATの反応中心ループと相同な合成ペプチドである、
アンチトロンビンIII(AT III)またはPAI−1が、トランスに含め
られた場合に、それら個々の分子におそらくb−シートAの中央鎖として組み込
まれるという研究から得られた(Bjork、Ylinenjarvi、Ols
onおよびBock.1992;Bjork、Nordling、Larsso
nおよびOlson.1992;Schulze、Baumann、Knof、
Jaeger、HuberおよびLaurell.1990;Carrell、
EvansおよびStein.1991;Kvassman、Lawrence
およびShore.1995)。このことは、セルピンの反応中心でのセルピン
の切断に続いて観察された熱安定性の増大に類似する熱安定性の増大を導き、そ
してインヒビターからその標的プロテイナーゼの基質へセルピンを転換する。第
3のセルピン構造形態もまた同定されており、潜在性コンフォメーションと呼ば
れている。この構造において、反応中心ループはインタクトであるが、露出され
る代わりに、反応中心ループのアミノ末端全体が中央鎖としてb−シートA内へ
挿入される(Mottonen、Strand、Symerskyら、1992
)。これは、潜在的PAI−1の安定性の増大(Lawrence、Olson
、PalaniappanおよびGinsburg、1994a)、ならびに阻
害活性の欠如(HekmanおよびLoskutoff、1985)を説明する
。このコンフォメーションに適合する能力は、PAI−1に固有ではないが、現
在、AT IIIおよびa1ATについても示されている(Carrell、S
tein、FermiおよびWardell.1994;Lomas、Elli
ot、Chang、WardellおよびCarrell.1995)。総合し
て、これらのデータは、活性なセルピンが可動性の反応中心ループを有し、そし
てこの可動性がインヒビター機能に必須であるという仮説を導いた(Lawre
nce、Standberg、Ericson、およびNy.1990;Car
rell、EvansおよびStein.1991;CarrellおよびEv
ans.1992;Lawrence、Olson、Palaniappanお
よびGinsburg.1994b;Shore、Day、Francis−C
hmuraら、1994;Lawrence、Ginsburug、Dayら、
1995;Fa、Karolin、Aleshkov、Strandberg、
JohanssonおよびNy.1995;Olson、Bock、Kvass
manら、1995)。ループ挿入に伴って観察される熱安定性の大きな増大は
、5本鎖b−シートAの混合された平行−逆平行配置から、6本鎖の優勢に逆平
行なb−シートへの再構成におそらく起因する(CarrellおよびOwen
.1985;GettinsおよびHarten.1988;Bruch、We
issおよびEngel.1988;Lawrence、Olson、Pala
niappanおよびGinsburg.1994a)。この劇的な安定化は、
ネイティブの阻害性セルピンが、その最も安定な熱力学的状態よりも高い自由エ
ネルギーの状態に動力学的に捕捉された準安定性構造であり得るという示唆を導
いた(Lawrence、Ginsburg、Dayら、1995;Lee、P
arkおよびYu.1996)。そのようなエネルギー的に好ましくない構造は
、ほぼ確実にネガティブ選択にさらされる。従って、その全ての阻害性セルピン
が維持されていることは、それが機能的理由のために変換されたことを意味する
。
【0005】 セルピンは、標的プロテイナーゼとわずか1回反応してSDS−安定複合体を
形成するという「自滅的インヒビター」として作用する。それらは、それらの反
応中心において酵素に対し、「餌」のアミノ酸残基を提示することによって相互
作用する。この餌の残基は、酵素の通常の基質を模擬し、そして酵素の特異的間
隙(すなわち、S1部位)と結合すると考えられる(CarrellおよびBo
swell.1986;HuberおよびCarrell.1989;Bode
およびHuber.1994)。この餌のアミノ酸はP1残基と呼ばれ、順にP
1、P2、P3などで標識された切断可能な反応中心結合のN末端側のアミノ酸
、およびカルボキシル側でP1’、P2’、などで標識されたアミノ酸を有する
(CarrellおよびBoswell.1986)。この反応中心P1−P1
’残基は、標的特異性を決定する際に重要な役割を果たすようである。この点は
、独特のヒト変異であるa1AT「ピッツバーグ」の同定によって劇的に例証さ
れた。この中で、P1残基でのMetのArgへの単一のアミノ酸置換が、エラ
スターゼインヒビターから効率的なトロンビンインヒビターへとa1ATを変換
し、独特でおよび究極的な胎児出血障害を生じる(Owen、Brennan、
LewisおよびCarrell.1983)。多くの変異セルピン(特にP1
での置換を伴う)が構築され、これは標的特異性における広範な変化を実証する
(York、LiおよびGardell.1991;Strandberg、L
awrence、JohanssonおよびNy.1991;Shubeita
、Cottey、FrankeおよびGerard.1990;Lawrenc
e、Strandberg、EricsonおよびNy.1990;Sherm
an、Lawrence、Yangら、1992)。
形成するという「自滅的インヒビター」として作用する。それらは、それらの反
応中心において酵素に対し、「餌」のアミノ酸残基を提示することによって相互
作用する。この餌の残基は、酵素の通常の基質を模擬し、そして酵素の特異的間
隙(すなわち、S1部位)と結合すると考えられる(CarrellおよびBo
swell.1986;HuberおよびCarrell.1989;Bode
およびHuber.1994)。この餌のアミノ酸はP1残基と呼ばれ、順にP
1、P2、P3などで標識された切断可能な反応中心結合のN末端側のアミノ酸
、およびカルボキシル側でP1’、P2’、などで標識されたアミノ酸を有する
(CarrellおよびBoswell.1986)。この反応中心P1−P1
’残基は、標的特異性を決定する際に重要な役割を果たすようである。この点は
、独特のヒト変異であるa1AT「ピッツバーグ」の同定によって劇的に例証さ
れた。この中で、P1残基でのMetのArgへの単一のアミノ酸置換が、エラ
スターゼインヒビターから効率的なトロンビンインヒビターへとa1ATを変換
し、独特でおよび究極的な胎児出血障害を生じる(Owen、Brennan、
LewisおよびCarrell.1983)。多くの変異セルピン(特にP1
での置換を伴う)が構築され、これは標的特異性における広範な変化を実証する
(York、LiおよびGardell.1991;Strandberg、L
awrence、JohanssonおよびNy.1991;Shubeita
、Cottey、FrankeおよびGerard.1990;Lawrenc
e、Strandberg、EricsonおよびNy.1990;Sherm
an、Lawrence、Yangら、1992)。
【0006】 セルピンとその標的プロテイナーゼとの間の複合体の正確な構造は、議論の余
地がある。もともとは、プロテイナーゼの活性部位であるセリン残基とP1残基
の新たなカルボキシル末端との間のエステル結合を通して共有結合的に連結し、
アシル−酵素複合体を形成すると考えられた(MoroiおよびYamasak
i.1974;Owen,1975;Cohen、Gruenke、Craig
およびGeczy.1977;NilssonおよびWiman.1982)。
しかし、1980年代後半および1990年代初期には、この解釈が不正確であ
り、そしてこのセルピン−プロテイナーゼ複合体が、KazalおよびKuni
tzファミリーのいわゆる標準的な機構のインヒビターと類似する、密接な非共
有結合で捕捉されると示唆された(LongstaffおよびGaffney,
J.1991;Shieh、PotempaおよびTravis.1989;P
otempa、KorzusおよびTravis.1994)。あるいは、1つ
の研究は、複合体は共有結合の中に固定されるが、切断されない4面体の遷移状
態の配置であるというこれらの2つのモデルの混合を示唆した(Matheso
n、van HalbeekおよびTravis.1991)。しかし、近年、
いくつかのグループによる新しいデータは、議論が一周して元の状態に戻ってい
ることを示唆した。この新しいデータは、インヒビターが実際にその反応中心に
おいて切断されていること、そして複合体は共有結合のアシル−酵素複合体とし
て捕捉されている可能性が最も高いことを示す、独立した方法を使用した種々の
研究による(Lawrence、Ginsburg、Dayら、1995;Ol
son、Bock、Kvassmanら、1995;Fa、Karolin、A
leshkov、Strandberg、JohanssonおよびNy.19
95;Wilczynska、Fa、OhlssonおよびNy.1995;L
awrence、Olson、PalaniappanおよびGinsburg
.1994b;Shore、Day、Francis−Chmuraら、199
4;Plotnick、Mayne、SchechterおよびRubin.1
996)。
地がある。もともとは、プロテイナーゼの活性部位であるセリン残基とP1残基
の新たなカルボキシル末端との間のエステル結合を通して共有結合的に連結し、
アシル−酵素複合体を形成すると考えられた(MoroiおよびYamasak
i.1974;Owen,1975;Cohen、Gruenke、Craig
およびGeczy.1977;NilssonおよびWiman.1982)。
しかし、1980年代後半および1990年代初期には、この解釈が不正確であ
り、そしてこのセルピン−プロテイナーゼ複合体が、KazalおよびKuni
tzファミリーのいわゆる標準的な機構のインヒビターと類似する、密接な非共
有結合で捕捉されると示唆された(LongstaffおよびGaffney,
J.1991;Shieh、PotempaおよびTravis.1989;P
otempa、KorzusおよびTravis.1994)。あるいは、1つ
の研究は、複合体は共有結合の中に固定されるが、切断されない4面体の遷移状
態の配置であるというこれらの2つのモデルの混合を示唆した(Matheso
n、van HalbeekおよびTravis.1991)。しかし、近年、
いくつかのグループによる新しいデータは、議論が一周して元の状態に戻ってい
ることを示唆した。この新しいデータは、インヒビターが実際にその反応中心に
おいて切断されていること、そして複合体は共有結合のアシル−酵素複合体とし
て捕捉されている可能性が最も高いことを示す、独立した方法を使用した種々の
研究による(Lawrence、Ginsburg、Dayら、1995;Ol
son、Bock、Kvassmanら、1995;Fa、Karolin、A
leshkov、Strandberg、JohanssonおよびNy.19
95;Wilczynska、Fa、OhlssonおよびNy.1995;L
awrence、Olson、PalaniappanおよびGinsburg
.1994b;Shore、Day、Francis−Chmuraら、199
4;Plotnick、Mayne、SchechterおよびRubin.1
996)。
【0007】 近年、3つのグループがほぼ同時に、セルピン阻害について類似した機構を提
案した(Lawrence、Ginsburg、Dayら、1995;Wilc
zynska、Fa、OhlssonおよびNy.1995;Wrightおよ
びScarsdale.1995)。このモデルは、標的プロテイナーゼと遭遇
すると、セルピンが酵素に結合して、酵素と基質との間のミカエリス複合体に類
似する可逆性複合体を形成することを示唆する。次いで、プロテイナーゼはP1
−P1’ペプチド結合を切断し、共有結合のアシル−酵素中間体の形成を生じる
。この切断は、反応中心ループ(RCL)の、少なくともP9位置までのb−シ
ートAへの迅速な挿入につながる。RCLは活性部位であるSerを介して酵素
と共有結合的に連結するため、この遷移はまたプロテイナーゼに作用するはずで
あり、インヒビターに対して相対的にその位置を顕著に変化する。この遷移の間
で、RCLがその酵素との会合のために完全な挿入の達成が妨げられ、そして部
分的にのみ挿入されたRCLを伴って複合体がロックされた場合、次いで、生じ
た応力は、酵素の活性部位を歪めるのに十分であり得る。次いでこの歪みは、ア
シル−酵素中間体の効率的な脱アシル化を妨げ、従って複合体を捕捉する。しか
し、RCLの挿入が妨げられる場合、または脱アシル化がRCLの挿入の前に生
じる場合、切断されたセルピンは、基質および放出された活性酵素としてターン
オーバーされる。これは、セルピンがインヒビターであるかまたは基質であるか
を決定するのはkstabに対するkdissの比率であることを意味する。脱アシル化
(kdiss)がRCLの挿入(kstab)よりも早い場合、この基質反応が優勢にな
る。しかし、RCLの挿入および活性部位の歪みが脱アシル化の前に生じ得る場
合、この複合体は共有結合のアシル−酵素として固定される。同様のモデルが1
990年に最初に提案された(Lawrence、Strandberg、Er
icsonおよびNy.1990)。そしてこれはRCLの挿入がプロテイナー
ゼ結合には必要とされないが、安定的な阻害に必要であることを実証する研究(
Lawrence、Olson、PalaniappanおよびGinsbur
g.1994b)、ならびに活性酵素のみがRCLの挿入を誘導し得るという観
察(Olson、Bock、Kvassmanら、1995)に一致する。ごく
最近、このモデルの直接的な証拠がPlotnickらによって提供された。P
lotnickらは、NMRによって、セルピン−酵素複合体において酵素の触
媒部位の明らかな歪みを観察した(Plotnick、Mayne、Schec
hterおよびRubin.1996)。結論として、これらのデータは、セル
ピンが分子のばねとして作用し、ここではネイティブの構造が動力学的に高エネ
ルギー状態に捕捉されていることを示唆する。酵素との会合に際し、RCLの挿
入によって解放されたいくらかのエネルギーが酵素の活性部位を歪ませるために
使用され、脱アシル化を妨げ、そして複合体を捕捉する。
案した(Lawrence、Ginsburg、Dayら、1995;Wilc
zynska、Fa、OhlssonおよびNy.1995;Wrightおよ
びScarsdale.1995)。このモデルは、標的プロテイナーゼと遭遇
すると、セルピンが酵素に結合して、酵素と基質との間のミカエリス複合体に類
似する可逆性複合体を形成することを示唆する。次いで、プロテイナーゼはP1
−P1’ペプチド結合を切断し、共有結合のアシル−酵素中間体の形成を生じる
。この切断は、反応中心ループ(RCL)の、少なくともP9位置までのb−シ
ートAへの迅速な挿入につながる。RCLは活性部位であるSerを介して酵素
と共有結合的に連結するため、この遷移はまたプロテイナーゼに作用するはずで
あり、インヒビターに対して相対的にその位置を顕著に変化する。この遷移の間
で、RCLがその酵素との会合のために完全な挿入の達成が妨げられ、そして部
分的にのみ挿入されたRCLを伴って複合体がロックされた場合、次いで、生じ
た応力は、酵素の活性部位を歪めるのに十分であり得る。次いでこの歪みは、ア
シル−酵素中間体の効率的な脱アシル化を妨げ、従って複合体を捕捉する。しか
し、RCLの挿入が妨げられる場合、または脱アシル化がRCLの挿入の前に生
じる場合、切断されたセルピンは、基質および放出された活性酵素としてターン
オーバーされる。これは、セルピンがインヒビターであるかまたは基質であるか
を決定するのはkstabに対するkdissの比率であることを意味する。脱アシル化
(kdiss)がRCLの挿入(kstab)よりも早い場合、この基質反応が優勢にな
る。しかし、RCLの挿入および活性部位の歪みが脱アシル化の前に生じ得る場
合、この複合体は共有結合のアシル−酵素として固定される。同様のモデルが1
990年に最初に提案された(Lawrence、Strandberg、Er
icsonおよびNy.1990)。そしてこれはRCLの挿入がプロテイナー
ゼ結合には必要とされないが、安定的な阻害に必要であることを実証する研究(
Lawrence、Olson、PalaniappanおよびGinsbur
g.1994b)、ならびに活性酵素のみがRCLの挿入を誘導し得るという観
察(Olson、Bock、Kvassmanら、1995)に一致する。ごく
最近、このモデルの直接的な証拠がPlotnickらによって提供された。P
lotnickらは、NMRによって、セルピン−酵素複合体において酵素の触
媒部位の明らかな歪みを観察した(Plotnick、Mayne、Schec
hterおよびRubin.1996)。結論として、これらのデータは、セル
ピンが分子のばねとして作用し、ここではネイティブの構造が動力学的に高エネ
ルギー状態に捕捉されていることを示唆する。酵素との会合に際し、RCLの挿
入によって解放されたいくらかのエネルギーが酵素の活性部位を歪ませるために
使用され、脱アシル化を妨げ、そして複合体を捕捉する。
【0008】 神経系の発達の間、ニューロンは標的領域中への予め特定化された経路に沿っ
て伸長する軸索を形成する。ここでそれらは、シナプス結合の形成および精製に
携わる。これらの段階は、道のりおよび行先でそれらが遭遇する、種々の構造物
と相互作用する軸索の成長円錐の能力に決定的に依存する。これらの構造物は、
ニューロンおよび非ニューロン由来の細胞表面ならびに細胞外マトリックスを含
む。それらの軌道に沿っておよびそれらの標的部位において、成長円錐はそれら
の局所的環境由来のシグナルを受容しそして応答するのみならず、活発に高分子
を分泌する。特に、分泌されたプロテアーゼは、組織を通る成長円錐の前進を支
持する際に関係する。10年以上前に、プラスミノゲン活性化因子はニューロン
によって軸索で分泌されることが、培養において実証された。近年、軸索成長の
期間にラットの神経系の発達に際して、それらが生じることが明らかにされた。
さらに、セリンプロテアーゼ(例えば、プラスミノーゲン活性化因子またはトロ
ンビン)が、発達および再生の間のシナプス結合の再構築に関与することを示す
いくつかの証拠が提示された。そのようなプロセスは、発達の間の排除(eli
mination)ならびに成人の学習および記憶と関連するシナプスの可塑性
を含む。例えば、Osterwalder,T.ら、「Neuroserpin
,an axonally secreted serine proteas
e inhibitor」、EMBO J.15:2944−2953(199
6)を参照のこと。
て伸長する軸索を形成する。ここでそれらは、シナプス結合の形成および精製に
携わる。これらの段階は、道のりおよび行先でそれらが遭遇する、種々の構造物
と相互作用する軸索の成長円錐の能力に決定的に依存する。これらの構造物は、
ニューロンおよび非ニューロン由来の細胞表面ならびに細胞外マトリックスを含
む。それらの軌道に沿っておよびそれらの標的部位において、成長円錐はそれら
の局所的環境由来のシグナルを受容しそして応答するのみならず、活発に高分子
を分泌する。特に、分泌されたプロテアーゼは、組織を通る成長円錐の前進を支
持する際に関係する。10年以上前に、プラスミノゲン活性化因子はニューロン
によって軸索で分泌されることが、培養において実証された。近年、軸索成長の
期間にラットの神経系の発達に際して、それらが生じることが明らかにされた。
さらに、セリンプロテアーゼ(例えば、プラスミノーゲン活性化因子またはトロ
ンビン)が、発達および再生の間のシナプス結合の再構築に関与することを示す
いくつかの証拠が提示された。そのようなプロセスは、発達の間の排除(eli
mination)ならびに成人の学習および記憶と関連するシナプスの可塑性
を含む。例えば、Osterwalder,T.ら、「Neuroserpin
,an axonally secreted serine proteas
e inhibitor」、EMBO J.15:2944−2953(199
6)を参照のこと。
【0009】 神経系の正常な発達の間、有糸分裂後の腰仙運動ニューロンの約50%は、そ
れらの細胞がその標的筋肉とのシナプス結合を形成する期間に天然に生じる(プ
ログラムされた)細胞死を経験する。天然に生じる運動ニューロン死は、多くの
脊椎動物種(ニワトリ、マウス、ラット、およびヒトの胚または胎児を含む)に
おいて記載されている。例えば、プログラムされた運動ニューロン死は、ニワト
リにおいて、胚形成の日数(E)6とE10との間に生じる。この系は、インビ
ボでの運動ニューロンの生存に対して、異なる神経栄養剤を試験するための生物
学的モデルとして使用されてきた。例えば、Houenou,L.J.ら、「A
serine protease inhibitor、protease
nexin I,rescues motoneurons from nat
urally occurring and axotomy−induced
cell death」、Proc.Natl.Adad.Sci.USA
92:895−899(1995)を参照のこと。
れらの細胞がその標的筋肉とのシナプス結合を形成する期間に天然に生じる(プ
ログラムされた)細胞死を経験する。天然に生じる運動ニューロン死は、多くの
脊椎動物種(ニワトリ、マウス、ラット、およびヒトの胚または胎児を含む)に
おいて記載されている。例えば、プログラムされた運動ニューロン死は、ニワト
リにおいて、胚形成の日数(E)6とE10との間に生じる。この系は、インビ
ボでの運動ニューロンの生存に対して、異なる神経栄養剤を試験するための生物
学的モデルとして使用されてきた。例えば、Houenou,L.J.ら、「A
serine protease inhibitor、protease
nexin I,rescues motoneurons from nat
urally occurring and axotomy−induced
cell death」、Proc.Natl.Adad.Sci.USA
92:895−899(1995)を参照のこと。
【0010】 プログラムされた細胞死は哺乳動物において誕生前に完了するが、運動ニュー
ロンの維持は、誕生後しばらくの間、標的からの支持に依存し続ける。従って、
新生児哺乳動物において運動性軸索の横断が実施され、そして再神経支配(re
innervation)が妨げられる場合、大多数の運動ニューロンが変質し
、そして死滅する。運動ニューロンの軸索切断に誘導される死はまた、種々の薬
剤(運動ニューロンでの神経栄養因子および成長因子を含む)の生存効果を試験
するためのモデルとして広範に使用されている。
ロンの維持は、誕生後しばらくの間、標的からの支持に依存し続ける。従って、
新生児哺乳動物において運動性軸索の横断が実施され、そして再神経支配(re
innervation)が妨げられる場合、大多数の運動ニューロンが変質し
、そして死滅する。運動ニューロンの軸索切断に誘導される死はまた、種々の薬
剤(運動ニューロンでの神経栄養因子および成長因子を含む)の生存効果を試験
するためのモデルとして広範に使用されている。
【0011】 プロテアーゼネキシンI(PNI)(グリア由来ネキシンとしても公知)は、
43〜47kDaのタンパク質であり、これは培養線維芽細胞によって分泌され
ることが最初に見出されたが、これはまたグリア(神経膠腫および始原)および
骨格筋細胞によっても産生される。PNIは、異なるニューロン細胞型からの軸
索成長を促進することが示されている。これらは、神経芽細胞腫、ならびに一次
海馬ニューロンおよび一次交感ニューロンを含む。インビトロでのPNIの軸索
促進活性は、トロンビン(強力なセリンプロテアーゼ)の阻害によって媒介され
る。PNI(mRNAおよびタンパク質)は、軸索切断後にラットの坐骨神経に
おいて一過的に上方調節され、そしてPNI産生細胞は、病変部位から遠位に局
在化される。このPNIの上方調節は、遠位の断端におけるプロトロンビンおよ
びトロンビンの類似した上方調節の2〜3日後に生じる。種々の解剖学的な脳の
領域において(アルツハイマー病を有する患者の海馬を含む)、遊離PNIタン
パク質は有意に減少するが、内因性PNI−トロンビン複合体は増加する。PN
Iが混合されたマウス脊髄ニューロンのインビトロでの生存を促進し得ること、
そして神経ペプチド(例えば、血管作用性腸ポリペプチド)によってグリア細胞
からPNIが放出されることの近年の実証をあわせて考慮した場合、これらの観
察は、PNIがインビボでのニューロンの生存、分化、および/または軸索の再
生において生理学的役割を果たし得ることを示唆する。
43〜47kDaのタンパク質であり、これは培養線維芽細胞によって分泌され
ることが最初に見出されたが、これはまたグリア(神経膠腫および始原)および
骨格筋細胞によっても産生される。PNIは、異なるニューロン細胞型からの軸
索成長を促進することが示されている。これらは、神経芽細胞腫、ならびに一次
海馬ニューロンおよび一次交感ニューロンを含む。インビトロでのPNIの軸索
促進活性は、トロンビン(強力なセリンプロテアーゼ)の阻害によって媒介され
る。PNI(mRNAおよびタンパク質)は、軸索切断後にラットの坐骨神経に
おいて一過的に上方調節され、そしてPNI産生細胞は、病変部位から遠位に局
在化される。このPNIの上方調節は、遠位の断端におけるプロトロンビンおよ
びトロンビンの類似した上方調節の2〜3日後に生じる。種々の解剖学的な脳の
領域において(アルツハイマー病を有する患者の海馬を含む)、遊離PNIタン
パク質は有意に減少するが、内因性PNI−トロンビン複合体は増加する。PN
Iが混合されたマウス脊髄ニューロンのインビトロでの生存を促進し得ること、
そして神経ペプチド(例えば、血管作用性腸ポリペプチド)によってグリア細胞
からPNIが放出されることの近年の実証をあわせて考慮した場合、これらの観
察は、PNIがインビボでのニューロンの生存、分化、および/または軸索の再
生において生理学的役割を果たし得ることを示唆する。
【0012】 近年、PNIは、新生仔マウスにおいて脊髄運動ニューロンの死を救出するこ
とが報告された。Houenou,L.J.ら、1995、前出。プログラムさ
れた細胞死の期間での、運動ニューロンに対するPNIの生存効果は、筋内神経
の枝分かれの増加と関連していない。PNIはまた、プログラムされた細胞死の
期間に運動ニューロンの核の大きさを有意に増大し、そして生存している運動ニ
ューロンの軸索切断に誘導される萎縮を妨げた。これらの結果は、神経栄養剤と
してのPNIの可能な役割を示す。これらはまた、セリンプロテアーゼ、または
より詳細には、プロテアーゼおよびセルピンの平衡が、発達の間に神経細胞の運
命を調節することに関与し得るという考えを支持する。
とが報告された。Houenou,L.J.ら、1995、前出。プログラムさ
れた細胞死の期間での、運動ニューロンに対するPNIの生存効果は、筋内神経
の枝分かれの増加と関連していない。PNIはまた、プログラムされた細胞死の
期間に運動ニューロンの核の大きさを有意に増大し、そして生存している運動ニ
ューロンの軸索切断に誘導される萎縮を妨げた。これらの結果は、神経栄養剤と
してのPNIの可能な役割を示す。これらはまた、セリンプロテアーゼ、または
より詳細には、プロテアーゼおよびセルピンの平衡が、発達の間に神経細胞の運
命を調節することに関与し得るという考えを支持する。
【0013】 より最近には、ニワトリの中枢神経系(CNS)および末梢神経系(PNS)
のニューロンの軸索で分泌される糖タンパク質をコードするcDNAがクローン
化され、そして配列決定された。Osterwalder,T.ら、1996)
前出。一次構造特性の分析は、このタンパク質をセルピンスーパーファミリーの
新規のメンバーとして特徴付けた(従って、これは「神経セルピン」と呼ばれる
)。しかし、いかなるプロテアーゼの阻害の実証もこのレポートに含まれていな
い。インサイチュハイブリダイゼーションは、神経発生の後期ステージの間で、
かつシナプス可塑性を示す成人脳の領域における優先的なニューロン発現を明ら
かにした。従って、発達の間のシナプス結合の再構成、および成人におけるシナ
プス可塑性に関与する局所的な細胞外タンパク質分解性の軸索で分泌される調節
因子として、神経セルピンが機能し得ることが示唆された。ニューロンのリモデ
リングにおけるセリンプロテアーゼおよびセルピンの役割は、tPA mRNA
およびタンパク質レベルの上昇が、運動性学習を受けたラットの小脳プルキンエ
ニューロンにおいて見出されるという知見によって、さらに支持される(See
ds NW;Williams BL;Bickford P.C.、「Tis
sue plasminogen activator induction
in Purkinje neurons after cerebellar
motor learning」、Science 270:1992−4(
1995))。
のニューロンの軸索で分泌される糖タンパク質をコードするcDNAがクローン
化され、そして配列決定された。Osterwalder,T.ら、1996)
前出。一次構造特性の分析は、このタンパク質をセルピンスーパーファミリーの
新規のメンバーとして特徴付けた(従って、これは「神経セルピン」と呼ばれる
)。しかし、いかなるプロテアーゼの阻害の実証もこのレポートに含まれていな
い。インサイチュハイブリダイゼーションは、神経発生の後期ステージの間で、
かつシナプス可塑性を示す成人脳の領域における優先的なニューロン発現を明ら
かにした。従って、発達の間のシナプス結合の再構成、および成人におけるシナ
プス可塑性に関与する局所的な細胞外タンパク質分解性の軸索で分泌される調節
因子として、神経セルピンが機能し得ることが示唆された。ニューロンのリモデ
リングにおけるセリンプロテアーゼおよびセルピンの役割は、tPA mRNA
およびタンパク質レベルの上昇が、運動性学習を受けたラットの小脳プルキンエ
ニューロンにおいて見出されるという知見によって、さらに支持される(See
ds NW;Williams BL;Bickford P.C.、「Tis
sue plasminogen activator induction
in Purkinje neurons after cerebellar
motor learning」、Science 270:1992−4(
1995))。
【0014】 神経セルピンと呼ばれる推定反応部位ループをコードするニワトリcDNAの
領域に対応する、約450bpのヒトcDNAフラグメントの、その領域に隣接
する2対のネスティッドプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いた増幅もま
た報告されている。Osterwalder,T.ら、1996、前出、第29
46頁。この著者らはまた、ヒトの推定アミノ酸配列および対応するマウスcD
NAが、ニワトリの神経セルピンと、それぞれ88%および87%の配列同一性
を示すことを報告した。このヒトcDNAについて、ヌクレオチド配列またはア
ミノ酸配列は全く報告されなかった。しかし、本発明者らは、ニワトリの神経セ
ルピンcDNAまたはポリペプチドのヒト相対物についての、全長cDNA配列
データの任意の他の公的な開示を認識していない。
領域に対応する、約450bpのヒトcDNAフラグメントの、その領域に隣接
する2対のネスティッドプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応を用いた増幅もま
た報告されている。Osterwalder,T.ら、1996、前出、第29
46頁。この著者らはまた、ヒトの推定アミノ酸配列および対応するマウスcD
NAが、ニワトリの神経セルピンと、それぞれ88%および87%の配列同一性
を示すことを報告した。このヒトcDNAについて、ヌクレオチド配列またはア
ミノ酸配列は全く報告されなかった。しかし、本発明者らは、ニワトリの神経セ
ルピンcDNAまたはポリペプチドのヒト相対物についての、全長cDNA配列
データの任意の他の公的な開示を認識していない。
【0015】 従って、種々のセリンプロテアーゼの調節におけるセルピン、特に神経系にお
けるセルピンとして機能するヒトポリペプチドについての必要性が存在する。な
ぜならば、このような調節の妨害は、血流遮断、新脈管形成、腫瘍転移、細胞性
遊走および排卵、ならびに神経発生に関連する障害に関与し得るからである;従
って、そのような障害を予防、改善、または矯正する際に役割を果たし得る、そ
のようなヒトポリペプチドの同定および特徴付けについて必要性が存在する。
けるセルピンとして機能するヒトポリペプチドについての必要性が存在する。な
ぜならば、このような調節の妨害は、血流遮断、新脈管形成、腫瘍転移、細胞性
遊走および排卵、ならびに神経発生に関連する障害に関与し得るからである;従
って、そのような障害を予防、改善、または矯正する際に役割を果たし得る、そ
のようなヒトポリペプチドの同定および特徴付けについて必要性が存在する。
【0016】 (発明の要旨) 本発明は、新規なポリヌクレオチドおよびそのコードされるポリペプチドに関
する。さらに、本発明は、このポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生する
ための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関する。このポリペプ
チドに関連する障害を検出するための診断方法、およびこのような障害を処置す
るための治療方法もまた提供される。本発明は、さらに、このポリペプチドの結
合パートナーを同定するためのスクリーニング方法に関する。
する。さらに、本発明は、このポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生する
ための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関する。このポリペプ
チドに関連する障害を検出するための診断方法、およびこのような障害を処置す
るための治療方法もまた提供される。本発明は、さらに、このポリペプチドの結
合パートナーを同定するためのスクリーニング方法に関する。
【0017】 (詳細な説明) (定義) 以下の定義は、本明細書を通じて使用される特定の用語の理解を容易にするた
めに提供される。
めに提供される。
【0018】 本発明において、「単離された」とは、その本来の環境(例えば、それが天然
に存在する場合は天然の環境)から取り出された物質をいい、したがって、天然
の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単離されたポリヌク
レオチドは、ベクターまたは組成物の一部であり得るか、あるいは細胞中に含ま
れ得、そしてなお「単離される」。なぜなら、ベクター、組成物、または特定の
細胞は、ポリヌクレオチドの本来の環境ではないからである。
に存在する場合は天然の環境)から取り出された物質をいい、したがって、天然
の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単離されたポリヌク
レオチドは、ベクターまたは組成物の一部であり得るか、あるいは細胞中に含ま
れ得、そしてなお「単離される」。なぜなら、ベクター、組成物、または特定の
細胞は、ポリヌクレオチドの本来の環境ではないからである。
【0019】 本発明において、「分泌」タンパク質とは、ER、分泌小胞、または細胞外間
隙にシグナル配列の結果として指向され得るタンパク質、ならびにシグナル配列
を必ずしも含まないが細胞外間隙に放出されるタンパク質をいう。分泌タンパク
質が細胞外間隙に放出される場合、この分泌タンパク質は、「成熟」タンパク質
を産生するために細胞外プロセシングを受け得る。細胞外間隙への放出は、エキ
ソサイトーシスおよびタンパク質分解切断を含む多くの機構によって生じ得る。
隙にシグナル配列の結果として指向され得るタンパク質、ならびにシグナル配列
を必ずしも含まないが細胞外間隙に放出されるタンパク質をいう。分泌タンパク
質が細胞外間隙に放出される場合、この分泌タンパク質は、「成熟」タンパク質
を産生するために細胞外プロセシングを受け得る。細胞外間隙への放出は、エキ
ソサイトーシスおよびタンパク質分解切断を含む多くの機構によって生じ得る。
【0020】 本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」とは、配列番号Xに含まれる核酸
配列を有する分子、またはATCCに寄託されたクローン内に含まれるcDNA
をいう。例えば、ポリヌクレオチドは、5’および3’非翻訳配列、シグナル配
列を含むかもしくは含まないコード領域、分泌タンパク質コード領域を含む全長
cDNA配列のヌクレオチド配列、ならびにこの核酸配列のフラグメント、エピ
トープ、ドメイン、および改変体を含み得る。さらに、本明細書で使用される場
合、「ポリペプチド」とは、広く定義される場合、ポリヌクレオチドから産生さ
れた翻訳されたアミノ酸配列を有する分子をいう。
配列を有する分子、またはATCCに寄託されたクローン内に含まれるcDNA
をいう。例えば、ポリヌクレオチドは、5’および3’非翻訳配列、シグナル配
列を含むかもしくは含まないコード領域、分泌タンパク質コード領域を含む全長
cDNA配列のヌクレオチド配列、ならびにこの核酸配列のフラグメント、エピ
トープ、ドメイン、および改変体を含み得る。さらに、本明細書で使用される場
合、「ポリペプチド」とは、広く定義される場合、ポリヌクレオチドから産生さ
れた翻訳されたアミノ酸配列を有する分子をいう。
【0021】 本発明において、配列番号Xとして同定される全長配列はしばしば、複数のク
ローンに含まれる重複した配列によって産生された(コンティグ分析)。配列番
号Xについての配列のすべてまたはほとんどを含む代表的なクローンを、アメリ
カンタイプカルチャーコレクション(「ATCC」)に寄託した。表1に示すよ
うに、各クローンは、cDNAクローンID (識別子)およびATCC寄託番
号によって同定される。ATCCは、アメリカ合衆国、バージニア20110−
2209、マナサス、Boulevard大学 10801に位置する。ATC
C寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項
によって行われた。
ローンに含まれる重複した配列によって産生された(コンティグ分析)。配列番
号Xについての配列のすべてまたはほとんどを含む代表的なクローンを、アメリ
カンタイプカルチャーコレクション(「ATCC」)に寄託した。表1に示すよ
うに、各クローンは、cDNAクローンID (識別子)およびATCC寄託番
号によって同定される。ATCCは、アメリカ合衆国、バージニア20110−
2209、マナサス、Boulevard大学 10801に位置する。ATC
C寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項
によって行われた。
【0022】 本発明の「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で、配列番号Xに含まれる配列、その相補体、またはATCCに寄
託されたクローン内のcDNAにハイブリダイズし得るそれらのポリヌクレオチ
ドを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、50%ホ
ルムアミド、5×SSC(750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム
)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×Denhardt溶液、1
0%硫酸デキストラン、および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶
液中での42℃での一晩インキュベーション、次いで0.1×SSC中で約65
℃にてフィルターを洗浄することをいう。
ション条件下で、配列番号Xに含まれる配列、その相補体、またはATCCに寄
託されたクローン内のcDNAにハイブリダイズし得るそれらのポリヌクレオチ
ドを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、50%ホ
ルムアミド、5×SSC(750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム
)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×Denhardt溶液、1
0%硫酸デキストラン、および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶
液中での42℃での一晩インキュベーション、次いで0.1×SSC中で約65
℃にてフィルターを洗浄することをいう。
【0023】 より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意図される。ハイブリダイゼー
ションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムア
ミド濃度(より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生
じる);塩条件、または温度の操作によって達成される。例えば、より低いスト
リンジェンシー条件は、6×SSPE(20×SSPE=3M NaCl;0.
2M NaH2PO4;0.02M EDTA、pH7.4)、0.5% SDS
、30%ホルムアミド、100μg/mlサケ精子ブロッキングDNAを含む溶
液中での37℃で一晩のインキュベーション;次いで1×SSPE、0.1%
SDSを用いた50℃での洗浄を含む。さらに、さらになおより低いストリンジ
ェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に実
施される洗浄は、より高い塩濃度(例えば、5×SSC)で行われ得る。
クレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意図される。ハイブリダイゼー
ションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムア
ミド濃度(より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生
じる);塩条件、または温度の操作によって達成される。例えば、より低いスト
リンジェンシー条件は、6×SSPE(20×SSPE=3M NaCl;0.
2M NaH2PO4;0.02M EDTA、pH7.4)、0.5% SDS
、30%ホルムアミド、100μg/mlサケ精子ブロッキングDNAを含む溶
液中での37℃で一晩のインキュベーション;次いで1×SSPE、0.1%
SDSを用いた50℃での洗浄を含む。さらに、さらになおより低いストリンジ
ェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に実
施される洗浄は、より高い塩濃度(例えば、5×SSC)で行われ得る。
【0024】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の包含および/ま
たは置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッキング試薬
としては、Denhardt試薬、BLOTTO、ヘパリン、変性サケ精子DN
A、および市販の専売処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の包含は、
適合性の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし
得る。
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の包含および/ま
たは置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッキング試薬
としては、Denhardt試薬、BLOTTO、ヘパリン、変性サケ精子DN
A、および市販の専売処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の包含は、
適合性の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし
得る。
【0025】 もちろん、ポリA+配列(例えば、配列表に示されるcDNAの任意の3’末
端ポリA+領域(tract))に、またはT(もしくはU)残基の相補的スト
レッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオ
チドが、ポリ(A)ストレッチまたはその相補体(例えば、事実上任意の二本鎖
cDNAクローン)を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするので、「ポリヌ
クレオチド」の定義に包含されない。
端ポリA+領域(tract))に、またはT(もしくはU)残基の相補的スト
レッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオ
チドが、ポリ(A)ストレッチまたはその相補体(例えば、事実上任意の二本鎖
cDNAクローン)を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするので、「ポリヌ
クレオチド」の定義に包含されない。
【0026】 本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキ
シリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変RNAもしくは非改変DN
Aまたは改変RNAもしくは改変DNAであり得る。例えば、ポリヌクレオチド
は、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA
、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物である
RNA、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖領域
の混合物であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子から構成され得
る。さらに、ポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNA、またはRNAおよび
DNAの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、安
定性のために、または他の理由のために改変された1つ以上の改変された塩基ま
たはDNAもしくはRNA骨格を含み得る。「改変された」塩基としては、例え
ば、トリチル化された塩基およびイノシンのような通常でない塩基が挙げられる
。種々の改変が、DNAおよびRNAに対してなされ得;従って、「ポリヌクレ
オチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む。
シリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変RNAもしくは非改変DN
Aまたは改変RNAもしくは改変DNAであり得る。例えば、ポリヌクレオチド
は、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA
、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物である
RNA、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖領域
の混合物であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子から構成され得
る。さらに、ポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNA、またはRNAおよび
DNAの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、安
定性のために、または他の理由のために改変された1つ以上の改変された塩基ま
たはDNAもしくはRNA骨格を含み得る。「改変された」塩基としては、例え
ば、トリチル化された塩基およびイノシンのような通常でない塩基が挙げられる
。種々の改変が、DNAおよびRNAに対してなされ得;従って、「ポリヌクレ
オチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む。
【0027】 本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すな
わち、ペプチドアイソスター(isostere)によって互いに連結したアミ
ノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする20個のアミノ酸以外のアミノ
酸を含み得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスに
よって、または当該分野で周知の化学的改変技術によってのいずれかで改変され
得る。このような改変は、基本的教科書、およびより詳細な研究論文、ならびに
多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およ
びアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチドのいずれの箇所でも生
じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同じまたは
種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多くの
型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝
状であり得、そしてポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない環状であり得
る。環状、分枝状および分枝した環状ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスか
ら生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変としては、アセチル
化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分
の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂
質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジ
スルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピ
ログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GP
Iアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、PEG
化(pegylation)、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニ
ル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質への
アミノ酸のトランスファーRNA媒介の付加、およびユビキチン化が挙げられる
。(例えば、PROTEINS−STRUCTURE AND MOLECUL
AR PROPERTIES, 第2版, T.E. Creighton,
W.H. Freeman and Company, New York (
1993);POSTTRANSLATIONAL COVALENT MOD
IFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson編
, Academic Press, New York, 1−12頁 (1
983);Seifterら, Meth Enzymol 182:626−
646 (1990);Rattanら, Ann NY Acad Sci
663:48−62 (1992)を参照のこと)。
わち、ペプチドアイソスター(isostere)によって互いに連結したアミ
ノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする20個のアミノ酸以外のアミノ
酸を含み得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスに
よって、または当該分野で周知の化学的改変技術によってのいずれかで改変され
得る。このような改変は、基本的教科書、およびより詳細な研究論文、ならびに
多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およ
びアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチドのいずれの箇所でも生
じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同じまたは
種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多くの
型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝
状であり得、そしてポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない環状であり得
る。環状、分枝状および分枝した環状ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスか
ら生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変としては、アセチル
化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分
の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂
質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジ
スルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピ
ログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GP
Iアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、PEG
化(pegylation)、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニ
ル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質への
アミノ酸のトランスファーRNA媒介の付加、およびユビキチン化が挙げられる
。(例えば、PROTEINS−STRUCTURE AND MOLECUL
AR PROPERTIES, 第2版, T.E. Creighton,
W.H. Freeman and Company, New York (
1993);POSTTRANSLATIONAL COVALENT MOD
IFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson編
, Academic Press, New York, 1−12頁 (1
983);Seifterら, Meth Enzymol 182:626−
646 (1990);Rattanら, Ann NY Acad Sci
663:48−62 (1992)を参照のこと)。
【0028】 「配列番号X」とはポリヌクレオチド配列をいうが、「配列番号Y」とはポリ
ペプチド配列をいい、両方の配列とも、表1に特定された整数によって同定され
る。
ペプチド配列をいい、両方の配列とも、表1に特定された整数によって同定され
る。
【0029】 「生物学的活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイで測定
した場合、用量依存性を伴なっても伴なわなくても、本発明のポリペプチド(成
熟形態を含む)の活性と類似である(しかし、必ずしも同一ではある必要はない
)活性を示すポリペプチドをいう。用量依存性が存在する場合、ポリペプチドの
用量依存性と同一である必要はないが、むしろ本発明のポリペプチドと比較した
場合に、所定の活性における用量依存性に実質的に類似する(すなわち、候補ポ
リペプチドは、本発明のポリペプチドと相対的に、より大きな活性を示すか、ま
たは約1/25以上、そして好ましくは約1/10以上の活性、そして最も好ま
しくは約1/3以上の活性を示す)。
した場合、用量依存性を伴なっても伴なわなくても、本発明のポリペプチド(成
熟形態を含む)の活性と類似である(しかし、必ずしも同一ではある必要はない
)活性を示すポリペプチドをいう。用量依存性が存在する場合、ポリペプチドの
用量依存性と同一である必要はないが、むしろ本発明のポリペプチドと比較した
場合に、所定の活性における用量依存性に実質的に類似する(すなわち、候補ポ
リペプチドは、本発明のポリペプチドと相対的に、より大きな活性を示すか、ま
たは約1/25以上、そして好ましくは約1/10以上の活性、そして最も好ま
しくは約1/3以上の活性を示す)。
【0030】 (本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド) (配列番号1、3および5によってコードされるタンパク質の特徴) 本明細書において配列番号2、4および6として示される各ポリペプチドは、
セリンプロテアーゼポリペプチドファミリーのメンバーである。この決定は、各
ポリペプチドがセリンプロテアーゼファミリーの他のメンバーと共有する高度な
配列類似性に基づいてなされた。クローンHMWJH67におけるヒトcDNA
の推定翻訳産物(配列番号2)は、推定プレプロアジプシン(Preproad
ipsin)[Sus scrofa domestica](Genbank
登録番号gi|915533)と高度な配列類似性を示し;クローンHKAET
41におけるヒトcDNAの推定翻訳産物(配列番号4)は、プロテアーゼM[
Homo sapiens](gi|1518788)、ニューロプシン(Ne
uropsin)[Homo sapiens](gnl|PID|d1011
968)、およびセリンプロテアーゼ[Homo sapiens](gi|2
318115)と高度な配列類似性を示し;ならびにクローンHKAFV61に
おけるヒトcDNAの推定翻訳産物(配列番号6)は、ニューロプシン[Mus
musculus](gnl|PID|d1007022)に高度な配列類似
性を示す。従って、配列番号7〜9として示されるポリペプチドおよびcDNA
クローンHMWJH67、HKAFV61、およびHKAET41によってコー
ドされるポリペプチドは、セリンプロテアーゼファミリーの他のメンバーに共通
したセリンプロテアーゼ活性を共有すると期待される。そのような活性は、当業
者に公知のアッセイ、ならびに本明細書中の他の箇所で参照および記載されるア
ッセイによって測定され得る。
セリンプロテアーゼポリペプチドファミリーのメンバーである。この決定は、各
ポリペプチドがセリンプロテアーゼファミリーの他のメンバーと共有する高度な
配列類似性に基づいてなされた。クローンHMWJH67におけるヒトcDNA
の推定翻訳産物(配列番号2)は、推定プレプロアジプシン(Preproad
ipsin)[Sus scrofa domestica](Genbank
登録番号gi|915533)と高度な配列類似性を示し;クローンHKAET
41におけるヒトcDNAの推定翻訳産物(配列番号4)は、プロテアーゼM[
Homo sapiens](gi|1518788)、ニューロプシン(Ne
uropsin)[Homo sapiens](gnl|PID|d1011
968)、およびセリンプロテアーゼ[Homo sapiens](gi|2
318115)と高度な配列類似性を示し;ならびにクローンHKAFV61に
おけるヒトcDNAの推定翻訳産物(配列番号6)は、ニューロプシン[Mus
musculus](gnl|PID|d1007022)に高度な配列類似
性を示す。従って、配列番号7〜9として示されるポリペプチドおよびcDNA
クローンHMWJH67、HKAFV61、およびHKAET41によってコー
ドされるポリペプチドは、セリンプロテアーゼファミリーの他のメンバーに共通
したセリンプロテアーゼ活性を共有すると期待される。そのような活性は、当業
者に公知のアッセイ、ならびに本明細書中の他の箇所で参照および記載されるア
ッセイによって測定され得る。
【0031】 ヒトcDNAクローンHMWJH67は、ヒト骨髄細胞株RS4;11由来の
cDNAライブラリーから単離された。ヒトcDNAクローンHKAET41お
よびHKAFV61は、ヒトケラチノサイト組織由来のcDNAライブラリーか
ら単離された。
cDNAライブラリーから単離された。ヒトcDNAクローンHKAET41お
よびHKAFV61は、ヒトケラチノサイト組織由来のcDNAライブラリーか
ら単離された。
【0032】 セリンプロテアーゼインヒビター(例えば、本発明のセリンプロテアーゼのア
ンタゴニスト(例えば、抗体)は、例えば細胞外マトリックスの分解によって特
徴付けられる障害(例えば、癌、関節炎、心臓血管障害、悪液質、免疫系障害、
消化器系障害、および多発性硬化症)の処置において、セリンプロテアーゼの作
用を阻害するために使用され得る。
ンタゴニスト(例えば、抗体)は、例えば細胞外マトリックスの分解によって特
徴付けられる障害(例えば、癌、関節炎、心臓血管障害、悪液質、免疫系障害、
消化器系障害、および多発性硬化症)の処置において、セリンプロテアーゼの作
用を阻害するために使用され得る。
【0033】 セリンプロテアーゼ自体は、アンタゴニスト(例えば、抗体)の開発において
有用である。プロテアーゼ活性のアンタゴニストを同定するためのアッセイは、
本明細書中の他の箇所に記載され、そして当該分野において周知である。
有用である。プロテアーゼ活性のアンタゴニストを同定するためのアッセイは、
本明細書中の他の箇所に記載され、そして当該分野において周知である。
【0034】 (配列番号7、9および11によってコードされるタンパク質の特徴) 本明細書において配列番号8、10および12として示される各ポリペプチド
は、セルピンポリペプチドファミリーのメンバーである。この決定は、本明細書
中に記載される各ポリペプチドがセルピンポリペプチドファミリーの他のメンバ
ーと共有する高度な配列類似性に基づいてなされた。HETDK50の推定翻訳
産物(配列番号8)は、プレ−α−1−抗トリプシン前駆体[Homo sap
iens](gi|177822)と高度な配列類似性を示し;HKAEF09
の推定翻訳産物(配列番号10)は、扁平上皮癌抗原[Homo sapien
s](gi|1172087)と高度な配列類似性を示し;そしてHKABR6
2の推定翻訳産物(配列番号12)は、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター
[Mus musculus](gi|1763263)に高度な配列類似性を
示す。
は、セルピンポリペプチドファミリーのメンバーである。この決定は、本明細書
中に記載される各ポリペプチドがセルピンポリペプチドファミリーの他のメンバ
ーと共有する高度な配列類似性に基づいてなされた。HETDK50の推定翻訳
産物(配列番号8)は、プレ−α−1−抗トリプシン前駆体[Homo sap
iens](gi|177822)と高度な配列類似性を示し;HKAEF09
の推定翻訳産物(配列番号10)は、扁平上皮癌抗原[Homo sapien
s](gi|1172087)と高度な配列類似性を示し;そしてHKABR6
2の推定翻訳産物(配列番号12)は、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター
[Mus musculus](gi|1763263)に高度な配列類似性を
示す。
【0035】 ヒトcDNAクローンHETDK50は、ヒト子宮内膜腫瘍組織由来のcDN
Aライブラリーから単離された。ヒトcDNAクローンHKAEF09およびH
KABR62は、ヒトケラチノサイト組織由来のcDNAライブラリーから単離
された。
Aライブラリーから単離された。ヒトcDNAクローンHKAEF09およびH
KABR62は、ヒトケラチノサイト組織由来のcDNAライブラリーから単離
された。
【0036】 セルピンとしてのこれらのポリペプチドの同定に基づいて、これらは、神経組
織変性に関連する炎症または疾患の間の過剰なプロテアーゼ産生と関連する「る
いそう」を処置するために有用であることが期待される。例えば、ニューロンの
減少は、カルマン症候群およびダウン症候群のような疾患と関連し、そしてアル
ツハイマー病およびハンティングトン病はまた、これら新規のセルピンポリペプ
チドの投与によって処置され得る。セルピンはまた、成長ホルモンの放出に対す
るソマトスタチンの阻害効果を妨げるために、遊離の循環するソマトスタチンの
量を減少させるために使用され得る。さらに、セルピンは、乳汁漏出症および/
または性機能低下症(hypogandism)の処置において、過剰なレベル
のプロラクチンを取り除くために使用され得る。
織変性に関連する炎症または疾患の間の過剰なプロテアーゼ産生と関連する「る
いそう」を処置するために有用であることが期待される。例えば、ニューロンの
減少は、カルマン症候群およびダウン症候群のような疾患と関連し、そしてアル
ツハイマー病およびハンティングトン病はまた、これら新規のセルピンポリペプ
チドの投与によって処置され得る。セルピンはまた、成長ホルモンの放出に対す
るソマトスタチンの阻害効果を妨げるために、遊離の循環するソマトスタチンの
量を減少させるために使用され得る。さらに、セルピンは、乳汁漏出症および/
または性機能低下症(hypogandism)の処置において、過剰なレベル
のプロラクチンを取り除くために使用され得る。
【0037】 上記のように、本発明のセルピンポリヌクレオチド、ポリペプチドは、哺乳動
物における種々の神経系関連障害(学習および記憶の障害を受けたプロセス(障
害を受けた空間的、嗅覚的、および味覚的な嫌悪学習、アルツハイマー病に関連
する学習および記憶の障害などを含む)を含む)の診断のために有用である。こ
のようなセルピンポリペプチドによって調節される活性を考慮すると、標準また
は「正常」のレベルと比較して、個体における本発明のセルピンポリペプチドの
実質的に改変された(増加または減少した)発現レベルが、神経系関連障害の診
断と関連して上記されるような病理学的状態を生成することは、容易に明らかで
ある。本発明のセルピンタンパク質は、このようなタンパク質を発現する細胞由
来の成熟タンパク質の分泌について適切なリーダーペプチドで翻訳されるため、
セルピンタンパク質(特に、成熟形態)が、外因的供給源から個体の細胞、組織
、または身体へ添加される場合に、このタンパク質が、その個体中の任意のその
標的細胞においてこの調節活性を働かせることは、また当業者に理解される。従
って、個体におけるセルピン活性の標準または正常レベルの減少、またはセルピ
ンによる阻害に対して感受性のプロテアーゼの増加によって生じる状態(特に、
神経系の障害)は、このようなセルピンタンパク質の投与によって処置され得る
。
物における種々の神経系関連障害(学習および記憶の障害を受けたプロセス(障
害を受けた空間的、嗅覚的、および味覚的な嫌悪学習、アルツハイマー病に関連
する学習および記憶の障害などを含む)を含む)の診断のために有用である。こ
のようなセルピンポリペプチドによって調節される活性を考慮すると、標準また
は「正常」のレベルと比較して、個体における本発明のセルピンポリペプチドの
実質的に改変された(増加または減少した)発現レベルが、神経系関連障害の診
断と関連して上記されるような病理学的状態を生成することは、容易に明らかで
ある。本発明のセルピンタンパク質は、このようなタンパク質を発現する細胞由
来の成熟タンパク質の分泌について適切なリーダーペプチドで翻訳されるため、
セルピンタンパク質(特に、成熟形態)が、外因的供給源から個体の細胞、組織
、または身体へ添加される場合に、このタンパク質が、その個体中の任意のその
標的細胞においてこの調節活性を働かせることは、また当業者に理解される。従
って、個体におけるセルピン活性の標準または正常レベルの減少、またはセルピ
ンによる阻害に対して感受性のプロテアーゼの増加によって生じる状態(特に、
神経系の障害)は、このようなセルピンタンパク質の投与によって処置され得る
。
【0038】 上記のように、セルピンファミリーの1つのメンバーは、プロテアーゼネキシ
ンI(PNI)またはグリア由来ネキシン(GDN)であり、これはトロンビン
を特異的に阻害すること、そしてインビトロにおいて神経芽細胞腫細胞株、なら
びに一次海馬ニューロンおよび交感ニューロンにおける軸索伸長を促進すること
が示されている。このPNI遺伝子は転写的に誘導され、そしてタンパク質レベ
ルは、ラットの坐骨神経の軸索切断後に増加する。神経成長因子、脳誘導性神経
栄養因子、およびインスリン様増殖因子Iのような他の神経栄養因子は、末梢神
経損傷に同じく応答する。ニワトリの発達中の運動ニューロン、すなわちE6〜
E9の腰仙部(lumbrosacral)運動ニューロン(これは通常アポト
ーシスを受ける)のPNIでの処置は、運動ニューロンの生存の増加を生じる。
マウスにおいて坐骨神経病変によって実験的に誘導される運動ニューロンの死は
また、PNIの添加によって減少する。アルツハイマーに罹患した脳領域は、正
常な脳の場合よりも遊離PNIと比較してより高いPNI/トロンビン複合体を
含み、このことはPNIがCNS病理学において役割を果たし得ることを示唆す
る。
ンI(PNI)またはグリア由来ネキシン(GDN)であり、これはトロンビン
を特異的に阻害すること、そしてインビトロにおいて神経芽細胞腫細胞株、なら
びに一次海馬ニューロンおよび交感ニューロンにおける軸索伸長を促進すること
が示されている。このPNI遺伝子は転写的に誘導され、そしてタンパク質レベ
ルは、ラットの坐骨神経の軸索切断後に増加する。神経成長因子、脳誘導性神経
栄養因子、およびインスリン様増殖因子Iのような他の神経栄養因子は、末梢神
経損傷に同じく応答する。ニワトリの発達中の運動ニューロン、すなわちE6〜
E9の腰仙部(lumbrosacral)運動ニューロン(これは通常アポト
ーシスを受ける)のPNIでの処置は、運動ニューロンの生存の増加を生じる。
マウスにおいて坐骨神経病変によって実験的に誘導される運動ニューロンの死は
また、PNIの添加によって減少する。アルツハイマーに罹患した脳領域は、正
常な脳の場合よりも遊離PNIと比較してより高いPNI/トロンビン複合体を
含み、このことはPNIがCNS病理学において役割を果たし得ることを示唆す
る。
【0039】 従って、アミノ酸配列における類似性および本発明のセルピンポリペプチドと
PNIとの間の組織局在化に起因して、このセルピンはALSまたは多発性硬化
症のような末梢神経障害を処置するために使用され得る。脊髄傷害から生じる運
動ニューロンまたは感覚ニューロンの損傷はまた、本発明のセルピンタンパク質
で処置することによって予防され得る。さらに、アルツハイマー病のような中枢
神経系の疾患は、セルピン、または好ましくは血液脳関門を横断し得る低分子ア
ナログ(このアナログは、本発明の方法に従って同定され得る)で処置され得る
。
PNIとの間の組織局在化に起因して、このセルピンはALSまたは多発性硬化
症のような末梢神経障害を処置するために使用され得る。脊髄傷害から生じる運
動ニューロンまたは感覚ニューロンの損傷はまた、本発明のセルピンタンパク質
で処置することによって予防され得る。さらに、アルツハイマー病のような中枢
神経系の疾患は、セルピン、または好ましくは血液脳関門を横断し得る低分子ア
ナログ(このアナログは、本発明の方法に従って同定され得る)で処置され得る
。
【0040】 上記の神経系関連障害の他に、セルピン発現を検出することに基づく本発明の
診断的使用の下で、本発明のセルピンタンパク質のプロテアーゼ阻害活性はまた
、このタンパク質が、セルピン感受性プロテアーゼ(特に、t−PA)の過剰な
タンパク質分解活性が関与し得る他の状態の治療的処置のために使用され得るこ
とを示す。従って、例えば、Genentechが発作(stoke)後の血餅
溶解のために市販しているActivase(組換えt−PA)との組み合わせ
において、血餅崩壊のプロセスを調節するためにBAITが使用され得る。この
Activase治療に伴う主要な問題は、過剰な出血が頻繁に生じることであ
る。本発明のセルピンは、t−PAの特異的インヒビターを提供する。この特異
的インヒビターは、処置プロセスを良好に調節し、そして神経系の他のセリンプ
ロテアーゼと相互作用しない。同様に、Trasylol(アプロチニン)と呼
ばれる製品(プロテアーゼインヒビター)は、出血障害のためにBayerから
市販されている。心肺バイパス後の出血損失を制限する際における、このセリン
プロテアーゼインヒビターの有益な作用は、広範に報告されている。本発明のセ
ルピンポリペプチドは、外科的手順の間に同じく有用である。
診断的使用の下で、本発明のセルピンタンパク質のプロテアーゼ阻害活性はまた
、このタンパク質が、セルピン感受性プロテアーゼ(特に、t−PA)の過剰な
タンパク質分解活性が関与し得る他の状態の治療的処置のために使用され得るこ
とを示す。従って、例えば、Genentechが発作(stoke)後の血餅
溶解のために市販しているActivase(組換えt−PA)との組み合わせ
において、血餅崩壊のプロセスを調節するためにBAITが使用され得る。この
Activase治療に伴う主要な問題は、過剰な出血が頻繁に生じることであ
る。本発明のセルピンは、t−PAの特異的インヒビターを提供する。この特異
的インヒビターは、処置プロセスを良好に調節し、そして神経系の他のセリンプ
ロテアーゼと相互作用しない。同様に、Trasylol(アプロチニン)と呼
ばれる製品(プロテアーゼインヒビター)は、出血障害のためにBayerから
市販されている。心肺バイパス後の出血損失を制限する際における、このセリン
プロテアーゼインヒビターの有益な作用は、広範に報告されている。本発明のセ
ルピンポリペプチドは、外科的手順の間に同じく有用である。
【0041】 PNIは、線維芽細胞腫瘍細胞株において細胞外マトリックスの崩壊を阻害す
ることが示されてきた。そのような崩壊は、組織を通した無関係の細胞の浸透を
通常予防する細胞外マトリックスを弱めることによって、腫瘍細胞が転移するこ
とを可能にすると考えられる。ここに本願のセルピンポリペプチドはまた、セル
ピン感受性プロテアーゼを分泌する腫瘍(例えば、t−PAを分泌する神経組織
腫瘍)と関連する細胞外マトリックスの破壊を阻害するために使用され得る。
ることが示されてきた。そのような崩壊は、組織を通した無関係の細胞の浸透を
通常予防する細胞外マトリックスを弱めることによって、腫瘍細胞が転移するこ
とを可能にすると考えられる。ここに本願のセルピンポリペプチドはまた、セル
ピン感受性プロテアーゼを分泌する腫瘍(例えば、t−PAを分泌する神経組織
腫瘍)と関連する細胞外マトリックスの破壊を阻害するために使用され得る。
【0042】
【表1】
【0043】 上記表1は、上記に記載される各「遺伝子番号」に対応する情報を要約する。
【0044】 cDNAクローンIDは、その日付に寄託され、そして「ATCC受託番号Z
および日付」において列挙される対応する寄託番号が与えられた。「ベクター」
は、ヒトcDNAを挿入されたベクターの型をいう。
および日付」において列挙される対応する寄託番号が与えられた。「ベクター」
は、ヒトcDNAを挿入されたベクターの型をいう。
【0045】 「総ヌクレオチド配列」は、「遺伝子番号」によって同定されるコンティグに
おけるヌクレオチドの総数をいう。寄託されたクローンは、これらの配列の全て
またはほとんどを含み得、この配列は、配列番号Xの「クローン配列の5'ヌク レオチド」および「クローン配列の3'ヌクレオチド」として示されるヌクレオ チドの位置によって反映される。推定開始コドン(メチオニン)の配列番号Xの
ヌクレオチドの位置は、「開始コドンの5'ヌクレオチド」として同定される。 同様に、推定シグナル配列の配列番号Xのヌクレオチドの位置は、「シグナルペ
プチドの第一のアミノ酸の5'ヌクレオチド」として同定される。
おけるヌクレオチドの総数をいう。寄託されたクローンは、これらの配列の全て
またはほとんどを含み得、この配列は、配列番号Xの「クローン配列の5'ヌク レオチド」および「クローン配列の3'ヌクレオチド」として示されるヌクレオ チドの位置によって反映される。推定開始コドン(メチオニン)の配列番号Xの
ヌクレオチドの位置は、「開始コドンの5'ヌクレオチド」として同定される。 同様に、推定シグナル配列の配列番号Xのヌクレオチドの位置は、「シグナルペ
プチドの第一のアミノ酸の5'ヌクレオチド」として同定される。
【0046】 翻訳されたアミノ酸配列は、メチオニンで始まり、「アミノ酸配列番号Y」と
して同定されるが、他のリーディングフレームもまた、公知の分子生物学的技術
を使用して容易に翻訳され得る。これらの代替的なオープンリーディングフレー
ムによって生成されるポリペプチドは、本発明によって具体的に意図される。
して同定されるが、他のリーディングフレームもまた、公知の分子生物学的技術
を使用して容易に翻訳され得る。これらの代替的なオープンリーディングフレー
ムによって生成されるポリペプチドは、本発明によって具体的に意図される。
【0047】 推定シグナルペプチドの配列番号Yの第1および最後のアミノ酸の位置は、「
シグナルペプチドの第1のアミノ酸」および「シグナルペプチドの最後のアミノ
酸」として同定される。分泌部分の配列番号Yの推定される第1のアミノ酸の位
置は、「分泌部分の推定される第1のアミノ酸」として同定される。最後には、
オープンリーディングフレームにおける最後のアミノ酸の配列番号Yのアミノ酸
の位置は、「ORFの最後のアミノ酸」として同定される。
シグナルペプチドの第1のアミノ酸」および「シグナルペプチドの最後のアミノ
酸」として同定される。分泌部分の配列番号Yの推定される第1のアミノ酸の位
置は、「分泌部分の推定される第1のアミノ酸」として同定される。最後には、
オープンリーディングフレームにおける最後のアミノ酸の配列番号Yのアミノ酸
の位置は、「ORFの最後のアミノ酸」として同定される。
【0048】 配列番号Xおよび翻訳される配列番号Yは、十分に正確であり、そうでなけれ
ば、当該分野において周知でありかつ以下でさらに記載される種々の使用に適切
である。例えば、配列番号Xは、配列番号Xにおいて含まれる核酸配列または寄
託されたクローンに含まれるcDNAを検出する核酸ハイブリダイゼーションプ
ローブを設計するために有用である。これらのプローブはまた、生物学的サンプ
ル中の核酸分子にハイブリダイズし、それによって本発明の種々の法医学の方法
、および診断の方法を可能にする。同様に、配列番号Yから同定されるポリぺプ
チドは、表1において同定されるcDNAクローンによってコードされるタンパ
ク質に特異的に結合する抗体を作製するために使用され得る。
ば、当該分野において周知でありかつ以下でさらに記載される種々の使用に適切
である。例えば、配列番号Xは、配列番号Xにおいて含まれる核酸配列または寄
託されたクローンに含まれるcDNAを検出する核酸ハイブリダイゼーションプ
ローブを設計するために有用である。これらのプローブはまた、生物学的サンプ
ル中の核酸分子にハイブリダイズし、それによって本発明の種々の法医学の方法
、および診断の方法を可能にする。同様に、配列番号Yから同定されるポリぺプ
チドは、表1において同定されるcDNAクローンによってコードされるタンパ
ク質に特異的に結合する抗体を作製するために使用され得る。
【0049】 にもかかわらず、配列決定反応によって生成されるDNA配列は、配列決定誤
差を含み得る。この誤差は、生成されたDNA配列における誤って同定されたヌ
クレオチドとして、またはヌクレオチドの挿入または欠失として存在する。誤っ
て挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配列のリーデ
ィングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場合において、
作製されるDNA配列は、実際のDNA配列と99.9%(例えば、1000塩
基を超えるオープンリーディングフレームにおいて1塩基の挿入または欠失)を
超えて同一であり得るとしても、推定アミノ酸配列は、実際のアミノ酸配列とは
異なる。
差を含み得る。この誤差は、生成されたDNA配列における誤って同定されたヌ
クレオチドとして、またはヌクレオチドの挿入または欠失として存在する。誤っ
て挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配列のリーデ
ィングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場合において、
作製されるDNA配列は、実際のDNA配列と99.9%(例えば、1000塩
基を超えるオープンリーディングフレームにおいて1塩基の挿入または欠失)を
超えて同一であり得るとしても、推定アミノ酸配列は、実際のアミノ酸配列とは
異なる。
【0050】 従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするこ
れらの適用のために、本発明は、配列番号Xとして同定される作製されたヌクレ
オチド配列および配列番号Yとして同定される推定の翻訳されたアミノ酸配列だ
けではなく、表1に記載されるような、ATCCに寄託された本発明のヒトcD
NAを含むプラスミドDNAのサンプルもまた提供する。寄託された各クローン
のヌクレオチド配列は、公知の方法に従って寄託されたクローンの配列決定によ
って容易に決定され得る。次いで、推定アミノ酸配列は、このような寄託物から
証明され得る。さらに、特定のクローンによってコードされるタンパク質のアミ
ノ酸配列はまた、ペプチド配列決定によって、または寄託されたヒトcDNAを
含む適切な宿主細胞中でタンパク質を発現させ、このタンパク質を収集し、そし
てその配列を決定することによって、直接的に決定され得る。
れらの適用のために、本発明は、配列番号Xとして同定される作製されたヌクレ
オチド配列および配列番号Yとして同定される推定の翻訳されたアミノ酸配列だ
けではなく、表1に記載されるような、ATCCに寄託された本発明のヒトcD
NAを含むプラスミドDNAのサンプルもまた提供する。寄託された各クローン
のヌクレオチド配列は、公知の方法に従って寄託されたクローンの配列決定によ
って容易に決定され得る。次いで、推定アミノ酸配列は、このような寄託物から
証明され得る。さらに、特定のクローンによってコードされるタンパク質のアミ
ノ酸配列はまた、ペプチド配列決定によって、または寄託されたヒトcDNAを
含む適切な宿主細胞中でタンパク質を発現させ、このタンパク質を収集し、そし
てその配列を決定することによって、直接的に決定され得る。
【0051】 本発明はまた、配列番号X、配列番号Y、または寄託されたクローンに対応す
る遺伝子に関する。対応する遺伝子は、本明細書中に開示される配列情報を使用
して、公知の方法に従って単離され得る。このような方法は、開示された配列か
らプローブまたはプライマーを調製する工程、およびゲノム物質の適切な供給源
から対応する遺伝子を同定または増幅する工程を包含する。
る遺伝子に関する。対応する遺伝子は、本明細書中に開示される配列情報を使用
して、公知の方法に従って単離され得る。このような方法は、開示された配列か
らプローブまたはプライマーを調製する工程、およびゲノム物質の適切な供給源
から対応する遺伝子を同定または増幅する工程を包含する。
【0052】 本発明においてまた提供されるものは、種ホモログである。種ホモログは、本
明細書中に提供される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、そし
て所望の相同体について適切な核酸供給源をスクリーニングすることによって単
離および同定され得る。
明細書中に提供される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、そし
て所望の相同体について適切な核酸供給源をスクリーニングすることによって単
離および同定され得る。
【0053】 本発明のポリぺプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。このようなポリ
ぺプチドとしては、単離された天然に存在するポリぺプチド、組換えによって生
成されたポリぺプチド、合成によって生成されたポリぺプチド、またはこれらの
方法の組合せによって生成されたポリぺプチドが挙げられる。このようなポリぺ
プチドを調製するための手段は、当該分野において十分に理解される。
ぺプチドとしては、単離された天然に存在するポリぺプチド、組換えによって生
成されたポリぺプチド、合成によって生成されたポリぺプチド、またはこれらの
方法の組合せによって生成されたポリぺプチドが挙げられる。このようなポリぺ
プチドを調製するための手段は、当該分野において十分に理解される。
【0054】 このポリぺプチドは、分泌タンパク質の形態(成熟形態を含む)であり得るか
、またはより大きなタンパク質(例えば、融合タンパク質)の部分であり得る(
以下を参照のこと)。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製を補助する
配列(例えば、複数のヒスチジン残基)、あるいは組換え生成の間の安定性のた
めのさらなる配列を含む、さらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利で
ある。
、またはより大きなタンパク質(例えば、融合タンパク質)の部分であり得る(
以下を参照のこと)。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製を補助する
配列(例えば、複数のヒスチジン残基)、あるいは組換え生成の間の安定性のた
めのさらなる配列を含む、さらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利で
ある。
【0055】 本発明のポリぺプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは実質的に精製される。ポリぺプチド(分泌ポリぺプチドを含む)の組換
えによって生成されたバージョン(version)は、SmithおよびJo
hnson、Gene 67:31−40(1988)に記載される1工程の方
法によって実質的に精製され得る。本発明のポリぺプチドはまた、当該分野にお
いて周知である方法で、タンパク質に対して惹起される本発明の抗体を使用して
、天然のまたは組換えの供給源から精製され得る。
ましくは実質的に精製される。ポリぺプチド(分泌ポリぺプチドを含む)の組換
えによって生成されたバージョン(version)は、SmithおよびJo
hnson、Gene 67:31−40(1988)に記載される1工程の方
法によって実質的に精製され得る。本発明のポリぺプチドはまた、当該分野にお
いて周知である方法で、タンパク質に対して惹起される本発明の抗体を使用して
、天然のまたは組換えの供給源から精製され得る。
【0056】 (シグナル配列) タンパク質が、シグナル配列、ならびにその配列についての切断点を有するか
否かを予測するための方法が、利用可能である。例えば、McGeoch,Vi
rus Res. 3:271−286(1985)の方法は、完全な(切断さ
れていない)タンパク質の短いN末端荷電領域およびそれに続く非荷電領域から
の情報を使用する。von Heinje,Nucleic Acids Re
s.14:4683−4690(1986)の方法は、切断部位の周辺の残基(
代表的には、−13〜+2残基)からの情報を使用し、ここで、+1は、分泌タ
ンパク質のアミノ末端を示す。これらの方法のそれぞれについての、公知の哺乳
動物分泌タンパク質の切断点を予測することの正確さは、75〜80%の範囲に
ある(von Heinje、前出)。しかし、2つの方法は、所定のタンパク
質について、同じ推定切断点をいつも生成するとは限らない。
否かを予測するための方法が、利用可能である。例えば、McGeoch,Vi
rus Res. 3:271−286(1985)の方法は、完全な(切断さ
れていない)タンパク質の短いN末端荷電領域およびそれに続く非荷電領域から
の情報を使用する。von Heinje,Nucleic Acids Re
s.14:4683−4690(1986)の方法は、切断部位の周辺の残基(
代表的には、−13〜+2残基)からの情報を使用し、ここで、+1は、分泌タ
ンパク質のアミノ末端を示す。これらの方法のそれぞれについての、公知の哺乳
動物分泌タンパク質の切断点を予測することの正確さは、75〜80%の範囲に
ある(von Heinje、前出)。しかし、2つの方法は、所定のタンパク
質について、同じ推定切断点をいつも生成するとは限らない。
【0057】 本発明の場合において、分泌ポリぺプチドの推定アミノ酸配列は、Signa
lPと呼ばれるコンピュータープログラム(Henrik Nielsenら、
Protein Engineering 10:1−6(1997))によっ
て分析された。このプログラムは、アミノ酸配列に基づいてタンパク質の細胞で
の位置を予測する。この局在化のコンピューター予測の一部として、McGeo
chおよびvon Heinjeの方法が援用される。このプログラムによって
、本明細書中に記載される分泌タンパク質のアミノ酸配列の分析は、表1におい
て示される結果を提供した。
lPと呼ばれるコンピュータープログラム(Henrik Nielsenら、
Protein Engineering 10:1−6(1997))によっ
て分析された。このプログラムは、アミノ酸配列に基づいてタンパク質の細胞で
の位置を予測する。この局在化のコンピューター予測の一部として、McGeo
chおよびvon Heinjeの方法が援用される。このプログラムによって
、本明細書中に記載される分泌タンパク質のアミノ酸配列の分析は、表1におい
て示される結果を提供した。
【0058】 しかし、当業者に理解されるように、切断部位は、時折、生物に応じて変化し
、そして絶対的な確実性を伴っては予測され得ない。従って、本発明は、配列番
号Yにおいて示される配列を有する分泌ポリぺプチドを提供し、これは推定切断
点の5残基(すなわち、+または−5残基)内で始まるN末端を有する。同様に
、いくつかの場合において、分泌タンパク質からのシグナル配列の切断は、必ず
しも一定ではなく、1つより多くの分泌種を生じることもまた認識される。これ
らのポリぺプチド、およびこのようなポリぺプチドをコードするポリヌクレオチ
ドは、本発明によって意図される。
、そして絶対的な確実性を伴っては予測され得ない。従って、本発明は、配列番
号Yにおいて示される配列を有する分泌ポリぺプチドを提供し、これは推定切断
点の5残基(すなわち、+または−5残基)内で始まるN末端を有する。同様に
、いくつかの場合において、分泌タンパク質からのシグナル配列の切断は、必ず
しも一定ではなく、1つより多くの分泌種を生じることもまた認識される。これ
らのポリぺプチド、およびこのようなポリぺプチドをコードするポリヌクレオチ
ドは、本発明によって意図される。
【0059】 さらに、上述の分析によって同定されるシグナル配列は、天然に存在するシグ
ナル配列を必ずしも予測しないかもしれない。例えば、天然に存在するシグナル
配列は、推定シグナル配列からさらに上流に存在し得る。しかし、推定シグナル
配列は、分泌タンパク質をERに指向し得るようである。これらのポリぺプチド
、およびこのようなポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明によ
って意図される。
ナル配列を必ずしも予測しないかもしれない。例えば、天然に存在するシグナル
配列は、推定シグナル配列からさらに上流に存在し得る。しかし、推定シグナル
配列は、分泌タンパク質をERに指向し得るようである。これらのポリぺプチド
、およびこのようなポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明によ
って意図される。
【0060】 (ポリヌクレオチドおよびポリぺプチド改変体) 「改変体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリぺプチドとは異なるが
、それらの本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリぺプチドをいう
。一般に、改変体は、全体的に密接に類似し、そして、多くの領域において、本
発明のポリヌクレオチドまたはポリぺプチドに同一である。
、それらの本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリぺプチドをいう
。一般に、改変体は、全体的に密接に類似し、そして、多くの領域において、本
発明のポリヌクレオチドまたはポリぺプチドに同一である。
【0061】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも95%「同一」である
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチドのヌク
レオチド配列は、ポリヌクレオチド配列がポリぺプチドをコードする参照ヌクレ
オチド配列の各100ヌクレオチドあたり5つまでの点変異を含み得ることを除
いて、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオ
チド配列に対して少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレ
オチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの5%までが、別のヌクレオチド
で欠失または置換され得るか、または参照配列中の総ヌクレオチドの5%までの
多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。問い合わせ(query)配
列は、表1に示される配列全体、ORF(オープンリーディングフレーム)、ま
たは本明細書中で記載されるように特定される任意のフラグメントであり得る。
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチドのヌク
レオチド配列は、ポリヌクレオチド配列がポリぺプチドをコードする参照ヌクレ
オチド配列の各100ヌクレオチドあたり5つまでの点変異を含み得ることを除
いて、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオ
チド配列に対して少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレ
オチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの5%までが、別のヌクレオチド
で欠失または置換され得るか、または参照配列中の総ヌクレオチドの5%までの
多数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。問い合わせ(query)配
列は、表1に示される配列全体、ORF(オープンリーディングフレーム)、ま
たは本明細書中で記載されるように特定される任意のフラグメントであり得る。
【0062】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、ま
たは99%同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従
来的に決定され得る。問い合わせ配列(本発明の配列)と対象配列(subje
ct sequence)との間の最も良好な全体的なマッチ(全体的な配列整
列としてもまた言及される)を決定するための好ましい方法は、Brutlag
ら(Comp.App. Biosci.(1990)6:237−245)の
アルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータープログラムを使用して決定さ
れ得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにDN
A配列である。RNA配列は、UからTに変換することによって比較され得る。
この全体的な配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。同一性パーセン
トを算定するためにDNA配列のFASTDB整列において使用される好ましい
パラメーターは以下である:Matrix=Unitary、k−tuple=
4、Mismatch Penalty=1、Joining Penalty
=30、Randomization Group Length=0、Cut
off Score=1、Gap Penalty=5、Gap Size P
enalty 0.05、Window Size=500または対象ヌクレオ
チド配列の長さ(どちらかより短い方)。
レオチド配列に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、ま
たは99%同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して従
来的に決定され得る。問い合わせ配列(本発明の配列)と対象配列(subje
ct sequence)との間の最も良好な全体的なマッチ(全体的な配列整
列としてもまた言及される)を決定するための好ましい方法は、Brutlag
ら(Comp.App. Biosci.(1990)6:237−245)の
アルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータープログラムを使用して決定さ
れ得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにDN
A配列である。RNA配列は、UからTに変換することによって比較され得る。
この全体的な配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。同一性パーセン
トを算定するためにDNA配列のFASTDB整列において使用される好ましい
パラメーターは以下である:Matrix=Unitary、k−tuple=
4、Mismatch Penalty=1、Joining Penalty
=30、Randomization Group Length=0、Cut
off Score=1、Gap Penalty=5、Gap Size P
enalty 0.05、Window Size=500または対象ヌクレオ
チド配列の長さ(どちらかより短い方)。
【0063】 対象配列が、5’または3’欠失のために(内部欠失のためではなく)問い合
わせ配列より短い場合、手動の修正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、FASTDBプログラムが対象配列
の5’および3’切断を考慮しないからである。5’末端または3’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致/整列されない対象配列の5’およ
び3’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって修正される。ヌ
クレオチドが一致/整列されるか否かは、FASTDB配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特
定のパラメーターを用いて上記のFASTDBプログラムによって算定され、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この修正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。FASTDB整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致/整列されいていない、対象配列の5’および3’塩基の外
側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される
。
わせ配列より短い場合、手動の修正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、FASTDBプログラムが対象配列
の5’および3’切断を考慮しないからである。5’末端または3’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致/整列されない対象配列の5’およ
び3’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって修正される。ヌ
クレオチドが一致/整列されるか否かは、FASTDB配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特
定のパラメーターを用いて上記のFASTDBプログラムによって算定され、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この修正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。FASTDB整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致/整列されいていない、対象配列の5’および3’塩基の外
側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される
。
【0064】 例えば、90塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために100塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失が対象配列の5’末端で生じ、従って、
FASTDB整列は、5’末端で最初の10塩基の一致/整列を示さない。10
個の不対合塩基は、配列の10%(一致していない5’および3’末端での塩基
の数/問い合わせ配列の塩基の総数)を表し、そのため10%は、FASTDB
プログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残
りの90塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは90%であ
る。別の例では、90塩基の対象配列は、100塩基の問い合わせ配列と比較さ
れる。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせ配列と一致/
整列しない対象配列の5’または3’に塩基が存在しない。この場合、FAST
DBによって算定される同一性パーセントは手動で修正されない。再び、問い合
わせ配列と一致/整列しない対象配列の5’または3’の塩基のみが手動で修正
される。他の手動の修正は、本発明の目的ではなされない。
基の問い合わせ配列に整列される。欠失が対象配列の5’末端で生じ、従って、
FASTDB整列は、5’末端で最初の10塩基の一致/整列を示さない。10
個の不対合塩基は、配列の10%(一致していない5’および3’末端での塩基
の数/問い合わせ配列の塩基の総数)を表し、そのため10%は、FASTDB
プログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残
りの90塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは90%であ
る。別の例では、90塩基の対象配列は、100塩基の問い合わせ配列と比較さ
れる。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせ配列と一致/
整列しない対象配列の5’または3’に塩基が存在しない。この場合、FAST
DBによって算定される同一性パーセントは手動で修正されない。再び、問い合
わせ配列と一致/整列しない対象配列の5’または3’の塩基のみが手動で修正
される。他の手動の修正は、本発明の目的ではなされない。
【0065】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも95%「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各100個のアミノ酸
あたり5つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
95%同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の5%までが、挿入、欠失、(消えない(indels))
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末
端部位の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列
内の1つ以上の連続した基においてのいずれかで、散在される。
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各100個のアミノ酸
あたり5つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
95%同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の5%までが、挿入、欠失、(消えない(indels))
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末
端部位の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列
内の1つ以上の連続した基においてのいずれかで、散在される。
【0066】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、表1に示されるアミ
ノ酸配列に対して、または寄託されたDNAクローンによってコードされるアミ
ノ酸配列に対して、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、また
は99%同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して、従
来的に決定され得る。問い合わせ配列(本発明の配列)と対象配列との間での最
良の全体的な一致(全体的配列整列としても言及される)を決定するための好ま
しい方法は、Brutlagら(Comp. App. Biosci. (1
990) 6:237−245)のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュ
ータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせおよ
び対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列
であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセント
で示される。FASTDBアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは以
下である:Matrix=PAM 0、k−tuple=2、Mismatch
Penalty=1、Joining Penalty=20、Random
ization Group Length=0、Cutoff Score=
1、Window Size = 配列の長さ、Gap Penalty=5、
Gap Size Penalty = 0.05、Window Size=
500または対象アミノ酸配列の長さ(どちらかより短い方)。
ノ酸配列に対して、または寄託されたDNAクローンによってコードされるアミ
ノ酸配列に対して、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、また
は99%同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラムを使用して、従
来的に決定され得る。問い合わせ配列(本発明の配列)と対象配列との間での最
良の全体的な一致(全体的配列整列としても言及される)を決定するための好ま
しい方法は、Brutlagら(Comp. App. Biosci. (1
990) 6:237−245)のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュ
ータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせおよ
び対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列
であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセント
で示される。FASTDBアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは以
下である:Matrix=PAM 0、k−tuple=2、Mismatch
Penalty=1、Joining Penalty=20、Random
ization Group Length=0、Cutoff Score=
1、Window Size = 配列の長さ、Gap Penalty=5、
Gap Size Penalty = 0.05、Window Size=
500または対象アミノ酸配列の長さ(どちらかより短い方)。
【0067】 対象配列が、N末端またはC末端欠失により(内部の欠失のためではなく)問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の修正が結果に対してなされなければならな
い。これは、FASTDBプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のN末端切断およびC末端切断を考慮しないからである。N末
端およびC末端で切断される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一
性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残
基と一致/整列しない対象配列のN末端およびC末端である問い合わせ配列の残
基の数を計算することによって修正される。残基が一致/整列されているか否か
は、FASTDB配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセント
は、同一性パーセントから差し引かれ、上記のFASTDBプログラムによって
特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに
到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使用され
るものである。問い合わせ配列と一致/整列していない対象配列のN末端および
C末端の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で考慮さ
れる。すなわち、対象配列の最も遠いN末端およびC末端残基の外側の問い合わ
せ残基位置のみである。
い合わせ配列よりも短い場合、手動の修正が結果に対してなされなければならな
い。これは、FASTDBプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のN末端切断およびC末端切断を考慮しないからである。N末
端およびC末端で切断される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一
性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残
基と一致/整列しない対象配列のN末端およびC末端である問い合わせ配列の残
基の数を計算することによって修正される。残基が一致/整列されているか否か
は、FASTDB配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセント
は、同一性パーセントから差し引かれ、上記のFASTDBプログラムによって
特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのスコアに
到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使用され
るものである。問い合わせ配列と一致/整列していない対象配列のN末端および
C末端の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で考慮さ
れる。すなわち、対象配列の最も遠いN末端およびC末端残基の外側の問い合わ
せ残基位置のみである。
【0068】 例えば、90アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために
100残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のN末端で生じ、従
って、FASTDB整列は、N末端での最初の10残基の一致/整列を示さない
。10個の不対合残基は、配列の10%(一致していないN末端およびC末端で
の残基の数/問い合わせ配列中の残基の総数)を表し、そのためFASTDBプ
ログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから10%が差し引かれ
る。残りの90残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは90%
である。別の例において、90残基の対象配列が、100残基の問い合わせ配列
と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ配列と
一致/整列しない対象配列のN末端またはC末端の残基は存在しない。この場合
、FASTDBによって算定される同一性パーセントは、手動で修正されない。
再び、FASTDB整列において示される、問い合わせ配列と一致/整列しない
対象配列のN末端およびC末端の外の残基位置のみが手動で修正される。他の手
動の修正は、本発明の目的のためにはなされない。
100残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のN末端で生じ、従
って、FASTDB整列は、N末端での最初の10残基の一致/整列を示さない
。10個の不対合残基は、配列の10%(一致していないN末端およびC末端で
の残基の数/問い合わせ配列中の残基の総数)を表し、そのためFASTDBプ
ログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから10%が差し引かれ
る。残りの90残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは90%
である。別の例において、90残基の対象配列が、100残基の問い合わせ配列
と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ配列と
一致/整列しない対象配列のN末端またはC末端の残基は存在しない。この場合
、FASTDBによって算定される同一性パーセントは、手動で修正されない。
再び、FASTDB整列において示される、問い合わせ配列と一致/整列しない
対象配列のN末端およびC末端の外の残基位置のみが手動で修正される。他の手
動の修正は、本発明の目的のためにはなされない。
【0069】 改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変化を含み得
る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するが、
コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化しない変化を含むポリヌクレ
オチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって生
成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合せにおいて5〜
10、1〜5、もしくは1〜2アミノ酸が置換、欠失、または付加される改変体
もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、多様な理由(例えば、特定の宿
主についてのコドン発現を至適化する(ヒトmRNAにおけるコドンを、E.c
oliのような細菌宿主によって好ましいコドンに変化する))ために、生成さ
れ得る。
る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するが、
コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化しない変化を含むポリヌクレ
オチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって生
成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合せにおいて5〜
10、1〜5、もしくは1〜2アミノ酸が置換、欠失、または付加される改変体
もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、多様な理由(例えば、特定の宿
主についてのコドン発現を至適化する(ヒトmRNAにおけるコドンを、E.c
oliのような細菌宿主によって好ましいコドンに変化する))ために、生成さ
れ得る。
【0070】 天然に存在する改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物の染色
体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの1つを
いう。(Genes II、Lewin,B.,編 John Wiley &
Sons,New York(1985))。これらの対立遺伝子改変体は、
ポリヌクレオチドレベルおよび/またはポリぺプチドレベルのいずれかで変化し
得る。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発技術によってまたは直接
的な合成によって生成され得る。
体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの1つを
いう。(Genes II、Lewin,B.,編 John Wiley &
Sons,New York(1985))。これらの対立遺伝子改変体は、
ポリヌクレオチドレベルおよび/またはポリぺプチドレベルのいずれかで変化し
得る。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発技術によってまたは直接
的な合成によって生成され得る。
【0071】 タンパク質工学および組換えDNA技術の公知の方法を使用して、改変体は、
本発明のポリぺプチドの特徴を改善または変化するために作製され得る。例えば
、1つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な欠損を伴わずに、タンパク質
のN末端またはC末端から欠失され得る。Ronら、J.Biol.Chem.
268:2984−2988(1993)の著者らは、3、8、または27個の
アミノ末端のアミノ酸残基を欠失した後でさえ、ヘパリン結合活性を有する改変
体KGFタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、このタンパク
質のカルボキシ末端から8〜10個のアミノ酸残基を欠失した後、10倍までの
より高い活性を示した(Dobeliら、J.Biotechnology 7
:199−216(1988))。
本発明のポリぺプチドの特徴を改善または変化するために作製され得る。例えば
、1つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な欠損を伴わずに、タンパク質
のN末端またはC末端から欠失され得る。Ronら、J.Biol.Chem.
268:2984−2988(1993)の著者らは、3、8、または27個の
アミノ末端のアミノ酸残基を欠失した後でさえ、ヘパリン結合活性を有する改変
体KGFタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、このタンパク
質のカルボキシ末端から8〜10個のアミノ酸残基を欠失した後、10倍までの
より高い活性を示した(Dobeliら、J.Biotechnology 7
:199−216(1988))。
【0072】 さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する生物学的活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Gayl
eおよび共同研究者ら(J.Biol.Chem 268:22105−221
11(1993))は、ヒトサイトカインIL−1aの広範囲にわたる変異分析
を行った。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変
体当たり平均2.5アミノ酸の変化になる、3,500個を超える個々のIL−
1a変異体を作製した。複数の変異が、全ての可能なアミノ酸の位置で試験され
た。この研究者らは、「分子の大部分は、結合活性または生物学的活性のいずれ
かに対してほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。(要約を
参照のこと)。実際、試験された3,500個を超えるヌクレオチド配列のうち
、わずか23個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク
質を生成した。
に類似する生物学的活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Gayl
eおよび共同研究者ら(J.Biol.Chem 268:22105−221
11(1993))は、ヒトサイトカインIL−1aの広範囲にわたる変異分析
を行った。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変
体当たり平均2.5アミノ酸の変化になる、3,500個を超える個々のIL−
1a変異体を作製した。複数の変異が、全ての可能なアミノ酸の位置で試験され
た。この研究者らは、「分子の大部分は、結合活性または生物学的活性のいずれ
かに対してほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。(要約を
参照のこと)。実際、試験された3,500個を超えるヌクレオチド配列のうち
、わずか23個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク
質を生成した。
【0073】 さらに、ポリぺプチドのN末端またはC末端からの1つ以上のアミノ酸の欠失
が、1つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的
活性はなお保持され得る。例えば、分泌形態を認識する抗体を誘導および/また
は結合する、欠失改変体の能力は、分泌形態の残基の過半数未満が、N末端また
はC末端から除去される場合に保持されるようである。タンパク質のN末端また
はC末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免疫原性活性を保持
するか否かは、本明細書中に記載され、そしてさもなければ当該分野において公
知である慣用の方法によって容易に決定され得る。
が、1つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的
活性はなお保持され得る。例えば、分泌形態を認識する抗体を誘導および/また
は結合する、欠失改変体の能力は、分泌形態の残基の過半数未満が、N末端また
はC末端から除去される場合に保持されるようである。タンパク質のN末端また
はC末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免疫原性活性を保持
するか否かは、本明細書中に記載され、そしてさもなければ当該分野において公
知である慣用の方法によって容易に決定され得る。
【0074】 従って、本発明はさらに、実質的な生物学的活性を示すポリぺプチド改変体を
含む。このような改変体としては、活性に対する影響をほとんど有さないように
、当該分野において公知の一般的な法則に従って選択される、欠失、挿入、逆位
、反復、および置換が挙げられる。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置
換を作製する方法に関する指針は、Bowie,J.U.ら、Science
247:1306−1310(1990)において提供され、ここで、著者らは
変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための2つの主要なストラテジー
が存在することを指摘する。
含む。このような改変体としては、活性に対する影響をほとんど有さないように
、当該分野において公知の一般的な法則に従って選択される、欠失、挿入、逆位
、反復、および置換が挙げられる。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置
換を作製する方法に関する指針は、Bowie,J.U.ら、Science
247:1306−1310(1990)において提供され、ここで、著者らは
変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための2つの主要なストラテジー
が存在することを指摘する。
【0075】 第1のストラテジーは、進化の過程の間の天然の選択によるアミノ酸置換の寛
容性を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することによって、保存
されるアミノ酸が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の
機能について重要であるようである。対照的に、置換が天然の選別によって寛容
されたアミノ酸の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないこと
を示す。従って、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の
生物学的活性をなおも維持する。
容性を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することによって、保存
されるアミノ酸が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の
機能について重要であるようである。対照的に、置換が天然の選別によって寛容
されたアミノ酸の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないこと
を示す。従って、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の
生物学的活性をなおも維持する。
【0076】 第2のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発(
分子中の各残基で1つずつのアラニン変異の導入)が、使用され得る。(Cun
ninghamおよびWells,Science 244:1081−108
5(1989))。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され
得る。
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発(
分子中の各残基で1つずつのアラニン変異の導入)が、使用され得る。(Cun
ninghamおよびWells,Science 244:1081−108
5(1989))。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され
得る。
【0077】 著者らが述べるように、これらの2つのストラテジーは、タンパク質がアミノ
酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミノ
酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示す
。例えば、最も埋もれている(タンパク質の三次構造内の)アミノ酸残基は、非
極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されない。さ
らに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸のAl
a、Val、Leu、およびIleの置換;ヒドロキシル残基のSerおよびT
hrの置換;酸性残基のAspおよびGluの置換;アミド残基のAsnおよび
Glnの置換、塩基性残基のLys、Arg、およびHisの置換;芳香族残基
のPhe、Tyr、およびTrpの置換、ならびに小さなサイズのアミノ酸のA
la、Ser、Thr、Met、およびGlyの置換を含む。
酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミノ
酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示す
。例えば、最も埋もれている(タンパク質の三次構造内の)アミノ酸残基は、非
極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されない。さ
らに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸のAl
a、Val、Leu、およびIleの置換;ヒドロキシル残基のSerおよびT
hrの置換;酸性残基のAspおよびGluの置換;アミド残基のAsnおよび
Glnの置換、塩基性残基のLys、Arg、およびHisの置換;芳香族残基
のPhe、Tyr、およびTrpの置換、ならびに小さなサイズのアミノ酸のA
la、Ser、Thr、Met、およびGlyの置換を含む。
【0078】 保存的なアミノ酸置換以外に、本発明の改変体は、(i)1つ以上の非保存的
なアミノ酸残基での置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードによ
ってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい、
または(ii)置換基を有する1つ以上のアミノ酸残基での置換、または(ii
i)別の化合物(例えば、ポリぺプチドの安定性および/もしくは可溶性を増加
するための化合物(例えば、ポリエチレングリコール))との成熟ポリぺプチド
の融合、または(iv)さらなるアミノ酸(例えば、IgG Fc融合領域ペプ
チド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列)とのポ
リぺプチドの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細書中の教示
から、当業者の範囲内であることが考えられる。
なアミノ酸残基での置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードによ
ってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい、
または(ii)置換基を有する1つ以上のアミノ酸残基での置換、または(ii
i)別の化合物(例えば、ポリぺプチドの安定性および/もしくは可溶性を増加
するための化合物(例えば、ポリエチレングリコール))との成熟ポリぺプチド
の融合、または(iv)さらなるアミノ酸(例えば、IgG Fc融合領域ペプ
チド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列)とのポ
リぺプチドの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細書中の教示
から、当業者の範囲内であることが考えられる。
【0079】 例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸で荷電されたアミノ酸
のアミノ酸置換を含むポリぺプチド改変体は、改善された特徴(例えば、より少
ない凝集性)を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集体
の免疫原活性に起因して、活性を減少し、かつクリアランスを増加する。(Pi
nckardら、Clin.Exp.Immunol.2:331−340(1
967);Robbinsら、Diabetes 36:838−845(19
87);Clelandら、Crit.Rev.Therapeutic Dr
ug Carrier Systems 10:307−377(1993))
。
のアミノ酸置換を含むポリぺプチド改変体は、改善された特徴(例えば、より少
ない凝集性)を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集体
の免疫原活性に起因して、活性を減少し、かつクリアランスを増加する。(Pi
nckardら、Clin.Exp.Immunol.2:331−340(1
967);Robbinsら、Diabetes 36:838−845(19
87);Clelandら、Crit.Rev.Therapeutic Dr
ug Carrier Systems 10:307−377(1993))
。
【0080】 (ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリぺプチドフラグメント) 本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、寄託されたクロー
ンに含まれるか、または配列番号Xにおいて示される核酸配列を有する短いポリ
ヌクレオチドをいう。短いヌクレオチドフラグメントは、好ましくは、少なくと
も約15ヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド、
なおより好ましくは少なくとも約30ヌクレオチド、およびさらにより好ましく
は少なくとも約40ヌクレオチドの長さである。例えば、「少なくとも20ヌク
レオチドの長さ」のフラグメントは、寄託されたクローンに含まれるcDNA配
列または配列番号Xにおいて示されるヌクレオチド配列からの20個以上の連続
した塩基を含むことが意図される。これらのヌクレオチドフラグメントは、本明
細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーとして有用である。
もちろん、より大きなフラグメント(例えば、50、150、500、600、
2000ヌクレオチド)が好ましい。
ンに含まれるか、または配列番号Xにおいて示される核酸配列を有する短いポリ
ヌクレオチドをいう。短いヌクレオチドフラグメントは、好ましくは、少なくと
も約15ヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド、
なおより好ましくは少なくとも約30ヌクレオチド、およびさらにより好ましく
は少なくとも約40ヌクレオチドの長さである。例えば、「少なくとも20ヌク
レオチドの長さ」のフラグメントは、寄託されたクローンに含まれるcDNA配
列または配列番号Xにおいて示されるヌクレオチド配列からの20個以上の連続
した塩基を含むことが意図される。これらのヌクレオチドフラグメントは、本明
細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーとして有用である。
もちろん、より大きなフラグメント(例えば、50、150、500、600、
2000ヌクレオチド)が好ましい。
【0081】 さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例は、例えば、配
列番号Xまたは寄託されたクローンにおいて含まれるcDNAのヌクレオチド番
号の約1〜50、51〜100、101〜150、151〜200、201〜2
50、251〜300、301〜350、351〜400、401〜450、4
51〜500、501〜550、551〜600、651〜700、701〜7
50、751〜800、800〜850、851〜900、901〜950、9
51〜1000、1001〜1050、1051〜1100、1101〜115
0、1151〜1200、1201〜1250、1251〜1300、1301
〜1350、1351〜1400、1401〜1450、1451〜1500、
1501〜1550、1551〜1600、1601〜1650、1651〜1
700、1701〜1750、1751〜1800、1801〜1850、18
51〜1900、1901〜1950、1951〜2000、または2001か
ら末端まで有するフラグメントを含む。この状況において、「約」は、いずれか
の末端もしくは両方の末端で、いくつか(5、4、3、2、もしくは1個)のヌ
クレオチドだけより大きいかまたはより小さい、具体的に示される範囲を含む。
好ましくは、これらのフラグメントは、生物学的活性を有するポリぺプチドをコ
ードする。より好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、本明細書において考
察されるようにプローブまたはプライマーとして使用され得る。
列番号Xまたは寄託されたクローンにおいて含まれるcDNAのヌクレオチド番
号の約1〜50、51〜100、101〜150、151〜200、201〜2
50、251〜300、301〜350、351〜400、401〜450、4
51〜500、501〜550、551〜600、651〜700、701〜7
50、751〜800、800〜850、851〜900、901〜950、9
51〜1000、1001〜1050、1051〜1100、1101〜115
0、1151〜1200、1201〜1250、1251〜1300、1301
〜1350、1351〜1400、1401〜1450、1451〜1500、
1501〜1550、1551〜1600、1601〜1650、1651〜1
700、1701〜1750、1751〜1800、1801〜1850、18
51〜1900、1901〜1950、1951〜2000、または2001か
ら末端まで有するフラグメントを含む。この状況において、「約」は、いずれか
の末端もしくは両方の末端で、いくつか(5、4、3、2、もしくは1個)のヌ
クレオチドだけより大きいかまたはより小さい、具体的に示される範囲を含む。
好ましくは、これらのフラグメントは、生物学的活性を有するポリぺプチドをコ
ードする。より好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、本明細書において考
察されるようにプローブまたはプライマーとして使用され得る。
【0082】 本発明において、「ポリぺプチドフラグメント」とは、配列番号Yにおいて含
まれ、または寄託されたクローンに含まれるcDNAによってコードされる、短
いアミノ酸配列をいう。タンパク質フラグメントは、「自立構造(free−s
tanding)」であり得るか、またはフラグメントが部分または領域を形成
するより大きなポリぺプチド内に、最も好ましくは単一の連続した領域として、
含まれ得る。本発明のポリぺプチドフラグメントの代表的な例は、例えばコード
領域のアミノ酸番号の約1〜20、21〜40、41〜60、61〜80、81
〜100、102〜120、121〜140、141〜160、または161か
ら末端までのフラグメントを含む。さらに、ポリぺプチドフラグメントは、約2
0、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、1
30、140、または150アミノ酸の長さであり得る。この状況において、「
約」は、いずれかの末端または両方の末端で、いくつかの(5、4、3、2、ま
たは1個)アミノ酸だけより大きいかまたはより小さい、具体的に示される範囲
を含む。
まれ、または寄託されたクローンに含まれるcDNAによってコードされる、短
いアミノ酸配列をいう。タンパク質フラグメントは、「自立構造(free−s
tanding)」であり得るか、またはフラグメントが部分または領域を形成
するより大きなポリぺプチド内に、最も好ましくは単一の連続した領域として、
含まれ得る。本発明のポリぺプチドフラグメントの代表的な例は、例えばコード
領域のアミノ酸番号の約1〜20、21〜40、41〜60、61〜80、81
〜100、102〜120、121〜140、141〜160、または161か
ら末端までのフラグメントを含む。さらに、ポリぺプチドフラグメントは、約2
0、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、1
30、140、または150アミノ酸の長さであり得る。この状況において、「
約」は、いずれかの末端または両方の末端で、いくつかの(5、4、3、2、ま
たは1個)アミノ酸だけより大きいかまたはより小さい、具体的に示される範囲
を含む。
【0083】 好ましいポリぺプチドフラグメントは、完全タンパク質および成熟形態を含む
。さらに好ましいポリぺプチドフラグメントは、アミノ末端もしくはカルボキシ
末端、またはその両方から、連続した一連の欠失された残基を有する、完全タン
パク質または成熟形態を含む。例えば、1〜60個の範囲の任意の数のアミノ酸
が、分泌ポリペプチドまたは成熟形態のいずれかのアミノ末端から欠失され得る
。同様に、1〜30個の範囲の任意数のアミノ酸が、タンパク質または成熟形態
のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、上述のアミノ末端およびカルボキ
シ末端の欠失の任意の組み合わせが好ましい。同様に、これらのポリぺプチドフ
ラグメントをコードするポリヌクレオチドフラグメントもまた、好ましい。
。さらに好ましいポリぺプチドフラグメントは、アミノ末端もしくはカルボキシ
末端、またはその両方から、連続した一連の欠失された残基を有する、完全タン
パク質または成熟形態を含む。例えば、1〜60個の範囲の任意の数のアミノ酸
が、分泌ポリペプチドまたは成熟形態のいずれかのアミノ末端から欠失され得る
。同様に、1〜30個の範囲の任意数のアミノ酸が、タンパク質または成熟形態
のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、上述のアミノ末端およびカルボキ
シ末端の欠失の任意の組み合わせが好ましい。同様に、これらのポリぺプチドフ
ラグメントをコードするポリヌクレオチドフラグメントもまた、好ましい。
【0084】 構造ドメインまたは機能ドメイン(例えば、αヘリックスおよびαヘリックス
形成領域、βシートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コ
イルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親
媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、基質結合領域、および抗原性指数の高い
領域を含むフラグメント)によって特徴付けられるポリぺプチドおよびポリヌク
レオチドのフラグメントもまた、好ましい。保存されるドメイン内にある配列番
号Yのポリぺプチドフラグメントは、本発明によって具体的に意図される。さら
に、これらのドメインをコードするポリヌクレオチドフラグメントもまた、意図
される。
形成領域、βシートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コ
イルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親
媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、基質結合領域、および抗原性指数の高い
領域を含むフラグメント)によって特徴付けられるポリぺプチドおよびポリヌク
レオチドのフラグメントもまた、好ましい。保存されるドメイン内にある配列番
号Yのポリぺプチドフラグメントは、本発明によって具体的に意図される。さら
に、これらのドメインをコードするポリヌクレオチドフラグメントもまた、意図
される。
【0085】 他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントである。生物学
的に活性なフラグメントは、本発明のポリぺプチドの活性に類似の活性を示すが
、必ずしも同一である必要はないフラグメントである。フラグメントの生物学活
性は、改善された所望の活性、または減少された所望されない活性を含み得る。
的に活性なフラグメントは、本発明のポリぺプチドの活性に類似の活性を示すが
、必ずしも同一である必要はないフラグメントである。フラグメントの生物学活
性は、改善された所望の活性、または減少された所望されない活性を含み得る。
【0086】 (エピトープおよび抗体) 本発明において、「エピトープ」とは、動物(特に、ヒト)において抗原性活
性または免疫原性活性を有するポリペプチドフラグメントをいう。本発明の好ま
しい実施態様は、エピトープを含むポリペプチドフラグメント、ならびにこのフ
ラグメントをコードするポリヌクレオチドに関する。抗体が結合し得るタンパク
質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。対照的に、「免疫原
性エピトープ」は、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される(例
えば、Geysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81
:3998〜4002(1983)を参照のこと)。
性または免疫原性活性を有するポリペプチドフラグメントをいう。本発明の好ま
しい実施態様は、エピトープを含むポリペプチドフラグメント、ならびにこのフ
ラグメントをコードするポリヌクレオチドに関する。抗体が結合し得るタンパク
質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。対照的に、「免疫原
性エピトープ」は、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される(例
えば、Geysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81
:3998〜4002(1983)を参照のこと)。
【0087】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の手段によって産生さ
れ得る(例えば、Houghten,R.A.、Proc.Natl.Acad
.Sci.USA 82:5131〜5135(1985)、米国特許第4,6
31,211号でさらに記載される、を参照のこと)。
れ得る(例えば、Houghten,R.A.、Proc.Natl.Acad
.Sci.USA 82:5131〜5135(1985)、米国特許第4,6
31,211号でさらに記載される、を参照のこと)。
【0088】 本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは少なくとも7つ、より好ま
しくは少なくとも9つ、そして最も好ましくは約15〜約30アミノ酸の間の配
列を含む。抗原性エピトープは、エピトープに特異的に結合する抗体(モノクロ
ーナル抗体を含む)を惹起するために有用である(例えば、Wilsonら、C
ell 37:767〜778(1984);Sutcliffe,J.G.ら
、Science 219:660〜666(1983)を参照のこと)。
しくは少なくとも9つ、そして最も好ましくは約15〜約30アミノ酸の間の配
列を含む。抗原性エピトープは、エピトープに特異的に結合する抗体(モノクロ
ーナル抗体を含む)を惹起するために有用である(例えば、Wilsonら、C
ell 37:767〜778(1984);Sutcliffe,J.G.ら
、Science 219:660〜666(1983)を参照のこと)。
【0089】 同様に、免疫原性エピトープは、当該分野で周知の方法に従って、抗体を誘導
するために使用され得る(例えば、Sutcliffeら、前出;Wilson
ら、前出;Chow,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
82:910〜914;およびBittle,F.J.ら、J.Gen.Vi
rol.66:2247〜2354(1985)を参照のこと)。好ましい免疫
原性エピトープは、完全タンパク質を含む。免疫原性エピトープは、動物系(例
えば、ウサギもしくはネズミ)に対してキャリアタンパク質(例えば、アルブミ
ン)とともに提示され得るか、または免疫原性エピトープが十分に長い場合(少
なくとも約25アミノ酸)は、キャリアなしで提示され得る。しかし、わずか8
〜10アミノ酸を含む免疫原性エピトープは、変性したポリペプチドにおいて少
なくとも線状エピトープに結合し得る抗体を惹起するために十分であることが示
された(例えば、ウエスタンブロッティングにおいて)。
するために使用され得る(例えば、Sutcliffeら、前出;Wilson
ら、前出;Chow,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
82:910〜914;およびBittle,F.J.ら、J.Gen.Vi
rol.66:2247〜2354(1985)を参照のこと)。好ましい免疫
原性エピトープは、完全タンパク質を含む。免疫原性エピトープは、動物系(例
えば、ウサギもしくはネズミ)に対してキャリアタンパク質(例えば、アルブミ
ン)とともに提示され得るか、または免疫原性エピトープが十分に長い場合(少
なくとも約25アミノ酸)は、キャリアなしで提示され得る。しかし、わずか8
〜10アミノ酸を含む免疫原性エピトープは、変性したポリペプチドにおいて少
なくとも線状エピトープに結合し得る抗体を惹起するために十分であることが示
された(例えば、ウエスタンブロッティングにおいて)。
【0090】 本明細書中で使用されるように、用語「抗体」(Ab)または「モノクローナ
ル抗体」(Mab)は、タンパク質に特異的に結合し得るインタクトな分子なら
びに抗体フラグメント(例えば、FabおよびF(ab’)2フラグメント)を
含むことを意味する。FabおよびF(ab’)2フラグメントは、インタクト
な抗体のFcフラグメントを欠損し、循環からより迅速に排除され、そしてイン
タクトな抗体よりも低い非特異的組織結合を有し得る(Wahlら、J.Nuc
l.Med.24:316〜325(1983))。従って、これらのフラグメ
ントは、FABまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物と同様に、好
ましい。さらに、本発明の抗体は、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体を
含む。
ル抗体」(Mab)は、タンパク質に特異的に結合し得るインタクトな分子なら
びに抗体フラグメント(例えば、FabおよびF(ab’)2フラグメント)を
含むことを意味する。FabおよびF(ab’)2フラグメントは、インタクト
な抗体のFcフラグメントを欠損し、循環からより迅速に排除され、そしてイン
タクトな抗体よりも低い非特異的組織結合を有し得る(Wahlら、J.Nuc
l.Med.24:316〜325(1983))。従って、これらのフラグメ
ントは、FABまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物と同様に、好
ましい。さらに、本発明の抗体は、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体を
含む。
【0091】 (融合タンパク質) 本発明の任意のポリペプチドは、融合タンパク質を産生するために使用され得
る。例えば、本発明のポリペプチドは、第2のタンパク質に融合される場合、抗
原性タグとして使用され得る。本発明のポリペプチドに対して惹起される抗体は
、ポリペプチドに結合することによって、この第2のタンパク質を間接的に検出
するために使用され得る。さらに、分泌タンパク質は、細胞位置をトラフィッキ
ングシグナルに基づいて標的化するので、本発明のポリペプチドは、他のタンパ
ク質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
る。例えば、本発明のポリペプチドは、第2のタンパク質に融合される場合、抗
原性タグとして使用され得る。本発明のポリペプチドに対して惹起される抗体は
、ポリペプチドに結合することによって、この第2のタンパク質を間接的に検出
するために使用され得る。さらに、分泌タンパク質は、細胞位置をトラフィッキ
ングシグナルに基づいて標的化するので、本発明のポリペプチドは、他のタンパ
ク質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
【0092】 本発明のポリペプチドと融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列のみ
ならず、また他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずしも直接的である必要
はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
ならず、また他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずしも直接的である必要
はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【0093】 さらに、融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチドの特徴を改良するため
に操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主
細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性ならびに持続性を改
良するためにポリペプチドのN末端に付加され得る。また、ペプチド部分は、精
製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペ
プチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを容易にするた
めのペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られ、そして慣用技術である。
に操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主
細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性ならびに持続性を改
良するためにポリペプチドのN末端に付加され得る。また、ペプチド部分は、精
製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペ
プチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを容易にするた
めのペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られ、そして慣用技術である。
【0094】 さらに、本発明のポリペプチド(フラグメント、そして特にエピトープを含む
)は、免疫グロブリン(IgG)の定常ドメインの一部と組み合わせられ得、キ
メラポリぺプチドを生じる。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そして
インビボにおいて増加した半減期を示す。1つの報告された例は、ヒトCD4ポ
リペプチドの最初の2つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖ま
たは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している
(EP A 394,827;Trauneckerら、Nature 331
: 84〜86(1988))。ジスルフィド連結二量体構造(IgGに起因す
る)を有する融合タンパク質はまた、単量体タンパク質またはタンパク質フラグ
メント単独よりも、他の分子を結合しそして中和するのに、より効率的であり得
る(Fountoulakisら、J.Biochem.270:3958〜3
964(1995))。
)は、免疫グロブリン(IgG)の定常ドメインの一部と組み合わせられ得、キ
メラポリぺプチドを生じる。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そして
インビボにおいて増加した半減期を示す。1つの報告された例は、ヒトCD4ポ
リペプチドの最初の2つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖ま
たは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している
(EP A 394,827;Trauneckerら、Nature 331
: 84〜86(1988))。ジスルフィド連結二量体構造(IgGに起因す
る)を有する融合タンパク質はまた、単量体タンパク質またはタンパク質フラグ
メント単独よりも、他の分子を結合しそして中和するのに、より効率的であり得
る(Fountoulakisら、J.Biochem.270:3958〜3
964(1995))。
【0095】 同様に、EP−A−O 464 533(カナダ国対応特許第2045869
号)は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質のFc部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る(EP−A 0232 262)。あるいは
、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Fc部分を欠
失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使
用される場合、Fc部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見
において、hIL−5のようなヒトタンパク質は、hIL−5のアンタゴニスト
を同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにFc部分と
融合された(D.Bennettら、J.Molecular Recogni
tion 8:52〜58(1995);K.Johansonら、J.Bio
l.Chem.270:9459〜9471(1995)を参照のこと)。
号)は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質のFc部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る(EP−A 0232 262)。あるいは
、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Fc部分を欠
失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使
用される場合、Fc部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見
において、hIL−5のようなヒトタンパク質は、hIL−5のアンタゴニスト
を同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにFc部分と
融合された(D.Bennettら、J.Molecular Recogni
tion 8:52〜58(1995);K.Johansonら、J.Bio
l.Chem.270:9459〜9471(1995)を参照のこと)。
【0096】 さらに、本発明のポリペプチドは、マーカー配列(例えば、融合されたポリペ
プチドの精製を容易にするペプチド)に融合され得る。好ましい実施態様におい
て、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサヒスチジンペプチド(例えば、p
QEベクター(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,
Chatsworth,CA,91311)において提供されるタグ)であり、
これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Gentzら
、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821〜824(1
989)に記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良
い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグである「HA」タグは
、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する(Wil
sonら、Cell 37:767(1984))。
プチドの精製を容易にするペプチド)に融合され得る。好ましい実施態様におい
て、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサヒスチジンペプチド(例えば、p
QEベクター(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,
Chatsworth,CA,91311)において提供されるタグ)であり、
これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Gentzら
、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821〜824(1
989)に記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良
い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグである「HA」タグは
、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する(Wil
sonら、Cell 37:767(1984))。
【0097】 従って、任意のこれら上記の融合物は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドを使用して操作され得る。
ペプチドを使用して操作され得る。
【0098】 (ベクター、宿主細胞、およびタンパク質産生) 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および
組換え技術によるポリペプチドの産生に関する。例えば、ベクターは、ファージ
ベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベク
ターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント、または複製欠
損であり得る。後者の場合、一般にウイルス増殖は、宿主細胞を補完する(co
mplementing)際にのみ生じる。
組換え技術によるポリペプチドの産生に関する。例えば、ベクターは、ファージ
ベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベク
ターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント、または複製欠
損であり得る。後者の場合、一般にウイルス増殖は、宿主細胞を補完する(co
mplementing)際にのみ生じる。
【0099】 ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを含むベクター
に連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のよ
うな沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイル
スである場合、ウイルスベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用してイ
ンビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
に連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のよ
うな沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイル
スである場合、ウイルスベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用してイ
ンビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【0100】 ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター(いくつか挙げれば、例えば
、ファージλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプ
ロモーター、phoAプロモーターおよびtacプロモーター、SV40初期プ
ロモーターおよびSV40後期プロモーター、ならびにレトロウイルスLTRの
プロモーター)に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは
当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結のための部位、
および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によ
って発現される転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドン、お
よび翻訳されるためのポリペプチドの末端に適切に位置される終結コドン(UA
A、UGAまたはUAG)を含む。
、ファージλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプ
ロモーター、phoAプロモーターおよびtacプロモーター、SV40初期プ
ロモーターおよびSV40後期プロモーター、ならびにレトロウイルスLTRの
プロモーター)に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは
当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結のための部位、
および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によ
って発現される転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドン、お
よび翻訳されるためのポリペプチドの末端に適切に位置される終結コドン(UA
A、UGAまたはUAG)を含む。
【0101】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも1つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、G418、またはネオマイシン耐性、ならびにE.coliおよび他の細菌
において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐
性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞(例えば、E.coli
、StreptomycesおよびSalmonella typhimuri
um細胞);酵母細胞のような真菌細胞;Drosophila S2およびS
podoptera Sf9細胞のような昆虫細胞;CHO細胞、COS細胞、
293細胞、およびBowesメラノーマ細胞のような動物細胞;ならびに植物
細胞を含むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地
および条件は、当該分野で公知である。
を含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、G418、またはネオマイシン耐性、ならびにE.coliおよび他の細菌
において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐
性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞(例えば、E.coli
、StreptomycesおよびSalmonella typhimuri
um細胞);酵母細胞のような真菌細胞;Drosophila S2およびS
podoptera Sf9細胞のような昆虫細胞;CHO細胞、COS細胞、
293細胞、およびBowesメラノーマ細胞のような動物細胞;ならびに植物
細胞を含むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地
および条件は、当該分野で公知である。
【0102】 細菌における使用のために好ましいベクターの中には、pQE70、pQE6
0およびpQE−9(QIAGEN,Inc.から入手可能);pBluesc
riptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16
a、pNH18A、pNH46A(Stratagene Cloning S
ystems,Inc.から入手可能);ならびにptrc99a、pKK22
3−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5(Pharmacia
Biotech,Inc.から入手可能)を含む。好ましい真核生物ベクターの
中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG(
Stratageneから入手可能);ならびにpSVK3、pBPV、pMS
GおよびpSVL(Pharmaciaから入手可能)がある。他の適切なベク
ターは当業者に容易に明らかである。
0およびpQE−9(QIAGEN,Inc.から入手可能);pBluesc
riptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16
a、pNH18A、pNH46A(Stratagene Cloning S
ystems,Inc.から入手可能);ならびにptrc99a、pKK22
3−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5(Pharmacia
Biotech,Inc.から入手可能)を含む。好ましい真核生物ベクターの
中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG(
Stratageneから入手可能);ならびにpSVK3、pBPV、pMS
GおよびpSVL(Pharmaciaから入手可能)がある。他の適切なベク
ターは当業者に容易に明らかである。
【0103】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DE
AE−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Davisら、Basic Metho
ds In Molecular Biology (1986)のような多く
の標準的な研究室マニュアルに記載される。本発明のポリペプチドは、実際、組
換えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ることが特に意図される。
AE−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Davisら、Basic Metho
ds In Molecular Biology (1986)のような多く
の標準的な研究室マニュアルに記載される。本発明のポリペプチドは、実際、組
換えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ることが特に意図される。
【0104】 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そして
精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)
が精製のために使用される。
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そして
精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)
が精製のために使用される。
【0105】 本発明のポリペプチド、および好ましくは分泌形態はまた、以下から回収され
得る:直接単離されるかまたは培養されるかにかかわらず、体液、組織および細
胞を含むネイティブの供給源から精製される産物;化学的合成手順の産物;なら
びに、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物
細胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって産生され
た産物。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプ
チドは、グリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい
。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として、いく
つかの場合において、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。従って、一
般に、翻訳開始コドンによってコードされるN末端メチオニンが、すべての真核
生物細胞における翻訳後の任意のタンパク質から高い効率で除去されることが、
当該分野において周知である。ほとんどのタンパク質においてN末端メチオニン
はまた、ほとんどの原核生物において効率的に除去されるが、いくつかのタンパ
ク質について、この原核生物除去プロセスは、N末端メチオニンが共有結合する
アミノ酸の性質に依存して、非効率的である。
得る:直接単離されるかまたは培養されるかにかかわらず、体液、組織および細
胞を含むネイティブの供給源から精製される産物;化学的合成手順の産物;なら
びに、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物
細胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって産生され
た産物。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプ
チドは、グリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい
。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として、いく
つかの場合において、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。従って、一
般に、翻訳開始コドンによってコードされるN末端メチオニンが、すべての真核
生物細胞における翻訳後の任意のタンパク質から高い効率で除去されることが、
当該分野において周知である。ほとんどのタンパク質においてN末端メチオニン
はまた、ほとんどの原核生物において効率的に除去されるが、いくつかのタンパ
ク質について、この原核生物除去プロセスは、N末端メチオニンが共有結合する
アミノ酸の性質に依存して、非効率的である。
【0106】 (ポリヌクレオチドの使用) 本明細書中で同定される各々のポリヌクレオチドは、多数の方法において試薬
として使用され得る。以下の説明は例示的であるとみなされるべきであり、そし
て公知の技術を利用する。
として使用され得る。以下の説明は例示的であるとみなされるべきであり、そし
て公知の技術を利用する。
【0107】 本発明のポリヌクレオチドは、染色体同定のために有用である。実際の配列デ
ータ(反復多型性)に基づく染色体マーキング試薬が現在ほとんど利用可能では
ないため、新しい染色体マーカーを同定する必要性が存在するままである。本発
明の各々のポリヌクレオチドは、染色体マーカーとして使用され得る。
ータ(反復多型性)に基づく染色体マーキング試薬が現在ほとんど利用可能では
ないため、新しい染色体マーカーを同定する必要性が存在するままである。本発
明の各々のポリヌクレオチドは、染色体マーカーとして使用され得る。
【0108】 簡単に言うと、配列は、配列番号Xにおいて示される配列からPCRプライマ
ー(好ましくは15〜25bp)を調製することによって染色体にマッピングさ
れ得る。プライマーが、ゲノムDNA中の1つより多くの予測されたエキソンに
またがらないように、プライマーは、コンピューター分析を使用して選択され得
る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッ
ドのPCRスクリーニングのために使用される。配列番号Xに対応するヒト遺伝
子を含むそれらのハイブリッドのみが、増幅したフラグメントを産生する。
ー(好ましくは15〜25bp)を調製することによって染色体にマッピングさ
れ得る。プライマーが、ゲノムDNA中の1つより多くの予測されたエキソンに
またがらないように、プライマーは、コンピューター分析を使用して選択され得
る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッ
ドのPCRスクリーニングのために使用される。配列番号Xに対応するヒト遺伝
子を含むそれらのハイブリッドのみが、増幅したフラグメントを産生する。
【0109】 同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをP
CRマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て、1日あたり3つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ポリヌクレオ
チドの準局在化(sublocalization)は、特定の染色体フラグメ
ントのパネルで達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピングストラテジー
は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート(labeled
flow sorted)染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異
的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択
を含む。
CRマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て、1日あたり3つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ポリヌクレオ
チドの準局在化(sublocalization)は、特定の染色体フラグメ
ントのパネルで達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピングストラテジー
は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート(labeled
flow sorted)染色体でのプレスクリーニング、および染色体特異
的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択
を含む。
【0110】 ポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレッドの蛍光イ
ンサイチュハイブリダイゼーション(FISH)を使用して達成され得る。この
技術は、500または600塩基ほどの短さのポリヌクレオチドを使用する;し
かし2,000〜4,000bpのポリヌクレオチドが好ましい。この技術の総
説に関しては、Vermaら、「Human Chromosomes:a M
anual of Basic Techniques」,Pergamon
Press,New York(1988)を参照のこと。
ンサイチュハイブリダイゼーション(FISH)を使用して達成され得る。この
技術は、500または600塩基ほどの短さのポリヌクレオチドを使用する;し
かし2,000〜4,000bpのポリヌクレオチドが好ましい。この技術の総
説に関しては、Vermaら、「Human Chromosomes:a M
anual of Basic Techniques」,Pergamon
Press,New York(1988)を参照のこと。
【0111】 染色体マッピングについては、ポリヌクレオチドは、個々に(単一染色体また
はその染色体上の単一部位をマークするために)またはパネルで(複数部位およ
び/または複数染色体をマークするために)使用され得る。好ましいポリヌクレ
オチドは、cDNAの非コード領域に対応する。なぜなら、コード配列は、遺伝
子ファミリー内に、より保存される傾向があり、従って、染色体マッピングの間
の交差ハイブリダイゼーションの機会が増加するからである。
はその染色体上の単一部位をマークするために)またはパネルで(複数部位およ
び/または複数染色体をマークするために)使用され得る。好ましいポリヌクレ
オチドは、cDNAの非コード領域に対応する。なぜなら、コード配列は、遺伝
子ファミリー内に、より保存される傾向があり、従って、染色体マッピングの間
の交差ハイブリダイゼーションの機会が増加するからである。
【0112】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされると、ポリヌクレオ
チドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体位置
と特定の疾患の提示との間の同時遺伝(coinheritance)を確立す
る(疾患マッピングデータは、例えば、V.McKusick,Mendeli
an Inheritance in Man(Johns Hopkins
University Welch Medical Libraryを通して
オンラインで利用可能である)において見出される)。1メガベースマッピング
解像度および20kbあたり1遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染色体領域
に正確に位置決めされるcDNAは、50〜500の潜在的な原因遺伝子の1つ
であり得る。
チドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体位置
と特定の疾患の提示との間の同時遺伝(coinheritance)を確立す
る(疾患マッピングデータは、例えば、V.McKusick,Mendeli
an Inheritance in Man(Johns Hopkins
University Welch Medical Libraryを通して
オンラインで利用可能である)において見出される)。1メガベースマッピング
解像度および20kbあたり1遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染色体領域
に正確に位置決めされるcDNAは、50〜500の潜在的な原因遺伝子の1つ
であり得る。
【0113】 従って、一旦、同時遺伝が確立されると、罹患個体と非罹患個体との間でのポ
リヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異が試験され得る。まず、染色
体中の可視的構造変化(例えば、欠失または転座)は染色体スプレッドにおいて
、またはPCRによって試験される。構造的変化が存在しない場合、点変異の存
在が確認される。何人かのまたは全ての罹患された個体で観察されたが、正常な
個体では観察されなかった変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得ることを
示す。しかし、いくつかの正常な個体由来のポリペプチドおよび対応する遺伝子
の完全な配列決定は、変異を多型性と区別するために要求される。新しい多型性
が同定される場合、この多型ポリペプチドはさらなる連鎖分析のために使用され
得る。
リヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異が試験され得る。まず、染色
体中の可視的構造変化(例えば、欠失または転座)は染色体スプレッドにおいて
、またはPCRによって試験される。構造的変化が存在しない場合、点変異の存
在が確認される。何人かのまたは全ての罹患された個体で観察されたが、正常な
個体では観察されなかった変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得ることを
示す。しかし、いくつかの正常な個体由来のポリペプチドおよび対応する遺伝子
の完全な配列決定は、変異を多型性と区別するために要求される。新しい多型性
が同定される場合、この多型ポリペプチドはさらなる連鎖分析のために使用され
得る。
【0114】 さらに、非罹患個体と比較した罹患個体の遺伝子の増加または減少した発現が
、本発明のポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変化(変
化した発現、染色体再配置、または変異)は、診断マーカーまたは予後マーカー
として使用され得る。
、本発明のポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変化(変
化した発現、染色体再配置、または変異)は、診断マーカーまたは予後マーカー
として使用され得る。
【0115】 前述に加えて、ポリヌクレオチドは、三重らせん形成またはアンチセンスDN
AもしくはRNAによって遺伝子発現を制御するために使用され得る。両方の方
法は、DNAまたはRNAへのポリヌクレオチドの結合に依存する。これらの技
術に関して、好ましいポリヌクレオチドは通常、20〜40塩基長であり、そし
て転写に関与する遺伝子領域(三重らせん−Leeら、Nucl.Acids
Res.6:3073(1979);Cooneyら、Science 241
:456(1988);およびDervanら、Science 251:13
60(1991)を参照のこと)またはmRNA自体(アンチセンス−Okan
o,J.Neurochem.56:560(1991);Oligodeox
y−nucleotides as Antisense Inhibitor
s of Gene Expression,CRC Press,Boca
Raton,FL(1988))のいずれかに相補的である。三重らせん形成は
、最適にはDNAからのRNA転写を遮断するが、アンチセンスRNAハイブリ
ダイゼーションは、ポリペプチドへのmRNA分子の翻訳を阻止する。両方の技
術は、モデル系において効果的であり、そして本明細書に開示される情報は、疾
患を処置するための試みにおいて、アンチセンスまたは三重らせんポリヌクレオ
チドを設計するために使用され得る。
AもしくはRNAによって遺伝子発現を制御するために使用され得る。両方の方
法は、DNAまたはRNAへのポリヌクレオチドの結合に依存する。これらの技
術に関して、好ましいポリヌクレオチドは通常、20〜40塩基長であり、そし
て転写に関与する遺伝子領域(三重らせん−Leeら、Nucl.Acids
Res.6:3073(1979);Cooneyら、Science 241
:456(1988);およびDervanら、Science 251:13
60(1991)を参照のこと)またはmRNA自体(アンチセンス−Okan
o,J.Neurochem.56:560(1991);Oligodeox
y−nucleotides as Antisense Inhibitor
s of Gene Expression,CRC Press,Boca
Raton,FL(1988))のいずれかに相補的である。三重らせん形成は
、最適にはDNAからのRNA転写を遮断するが、アンチセンスRNAハイブリ
ダイゼーションは、ポリペプチドへのmRNA分子の翻訳を阻止する。両方の技
術は、モデル系において効果的であり、そして本明細書に開示される情報は、疾
患を処置するための試みにおいて、アンチセンスまたは三重らせんポリヌクレオ
チドを設計するために使用され得る。
【0116】 本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治
療の1つの目標は、遺伝子欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生
物へ正常遺伝子を挿入することである。本発明に開示されるポリヌクレオチドは
、高度に正確な様式でこのような遺伝子欠損を標的とする手段を提供する。別の
目標は、宿主ゲノム中には存在しなかった新しい遺伝子を挿入することであり、
それによって宿主細胞中に新しい形質を生成する。
療の1つの目標は、遺伝子欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生
物へ正常遺伝子を挿入することである。本発明に開示されるポリヌクレオチドは
、高度に正確な様式でこのような遺伝子欠損を標的とする手段を提供する。別の
目標は、宿主ゲノム中には存在しなかった新しい遺伝子を挿入することであり、
それによって宿主細胞中に新しい形質を生成する。
【0117】 ポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同定するために
有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フラグメント長
の多型性(RFLP)の使用を考慮している。この技術において、個体のゲノム
DNAは1つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するための固有なバ
ンドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この方法は、「認
識票(Dog tag)」(これは、失われたり、交換されたり、または盗まれ
たりすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る)の現在の限界を受けな
い。本発明のポリヌクレオチドは、RFLPのためのさらなるDNAマーカーと
して使用され得る。
有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フラグメント長
の多型性(RFLP)の使用を考慮している。この技術において、個体のゲノム
DNAは1つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するための固有なバ
ンドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この方法は、「認
識票(Dog tag)」(これは、失われたり、交換されたり、または盗まれ
たりすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る)の現在の限界を受けな
い。本発明のポリヌクレオチドは、RFLPのためのさらなるDNAマーカーと
して使用され得る。
【0118】 本発明のポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩
基ごとのDNA配列を決定することによって、RFLPのための代替として使用
され得る。これらの配列は、このような選択されたDNA(これは、次いで配列
決定され得る)を増幅しそして単離するためのPCRプライマーを調製するため
に使用され得る。各々の個体が独特のセットのDNA配列を有するので、この技
術を使用して、個体が同定され得る。一旦、独特のIDデータベースが個体につ
いて確立されると、個体が生存していようとまたは死亡していようと、その個体
のポジティブ同定が、極めて小さな組織サンプルから行われ得る。
基ごとのDNA配列を決定することによって、RFLPのための代替として使用
され得る。これらの配列は、このような選択されたDNA(これは、次いで配列
決定され得る)を増幅しそして単離するためのPCRプライマーを調製するため
に使用され得る。各々の個体が独特のセットのDNA配列を有するので、この技
術を使用して、個体が同定され得る。一旦、独特のIDデータベースが個体につ
いて確立されると、個体が生存していようとまたは死亡していようと、その個体
のポジティブ同定が、極めて小さな組織サンプルから行われ得る。
【0119】 法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなDNAに基づく同定技術を
使用して利益を得る。組織(例えば、髪または皮膚)、または体液(例えば、血
液、唾液、精液など)のような非常にわずかな生物学的サンプルから得られたD
NA配列は、PCRを使用して増幅され得る。ある先行技術において、DQaク
ラスII HLA遺伝子のような多型性遺伝子座から増幅された遺伝子配列は、
個体を同定するための法医学生物学において使用される。(Erlich, H
., PCR Technology, Freeman and Co. (
1992))。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が増幅されると、これらは
1つ以上の制限酵素で消化される。これは、DQaクラスII HLA遺伝子に
対応するDNAでプローブされたサザンブロットについてのバンドのセットの同
定を生じる。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、法医学的目的のための多型
性マーカーとして使用され得る。
使用して利益を得る。組織(例えば、髪または皮膚)、または体液(例えば、血
液、唾液、精液など)のような非常にわずかな生物学的サンプルから得られたD
NA配列は、PCRを使用して増幅され得る。ある先行技術において、DQaク
ラスII HLA遺伝子のような多型性遺伝子座から増幅された遺伝子配列は、
個体を同定するための法医学生物学において使用される。(Erlich, H
., PCR Technology, Freeman and Co. (
1992))。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が増幅されると、これらは
1つ以上の制限酵素で消化される。これは、DQaクラスII HLA遺伝子に
対応するDNAでプローブされたサザンブロットについてのバンドのセットの同
定を生じる。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、法医学的目的のための多型
性マーカーとして使用され得る。
【0120】 また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例
えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、本発明の配列から調製される特定の組織に特異
的なDNAプローブまたはプライマーを含み得る。このような試薬のパネルは、
種および/または器官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これらの試
薬は、夾雑物について組織培養物をスクリーニングするために使用され得る。
えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、本発明の配列から調製される特定の組織に特異
的なDNAプローブまたはプライマーを含み得る。このような試薬のパネルは、
種および/または器官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これらの試
薬は、夾雑物について組織培養物をスクリーニングするために使用され得る。
【0121】 少なくとも、本発明のポリヌクレオチドは、サザンゲルでの分子量マーカーと
して、特定の細胞型における特定のmRNAの存在に関する診断用プローブとし
て、新規なポリヌクレオチドを発見するプロセスでの公知の配列を「差し引き」
するためのプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着させるた
めのオリゴマーを選択および作製するため、DNA免疫技術を用いて抗DNA抗
体を惹起させるため、および免疫応答を誘発する抗原として、使用され得る。
して、特定の細胞型における特定のmRNAの存在に関する診断用プローブとし
て、新規なポリヌクレオチドを発見するプロセスでの公知の配列を「差し引き」
するためのプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着させるた
めのオリゴマーを選択および作製するため、DNA免疫技術を用いて抗DNA抗
体を惹起させるため、および免疫応答を誘発する抗原として、使用され得る。
【0122】 (ポリペプチドの使用) 本明細書中に同定される各ポリペプチドは、多くの方法に使用され得る。以下
の説明は、例示としてみなされるべきであり、そして公知の技術を使用する。
の説明は、例示としてみなされるべきであり、そして公知の技術を使用する。
【0123】 本発明のポリペプチドは、抗体に基づいた技術を使用して生物学的サンプル中
のタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る。例えば、組織における
タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る(Jalk
anen,M.ら、J.Cell.Biol.101:976−985(198
5);Jalkanen,M.ら、J.Cell.Biol.105:3087
−3096(1987))。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用である、
抗体に基づいた他の方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および
ラジオイムノアッセイ(RIA)のような免疫アッセイが含まれる。適切な抗体
アッセイの標識は、当該分野で公知であり、そして例えば、グルコースオキシダ
ーゼのような酵素標識、ならびにヨウ素(125I、121I)、炭素(14C
)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(112In)、および
テクネチウム(99mTc)のような放射性同位体、ならびにフルオレセインお
よびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。
のタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る。例えば、組織における
タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る(Jalk
anen,M.ら、J.Cell.Biol.101:976−985(198
5);Jalkanen,M.ら、J.Cell.Biol.105:3087
−3096(1987))。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用である、
抗体に基づいた他の方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および
ラジオイムノアッセイ(RIA)のような免疫アッセイが含まれる。適切な抗体
アッセイの標識は、当該分野で公知であり、そして例えば、グルコースオキシダ
ーゼのような酵素標識、ならびにヨウ素(125I、121I)、炭素(14C
)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(112In)、および
テクネチウム(99mTc)のような放射性同位体、ならびにフルオレセインお
よびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。
【0124】 生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイすることに加えて、タンパ
ク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質をインビボで画
像化するための抗体の標識またはマーカーとしては、X線ラジオグラフィー、N
MRまたはESRにより検出可能なものが挙げられる。X線ラジオグラフィーに
ついては、適切な標識は、検出可能な放射線を発するが、被験体に対して明白に
有害ではないバリウムまたはセシウムのような放射性同位体を含む。NMRおよ
びESRに適切なマーカーには、例えば重水素のような検出可能な特徴的なスピ
ンを有するものが含まれ、これは、関連したハイブリドーマのための栄養素を標
識することにより抗体に取り込まれ得る。
ク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質をインビボで画
像化するための抗体の標識またはマーカーとしては、X線ラジオグラフィー、N
MRまたはESRにより検出可能なものが挙げられる。X線ラジオグラフィーに
ついては、適切な標識は、検出可能な放射線を発するが、被験体に対して明白に
有害ではないバリウムまたはセシウムのような放射性同位体を含む。NMRおよ
びESRに適切なマーカーには、例えば重水素のような検出可能な特徴的なスピ
ンを有するものが含まれ、これは、関連したハイブリドーマのための栄養素を標
識することにより抗体に取り込まれ得る。
【0125】 放射性同位体(例えば、131I、112In、99mTc)、放射線不透過
性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像
化部分で標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動
物に(例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に)導入される。被験体のサイズ
および用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部
分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、
ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、99mTcの約5〜20
ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは
、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像
化は、S.W.Burchielら、「Immunopharmacokine
tics of Radiolabeled Antibodies and
Their Fragments」(Tumor Imaging:The R
adiochemical Detection of Cancerの第13
章、S.W.BurchielおよびB.A.Rhodes編、Masson
Publishing Inc.(1982)に記載される。
性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像
化部分で標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動
物に(例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に)導入される。被験体のサイズ
および用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部
分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、
ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、99mTcの約5〜20
ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは
、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像
化は、S.W.Burchielら、「Immunopharmacokine
tics of Radiolabeled Antibodies and
Their Fragments」(Tumor Imaging:The R
adiochemical Detection of Cancerの第13
章、S.W.BurchielおよびB.A.Rhodes編、Masson
Publishing Inc.(1982)に記載される。
【0126】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、この方法は、(a)個体の細胞
または体液中の本発明のポリペプチドの発現をアッセイする工程;(b)この遺
伝子発現レベルを標準の遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、これによっ
て、標準的な発現レベルと比較して、アッセイされたポリペプチドの遺伝子発現
レベルの増加または減少が、障害の指標になる。
または体液中の本発明のポリペプチドの発現をアッセイする工程;(b)この遺
伝子発現レベルを標準の遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、これによっ
て、標準的な発現レベルと比較して、アッセイされたポリペプチドの遺伝子発現
レベルの増加または減少が、障害の指標になる。
【0127】 さらに、本発明のポリペプチドを用いて疾患を処置し得る。例えば、患者は、
ポリペプチド(例えば、インスリン)の非存在またはレベルの減少を元に戻すこ
と、異なるポリペプチド(例えば、ヘモグロビンBに対するヘモグロビンS)の
非存在またはレベルの減少を補充すること、ポリペプチド(例えば、癌遺伝子)
の活性を阻害すること、ポリペプチドの活性を(例えば、レセプターに結合する
ことによって)活性化すること、遊離リガンド(例えば、炎症を低減させる際に
用いられる可溶性TNFレセプター)と膜結合レセプターと競合させることによ
って膜結合レセプターの活性を減少させること、または所望の応答(例えば、血
管の増殖)をもたらすことに取り組む際に、本発明のポリペプチドが投与され得
る。
ポリペプチド(例えば、インスリン)の非存在またはレベルの減少を元に戻すこ
と、異なるポリペプチド(例えば、ヘモグロビンBに対するヘモグロビンS)の
非存在またはレベルの減少を補充すること、ポリペプチド(例えば、癌遺伝子)
の活性を阻害すること、ポリペプチドの活性を(例えば、レセプターに結合する
ことによって)活性化すること、遊離リガンド(例えば、炎症を低減させる際に
用いられる可溶性TNFレセプター)と膜結合レセプターと競合させることによ
って膜結合レセプターの活性を減少させること、または所望の応答(例えば、血
管の増殖)をもたらすことに取り組む際に、本発明のポリペプチドが投与され得
る。
【0128】 同様に、本発明のポリペプチドに指向される抗体もまた使用されて疾患を処置
し得る。例えば、本発明のポリペプチドに指向される抗体の投与によって、ポリ
ペプチドに結合して、そしてポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗
体の投与によって、例えば、膜に結合したポリペプチド(レセプター)へ結合す
ることにより、ポリペプチドを活性化し得る。
し得る。例えば、本発明のポリペプチドに指向される抗体の投与によって、ポリ
ペプチドに結合して、そしてポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗
体の投与によって、例えば、膜に結合したポリペプチド(レセプター)へ結合す
ることにより、ポリペプチドを活性化し得る。
【0129】 少なくとも本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるSDS−P
AGEゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され得
る。ポリペプチドを用いてもまた、抗体を惹起し得、次いで、この抗体を使用し
て、宿主細胞の形質転換を評価する方法として、組換え細胞からのタンパク質発
現を測定する。さらに、本発明のポリペプチドを使用して、以下の生物学的活性
を試験し得る。
AGEゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され得
る。ポリペプチドを用いてもまた、抗体を惹起し得、次いで、この抗体を使用し
て、宿主細胞の形質転換を評価する方法として、組換え細胞からのタンパク質発
現を測定する。さらに、本発明のポリペプチドを使用して、以下の生物学的活性
を試験し得る。
【0130】 (生物学的活性) 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドをアッセイに用いて、1つ以上
の生物学的活性について試験し得る。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドが、特定のアッセイにおいて活性を示す場合、これらの分子は、生物学的活
性に関連した疾患に関与し得る可能性が高い。従って、このポリヌクレオチドお
よびポリペプチドを用いて、関連する疾患を処置し得る。
の生物学的活性について試験し得る。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドが、特定のアッセイにおいて活性を示す場合、これらの分子は、生物学的活
性に関連した疾患に関与し得る可能性が高い。従って、このポリヌクレオチドお
よびポリペプチドを用いて、関連する疾患を処置し得る。
【0131】 (免疫活性) 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、免疫細胞の増殖、分化、ま
たは移動(走化性)の活性化もしくは阻害によって、免疫系の不全または障害を
処置するのに有用であり得る。免疫細胞は、造血と称されるプロセス、すなわち
、多能性幹細胞から骨髄性細胞(血小板、赤血球、好中球、およびマクロファー
ジ)およびリンパ系(BおよびTリンパ球)細胞を産生するプロセスを介して発
生する。これらの免疫不全または障害の病因は、遺伝性、体細胞性(例えば、癌
またはいくつかの自己免疫障害)、後天性(例えば、化学治療または毒素による
)、あるいは感染性であり得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーまたは検出因子として使用
され得る。
たは移動(走化性)の活性化もしくは阻害によって、免疫系の不全または障害を
処置するのに有用であり得る。免疫細胞は、造血と称されるプロセス、すなわち
、多能性幹細胞から骨髄性細胞(血小板、赤血球、好中球、およびマクロファー
ジ)およびリンパ系(BおよびTリンパ球)細胞を産生するプロセスを介して発
生する。これらの免疫不全または障害の病因は、遺伝性、体細胞性(例えば、癌
またはいくつかの自己免疫障害)、後天性(例えば、化学治療または毒素による
)、あるいは感染性であり得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーまたは検出因子として使用
され得る。
【0132】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、造血細胞の不全または障害
を処置または検出する際に有用であり得る。本発明のポリペプチドまたはポリヌ
クレオチドを使用して、特定の(または多くの)型の造血細胞の減少に関連する
これらの障害を処置するための取り組みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞
の分化および増殖を増加させ得る。免疫学的な不全症候群の例には、以下が挙げ
られるがそれらに限定されない:血液タンパク質障害(例えば、無ガンマグロブ
リン血症、低ガンマグロブリン血症(dysgammaglobulinemi
a))、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・ジョージ(Di
george)症候群、HIV感染、HTLV−BLV感染、白血球接着不全症
候群、リンパ球減少、食細胞殺菌機能不全、重症複合型免疫不全(SCID)、
ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少症、または血色素尿。
を処置または検出する際に有用であり得る。本発明のポリペプチドまたはポリヌ
クレオチドを使用して、特定の(または多くの)型の造血細胞の減少に関連する
これらの障害を処置するための取り組みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞
の分化および増殖を増加させ得る。免疫学的な不全症候群の例には、以下が挙げ
られるがそれらに限定されない:血液タンパク質障害(例えば、無ガンマグロブ
リン血症、低ガンマグロブリン血症(dysgammaglobulinemi
a))、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・ジョージ(Di
george)症候群、HIV感染、HTLV−BLV感染、白血球接着不全症
候群、リンパ球減少、食細胞殺菌機能不全、重症複合型免疫不全(SCID)、
ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少症、または血色素尿。
【0133】 さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、止血活性(出
血を停止する)または血栓崩壊活性(血餅の形成)を調節するために使用され得
る。例えば、止血または血栓崩壊活性を増加させることによって、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドは、血液凝固障害(例えば、無フィブリノーゲ
ン血症、因子欠乏)、血液血小板障害(例えば、血小板減少症)、または外傷、
手術もしくは他の原因から生じる創傷を処置するために使用され得る。あるいは
、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る、本発明のポリヌクレオチドまた
はポリペプチドを用いて、凝固を阻害または溶解し得る。これらの分子は、心臓
発作(梗塞)、発作、または瘢痕の処置に重要であり得る。
血を停止する)または血栓崩壊活性(血餅の形成)を調節するために使用され得
る。例えば、止血または血栓崩壊活性を増加させることによって、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドは、血液凝固障害(例えば、無フィブリノーゲ
ン血症、因子欠乏)、血液血小板障害(例えば、血小板減少症)、または外傷、
手術もしくは他の原因から生じる創傷を処置するために使用され得る。あるいは
、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る、本発明のポリヌクレオチドまた
はポリペプチドを用いて、凝固を阻害または溶解し得る。これらの分子は、心臓
発作(梗塞)、発作、または瘢痕の処置に重要であり得る。
【0134】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、自己免疫障害を処置ま
たは検出する際に有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって、
自己を外来物質として不適切に認識することからもたらされる。この不適切な認
識は、宿主組織の破壊を導く免疫応答を生じる。それゆえ、免疫応答、特にT細
胞の増殖、分化、または走化性を阻害する本発明のポリペプチドまたはポリヌク
レオチドの投与は、自己免疫障害を予防するのに有効な治療であり得る。
たは検出する際に有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって、
自己を外来物質として不適切に認識することからもたらされる。この不適切な認
識は、宿主組織の破壊を導く免疫応答を生じる。それゆえ、免疫応答、特にT細
胞の増殖、分化、または走化性を阻害する本発明のポリペプチドまたはポリヌク
レオチドの投与は、自己免疫障害を予防するのに有効な治療であり得る。
【0135】 本発明によって処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、以下が挙
げられるが、それらに限定されない:アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症
候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッド
パスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、結膜
炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、スティッ
フマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎
症、ギヤンバレー症候群、インスリン依存性真性糖尿病、および自己免疫炎症性
眼病。
げられるが、それらに限定されない:アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症
候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッド
パスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、結膜
炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、スティッ
フマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎
症、ギヤンバレー症候群、インスリン依存性真性糖尿病、および自己免疫炎症性
眼病。
【0136】 同様に、例えば、喘息(特にアレルギー性喘息)または他の呼吸問題のような
アレルギー性反応および状態はまた、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドにより処置され得る。さらに、これらの分子を用いてアナフィラキシー、抗
原性分子に対する過敏症、または血液型不適合性を処置し得る。
アレルギー性反応および状態はまた、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドにより処置され得る。さらに、これらの分子を用いてアナフィラキシー、抗
原性分子に対する過敏症、または血液型不適合性を処置し得る。
【0137】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、器官拒絶または対宿主
性移植片病(GVHD)を処置および/または予防するために用いられ得る。器
官拒絶は、宿主免疫細胞が免疫応答を介して移植された組織を破壊することによ
り生じる。同様に、免疫応答はまた、GVHDに関与するが、この場合、外来の
移植された免疫細胞は宿主組織を破壊する。免疫応答、特にT細胞の増殖、分化
、または走化性を阻害する本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与
は、器官拒絶またはGVHDを予防するのに有効な治療であり得る。
性移植片病(GVHD)を処置および/または予防するために用いられ得る。器
官拒絶は、宿主免疫細胞が免疫応答を介して移植された組織を破壊することによ
り生じる。同様に、免疫応答はまた、GVHDに関与するが、この場合、外来の
移植された免疫細胞は宿主組織を破壊する。免疫応答、特にT細胞の増殖、分化
、または走化性を阻害する本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与
は、器官拒絶またはGVHDを予防するのに有効な治療であり得る。
【0138】 同様に、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、炎症を調節す
るために用いられ得る。例えば、このポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、
炎症性応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子は、以
下を含む炎症状態(慢性および急性の両方の状態)を処置するために使用され得
る:感染に関連した炎症(例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎
症応答症候群(SIRS))、虚血性再灌流傷害、内毒素死亡、関節炎、補体媒
介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性腸
疾患、クローン病、またはサイトカイン(例えば、TNFまたはIL−1)の過
剰産生からもたらされる状態。
るために用いられ得る。例えば、このポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、
炎症性応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分子は、以
下を含む炎症状態(慢性および急性の両方の状態)を処置するために使用され得
る:感染に関連した炎症(例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎
症応答症候群(SIRS))、虚血性再灌流傷害、内毒素死亡、関節炎、補体媒
介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性腸
疾患、クローン病、またはサイトカイン(例えば、TNFまたはIL−1)の過
剰産生からもたらされる状態。
【0139】 (過剰増殖性障害) ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、新生物を含む過剰増殖性障害を処置
または検出するために使用され得る。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドは、直接的相互作用または間接的相互作用を介して障害の増殖を阻害し得る
。あるいは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、過剰増殖性障害
を阻害し得る他の細胞を増殖させ得る。
または検出するために使用され得る。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドは、直接的相互作用または間接的相互作用を介して障害の増殖を阻害し得る
。あるいは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、過剰増殖性障害
を阻害し得る他の細胞を増殖させ得る。
【0140】 例えば、免疫応答を増加させることによって、特に過剰増殖性障害の抗原性の
質を上げることによって、またはT細胞の増殖、分化、もしくは遊走によって、
過剰増殖性障害は処置され得る。この免疫応答は、存在する免疫応答を増強させ
るかまたは新たな免疫応答を開始させるかのいずれかによって上昇され得る。あ
るいは、免疫応答の減少はまた、化学療法剤のような過剰増殖性障害を処置する
方法であり得る。
質を上げることによって、またはT細胞の増殖、分化、もしくは遊走によって、
過剰増殖性障害は処置され得る。この免疫応答は、存在する免疫応答を増強させ
るかまたは新たな免疫応答を開始させるかのいずれかによって上昇され得る。あ
るいは、免疫応答の減少はまた、化学療法剤のような過剰増殖性障害を処置する
方法であり得る。
【0141】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置されるかまたは検出
され得る過剰増殖性障害の例には、以下に見出される新生物が含まれるがこれら
に限定されない:腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副
腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺)、眼、頭部および頸部、神
経(中枢および末梢)、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、ならびに
泌尿生殖器。
され得る過剰増殖性障害の例には、以下に見出される新生物が含まれるがこれら
に限定されない:腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副
腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺)、眼、頭部および頸部、神
経(中枢および末梢)、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、ならびに
泌尿生殖器。
【0142】 同様に、他の過剰増殖性障害もまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドにより処置または検出され得る。このような過剰増殖性障害の例には、以
下が挙げられるがこれらに限定されない:高ガンマグロブリン血症、リンパ球増
殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および
任意のその他の過剰増殖性疾患、加えて上記に列挙した器官系に見出される新生
物。
プチドにより処置または検出され得る。このような過剰増殖性障害の例には、以
下が挙げられるがこれらに限定されない:高ガンマグロブリン血症、リンパ球増
殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、
ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および
任意のその他の過剰増殖性疾患、加えて上記に列挙した器官系に見出される新生
物。
【0143】 (感染性疾患) 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染因子を処置または検出
するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特にB
細胞および/またはT細胞の増殖および分化を増加させることによって、感染性
疾患が処置され得る。免疫応答は、存在する免疫応答を上昇させるか、または新
たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得る。あるいは、本発明
のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、必ずしも免疫応答を誘発するこ
となく、感染因子を直接阻害し得る。
するために用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特にB
細胞および/またはT細胞の増殖および分化を増加させることによって、感染性
疾患が処置され得る。免疫応答は、存在する免疫応答を上昇させるか、または新
たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得る。あるいは、本発明
のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、必ずしも免疫応答を誘発するこ
となく、感染因子を直接阻害し得る。
【0144】 ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置または
検出され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルス
の例としては、以下のDNAおよびRNAウイルス科が挙げられるがこれらに限
定されない:アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリ
ウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カリチウイルス科、サルコウ
イルス科(Circoviridae)、コロナウイルス科、フラビウイルス科
、ヘパドナウイルス科(肝炎)、ヘルペスウイルス科(例えば、サイトメガロウ
イルス、単純ヘルペス、帯状ヘルペス)、モノネガウイルス(Mononega
virus)(例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス
科)、オルソミクソウイルス科(例えば、インフルエンザ)、パポーバウイルス
科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科(例えば、痘
瘡または痘疹)、レオウイルス科(例えば、ロタウイルス)、レトロウイルス科
(HTLV−I、HTLV−II、レンチウイルス)、およびトガウイルス科(
例えば、ルビウイルス属)。これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれ
らに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る:関節炎、細気管支炎
(bronchiollitis)、脳炎、眼性感染症(例えば、結膜炎、角膜
炎)、慢性疲労症候群、肝炎(A型、B型、C型、E型、慢性活動性、デルタ)
、髄膜炎、日和見感染症(例えば、AIDS)、肺炎、バーキットリンパ腫、水
痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリ
オ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病(例えば、カポージ、いぼ)、およびウイ
ルス血症。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、任意のこれ
らの症状もしくは疾患が処置または検出され得る。
検出され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルス
の例としては、以下のDNAおよびRNAウイルス科が挙げられるがこれらに限
定されない:アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリ
ウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カリチウイルス科、サルコウ
イルス科(Circoviridae)、コロナウイルス科、フラビウイルス科
、ヘパドナウイルス科(肝炎)、ヘルペスウイルス科(例えば、サイトメガロウ
イルス、単純ヘルペス、帯状ヘルペス)、モノネガウイルス(Mononega
virus)(例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス
科)、オルソミクソウイルス科(例えば、インフルエンザ)、パポーバウイルス
科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科(例えば、痘
瘡または痘疹)、レオウイルス科(例えば、ロタウイルス)、レトロウイルス科
(HTLV−I、HTLV−II、レンチウイルス)、およびトガウイルス科(
例えば、ルビウイルス属)。これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれ
らに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る:関節炎、細気管支炎
(bronchiollitis)、脳炎、眼性感染症(例えば、結膜炎、角膜
炎)、慢性疲労症候群、肝炎(A型、B型、C型、E型、慢性活動性、デルタ)
、髄膜炎、日和見感染症(例えば、AIDS)、肺炎、バーキットリンパ腫、水
痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリ
オ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病(例えば、カポージ、いぼ)、およびウイ
ルス血症。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、任意のこれ
らの症状もしくは疾患が処置または検出され得る。
【0145】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のポリヌクレオチドまた
はポリペプチドによって処置または検出され得る細菌性因子または真菌性因子は
、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌科および真菌類を含むがこれらに限定
されない:Actinomycetales(例えば、Corynebacte
rium、Mycobacterium、Norcardia)、Asperg
illosis、Bacillaceae(例えば、Anthrax、Clos
tridium)、Bacteroidaceae、Blastomycosi
s、Bordetella、Borrelia、Brucellosis、Ca
ndidiasis、Campylobacter、Coccidioidom
ycosis、Cryptococcosis、Dermatocycoses
、Enterobacteriaceae(Klebsiella、Salmo
nella、Serratia、Yersinia)、Erysipeloth
rix、Helicobacter、Legionellosis、Lepto
spirosis、Listeria、Mycoplasmatales、Ne
isseriaceae(例えば、Acinetobacter、Gonorr
hea、Menigococcal)、Pasteurellaceaの感染症
(例えば、Actinobacillus、Heamophilus、Past
eurella)、Pseudomonas、Rickettsiaceae、
Chlamydiaceae、Syphilis、およびStaphyloco
ccal。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない
疾患または症状を引き起こし得る:菌血症、心内膜炎、眼感染症(結膜炎、結核
、ブドウ膜炎)、歯肉炎、日和見感染症(例えば、AIDSに関連した感染症)
、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症(例えば、百日咳
または蓄膿症)、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食
中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病
、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱
、猩紅熱、性感染病、皮膚病(例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症(dermatoc
ycoses))、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。本発明のポリペプチドま
たはポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置または
検出し得る。
はポリペプチドによって処置または検出され得る細菌性因子または真菌性因子は
、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌科および真菌類を含むがこれらに限定
されない:Actinomycetales(例えば、Corynebacte
rium、Mycobacterium、Norcardia)、Asperg
illosis、Bacillaceae(例えば、Anthrax、Clos
tridium)、Bacteroidaceae、Blastomycosi
s、Bordetella、Borrelia、Brucellosis、Ca
ndidiasis、Campylobacter、Coccidioidom
ycosis、Cryptococcosis、Dermatocycoses
、Enterobacteriaceae(Klebsiella、Salmo
nella、Serratia、Yersinia)、Erysipeloth
rix、Helicobacter、Legionellosis、Lepto
spirosis、Listeria、Mycoplasmatales、Ne
isseriaceae(例えば、Acinetobacter、Gonorr
hea、Menigococcal)、Pasteurellaceaの感染症
(例えば、Actinobacillus、Heamophilus、Past
eurella)、Pseudomonas、Rickettsiaceae、
Chlamydiaceae、Syphilis、およびStaphyloco
ccal。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない
疾患または症状を引き起こし得る:菌血症、心内膜炎、眼感染症(結膜炎、結核
、ブドウ膜炎)、歯肉炎、日和見感染症(例えば、AIDSに関連した感染症)
、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症(例えば、百日咳
または蓄膿症)、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食
中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病
、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱
、猩紅熱、性感染病、皮膚病(例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症(dermatoc
ycoses))、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。本発明のポリペプチドま
たはポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置または
検出し得る。
【0146】 さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置もしくは検
出され得る疾患または症状を引き起こす寄生生物性因子としては以下のファミリ
ーが挙げられるがこれらに限定されない:アメーバ、バベシア、コクシジウム、
クリプトスポリジウム、二核アメーバ、交疫、外部寄生生物、ジアルジア鞭毛虫
、蠕虫、リーシュマニア、タイレリア、トキソプラスマ、トリパノソーマ、およ
びトリコモナス。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々
の疾患または症状を引き起こし得る:疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患
(例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症)、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症(例
えば、AIDS関連)、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ。本発明
のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状もしくは
疾患を処置または検出し得る。
出され得る疾患または症状を引き起こす寄生生物性因子としては以下のファミリ
ーが挙げられるがこれらに限定されない:アメーバ、バベシア、コクシジウム、
クリプトスポリジウム、二核アメーバ、交疫、外部寄生生物、ジアルジア鞭毛虫
、蠕虫、リーシュマニア、タイレリア、トキソプラスマ、トリパノソーマ、およ
びトリコモナス。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々
の疾患または症状を引き起こし得る:疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患
(例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症)、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症(例
えば、AIDS関連)、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ。本発明
のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状もしくは
疾患を処置または検出し得る。
【0147】 好ましくは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いる処置は、
患者に有効量のポリペプチドを投与するか、または患者から細胞を取り出して、
本発明のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして患者に操作した細胞を戻
す(エキソビボ治療)かのいずれかによるものであり得る。さらに、本発明のポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドはワクチン中の抗原として用いられて、感染
性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
患者に有効量のポリペプチドを投与するか、または患者から細胞を取り出して、
本発明のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして患者に操作した細胞を戻
す(エキソビボ治療)かのいずれかによるものであり得る。さらに、本発明のポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドはワクチン中の抗原として用いられて、感染
性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【0148】 (再生) 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて、細胞を分化させ、増
殖させ、そして誘引して、組織の再生を導き得る(Science 276:5
9−87(1997)を参照のこと)。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷
(創傷、熱傷、切開、または潰瘍)、加齢、疾患(例えば、骨粗鬆症、変形性関
節炎(osteocarthritis)、歯周病、肝不全)、美容形成手術を
含む手術、線維症、再灌流傷害、または全身性サイトカイン損傷により損傷を受
けた組織を修復、置換、または保護し得る。
殖させ、そして誘引して、組織の再生を導き得る(Science 276:5
9−87(1997)を参照のこと)。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷
(創傷、熱傷、切開、または潰瘍)、加齢、疾患(例えば、骨粗鬆症、変形性関
節炎(osteocarthritis)、歯周病、肝不全)、美容形成手術を
含む手術、線維症、再灌流傷害、または全身性サイトカイン損傷により損傷を受
けた組織を修復、置換、または保護し得る。
【0149】 本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる:器官(例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮)、筋肉(平滑筋、骨格筋、または心筋)、
脈管(脈管内皮を含む)、神経、造血、および骨格(骨、軟骨、腱、および靭帯
)の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて生じる。再
生はまた、新脈管形成を含み得る。
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮)、筋肉(平滑筋、骨格筋、または心筋)、
脈管(脈管内皮を含む)、神経、造血、および骨格(骨、軟骨、腱、および靭帯
)の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて生じる。再
生はまた、新脈管形成を含み得る。
【0150】 さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、治癒するのが困難
な組織の再生を増加し得る。例えば、腱/靭帯再生を増大させることによって、
損傷後の回復時間が早まる。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはま
た、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾
患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創
傷の組織再生のさらなる例は、褥瘡性潰瘍、脈管不全に関連する潰瘍、外科的創
傷、および外傷性創傷を含む。
な組織の再生を増加し得る。例えば、腱/靭帯再生を増大させることによって、
損傷後の回復時間が早まる。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはま
た、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾
患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創
傷の組織再生のさらなる例は、褥瘡性潰瘍、脈管不全に関連する潰瘍、外科的創
傷、および外傷性創傷を含む。
【0151】 同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるために本
発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用することによって再生され得
る。本方法を用いて処置され得る疾患は、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患
、神経障害、または機械的および外傷性障害(例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳
血管疾患、および発作(stoke))を含む。詳細には、末梢神経傷害、末梢
神経障害(例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる)、局在神経障害
、および中枢神経系疾患(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチ
ントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群)と関連する
疾患はすべて、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて処置され
得る。
発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用することによって再生され得
る。本方法を用いて処置され得る疾患は、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患
、神経障害、または機械的および外傷性障害(例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳
血管疾患、および発作(stoke))を含む。詳細には、末梢神経傷害、末梢
神経障害(例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる)、局在神経障害
、および中枢神経系疾患(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチ
ントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群)と関連する
疾患はすべて、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて処置され
得る。
【0152】 (走化性) 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化性活性を有し得る。走
化性分子は、細胞(例えば、単球、線維芽細胞、好中球、T細胞、肥満細胞、好
酸球、上皮細胞、および/または内皮細胞)を、身体中の特定の部位(例えば、
炎症、感染、または過剰増殖の部位)に誘引または移動させる。次いで、移動し
た細胞は、特定の外傷または異常性を撃退および/または治癒し得る。
化性分子は、細胞(例えば、単球、線維芽細胞、好中球、T細胞、肥満細胞、好
酸球、上皮細胞、および/または内皮細胞)を、身体中の特定の部位(例えば、
炎症、感染、または過剰増殖の部位)に誘引または移動させる。次いで、移動し
た細胞は、特定の外傷または異常性を撃退および/または治癒し得る。
【0153】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特定の細胞の走化性活性を
増大し得る。次いで、これらの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標
的化した細胞の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、ま
たは任意の免疫系障害を処置し得る。例えば、走化性分子を使用して、免疫細胞
を傷害を受けた位置に誘引することによって、組織に対する創傷および他の外傷
を処置し得る。本発明の走化性分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷
を処置するために使用され得る。
増大し得る。次いで、これらの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標
的化した細胞の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、ま
たは任意の免疫系障害を処置し得る。例えば、走化性分子を使用して、免疫細胞
を傷害を受けた位置に誘引することによって、組織に対する創傷および他の外傷
を処置し得る。本発明の走化性分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷
を処置するために使用され得る。
【0154】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが走化性活性を阻害し得ること
もまた意図される。これらの分子はまた、障害を処置するために使用され得る。
従って、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化性のインヒビタ
ーとして使用され得る。
もまた意図される。これらの分子はまた、障害を処置するために使用され得る。
従って、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化性のインヒビタ
ーとして使用され得る。
【0155】 (結合活性) 本発明のポリペプチドは、ポリペプチドに結合する分子、またはポリペプチド
が結合する分子をスクリーニングするために使用され得る。ポリペプチドと分子
との結合は、結合したポリペプチドまたは分子の活性を活性化(アゴニスト)、
増大、阻害(アンタゴニスト)、または減少させ得る。そのような分子の例は、
抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質(例えば、レセプター)、または低分子
を含む。
が結合する分子をスクリーニングするために使用され得る。ポリペプチドと分子
との結合は、結合したポリペプチドまたは分子の活性を活性化(アゴニスト)、
増大、阻害(アンタゴニスト)、または減少させ得る。そのような分子の例は、
抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質(例えば、レセプター)、または低分子
を含む。
【0156】 好ましくは、分子は、ポリペプチドのネイティブのリガンド(例えば、リガン
ドのフラグメント、またはネイティブの基質)、リガンド、構造的模倣物、もし
くは機能的模倣物に密接に関連する(Coliganら、Current Pr
otocols in Immunology 1(2): 第5章(1991
)を参照のこと)。同様に、分子は、ポリペプチドが結合するネイティブのレセ
プター、または少なくともポリペプチドによって結合され得るレセプターのフラ
グメント(例えば、活性部位)に密接に関連し得る。いずれの場合においても、
分子は、公知の技術を用いて合理的に設計され得る。
ドのフラグメント、またはネイティブの基質)、リガンド、構造的模倣物、もし
くは機能的模倣物に密接に関連する(Coliganら、Current Pr
otocols in Immunology 1(2): 第5章(1991
)を参照のこと)。同様に、分子は、ポリペプチドが結合するネイティブのレセ
プター、または少なくともポリペプチドによって結合され得るレセプターのフラ
グメント(例えば、活性部位)に密接に関連し得る。いずれの場合においても、
分子は、公知の技術を用いて合理的に設計され得る。
【0157】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、ポリペプチドを、分
泌タンパク質としてかまたは細胞膜上でのいずれかで発現する適切な細胞を産生
する工程を包含する。好ましい細胞は、哺乳動物、酵母、Drosophila
、またはE.coli由来の細胞を含む。次いで、ポリペプチドを発現する細胞
(または、発現されたポリペプチドを含む細胞膜)は、好ましくは、ポリペプチ
ドまたは分子のいずれかの結合、刺激、または活性の阻害を観察するための分子
を潜在的に含む試験化合物と接触される。
泌タンパク質としてかまたは細胞膜上でのいずれかで発現する適切な細胞を産生
する工程を包含する。好ましい細胞は、哺乳動物、酵母、Drosophila
、またはE.coli由来の細胞を含む。次いで、ポリペプチドを発現する細胞
(または、発現されたポリペプチドを含む細胞膜)は、好ましくは、ポリペプチ
ドまたは分子のいずれかの結合、刺激、または活性の阻害を観察するための分子
を潜在的に含む試験化合物と接触される。
【0158】 アッセイは、ポリペプチドへの候補化合物の結合を簡単に試験し得、ここで結
合は、標識によってか、または標識された競合物との競合に関するアッセイにお
いて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がポリペプチドへの結合によ
って生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
合は、標識によってか、または標識された競合物との競合に関するアッセイにお
いて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がポリペプチドへの結合によ
って生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【0159】 あるいは、アッセイは、細胞を含まない調製物、固体支持体に固定されたポリ
ペプチド/分子、化学ライブラリー、またはネイティブの産物の混合物を用いて
実施され得る。アッセイはまた、ポリペプチドを含む溶液を候補化合物と混合す
る工程、ポリペプチド/分子の活性または結合を測定する工程、およびポリペプ
チド/分子の活性または結合を、標準と比較する工程を単に包含し得る。
ペプチド/分子、化学ライブラリー、またはネイティブの産物の混合物を用いて
実施され得る。アッセイはまた、ポリペプチドを含む溶液を候補化合物と混合す
る工程、ポリペプチド/分子の活性または結合を測定する工程、およびポリペプ
チド/分子の活性または結合を、標準と比較する工程を単に包含し得る。
【0160】 好ましくは、ELISAアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル(例えば、生物学的サンプル)におけるポリペプチド
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ポリペプチドへの直接的もしくは間
接的な結合のいずれか、またはポリペプチドとの基質についての競合によって、
ポリペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。
ル抗体を用いて、サンプル(例えば、生物学的サンプル)におけるポリペプチド
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ポリペプチドへの直接的もしくは間
接的な結合のいずれか、またはポリペプチドとの基質についての競合によって、
ポリペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。
【0161】 これらの上記のアッセイのすべては、診断マーカーまたは予後マーカーとして
使用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ポリペプチド/分
子を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者におけ
る特定の結果(例えば、血管増殖)をもたらすために使用され得る。さらに、ア
ッセイは、適切に操作された細胞または組織からのポリペプチドの産生を阻害ま
たは増強し得る因子を発見し得る。
使用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ポリペプチド/分
子を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者におけ
る特定の結果(例えば、血管増殖)をもたらすために使用され得る。さらに、ア
ッセイは、適切に操作された細胞または組織からのポリペプチドの産生を阻害ま
たは増強し得る因子を発見し得る。
【0162】 従って、本発明は、以下の工程を含む本発明のポリペプチドに結合する化合物
を同定する方法を包含する:(a)候補結合化合物を本発明のポリペプチドとと
もにインキュベートする工程;および(b)結合が生じたか否かを決定する工程
。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト/アンタゴニストを同定する
方法を包含する:(a)候補化合物を本発明のポリペプチドとともにインキュベ
ートする工程、(b)生物学的活性をアッセイする工程、および(b)ポリペプ
チドの生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。
を同定する方法を包含する:(a)候補結合化合物を本発明のポリペプチドとと
もにインキュベートする工程;および(b)結合が生じたか否かを決定する工程
。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト/アンタゴニストを同定する
方法を包含する:(a)候補化合物を本発明のポリペプチドとともにインキュベ
ートする工程、(b)生物学的活性をアッセイする工程、および(b)ポリペプ
チドの生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。
【0163】 (他の活性) 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、先に議論されるように
造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化または増殖を増加または減少し得る。
造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化または増殖を増加または減少し得る。
【0164】 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、哺乳動物の特徴(例え
ば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、
および形(例えば、美容外科)を調節するために使用され得る。同様に、本発明
のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、異化作用、同化作用、プロセシング
、利用、およびエネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するため
に使用され得る。
ば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、
および形(例えば、美容外科)を調節するために使用され得る。同様に、本発明
のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、異化作用、同化作用、プロセシング
、利用、およびエネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するため
に使用され得る。
【0165】 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、バイオリズム、カリカディ
ック(caricadic)リズム、うつ病(抑うつ性障害を含む)、暴力の傾
向、痛みへの耐性、生殖能力(好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性
によって)、ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレ
ス、または他の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態また
は身体状態を変更するために使用され得る。
ック(caricadic)リズム、うつ病(抑うつ性障害を含む)、暴力の傾
向、痛みへの耐性、生殖能力(好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性
によって)、ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレ
ス、または他の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態また
は身体状態を変更するために使用され得る。
【0166】 本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、例えば、貯蔵能力、脂
肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または
他の栄養成分を増加または減少させるような食品添加物または保存剤として使用
され得る。
肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または
他の栄養成分を増加または減少させるような食品添加物または保存剤として使用
され得る。
【0167】 (他の好ましい実施態様) 本願発明の他の好ましい実施態様は、配列番号Xのヌクレオチド配列中の少な
くとも約50の連続したヌクレオチドの配列に、少なくとも95%同一であるヌ
クレオチド配列を含む、単離された核酸分子を含み、ここで、Xは表1に規定さ
れる任意の整数である。
くとも約50の連続したヌクレオチドの配列に、少なくとも95%同一であるヌ
クレオチド配列を含む、単離された核酸分子を含み、ここで、Xは表1に規定さ
れる任意の整数である。
【0168】 上記連続したヌクレオチドの配列が、表1中の配列番号Xについて規定される
ような、ほぼクローン配列の5’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで始まり、
そしてほぼクローン配列の3’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで終わる位置
の範囲で、配列番号Xのヌクレオチド配列に含まれる、核酸分子もまた好ましい
。
ような、ほぼクローン配列の5’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで始まり、
そしてほぼクローン配列の3’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで終わる位置
の範囲で、配列番号Xのヌクレオチド配列に含まれる、核酸分子もまた好ましい
。
【0169】 上記連続したヌクレオチドの配列が、表1中の配列番号Xについて規定される
ような、ほぼ開始コドンの5’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで始まり、そ
してほぼクローン配列の3’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで終わる位置の
範囲で、配列番号Xのヌクレオチド配列に含まれる、核酸分子もまた好ましい。
ような、ほぼ開始コドンの5’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで始まり、そ
してほぼクローン配列の3’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで終わる位置の
範囲で、配列番号Xのヌクレオチド配列に含まれる、核酸分子もまた好ましい。
【0170】 上記連続したヌクレオチドの配列が、表1中の配列番号Xについて規定される
ような、ほぼシグナルペプチドの第1のアミノ酸の5’ヌクレオチドの位置のヌ
クレオチドで始まり、そしてほぼクローン配列の3’ヌクレオチドの位置のヌク
レオチドで終わる位置の範囲で、配列番号Xのヌクレオチド配列に含まれる、核
酸分子も同様に好ましい。
ような、ほぼシグナルペプチドの第1のアミノ酸の5’ヌクレオチドの位置のヌ
クレオチドで始まり、そしてほぼクローン配列の3’ヌクレオチドの位置のヌク
レオチドで終わる位置の範囲で、配列番号Xのヌクレオチド配列に含まれる、核
酸分子も同様に好ましい。
【0171】 配列番号Xのヌクレオチド配列中の少なくとも約150の連続したヌクレオチ
ドの配列に、少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された
核酸分子もまた好ましい。
ドの配列に、少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された
核酸分子もまた好ましい。
【0172】 配列番号Xのヌクレオチド配列中の少なくとも約500の連続したヌクレオチ
ドの配列に、少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された
核酸分子はさらに好ましい。
ドの配列に、少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された
核酸分子はさらに好ましい。
【0173】 さらに好ましい実施態様は、表1中の配列番号Xについて規定されるような、
ほぼシグナルペプチドの第1のアミノ酸の5’ヌクレオチドの位置のヌクレオチ
ドで始まり、そしてほぼクローン配列の3’ヌクレオチドの位置のヌクレオチド
で終わる配列番号Xのヌクレオチド配列に少なくとも95%同一であるヌクレオ
チド配列を含む核酸分子である。
ほぼシグナルペプチドの第1のアミノ酸の5’ヌクレオチドの位置のヌクレオチ
ドで始まり、そしてほぼクローン配列の3’ヌクレオチドの位置のヌクレオチド
で終わる配列番号Xのヌクレオチド配列に少なくとも95%同一であるヌクレオ
チド配列を含む核酸分子である。
【0174】 さらに好ましい実施態様は、配列番号Xの完全なヌクレオチド配列に、少なく
とも95%同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
とも95%同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
【0175】 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸分子にハイブリダイ
ズする単離された核酸分子もまた好ましく、ここで上記のハイブリダイズする核
酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、A残基のみま
たはT残基のみからなるヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズし
ない。
ズする単離された核酸分子もまた好ましく、ここで上記のハイブリダイズする核
酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、A残基のみま
たはT残基のみからなるヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズし
ない。
【0176】 表1におけるcDNAクローンIDによって同定されるヒトcDNAクローン
を含むDNA分子を含む物質の組成物もまた好ましく、このDNA分子は、アメ
リカンタイプカルチャーコレクションに寄託された物質中に含まれ、そして上記
のcDNAクローンIDについて表1中に示される所定のATCC受託番号を与
えられている。
を含むDNA分子を含む物質の組成物もまた好ましく、このDNA分子は、アメ
リカンタイプカルチャーコレクションに寄託された物質中に含まれ、そして上記
のcDNAクローンIDについて表1中に示される所定のATCC受託番号を与
えられている。
【0177】 表1中のcDNAクローンIDによって同定されるヒトcDNAクローンのヌ
クレオチド配列中の少なくとも50の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも
95%同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた好ましく、
このDNA分子は表1において示されるATCC受託番号を付与された寄託物中
に含まれる。
クレオチド配列中の少なくとも50の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも
95%同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた好ましく、
このDNA分子は表1において示されるATCC受託番号を付与された寄託物中
に含まれる。
【0178】 上記の少なくとも50の連続したヌクレオチドの配列が、上記ヒトcDNAク
ローンによってコードされる完全なオープンリーディングフレームの配列のヌク
レオチド配列中に含まれる、単離された核酸分子もまた好ましい。
ローンによってコードされる完全なオープンリーディングフレームの配列のヌク
レオチド配列中に含まれる、単離された核酸分子もまた好ましい。
【0179】 上記ヒトcDNAクローンによってコードされるヌクレオチド配列中の少なく
とも150の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一であるヌクレ
オチド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ましい。
とも150の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一であるヌクレ
オチド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ましい。
【0180】 さらに好ましい実施態様は、上記ヒトcDNAクローンによってコードされる
ヌクレオチド配列中の少なくとも500の連続したヌクレオチドの配列に少なく
とも95%同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
ヌクレオチド配列中の少なくとも500の連続したヌクレオチドの配列に少なく
とも95%同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
【0181】 さらに好ましい実施態様は、上記ヒトcDNAクローンによってコードされる
完全なヌクレオチド配列に少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む
、単離された核酸分子である。
完全なヌクレオチド配列に少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む
、単離された核酸分子である。
【0182】 さらに好ましい実施態様は、以下からなる群から選択される配列中の少なくと
も50の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一であるヌクレオチ
ド配列を含む核酸分子を、生物学的サンプルにおいて検出するための方法である
:配列番号Xのヌクレオチド配列、ここで、Xは表1において規定される任意の
整数である;および表1中のcDNAクローンIDによって同定され、そして表
1において上記cDNAクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄
託物中に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされるヌクレオチド配列
;上記の方法は、上記の群から選択される配列と、上記のサンプル中の少なくと
も1つの核酸分子のヌクレオチド配列とを比較する工程、および上記サンプル中
の上記核酸分子の配列が、上記の選択された配列に対して少なくとも95%同一
であるか否かを決定する工程を包含する。
も50の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一であるヌクレオチ
ド配列を含む核酸分子を、生物学的サンプルにおいて検出するための方法である
:配列番号Xのヌクレオチド配列、ここで、Xは表1において規定される任意の
整数である;および表1中のcDNAクローンIDによって同定され、そして表
1において上記cDNAクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄
託物中に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされるヌクレオチド配列
;上記の方法は、上記の群から選択される配列と、上記のサンプル中の少なくと
も1つの核酸分子のヌクレオチド配列とを比較する工程、および上記サンプル中
の上記核酸分子の配列が、上記の選択された配列に対して少なくとも95%同一
であるか否かを決定する工程を包含する。
【0183】 上記の配列を比較する工程が、上記サンプル中の核酸分子と、上記群から選択
された上記配列を含む核酸分子との間の核酸ハイブリダイゼーションの程度を決
定する工程を包含する、上記方法もまた好ましい。同様に、配列を比較する上記
の工程が、上記サンプル中の核酸分子から決定されるヌクレオチド配列と、上記
群から選択された上記配列とを比較する工程によって実施される、上記方法もま
た好ましい。核酸分子は、DNA分子またはRNA分子を含み得る。
された上記配列を含む核酸分子との間の核酸ハイブリダイゼーションの程度を決
定する工程を包含する、上記方法もまた好ましい。同様に、配列を比較する上記
の工程が、上記サンプル中の核酸分子から決定されるヌクレオチド配列と、上記
群から選択された上記配列とを比較する工程によって実施される、上記方法もま
た好ましい。核酸分子は、DNA分子またはRNA分子を含み得る。
【0184】 さらに好ましい実施態様は、生物学的サンプルの種、組織、または細胞型を同
定するための方法であって、この方法は、以下からなる群から選択される配列中
の少なくとも50の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一である
ヌクレオチド配列を含む上記サンプル中の核酸分子を(もしあれば)検出する工
程を包含する:配列番号Xのヌクレオチド配列、ここで、Xは表1において規定
される任意の整数である;および表1中のcDNAクローンIDによって同定さ
れ、そして表1において上記cDNAクローンについて示されるATCC受託番
号を有する寄託物中に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされるヌク
レオチド配列。
定するための方法であって、この方法は、以下からなる群から選択される配列中
の少なくとも50の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一である
ヌクレオチド配列を含む上記サンプル中の核酸分子を(もしあれば)検出する工
程を包含する:配列番号Xのヌクレオチド配列、ここで、Xは表1において規定
される任意の整数である;および表1中のcDNAクローンIDによって同定さ
れ、そして表1において上記cDNAクローンについて示されるATCC受託番
号を有する寄託物中に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされるヌク
レオチド配列。
【0185】 生物学的サンプルの種、組織、または細胞型を同定するための方法は、少なく
とも2つのヌクレオチド配列のパネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検
出する工程を包含し得、ここで上記パネル中の少なくとも1つの配列は、上記の
群から選択される配列中の少なくとも50の連続したヌクレオチドの配列に少な
くとも95%同一である。
とも2つのヌクレオチド配列のパネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検
出する工程を包含し得、ここで上記パネル中の少なくとも1つの配列は、上記の
群から選択される配列中の少なくとも50の連続したヌクレオチドの配列に少な
くとも95%同一である。
【0186】 表1において同定されるタンパク質をコードする遺伝子の異常な構造または発
現と関連する病理学的状態を、被験体において診断するための方法もまた好まし
く、この方法は、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも50の連続
したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む
、核酸分子を、(もしあれば)上記被験体から得られる生物学的サンプルにおい
て検出する工程を包含する:配列番号Xのヌクレオチド配列、ここでXは表1に
おいて規定される任意の整数である;および表1中のcDNAクローンIDによ
って同定され、かつ表1中の上記のcDNAクローンについて示されるATCC
受託番号を有する寄託物に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされる
ヌクレオチド配列。
現と関連する病理学的状態を、被験体において診断するための方法もまた好まし
く、この方法は、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも50の連続
したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む
、核酸分子を、(もしあれば)上記被験体から得られる生物学的サンプルにおい
て検出する工程を包含する:配列番号Xのヌクレオチド配列、ここでXは表1に
おいて規定される任意の整数である;および表1中のcDNAクローンIDによ
って同定され、かつ表1中の上記のcDNAクローンについて示されるATCC
受託番号を有する寄託物に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされる
ヌクレオチド配列。
【0187】 病理学的状態を診断するための方法は、少なくとも2つのヌクレオチド配列の
パネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する工程を包含し得、ここで
、上記パネル中の少なくとも1つの配列は、上記群から選択される配列中の少な
くとも50の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一である。
パネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する工程を包含し得、ここで
、上記パネル中の少なくとも1つの配列は、上記群から選択される配列中の少な
くとも50の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一である。
【0188】 上記の核酸分子のヌクレオチド配列が、少なくとも2つのヌクレオチド配列の
パネルを含む、単離された核酸分子を含む物質の組成物もまた好ましく、ここで
上記のパネル中の少なくとも1つの配列は、以下からなる群から選択される配列
中の少なくとも50の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一であ
る:配列番号Xのヌクレオチド配列、ここでXは表1において規定される任意の
整数である;および表1中のcDNAクローンIDによって同定され、かつ表1
中の上記のcDNAクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物
に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされるヌクレオチド配列。核酸
分子は、DNA分子またはRNA分子を含み得る。
パネルを含む、単離された核酸分子を含む物質の組成物もまた好ましく、ここで
上記のパネル中の少なくとも1つの配列は、以下からなる群から選択される配列
中の少なくとも50の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも95%同一であ
る:配列番号Xのヌクレオチド配列、ここでXは表1において規定される任意の
整数である;および表1中のcDNAクローンIDによって同定され、かつ表1
中の上記のcDNAクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物
に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされるヌクレオチド配列。核酸
分子は、DNA分子またはRNA分子を含み得る。
【0189】 配列番号Yのアミノ酸配列中の少なくとも約10の連続したアミノ酸の配列に
、少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた
好ましく、ここでYは、表1において規定される任意の整数である。
、少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた
好ましく、ここでYは、表1において規定される任意の整数である。
【0190】 上記連続したアミノ酸の配列が、表1中の配列番号Yについて示されるような
、ほぼ分泌部分の第1のアミノ酸の位置の残基で始まり、そしてほぼオープンリ
ーディングフレームの最後のアミノ酸の残基で終わる位置の範囲で、配列番号Y
のアミノ酸配列中に含まれる、ポリペプチドもまた好ましい。
、ほぼ分泌部分の第1のアミノ酸の位置の残基で始まり、そしてほぼオープンリ
ーディングフレームの最後のアミノ酸の残基で終わる位置の範囲で、配列番号Y
のアミノ酸配列中に含まれる、ポリペプチドもまた好ましい。
【0191】 配列番号Yのアミノ酸配列中の少なくとも約30の連続したアミノ酸の配列に
少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好
ましい。
少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好
ましい。
【0192】 配列番号Yのアミノ酸配列中の少なくとも約100の連続したアミノ酸の配列
に少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさら
に好ましい。
に少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさら
に好ましい。
【0193】 配列番号Yの完全なアミノ酸配列に少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含
む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【0194】 表1中のcDNAクローンIDによって同定され、かつ表1中の上記のcDN
Aクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれるヒトc
DNAクローンによってコードされる分泌タンパク質の完全なアミノ酸配列にお
いて、少なくとも約10の連続したアミノ酸の配列に少なくとも90%同一のア
ミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
Aクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれるヒトc
DNAクローンによってコードされる分泌タンパク質の完全なアミノ酸配列にお
いて、少なくとも約10の連続したアミノ酸の配列に少なくとも90%同一のア
ミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【0195】 上記の連続したアミノ酸の配列が、表1中のcDNAクローンIDによって同
定され、かつ表1中の上記のcDNAクローンについて示されるATCC受託番
号を有する寄託物に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされる完全な
タンパク質の分泌部分のアミノ酸配列に含まれる、ポリペプチドもまた好ましい
。
定され、かつ表1中の上記のcDNAクローンについて示されるATCC受託番
号を有する寄託物に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされる完全な
タンパク質の分泌部分のアミノ酸配列に含まれる、ポリペプチドもまた好ましい
。
【0196】 表1におけるcDNAクローンIDによって同定され、かつ表1のこのcDN
Aクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒト
cDNAクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のアミノ酸配列中
の少なくとも約30の連続したアミノ酸の配列に少なくとも95%同一であるア
ミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた、好ましい。
Aクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒト
cDNAクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のアミノ酸配列中
の少なくとも約30の連続したアミノ酸の配列に少なくとも95%同一であるア
ミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた、好ましい。
【0197】 表1におけるcDNAクローンIDによって同定され、かつ表1のこのcDN
Aクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒト
cDNAクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のアミノ酸配列中
の少なくとも約100の連続したアミノ酸の配列に少なくとも95%同一である
アミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた、好ましい。
Aクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒト
cDNAクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のアミノ酸配列中
の少なくとも約100の連続したアミノ酸の配列に少なくとも95%同一である
アミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた、好ましい。
【0198】 表1におけるcDNAクローンIDによって同定され、かつ表1のこのcDN
Aクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれるヒトc
DNAクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のアミノ酸配列に少
なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた
、好ましい。
Aクローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれるヒトc
DNAクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のアミノ酸配列に少
なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた
、好ましい。
【0199】 以下からなる群から選択される配列中の、少なくとも10の連続したアミノ酸
の配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して
特異的に結合する単離された抗体は、さらに好ましい:配列番号Yのアミノ酸配
列、ここで、Yは表1で規定される任意の整数である;および表1におけるcD
NAクローンIDによって同定され、かつ表1のこのcDNAクローンについて
示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンに
よってコードされるタンパク質の完全アミノ酸配列。
の配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して
特異的に結合する単離された抗体は、さらに好ましい:配列番号Yのアミノ酸配
列、ここで、Yは表1で規定される任意の整数である;および表1におけるcD
NAクローンIDによって同定され、かつ表1のこのcDNAクローンについて
示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンに
よってコードされるタンパク質の完全アミノ酸配列。
【0200】 以下からなる群から選択された配列中の、少なくとも10の連続したアミノ酸
の配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを、生物
学的サンプルにおいて検出する方法はさらに好ましい:配列番号Yのアミノ酸配
列、ここで、Yは表1で規定される任意の整数である;および表1におけるcD
NAクローンIDによって同定され、かつ表1のこのcDNAクローンについて
示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンに
よってコードされるタンパク質の完全アミノ酸配列;この方法は、このサンプル
中における少なくとも1つのポリペプチド分子のアミノ酸配列をこの群から選択
された配列と比較する工程、およびこのサンプル中におけるこのポリペプチド分
子の配列が、少なくとも10の連続したアミノ酸のこの配列と少なくとも90%
同一であるかどうかを決定する工程を含む。
の配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを、生物
学的サンプルにおいて検出する方法はさらに好ましい:配列番号Yのアミノ酸配
列、ここで、Yは表1で規定される任意の整数である;および表1におけるcD
NAクローンIDによって同定され、かつ表1のこのcDNAクローンについて
示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンに
よってコードされるタンパク質の完全アミノ酸配列;この方法は、このサンプル
中における少なくとも1つのポリペプチド分子のアミノ酸配列をこの群から選択
された配列と比較する工程、およびこのサンプル中におけるこのポリペプチド分
子の配列が、少なくとも10の連続したアミノ酸のこの配列と少なくとも90%
同一であるかどうかを決定する工程を含む。
【0201】 このサンプル中における少なくとも1つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を
、この群から選択された配列と比較するこの工程は、このサンプル中のポリペプ
チドの、以下からなる群から選択された配列中の少なくとも10の連続したアミ
ノ酸の配列に対して、少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チドと特異的に結合する抗体に対する特異的な結合の程度を決定する工程を含む
、上記の方法もまた、好ましい:配列番号Yのアミノ酸配列、ここで、Yは表1
に規定される任意の整数である;および表1におけるcDNAクローンIDによ
って同定されかつ表1のこのcDNAクローンについて示されるATCC受託番
号を有する寄託物に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされるタンパ
ク質の完全アミノ酸配列。
、この群から選択された配列と比較するこの工程は、このサンプル中のポリペプ
チドの、以下からなる群から選択された配列中の少なくとも10の連続したアミ
ノ酸の配列に対して、少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプ
チドと特異的に結合する抗体に対する特異的な結合の程度を決定する工程を含む
、上記の方法もまた、好ましい:配列番号Yのアミノ酸配列、ここで、Yは表1
に規定される任意の整数である;および表1におけるcDNAクローンIDによ
って同定されかつ表1のこのcDNAクローンについて示されるATCC受託番
号を有する寄託物に含まれるヒトcDNAクローンによってコードされるタンパ
ク質の完全アミノ酸配列。
【0202】 配列を比較するこの工程が、このサンプル中のポリペプチド分子から決定され
たアミノ酸配列を、この群から選択されたこの配列と比較することによって行わ
れる、上記の方法もまた好ましい。
たアミノ酸配列を、この群から選択されたこの配列と比較することによって行わ
れる、上記の方法もまた好ましい。
【0203】 生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する方法もまた好ましく、こ
こでこの方法は、以下からなる群から選択される配列における少なくとも10の
連続的したアミノ酸の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む上
記サンプル中のポリペプチド分子を(もしあれば)検出する工程を含む:配列番
号Yのアミノ酸配列、ここで、Yは表1に規定される任意の整数である;および
表1におけるcDNAクローンIDによって同定されかつ表1のこのcDNAク
ローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトcD
NAクローンによってコードされる、タンパク質の完全アミノ酸配列。
こでこの方法は、以下からなる群から選択される配列における少なくとも10の
連続的したアミノ酸の配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む上
記サンプル中のポリペプチド分子を(もしあれば)検出する工程を含む:配列番
号Yのアミノ酸配列、ここで、Yは表1に規定される任意の整数である;および
表1におけるcDNAクローンIDによって同定されかつ表1のこのcDNAク
ローンについて示されるATCC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトcD
NAクローンによってコードされる、タンパク質の完全アミノ酸配列。
【0204】 生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する上記の方法もまた好まし
く、ここでこの方法は、少なくとも2つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ
酸配列を含むポリペプチド分子を検出する工程を含み、ここでこのパネル中の少
なくとも1つの配列は、上記の群から選択された配列における少なくとも10の
連続したアミノ酸の配列と少なくとも90%同一である。
く、ここでこの方法は、少なくとも2つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ
酸配列を含むポリペプチド分子を検出する工程を含み、ここでこのパネル中の少
なくとも1つの配列は、上記の群から選択された配列における少なくとも10の
連続したアミノ酸の配列と少なくとも90%同一である。
【0205】 被験体において、表1において同定されたタンパク質をコードする遺伝子の異
常な構造または発現に関連する病的状態を診断する方法もまた、好ましい。ここ
で、この方法は、この被験体から得られた生物学的サンプルにおいて、少なくと
も2つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を
検出する工程を含み、ここでこのパネル中の少なくとも1つの配列は、以下から
なる群から選択される配列における少なくとも10の連続したアミノ酸の配列と
少なくとも90%同一である:配列番号Yのアミノ酸配列、ここで、Yは表1に
規定される任意の整数である;および表1におけるcDNAクローンIDによっ
て同定されかつ表1のこのcDNAクローンについて示されるATCC受託番号
を有する寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンによってコードされるタンパ
ク質の完全アミノ酸配列。
常な構造または発現に関連する病的状態を診断する方法もまた、好ましい。ここ
で、この方法は、この被験体から得られた生物学的サンプルにおいて、少なくと
も2つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を
検出する工程を含み、ここでこのパネル中の少なくとも1つの配列は、以下から
なる群から選択される配列における少なくとも10の連続したアミノ酸の配列と
少なくとも90%同一である:配列番号Yのアミノ酸配列、ここで、Yは表1に
規定される任意の整数である;および表1におけるcDNAクローンIDによっ
て同定されかつ表1のこのcDNAクローンについて示されるATCC受託番号
を有する寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンによってコードされるタンパ
ク質の完全アミノ酸配列。
【0206】 これらの方法のいずれかにおいて、このポリペプチド分子を検出する工程は、
抗体を使用することを包含する。
抗体を使用することを包含する。
【0207】 以下からなる群から選択された配列中の、少なくとも10の連続的なアミノ酸
の配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列と、少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む
、単離された核酸分子もまた、好ましい:配列番号Yのアミノ酸配列(ここで、
Yは表1に規定される任意の整数である);および表1におけるcDNAクロー
ンIDによって同定されかつ表1のこのcDNAクローンについて示されるAT
CC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンによってコード
されるタンパク質の完全アミノ酸配列。
の配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列と、少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む
、単離された核酸分子もまた、好ましい:配列番号Yのアミノ酸配列(ここで、
Yは表1に規定される任意の整数である);および表1におけるcDNAクロー
ンIDによって同定されかつ表1のこのcDNAクローンについて示されるAT
CC受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンによってコード
されるタンパク質の完全アミノ酸配列。
【0208】 ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、原核生物宿主でのこのポリペ
プチドの発現について最適化されている、単離された核酸分子もまた、好ましい
。
プチドの発現について最適化されている、単離された核酸分子もまた、好ましい
。
【0209】 また、ポリペプチドが以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単
離された核酸分子もまた、好ましい:配列番号Yのアミノ酸配列(ここで、Yは
表1に規定される任意の整数である);および表1におけるcDNAクローンI
Dによって同定されかつ表1のこのcDNAクローンについて示されるATCC
受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンによってコードされ
るタンパク質の完全アミノ酸配列。
離された核酸分子もまた、好ましい:配列番号Yのアミノ酸配列(ここで、Yは
表1に規定される任意の整数である);および表1におけるcDNAクローンI
Dによって同定されかつ表1のこのcDNAクローンについて示されるATCC
受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンによってコードされ
るタンパク質の完全アミノ酸配列。
【0210】 上記の単離された核酸分子のいずれかをベクター中に挿入する工程を含む、組
換えベクターの作製方法はさらに好ましい。この方法によって生成された組換え
ベクターも、好ましい。宿主細胞中にベクターを導入する工程を含む、組換え宿
主細胞を作製する方法、ならびにこの方法によって生成された組換え宿主細胞も
また、好ましい。
換えベクターの作製方法はさらに好ましい。この方法によって生成された組換え
ベクターも、好ましい。宿主細胞中にベクターを導入する工程を含む、組換え宿
主細胞を作製する方法、ならびにこの方法によって生成された組換え宿主細胞も
また、好ましい。
【0211】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、このポリペプチドが発現さ
れるような条件下でこの組換え宿主細胞を培養する工程、およびこのポリペプチ
ドを回収する工程を包含する、方法もまた、好ましい。単離されたポリペプチド
を作製するこの方法もまた好ましく、ここでこの組換え宿主細胞は真核細胞であ
り、そしてこのポリペプチドは、以下からなる群から選択されたアミノ酸配列を
含む、ヒト分泌タンパク質の分泌部分である:配列番号Yの分泌部分の第1のア
ミノ酸の位置の残基で始まる、配列番号Yのアミノ酸配列(ここで、Yは表1に
記載される整数であり、そして配列番号Yの分泌部分の第1のアミノ酸の位置は
表1に規定される);および表1におけるcDNAクローンIDによって同定さ
れかつ表1のこのcDNAクローンについて示されるATCC受託番号を有する
寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンによってコードされるタンパク質の分
泌部分のアミノ酸配列。この方法によって生成された単離されたポリペプチドも
また、好ましい。
れるような条件下でこの組換え宿主細胞を培養する工程、およびこのポリペプチ
ドを回収する工程を包含する、方法もまた、好ましい。単離されたポリペプチド
を作製するこの方法もまた好ましく、ここでこの組換え宿主細胞は真核細胞であ
り、そしてこのポリペプチドは、以下からなる群から選択されたアミノ酸配列を
含む、ヒト分泌タンパク質の分泌部分である:配列番号Yの分泌部分の第1のア
ミノ酸の位置の残基で始まる、配列番号Yのアミノ酸配列(ここで、Yは表1に
記載される整数であり、そして配列番号Yの分泌部分の第1のアミノ酸の位置は
表1に規定される);および表1におけるcDNAクローンIDによって同定さ
れかつ表1のこのcDNAクローンについて示されるATCC受託番号を有する
寄託物に含まれる、ヒトcDNAクローンによってコードされるタンパク質の分
泌部分のアミノ酸配列。この方法によって生成された単離されたポリペプチドも
また、好ましい。
【0212】 増加したレベルのタンパク質活性を必要とする個体を処置する方法もまた、好
ましい。ここで、この方法は、このような個体に、この個体においてこのタンパ
ク質の活性のレベルを増加させるのに有効な本願発明の単離されたポリペプチド
、ポリヌクレオチド、または抗体の量を含む薬学的組成物を投与する工程を包含
する。
ましい。ここで、この方法は、このような個体に、この個体においてこのタンパ
ク質の活性のレベルを増加させるのに有効な本願発明の単離されたポリペプチド
、ポリヌクレオチド、または抗体の量を含む薬学的組成物を投与する工程を包含
する。
【0213】 概して、本発明を記載してきたが、本発明は、例示の目的のために提供され、
そして限定を意図されない、以下の実施例を参照することによってより容易に理
解される。
そして限定を意図されない、以下の実施例を参照することによってより容易に理
解される。
【0214】 (実施例) (実施例1:選択されたcDNAクローンの寄託されたサンプルからの単離) 引用されるATCC寄託物中の各cDNAクローンは、プラスミドベクター中
に含まれる。表1は、各クローンが単離されたcDNAライブラリーを構築する
ために用いられたベクターを示す。多くの場合において、ライブラリーを構築す
るために使用されたベクターは、プラスミドが切り出されたファージベクターで
ある。直下の表は、cDNAライブラリーを構築する際に使用される各ファージ
ベクターについて関連するプラスミドを相関づける。例えば、特定のクローンが
ベクター「Lambda Zap」中に単離されていると表1に示される場合、
対応する寄託クローンは、「pBluescript」である。
に含まれる。表1は、各クローンが単離されたcDNAライブラリーを構築する
ために用いられたベクターを示す。多くの場合において、ライブラリーを構築す
るために使用されたベクターは、プラスミドが切り出されたファージベクターで
ある。直下の表は、cDNAライブラリーを構築する際に使用される各ファージ
ベクターについて関連するプラスミドを相関づける。例えば、特定のクローンが
ベクター「Lambda Zap」中に単離されていると表1に示される場合、
対応する寄託クローンは、「pBluescript」である。
【0215】
【表2】
【0216】 ベクターLambda Zap(米国特許第5,128,256号および同第
5,286,636号)、Uni−Zap XR(米国特許第5,128,25
6号および同第5,286,636号)、Zap Express(米国特許第
5,128,256号および同第5,286,636号)、pBluescri
pt(pBS)(Short,J.M.ら、Nucleic Acids Re
s.16:7583−7600(1988);Alting−Mees,M.A
.およびShort,J.M.、Nucleic Acids Res.17:
9494(1989))ならびにpBK(Alting−Mees,M.A.ら
、Strategies 5:58−61(1992))は、Stratage
ne Cloning Systems,Inc.、11011 N.Torr
ey Pines Road、La Jolla,CA,92037から市販さ
れている。pBSは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてpBKはネオマイ
シン耐性遺伝子を含む。両方とも、E.coli株XL−1 Blue(これも
また、Stratageneから入手可能である)に形質転換され得る。pBS
は、SK+、SK−、KS+およびKSの4形態で入荷する。SおよびKとは、
ポリリンカー領域(「S」とはSacIであり、そして「K」とは、KpnIの
ことであり、これらは、それぞれのリンカーの各末端での最初の部位である)に
隣接するT7およびT3プライマー配列に対するポリリンカーの配向をいう。「
+」または「−」とは、ある方向においてf1 oriから開始される一本鎖レ
スキューがセンス鎖DNAを生成し、そして他方においてアンチセンス鎖DNA
を生成するようなf1複製起点(「ori」)の配向をいう。
5,286,636号)、Uni−Zap XR(米国特許第5,128,25
6号および同第5,286,636号)、Zap Express(米国特許第
5,128,256号および同第5,286,636号)、pBluescri
pt(pBS)(Short,J.M.ら、Nucleic Acids Re
s.16:7583−7600(1988);Alting−Mees,M.A
.およびShort,J.M.、Nucleic Acids Res.17:
9494(1989))ならびにpBK(Alting−Mees,M.A.ら
、Strategies 5:58−61(1992))は、Stratage
ne Cloning Systems,Inc.、11011 N.Torr
ey Pines Road、La Jolla,CA,92037から市販さ
れている。pBSは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてpBKはネオマイ
シン耐性遺伝子を含む。両方とも、E.coli株XL−1 Blue(これも
また、Stratageneから入手可能である)に形質転換され得る。pBS
は、SK+、SK−、KS+およびKSの4形態で入荷する。SおよびKとは、
ポリリンカー領域(「S」とはSacIであり、そして「K」とは、KpnIの
ことであり、これらは、それぞれのリンカーの各末端での最初の部位である)に
隣接するT7およびT3プライマー配列に対するポリリンカーの配向をいう。「
+」または「−」とは、ある方向においてf1 oriから開始される一本鎖レ
スキューがセンス鎖DNAを生成し、そして他方においてアンチセンス鎖DNA
を生成するようなf1複製起点(「ori」)の配向をいう。
【0217】 ベクターpSport1、pCMVSport2.0およびpCMVSpor
t3.0をLife Technologies、Inc.、P.O.Box6
009、Gaithersburg,MD 20897から入手した。全てのS
portベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてE.coli株DH
10B(これもまた、Life Technologiesから入手可能である
)に形質転換され得る。(例えば、Gruber,C.E.ら、Focus 1
5:59(1993)を参照のこと)。ベクターlafmid BA(Bent
o Soares、Columbia University、NY)は、アン
ピシリン耐性遺伝子を含み、そしてE.coli株XL−1 Blueに形質転
換され得る。ベクターpCR(登録商標)2.1(これはInvitrogen
、1600 Faraday Avenue、Carlsbad、CA 920
08から入手可能である)は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてE.co
li株DH10B(Life Technologiesから入手可能である)
に形質転換され得る(例えば、Clark,J.M.、Nuc.Acids R
es.16:9677−9686(1988)およびMead,D.ら、Bio
/Technology 9:(1991)を参照のこと)。好ましくは、本発
明のポリヌクレオチドは、表1における特定のクローンについて同定されたファ
ージベクター配列、ならびに上記に示された対応するプラスミドベクター配列を
含まない。
t3.0をLife Technologies、Inc.、P.O.Box6
009、Gaithersburg,MD 20897から入手した。全てのS
portベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてE.coli株DH
10B(これもまた、Life Technologiesから入手可能である
)に形質転換され得る。(例えば、Gruber,C.E.ら、Focus 1
5:59(1993)を参照のこと)。ベクターlafmid BA(Bent
o Soares、Columbia University、NY)は、アン
ピシリン耐性遺伝子を含み、そしてE.coli株XL−1 Blueに形質転
換され得る。ベクターpCR(登録商標)2.1(これはInvitrogen
、1600 Faraday Avenue、Carlsbad、CA 920
08から入手可能である)は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてE.co
li株DH10B(Life Technologiesから入手可能である)
に形質転換され得る(例えば、Clark,J.M.、Nuc.Acids R
es.16:9677−9686(1988)およびMead,D.ら、Bio
/Technology 9:(1991)を参照のこと)。好ましくは、本発
明のポリヌクレオチドは、表1における特定のクローンについて同定されたファ
ージベクター配列、ならびに上記に示された対応するプラスミドベクター配列を
含まない。
【0218】 表1に引用される、任意の所定のcDNAクローンについてATCC受託番号
を与えられたサンプルにおける寄託された物質はまた、1つ以上のさらなるプラ
スミド(これは各々、その所定のクローンとは異なるcDNAクローンを含む)
を含み得る。従って、同じATCC受託番号を共有する寄託物は、表1に示され
る各cDNAクローンのためのプラスミドを少なくとも含む。代表的には、表1
に引用される各ATCC寄託物のサンプルは、ほぼ等量(重量で)の約50個の
プラスミドDNA(これは各々、異なるcDNAクローンを含む)の混合物を含
む;しかし、このような寄託サンプルは、50個よりも多いかまたは少ないcD
NAクローン(約500個までのcDNAクローン)のためのプラスミドを含み
得る。
を与えられたサンプルにおける寄託された物質はまた、1つ以上のさらなるプラ
スミド(これは各々、その所定のクローンとは異なるcDNAクローンを含む)
を含み得る。従って、同じATCC受託番号を共有する寄託物は、表1に示され
る各cDNAクローンのためのプラスミドを少なくとも含む。代表的には、表1
に引用される各ATCC寄託物のサンプルは、ほぼ等量(重量で)の約50個の
プラスミドDNA(これは各々、異なるcDNAクローンを含む)の混合物を含
む;しかし、このような寄託サンプルは、50個よりも多いかまたは少ないcD
NAクローン(約500個までのcDNAクローン)のためのプラスミドを含み
得る。
【0219】 表1における特定のクローンについて引用されるプラスミドDNAの寄託サン
プルからそのクローンを単離するために2つのアプローチが使用され得る。第一
に、プラスミドを、配列番号Xに対応するポリヌクレオチドプローブを使用して
、クローンをスクリーニングすることによって直接単離する。
プルからそのクローンを単離するために2つのアプローチが使用され得る。第一
に、プラスミドを、配列番号Xに対応するポリヌクレオチドプローブを使用して
、クローンをスクリーニングすることによって直接単離する。
【0220】 特に、30〜40ヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドを、報告され
ている配列に従って、Applied BiosystemsのDNA合成装置
を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば、32P−γ−ATPで、T
4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、そして慣用の方法に従って精製す
る。(例えば、Maniatisら、Molecular Cloning:A
Laboratory Manual、Cold Spring Harbo
r Press、Cold Spring、NY(1982))。プラスミド混
合物を、当業者に公知の技術(例えば、ベクター供給者によって提供される技術
または上記で引用された関連の刊行物もしくは特許において提供される技術)を
用いて、上記のような適切な宿主(例えば、XL−1 Blue(Strata
gene))に形質転換する。形質転換体を1.5%寒天プレート(適切な選択
薬剤、例えば、アンピシリンを含む)に、1プレートあたり約150の形質転換
体(コロニー)の密度でプレートする。これらのプレートを、細菌コロニースク
リーニングについての慣用の方法(例えば、Sambrookら、Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual、第2版、
(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory
Press、1.93〜1.104頁)または当業者に公知の他の技術に従っ
て、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
ている配列に従って、Applied BiosystemsのDNA合成装置
を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば、32P−γ−ATPで、T
4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、そして慣用の方法に従って精製す
る。(例えば、Maniatisら、Molecular Cloning:A
Laboratory Manual、Cold Spring Harbo
r Press、Cold Spring、NY(1982))。プラスミド混
合物を、当業者に公知の技術(例えば、ベクター供給者によって提供される技術
または上記で引用された関連の刊行物もしくは特許において提供される技術)を
用いて、上記のような適切な宿主(例えば、XL−1 Blue(Strata
gene))に形質転換する。形質転換体を1.5%寒天プレート(適切な選択
薬剤、例えば、アンピシリンを含む)に、1プレートあたり約150の形質転換
体(コロニー)の密度でプレートする。これらのプレートを、細菌コロニースク
リーニングについての慣用の方法(例えば、Sambrookら、Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual、第2版、
(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory
Press、1.93〜1.104頁)または当業者に公知の他の技術に従っ
て、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
【0221】 あるいは、配列番号Xの両端(すなわち、表1に規定されるクローンの5’N
Tおよび3’NTによって囲まれる配列番号Xの領域内)に由来する、17〜2
0ヌクレオチドの2つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託さ
れたcDNAプラスミドを鋳型として用いて、所望のcDNAを増幅する。ポリ
メラーゼ連鎖反応を、慣用の条件下で、例えば、0.5μgの上記cDNA鋳型
との反応混合物の25μl中で実施する。簡便な反応混合物は、1.5〜5mM
MgCl2、0.01%(w/v)ゼラチン、それぞれ20μMのdATP、 dCTP、dGTP、dTTP、25pmolの各プライマーおよび0.25ユ
ニットのTaqポリメラーゼである。35サイクルのPCR(94℃での変性を
1分間;55℃でのアニールを1分間;72℃での伸長を1分間)を、Perk
in−Elmer Cetus自動化サーマルサイクラーを用いて実施する。増
幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そして予想される分子量のDN
Aバンドを切り出し、そして精製する。PCR産物を、DNA産物をサブクロー
ニングおよび配列決定することによって選択された配列であることを確認する。
Tおよび3’NTによって囲まれる配列番号Xの領域内)に由来する、17〜2
0ヌクレオチドの2つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託さ
れたcDNAプラスミドを鋳型として用いて、所望のcDNAを増幅する。ポリ
メラーゼ連鎖反応を、慣用の条件下で、例えば、0.5μgの上記cDNA鋳型
との反応混合物の25μl中で実施する。簡便な反応混合物は、1.5〜5mM
MgCl2、0.01%(w/v)ゼラチン、それぞれ20μMのdATP、 dCTP、dGTP、dTTP、25pmolの各プライマーおよび0.25ユ
ニットのTaqポリメラーゼである。35サイクルのPCR(94℃での変性を
1分間;55℃でのアニールを1分間;72℃での伸長を1分間)を、Perk
in−Elmer Cetus自動化サーマルサイクラーを用いて実施する。増
幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そして予想される分子量のDN
Aバンドを切り出し、そして精製する。PCR産物を、DNA産物をサブクロー
ニングおよび配列決定することによって選択された配列であることを確認する。
【0222】 寄託されたクローンに存在し得ない遺伝子の5’非コード部分または3’非コ
ード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これらの方法は、
以下を含むがこれらに限定されない:フィルタープローブ探索、特異的プローブ
を使用するクローン富化、および当該分野で周知である5’および3’「RAC
E」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、5’RACEに
類似する方法は、所望の全長転写物の5’末端の欠失を生成するために利用可能
である(Fromont−Racineら、Nucleic Acids Re
s. 21(7):1683−1684(1993))。
ード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これらの方法は、
以下を含むがこれらに限定されない:フィルタープローブ探索、特異的プローブ
を使用するクローン富化、および当該分野で周知である5’および3’「RAC
E」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、5’RACEに
類似する方法は、所望の全長転写物の5’末端の欠失を生成するために利用可能
である(Fromont−Racineら、Nucleic Acids Re
s. 21(7):1683−1684(1993))。
【0223】 簡潔には、特定のRNAオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子RNA転写物をお
そらく含むRNAの集団の5’末端に連結する。連結されたRNAオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライ
マーを含むプライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の5’部分をPCR
増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全
長遺伝子を生成し得る。
そらく含むRNAの集団の5’末端に連結する。連結されたRNAオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライ
マーを含むプライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の5’部分をPCR
増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全
長遺伝子を生成し得る。
【0224】 この上記の方法は、所望の供給源から単離された全RNAを用いて開始するが
、ポリA+RNAをも使用し得る。次いで、RNA調製物を、必要ならばホスフ
ァターゼで処理して、後のRNAリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷RN
Aの5’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであ
り、そしてRNAをメッセンジャーRNAの5’末端に存在するキャップ構造を
除去するために、タバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。こ
の反応は、次いでT4 RNAリガーゼを用いてRNAオリゴヌクレオチドに連
結され得る、キャップ切断RNAの5’末端に5’リン酸基を残す。
、ポリA+RNAをも使用し得る。次いで、RNA調製物を、必要ならばホスフ
ァターゼで処理して、後のRNAリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷RN
Aの5’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであ
り、そしてRNAをメッセンジャーRNAの5’末端に存在するキャップ構造を
除去するために、タバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。こ
の反応は、次いでT4 RNAリガーゼを用いてRNAオリゴヌクレオチドに連
結され得る、キャップ切断RNAの5’末端に5’リン酸基を残す。
【0225】 この改変型RNA調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖cDNA合成のための鋳型として使用する。第一鎖合成反応物を、連結され
たRNAオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の
配列に特異的なプライマーを用いる、所望の5’末端のPCR増幅のための鋳型
として使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そして分析して5’末
端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。
一鎖cDNA合成のための鋳型として使用する。第一鎖合成反応物を、連結され
たRNAオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の
配列に特異的なプライマーを用いる、所望の5’末端のPCR増幅のための鋳型
として使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そして分析して5’末
端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。
【0226】 (実施例2:ポリヌクレオチドに対応するゲノムクローンの単離) ヒトゲノムP1ライブラリー(Genomic Systems、Inc.)
を、実施例1に記載される方法に従って、配列番号Xに対応するcDNA配列に
ついて選択されたプライマーを用いるPCRによってスクリーニングする(Sa
mbrookもまた参照のこと)。
を、実施例1に記載される方法に従って、配列番号Xに対応するcDNA配列に
ついて選択されたプライマーを用いるPCRによってスクリーニングする(Sa
mbrookもまた参照のこと)。
【0227】 (実施例3:ポリペプチドの組織分布) 本発明のポリヌクレオチドのmRNA発現の組織分布を、とりわけ、Samb
rookらによって記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用
いて決定する。例えば、実施例1に記載される方法によって生成されるcDNA
プローブを、rediprimeTM DNA labeling system
(Amersham Life Science)を用いて、製造者の指示に従
って、P32で標識する。標識後、プローブを、CHROMA SPIN−100 TM カラム(Clontech Laboratories、Inc.)を使用し
て、製造者のプロトコル番号PT1200−1に従って精製する。次いで、この
精製した標識プローブを使用して、種々のヒト組織をmRNA発現について試験
する。
rookらによって記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用
いて決定する。例えば、実施例1に記載される方法によって生成されるcDNA
プローブを、rediprimeTM DNA labeling system
(Amersham Life Science)を用いて、製造者の指示に従
って、P32で標識する。標識後、プローブを、CHROMA SPIN−100 TM カラム(Clontech Laboratories、Inc.)を使用し
て、製造者のプロトコル番号PT1200−1に従って精製する。次いで、この
精製した標識プローブを使用して、種々のヒト組織をmRNA発現について試験
する。
【0228】 種々のヒト組織(H)またはヒト免疫系組織(IM)を含む多重組織ノーザン
(MTN)ブロット(Clontech)を、ExpressHybTMハイブリ
ダイゼーション溶液(Clontech)を用いて、製造者のプロトコル番号P
T1190−1に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄後、ブロットをマウントして、そして−70℃で一晩フィルムに曝露し
、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
(MTN)ブロット(Clontech)を、ExpressHybTMハイブリ
ダイゼーション溶液(Clontech)を用いて、製造者のプロトコル番号P
T1190−1に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄後、ブロットをマウントして、そして−70℃で一晩フィルムに曝露し
、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【0229】 (実施例4:ポリヌクレオチドの染色体マッピング) オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号Xの5’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約100ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する:95℃で30秒;56℃で1分;70℃で1分。このサイクルを
32回反復し、次いで1回、70℃で5分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル(Bios, Inc
)に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのDNAを鋳型として使用する。
反応物を、8%ポリアクリルアミドゲルまたは3.5%アガロースゲルのいずれ
かで分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約10
0bpのPCRフラグメントの存在によって決定する。
って設計する。このプライマーは、好ましくは約100ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する:95℃で30秒;56℃で1分;70℃で1分。このサイクルを
32回反復し、次いで1回、70℃で5分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル(Bios, Inc
)に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのDNAを鋳型として使用する。
反応物を、8%ポリアクリルアミドゲルまたは3.5%アガロースゲルのいずれ
かで分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約10
0bpのPCRフラグメントの存在によって決定する。
【0230】 (実施例5:ポリペプチドの細菌発現) 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、実施例1に概説する
ように、DNA配列の5’および3’末端に対応するPCRオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して増幅し、挿入フラグメントを合成する。cDNA挿入物を
増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクターに増幅産物をクローニン
グするために、好ましくはプライマーの5’末端にBamHIおよびXbaIの
ような制限部位を含むべきである。例えば、BamHIおよびXbaIは、細菌
発現ベクターpQE−9(Qiagen,Inc.,Chatsworth,C
A)の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性(A
mpr)、細菌の複製起点(ori)、IPTGで調節可能なプロモーター/オ ペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6−ヒスチジンタグ(
6−His)、および制限酵素クローニング部位をコードする。
ように、DNA配列の5’および3’末端に対応するPCRオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して増幅し、挿入フラグメントを合成する。cDNA挿入物を
増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクターに増幅産物をクローニン
グするために、好ましくはプライマーの5’末端にBamHIおよびXbaIの
ような制限部位を含むべきである。例えば、BamHIおよびXbaIは、細菌
発現ベクターpQE−9(Qiagen,Inc.,Chatsworth,C
A)の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性(A
mpr)、細菌の複製起点(ori)、IPTGで調節可能なプロモーター/オ ペレーター(P/O)、リボソーム結合部位(RBS)、6−ヒスチジンタグ(
6−His)、および制限酵素クローニング部位をコードする。
【0231】 pQE−9ベクターをBamHIおよびXbaIで消化し、そして、増幅され
たフラグメントを細菌性RBSにおいて開始されるリーディングフレームを維持
するpQE−9ベクターに連結する。次いで、連結混合物を、lacIリプレッ
サーを発現し、またカナマイシン耐性(Kanr)を与えるプラスミドpREP 4の多重コピーを含む、E.coli株M15/rep4(Qiagen,In
c.)を形質転換するために使用する。形質転換体を、それらのLBプレート上
で生育できる能力によって同定し、そしてアンピシリン/カナマイシン耐性コロ
ニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、そして制限分析によって確認する
。
たフラグメントを細菌性RBSにおいて開始されるリーディングフレームを維持
するpQE−9ベクターに連結する。次いで、連結混合物を、lacIリプレッ
サーを発現し、またカナマイシン耐性(Kanr)を与えるプラスミドpREP 4の多重コピーを含む、E.coli株M15/rep4(Qiagen,In
c.)を形質転換するために使用する。形質転換体を、それらのLBプレート上
で生育できる能力によって同定し、そしてアンピシリン/カナマイシン耐性コロ
ニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、そして制限分析によって確認する
。
【0232】 所望の構築物を含むクローンを、Amp(100μg/ml)およびKan(
25μg/ml)の両方を補充したLB培地における液体培養で一晩(O/N)
増殖させる。O/N培養物を、1:100〜1:250の比で大量培養に接種す
るために使用する。細胞を、0.4〜0.6の間の吸光度600(O.D.600 )まで増殖させる。次いで、IPTG(イソプロピル−B−D−チオガラクトピ
ラノシド)を最終濃度1mMになるように加える。IPTGは、lacIリプレ
ッサーの不活化によりP/Oの活性化(clearing)を誘導し、遺伝子発
現の増加を導く。
25μg/ml)の両方を補充したLB培地における液体培養で一晩(O/N)
増殖させる。O/N培養物を、1:100〜1:250の比で大量培養に接種す
るために使用する。細胞を、0.4〜0.6の間の吸光度600(O.D.600 )まで増殖させる。次いで、IPTG(イソプロピル−B−D−チオガラクトピ
ラノシド)を最終濃度1mMになるように加える。IPTGは、lacIリプレ
ッサーの不活化によりP/Oの活性化(clearing)を誘導し、遺伝子発
現の増加を導く。
【0233】 細胞を、さらに3〜4時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離(6000×
gで20分間)によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック試薬である
6MグアニジンHCl中に、4℃で3〜4時間攪拌することによって可溶化させ
る。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、
ニッケル−ニトリロ−三酢酸(「Ni−NTA」)アフィニティー樹脂カラムに
ロードする(QIAGEN,Inc.前出より入手可能)。6×Hisタグを有
するタンパク質は、Ni−NTA樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な1工
程手順で精製され得る(詳細については、The QIAexpression
ist(1995)QIAGEN,Inc.,前出を参照のこと)。
gで20分間)によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック試薬である
6MグアニジンHCl中に、4℃で3〜4時間攪拌することによって可溶化させ
る。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、
ニッケル−ニトリロ−三酢酸(「Ni−NTA」)アフィニティー樹脂カラムに
ロードする(QIAGEN,Inc.前出より入手可能)。6×Hisタグを有
するタンパク質は、Ni−NTA樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な1工
程手順で精製され得る(詳細については、The QIAexpression
ist(1995)QIAGEN,Inc.,前出を参照のこと)。
【0234】 手短に言えば、上清を、6Mグアニジン−HCl、pH8のカラムにロードし
、カラムを、最初に10容量の6Mグアニジン−HCl、pH8で洗浄し、次い
で10容量の6Mグアニジン−HCl、pH6で洗浄し、最後にポリペプチドを
、6Mグアニジン−HCl、pH5で溶出する。
、カラムを、最初に10容量の6Mグアニジン−HCl、pH8で洗浄し、次い
で10容量の6Mグアニジン−HCl、pH6で洗浄し、最後にポリペプチドを
、6Mグアニジン−HCl、pH5で溶出する。
【0235】 次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)または5
0mM酢酸ナトリウム、pH6の緩衝液および200mM NaClに対して透
析することにより再生させる。あるいは、タンパク質はNi−NTAカラムに固
定化している間に、首尾よく再折り畳みされ得る。推奨条件は以下の通りである
:プロテアーゼインヒビターを含む、500mM NaCl、20%グリセロー
ル、20mM Tris/HCl pH7.4中の6M〜1M尿素の直線勾配を
使用する再生。再生は1.5時間以上の時間をかけて行うべきである。再生後、
タンパク質を250mMイミダゾールの添加によって溶出する。イミダゾールを
、PBSまたは50mM酢酸ナトリウムpH6の緩衝液および200mM Na
Clに対する最終の透析工程によって除去する。精製したタンパク質を、4℃で
保存するか、または−80℃で凍結する。
0mM酢酸ナトリウム、pH6の緩衝液および200mM NaClに対して透
析することにより再生させる。あるいは、タンパク質はNi−NTAカラムに固
定化している間に、首尾よく再折り畳みされ得る。推奨条件は以下の通りである
:プロテアーゼインヒビターを含む、500mM NaCl、20%グリセロー
ル、20mM Tris/HCl pH7.4中の6M〜1M尿素の直線勾配を
使用する再生。再生は1.5時間以上の時間をかけて行うべきである。再生後、
タンパク質を250mMイミダゾールの添加によって溶出する。イミダゾールを
、PBSまたは50mM酢酸ナトリウムpH6の緩衝液および200mM Na
Clに対する最終の透析工程によって除去する。精製したタンパク質を、4℃で
保存するか、または−80℃で凍結する。
【0236】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドに
作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含
む、pHE4aと呼ばれる発現ベクターを含む(ATCC受託番号209645
、1998年2月25日に寄託。)。このベクターは以下を含む:1)選択マー
カーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、2)E.coli
複製起点、3)T5ファージプロモーター配列、4)2つのlacオペレーター
配列、5)シャイン−ダルガーノ配列、および6)ラクトースオペロンリプレッ
サー遺伝子(lacIq)。複製起点(oriC)は、pUC19(LTI,G
aithersburg,MD)に由来する。プロモーター配列およびオペレー
ター配列を合成的に作製する。
作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含
む、pHE4aと呼ばれる発現ベクターを含む(ATCC受託番号209645
、1998年2月25日に寄託。)。このベクターは以下を含む:1)選択マー
カーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、2)E.coli
複製起点、3)T5ファージプロモーター配列、4)2つのlacオペレーター
配列、5)シャイン−ダルガーノ配列、および6)ラクトースオペロンリプレッ
サー遺伝子(lacIq)。複製起点(oriC)は、pUC19(LTI,G
aithersburg,MD)に由来する。プロモーター配列およびオペレー
ター配列を合成的に作製する。
【0237】 NdeIおよびXbaI、BamHI、XhoI、またはAsp718によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きなフラグ
メント(スタッファー(stuffer)フラグメントは約310塩基対である
べきである)を単離することによって、DNAをpHEaに挿入し得る。DNA
挿入物を、NdeI(5’プライマー)およびXbaI、BamHI、XhoI
、またはAsp718(3’プライマー)に対する制限部位を有するPCRプラ
イマーを使用して、実施例1に記載のPCRプロトコールに従って生成する。P
CR挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物および
ベクターを標準的なプロトコールに従って連結する。
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きなフラグ
メント(スタッファー(stuffer)フラグメントは約310塩基対である
べきである)を単離することによって、DNAをpHEaに挿入し得る。DNA
挿入物を、NdeI(5’プライマー)およびXbaI、BamHI、XhoI
、またはAsp718(3’プライマー)に対する制限部位を有するPCRプラ
イマーを使用して、実施例1に記載のPCRプロトコールに従って生成する。P
CR挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物および
ベクターを標準的なプロトコールに従って連結する。
【0238】 操作されたベクターは、上記のプロトコールにおいて、細菌系でタンパク質を
発現させるために容易に置換され得る。
発現させるために容易に置換され得る。
【0239】 (実施例6:封入体からのポリペプチドの精製) 以下の代替的な方法は、ポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、E.
coli中で発現されたポリペプチドを精製するために使用され得る。他に指定
されない場合には、以下のすべての工程は4〜10℃で行われる。
coli中で発現されたポリペプチドを精製するために使用され得る。他に指定
されない場合には、以下のすべての工程は4〜10℃で行われる。
【0240】 E.coli発酵の生産期の完了後、細胞培養物を4〜10℃に冷却し、そし
て15,000rpmの連続遠心分離(Heraeus Sepatech)に
よって細胞を収集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量(重量による)を、100mM Tris、50mM EDTA、pH7.
4を含む緩衝溶液に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁液
に分散させる。
て15,000rpmの連続遠心分離(Heraeus Sepatech)に
よって細胞を収集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量(重量による)を、100mM Tris、50mM EDTA、pH7.
4を含む緩衝溶液に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁液
に分散させる。
【0241】 次いで、細胞をマイクロフルイダイザー(microfluidizer)(
Microfuidics,Corp.またはAPV Gaulin,Inc.
)に2回、4000〜6000psiで溶液を通すことによって溶解する。次い
でホモジネートを、最終濃度0.5M NaClになるようにNaCl溶液と混
合し、続いて7000×gで15分間遠心分離を行う。得られたペレットを、0
.5M NaCl、100mM Tris、50mM EDTA、pH7.4を
使用して再度洗浄する。
Microfuidics,Corp.またはAPV Gaulin,Inc.
)に2回、4000〜6000psiで溶液を通すことによって溶解する。次い
でホモジネートを、最終濃度0.5M NaClになるようにNaCl溶液と混
合し、続いて7000×gで15分間遠心分離を行う。得られたペレットを、0
.5M NaCl、100mM Tris、50mM EDTA、pH7.4を
使用して再度洗浄する。
【0242】 得られた洗浄した封入体を、1.5M塩酸グアニジン(GuHCl)で2〜4
時間可溶化する。7000×gで15分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し、
そしてポリペプチドを含む上清を4℃で一晩インキュベートしてさらなるGuH
Cl抽出を可能にする。
時間可溶化する。7000×gで15分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し、
そしてポリペプチドを含む上清を4℃で一晩インキュベートしてさらなるGuH
Cl抽出を可能にする。
【0243】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離(30,000×g)に続き、Gu
HCl可溶化タンパク質を、GuHCl抽出物と、50mMナトリウム、pH4
.5、150mM NaCl、2mM EDTAを含む20容量の緩衝液とを、
激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希釈
タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の12時間、混合しないで4℃で保つ
。
HCl可溶化タンパク質を、GuHCl抽出物と、50mMナトリウム、pH4
.5、150mM NaCl、2mM EDTAを含む20容量の緩衝液とを、
激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希釈
タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の12時間、混合しないで4℃で保つ
。
【0244】 再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄にするために、予め調製した40mM
酢酸ナトリウム、pH6.0で平衡化された、適切な表面積を有する0.16μ
mメンブレンフィルターを備える接触濾過ユニット(tangential f
iltration unit)(例えば、Filtron)を使用する。濾過
したサンプルを、カチオン交換樹脂(例えば、Poros HS−50,Per
septive Biosystems)上にロードする。カラムを40mM酢
酸ナトリウム、pH6.0で洗浄し、そして同じ緩衝液中の250mM、500
mM、1000mM、および1500mM NaClで、段階的な様式で溶出す
る。溶出液の280nmにおける吸光度を継続的にモニターする。画分を収集し
、そしてSDS−PAGEによってさらに分析する。
酢酸ナトリウム、pH6.0で平衡化された、適切な表面積を有する0.16μ
mメンブレンフィルターを備える接触濾過ユニット(tangential f
iltration unit)(例えば、Filtron)を使用する。濾過
したサンプルを、カチオン交換樹脂(例えば、Poros HS−50,Per
septive Biosystems)上にロードする。カラムを40mM酢
酸ナトリウム、pH6.0で洗浄し、そして同じ緩衝液中の250mM、500
mM、1000mM、および1500mM NaClで、段階的な様式で溶出す
る。溶出液の280nmにおける吸光度を継続的にモニターする。画分を収集し
、そしてSDS−PAGEによってさらに分析する。
【0245】 次いでポリペプチドを含む画分をプールし、そして4容量の水と混合する。次
いで希釈されたサンプルを、予め調製した強アニオン(Poros HQ−50
,Perseptive Biosystems)および弱アニオン(Poro
s CM−20,Perseptive Biosystems)交換樹脂の直
列カラムのセットにロードする。カラムを40mM酢酸ナトリウム、pH6.0
で平衡化する。両方のカラムを、40mM酢酸ナトリウム、pH6.0、200
mM NaClで洗浄する。次いでCM−20カラムを、10カラム容量の直線
的勾配(0.2M NaCl、50mM酢酸ナトリウム、pH6.0から1.0
M NaCl、50mM酢酸ナトリウム、pH6.5の範囲)を用いて溶出する
。画分を、溶出液の定常A280モニタリング下で収集する。次いで、(例えば、 16%SDS−PAGEによって判明した)ポリペプチドを含む画分をプールす
る。
いで希釈されたサンプルを、予め調製した強アニオン(Poros HQ−50
,Perseptive Biosystems)および弱アニオン(Poro
s CM−20,Perseptive Biosystems)交換樹脂の直
列カラムのセットにロードする。カラムを40mM酢酸ナトリウム、pH6.0
で平衡化する。両方のカラムを、40mM酢酸ナトリウム、pH6.0、200
mM NaClで洗浄する。次いでCM−20カラムを、10カラム容量の直線
的勾配(0.2M NaCl、50mM酢酸ナトリウム、pH6.0から1.0
M NaCl、50mM酢酸ナトリウム、pH6.5の範囲)を用いて溶出する
。画分を、溶出液の定常A280モニタリング下で収集する。次いで、(例えば、 16%SDS−PAGEによって判明した)ポリペプチドを含む画分をプールす
る。
【0246】 得られたポリペプチドは、上記の再折畳みおよび精製工程の後で95%より高
い純度を示すべきである。5μgの精製タンパク質がロードされる場合、いかな
る主たる夾雑バンドも、クマシーブルー染色した16%SDS−PAGEゲルか
ら観察されないはずである。精製タンパク質はまた、エンドトキシン/LPS夾
雑物について試験され得、そして代表的には、LPS含量はLALアッセイに従
って、0.1ng/ml未満である。
い純度を示すべきである。5μgの精製タンパク質がロードされる場合、いかな
る主たる夾雑バンドも、クマシーブルー染色した16%SDS−PAGEゲルか
ら観察されないはずである。精製タンパク質はまた、エンドトキシン/LPS夾
雑物について試験され得、そして代表的には、LPS含量はLALアッセイに従
って、0.1ng/ml未満である。
【0247】 (実施例7:バキュロウイルス発現系におけるポリペプチドのクローニングお
よび発現) この実施例では、ポリペプチドを発現するために、プラスミドシャトルベクタ
ーpA2を使用してポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入する。この発現
ベクターは、Autographa californica核多核体病ウイル
ス(AcMNPV)の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてBamHI、X
baI、およびAsp718のような便利な制限部位を含む。シミアンウイルス
40(「SV40」)のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のため
に使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは、同方向にあ
る弱いDrosophilaプロモーターの制御下でE.coli由来のβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを
含む。挿入された遺伝子は、クローニングしたポリヌクレオチドを発現する生存
可能なウイルスを生成する、野生型ウイルスDNAとの細胞媒介性の相同組換え
のためのウイルス配列と両側で隣接する。
よび発現) この実施例では、ポリペプチドを発現するために、プラスミドシャトルベクタ
ーpA2を使用してポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入する。この発現
ベクターは、Autographa californica核多核体病ウイル
ス(AcMNPV)の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてBamHI、X
baI、およびAsp718のような便利な制限部位を含む。シミアンウイルス
40(「SV40」)のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のため
に使用する。組換えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは、同方向にあ
る弱いDrosophilaプロモーターの制御下でE.coli由来のβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを
含む。挿入された遺伝子は、クローニングしたポリヌクレオチドを発現する生存
可能なウイルスを生成する、野生型ウイルスDNAとの細胞媒介性の相同組換え
のためのウイルス配列と両側で隣接する。
【0248】 多くの他のバキュロウイルスベクター(例えば、pAc373、pVL941
、およびpAcIM1)は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル(必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなAUGを含む)を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Lucko
wら、Virology 170:31−39(1989)に記載される。
、およびpAcIM1)は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル(必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなAUGを含む)を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Lucko
wら、Virology 170:31−39(1989)に記載される。
【0249】 具体的には、寄託されたクローンに含まれるcDNA配列(これは、表1に示
されるAUG開始コドンおよびネイティブに付随するリーダー配列を含む)を、
実施例1に記載されるPCRプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在する
シグナル配列を使用して分泌タンパク質を産生する場合、pA2ベクターは第2
のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、ベクターは、Summersら
、「A Manual of Methods for Baculoviru
s Vectors and Insect Cell Culture Pr
ocedures」、Texas Agricultural Experim
ental Station Bulletin No.1555(1987)
に記載される標準的な方法を用いて、バキュロウイルスリーダー配列を含むよう
に改変され得る(pA2 GP)。
されるAUG開始コドンおよびネイティブに付随するリーダー配列を含む)を、
実施例1に記載されるPCRプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在する
シグナル配列を使用して分泌タンパク質を産生する場合、pA2ベクターは第2
のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、ベクターは、Summersら
、「A Manual of Methods for Baculoviru
s Vectors and Insect Cell Culture Pr
ocedures」、Texas Agricultural Experim
ental Station Bulletin No.1555(1987)
に記載される標準的な方法を用いて、バキュロウイルスリーダー配列を含むよう
に改変され得る(pA2 GP)。
【0250】 増幅されたフラグメントを、市販のキット(「Geneclean」BIO
101 Inc.,La Jolla,Ca)を使用して、1%アガロースゲル
から単離する。次いでフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再度1%
アガロースゲルで精製する。
101 Inc.,La Jolla,Ca)を使用して、1%アガロースゲル
から単離する。次いでフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再度1%
アガロースゲルで精製する。
【0251】 プラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公
知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。
次いでDNAを、市販のキット(「Geneclean」BIO 101 In
c.,La Jolla,Ca)を使用して、1%アガロースゲルから単離する
。
知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。
次いでDNAを、市販のキット(「Geneclean」BIO 101 In
c.,La Jolla,Ca)を使用して、1%アガロースゲルから単離する
。
【0252】 フラグメントおよび脱リン酸化したプラスミドを、T4 DNAリガーゼを用
いて互いに連結する。E.coli HB101またはXL−1 Blue(S
tratagene Cloning Systems,La Jolla,C
A)細胞のような他の適切なE.coli宿主を、連結混合液で形質転換し、そ
して培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー由来の
DNAを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することにより同
定する。クローニングしたフラグメントの配列をDNA配列決定によって確認す
る。
いて互いに連結する。E.coli HB101またはXL−1 Blue(S
tratagene Cloning Systems,La Jolla,C
A)細胞のような他の適切なE.coli宿主を、連結混合液で形質転換し、そ
して培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー由来の
DNAを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することにより同
定する。クローニングしたフラグメントの配列をDNA配列決定によって確認す
る。
【0253】 このポリヌクレオチドを含む5μgのプラスミドを、Felgnerら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413−7417(19
87)によって記載されたリポフェクション法を使用して、1.0μgの市販の
線状化バキュロウイルスDNA(「BaculoGoldTM baculovi
rus DNA」,Pharmingen,San Diego,CA)ととも
に同時トランスフェクトする。1μgのBaculoGoldTMウイルスDNA
および5μgのプラスミドを、50μlの無血清グレース培地(Life Te
chnologies Inc.,Gaithersburg,MD)を含む、
マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、10μlの
リポフェクチンおよび90μlグレース培地を加え、混合し、そして室温で15
分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清グレ
ース培地1mlを加えた35mm組織培養プレートに播種したSf9昆虫細胞(
ATCC CRL 1711)に滴下して加える。次いでプレートを27℃で5
時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除
去し、そして10%ウシ胎仔血清を補充した1mlのグレース昆虫培地を添加す
る。次いで培養を27℃で4日間継続する。
oc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413−7417(19
87)によって記載されたリポフェクション法を使用して、1.0μgの市販の
線状化バキュロウイルスDNA(「BaculoGoldTM baculovi
rus DNA」,Pharmingen,San Diego,CA)ととも
に同時トランスフェクトする。1μgのBaculoGoldTMウイルスDNA
および5μgのプラスミドを、50μlの無血清グレース培地(Life Te
chnologies Inc.,Gaithersburg,MD)を含む、
マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、10μlの
リポフェクチンおよび90μlグレース培地を加え、混合し、そして室温で15
分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清グレ
ース培地1mlを加えた35mm組織培養プレートに播種したSf9昆虫細胞(
ATCC CRL 1711)に滴下して加える。次いでプレートを27℃で5
時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除
去し、そして10%ウシ胎仔血清を補充した1mlのグレース昆虫培地を添加す
る。次いで培養を27℃で4日間継続する。
【0254】 4日後、上清を収集し、そしてSummersおよびSmith、前出によっ
て記載されたようにプラークアッセイを行う。「Blue Gal」(Life
Technologies Inc.,Gaithersburg)を含むア
ガロースゲルを、gal発現クローン(青色に着色したプラークを生ずる)の容
易な同定および単離を可能にするために使用する。(この型の「プラークアッセ
イ」の詳細な説明はまた、Life Technologies Inc.,G
aithersburg,によって配布される、昆虫細胞培養およびバキュロウ
イルス学のための使用者ガイド(9−10頁)の中に見出され得る)。適切なイ
ンキュベーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッター(例えば
、Eppendorf)のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を
、200μlのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁し、そして
組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を、35mmディッシュに播種したSf9
細胞に感染させるために使用する。4日後、これらの培養ディッシュの上清を収
集し、次いで4℃で保存する。
て記載されたようにプラークアッセイを行う。「Blue Gal」(Life
Technologies Inc.,Gaithersburg)を含むア
ガロースゲルを、gal発現クローン(青色に着色したプラークを生ずる)の容
易な同定および単離を可能にするために使用する。(この型の「プラークアッセ
イ」の詳細な説明はまた、Life Technologies Inc.,G
aithersburg,によって配布される、昆虫細胞培養およびバキュロウ
イルス学のための使用者ガイド(9−10頁)の中に見出され得る)。適切なイ
ンキュベーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッター(例えば
、Eppendorf)のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を
、200μlのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁し、そして
組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を、35mmディッシュに播種したSf9
細胞に感染させるために使用する。4日後、これらの培養ディッシュの上清を収
集し、次いで4℃で保存する。
【0255】 ポリペプチドの発現を確認するために、10%熱非働化FBSを補充したグレ
ース培地中でSf9細胞を増殖させる。細胞を、約2の感染多重度(「MOI」
)でポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスに感染させる。放射性標識
したタンパク質を所望する場合には、6時間後に培地を除去し、そしてメチオニ
ンおよびシステインを含まないSF900 II培地(Life Techno
logies Inc.,Rockville,MDから入手可能)に置き換え
る。42時間後、5μCiの35S−メチオニンおよび5μCiの35S−システイ
ン(Amershamから入手可能)を添加する。細胞をさらに16時間インキ
ュベートし、次いで遠心分離によって収集する。上清中のタンパク質および細胞
内タンパク質を、SDS−PAGE、次いで(放射性標識した場合)オートラジ
オグラフィーによって分析する。
ース培地中でSf9細胞を増殖させる。細胞を、約2の感染多重度(「MOI」
)でポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスに感染させる。放射性標識
したタンパク質を所望する場合には、6時間後に培地を除去し、そしてメチオニ
ンおよびシステインを含まないSF900 II培地(Life Techno
logies Inc.,Rockville,MDから入手可能)に置き換え
る。42時間後、5μCiの35S−メチオニンおよび5μCiの35S−システイ
ン(Amershamから入手可能)を添加する。細胞をさらに16時間インキ
ュベートし、次いで遠心分離によって収集する。上清中のタンパク質および細胞
内タンパク質を、SDS−PAGE、次いで(放射性標識した場合)オートラジ
オグラフィーによって分析する。
【0256】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
【0257】 (実施例8:哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現) 本発明のポリペプチドを、哺乳動物細胞中で発現させ得る。代表的な哺乳動物
発現ベクターは、mRNAの転写の開始を仲介するプロモーターエレメント、タ
ンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要
なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック配列、およ
び、RNAスプライシングのドナーおよびアクセプター部位に隣接する介在配列
を含む。非常に効率的な転写は、SV40由来の初期および後期プロモーター、
レトロウイルス(例えばRSV、HTLVI、HIVI)由来の長い末端反復(
LTR)、およびサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターを用いて
達成される。しかし、細胞内エレメント(例えば、ヒトアクチンプロモーター)
もまた、使用され得る。
発現ベクターは、mRNAの転写の開始を仲介するプロモーターエレメント、タ
ンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要
なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック配列、およ
び、RNAスプライシングのドナーおよびアクセプター部位に隣接する介在配列
を含む。非常に効率的な転写は、SV40由来の初期および後期プロモーター、
レトロウイルス(例えばRSV、HTLVI、HIVI)由来の長い末端反復(
LTR)、およびサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターを用いて
達成される。しかし、細胞内エレメント(例えば、ヒトアクチンプロモーター)
もまた、使用され得る。
【0258】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、pSVLおよび
pMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pRSVc
at(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)、
pBC12MI(ATCC 67109)、pCMVSport2.0、ならび
にpCMVSport3.0のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿
主細胞としては、ヒトHela細胞、293細胞、H9細胞およびJurkat
細胞、マウスNIH3T3細胞およびC127細胞、Cos 1細胞、Cos
7細胞およびCV1細胞、ウズラQC1−3細胞、マウスL細胞、ならびにチャ
イニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられる。
pMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pRSVc
at(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)、
pBC12MI(ATCC 67109)、pCMVSport2.0、ならび
にpCMVSport3.0のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿
主細胞としては、ヒトHela細胞、293細胞、H9細胞およびJurkat
細胞、マウスNIH3T3細胞およびC127細胞、Cos 1細胞、Cos
7細胞およびCV1細胞、ウズラQC1−3細胞、マウスL細胞、ならびにチャ
イニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられる。
【0259】 あるいは、ポリペプチドは、染色体に組み込まれたポリヌクレオチドを含む、
安定な細胞株中で発現され得る。dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマ
イシンのような選択可能なマーカーを用いる同時トランスフェクションは、トラ
ンスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
安定な細胞株中で発現され得る。dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマ
イシンのような選択可能なマーカーを用いる同時トランスフェクションは、トラ
ンスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【0260】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現
するために増幅され得る。DHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)マーカーは、目的
の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用である。
(例えば、Alt,F.W.ら、J.Biol.Chem.253:1357−
1370(1978);Hamlin,J.L.およびMa,C.、Bioch
em.et Biophys.Acta、1097:107−143(1990
):Page,M.J.およびSyndenham,M.A.、Biotech
nology 9:64−68(1991)を参照のこと)。別の有用な選択マ
ーカーは、酵素グルタミンシンターゼ(GS)である(Murphyら、Bio
chem J.227:277−279(1991);Bebbingtonら
、Bio/Technology 10:169−175(1992))。これ
らのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そしてもっと
も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた
増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)およびNSO
細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
するために増幅され得る。DHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)マーカーは、目的
の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用である。
(例えば、Alt,F.W.ら、J.Biol.Chem.253:1357−
1370(1978);Hamlin,J.L.およびMa,C.、Bioch
em.et Biophys.Acta、1097:107−143(1990
):Page,M.J.およびSyndenham,M.A.、Biotech
nology 9:64−68(1991)を参照のこと)。別の有用な選択マ
ーカーは、酵素グルタミンシンターゼ(GS)である(Murphyら、Bio
chem J.227:277−279(1991);Bebbingtonら
、Bio/Technology 10:169−175(1992))。これ
らのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そしてもっと
も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた
増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)およびNSO
細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【0261】 プラスミドpSV2−dhfr(ATCC受託番号37146)の誘導体であ
る、発現ベクターpC4(ATCC受託番号209646)およびpC6(AT
CC受託番号209647)は、ラウス肉腫ウイルス(Cullenら、Mol
ecular and Cellular Biology,438−447(
1985年3月))の強力なプロモーター(LTR)、およびCMVエンハンサ
ー(Boshartら、Cell 41:521−530(1985))のフラ
グメントを含む。例えば、BamHI、XbaI、およびAsp718の制限酵
素切断部位を有する複数のクローニングサイトは、目的の遺伝子のクローニング
を容易にする。ベクターはまた、3’イントロン、ラットプレプロインシュリン
遺伝子のポリアデニル化および終結シグナル、ならびに、SV40初期プロモー
ターの制御下にあるマウスDHFR遺伝子を含む。
る、発現ベクターpC4(ATCC受託番号209646)およびpC6(AT
CC受託番号209647)は、ラウス肉腫ウイルス(Cullenら、Mol
ecular and Cellular Biology,438−447(
1985年3月))の強力なプロモーター(LTR)、およびCMVエンハンサ
ー(Boshartら、Cell 41:521−530(1985))のフラ
グメントを含む。例えば、BamHI、XbaI、およびAsp718の制限酵
素切断部位を有する複数のクローニングサイトは、目的の遺伝子のクローニング
を容易にする。ベクターはまた、3’イントロン、ラットプレプロインシュリン
遺伝子のポリアデニル化および終結シグナル、ならびに、SV40初期プロモー
ターの制御下にあるマウスDHFR遺伝子を含む。
【0262】 具体的には、例えば、プラスミドpC6は、適切な制限酵素によって消化され
、次いで当該分野で公知の手順に従って、仔ウシ腸ホスファターゼ(phosp
hate)を使用して脱リン酸化する。次いで、ベクターを1%アガロースゲル
から単離する。
、次いで当該分野で公知の手順に従って、仔ウシ腸ホスファターゼ(phosp
hate)を使用して脱リン酸化する。次いで、ベクターを1%アガロースゲル
から単離する。
【0263】 本発明のポリヌクレオチドは、実施例1に概説するプロトコルに従って増幅さ
れる。天然に存在するシグナル配列が、分泌タンパク質を産生するために使用さ
れる場合、ベクターは、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天
然に存在するシグナル配列が使用されない場合には、ベクターは異種シグナル配
列を含むように改変され得る(例えば、WO96/34891を参照のこと)。
れる。天然に存在するシグナル配列が、分泌タンパク質を産生するために使用さ
れる場合、ベクターは、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天
然に存在するシグナル配列が使用されない場合には、ベクターは異種シグナル配
列を含むように改変され得る(例えば、WO96/34891を参照のこと)。
【0264】 増幅フラグメントを、市販のキット(「Geneclean」、BIO 10
1 Inc.,La Jolla,Ca.)を使用して1%アガロースゲルから
単離する。次いで、フラグメントを、適切な制限酵素で消化し、そして再度1%
アガロースゲル上で精製する。
1 Inc.,La Jolla,Ca.)を使用して1%アガロースゲルから
単離する。次いで、フラグメントを、適切な制限酵素で消化し、そして再度1%
アガロースゲル上で精製する。
【0265】 次いで、増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、そして1%アガロースゲ
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクター
を、T4 DNAリガーゼで連結する。次いで、E.coli HB101また
はXL−1 Blue細胞を形質転換し、そしてプラスミドpC6に挿入された
フラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクター
を、T4 DNAリガーゼで連結する。次いで、E.coli HB101また
はXL−1 Blue細胞を形質転換し、そしてプラスミドpC6に挿入された
フラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
【0266】 活性なDHFR遺伝子を欠失するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。5μgの発現プラスミドpC6を、リポフェクチン
を用いて、0.5μgのプラスミドpSVneoとともに同時トランスフェクト
する(Felgnerら、前出)。プラスミドpSV2−neoは、優性選択マ
ーカーであるところの、G418を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する酵
素をコードするTn5由来のneo遺伝子を含む。細胞を、1mg/mlのG4
18を補充したαマイナスMEMに播種する。2日後、細胞をトリプシン処理し
、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートおよび1mg/
mlのG418を補充したαマイナスMEM中のハイブリドーマクローニングプ
レート(Greiner,Germany)中に播種する。約10〜14日後、
単一のクローンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異なる濃度(5
0nM、100nM、200nM、400nM、800nM)を使用して、6ウ
ェルのペトリ皿または10mlのフラスコに播種する。次いで、メトトレキサー
トの最高濃度で増殖するクローンを、さらに高い濃度(1μM、2μM、5μM
、10mM、20mM)のメトトレキサートを含む新たな6ウェルプレートに移
す。同じ手順を、100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで
繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS−PAGEおよびウエス
タンブロットによって、または逆相HPLC分析によって分析する。
スフェクションに使用する。5μgの発現プラスミドpC6を、リポフェクチン
を用いて、0.5μgのプラスミドpSVneoとともに同時トランスフェクト
する(Felgnerら、前出)。プラスミドpSV2−neoは、優性選択マ
ーカーであるところの、G418を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する酵
素をコードするTn5由来のneo遺伝子を含む。細胞を、1mg/mlのG4
18を補充したαマイナスMEMに播種する。2日後、細胞をトリプシン処理し
、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートおよび1mg/
mlのG418を補充したαマイナスMEM中のハイブリドーマクローニングプ
レート(Greiner,Germany)中に播種する。約10〜14日後、
単一のクローンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異なる濃度(5
0nM、100nM、200nM、400nM、800nM)を使用して、6ウ
ェルのペトリ皿または10mlのフラスコに播種する。次いで、メトトレキサー
トの最高濃度で増殖するクローンを、さらに高い濃度(1μM、2μM、5μM
、10mM、20mM)のメトトレキサートを含む新たな6ウェルプレートに移
す。同じ手順を、100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで
繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS−PAGEおよびウエス
タンブロットによって、または逆相HPLC分析によって分析する。
【0267】 (実施例9:タンパク質融合物) 本発明のポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これら
の融合タンパク質は、種々の適用について使用され得る。例えば、本発明のポリ
ぺプチドの、Hisタグ、HAタグ、プロテインA、IgGドメイン、およびマ
ルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする(実施例5を参照のこと
;EP A 394,827;Trauneckerら、Nature 331
:84−86(1988)もまた参照のこと)。同様に、IgG−1、IgG−
3、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。本発明の
ポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞下(su
bcellular)局在に標的化し得る。一方、共有結合ヘテロダイマーまた
はホモダイマーは、融合タンパク質の活性を増大または減少させ得る。融合タン
パク質はまた、1つより多い機能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融
合タンパク質は、非融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および
/または安定性を増大させ得る。上記の融合タンパク質の全ての型は、ポリぺプ
チドのIgG分子への融合を概説する以下のプロトコル、または実施例5に記載
されるプロトコルを改変することによって作製され得る。
の融合タンパク質は、種々の適用について使用され得る。例えば、本発明のポリ
ぺプチドの、Hisタグ、HAタグ、プロテインA、IgGドメイン、およびマ
ルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする(実施例5を参照のこと
;EP A 394,827;Trauneckerら、Nature 331
:84−86(1988)もまた参照のこと)。同様に、IgG−1、IgG−
3、およびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。本発明の
ポリぺプチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞下(su
bcellular)局在に標的化し得る。一方、共有結合ヘテロダイマーまた
はホモダイマーは、融合タンパク質の活性を増大または減少させ得る。融合タン
パク質はまた、1つより多い機能を有するキメラ分子を作製し得る。最後に、融
合タンパク質は、非融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の可溶性および
/または安定性を増大させ得る。上記の融合タンパク質の全ての型は、ポリぺプ
チドのIgG分子への融合を概説する以下のプロトコル、または実施例5に記載
されるプロトコルを改変することによって作製され得る。
【0268】 簡単には、IgG分子のヒトFc部分は、以下に記載の配列の5’および3’
末端にわたるプライマーを使用してPCR増幅され得る。これらのプライマーは
また、発現ベクター(好ましくは、哺乳動物発現ベクター)へのクローニングを
容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
末端にわたるプライマーを使用してPCR増幅され得る。これらのプライマーは
また、発現ベクター(好ましくは、哺乳動物発現ベクター)へのクローニングを
容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【0269】 例えば、pC4(受託番号第209646号)が使用される場合、ヒトFc部
分は、BamHIクローニング部位に連結され得る。3’BamHI部位が破壊
されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトFc部分を含有するベクターが
、BamHIによって再び制限処理され、ベクターを線状化し、そして実施例1
に記載するPCRプロトコルによって単離された本発明のポリヌクレオチドが、
このBamHI部位に連結される。ポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクロ
ーニングされ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意する
こと。
分は、BamHIクローニング部位に連結され得る。3’BamHI部位が破壊
されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトFc部分を含有するベクターが
、BamHIによって再び制限処理され、ベクターを線状化し、そして実施例1
に記載するPCRプロトコルによって単離された本発明のポリヌクレオチドが、
このBamHI部位に連結される。ポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクロ
ーニングされ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意する
こと。
【0270】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、pC4は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むよ
うに改変され得る(例えば、WO 96/34891を参照のこと)。
合、pC4は、第二のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むよ
うに改変され得る(例えば、WO 96/34891を参照のこと)。
【0271】
【化1】 (実施例10:ポリぺプチドからの抗体の産生) 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る(Current Pro
tocols,第2章を参照のこと。)。例えば、本発明のポリぺプチドを発現
する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与
される。好ましい方法において、分泌タンパク質の調製物が調製され、そして精
製されて、ネイティブの夾雑物を実質的に含まないようにする。次いで、このよ
うな調製物は、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために動物
に導入される。
tocols,第2章を参照のこと。)。例えば、本発明のポリぺプチドを発現
する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与
される。好ましい方法において、分泌タンパク質の調製物が調製され、そして精
製されて、ネイティブの夾雑物を実質的に含まないようにする。次いで、このよ
うな調製物は、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するために動物
に導入される。
【0272】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体(または、
そのタンパク質結合フラグメント)である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る(Koehlerら、Nature
256:495(1975);Koehlerら、Eur.J.Immuno
l.6:511(1976);Koehlerら、Eur.J.Immunol
.6:292(1976);Hammerlingら:Monoclonal
Antibodies and T−Cell Hybridomas,Els
evier,N.Y.、563−681頁(1981))。一般に、このような
手順は、動物(好ましくは、マウス)をポリぺプチドで免疫すること、またはよ
り好ましくは、分泌ポリぺプチド発現細胞で免疫することを含む。このような細
胞は、任意の適切な組織培養培地において培養され得る;しかし、10%ウシ胎
仔血清(約56℃で非働化した)を補充し、そして約10g/lの非必須アミノ
酸、約1,000U/mlのペニシリン、および約100μg/mlのストレプ
トマイシンを補充したアール改変イーグル培地において細胞を培養することが好
ましい。
そのタンパク質結合フラグメント)である。このようなモノクローナル抗体は、
ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る(Koehlerら、Nature
256:495(1975);Koehlerら、Eur.J.Immuno
l.6:511(1976);Koehlerら、Eur.J.Immunol
.6:292(1976);Hammerlingら:Monoclonal
Antibodies and T−Cell Hybridomas,Els
evier,N.Y.、563−681頁(1981))。一般に、このような
手順は、動物(好ましくは、マウス)をポリぺプチドで免疫すること、またはよ
り好ましくは、分泌ポリぺプチド発現細胞で免疫することを含む。このような細
胞は、任意の適切な組織培養培地において培養され得る;しかし、10%ウシ胎
仔血清(約56℃で非働化した)を補充し、そして約10g/lの非必須アミノ
酸、約1,000U/mlのペニシリン、および約100μg/mlのストレプ
トマイシンを補充したアール改変イーグル培地において細胞を培養することが好
ましい。
【0273】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合され
る。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る;しかし、AT
CCから入手可能な親骨髄腫細胞株(SP2O)を用いることが好ましい。融合
後、得られるハイブリドーマ細胞を、HAT培地において選択的に維持し、次い
でWandsら(Gastroenterology 80:225−232(
1981))に記載されるように限界希釈によってクローニングする。このよう
な選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、次いでポリぺプチドに結合し得
る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
る。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る;しかし、AT
CCから入手可能な親骨髄腫細胞株(SP2O)を用いることが好ましい。融合
後、得られるハイブリドーマ細胞を、HAT培地において選択的に維持し、次い
でWandsら(Gastroenterology 80:225−232(
1981))に記載されるように限界希釈によってクローニングする。このよう
な選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、次いでポリぺプチドに結合し得
る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
【0274】 あるいは、ポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体
を使用して2段階の手順において生成し得る。このような方法は、抗体それ自体
が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるとい
う事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体が使用されて、動
物(好ましくは、マウス)を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞を使用
して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、ハイブリドーマ細胞は、タンパ
ク質特異的抗体に結合する能力がこのポリぺプチドによってブロックされ得る抗
体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体
は、タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を
免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。
を使用して2段階の手順において生成し得る。このような方法は、抗体それ自体
が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるとい
う事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体が使用されて、動
物(好ましくは、マウス)を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞を使用
して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、ハイブリドーマ細胞は、タンパ
ク質特異的抗体に結合する能力がこのポリぺプチドによってブロックされ得る抗
体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体
は、タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を
免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。
【0275】 本発明の抗体のFabおよびF(ab’)2ならびに他のフラグメントは、本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントは、代表的には、パパイン(Fabフラグメントを産生するため)
またはペプシン(F(ab’)2フラグメントを産生するため)のような酵素を
使用して、タンパク質分解性切断によって産生される。あるいは、分泌タンパク
質結合フラグメントは、組換えDNA技術の適用により、または合成化学により
産生され得る。
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントは、代表的には、パパイン(Fabフラグメントを産生するため)
またはペプシン(F(ab’)2フラグメントを産生するため)のような酵素を
使用して、タンパク質分解性切断によって産生される。あるいは、分泌タンパク
質結合フラグメントは、組換えDNA技術の適用により、または合成化学により
産生され得る。
【0276】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用すること
によって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知であ
る(総説については、Morrison,Science 229:1202(
1985);Oiら、BioTechniques 4:214(1986);
Cabillyら、米国特許第4,816,567号;Taniguchiら、
EP 171496;Morrisonら、EP 173494;Neuber
gerら、WO 8601533;Robinsonら、WO 8702671
;Boulianneら、Nature 312:643 (1984);Ne
ubergerら、Nature 314:268(1985)を参照のこと。
)。
抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用すること
によって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該分野で公知であ
る(総説については、Morrison,Science 229:1202(
1985);Oiら、BioTechniques 4:214(1986);
Cabillyら、米国特許第4,816,567号;Taniguchiら、
EP 171496;Morrisonら、EP 173494;Neuber
gerら、WO 8601533;Robinsonら、WO 8702671
;Boulianneら、Nature 312:643 (1984);Ne
ubergerら、Nature 314:268(1985)を参照のこと。
)。
【0277】 (実施例11:ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における変化の決定方法) 目的の表現型(例えば、疾患)を提示する家族全員または個々の患者から単離
されたRNAを単離する。次に、cDNAをこれらのRNAサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する(Sambrookを参照のこと)。
次に、このcDNAを、配列番号Xにおける目的の領域を取り囲むプライマーを
用いるPCRのテンプレートとして使用する。示唆されるPCR条件は、Sid
ransky,D.ら、Science 252:706(1991)に記載の
緩衝溶液を使用し、95℃で30秒間;52〜58℃で60〜120秒間;およ
び70℃で60〜120秒間の35サイクルからなる。
されたRNAを単離する。次に、cDNAをこれらのRNAサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する(Sambrookを参照のこと)。
次に、このcDNAを、配列番号Xにおける目的の領域を取り囲むプライマーを
用いるPCRのテンプレートとして使用する。示唆されるPCR条件は、Sid
ransky,D.ら、Science 252:706(1991)に記載の
緩衝溶液を使用し、95℃で30秒間;52〜58℃で60〜120秒間;およ
び70℃で60〜120秒間の35サイクルからなる。
【0278】 次に、PCR産物を、SequiTherm Polymerase(Epi
centre Technologies)を用い、5’末端にT4ポリヌクレ
オチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。選択したエキソ
ンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノムPCR産物を分析してその
結果を確認する。次に、疑わしい変異を有するPCR産物のクローン化および配
列決定を行い、直接配列決定の結果を確認する。
centre Technologies)を用い、5’末端にT4ポリヌクレ
オチドキナーゼで標識したプライマーを使用して配列決定する。選択したエキソ
ンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノムPCR産物を分析してその
結果を確認する。次に、疑わしい変異を有するPCR産物のクローン化および配
列決定を行い、直接配列決定の結果を確認する。
【0279】 PCR産物を、Holton,T.A.およびGraham,M.W.,Nu
cleic Acids Research,19:1156(1991)に記
載のようにTテールベクターにクローン化し、そしてT7ポリメラーゼ(Uni
ted States Biochemical)で配列決定する。罹患個体を
、非罹患個体には存在しない変異により同定する。
cleic Acids Research,19:1156(1991)に記
載のようにTテールベクターにクローン化し、そしてT7ポリメラーゼ(Uni
ted States Biochemical)で配列決定する。罹患個体を
、非罹患個体には存在しない変異により同定する。
【0280】 ゲノム再配置もまた、ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における改変を決定
する方法として観察する。実施例2に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキ
シゲニンデオキシ−ウリジン5’−三リン酸(Boehringer Manh
eim)を用いてニックトランスレーションし、そしてJohnson,Cg.
ら、Methods Cell Biol.35:73−99(1991)に記
載のようにFISHを行う。対応するゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイ
ゼーションのために、大過剰のヒトcot−1 DNAを用いて標識プローブと
のハイブリダイゼーションを行う。
する方法として観察する。実施例2に従って単離したゲノムクローンを、ジゴキ
シゲニンデオキシ−ウリジン5’−三リン酸(Boehringer Manh
eim)を用いてニックトランスレーションし、そしてJohnson,Cg.
ら、Methods Cell Biol.35:73−99(1991)に記
載のようにFISHを行う。対応するゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイ
ゼーションのために、大過剰のヒトcot−1 DNAを用いて標識プローブと
のハイブリダイゼーションを行う。
【0281】 染色体を、4,6−ジアミノ−2−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、CおよびRバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピングの
ための整列イメージを、三重バンドフィルターセット(Chroma Tech
nology,Brattleboro,VT)と冷却電荷結合素子カメラ(P
hotometrics,Tucson,AZ)および可変励起波長フィルター
(Johnson,Cv.ら、Genet.Anal.Tech.Appl.,
8:75(1991))とを組み合わせて用いて得る。ISee Graphi
cal Program System(Inovision Corpora
tion,Durham,NC)を使用して、イメージ収集、分析および染色体
部分長測定を行う。プローブがハイブリダイズしたゲノム領域の染色体変化を、
挿入、欠失および転座として同定する。これらの変化を関連疾患の診断マーカー
として使用する。
で対比染色し、CおよびRバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピングの
ための整列イメージを、三重バンドフィルターセット(Chroma Tech
nology,Brattleboro,VT)と冷却電荷結合素子カメラ(P
hotometrics,Tucson,AZ)および可変励起波長フィルター
(Johnson,Cv.ら、Genet.Anal.Tech.Appl.,
8:75(1991))とを組み合わせて用いて得る。ISee Graphi
cal Program System(Inovision Corpora
tion,Durham,NC)を使用して、イメージ収集、分析および染色体
部分長測定を行う。プローブがハイブリダイズしたゲノム領域の染色体変化を、
挿入、欠失および転座として同定する。これらの変化を関連疾患の診断マーカー
として使用する。
【0282】 (実施例12:生物学的サンプル中のポリペプチドの異常レベルを検出する方
法) 本発明のポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてポリペプチ
ドレベルの上昇または低下が検出される場合、このポリペプチドは、特定表現型
のマーカーである。検出方法は数多くあり、それ故、当業者は以下のアッセイを
それらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。
法) 本発明のポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてポリペプチ
ドレベルの上昇または低下が検出される場合、このポリペプチドは、特定表現型
のマーカーである。検出方法は数多くあり、それ故、当業者は以下のアッセイを
それらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される。
【0283】 例えば、抗体サンドイッチELISAを使用し、サンプル中、好ましくは、生
物学的サンプル中のポリペプチドを検出する。マイクロタイタープレートのウェ
ルを、最終濃度0.2〜10μg/mlの特異的抗体でコーティングする。この
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであって、そして実施
例10に記載の方法により産生される。ウェルに対するポリペプチドの非特異的
結合が減少するように、このウェルをブロックする。
物学的サンプル中のポリペプチドを検出する。マイクロタイタープレートのウェ
ルを、最終濃度0.2〜10μg/mlの特異的抗体でコーティングする。この
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであって、そして実施
例10に記載の方法により産生される。ウェルに対するポリペプチドの非特異的
結合が減少するように、このウェルをブロックする。
【0284】 次に、コーティングしたウェルを、ポリペプチド含有サンプルを用いてRTで
2時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用し
て結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗
浄し、非結合ポリペプチドを除去する。
2時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈を使用し
て結果を確認すべきである。次に、プレートを脱イオン水または蒸留水で三回洗
浄し、非結合ポリペプチドを除去する。
【0285】 次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体50μlを25〜400n
gの濃度で加え、そして室温で2時間インキュベートする。プレートを再び脱イ
オン水または蒸留水で三回洗浄し、非結合の結合体を除去する。
gの濃度で加え、そして室温で2時間インキュベートする。プレートを再び脱イ
オン水または蒸留水で三回洗浄し、非結合の結合体を除去する。
【0286】 4−メチルウンベリフェリルリン酸(MUP)またはp−ニトロフェニルリン
酸(NPP)の基質溶液75μlを各ウェルに添加し、そして室温で1時間イン
キュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。
コントロールサンプルの系列希釈を使用して標準曲線を作成し、そしてX軸(対
数スケール)にポリペプチド濃度を、そしてY軸(直線スケール)に蛍光または
吸光度をプロットする。標準曲線を用いてサンプル中のポリペプチド濃度を補間
する。
酸(NPP)の基質溶液75μlを各ウェルに添加し、そして室温で1時間イン
キュベートする。反応物をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。
コントロールサンプルの系列希釈を使用して標準曲線を作成し、そしてX軸(対
数スケール)にポリペプチド濃度を、そしてY軸(直線スケール)に蛍光または
吸光度をプロットする。標準曲線を用いてサンプル中のポリペプチド濃度を補間
する。
【0287】 (実施例13:ポリペプチドの処方) 分泌ポリペプチド組成物を、個々の患者の臨床状態(特に、分泌ポリペプチド
単独処置の副作用)、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の
因子を考慮に入れ、医療実施基準(good medical practic
e)を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とす
る「有効量」は、このような考慮により決定される。
単独処置の副作用)、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の
因子を考慮に入れ、医療実施基準(good medical practic
e)を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とす
る「有効量」は、このような考慮により決定される。
【0288】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される分泌ポリペプチドの合計
薬学的有効量は、患者体重の、約1μg/kg/日〜10mg/kg/日の範囲
にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、こ
のホルモンについて、この用量は、少なくとも0.01mg/kg/日、そして
最も好ましくはヒトに対して約0.01mg/kg/日と約1mg/kg/日と
の間である。連続投与する場合、代表的には、分泌ポリペプチドを約1μg/k
g/時間〜約50μg/kg/時間の投薬速度で1日に1〜4回の注射かまたは
連続皮下注入(例えばミニポンプを用いる)のいずれかにより投与する。静脈内
用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応
答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
薬学的有効量は、患者体重の、約1μg/kg/日〜10mg/kg/日の範囲
にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、こ
のホルモンについて、この用量は、少なくとも0.01mg/kg/日、そして
最も好ましくはヒトに対して約0.01mg/kg/日と約1mg/kg/日と
の間である。連続投与する場合、代表的には、分泌ポリペプチドを約1μg/k
g/時間〜約50μg/kg/時間の投薬速度で1日に1〜4回の注射かまたは
連続皮下注入(例えばミニポンプを用いる)のいずれかにより投与する。静脈内
用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応
答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
【0289】 本発明の分泌タンパク質を含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口的、
槽内(intracistemally)、膣内、腹腔内、局所的(粉末、軟膏
、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど)、口内あるいは経口または鼻腔
スプレーとして投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体
、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をい
う。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内
、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
槽内(intracistemally)、膣内、腹腔内、局所的(粉末、軟膏
、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど)、口内あるいは経口または鼻腔
スプレーとして投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体
、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をい
う。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内
、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【0290】 分泌ポリペプチドはまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性組
成物の適切な例は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形品の形態の
半透過性ポリマーマトリックスを包含する。徐放性マトリックスとしては、ポリ
ラクチド(米国特許第3,773,919号、EP58,481)、L−グルタ
ミン酸およびγ−エチル−L−グルタメートのコポリマー(Sidman,U.
ら、Biopolymers22:547−556(1983))、ポリ(2−
ヒドロキシエチルメタクリレート)(R.Langerら、J.Biomed.
Mater.Res.15:167−277(1981)、およびR.Lang
er,Chem.Tech.12:98−105(1982))、エチレンビニ
ルアセテート(R.Langerら)またはポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ
酪酸(EP133,988)が挙げられる。徐放性組成物はまた、リポソームに
封入されたポリペプチドを包含する。分泌ポリペプチドを含有するリポソームは
、それ自体が公知である方法により調製される:DE3,218,121;Ep
steinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:368
8−3692(1985);Hwangら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 77:4030−4034(1980);EP52,322;E
P36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641
;日本国特許出願第83−118008号;米国特許第4,485,045号お
よび同第4,544,545号;ならびにEP第102,324号。通常、リポ
ソームは、小さな(約200〜800オングストローム)単層状型であり、脂質
含有量は、約30モル%コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適分
泌ポリペプチド治療のために調整される。
成物の適切な例は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形品の形態の
半透過性ポリマーマトリックスを包含する。徐放性マトリックスとしては、ポリ
ラクチド(米国特許第3,773,919号、EP58,481)、L−グルタ
ミン酸およびγ−エチル−L−グルタメートのコポリマー(Sidman,U.
ら、Biopolymers22:547−556(1983))、ポリ(2−
ヒドロキシエチルメタクリレート)(R.Langerら、J.Biomed.
Mater.Res.15:167−277(1981)、およびR.Lang
er,Chem.Tech.12:98−105(1982))、エチレンビニ
ルアセテート(R.Langerら)またはポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ
酪酸(EP133,988)が挙げられる。徐放性組成物はまた、リポソームに
封入されたポリペプチドを包含する。分泌ポリペプチドを含有するリポソームは
、それ自体が公知である方法により調製される:DE3,218,121;Ep
steinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:368
8−3692(1985);Hwangら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 77:4030−4034(1980);EP52,322;E
P36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641
;日本国特許出願第83−118008号;米国特許第4,485,045号お
よび同第4,544,545号;ならびにEP第102,324号。通常、リポ
ソームは、小さな(約200〜800オングストローム)単層状型であり、脂質
含有量は、約30モル%コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適分
泌ポリペプチド治療のために調整される。
【0291】 非経口投与のために、1つの実施態様において、一般に、分泌ポリペプチドは
、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち、用いる
投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と
適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態(溶液、懸濁液または乳濁液)で
混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、
およびポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含まな
い。
、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち、用いる
投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と
適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態(溶液、懸濁液または乳濁液)で
混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、
およびポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含まな
い。
【0292】 一般に、ポリペプチドを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはそ
の両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、
生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア
であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このよう
なキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキス
トロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性
ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
の両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、
生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア
であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このよう
なキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキス
トロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性
ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【0293】 キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加剤
を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエント
に対して毒性がなく、そしてこのような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、
コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤;アスコルビ
ン酸のような抗酸化剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド(例えば、ポ
リアルギニンまたはトリペプチド);血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロ
ブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グ
リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸;セ
ルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、
単糖類、二糖類、および他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;マンニト
ールまたはソルビトールのような糖アルコール;ナトリウムのような対イオン;
および/またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはPEGのような非イオン
性界面活性剤が挙げられる。
を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエント
に対して毒性がなく、そしてこのような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、
コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤;アスコルビ
ン酸のような抗酸化剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド(例えば、ポ
リアルギニンまたはトリペプチド);血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロ
ブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グ
リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸;セ
ルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、
単糖類、二糖類、および他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;マンニト
ールまたはソルビトールのような糖アルコール;ナトリウムのような対イオン;
および/またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはPEGのような非イオン
性界面活性剤が挙げられる。
【0294】 分泌ポリペプチドは、代表的には約0.1mg/ml〜100mg/ml、好
ましくは1〜10mg/mlの濃度で、約3〜8のpHで、このようなビヒクル
中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用すること
により、ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
ましくは1〜10mg/mlの濃度で、約3〜8のpHで、このようなビヒクル
中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用すること
により、ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
【0295】 治療的投与に用いられる任意のポリペプチドは無菌状態であり得る。滅菌濾過
膜(例えば0.2ミクロンメンブレン)で濾過することにより無菌状態は容易に
達成される。一般に、治療用ポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有す
る容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグ
またはバイアルに配置される。
膜(例えば0.2ミクロンメンブレン)で濾過することにより無菌状態は容易に
達成される。一般に、治療用ポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有す
る容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグ
またはバイアルに配置される。
【0296】 ポリペプチドは、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプル
またはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵さ
れる。凍結乾燥処方物の例として、10mlのバイアルに、滅菌濾過した1%(
w/v)ポリペプチド水溶液5mlを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥
する。凍結乾燥したポリペプチドを注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を
調製する。
またはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵さ
れる。凍結乾燥処方物の例として、10mlのバイアルに、滅菌濾過した1%(
w/v)ポリペプチド水溶液5mlを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥
する。凍結乾燥したポリペプチドを注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を
調製する。
【0297】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の1つ以上の成分を満たした一つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関
する政府機関による承認を表す。さらに、本発明のポリペプチドを他の治療用化
合物と組み合わせて使用し得る。
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関
する政府機関による承認を表す。さらに、本発明のポリペプチドを他の治療用化
合物と組み合わせて使用し得る。
【0298】 (実施例14:ポリペプチドのレベル低下を処置する方法) 個体における分泌タンパク質の標準的なまたは正常な発現レベルの低下により
引き起こされる状態は、本発明のポリペプチドを、好ましくは分泌形態で投与す
ることにより処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ポリペプ
チドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方法は、このよう
な個体でポリペプチドの活性レベルを増加させる量のポリペプチドを含む薬学的
組成物を、このような個体に投与する工程を包含する。
引き起こされる状態は、本発明のポリペプチドを、好ましくは分泌形態で投与す
ることにより処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ポリペプ
チドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方法は、このよう
な個体でポリペプチドの活性レベルを増加させる量のポリペプチドを含む薬学的
組成物を、このような個体に投与する工程を包含する。
【0299】 例えば、ポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリペプチドを、1日用量
0.1〜100μg/kgで6日続けて服用する。好ましくは、ポリペプチドは
分泌形態である。投与および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、実施例2
3に提供される。
0.1〜100μg/kgで6日続けて服用する。好ましくは、ポリペプチドは
分泌形態である。投与および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、実施例2
3に提供される。
【0300】 (実施例15:ポリペプチドのレベル上昇を処置する方法) アンチセンス技術を使用して本発明のポリペプチドの産生を阻害する。この技
術は、癌のような様々な病因に起因するポリペプチド、好ましくは分泌形態のポ
リペプチドのレべルを低下させる方法の1つの例である。
術は、癌のような様々な病因に起因するポリペプチド、好ましくは分泌形態のポ
リペプチドのレべルを低下させる方法の1つの例である。
【0301】 例えば、ポリペプチドのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチ
センスポリヌクレオチドを、0.5、1.0、1.5、2.0および3.0mg
/kg/日で静脈内に21日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば
、7日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチド
処方物は、実施例23に提供される。
センスポリヌクレオチドを、0.5、1.0、1.5、2.0および3.0mg
/kg/日で静脈内に21日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば
、7日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチド
処方物は、実施例23に提供される。
【0302】 (実施例16:遺伝子治療を使用する処置方法) 遺伝子治療の1つの方法は、ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移
植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる
。得られた組織を組織培養培地中に配置し、そして小片に分割する。小塊の組織
を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、およそ10片を各フラスコに置く。この
フラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で24時間
後、フラスコを反転させ、そして組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、
そして新鮮培地(例えば、10%FBS、ペニシリンおよびストレプトマイシン
を含有するHamのF12培地)を添加する。次に、フラスコを37℃で約1週
間インキュベートする。
植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる
。得られた組織を組織培養培地中に配置し、そして小片に分割する。小塊の組織
を組織培養フラスコの湿潤表面に置き、およそ10片を各フラスコに置く。この
フラスコを倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で24時間
後、フラスコを反転させ、そして組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、
そして新鮮培地(例えば、10%FBS、ペニシリンおよびストレプトマイシン
を含有するHamのF12培地)を添加する。次に、フラスコを37℃で約1週
間インキュベートする。
【0303】 この時点で、新鮮培地を添加し、続いて数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてよ
り大きなフラスコにスケールアップする。
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてよ
り大きなフラスコにスケールアップする。
【0304】 モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端反復が隣接するpMV−7(Kirs
chmeier,P.T.ら、DNA,7:219−25(1988))をEc
oRIおよびHindIIIで消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理す
る。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して精
製する。
chmeier,P.T.ら、DNA,7:219−25(1988))をEc
oRIおよびHindIIIで消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理す
る。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して精
製する。
【0305】 本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、実施例1に記載のそれぞれ5
’および3’末端配列に対応するPCRプライマーを使用して増幅し得る。好ま
しくは、5’プライマーはEcoRI部位を含み、そして3’プライマーはHi
ndIII部位を含む。等量の、モロニーマウス肉腫ウイルス線状骨格および増
幅したEcoRIおよびHindIIIフラグメントを、T4 DNAリガーゼ
の存在下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントを連結するのに
適した条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌HB101を形質転
換する。次に、ベクターが正確に挿入された目的の遺伝子を有することを確認す
るためにカナマイシンを含む寒天上にそれを、プレーティングする。
’および3’末端配列に対応するPCRプライマーを使用して増幅し得る。好ま
しくは、5’プライマーはEcoRI部位を含み、そして3’プライマーはHi
ndIII部位を含む。等量の、モロニーマウス肉腫ウイルス線状骨格および増
幅したEcoRIおよびHindIIIフラグメントを、T4 DNAリガーゼ
の存在下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメントを連結するのに
適した条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌HB101を形質転
換する。次に、ベクターが正確に挿入された目的の遺伝子を有することを確認す
るためにカナマイシンを含む寒天上にそれを、プレーティングする。
【0306】 両栄養性pA317またはGP+am12パッケージング細胞を、10%仔ウ
シ血清(CS)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDulbecco
改変Eagles培地(DMEM)中の組織培養でコンフルエントな密度まで増
殖させる。次に、遺伝子を含むMSVベクターを培地に加え、そしてパッケージ
ング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージング細胞は遺伝子を
含む感染性ウイルス粒子を産生する(ここで、パッケージング細胞をプロデュー
サー細胞という)。
シ血清(CS)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDulbecco
改変Eagles培地(DMEM)中の組織培養でコンフルエントな密度まで増
殖させる。次に、遺伝子を含むMSVベクターを培地に加え、そしてパッケージ
ング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージング細胞は遺伝子を
含む感染性ウイルス粒子を産生する(ここで、パッケージング細胞をプロデュー
サー細胞という)。
【0307】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地を10c
mプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から収集する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地をミリポアフィルターを通して濾過し、はがれたプロ
デューサー細胞を除去し、次いで、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させ
る。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロ
デューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新
鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細胞
に感染し、そして選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、neoまたはh
isのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必
要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染すると、線維芽細胞を分析し、タン
パク質が産生されているか否かを決定する。
mプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から収集する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地をミリポアフィルターを通して濾過し、はがれたプロ
デューサー細胞を除去し、次いで、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させ
る。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロ
デューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新
鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細胞
に感染し、そして選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、neoまたはh
isのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必
要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染すると、線維芽細胞を分析し、タン
パク質が産生されているか否かを決定する。
【0308】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス3マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する。
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する。
【0309】 本発明は、前記の説明および実施例で詳細に記載した通り以外にも、実施し得
ることは明らかである。本発明の数多くの改変および変更は、上記の教示を考慮
すれば可能であり、従って、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
ることは明らかである。本発明の数多くの改変および変更は、上記の教示を考慮
すれば可能であり、従って、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【0310】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用した各文献(特許、特許出
願、雑誌論文、抄録、実験室マニュアル、書籍または他の開示を含む)の全開示
は、本明細書中に参考として援用される。さらに、同封して提出した配列表のハ
ードコピーおよび対応するコンピューター読み出し可能な形態の両方は、それら
の全体が本明細書中において参考として援用される。
願、雑誌論文、抄録、実験室マニュアル、書籍または他の開示を含む)の全開示
は、本明細書中に参考として援用される。さらに、同封して提出した配列表のハ
ードコピーおよび対応するコンピューター読み出し可能な形態の両方は、それら
の全体が本明細書中において参考として援用される。
【0311】
【表3】
【配列表】
【図1】 図1は、クローンHMWJH67におけるヒトcDNAのヌクレオチド配列(
配列番号1)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号2)を
示す。
配列番号1)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号2)を
示す。
【図2】 図2は、クローンHKAET41におけるヒトcDNAのヌクレオチド配列(
配列番号3)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号4)を
示す。
配列番号3)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号4)を
示す。
【図3】 図3は、クローンHKAFV61におけるヒトcDNAのヌクレオチド配列(
配列番号5)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号6)を
示す。
配列番号5)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号6)を
示す。
【図4A】 図4は、クローンHETDK50におけるヒトcDNAのヌクレオチド配列(
配列番号7)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号8)を
示す。
配列番号7)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号8)を
示す。
【図4B】 図4は、クローンHETDK50におけるヒトcDNAのヌクレオチド配列(
配列番号7)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号8)を
示す。
配列番号7)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号8)を
示す。
【図5】 図5は、クローンHKAEF09におけるヒトcDNAのヌクレオチド配列(
配列番号9)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号10)
を示す。
配列番号9)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号10)
を示す。
【図6】 図6は、クローンHKABR62におけるヒトcDNAのヌクレオチド配列(
配列番号11)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号12
)を示す。
配列番号11)およびそれによりコードされる推定アミノ酸配列(配列番号12
)を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 29/00 A61P 31/00 4H045 31/00 35/00 35/00 37/06 37/06 C07K 14/81 C07K 14/81 16/40 16/40 C12N 1/15 C12N 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 C12Q 1/37 5/10 A61K 37/547 15/09 ZNA C12N 5/00 A C12Q 1/37 15/00 ZNAA (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM ,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM) ,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG, BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,D K,EE,ES,FI,GB,GE,GH,GM,HR ,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG, KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,L U,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO ,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG, SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,UA,U G,US,UZ,VN,YU,ZW (71)出願人 9410 Key West Avenue, Rockville, Marylan d 20850, United State s of America (72)発明者 ニ, ジアン アメリカ合衆国 メリーランド 20853, ロックビル, マナーフィールド ロー ド 5502 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA14 BA53 CA01 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ36 QQ79 QS33 QX07 4B065 AA90X AA91X AA93Y AB01 BA02 CA33 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 BA01 BA19 BA44 DC03 NA14 ZB012 ZB112 ZB312 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA75 DA89 EA21 EA50 FA74
Claims (20)
- 【請求項1】 単離された核酸分子であって、以下: (a)配列番号2の32〜283残基; (b)配列番号4の24〜207残基; (c)配列番号6の18〜162残基; (d)配列番号8の20〜422残基; (e)配列番号10の50〜316残基;および (f)配列番号12の20〜76残基、 からなる群から選択される配列に、少なくとも95%同一のアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。 - 【請求項2】 配列番号1および配列番号3からなる群から選択されるヌク
レオチド配列を含む、請求項1に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項3】 配列番号5および配列番号7からなる群から選択されるヌク
レオチド配列を含む、請求項1に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項4】 配列番号9および配列番号11からなる群から選択されるヌ
クレオチド配列を含む、請求項1に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項5】 配列番号1として示されるヌクレオチド配列を含む、請求項
1に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項6】 単離された核酸分子であって、以下: (a)配列番号2の少なくとも30個連続したアミノ酸残基; (b)配列番号4の少なくとも30個連続したアミノ酸残基; (c)配列番号6の少なくとも30個連続したアミノ酸残基; (d)配列番号8の少なくとも30個連続したアミノ酸残基; (e)配列番号10の少なくとも30個連続したアミノ酸残基;および (f)配列番号12の少なくとも30個連続したアミノ酸残基、 からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、
単離された核酸分子。 - 【請求項7】 請求項1に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
- 【請求項8】 遺伝子発現を制御する異種調節エレメントに作動可能に連結
された請求項1に記載の核酸分子を含む、核酸分子。 - 【請求項9】 請求項7に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 【請求項10】 請求項8に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
- 【請求項11】 単離されたポリペプチドであって、以下: (a)配列番号2の32〜283残基; (b)配列番号4の24〜207残基; (c)配列番号6の18〜162残基; (d)配列番号8の20〜422残基; (e)配列番号10の50〜316残基;および (f)配列番号12の20〜76残基、 からなる群から選択される配列に、少なくとも95%同一のアミノ酸配列を含む
、単離されたポリペプチド。 - 【請求項12】 単離されたポリペプチドであって、以下: (a)配列番号2の少なくとも30個連続したアミノ酸残基; (b)配列番号4の少なくとも30個連続したアミノ酸残基; (c)配列番号6の少なくとも30個連続したアミノ酸残基; (d)配列番号8の少なくとも30個連続したアミノ酸残基; (e)配列番号10の少なくとも30個連続したアミノ酸残基;および (f)配列番号12の少なくとも30個連続したアミノ酸残基、 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 【請求項13】 請求項11に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
合する、単離された抗体。 - 【請求項14】 請求項11に記載のポリペプチドを含む、組成物。
- 【請求項15】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、以下: (a)該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項10に記載の宿主
細胞を培養する工程;および (b)該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項16】 請求項15に記載の方法によって産生される、ポリペプチ
ド。 - 【請求項17】 医学的状態を処置する方法であって、請求項11に記載の
ポリペプチドの治療的有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。 - 【請求項18】 被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対す
る感受性を診断する方法であって、以下: (a)請求項1に記載のポリヌクレオチドにおいて変異の存在または非存在を
決定する工程;および (b)該変異の存在もしくは非存在に基づいて、病理学的状態または病理学的
状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項19】 被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対す
る感受性を診断する方法であって、以下: (a)生物学的サンプルにおいて請求項11に記載のポリペプチドの発現の存
在または量を決定する工程;および (b)該ポリペプチドの発現の存在もしくは量に基づいて病理学的状態または
病理学的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項20】 請求項11に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
を同定するための方法であって、以下: (a)請求項11に記載のポリペプチドを結合パートナーと接触する工程;お
よび (b)該結合パートナーが該ポリペプチドの活性に効果をもたらすか否かを決
定する工程、 包含する、方法。
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