JP2002333420A

JP2002333420A - バイオセンサおよび基質の定量方法

Info

Publication number: JP2002333420A
Application number: JP2002057681A
Authority: JP
Inventors: Kiichi Watanabe; 基一渡邊; Yoshikazu Hasegawa; 美和長谷川; Tomohiro Yamamoto; 智浩山本; Toshihiko Yoshioka; 俊彦吉岡; Shiro Nankai; 史朗南海
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2001-03-07
Filing date: 2002-03-04
Publication date: 2002-11-22

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、高い応答性を有する、コレステロ
ールを酸化する酵素およびコレステロールエステラーゼ
を含むバイオセンサを提供する。【解決手段】本発明のバイオセンサは、絶縁性の基
板、前記基板上に形成された測定極および対極を含む電
極系、前記電極系上に形成された親水性高分子層、前記
基板に組み合わされて基板との間に試料供給口から前記
電極系に試料液を導く試料供給路を形成するカバー部
材、および前記試料供給路内に設けられた試薬層を具備
し、前記試薬層が、コレステロールを酸化する酵素、コ
レステロールエステラーゼ、電子メディエータ、および
酸性のｐＨ領域に緩衝能を有する緩衝剤を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の特定成分
を迅速かつ簡便に定量することができるバイオセンサ、
および基質の定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、試料液の希釈や攪拌などを行
うことなく試料液中の特定成分を簡易に定量する方式と
して、様々なバイオセンサが提案されている。バイオセ
ンサの一例として、例えば次のようなセンサが知られて
いる（特開２０００−３９４１６号公報参照）。このバ
イオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷などの方
法で測定極、対極および参照極からなる電極系を形成
し、この電極系上に接して酸化酵素と電子メディエータ
とを含む酵素反応層を形成したものである。

【０００３】このバイオセンサの酵素反応層上に基質を
含む試料液を滴下すると、酵素反応層が溶解して酵素と
基質が反応し、これにともなって電子メディエータが還
元される。酵素反応終了後、還元された電子メディエー
タを電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値
から試料液中の基質濃度を求めることができる。この従
来のバイオセンサでは、血液、血漿、または血清等の試
料液中のコレステロール濃度を測定するため、エステル
型コレステロールを脱エステル化するコレステロールエ
ステラーゼと、遊離型コレステロールを酸化するコレス
テロール酸化酵素であるコレステロールオキシダーゼの
２種類の酵素を含む。しかしながら、血液、血漿、また
は血清等の測定試料は、中性付近にｐＨ緩衝能を有する
ため、コレステロールを酸化する酵素およびコレステロ
ールエステラーゼを含むバイオセンサにとって、必ずし
も好ましいｐＨ条件ではなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
問題点に鑑み、コレステロールを酸化する酵素およびコ
レステロールエステラーゼを含むバイオセンサの至適ｐ
Ｈおよび好ましい緩衝剤を明確にして、高い応答性を有
する高性能なバイオセンサを提供することを目的とす
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明によるバイオセン
サは、絶縁性の基板、前記基板上に形成された測定極お
よび対極を含む電極系、前記基板に組み合わされて基板
との間に試料供給口から前記電極系に試料液を導く試料
供給路を形成するカバー部材、および前記試料供給路内
に設けられた試薬層を具備し、前記試薬層が、コレステ
ロールを酸化する酵素、コレステロールエステラーゼ、
電子メディエータ、および酸性のｐＨ領域に緩衝能を有
する緩衝剤を含む。

【０００６】本発明による基質の定量方法は、絶縁性の
基板、前記基板上に形成された測定極および対極を含む
電極系、前記基板上に組み合わされて基板との間に試料
供給口から前記電極系に試料液を導く試料供給路を形成
するカバー部材、および前記試料供給路内に設けられ
た、コレステロールを酸化する酵素、コレステロールエ
ステラーゼ、および電子メディエータを含む試薬層を具
備するバイオセンサを用いる基質の定量方法であって、
測定試料を、酸性のｐＨ領域に緩衝能を有する緩衝剤と
混合する前処理工程、前記前処理工程により得られた溶
液を前記バイオセンサに供給する工程、および前記バイ
オセンサによって前記測定試料中の基質の定量を行う工
程を含む。

【０００７】本発明は、別の観点において、上記のバイ
オセンサ、並びに前記バイオセンサの測定極と対極との
間に電圧を印加する電圧印加手段および電圧を印加され
た前記測定極と対極との間に流れる電流を検知する電流
検出手段を備えた測定システムを提供する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明によるバイオセンサは、絶
縁性の基板、前記基板上に形成された測定極および対極
を含む電極系、前記基板に組み合わされて基板との間に
試料供給口から前記電極系に試料液を導く試料供給路を
形成するカバー部材、および前記試料供給路内に設けら
れた試薬層を具備し、前記試薬層が、コレステロールを
酸化する酵素、コレステロールエステラーゼ、電子メデ
ィエータ、および酸性のｐＨ領域に緩衝能を有する緩衝
剤を含むことを特徴とする。ここで、前記電極系上に
は、親水性高分子層が形成されていることが好ましい。

【０００９】本発明のバイオセンサは、試薬層が酸性の
ｐＨ領域に緩衝能を有する緩衝剤を含んでいるから、測
定試料液が中性付近に緩衝能を有する血液、血漿、また
は血清等である場合にも、試料に試薬層が溶解した反応
系のｐＨは酸性領域に調製される。このため、酵素の反
応性を向上させ、センサの応答性を向上することができ
る。また、反応系の基質濃度が高濃度であっても、一定
時間内に十分な応答値が得られるので、測定時間が短縮
できる。さらに、センサの応答性の向上に伴いＳ／Ｎ比
が向上する、すなわち測定精度が向上する。また、試薬
層が緩衝剤を含むと、溶液の展開および乾燥により形成
される試薬層が平滑化される。試薬層をその試薬の水溶
液からの乾燥により形成する場合、試薬の結晶の粗大化
などにより試薬層が凹凸を有するものとなることがあ
る。特に、電子メディエータのフェリシアン化カリウム
を含むとき顕著である。試薬層が緩衝剤を含むとそのよ
うな凹凸を有しない、平滑な試薬層が得られる。その理
由は、必ずしもここに述べる理論に拘束されるのを好む
ものではないが、緩衝剤はその溶液の乾燥により生成す
る結晶がより微細であるためと思われる。

【００１０】センサに試料液を供給して試薬層を試料液
に溶解する際、試薬層が凹凸を有すると、試料液と試薬
層の凹凸部との間に空気が介在し、そのため試薬層を溶
解した試料液中に気泡が生じることがある。試料液に気
泡が生じると、試料供給路中を試料液がスムーズに移動
できず、測定に支障を来すことがある。試薬層が平滑化
されることにより、前記のような不都合を解消すること
ができる。さらに試薬層が平滑化されるので、試料供給
路内の体積または高さを減少することができ、試料液の
微量化が実現される。

【００１１】ここで緩衝剤が、コハク酸、コハク酸塩、
Ｄ−酒石酸、クエン酸、クエン酸塩、フタル酸、フタル
酸塩、ｔｒａｎｓ−アクチニン酸、ギ酸、３，３−ジメ
チルグルタル酸、フェニル酢酸ナトリウム、酢酸、酢酸
塩、カコジル酸ナトリウム、マレイン酸、マレイン酸
塩、リン酸、リン酸塩、イミダゾール、２，４，６−ト
リメチルピリジン、トリエタノールアミン、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（以下Ｔｒｉｓで表
す）、２−モルホリノエタンスルホン酸（以下ＭＥＳで
表す）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジアセト酢酸
（以下ＡＤＡで表す）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス
（２−エタンスルホン酸）（以下ＰＩＰＥＳで表す）、
Ｎ−２−（アセトアミド）−２−アミノエタノールスル
ホン酸（以下ＡＣＥＳで表す）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（以下
ＢＥＳで表す）、３−モルホリノプロパンスルホン酸
（以下ＭＯＰＳで表す）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（以下ＴＥＳ
で表す）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’
−２−エタンスルホン酸（以下ＨＥＰＥＳで表す）、お
よびクロロ酢酸からなる群より選択されることが好まし
い。

【００１２】これらの中で、溶解性が十分高いという観
点から、コハク酸カリウム、コハク酸ナトリウム等のコ
ハク酸塩、リン酸一水素二カリウム、リン酸二水素一カ
リウム、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸二水素一ナ
トリウム等のリン酸塩、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム
等の酢酸塩、フタル酸水素カリウム、フタル酸ナトリウ
ム、フタル酸カリウム等のフタル酸塩、マレイン酸水素
ナトリウム、マレイン酸カリウム、マレイン酸ナトリウ
ム等のマレイン酸塩が好ましい。これらコハク酸、コハ
ク酸塩、リン酸、リン酸塩、マレイン酸、マレイン酸
塩、フタル酸、フタル酸塩を用いると、特に応答値の向
上が著しく、応答の直線性に優れたバイオセンサが得ら
れる。さらに好ましくは、良好なバイオセンサ保存特性
が得られるという点でコハク酸がよい。

【００１３】上記の緩衝剤は、水に溶けやすいので、試
料液を添加した際、緩衝剤を含む層は直ちに試料液に溶
解し、酵素反応と電極反応を円滑に進めることができ
る。上記の緩衝剤は、必要に応じて塩酸、酢酸などの酸
や、ＮａＯＨ、ＫＯＨなどのアルカリによって、所定の
ｐＨ領域に緩衝能を有するように調製してバイオセンサ
の試料供給路内に添加すればよい。応答の直線性の向
上、および一定時間内において十分高い応答値を得ると
いう観点から、好適なｐＨは、４〜６．５である。さら
に好ましいｐＨは、４〜５．５である。

【００１４】測定試料が緩衝作用を有する場合もあるた
め、２種類以上の緩衝剤をバイオセンサに添加してもよ
い。緩衝剤の組み合わせとしては、コハク酸とマレイン
酸の混合物、コハク酸とリン酸の混合物、マレイン酸と
Ｔｒｉｓの混合物等が好ましい。上記緩衝剤の添加量
は、試料液として血液０．０４〜２０μｌを測定対象と
する使い捨てタイプのセンサでは、緩衝剤を含む層の効
果的な平滑化、およびブランク値の低減化という観点か
ら、センサ１個当たり５〜１０００ｎｍｏｌの範囲であ
ることが好ましい。さらに、緩衝剤を含む試薬層の溶解
性の向上およびブランク値の低減化という観点から、セ
ンサ１個当たり２０〜５００ｎｍｏｌであることがより
好ましい。ここで、ブランク値とは、基質濃度が０の測
定試料、例えば、水に対する応答値をいう。測定を迅速
化するため、センサへ試料を供給してから応答値を得る
までの測定に要する時間を４分程度より短くするために
好ましい酵素量は、センサ１個当たり、コレステロール
エステラーゼが０．１〜１０Ｕ、コレステロールオキシ
ダーゼが０．０３〜３Ｕである。

【００１５】本発明の好ましい実施の形態において、前
記コレステロールを酸化する酵素および前記コレステロ
ールエステラーゼと、前記電子メディエータとが互いに
離れて担持されている。この実施の形態によれば、ブラ
ンク値が低いバイオセンサが得られる。さらに、保存に
よる応答値増加が防止されるので、保存特性に優れたバ
イオセンサが得られる。本発明の他の好ましい実施の形
態において、前記緩衝剤が、前記コレステロールを酸化
する酵素またはコレステロールエステラーゼと混合して
担持されている。この実施の形態によれば、コレステロ
ールを酸化する酵素またはコレステロールエステラーゼ
を含む層が平滑化されるので、測定試料をセンサに供給
する時に、気泡が混入することを防ぐことができる。

【００１６】本発明のさらに他の好ましい実施の形態に
おいて、前記緩衝剤が、前記電子メディエータと混合し
て担持されている。この実施の形態によれば、電子メデ
ィエータを含む層が平滑化されるので、測定試料供給時
に気泡が混入することを防ぐことができる。本発明の好
ましい実施の形態において、前記緩衝剤が、前記コレス
テロールを酸化する酵素、前記コレステロールエステラ
ーゼおよび前記電子メディエータから離れて担持されて
おり、かつ前記試料供給路内において、前記コレステロ
ールを酸化する酵素、前記コレステロールエステラーゼ
および前記電子メディエータよりも前記試料供給口に近
い位置に担持されている。この実施の形態によれば、バ
イオセンサに供給された測定試料は、まず緩衝剤を溶解
することで、測定試料のｐＨがすみやかに酸性側に調製
されるという効果を有する。

【００１７】本発明の他の好ましい実施の形態におい
て、さらに前記試料供給路内にフィルターを有する。試
料として血液を用いたとき、このフィルタにより、血球
成分が濾過され、血球成分が電極に対して与える影響を
防ぐことができる。前記フィルタが、試料供給路内にお
いて、試料供給口に近い位置にあると、試料から血球成
分をより効果的に除去できるので、より好ましい。前記
フィルタが、試料供給路のうち試料供給口に近い位置に
セットされていると、試料として血液を用いたときに、
酵素や電子メディエータなどの試薬や電極へ血球成分が
接触することをより効果的に防止することができる。フ
ィルタとしては、ガラスフィルタ、濾紙、セルロース繊
維等が用いられる。

【００１８】本発明のバイオセンサが測定する対象とし
ては、体液が挙げられる。体液としては、血液、血漿、
血清、リンパ液、細胞間質液、汗のいずれかが挙げられ
る。特に、血液、血漿、および血清に含まれるコレステ
ロールの一部は、脂肪酸が結合したコレステロールエス
テルとして存在している。本発明のバイオセンサは、コ
レステロールエステラーゼを含み、その触媒作用によっ
て、コレステロールエステルを遊離型のコレステロール
に変換し、これをコレステロールオキシダーゼ等により
酸化する。

【００１９】本発明は、別の観点において、上記のバイ
オセンサ、並びに前記バイオセンサの測定極と対極との
間に電圧を印加する電圧印加手段および電圧を印加され
た前記測定極と対極との間に流れる電流を検知する電流
検出手段を備えた測定システムを提供する。本発明の好
ましい測定システムは、さらに前記電流検出手段の検知
した電流または前記電流を例えばコレステロール値に変
換した値を表示する表示部を有する。

【００２０】本発明は、さらに、絶縁性の基板、前記基
板上に形成された測定極および対極を含む電極系、前記
電極系上に形成された親水性高分子層、前記基板に組み
合わされて基板との間に試料供給口から前記電極系に試
料液を導く試料供給路を形成するカバー部材、および前
記試料供給路内に設けられた試薬層を具備し、前記試薬
層が、コレステロールを酸化する酵素、コレステロール
エステラーゼ、および電子メディエータを含むバイオセ
ンサを用いる基質の定量方法であって、酸性のｐＨ領域
に緩衝能を有する緩衝剤と測定試料とを混合する前処理
工程、記前処理工程がされた溶液を前記バイオセンサに
供給する工程、および前記バイオセンサによって前記測
定試料中の基質の定量を行う工程を含む基質の定量方法
を提供する。この方法によると、前処理工程によって、
測定試料のｐＨがすみやかに酸性側に調製されるので、
酵素の反応性を向上し、センサの応答性を向上すること
ができる。

【００２１】本発明は、酸性のｐＨ領域に緩衝能を有す
る緩衝剤および酵素を含み、前記酵素が少なくともコレ
ステロールを酸化する酵素およびコレステロールエステ
ラーゼである酵素試薬を提供する。この酵素試薬をバイ
オセンサに添加するだけで、応答性が向上したバイオセ
ンサが得られる。本発明においてコレステロールを酸化
する酵素としては、コレステロールオキシダーゼおよび
コレステロールデヒドロゲナーゼが挙げられる。電子メ
ディエータとしては、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベ
ンゾキノンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェ
ート、メチレンブルー、フェロセンおよびその誘導体な
どを用いることができる。中でも、空気中において安定
な酸化還元を行うことができるフェリシアン化カリウム
が好ましい。

【００２２】親水性高分子は、電極系表面または基板表
面から、コレステロールを酸化する酵素、コレステロー
ルエステラーゼ、電子メディエータ、緩衝剤等の試薬を
含む試薬層の剥離を防ぐことができる。さらに、親水性
高分子は、前記試薬層表面の割れを防ぐ効果も有してお
り、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。
このような親水性高分子としては、カルボキシメチルセ
ルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロー
ス、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメ
チルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビ
ニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリ
スチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アク
リル酸またはその塩の重合体、メタクリル酸またはその
塩の重合体、スターチおよびその誘導体、無水マレイン
酸またはその塩の重合体、アガロースゲルおよびその誘
導体があげられる。特に、十分な粘度が得られることか
ら、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセ
ルロース、およびポリビニルピロリドンが好ましい。

【００２３】本発明は、微量の試料量で精度の高い測定
値の得られるバイオセンサを提供することをも意図して
いる。そのような目的には、後述のような構造のセンサ
が適する。特に、試料供給口から空気孔に至る試料供給
路のサイズを、幅０．４〜４ｍｍ、高さ０．０５〜０．
５ｍｍ、長さ２〜１０ｍｍとするのが好ましい。さらに
好ましいセンサは、試料供給路のサイズが、幅０．５〜
２ｍｍ、高さ０．０５〜０．２ｍｍ、長さ３〜５ｍｍで
あり、試料量は０．０７５〜２μｌとなる。以下に、実
施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらのみ
に限定されるものではない。

【００２４】

【実施例】《実施例１》図１は、本発明のバイオセンサ
において酸性溶液を与える緩衝剤を用いることの効果を
実証するために用いた、バイオセンサの斜視図を示す。
ポリエチレンテレフタレートからなる電気絶縁性の基板
１上に、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷し、リ
ード２および３を形成している。ついで、樹脂バインダ
ーを含む導電性カーボンペーストを基板１上に印刷して
測定極４を形成している。この測定極４は、リード２と
接触している。さらに、この基板１上に、絶縁性ペース
トを印刷して絶縁層６を形成している。絶縁層６は、測
定極４の外周部を覆っており、これにより測定極４の露
出部分の面積を一定に保っている。そして、樹脂バイン
ダーを含む導電性カーボンペーストをリード３と接触す
るように基板１上に印刷してリング状の対極５を形成し
ている。測定極４および対極５から電極系が形成され
る。

【００２５】コレステロールを酸化する酵素およびコレ
ステロールエステラーゼを用いたバイオセンサの至適ｐ
Ｈ、および好ましい緩衝剤を明確にするため、上記バイ
オセンサを用いて以下の実験を行った。まず、コレステ
ロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、お
よび１種類の緩衝剤を含む水溶液を調製した。次に、フ
ェリシアン化カリウム、およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００
を含む水溶液を調製した。測定試料としてヒト血清を用
いた。緩衝剤は、コハク酸、マレイン酸、リン酸、およ
びＴｒｉｓの中から１種類選択した。コレステロール濃
度０ｍｇ／ｍｌに対する応答値を得るためには、ヒト血
清の代わりに水を用いた。上記３種の溶液をチューブ内
で撹拌、混合した。得られた混合溶液中の各試薬および
測定対象のコレステロールの濃度は次のとおりである。

【００２６】コレステロールエステラーゼ：２００ユニ
ット（Ｕ）／ｍｌコレステロールオキシダーゼ：１０００Ｕ／ｍｌ緩衝剤：１００ｍＭフェリシアン化カリウム：３００ｍＭＴｒｉｔｏｎＸ−１００：２ｗｔ％コレステロール：０〜１１６ｍｇ／ｄｌ

【００２７】前記の混合された溶液中では、血清中に含
まれるエステル型コレステロールは、コレステロールエ
ステラーゼによって、脱エステル化される。この脱エス
テル化されたコレステロール、および初めから血清に含
まれているコレステロールは、コレステロールオキシダ
ーゼによって酸化される。同時に、溶液中のフェリシア
ン化カリウムがフェロシアン化カリウムに還元される。

【００２８】次に、上記の混合液を図１に示す電極系上
に１０μｌ（マイクロリットル）滴下した。３種の溶液
を混合してから２０秒後に、対極を基準として測定極に
５００ｍＶの電圧を印加した。このとき、溶液中に含ま
れるフェロシアン化イオンが酸化され、測定極と対極の
間に電流が流れる。電圧を印加して５秒後に測定極およ
び対極間を流れる電流値を測定した。最後に、血清が緩
衝能を有するため、混合溶液のｐＨを実測した。緩衝剤
の一例としてマレイン酸を用い、種々の総コレステロー
ル濃度に調製された混合溶液の応答電流値を測定した。
横軸に混合溶液の総コレステロール濃度、縦軸に応答電
流値をプロットしてセンサの応答特性図を作成した。そ
れを図２に示す。その結果、溶液のｐＨが酸性領域にあ
る場合に、より応答値が高く、よりよい応答の直線性が
得られた。また、ｐＨが酸性領域にある場合、一定時間
内に応答の直線性が得られることから、酸性の緩衝剤の
添加によって、測定時間の短縮を実現できた。

【００２９】次に、緩衝剤としてコハク酸を用いた場合
のセンサの応答特性図を図３に示す。その結果、ｐＨ４
または５のいずれの場合にも応答値が高く、よりよい応
答の直線性が得られた。また、応答直線の傾き向上によ
るＳ／Ｎ比向上、すなわち測定精度の向上が望める。コ
ハク酸、マレイン酸、リン酸、およびＴｒｉｓをそれぞ
れ緩衝剤に用いたときの結果を図４に示す。この図から
センサのｐＨ依存性が明らかである。混合液のｐＨを酸
性領域に調製した場合に、より高い応答値が得られるこ
とが明らかになった。一方、混合液のｐＨを８より高く
した場合は、ブランク応答（コレステロール０ｍｇ／ｄ
ｌに対する電流応答値）が高いことが明らかとなり、不
適であった。最適なｐＨは、４〜６．５であり、さらに
好ましくは、４〜５．５であった。この実験で用いた酵
素の至適ｐＨは、コレステロールエステラーゼがｐＨ
６．５以下、コレステロールオキシダーゼがｐＨ７付近
であった。よって、これらの結果は、コレステロールエ
ステラーゼの至適ｐＨにより近いｐＨに、試料液のｐＨ
を調節することで、より高い応答値が得られることを示
している。

【００３０】《実施例２》図５および図６を用いて本実
施例を説明する。図５は、本実施例におけるバイオセン
サの試薬層を除いた分解斜視図であり、図６はその縦断
面図である。基板１は、図１と同様の電極系を有する。
この基板に組み合わせるカバー部材は、スリット８を有
するスペーサ７、および空気孔１０を有するカバー９か
らなる。後述のように各試薬層を形成した後、図５の一
点鎖線で示すような位置関係をもって、基板１にスペー
サ７およびカバー９を接着することにより、バイオセン
サが組み立てられる。このバイオセンサは、スペーサ７
のスリット８の部分に試料供給路が形成される。センサ
の端部におけるスリット８の開放端部８ａは、試料供給
路への試料供給口となる。ここに用いた基板１のサイズ
は、幅６ｍｍ、長さ３０ｍｍである。試料供給口から空
気孔に至る試料供給路の内容積のサイズは、幅２．０ｍ
ｍ、高さ０．１ｍｍ、長さ５．０ｍｍである。

【００３１】電極系を形成した基板１上に、親水性高分
子の一種であるカルボキシメチルセルロース（以下ＣＭ
Ｃで表す）の０．５ｗｔ％水溶液を４μｌ滴下し、５０
℃で１５分間乾燥することによりＣＭＣ層１１を形成し
た。次いで、このＣＭＣ層１１上に、緩衝剤の一種であ
るコハク酸、および電子メディエータの一種であるフェ
リシアン化カリウムを含む電子メディエータ・緩衝剤層
１２を形成した。電子メディエータ・緩衝剤層１２の作
製方法は、以下の通りである。まず、ｐＨ５に調製した
コハク酸濃度２０ｍＭの緩衝液に、フェリシアン化カリ
ウムを７５ｍＭとなる量を添加し、溶解した。次に、こ
のフェリシアン化カリウムを含むコハク酸緩衝液を、Ｃ
ＭＣ層１１上に４μｌ滴下した後、５０℃において１５
分間乾燥した。

【００３２】一方、スペーサ７とカバー９を張り合わせ
たカバー部材における試料供給路となるスリット８に面
するカバー９側には、コレステロールエステラーゼ９０
０Ｕ／ｍｌ、コレステロールオキシダーゼ４００Ｕ／ｍ
ｌ、並びに界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を
１．６ｗｔ％およびコール酸ナトリウムを３０ｍＭ含む
水溶液０．５μｌを滴下し、凍結乾燥することで、酵素
・界面活性剤層１３を形成した。酵素・界面活性剤層１
３を形成したカバー部材と、ＣＭＣ層１１および電子メ
ディエータ・緩衝剤層１２を形成した基板１とを張り合
わせてバイオセンサが完成する。

【００３３】測定試料がセンサ内に導入されると、電子
メディエータ・緩衝剤層１２に含まれるコハク酸が溶解
して、センサ内の溶液のｐＨを酸性側に調製する。その
ため、酵素の活性が向上して、センサの応答性が向上す
る効果が得られる。そして、一定時間内に十分な応答が
得られるので、測定時間が短縮されるという効果が得ら
れる。また、電子メディエータ・緩衝剤層１２に含まれ
るコハク酸が、層１２自体を平滑化するので、電極系上
への気泡の混入を防止するという効果が得られる。さら
に、酵素と電子メディエータとが互いに離れて担持され
ているので、ブランク値が低いバイオセンサが得られ
る。酵素と電子メディエータとが互いに離れて担持され
ているので、保存特性に優れたバイオセンサが得られ
る。すなわち、保存後のバイオセンサにおいても作製直
後のバイオセンサと同等の応答値を示し、ブランク値の
増加その他により保存後の応答値が不当に増加するのが
抑制される。

【００３４】バイオセンサ内における酵素、またはフェ
リシアン化カリウムは、本発明の効果を損なわない限
り、種々の位置に配置することができる。例えば、フェ
リシアン化カリウムは、試料供給路内のＣＭＣ層上以外
の場所にも配置することができる。本実施例では、界面
活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびコール酸ナ
トリウムを用いたが、他のオクチルチオグルコシド、Ｌ
ｕｂｒｏｌ、コール酸、デオキシコール酸ナトリウム、
ジギトニン、ドデシルマルトシド、シュクロースモノラ
ウレート、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ポリオ
キシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル等の
界面活性剤を用いてもよい。酵素反応に伴い還元された
電子メディエータを酸化する電流の測定方法としては、
測定極と対極のみの二電極方式と、さらに参照極を加え
た三電極方式の両方の方式が可能である。

【００３５】《実施例３》本実施例のバイオセンサを図
７に示す。まず、基板１上に、実施例２と同様にして、
ＣＭＣ層１１を形成した。次に、ｐＨ５に調製したマレ
イン酸緩衝液に、コレステロールエステラーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ、フェリシアン化カリウム、Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００、およびコール酸ナトリウムを加え
た水溶液を調製した。この水溶液中の各試薬の濃度は、
マレイン酸：２００ｍＭ、コレステロールエステラー
ゼ：９００Ｕ／ｍｌ、コレステロールオキシダーゼ：４
００Ｕ／ｍｌ、フェリシアン化カリウム：６００ｍＭ、
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：１．６ｗｔ％、コール酸ナト
リウム：３０ｍＭである。この水溶液をＣＭＣ層１１上
に０．５μｌ滴下して凍結乾燥することで酵素・界面活
性剤・電子メディエータ・緩衝剤層１４を形成した。

【００３６】本実施例では、ＣＭＣ以外の全ての試薬を
一度に滴下し乾燥するので、作製方法が最も容易である
という利点を有する。また、測定試料がセンサ内に導入
されると、酵素・界面活性剤・電子メディエータ・緩衝
剤層１４に含まれるマレイン酸が溶解して、センサ内の
溶液のｐＨを酸性側に調製する。そのため、酵素の活性
が向上して、センサの応答性が向上する効果が得られ
る。

【００３７】《実施例４》本実施例のバイオセンサを図
８に示す。電極系を形成した基板１上に、実施例２と同
様にして、ＣＭＣ層１１を形成した。次いで、ＣＭＣ層
１１上に、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．１６ｗｔ％、
コール酸ナトリウムを３ｍＭ、およびフェリシアン化カ
リウムを７５ｍＭ含む水溶液を５μｌ滴下した後、５０
℃において１５分間乾燥して、界面活性剤・電子メディ
エータ層１５を形成した。一方、試料供給路内のカバー
９側には、コレステロールエステラーゼ９００Ｕ／ｍ
ｌ、コレステロールオキシダーゼ４００Ｕ／ｍｌ、およ
び緩衝剤の一種であるリン酸を２０ｍＭ含む水溶液を
０．５μｌ滴下した後に凍結乾燥することで酵素・緩衝
剤層１６を形成した。

【００３８】測定試料がセンサ内に導入されると、酵素
・緩衝剤層１６に含まれるリン酸が溶解して、センサ内
の溶液のｐＨを酸性側に調製する。そのため、酵素の活
性が向上して、センサの応答性が向上する効果が得られ
る。また、酵素・緩衝剤層１６に含まれるリン酸が、層
１６自体を平滑化するので、電極系上への気泡の混入を
防止するという効果が得られる。さらに、酵素と電子メ
ディエータとが互いに離れて担持されているので、ブラ
ンク値が低く、保存による応答値増加が防止され、保存
特性に優れたバイオセンサが得られる。

【００３９】《実施例５》図９および図１０を用いて、
本実施例を説明する。図９は本実施例におけるバイオセ
ンサの試薬層を除いた分解斜視図であり、図１０は同バ
イオセンサの縦断面図である。基板２１は、実施例１と
同様にして、リード２２に接続された測定極２４、リー
ド２３に接続された対極２５および絶縁層２６を有す
る。基板２１上に電極系を覆うように、実施例２と同様
にして、ＣＭＣ層３２を形成した。次いで、ＣＭＣ層３
２上に、フェリシアン化カリウムの７５ｍＭ水溶液を５
μｌ滴下した後、５０℃において１５分間乾燥し、電子
メディエータ層３３を形成した。

【００４０】一方、スペーサ２７とカバー２９を張り合
わせたカバー部材側には、試料供給路内のカバー２９
に、コレステロールエステラーゼ９００Ｕ／ｍｌ、コレ
ステロールオキシダーゼ４００Ｕ／ｍｌ、並びに界面活
性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１．６ｗｔ％およ
びコール酸ナトリウムを３０ｍＭ含む水溶液を０．５μ
ｌ滴下した後に凍結乾燥することで酵素・界面活性剤層
３４を形成した。さらに、試料供給路内において、酵素
・界面活性剤層３４の上流には、測定試料に含まれる固
体成分を濾過するためのフィルタ３１を設けた。

【００４１】フィルタ３１は、例えば、測定試料が血液
である場合には、その血球を濾過し、血球成分が電極に
対して与える影響を防ぐ役割を果たす。図１０のよう
に、試料供給路において、フィルタ３１が試料供給口に
近い位置にあると、試料から血球成分をより効果的に除
去できるので、好ましい。フィルタ３１が、試料供給路
のうち試料供給口に近い位置にセットされると、試料と
して血液を用いたときに、電子メディエータ層３３、酵
素・界面活性剤層３４や電極へ、血球成分が接触するこ
とをより効果的に防止することができる。フィルタとし
ては、ガラスフィルタ、濾紙、セルロース繊維等の三次
元的に連なる多孔体が用いられる。この多孔体は、毛管
作用により血液を電極系側へ移動させるが、血漿と血球
との流通抵抗の差により血球を濾過する作用を有する。

【００４２】基板２１、スペーサ２７、およびカバー２
９を一点鎖線で示す位置関係で接着した際に、フィルタ
３１は基板２１の表面と３１’の部分において接する。
基板２１上のセンサ端部２１ａは、試料供給路への試料
供給口となる。ここに供給された試料は、フィルタ３１
に吸収され、毛管作用により電極系へ移動する。緩衝剤
であるコハク酸は、酵素・界面活性剤層３４および電子
メディエータ層３３より上流側に位置するフィルタ３１
内に含有させた。コハク酸の含有方法としては、フィル
タ３１を所定の位置に配置した後、コハク酸の水溶液を
フィルタ３１に滴下して、凍結乾燥する方法によった。

【００４３】本実施例では、試料供給路内において、コ
ハク酸が、酵素およびフェリシアン化カリウムより上流
に位置するので、測定試料がまずコハク酸を溶解するこ
とで、測定試料のｐＨが速やかに酸性側に調製される。
そのため、バイオセンサ内における酵素の活性が向上し
て、センサの応答性が向上する効果が得られる。

【００４４】《実施例６》図１１は、本発明の一実施例
における測定システムの回路構成を示すブロック図であ
る。測定装置４０は、バイオセンサ４１の測定極のリー
ド４２と対極のリード４３とを通して両電極間に制御さ
れた電圧を印加する電圧印加装置４４およびセンサの測
定極と対極間に流れる電流を測定する電流測定器４５を
有する。測定された電流値は、表示部４６に表示され
る。表示部４６は、測定された電流値を例えばコレステ
ロールに換算して表示することもある。

【００４５】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、緩衝剤を
添加してバイオセンサ内の反応系のｐＨを酸性領域に調
製することで、バイオセンサの応答値を向上することが
でき、より良好な応答の直線性が得られる。また、一定
時間内に十分高い応答値が得られることから、測定時間
の短縮を実現することができる。さらに、緩衝剤がこれ
を含む試薬層を平滑化するので、測定試料を供給した時
に、気泡が混入することを防ぐことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のバイオセンサにおいて緩衝剤を用いる
ことの効果を実証するために用いた、バイオセンサの斜
視図である。

【図２】同バイオセンサにおいて緩衝剤としてマレイン
酸を用いた場合の応答特性を示す図である。

【図３】同バイオセンサにおいて緩衝剤としてコハク酸
を用いた場合の応答特性を示す図である。

【図４】同バイオセンサにおいて各種緩衝剤を用いた場
合の応答特性を示す図である。

【図５】本発明の一実施例におけるバイオセンサの試薬
層を除いた分解斜視図である。

【図６】同バイオセンサの縦断面図である。

【図７】本発明の他の実施例におけるバイオセンサの縦
断面図である。

【図８】本発明のさらに他の実施例におけるバイオセン
サの縦断面図である。

【図９】本発明のさらに他の実施例におけるバイオセン
サの試薬層を除いた分解斜視図である。

【図１０】同バイオセンサの縦断面図である。

【図１１】本発明の実施例における測定システムの回路
構成を示すブロック図である。

【符号の説明】

１基板２、３リード４測定極５対極６絶縁層７スペーサ８スリット９カバー１０空気孔１１ＣＭＣ層１２電子メディエータ・緩衝剤層１３酵素・界面活性剤層

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｐ３５３Ｒ (72)発明者山本智浩大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者吉岡俊彦大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者南海史朗大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内Ｆターム(参考） 2G045 AA13 BA01 BB05 BB52 CA25 CA26 CA30 DA69 FB01 FB05 GC20 HA01 4B029 AA07 AA21 BB20 CC01 CC03 CC08 FA12 4B063 QA01 QQ03 QQ76 QR03 QR12 QR50 QR51 QR52 QR85 QS39 QX04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】絶縁性の基板、前記基板上に形成された
測定極および対極を含む電極系、前記基板に組み合わさ
れて基板との間に試料供給口から前記電極系に試料液を
導く試料供給路を形成するカバー部材、および前記試料
供給路内に設けられた試薬層を具備し、前記試薬層が、
コレステロールを酸化する酵素、コレステロールエステ
ラーゼ、電子メディエータ、および酸性のｐＨ領域に緩
衝能を有する緩衝剤を含むことを特徴とするバイオセン
サ。
【請求項２】前記緩衝剤が、コハク酸、コハク酸塩、
クエン酸、クエン酸塩、フタル酸、フタル酸塩、マレイ
ン酸、マレイン酸塩、リン酸、およびリン酸塩からなる
群より選択される請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】前記緩衝剤がｐＨ４〜６．５の領域に緩
衝能を有する請求項２記載のバイオセンサ。
【請求項４】前記緩衝剤の量がセンサ１個当たり５〜
１０００ｎｍｏｌである請求項３記載のバイオセンサ。
【請求項５】前記緩衝剤の量がセンサ１個当たり２０
〜５００ｎｍｏｌである請求項４記載のバイオセンサ。
【請求項６】前記コレステロールを酸化する酵素およ
びコレステロールエステラーゼと、前記電子メディエー
タとが互いに離れて前記試料供給路内に担持されている
請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項７】前記緩衝剤が、前記コレステロールを酸
化する酵素またはコレステロールエステラーゼと混合し
て担持されている請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項８】前記緩衝剤が、前記電子メディエータと
混合して担持されている請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項９】前記緩衝剤が、前記コレステロールを酸
化する酵素、前記コレステロールエステラーゼおよび前
記電子メディエータから離れて担持されており、かつ前
記試料供給路内において、前記コレステロールを酸化す
る酵素、前記コレステロールエステラーゼおよび前記電
子メディエータよりも前記試料供給口に近い位置に担持
されている請求項１記載のバイオセンサ
【請求項１０】さらに前記試料供給路内にフィルター
を有する請求項１記載のバイオセンサ
【請求項１１】前記フィルターが試料供給口に近い位
置にある請求項１０記載のバイオセンサ
【請求項１２】前記フィルタが前記緩衝剤を担持して
いる請求項１０記載のバイオセンサ。
【請求項１３】前記コレステロールを酸化する酵素
が、コレステロールオキシダーゼである請求項１記載の
バイオセンサ。
【請求項１４】測定対象が体液である請求項１記載の
バイオセンサ。
【請求項１５】前記体液が血液、血漿、リンパ液、ま
たは細胞間質液である請求項１４記載のバイオセンサ。
【請求項１６】絶縁性の基板、前記基板上に形成され
た測定極および対極を含む電極系、前記基板に組み合わ
されて基板との間に試料供給口から前記電極系に試料液
を導く試料供給路を形成するカバー部材、および前記試
料供給路内に設けられた試薬層を具備し、前記試薬層
が、コレステロールを酸化する酵素、コレステロールエ
ステラーゼ、電子メディエータ、および酸性のｐＨ領域
に緩衝能を有する緩衝剤を含むバイオセンサ、並びに前
記測定極と対極との間に電圧を印加する電圧印加手段お
よび電圧を印加された前記測定極と対極との間に流れる
電流を検知する電流検出手段を備えた測定システム。
【請求項１７】さらに前記電流検出手段の検知した電
流または前記電流を変換した値を表示する表示部を有す
る請求項１６記載の測定システム。
【請求項１８】絶縁性の基板、前記基板上に形成され
た測定極および対極を含む電極系、前記基板に組み合わ
されて基板との間に試料供給口から前記電極系に試料液
を導く試料供給路を形成するカバー部材、および前記試
料供給路内に設けられた試薬層を具備し、前記試薬層
が、コレステロールを酸化する酵素、コレステロールエ
ステラーゼ、および電子メディエータを含むバイオセン
サを用いる基質の定量方法であって、酸性のｐＨ領域に
緩衝能を有する緩衝剤と測定試料とを混合する前処理工
程、前記前処理工程がされた溶液を前記バイオセンサに
供給する工程、および前記バイオセンサによって前記測
定試料中の基質の定量を行う工程を含む基質の定量方
法。
【請求項１９】酸性のｐＨ領域に緩衝能を有する緩衝
剤および酵素を含み、前記酵素が少なくともコレステロ
ールを酸化する酵素およびコレステロールエステラーゼ
である酵素試薬。
【請求項２０】前記緩衝剤が、コハク酸、コハク酸
塩、クエン酸、クエン酸塩、フタル酸、フタル酸塩、マ
レイン酸、マレイン酸塩、リン酸、およびリン酸塩から
なる群より選択される請求項１９記載の酵素試薬。