JP2002316998A

JP2002316998A - リカバリン由来癌抗原ペプチド

Info

Publication number: JP2002316998A
Application number: JP2001122609A
Authority: JP
Inventors: Noriyuki Sato; 昇志佐藤; Akiko Maeda; 亜希子前田; Hiroshi Oguro; 浩大黒
Original assignee: Hokkaido Technology Licensing Office Co Ltd
Current assignee: Hokkaido Technology Licensing Office Co Ltd
Priority date: 2001-04-20
Filing date: 2001-04-20
Publication date: 2002-10-31

Abstract

(57)【要約】【課題】癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導
しうるペプチドを提供する。【解決手段】以下のアミノ酸配列： Gln Phe Gln Ser Ile Tyr Ala Lys Phe 、 Gln Phe Gln Ser Ile Tyr Ala Lys Phe Phe 及び、 Ala Tyr Ala Gln His Val Phe Arg Ser Phe からなる群より選ばれるアミノ酸配列からなるペプチ
ド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、癌細胞を標的とする細
胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬという）を誘導すること
ができるペプチドに関する。また本発明は、前記ペプチ
ドを含む癌ワクチン及び抗癌剤に関する。更に本発明
は、癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導するための前記ペ
プチドの使用、得られたＣＴＬ及び前記ＣＴＬを含む抗
癌剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】癌治療においては、外科療法、化学療法
及び放射線療法とあわせて、免疫療法が行われている。
癌に対する生体防御機構を高めることで癌細胞を攻撃す
る免疫療法分野においては、１９８０年代までは、ＢＣ
Ｇ及びＯＫ４３２等の菌体成分を用いた非特異的方法が
中心であった。１９９０年前後には、サイトカインやそ
の遺伝子が明らかにされ、これらを用いた免疫治療、例
えばＩＬ−２によりin vitroで非特異的に増やしたリン
パ球を患者に戻すＬＡＫ（lymphokine-activatedkille
r）療法などが行われた。しかしながら、これらの治療
法は免疫系が標的として認識する癌抗原の実体が明らか
にされていない状況下で行われたものなので、癌に対し
て非特異的な免疫治療法であった。１９９０年代にな
り、遺伝子クローニング技術及び生化学的酸抽出法を用
いてヒト悪性黒色種（メラノーマ）について多数の癌抗
原ペプチドが同定され、現在これらの癌抗原ペプチドを
用いた免疫治療の臨床試験が行われている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、臨床的に癌の
大部分を占める肺癌、胃癌、大腸癌などの上皮癌では癌
抗原がほとんど同定されておらず、これらを用いた免疫
療法は確立されていない。そこで本発明は、癌の免疫療
法に使用しうる癌ワクチン及び抗癌剤を提供することを
解決すべき課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、免疫学的
なヒト癌拒絶が主にＣＴＬ、特にＣＤ８（＋）ＣＴＬに
より担われていることに着目した。ＣＤ８（＋）ＣＴＬ
は癌細胞上の主要組織適合抗原複合体（ヒトではＨＬ
Ａ）と当該ＨＬＡ上に提示された癌抗原ペプチドとから
なる複合体を認識して活性化する。そして、活性化され
たＣＴＬはその細胞表面上のＴ細胞抗原レセプターを介
して癌細胞を認識し、これを攻撃する。したがって、癌
抗原ペプチドが同定されれば、これを癌ワクチン及び抗
癌剤として使用し、ＣＴＬを効率的に誘導して、癌を予
防及び治療することができる。リカバリンは、網膜の光
順応におけるロドプシンのリン酸化制御に関係するタン
パク質である。リカバリンは、健康な大人では網膜での
み発現し、他の正常組織では発現しない。しかしなが
ら、リカバリンは上皮癌細胞の約５０％で発現すること
が本発明者等により明らかにされている（Maeda等、 Ca
ncer Res., 60:1914-1920, 2000）。しかしながら、リ
カバリンが実際にＣＴＬを誘導しうるか否かは全く明ら
かにされていなかった。そこで、種々のリカバリン由来
のペプチドについて癌抗原性、すなわちＣＴＬ誘導能に
ついて鋭意検討を重ねたところ、特定のペプチドがＣＴ
Ｌを誘導することができることを見いだした。本発明は
この知見に基づいてなされたものである。すなわち、本
発明は、（１）配列番号１〜３からなる群より選ばれるアミノ酸
配列からなり、癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を
誘導しうるペプチド；（２）前記（１）のペプチドを含む癌ワクチン；（３）前記（１）のペプチドを含む抗癌剤；（４）癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する
ための前記（１）のペプチドの使用；（５）前記（１）のペプチドにより誘導された細胞傷害
性Ｔ細胞及び、（６）前記（５）の細胞傷害性Ｔ細胞を含む抗癌剤；である。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し
うるペプチドは、以下の配列： Gln Phe Gln Ser Ile Tyr Ala Lys Phe （配列番号１）、 Gln Phe Gln Ser Ile Tyr Ala Lys Phe Phe （配列番号２）及び、 Ala Tyr Ala Gln His Val Phe Arg Ser Phe （配列番号３）からなる群より選ばれるアミノ酸配列からなるペプチド
をいう。

【０００６】本発明のペプチドの同定は、以下の工程：（１）ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ
であるＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフに対応する配列を
有するリカバリン由来ペプチドを提供する工程、（２）
前記のペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４を発現する抗原提示
細胞に添加し、ＨＬＡ−Ａ２４により前記ペプチドを提
示している抗原提示細胞を得る工程、（３）前記抗原提
示細胞でＴ細胞を刺激してＣＴＬを誘導する工程、及
び、（４）誘導されたＣＴＬの癌細胞傷害能を測定する
工程、を含む方法により行うことができる。

【０００７】本発明のペプチドはアミノ酸数が９〜１０
と小さいので、一般的なアミノ酸の化学合成法、例えば
Ｆｍｏｃ法により合成することができる。市販のアミノ
酸合成装置を使用して合成することもできる。また、本
発明のペプチドはリカバリンに由来するので、癌患者の
癌細胞から文献（Cancer Res.,60:1914-1920）に記載の
方法にしたがいリカバリンを単離して、該当するペプチ
ドを得ることもできる。

【０００８】本発明のペプチドを使用して癌細胞を標的
とするＣＴＬを誘導することができる。誘導されたＣＴ
Ｌは癌細胞を認識して、これを攻撃する。したがって、
本発明のペプチドは癌ワクチン及び抗癌剤として使用す
ることができる。本発明の癌ワクチン及び抗癌剤を適用
しうる癌は、本発明のペプチドをＨＬＡ−Ａ２４により
提示している癌細胞からなる癌、例えば上皮癌である。
上皮癌としては、肺癌、消化器の癌、例えば胃癌、大腸
癌、膵癌等が挙げられる。本発明のペプチドを癌ワクチ
ン及び抗癌剤として使用する場合、本発明のペプチド
は、それ自身で又は補助剤と共に使用することができ、
更に医薬的に許容しうる担体を適宜含有させることがで
きる。補助剤としては、免疫応答の強化を目的とするア
ジュバント、例えばフロイドの不完全（完全）アジュバ
ント、アルミニウムアジュバント等が挙げられる。医薬
的に許容しうる担体としては、例えばＰＢＳ、蒸留水等
の希釈剤、生理食塩水等が挙げられる。本発明の癌ワク
チン及び抗癌剤は、当該技術分野において周知の方法に
より、液剤、油剤、エマルジョン、ソフトカプセル剤、
ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、固形剤等の形態にす
ることができる。本発明の癌ワクチン及び抗癌剤は、そ
の使用形態に応じて経口、非経口又は経皮投与すること
ができる。例えば、静注投与、筋射投与が挙げられる。
投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依
存して変化するが、成人に使用する場合、１日あたり最
大で５〜１０ｍｇである。例えば、成人の癌患者に皮下
注射により使用する場合、１週間あたり１００〜１００
０μｇであり、好ましくは１００〜２００μｇである。

【０００９】また、本発明のペプチドを、癌細胞を標的
とするＣＴＬを誘導するために使用することができる。
誘導は、例えば文献（Nabeta, Y.ら, Jpn. J. Cancer R
es.2000. 91:616-621）に記載の方法にしたがい行うこ
とができる。具体的には以下の工程：ＨＬＡ−Ａ２４を発現している
細胞を提供する工程、前記細胞に本発明のペプチドを添
加して、ＨＬＡ−Ａ２４上に提示させる工程、前記ペプ
チドをＨＬＡ−Ａ２４により提示している細胞でＴ細胞
を刺激し、前記Ｔ細胞を癌細胞標的ＣＴＬへ誘導する工
程、を含む方法を使用することができる。ＨＬＡ−Ａ２
４を発現する細胞は癌患者から採取したものでもよい
が、非ＨＬＡ−Ａ２４発現細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４をコ
ードする遺伝子を導入して作成してもよい。

【００１０】得られたＣＴＬは癌細胞を標的とするの
で、これを抗癌剤に使用することができる。この場合、
前記の本発明のペプチドを含む抗癌剤と同様に、適宜医
薬的に許容しうる担体を含み、かつ種々の形態をとるこ
とができる。本発明のＣＴＬを含む抗癌剤は、本発明の
ペプチドを含む癌ワクチン及び抗癌剤と同様に非経口投
与することができる。投与量は、通常、患者の体重、疾
患の性質及び状態に依存して変化するが、成人の癌患者
に皮下注射により使用する場合、１週間あたり１００〜
１０００μｇであり、好ましくは１００〜２００μｇで
ある。

【実施例】次に、実施例により本発明の効果を具体的に
説明するが、本発明は実施例に限定されるものではな
い。

【００１１】参考例１リカバリンｍＲＮＡの細胞株に
おける発現以下の細胞株、ＬＨＫ−２（肺腺癌細胞）、ＨＣ−ＭＡ
（下咽頭扁平上皮癌細胞）、ＯＳＣ７０（口腔扁平上皮
癌細胞）、１１０２ＭＥＬ（黒色腫細胞）、ＨＳＴ−２
（胃印環細胞癌細胞）、Ｃ１Ｒ（リンパ腫細胞）、ＬＢ
３３ＭＥＬ（黒色腫細胞）、Ａ５４９（肺癌細胞）、Ｋ
５６２（白血病細胞）、ＹＨＥＢＶ−ＢＣＬｓ（ＥＢウ
イルス感染細胞）及びＫＫＥＢＶ−ＢＣＬｓ（ＥＢウイ
ルス感染細胞）由来のｍＲＮＡ２μｇを、リカバリン
遺伝子特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲし、得ら
れたＰＣＲ産物を電気泳動した後、エチジウムブロマイ
ドで染色した。内部標準としてβ-アクチンを用いた。
図１に示されるように、構成的タンパク質であるβ−ア
クチンはいずれの細胞においても発現が見られた。一方
リカバリンは、癌細胞であるＬＨＫ−２、ＨＣ−ＭＡ、
ＯＳＣ２０、１１０２ＭＥＬ、ＨＳＴ−２、ＣＩＲでリ
カバリンｍＲＮＡの発現が見られたが、ＬＢ３３ＭＥ
Ｌ、Ａ５４９、Ｋ５６２及びＹＨＥＢＶ−ＢＣＬｓ及び
ＫＫＥＢＶ−ＢＣＬｓでは発現が見られなかった。この
結果より、リカバリンは多くの癌細胞に特異的に発現す
ることが理解される。

【００１２】実施例１本発明のリカバリン由来癌抗原
ペプチドの製造以下のアミノ酸配列： Gln Phe Gln Ser Ile Tyr Ala Lys Phe （配列番号１）、 Gln Phe Gln Ser Ile Tyr Ala Lys Phe Phe （配列番号２）又は、 Ala Tyr Ala Gln His Val Phe Arg Ser Phe （配列番号３）を有する３種のペプチドを合成した。ペプチドは、９−
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）戦略
に基づいて固相同時多重ペプチド合成機ＰＳＳＭ−８
（島津製作所）を使用して合成し、次いでＣ１８逆相高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Millipore）
により精製した。ペプチドの純度及び同一性は、それぞ
れ分析用ＨＰＬＣ及び質量分析により測定した。ペプチ
ドを、ジメチルスルホキシド中に濃度１．５ｍｇ／ｍｌ
で溶解し、−８０℃で保存した。

【００１３】実施例２本発明のリカバリン由来癌抗原
ペプチドを用いたＣＴＬのin vitro誘導ヒトの末梢血をフィコール・コンレイ密度勾配中で遠心
分離して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を集め、次いで接着
細胞と非接着細胞とに分離した。接着細胞をＡＩＭ−Ｖ
（Gibco Co.）中、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（N
ovartis Pharmaceuticals）及び１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ
−４（Gibco-BRL）と共にインキュベートした。この細
胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。非接着細
胞をＡＩＭ−Ｖ中、３０〜１００ＩＵ／ｍｌの組換えＩ
Ｌ−４（味の素）と共にインキュベートした。７〜１０
日目に、本発明のペプチド（終濃度３０μｇ／ｍｌ）を
ＡＰＣに添加し、１日後、組換えＴＮＦ−α及びＩＦＮ
−α（住友製薬）を添加してＡＰＣを成熟させた。次い
でＡＰＣに放射線を照射した。１日後、ＡＰＣと自家非
接着細胞とを、ＩＬ−２を含まないＡＩＭ−Ｖ中で混合
した。インキュベート２日後、ＩＬ−２（武田薬品工
業）を終濃度１００ＩＵ／ｍｌで培養へ添加した。７日
毎に、前記と同様のプロトコルにしたがい、ＡＰＣとし
ての自家接着細胞で応答細胞を刺激した。刺激毎に、培
養に１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮培地を追加
した。２８日目のＣＴＬを以下の活性試験に使用した。

【００１４】実施例３本発明のＣＴＬの細胞傷害性（１）試験方法ＣＴＬの細胞傷害能を^５１Ｃｒ細胞傷害試験により評価
した。ＣＴＬの標的細胞を１００μＣｉのクロム酸ナト
リウム（^５１Ｃｒ）を用いて３７℃で２時間標識し、洗
浄し、再懸濁した。試験ペプチドが提示された標識標的
細胞は、前記の標的細胞（５×１０^５細胞／ｍｌ）と３
０μｇ／ｍｌの試験ペプチドとを３７℃で１８時間イン
キュベートし、^５１Ｃｒで標識することにより得た。エ
フェクター細胞（ＣＴＬ）をＶ字底マイクロタイタープ
レートＣｏｓｔａｒ３８９４（Corning Incorporated）
の各ウェルに入れ、ここに前記標識標的細胞を濃度５×
１０^３細胞／ウェルで添加し、容量０．２ｍｌとした。
４時間のインキュベート後、０．１ｍｌの上清を集め、
自動化ガンマカウンター（LKB Wallac）により^５１Ｃｒ
の放出を測定した。測定は３重に行い標準偏差を計算し
た。特異的細胞傷害能の百分率は、特異的^５１Ｃｒ放出
の百分率を下記の式：［（実験値）−（自発的放出値）
／（最大放出値）−（自発的放出値）］×１００を用い
て計算することにより決定した。自発的放出値は、標的
細胞をエフェクター細胞の非存在下で単独でインキュベ
ートしたときの放出値より得た。最大放出値は界面活性
剤である１０％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０（ナカライケミ
カルＣｏ．）と共にインキュベートしたときの最大放出
量により得た。

【００１５】（２）本発明のＣＴＬの細胞傷害性文献（Murakamiら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1
992 187:234-244、Kondoら, J. Immunol. 1995. 155:43
07-4312及びKuboら, J. Immunol. 1994. 152:3913-392
4）に記載のリカバリンのアミノ酸一次配列にしたが
い、表１に示すＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフに対応す
る９種のペプチド（配列番号１〜３のアミノ酸配列から
なるペプチドを含む）を、リカバリンを発現する癌患者
の末梢血リンパ球から文献（Cancer Res.,60:1914-192
0）に記載の方法にしたがい得た。

【００１６】表１．試験ペプチド＊下線部はＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフに対応するア
ミノ酸を示す。

【００１７】試験の便宜のため、９種のペプチドを、本
発明のペプチドを含むＡ群（Ｒ２２、Ｒ４９、Ｒ４９．
２、Ｒ６４及びＲ１０８）と本発明のペプチドを含まな
いＢ群（Ｒ６９、Ｒ８２、Ｒ１３１及びＲ１５８）とに
分けた。実施例２と同様の方法により各群のペプチドを
用いてＣＴＬを誘導した。ＣＴＬの標的細胞として、リ
カバリンを発現する（以降、リカバリン陽性という）Ｃ
１Ｒ細胞株（ATCCより入手）に、ＨＬＡ−Ａ２４＊２４
０２遺伝子を、ベクターｐＢＪ−Ａ＊２４０２を用い
て、文献（J. Immunol. 163:2783-2791(1999)）にした
がい導入し、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面に発現させ
た（以降、ＨＬＡ−Ａ２４陽性という）Ｃ１Ｒ−Ａ＊２
４０２細胞、対照としてＣ１Ｒ細胞株でＨＬＡ−Ａ３１
分子を発現させたＨＬＡ−Ａ＊３１０１２細胞及びクラ
スＩＭＨＣを発現しないＫ５６２細胞（ATCCより入手）
を用いた。前記（１）の試験法にしたがい、各標的細胞
に試験ペプチドを添加して、標的細胞上にペプチドを提
示させ、これを試験に使用した。Ａ群及びＢ群のペプチ
ドを用いて誘導したＣＴＬについての^５１Ｃｒ細胞傷害
試験の結果をそれぞれ図２Ａ及び図２Ｂに示す。縦軸は
標的細胞の溶解の百分率を、横軸はＥ／Ｔ比（エフェク
ター細胞（ＣＴＬ）／標的細胞）を示す。Ａ群ペプチド
により誘導されたＣＴＬはＣ１Ｒ−Ａ＊２４０２細胞に
対して高い細胞溶解を示したが、ＨＬＡ−Ａ＊３１０１
２細胞及びＫ５６２細胞に対しての細胞溶解性は低かっ
た（図２Ａ）。また、Ｂ群ペプチドにより誘導されたＣ
ＴＬはいずれの細胞に対しても低い細胞溶解性を示した
（図２Ｂ）。更にＡ群ペプチドにより誘導されたＣＴＬ
は、リカバリン陽性かつＨＬＡ−Ａ２４陽性の肺癌細胞
ＬＨＫ−２に対しても高い細胞傷害性を示した（図２
Ｃ）。これらの結果より、本発明のペプチドを含むＡ群
ペプチドにより誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽
性かつリカバリン陽性の細胞、すなわち癌細胞に対し高
い細胞傷害性を有していることが理解される。

【００１８】実施例４単一ペプチドにより誘導したＣ
ＴＬの細胞傷害性実施例３のＡ群ペプチドをより詳細に特徴付けるため
に、単一ペプチドで誘導したＣＴＬについての細胞傷害
性試験を行った。健常人から採取したＰＢＭＣ及びＡ群
の各ペプチド（Ｒ２２、Ｒ４９、Ｒ４９．２、Ｒ６４及
びＲ１０８）を用いて、実施例２の誘導方法にしたが
い、ＣＴＬを誘導した。評価は実施例３（１）の^５１Ｃ
ｒ細胞傷害試験にしたがい行った。標的細胞として、Ａ
群の各ペプチド又は陰性コントロールとしてＢ群のペプ
チド混合物（ｇＢ）のいずれかを添加したＨＬＡ−Ａ２
４陽性の自家ＥＢＶ−Ｂ細胞（ＥＢＶ−ＢＣＬ）を使用
した。^５１Ｃｒ細胞傷害試験の結果をそれぞれ図３Ａに
示す。ペプチドＲ４９、Ｒ４９．２及びＲ６４により誘
導されたＣＴＬは、それぞれのペプチドを提示するＥＢ
Ｖ−Ｂ細胞に対して高い細胞溶解性を示したが、ｇＢ提
示細胞に対しての細胞溶解性は低かった。また、ペプチ
ドＲ２２及びＲ１０８Ｂ群ペプチドにより誘導されたＣ
ＴＬはいずれの細胞に対しても低い細胞溶解性を示し
た。更にペプチドＲ４９、Ｒ４９．２及びＲ６４により
誘導されたＣＴＬは、リカバリン陽性、ＨＬＡ−Ａ２４
陽性肺癌細胞ＬＨＫ−２に対しても細胞傷害性を示した
（図３Ｂ）。これらの結果より、本発明のペプチドによ
り誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリカバ
リン陽性の細胞、すなわち癌細胞に対し高い細胞傷害性
を有していることが理解される。

【００１９】実施例５リカバリン特異的なＣＴＬ前駆
細胞（ｐＣＴＬ）の存在頻度の測定ｐＣＴＬの存在頻度は、Lefkovitsらの限界希釈法（Lef
kovits, Immunol. Today 1984. 5:265-268）により測定
した。具体的には、健常人から採取したＰＢＭＣを、丸
底９６ウェルプレートＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏ
ｎＬａｂｗａｒｅ３０７７に、リカバリンペプチド
（４０μｇ／ｍｌ）の存在下、２×１０^５／ウェル、１
×１０^５／ウェル及び５×１０^４／ウェルの各細胞濃度
（各細胞濃度について４８の複製）で播いた。培養細胞
を、リカバリンペプチド及びＡＰＣ源として１×１０^５
細胞／ウェルの放射線照射（８０００ｒａｄ）ＰＢＭＣ
を用いて１週間間隔で再度刺激した。２日目にＩＬ−２
（１００Ｕ／ｍｌ）を添加した。連続２回の刺激サイク
ルの後、各ウェルの内容物の半分を取り出し、４時間の
微小細胞傷害性試験法（J. Immunol.,163:2783-2791(19
99)）においてリカバリン応答性ＣＴＬの存在について
試験した。５０倍をこえる量のＫ５６２細胞の存在下で
細胞傷害性試験を行い、非特異的傷害を除去した。ウェ
ルにおいて標準偏差が３をこえる平均自発的放出を示す
^５１Ｃｒ放出を陽性と定義した。これは１５％以上の特
異的細胞溶解に達する。陰性を示すウェルの画分を、播
いた細胞数に対してプロットし、最良適合の直線回帰分
析をＳｔａｙｗｏｒｋｓ（Cricket Software）を用いて
行った。Lefkovitsらの限界希釈法（前出）に記載され
るようにして、ポアソン分布に基づき、回帰線の勾配よ
りｐＣＴＬの存在頻度を決定した。結果を図４に示す。
ペプチドＲ４９．２に対するＣＴＬ前駆細胞が最も多く
存在することが理解される（図４）。この結果より、本
発明の３種のペプチドの中では、Ｒ４９．２が最も多く
のＣＴＬを誘導するので、癌ワクチン及び抗癌剤として
の効果が最も期待される。

【００２０】実施例６本発明のＣＴＬの反応性の解析（１）ＣＴＬのクローンの作成本発明のＣＴＬの反応性（ＨＬＡ−Ａ２４拘束性及びリ
カバリン拘束性）を検討するために、単一のＣＴＬクロ
ーンを、Koupら（Koupら, J. Exp. Med. 1991.174:1593
-1600）の方法と類似の方法にしたがい行った。具体的
には、健常人由来の放射線照射したＰＢＭＣを、実施例
２に記載の方法にしたがい配列番号２のペプチドを用い
て誘導したＣＴＬ（５×１０^４）及び放射線照射したＬ
Ｇ２−ＥＢＶ形質転換細胞（Institute of Ludwig Canc
er Researchより入手）を、１５％ＦＣＳ（Gibco）、
２００ＩＵ／ｍｌ組換えＩＬ−２（武田薬品工業）、
５０μＭ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業）
及び４０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３モノクローナル抗体（フ
ナコシ株式会社）を含む２００μｌのＡＩＭ−Ｖを含む
丸底マイクロタイタープレートＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋ
ｉｎｓｏｎＬａｂｗａｒｅ３０７７（Becton Dickins
on）の各ウェルに入れた。７日毎に、１５％ＦＣＳ、
５０ＩＵ／ｍｌＩＬ−２及び５０μＭ２−メルカプ
トエタノールを含む新鮮なＡＩＭ−Ｖを培養に追加し
た。１４〜２０日目に、平均して１×１０^７〜２×１０
^７の細胞を得た。得られたクローンをＵＨＣ−９と命名
し、反応性の解析に使用した。

【００２１】（２）ＵＨＣ−９のＨＬＡ−Ａ２４拘束性エフェクター細胞としてのＵＨＣ−９、標的細胞として
のＬＨＫ−２及び各種モノクローナル抗体を用いた^５１
Ｃｒ細胞傷害試験により評価した。具体的には、標的細
胞ＬＨＫ−２肺癌細胞株（ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつリカ
バリン陽性）を、以下のモノクローナル抗体：ｗ６／３
２（抗ＨＬＡクラスＩ抗体、終濃度２０μｇ／ｍｌ）、
Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、終濃度２０μｇ／ｍ
ｌ）、Ａ１１．１のＩｇＭフラグメント（抗ＨＬＡ−Ａ
２４特異的抗体、終濃度３０μｇ／ｍｌで１：２００希
釈で使用）と共に４℃で１時間インキュベートし、その
後、細胞傷害性試験を行った。結果を図５Ａに示す。Ｕ
ＨＣ−９のＬＨＫ−２に対する細胞傷害性は、標的細胞
上のＨＬＡ−２４をブロックする抗体Ａ１１．１及びｗ
６／３２により選択的に阻止された。一方、ＨＬＡ−２
４をブロックしない抗体Ｌ２４３では細胞傷害性は阻止
されなかった。この結果より、本発明のＣＴＬはＨＬＡ
−Ａ２４拘束性であることが理解される。

【００２２】（３）ＵＨＣ−９のリカバリン拘束性及び
ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＵＨＣ−９のリカバリン拘束性を、以下の表２に示す標
的細胞を用い、実施例３に記載の^５１Ｃｒ細胞傷害試験
により評価した。

【００２３】表２．標的細胞＋：陽性 −：陰性

【００２４】結果を図５Ｂに示す。ＵＨＣ−９はリカバ
リン及びＨＬＡ−Ａ２４両方が陽性の細胞（ＬＨＫ−
２、ＨＣ−ＭＡ、ＯＳＣ７０及び１１０２ＭＥＬ）に対
して高い細胞傷害性を示したが、いずれか一方を発現し
た細胞株（ＨＳＴ−２及びＬＢ３３ＭＥＬ）及び両方陰
性（Ａ５４９）細胞株に対しては細胞傷害性を示さなか
った。この結果より、本発明のＣＴＬはリカバリン拘束
性かつＨＬＡ−Ａ２４拘束性であることが理解される。

【００２５】（４）ＵＨＣ−９のリカバリン遺伝子及び
／又はＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入細胞に対する細胞傷害
性文献（Cancer Res.,60:1914-1920(2000)）に記載の方法
にしたがい、リカバリン及びＨＬＡ−Ａ２４の両方が陰
性である細胞株Ａ５４９にリカバリン遺伝子及び／又は
ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を導入した細胞を作成し、これら
を標的細胞としてＵＨＣ−９の^５１Ｃｒ細胞傷害試験を
行った。

【００２６】表３．標的細胞

【００２７】結果を図５Ｃに示す。ＵＨＣ−９はリカバ
リン及びＨＬＡ−Ａ２４両方を発現した細胞株（Ａ５４
９ＲＡ＊２４０２）に対して高い細胞傷害性を示した
が、いずれか一方のみを発現した細胞（Ａ５４９Ｒ及び
Ａ５４９Ｒ＊２４０２）及び両方を発現しない細胞（Ａ
５４９）に対しては細胞傷害性を示さなかった。この結
果より、本発明のＣＴＬはＨＬＡ−Ａ２４拘束性かつリ
カバリン発現選択性であることが理解される。

【００２８】

【発明の効果】本発明のペプチドは、本発明のペプチド
を提示したＨＬＡ−Ａ２４を有する癌細胞を標的とする
ＣＴＬを誘導することができる。ＨＬＡ−Ａ２４の発現
率は高く、欧米人では２０〜３０％であり、特に日本人
では５０％以上が発現している。したがって、本発明の
癌抗原ペプチドは有用な癌ワクチン及び抗癌剤として使
用することができる。

【００２９】

【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Hokkaido Technology Licensing Office Co. Lt
d. <120> A cancer antigen peptide derived from recove
rin <130> y1i-0017 <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、癌細胞及び正常細胞におけるリカバリ
ンの発現を示す図である。

【図２Ａ】図２Ａは、Ａ群のペプチドを用いて誘導した
ＣＴＬについての^５１Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグ
ラフである。

【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｂ群のペプチドを用いて誘導した
ＣＴＬについての^５１Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグ
ラフである。

【図２Ｃ】図２Ｃは、Ａ群ペプチドにより誘導されたＣ
ＴＬの肺癌細胞ＬＨＫ−２に対する^５１Ｃｒ細胞傷害試
験の結果を示すグラフである。

【図３Ａ】図３Ａは、ペプチドＲ２２、Ｒ４９、Ｒ４
９．２、Ｒ６４及びＲ１０８を用いて誘導したＣＴＬに
ついての^５１Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグラフであ
る。

【図３Ｂ】図３Ｂは、ペプチドＲ４９、Ｒ４９．２及び
Ｒ６４により誘導されたＣＴＬの肺癌細胞ＬＨＫ−２に
対する^５１Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグラフであ
る。

【図４】図４は、本発明のペプチドに対するＣＴＬ前駆
細胞（ｐＣＴＬ）の末梢血中での在存頻度を示すグラフ
である。

【図５Ａ】図５Ａは、ＵＨＣ−９、ＬＨＫ−２及び各種
モノクローナル抗体を用いた^５１Ｃｒ細胞傷害試験の結
果を示すグラフである。

【図５Ｂ】図５Ｂは、リカバリン及び／又はＨＬＡ−Ａ
２４を発現する種々の標的細胞に対するＵＨＣ−９につ
いての^５１Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグラフであ
る。

【図５Ｃ】図５Ｃは、リカバリン遺伝子及び／又はＨＬ
Ａ−Ａ２４遺伝子を導入した種々の標的細胞に対するＵ
ＨＣ−９についての^５１Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示す
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＥＦターム(参考） 4B065 AA94X AC20 BA30 BB01 BB40 BD50 CA44 4C085 AA03 BB01 CC03 CC32 EE06 FF02 FF03 FF20 GG02 GG03 GG08 4C087 AA01 AA02 BB37 DA19 DA32 MA17 MA22 MA23 MA34 MA35 MA37 MA41 MA43 MA52 MA55 MA63 MA66 NA14 ZB02 ZB21 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA15 CA50 DA86 EA22 EA28 FA34 FA41 FA58 GA25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１〜３からなる群より選ばれる
アミノ酸配列からなり、癌細胞を標的とする細胞傷害性
Ｔ細胞を誘導しうるペプチド。
【請求項２】請求項１に記載のペプチドを含む癌ワク
チン。
【請求項３】請求項１に記載のペプチドを含む抗癌
剤。
【請求項４】癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を
誘導するための請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項５】請求項１に記載のペプチドにより誘導さ
れた細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項６】請求項５に記載の細胞傷害性Ｔ細胞を含
む抗癌剤。