JP2002262879A - 新規動物細胞用ベクターおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新たな薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして
用いて遺伝子が安定に導入された細胞を選択する技術、
遺伝子の高発現細胞を効率的に取得する技術を提供す
る。 【解決手段】 蛋白質合成阻害剤（代表的にはシクロヘ
キシミド）に感受性の動物細胞に該阻害剤に対する耐性
を付与する性質を有し、かつ動物由来のリボソーム構成
蛋白質をコードする遺伝子を置換変異した配列を有す
る、蛋白合成阻害剤耐性遺伝子（代表的にはシクロヘキ
シミド耐性遺伝子）。上記の蛋白質合成阻害剤耐性遺伝
子を含む組換えベクター。上記の遺伝子および外来蛋白
質構造遺伝子とを含む発現ベクター。上記の発現ベクタ
ーを上記蛋白質合成阻害剤感受性の動物細胞に導入して
これを培養し、蛋白合成阻害剤耐性遺伝子を選択マーカ
ーとして細胞株を選択することを特徴とする、蛋白合成
阻害剤耐性動物細胞株の選択方法。上記の形質転換細胞
を培養し、発現された外来蛋白質を培養物から採取する
ことを特徴とする、蛋白質の生産方法。
用いて遺伝子が安定に導入された細胞を選択する技術、
遺伝子の高発現細胞を効率的に取得する技術を提供す
る。 【解決手段】 蛋白質合成阻害剤（代表的にはシクロヘ
キシミド）に感受性の動物細胞に該阻害剤に対する耐性
を付与する性質を有し、かつ動物由来のリボソーム構成
蛋白質をコードする遺伝子を置換変異した配列を有す
る、蛋白合成阻害剤耐性遺伝子（代表的にはシクロヘキ
シミド耐性遺伝子）。上記の蛋白質合成阻害剤耐性遺伝
子を含む組換えベクター。上記の遺伝子および外来蛋白
質構造遺伝子とを含む発現ベクター。上記の発現ベクタ
ーを上記蛋白質合成阻害剤感受性の動物細胞に導入して
これを培養し、蛋白合成阻害剤耐性遺伝子を選択マーカ
ーとして細胞株を選択することを特徴とする、蛋白合成
阻害剤耐性動物細胞株の選択方法。上記の形質転換細胞
を培養し、発現された外来蛋白質を培養物から採取する
ことを特徴とする、蛋白質の生産方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動物細胞において
有用物質を生産するための組換え発現ベクター、および
その発現ベクターを用いた蛋白質等の生産方法に関し、
特に、新たな薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして用い
て遺伝子が安定に導入された細胞を選択する技術、遺伝
子の高発現細胞を効率的に取得する技術に関する。
有用物質を生産するための組換え発現ベクター、および
その発現ベクターを用いた蛋白質等の生産方法に関し、
特に、新たな薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとして用い
て遺伝子が安定に導入された細胞を選択する技術、遺伝
子の高発現細胞を効率的に取得する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】＜組換え蛋白質生産技術＞遺伝子組換え
発現技術の進展によって、生体内では非常に微量しか存
在しなかったり、安定性が低く精製困難であった蛋白質
でも、様々な有用蛋白質の生産が可能になった。当該技
術を用いることにより、数多くの組換え蛋白質が医薬品
や産業用酵素として実用化されているのみならず、蛋白
質の立体構造が明らかにされたり、蛋白質間の相互作用
の解析がなされることにより生命への理解が急速に進ん
でいる。また、ヒトを初め多くの生物種についてのゲノ
ム研究の急速な進展や、バイオインフォマティクスやPC
R技術の進歩により、有用遺伝子の取得が格段に容易に
なっている。したがって、遺伝子のクローニングがしば
しば研究の律速となった従来とは状況が異なり、現在で
はクローニングした遺伝子の発現、すなわちその遺伝子
にコードされている蛋白質を安定かつ大量に生産するた
めの研究開発に多大な時間を要するようになってきた。
発現技術の進展によって、生体内では非常に微量しか存
在しなかったり、安定性が低く精製困難であった蛋白質
でも、様々な有用蛋白質の生産が可能になった。当該技
術を用いることにより、数多くの組換え蛋白質が医薬品
や産業用酵素として実用化されているのみならず、蛋白
質の立体構造が明らかにされたり、蛋白質間の相互作用
の解析がなされることにより生命への理解が急速に進ん
でいる。また、ヒトを初め多くの生物種についてのゲノ
ム研究の急速な進展や、バイオインフォマティクスやPC
R技術の進歩により、有用遺伝子の取得が格段に容易に
なっている。したがって、遺伝子のクローニングがしば
しば研究の律速となった従来とは状況が異なり、現在で
はクローニングした遺伝子の発現、すなわちその遺伝子
にコードされている蛋白質を安定かつ大量に生産するた
めの研究開発に多大な時間を要するようになってきた。
【０００３】組換え蛋白質生産に用いる宿主としては、
大腸菌や酵母、及び昆虫、哺乳類由来の細胞などが挙げ
られるが、あらゆるニーズを満たすような万能の蛋白質
生産用の宿主生物はいまだ開発されておらず、目的とす
る蛋白質ごとに生産系を構築するという試行錯誤が続い
ている。例えば大腸菌は最も一般的に使われる発現系で
あるが、生産した蛋白質は不溶性の封入体を形成するこ
とが多いことや、真核生物とは異なり糖鎖修飾など翻訳
後修飾がほとんど起きないことが活性を有する蛋白質を
生産する上での問題となる。また、酵母やかびなどの真
核微生物を宿主とした発現系も使用されるが、必ずしも
すべての蛋白質について有効であるわけではなく、動物
由来の構造の複雑な蛋白質の活性発現や複雑な翻訳後修
飾は困難であることが多い。さらに、近年はバキュロウ
イルスを用いた昆虫細胞を宿主とした発現系も多用され
ている。本系は生産された蛋白質がリン酸化、糖鎖の付
加など翻訳後修飾を受け、本来の生理活性を保持したま
ま発現させることができるなどメリットが多いが、分泌
蛋白質の糖鎖構造は哺乳類由来の細胞のものとは異なる
ことから、医薬品用途とするには組換え蛋白質の抗原性
などが問題となる。
大腸菌や酵母、及び昆虫、哺乳類由来の細胞などが挙げ
られるが、あらゆるニーズを満たすような万能の蛋白質
生産用の宿主生物はいまだ開発されておらず、目的とす
る蛋白質ごとに生産系を構築するという試行錯誤が続い
ている。例えば大腸菌は最も一般的に使われる発現系で
あるが、生産した蛋白質は不溶性の封入体を形成するこ
とが多いことや、真核生物とは異なり糖鎖修飾など翻訳
後修飾がほとんど起きないことが活性を有する蛋白質を
生産する上での問題となる。また、酵母やかびなどの真
核微生物を宿主とした発現系も使用されるが、必ずしも
すべての蛋白質について有効であるわけではなく、動物
由来の構造の複雑な蛋白質の活性発現や複雑な翻訳後修
飾は困難であることが多い。さらに、近年はバキュロウ
イルスを用いた昆虫細胞を宿主とした発現系も多用され
ている。本系は生産された蛋白質がリン酸化、糖鎖の付
加など翻訳後修飾を受け、本来の生理活性を保持したま
ま発現させることができるなどメリットが多いが、分泌
蛋白質の糖鎖構造は哺乳類由来の細胞のものとは異なる
ことから、医薬品用途とするには組換え蛋白質の抗原性
などが問題となる。
【０００４】一方、目的蛋白質を生体内と同じ状態、す
なわち、その蛋白質が生体内で保っている立体構造や、
例えばリン酸化や糖鎖付加、部分的切断などの翻訳後の
修飾に関して同一の状態、で生産するには、その蛋白質
の由来の生物と近縁の生物を用いる発現系を選択した方
が良い。このため、動物由来であり、蛋白質の活性化に
糖鎖付加などの翻訳後修飾が必要な場合や、構造が複雑
であったり、未だ機能が特定されていない蛋白質の発現
には、哺乳類由来の細胞を宿主とした発現系が最も一般
的に用いられている。動物細胞発現系の利点は、蛋白質
が正確な翻訳後修飾を受け、活性を発揮するのに適切な
フォールディングが期待できることであり、動物由来の
蛋白質の生化学的な解析や機能解析の目的では最も適し
た系といえる。
なわち、その蛋白質が生体内で保っている立体構造や、
例えばリン酸化や糖鎖付加、部分的切断などの翻訳後の
修飾に関して同一の状態、で生産するには、その蛋白質
の由来の生物と近縁の生物を用いる発現系を選択した方
が良い。このため、動物由来であり、蛋白質の活性化に
糖鎖付加などの翻訳後修飾が必要な場合や、構造が複雑
であったり、未だ機能が特定されていない蛋白質の発現
には、哺乳類由来の細胞を宿主とした発現系が最も一般
的に用いられている。動物細胞発現系の利点は、蛋白質
が正確な翻訳後修飾を受け、活性を発揮するのに適切な
フォールディングが期待できることであり、動物由来の
蛋白質の生化学的な解析や機能解析の目的では最も適し
た系といえる。
【０００５】発現形態としては、遺伝子の発現が一時的
な一過性発現法と、遺伝子を恒常的に発現する細胞を作
製する安定発現法の２つに分類される。一過性発現法で
は、導入された遺伝子は細胞内で転写・翻訳され、導入
後数時間から蛋白質の発現が認められ、2,3日後にピー
クを迎える。蛋白質の生産量を高めるためにはSV40のor
iを含んだプラスミドを、COS細胞などのSV40ラージT抗
原遺伝子を発現する細胞に導入することによって、プラ
スミドのコピー数を増幅させる方法が取られるが、細胞
へのプラスミドの形質導入を毎回行う必要があるために
生産できる蛋白質量には限界がある。一方、目的の蛋白
質を恒常的に発現した細胞を用いた解析を行ったり、目
的蛋白質をある程度の量生産する必要性がある場合に
は、導入遺伝子を細胞の染色体に組込む安定発現法を選
択する。一度、生産性の高い組換細胞株が樹立されれ
ば、すべての細胞が目的遺伝子を発現しているのでさま
ざまな解析が可能になるとともに、均一な組換え蛋白質
の生産のために大規模な培養を行うことも可能となる。
しかしながら、細胞の染色体に組み込まれた遺伝子のコ
ピー数や組込まれた染色体の位置により組換細胞株間で
遺伝子発現量が大きく異なるため、解析や生産に使用出
来る発現量の高い細胞株を選択しなければならないが、
大多数の形質転換株は発現量が極めて低く、高発現株を
選択する作業には多大な時間と労力を要する。以上のよ
うに、いずれの発現形態で蛋白質を生産させた場合にお
いても、一般的に動物細胞での蛋白質の生産量は他の組
換え発現宿主系と比較して低いという問題点を解決する
ための様々な工夫がなされている。
な一過性発現法と、遺伝子を恒常的に発現する細胞を作
製する安定発現法の２つに分類される。一過性発現法で
は、導入された遺伝子は細胞内で転写・翻訳され、導入
後数時間から蛋白質の発現が認められ、2,3日後にピー
クを迎える。蛋白質の生産量を高めるためにはSV40のor
iを含んだプラスミドを、COS細胞などのSV40ラージT抗
原遺伝子を発現する細胞に導入することによって、プラ
スミドのコピー数を増幅させる方法が取られるが、細胞
へのプラスミドの形質導入を毎回行う必要があるために
生産できる蛋白質量には限界がある。一方、目的の蛋白
質を恒常的に発現した細胞を用いた解析を行ったり、目
的蛋白質をある程度の量生産する必要性がある場合に
は、導入遺伝子を細胞の染色体に組込む安定発現法を選
択する。一度、生産性の高い組換細胞株が樹立されれ
ば、すべての細胞が目的遺伝子を発現しているのでさま
ざまな解析が可能になるとともに、均一な組換え蛋白質
の生産のために大規模な培養を行うことも可能となる。
しかしながら、細胞の染色体に組み込まれた遺伝子のコ
ピー数や組込まれた染色体の位置により組換細胞株間で
遺伝子発現量が大きく異なるため、解析や生産に使用出
来る発現量の高い細胞株を選択しなければならないが、
大多数の形質転換株は発現量が極めて低く、高発現株を
選択する作業には多大な時間と労力を要する。以上のよ
うに、いずれの発現形態で蛋白質を生産させた場合にお
いても、一般的に動物細胞での蛋白質の生産量は他の組
換え発現宿主系と比較して低いという問題点を解決する
ための様々な工夫がなされている。
【０００６】＜遺伝子発現量の増大＞動物細胞に導入し
た真核生物由来の遺伝子の発現量は、遺伝子発現に対し
てシスに作用するDNA配列、もしくはそのDNA配列に対し
てトランスに働く転写制御因子、遺伝子のコピー数、導
入遺伝子の染色体挿入部位、ｍRNAの安定性、など様々
な要因により制御されている（Dillon and Grosveld, T
rends Genet. 9:134;1993）。この制御システムについ
てはこれまでに様々な解析がなされ、その結果をもと
に、遺伝子高発現細胞株を得るためのプラスミドベクタ
ーが開発されてきた（Makrides S. C.; 1999）。代表的
な知見を以下に記述する。
た真核生物由来の遺伝子の発現量は、遺伝子発現に対し
てシスに作用するDNA配列、もしくはそのDNA配列に対し
てトランスに働く転写制御因子、遺伝子のコピー数、導
入遺伝子の染色体挿入部位、ｍRNAの安定性、など様々
な要因により制御されている（Dillon and Grosveld, T
rends Genet. 9:134;1993）。この制御システムについ
てはこれまでに様々な解析がなされ、その結果をもと
に、遺伝子高発現細胞株を得るためのプラスミドベクタ
ーが開発されてきた（Makrides S. C.; 1999）。代表的
な知見を以下に記述する。
【０００７】遺伝子発現の制御に関わるシス因子はDNA
配列であり、代表的なDNA配列としてはプロモーター配
列及びエンハンサー配列が挙げられる。それぞれの配列
に対しては転写を制御する様々な転写制御蛋白質がトラ
ンスに作用することが良く研究されている。プロモータ
ー配列は遺伝子の上流に隣接しており、基本的な転写に
必須の領域である。エンハンサー配列は遺伝子から離れ
た位置や、イントロン中に存在する場合もあり、その配
列の方向性も一定ではない。また、エンハンサー配列は
組織特異的な遺伝子の発現調節をになう場合も多い。一
般にプロモーターやエンハンサーの活性は、一過性遺伝
子導入実験などによって検出することができる。外来遺
伝子を高発現させるためには、強力なプロモーターやエ
ンハンサー配列を効果的に配置し、利用することが重要
である。強力なプロモーター配列にはエンハンサー配列
と近接することが多く、そのような配列としては、ＳＶ
４０初期プロモーター、アデノウイスルメジャー後期プ
ロモーター、マウスメタロチオネインＩプロモーター、
ラウスザルコーマウイルスロングターミナルリピートお
よびヒトサイトメガロウイルスプロモーター(ＣＭＶ)な
どが挙げられる。
配列であり、代表的なDNA配列としてはプロモーター配
列及びエンハンサー配列が挙げられる。それぞれの配列
に対しては転写を制御する様々な転写制御蛋白質がトラ
ンスに作用することが良く研究されている。プロモータ
ー配列は遺伝子の上流に隣接しており、基本的な転写に
必須の領域である。エンハンサー配列は遺伝子から離れ
た位置や、イントロン中に存在する場合もあり、その配
列の方向性も一定ではない。また、エンハンサー配列は
組織特異的な遺伝子の発現調節をになう場合も多い。一
般にプロモーターやエンハンサーの活性は、一過性遺伝
子導入実験などによって検出することができる。外来遺
伝子を高発現させるためには、強力なプロモーターやエ
ンハンサー配列を効果的に配置し、利用することが重要
である。強力なプロモーター配列にはエンハンサー配列
と近接することが多く、そのような配列としては、ＳＶ
４０初期プロモーター、アデノウイスルメジャー後期プ
ロモーター、マウスメタロチオネインＩプロモーター、
ラウスザルコーマウイルスロングターミナルリピートお
よびヒトサイトメガロウイルスプロモーター(ＣＭＶ)な
どが挙げられる。
【０００８】プロモーターやエンハンサー以外にもシス
に機能する遺伝子発現制御配列もある。これらは、locu
s control region (LCR; Grosveld F., Cell 51:975, 1
987)、matrix attachment region (MAR; Phi-Van, Mol
Cell Biol 10:2302, 1980)、scaffold attachment regi
on (SAR; Gasser, Trends Genet 3:16, 1987)、insulat
or element (Kellum, Cell 64:941, 1991) と呼ばれて
おり、染色体のクロマチン構造に作用すると考えられて
いる。これらの領域は、遺伝子との距離が離れていても
機能するという点からはエンハンサーと類似した機能で
あるが、外来遺伝子を染色体に安定的に導入する実験に
よってのみ検出可能である点でエンハンサー配列とは異
なる。これらのうちLCRは、遺伝子に対する位置及び方
向性依存性に機能する点でエンハンサーとは異なる。さ
らに、LCRやSARに特徴的に存在するA box、T boxと呼ば
れる配列やトポイソメラーゼII認識配列は、エンハンサ
ー配列やプロモーター配列には見つかっていない特異的
な配列である（Klehr D.,Biochemistry 30:1264, 199
1）。
に機能する遺伝子発現制御配列もある。これらは、locu
s control region (LCR; Grosveld F., Cell 51:975, 1
987)、matrix attachment region (MAR; Phi-Van, Mol
Cell Biol 10:2302, 1980)、scaffold attachment regi
on (SAR; Gasser, Trends Genet 3:16, 1987)、insulat
or element (Kellum, Cell 64:941, 1991) と呼ばれて
おり、染色体のクロマチン構造に作用すると考えられて
いる。これらの領域は、遺伝子との距離が離れていても
機能するという点からはエンハンサーと類似した機能で
あるが、外来遺伝子を染色体に安定的に導入する実験に
よってのみ検出可能である点でエンハンサー配列とは異
なる。これらのうちLCRは、遺伝子に対する位置及び方
向性依存性に機能する点でエンハンサーとは異なる。さ
らに、LCRやSARに特徴的に存在するA box、T boxと呼ば
れる配列やトポイソメラーゼII認識配列は、エンハンサ
ー配列やプロモーター配列には見つかっていない特異的
な配列である（Klehr D.,Biochemistry 30:1264, 199
1）。
【０００９】HIRPE(Hot spot of Increased Recombinan
t Protein Expression)は、 MARと似た配列とATに富む
配列を含む特徴的な5kbのDNA断片であり、ある外来遺伝
子を高発現するCHO細胞からクローニングされている（K
oduri,K, Thammana, P. Patent No WO00/17337）。この
DNA断片を外来遺伝子と共に連結した発現プラスミドでC
HO細胞を形質転換することにより、当該プラスミドは染
色体のある特定の部位に組込まれ、発現量が数倍増加す
ることが示されている。また、Expression augmenting
sequence element (EASE; Morris, A. E., Patent No.
WO97/25420)は同様にCHO細胞で発見された因子であり、
染色体上に安定に組込まれた外来遺伝子の発現量を数倍
に増大する効果があるとされる。ある外来遺伝子を高発
現する細胞からクローニングされた14.5kbのDNA断片中
にその活性が認められる。当該DNA断片中には制御因子
をコードするようなORFは含まれず、この遺伝子発現量
増大効果は、染色体に安定に組込まれた後にEASEがプロ
モーターやエンハンサーに作用することによるためでは
ないかと考えられている。どちらもある特異的なDNA断
片を用いる遺伝子発現増強法であり、それらのDNA断片
を用いない限りは他の外来遺伝子発現に応用することは
できない。
t Protein Expression)は、 MARと似た配列とATに富む
配列を含む特徴的な5kbのDNA断片であり、ある外来遺伝
子を高発現するCHO細胞からクローニングされている（K
oduri,K, Thammana, P. Patent No WO00/17337）。この
DNA断片を外来遺伝子と共に連結した発現プラスミドでC
HO細胞を形質転換することにより、当該プラスミドは染
色体のある特定の部位に組込まれ、発現量が数倍増加す
ることが示されている。また、Expression augmenting
sequence element (EASE; Morris, A. E., Patent No.
WO97/25420)は同様にCHO細胞で発見された因子であり、
染色体上に安定に組込まれた外来遺伝子の発現量を数倍
に増大する効果があるとされる。ある外来遺伝子を高発
現する細胞からクローニングされた14.5kbのDNA断片中
にその活性が認められる。当該DNA断片中には制御因子
をコードするようなORFは含まれず、この遺伝子発現量
増大効果は、染色体に安定に組込まれた後にEASEがプロ
モーターやエンハンサーに作用することによるためでは
ないかと考えられている。どちらもある特異的なDNA断
片を用いる遺伝子発現増強法であり、それらのDNA断片
を用いない限りは他の外来遺伝子発現に応用することは
できない。
【００１０】外来遺伝子の発現量を高めることは、宿主
細胞中の遺伝子のコピー数を増加させることによっても
可能である。形質導入細胞中の外来遺伝子のコピー数を
高くするための一つの方法は、選択マーカー遺伝子を含
むプラスミドと共に外来遺伝子を含みかつ選択マーカー
遺伝子を含まないプラスミドを大過剰に混合し、細胞に
共形質導入することによる。この方法により、外来遺伝
子が多数染色体に組込まれた安定形質導入株を取得する
ことが可能である（Ｋaufman、Ｍeth.Ｅnzymol.、185：
537,1990）。しかしながら、この方法で形質導入を行っ
ても得られるクローンの大部分においては外来遺伝子の
コピー数は少ないため、そのような中から外来遺伝子が
多コピー組込まれた細胞をスクリーニングしなければな
らない。これには時間と労力とが必要である。
細胞中の遺伝子のコピー数を増加させることによっても
可能である。形質導入細胞中の外来遺伝子のコピー数を
高くするための一つの方法は、選択マーカー遺伝子を含
むプラスミドと共に外来遺伝子を含みかつ選択マーカー
遺伝子を含まないプラスミドを大過剰に混合し、細胞に
共形質導入することによる。この方法により、外来遺伝
子が多数染色体に組込まれた安定形質導入株を取得する
ことが可能である（Ｋaufman、Ｍeth.Ｅnzymol.、185：
537,1990）。しかしながら、この方法で形質導入を行っ
ても得られるクローンの大部分においては外来遺伝子の
コピー数は少ないため、そのような中から外来遺伝子が
多コピー組込まれた細胞をスクリーニングしなければな
らない。これには時間と労力とが必要である。
【００１１】外来遺伝子のコピー数を高くするためのも
う一つの方法は、一度安定な形質導入株を選択した後に
宿主細胞中で遺伝子増幅を行うことである。遺伝子増幅
は動物細胞中で低頻度ながら自然に起るとされる。（Sc
himke RT、J Biol Chem 1988263、5989-92）。遺伝子増
幅は、細胞を適当な選択圧にさらすことにより誘導され
ることを利用し、外来遺伝子をあらかじめ増幅可能な遺
伝子と共に宿主細胞中に形質導入し、選択剤の濃度を連
続的に増加させることによってマーカー遺伝子と共に外
来遺伝子を増幅させる手法が広く用いられている。
う一つの方法は、一度安定な形質導入株を選択した後に
宿主細胞中で遺伝子増幅を行うことである。遺伝子増幅
は動物細胞中で低頻度ながら自然に起るとされる。（Sc
himke RT、J Biol Chem 1988263、5989-92）。遺伝子増
幅は、細胞を適当な選択圧にさらすことにより誘導され
ることを利用し、外来遺伝子をあらかじめ増幅可能な遺
伝子と共に宿主細胞中に形質導入し、選択剤の濃度を連
続的に増加させることによってマーカー遺伝子と共に外
来遺伝子を増幅させる手法が広く用いられている。
【００１２】この操作に一般的に使用されるマーカー遺
伝子はジヒドロ葉酸リダクターゼ酵素をコードするdhfr
遺伝子であり、使用可能な宿主はdhfr活性を欠いたCHO
細胞である。培地に添加するdhfr阻害剤メトトレキセー
ト（MTX）の濃度を徐々に高くすることによって遺伝子
の増幅が生じ、その際に近傍にある目的の外来遺伝子の
増幅も期待できる（Mammalian Cell Biotechnology, E
d. Butler, M. IRL Press, P79）。さらに、3段階のMTX
濃度上昇により外来遺伝子のコピー数を2000コピーまで
増幅させることが可能であることが報告されている（Be
bbington C andHentschel, C., Trends Biotechnol.,
3., 314 1985）。しかしながら、この方法には長時間を
要し、さらにdhfr遺伝子欠損細胞にしか利用できないと
いう問題点がある。また、選択用の薬剤は高価であり、
組換え動物細胞を大スケールで培養する際に添加するこ
とは好ましくない。さらに、本方法により一度増幅した
遺伝子は、薬剤非添加の条件では不安定であり脱落しや
すいことも指摘されている（「遺伝子」第6版、菊地韶
彦他訳、P845‐848、東京化学同人）。
伝子はジヒドロ葉酸リダクターゼ酵素をコードするdhfr
遺伝子であり、使用可能な宿主はdhfr活性を欠いたCHO
細胞である。培地に添加するdhfr阻害剤メトトレキセー
ト（MTX）の濃度を徐々に高くすることによって遺伝子
の増幅が生じ、その際に近傍にある目的の外来遺伝子の
増幅も期待できる（Mammalian Cell Biotechnology, E
d. Butler, M. IRL Press, P79）。さらに、3段階のMTX
濃度上昇により外来遺伝子のコピー数を2000コピーまで
増幅させることが可能であることが報告されている（Be
bbington C andHentschel, C., Trends Biotechnol.,
3., 314 1985）。しかしながら、この方法には長時間を
要し、さらにdhfr遺伝子欠損細胞にしか利用できないと
いう問題点がある。また、選択用の薬剤は高価であり、
組換え動物細胞を大スケールで培養する際に添加するこ
とは好ましくない。さらに、本方法により一度増幅した
遺伝子は、薬剤非添加の条件では不安定であり脱落しや
すいことも指摘されている（「遺伝子」第6版、菊地韶
彦他訳、P845‐848、東京化学同人）。
【００１３】＜安定高発現株の取得＞外来遺伝子が安定
に導入された動物細胞を選択する際には、選択マーカー
遺伝子が必要である。使用される選択用マーカー遺伝子
には様々な種類があり、これらは大きく２つに分類され
る。一つはhypoxanthine-guanine phosphoribosyl tran
sferase (HGPRT)、thymidine kinase (TK)、dihydrofol
ate reductase (DHFR)、adenine phosphoribosyl trans
ferase (APRT)などの遺伝子であり、それぞれの遺伝子
に対応する酵素活性が欠損した細胞のみを宿主として利
用できる。これらの酵素活性が欠損した細胞では、対応
する遺伝子が導入されることによって栄養要求性等が回
復するため外来遺伝子が導入された細胞株の選抜が可能
となる。もう一つの分類は、細胞の増殖を阻害する抗生
物質や薬剤に対して耐性を付与する遺伝子群である。具
体的には、methotrexate (MTX)耐性を与える変異型DHF
R、xanthine耐性を与えるxanthine-guanine phosphorib
osyl transferase (gpt)、ジェネティシン（G418）、ゲ
ンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシンなどの薬剤
に耐性を与えるトランスポゾンTn5由来のaminoglycosid
e 3’-phosphotransferase (neo)などがある。また最近
ではZeocinやHygromycin耐性を付与する遺伝子も開発さ
れている。これらの遺伝子はあらゆる動物細胞に対して
選択マーカー遺伝子として使用することが可能である。
に導入された動物細胞を選択する際には、選択マーカー
遺伝子が必要である。使用される選択用マーカー遺伝子
には様々な種類があり、これらは大きく２つに分類され
る。一つはhypoxanthine-guanine phosphoribosyl tran
sferase (HGPRT)、thymidine kinase (TK)、dihydrofol
ate reductase (DHFR)、adenine phosphoribosyl trans
ferase (APRT)などの遺伝子であり、それぞれの遺伝子
に対応する酵素活性が欠損した細胞のみを宿主として利
用できる。これらの酵素活性が欠損した細胞では、対応
する遺伝子が導入されることによって栄養要求性等が回
復するため外来遺伝子が導入された細胞株の選抜が可能
となる。もう一つの分類は、細胞の増殖を阻害する抗生
物質や薬剤に対して耐性を付与する遺伝子群である。具
体的には、methotrexate (MTX)耐性を与える変異型DHF
R、xanthine耐性を与えるxanthine-guanine phosphorib
osyl transferase (gpt)、ジェネティシン（G418）、ゲ
ンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシンなどの薬剤
に耐性を与えるトランスポゾンTn5由来のaminoglycosid
e 3’-phosphotransferase (neo)などがある。また最近
ではZeocinやHygromycin耐性を付与する遺伝子も開発さ
れている。これらの遺伝子はあらゆる動物細胞に対して
選択マーカー遺伝子として使用することが可能である。
【００１４】シクロヘキシミド（ＣＹＨ）は蛋白質合成
阻害剤であり、CYH耐性遺伝子を選択マーカーとした利
用例としては酵母での例が知られている。酵母において
は、CYHはリボソーム蛋白質サブユニットのL41蛋白質に
作用して蛋白質の生合成を阻害し、本蛋白質の56番目の
アミノ酸がプロリンであるとCYH感受性、グルタミンで
あると非感受性となることが明らかにされている(Kawai
S. 1992, J. Bacteriol., 174, ,254-262)。このこと
から、Candida utilis及びPhaffia rhodozymaなどのCYH
感受性酵母からL41蛋白質の遺伝子をクローニングし、
置換変異を導入することにより、L41-Qタイプ遺伝子を
構築して元の酵母に導入すると、これらの酵母がCYH耐
性になることが証明されている（Kondo K., 1995, J. B
acteriol.,177, 24, 7171-7177; Kim I.-G., 1998, App
l. Environ. Microbiol., 64, 5, 1947-1949）。しか
し、動物細胞など高等真核生物に応用を試みた報告はな
い。動物細胞における外来遺伝子導入用ベクターには通
常、これらのマーカー遺伝子のいずれかもしくは両方が
含まれており、さらに高発現株を容易に選択するため
に、green fluorescent protein (GFP)を組み込んだベ
クターも使用されている。以上の選択マーカー遺伝子を
用いて取得される多数の形質導入株の中から、所望の蛋
白質を高発現する株を選択しなければならないが、一般
にほとんどの形質導入株における外来遺伝子発現量は極
めて低く、そのスクリーニングは極めて困難である。
阻害剤であり、CYH耐性遺伝子を選択マーカーとした利
用例としては酵母での例が知られている。酵母において
は、CYHはリボソーム蛋白質サブユニットのL41蛋白質に
作用して蛋白質の生合成を阻害し、本蛋白質の56番目の
アミノ酸がプロリンであるとCYH感受性、グルタミンで
あると非感受性となることが明らかにされている(Kawai
S. 1992, J. Bacteriol., 174, ,254-262)。このこと
から、Candida utilis及びPhaffia rhodozymaなどのCYH
感受性酵母からL41蛋白質の遺伝子をクローニングし、
置換変異を導入することにより、L41-Qタイプ遺伝子を
構築して元の酵母に導入すると、これらの酵母がCYH耐
性になることが証明されている（Kondo K., 1995, J. B
acteriol.,177, 24, 7171-7177; Kim I.-G., 1998, App
l. Environ. Microbiol., 64, 5, 1947-1949）。しか
し、動物細胞など高等真核生物に応用を試みた報告はな
い。動物細胞における外来遺伝子導入用ベクターには通
常、これらのマーカー遺伝子のいずれかもしくは両方が
含まれており、さらに高発現株を容易に選択するため
に、green fluorescent protein (GFP)を組み込んだベ
クターも使用されている。以上の選択マーカー遺伝子を
用いて取得される多数の形質導入株の中から、所望の蛋
白質を高発現する株を選択しなければならないが、一般
にほとんどの形質導入株における外来遺伝子発現量は極
めて低く、そのスクリーニングは極めて困難である。
【００１５】このため、高発現組換え細胞を直接選択す
るいくつかの方法が報告されている。一つの方法は、細
胞を外来遺伝子とdhfr遺伝子とで共形質導入し、高濃度
のＭtxを含む培地中で直接培養することにより、高レベ
ルのdhfrを発現する形質導入細胞を選択する方法であ
る。これにより選択された細胞の多くは、外来遺伝子を
高発現する（Page MJ, Sydenham MA、Biotechnology 9,
1991, 64-68)。しかしながら、高濃度の選択剤を含む
培地中で直接培養することにより得られた高発現細胞は
増殖および安定性が悪いため、長期間の蛋白質生産の目
的で使用するには向かない。また、Ｍtxでの直接選択に
よって得られる組換え細胞中には、Mtxに対する感受性
が変化したdhfr酵素やMtxの作用を受けにくい細胞が優
先的に選択されてしまう可能性もある。
るいくつかの方法が報告されている。一つの方法は、細
胞を外来遺伝子とdhfr遺伝子とで共形質導入し、高濃度
のＭtxを含む培地中で直接培養することにより、高レベ
ルのdhfrを発現する形質導入細胞を選択する方法であ
る。これにより選択された細胞の多くは、外来遺伝子を
高発現する（Page MJ, Sydenham MA、Biotechnology 9,
1991, 64-68)。しかしながら、高濃度の選択剤を含む
培地中で直接培養することにより得られた高発現細胞は
増殖および安定性が悪いため、長期間の蛋白質生産の目
的で使用するには向かない。また、Ｍtxでの直接選択に
よって得られる組換え細胞中には、Mtxに対する感受性
が変化したdhfr酵素やMtxの作用を受けにくい細胞が優
先的に選択されてしまう可能性もある。
【００１６】２つめの方法として、１つのプロモーター
で所望の蛋白質をコードする遺伝子と選択マーカー遺伝
子とを一緒に発現させることにより、高発現細胞を効率
的に取得する方法も使われている。この場合、外来遺伝
子を５’側に、選択マーカー遺伝子をその３’側に含ん
だｍRNAを発現するようなベクターを用いる。一般的に
ポリシストロン性mＲＮＡの３'端の遺伝子の翻訳効率が
悪いため、選択される形質導入細胞においてはポリシス
トロン性mＲＮＡが高発現し、所望の蛋白質を高発現し
ていることが期待される(Kaufman RJ, Murtha P, Davie
s MV EMBO J、6:187 1987)。しかしながら、５’側の
遺伝子の種類により３'側の選択マーカーの翻訳効率が
大きく影響を受けたり、さらには、３’側の選択マーカ
ー遺伝子の発現量が極めて低い場合には形質導入株が選
択されなかったり、５’側遺伝子の一部が欠失して選択
マーカー遺伝子の翻訳効率が高まった細胞が選択されて
しまう危険性がある。Internal ribosome entry site
(IRES)は、ウイルス由来のRNAなどで発見された配列で
あり、リボソームのｍRNAへの結合と翻訳開始を促進す
ることが明らかにされている（Kaufman R. J., Nucleic
Acid Res 19:4485, 1991)。この性質を利用して、ポリ
シストロン性ｍRNA上の３’側遺伝子の翻訳効率を高め
ることが可能であり、IRESを利用して高発現細胞の選択
を比較的容易にしたベクターが開発されている。
で所望の蛋白質をコードする遺伝子と選択マーカー遺伝
子とを一緒に発現させることにより、高発現細胞を効率
的に取得する方法も使われている。この場合、外来遺伝
子を５’側に、選択マーカー遺伝子をその３’側に含ん
だｍRNAを発現するようなベクターを用いる。一般的に
ポリシストロン性mＲＮＡの３'端の遺伝子の翻訳効率が
悪いため、選択される形質導入細胞においてはポリシス
トロン性mＲＮＡが高発現し、所望の蛋白質を高発現し
ていることが期待される(Kaufman RJ, Murtha P, Davie
s MV EMBO J、6:187 1987)。しかしながら、５’側の
遺伝子の種類により３'側の選択マーカーの翻訳効率が
大きく影響を受けたり、さらには、３’側の選択マーカ
ー遺伝子の発現量が極めて低い場合には形質導入株が選
択されなかったり、５’側遺伝子の一部が欠失して選択
マーカー遺伝子の翻訳効率が高まった細胞が選択されて
しまう危険性がある。Internal ribosome entry site
(IRES)は、ウイルス由来のRNAなどで発見された配列で
あり、リボソームのｍRNAへの結合と翻訳開始を促進す
ることが明らかにされている（Kaufman R. J., Nucleic
Acid Res 19:4485, 1991)。この性質を利用して、ポリ
シストロン性ｍRNA上の３’側遺伝子の翻訳効率を高め
ることが可能であり、IRESを利用して高発現細胞の選択
を比較的容易にしたベクターが開発されている。
【００１７】３つめの方法として、選択マーカー遺伝子
の発現量を人為的に低下させることにより、同時に導入
する遺伝子発現量が選択された形質導入株中で高くなる
であろうことを期待する方法もある。例えば、所望の蛋
白質をコードする遺伝子の５’側にイントロンを配置
し、選択マーカー遺伝子をそのイントロン内部に配置す
る。これにより、低頻度で存在するスプライシングされ
ない完全長のｍＲＮＡだけが選択マーカー蛋白質を生産
する。このようなプラスミドにより選択される形質導入
株中では、選択マーカー遺伝子をイントロン中に含んで
なる遺伝子の転写物が高発現しており、結果として所望
の蛋白質が高発現することが示された(クローリー、ク
レイグ・ダブリュー ＷＯ９６／０４３９１)。また、
選択マーカー遺伝子の翻訳開始コドン周囲のＤＮＡ配列
を改変して当該遺伝子の翻訳効率を下げることによって
選択マーカー遺伝子の発現量を減弱化することにより、
選択された形質導入株中で外来遺伝子を高発現する方法
も報告されている（Reff Mitchell E. WO98/41645）。
の発現量を人為的に低下させることにより、同時に導入
する遺伝子発現量が選択された形質導入株中で高くなる
であろうことを期待する方法もある。例えば、所望の蛋
白質をコードする遺伝子の５’側にイントロンを配置
し、選択マーカー遺伝子をそのイントロン内部に配置す
る。これにより、低頻度で存在するスプライシングされ
ない完全長のｍＲＮＡだけが選択マーカー蛋白質を生産
する。このようなプラスミドにより選択される形質導入
株中では、選択マーカー遺伝子をイントロン中に含んで
なる遺伝子の転写物が高発現しており、結果として所望
の蛋白質が高発現することが示された(クローリー、ク
レイグ・ダブリュー ＷＯ９６／０４３９１)。また、
選択マーカー遺伝子の翻訳開始コドン周囲のＤＮＡ配列
を改変して当該遺伝子の翻訳効率を下げることによって
選択マーカー遺伝子の発現量を減弱化することにより、
選択された形質導入株中で外来遺伝子を高発現する方法
も報告されている（Reff Mitchell E. WO98/41645）。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】前述したように、動物
細胞を宿主とした発現系は、発現した蛋白質が正確な翻
訳後修飾を受け、活性を発揮するのに適切なフォールデ
ィングが期待できることから、ヒトやそれ以外の動物由
来の遺伝子の機能性を調べる研究やそれらがコードする
蛋白質の大量生産において、最も適した生産系である。
しかしながら、他の宿主を用いた組換え生産系に比較し
て蛋白質の生産性の低さが大きな欠点となっている。こ
のため、外来遺伝子の高発現細胞株を樹立するには数多
くのDNA導入細胞株から高発現株をスクリーニングする
必要がある。所望の蛋白質を比較的高発現する安定形質
導入株を選択した後においても、蛋白質の生産のために
はしばしば前述の多大な労力と時間のかかる導入遺伝子
の増幅操作が必要になる。以上のことから、遺伝子を高
発現する組換え動物細胞を効率的に選択可能にする技術
の開発、取得した遺伝子高発現細胞中での遺伝子の安定
化技術の開発、簡便な遺伝子増幅技術の開発など、動物
細胞による遺伝子発現系にはさらなる改良が待たれてい
る。
細胞を宿主とした発現系は、発現した蛋白質が正確な翻
訳後修飾を受け、活性を発揮するのに適切なフォールデ
ィングが期待できることから、ヒトやそれ以外の動物由
来の遺伝子の機能性を調べる研究やそれらがコードする
蛋白質の大量生産において、最も適した生産系である。
しかしながら、他の宿主を用いた組換え生産系に比較し
て蛋白質の生産性の低さが大きな欠点となっている。こ
のため、外来遺伝子の高発現細胞株を樹立するには数多
くのDNA導入細胞株から高発現株をスクリーニングする
必要がある。所望の蛋白質を比較的高発現する安定形質
導入株を選択した後においても、蛋白質の生産のために
はしばしば前述の多大な労力と時間のかかる導入遺伝子
の増幅操作が必要になる。以上のことから、遺伝子を高
発現する組換え動物細胞を効率的に選択可能にする技術
の開発、取得した遺伝子高発現細胞中での遺伝子の安定
化技術の開発、簡便な遺伝子増幅技術の開発など、動物
細胞による遺伝子発現系にはさらなる改良が待たれてい
る。
【００１９】本発明は、上記の問題点を解決すること、
特に、外来遺伝子を高発現する組換え細胞が高頻度で選
択され得る新規な選択マーカー遺伝子含有ベクター、な
らびにこのベクターを用いて高発現株を効率的に選択す
るスクリーニング法、および所望の蛋白質を高レベルで
生産することを可能とする蛋白製造技術を提供すること
を目的とするものである。
特に、外来遺伝子を高発現する組換え細胞が高頻度で選
択され得る新規な選択マーカー遺伝子含有ベクター、な
らびにこのベクターを用いて高発現株を効率的に選択す
るスクリーニング法、および所望の蛋白質を高レベルで
生産することを可能とする蛋白製造技術を提供すること
を目的とするものである。
【００２０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、新たな動
物細胞用選択マーカー遺伝子として変異型リボソームサ
ブユニット構成蛋白質をコードする遺伝子を開発し、当
該遺伝子の導入が、動物細胞に蛋白質合成阻害作用を持
つシクロヘキシミドに対する耐性を付与することを明ら
かにした。さらに、当該遺伝子を含む発現ベクターを用
いて選択されたシクロヘキシミド耐性動物細胞において
は、(i) 従来より使用されてきた薬剤耐性遺伝子で選択
された安定形質導入細胞に比較して外来遺伝子の発現量
が極めて高い形質転換細胞が数多く得られること、(ii)
外来遺伝子がコードする蛋白質は細胞内蛋白質であっ
ても分泌蛋白質であっても良く、その傾向は変わらない
こと、(iii) シクロヘキシミド非添加の培養条件下で細
胞を継代培養してもその高い発現量は安定に保持される
こと、を明らかにした。さらに、 導入された遺伝子の
コピー数とその発現量の間に相関関係が認められないこ
とから、当該選択マーカーを用いることによって、外来
遺伝子が宿主細胞染色体上の高発現位置に組み込まれる
頻度が高くなることにより遺伝子の高発現が生じる可能
性を明らかにした。以上のように、本発明者らは、新た
な薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとした発現プラスミド
の形態で外来遺伝子を動物細胞に導入することにより、
外来遺伝子を高発現する細胞を短時間で効率的に選択す
る技術を確立できることを見出し、この知見に基づいて
本発明を完成させるに至った。
物細胞用選択マーカー遺伝子として変異型リボソームサ
ブユニット構成蛋白質をコードする遺伝子を開発し、当
該遺伝子の導入が、動物細胞に蛋白質合成阻害作用を持
つシクロヘキシミドに対する耐性を付与することを明ら
かにした。さらに、当該遺伝子を含む発現ベクターを用
いて選択されたシクロヘキシミド耐性動物細胞において
は、(i) 従来より使用されてきた薬剤耐性遺伝子で選択
された安定形質導入細胞に比較して外来遺伝子の発現量
が極めて高い形質転換細胞が数多く得られること、(ii)
外来遺伝子がコードする蛋白質は細胞内蛋白質であっ
ても分泌蛋白質であっても良く、その傾向は変わらない
こと、(iii) シクロヘキシミド非添加の培養条件下で細
胞を継代培養してもその高い発現量は安定に保持される
こと、を明らかにした。さらに、 導入された遺伝子の
コピー数とその発現量の間に相関関係が認められないこ
とから、当該選択マーカーを用いることによって、外来
遺伝子が宿主細胞染色体上の高発現位置に組み込まれる
頻度が高くなることにより遺伝子の高発現が生じる可能
性を明らかにした。以上のように、本発明者らは、新た
な薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとした発現プラスミド
の形態で外来遺伝子を動物細胞に導入することにより、
外来遺伝子を高発現する細胞を短時間で効率的に選択す
る技術を確立できることを見出し、この知見に基づいて
本発明を完成させるに至った。
【００２１】すなわち、本発明は、下記の薬剤耐性遺伝
子、発現ベクター、遺伝子の高発現細胞のスクリーニン
グ方法、形質転換細胞、および組換え蛋白質の生産法、
に関するものである。 （１）蛋白質合成阻害剤に感受性の動物細胞に、該阻害
剤に対する耐性を付与する性質を有し、かつ動物由来の
リボソームを構成する蛋白質をコードする遺伝子を置換
変異した配列を有する、薬剤耐性遺伝子（蛋白質合成阻
害剤耐性遺伝子）。代表的には、シクロヘキシミド感受
性の動物細胞にシクロヘキシミド耐性を付与する性質を
有し、かつ動物由来リボソーム蛋白質L36aまたはその相
同蛋白質をコードする遺伝子を置換変異した配列を有す
る、上記蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子（シクロヘキシミ
ド耐性遺伝子）。別の好ましい態様は、シクロヘキシミ
ド感受性の動物細胞にシクロヘキシミド耐性を付与する
性質を有し、かつ配列番号１または２に示されるアミノ
酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個
のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミ
ノ酸配列をコードする、上記のシクロヘキシミド耐性遺
伝子。 （２）上記の蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子を含む組換え
ベクター。 （３）上記の遺伝子と外来蛋白質構造遺伝子とを含む発
現ベクター。 （４）上記の発現ベクターが導入された蛋白質合成阻害
剤耐性動物細胞株を選択する方法。具体的には、上記の
発現ベクターを蛋白質合成阻害剤感受性の動物細胞に導
入してこれを培養し、蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子を選
択マーカーとして細胞株を選択することを特徴とする、
蛋白質合成阻害剤耐性動物細胞株の選択方法。 （５）上記の発現ベクターを含む動物細胞からなる形質
転換細胞。 （６）上記の形質転換動物細胞を培養し、発現された外
来蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質生産方法。
子、発現ベクター、遺伝子の高発現細胞のスクリーニン
グ方法、形質転換細胞、および組換え蛋白質の生産法、
に関するものである。 （１）蛋白質合成阻害剤に感受性の動物細胞に、該阻害
剤に対する耐性を付与する性質を有し、かつ動物由来の
リボソームを構成する蛋白質をコードする遺伝子を置換
変異した配列を有する、薬剤耐性遺伝子（蛋白質合成阻
害剤耐性遺伝子）。代表的には、シクロヘキシミド感受
性の動物細胞にシクロヘキシミド耐性を付与する性質を
有し、かつ動物由来リボソーム蛋白質L36aまたはその相
同蛋白質をコードする遺伝子を置換変異した配列を有す
る、上記蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子（シクロヘキシミ
ド耐性遺伝子）。別の好ましい態様は、シクロヘキシミ
ド感受性の動物細胞にシクロヘキシミド耐性を付与する
性質を有し、かつ配列番号１または２に示されるアミノ
酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個
のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミ
ノ酸配列をコードする、上記のシクロヘキシミド耐性遺
伝子。 （２）上記の蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子を含む組換え
ベクター。 （３）上記の遺伝子と外来蛋白質構造遺伝子とを含む発
現ベクター。 （４）上記の発現ベクターが導入された蛋白質合成阻害
剤耐性動物細胞株を選択する方法。具体的には、上記の
発現ベクターを蛋白質合成阻害剤感受性の動物細胞に導
入してこれを培養し、蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子を選
択マーカーとして細胞株を選択することを特徴とする、
蛋白質合成阻害剤耐性動物細胞株の選択方法。 （５）上記の発現ベクターを含む動物細胞からなる形質
転換細胞。 （６）上記の形質転換動物細胞を培養し、発現された外
来蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質生産方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】本発明において、蛋白質合成阻害
剤耐性遺伝子としては、例えばシクロヘキシミド耐性遺
伝子がその代表例として挙げられる。以下、本発明を好
ましい態様に基づいて詳細に説明する。
剤耐性遺伝子としては、例えばシクロヘキシミド耐性遺
伝子がその代表例として挙げられる。以下、本発明を好
ましい態様に基づいて詳細に説明する。
【００２３】＜シクロヘキシミド耐性遺伝子＞シクロヘ
キシミド（以下、CYHとも呼ぶ）は多くの真核生物に作
用する蛋白質合成阻害剤であり、ｍＲＮＡ翻訳反応の場
であるリボソームの60Sラージサブユニットに作用して
ペプチド鎖の伸張反応を抑制することにより阻害作用を
示すことが知られている。
キシミド（以下、CYHとも呼ぶ）は多くの真核生物に作
用する蛋白質合成阻害剤であり、ｍＲＮＡ翻訳反応の場
であるリボソームの60Sラージサブユニットに作用して
ペプチド鎖の伸張反応を抑制することにより阻害作用を
示すことが知られている。
【００２４】本発明もしくは本明細書において「蛋白質
合成阻害剤耐性遺伝子」（代表的には「シクロヘキシミ
ド耐性遺伝子」）とは、蛋白質合成阻害剤（代表的には
CYH）に対する耐性を付与することが可能な遺伝子であ
り、蛋白質合成阻害剤感受性（代表的にはCYH感受性）
の動物もしくは動物細胞に蛋白質合成阻害剤耐性（代表
的にはCYH耐性）を付与することができる遺伝子のこと
を言う。
合成阻害剤耐性遺伝子」（代表的には「シクロヘキシミ
ド耐性遺伝子」）とは、蛋白質合成阻害剤（代表的には
CYH）に対する耐性を付与することが可能な遺伝子であ
り、蛋白質合成阻害剤感受性（代表的にはCYH感受性）
の動物もしくは動物細胞に蛋白質合成阻害剤耐性（代表
的にはCYH耐性）を付与することができる遺伝子のこと
を言う。
【００２５】本発明の代表的態様であるシクロヘキシミ
ド耐性遺伝子は、シクロヘキシミド感受性の動物細胞に
シクロヘキシミド耐性を付与する性質を有し、かつ動物
由来の蛋白合成の場であるリボソームの構成蛋白質をコ
ードする遺伝子を置換変異した配列を有する遺伝子であ
る。上記動物由来のリボソーム（具体的には６０Ｓラー
ジサブユニット）の構成蛋白質は、好ましくは哺乳動物
由来の蛋白質であり、更に好ましくはヒト由来の蛋白質
である。
ド耐性遺伝子は、シクロヘキシミド感受性の動物細胞に
シクロヘキシミド耐性を付与する性質を有し、かつ動物
由来の蛋白合成の場であるリボソームの構成蛋白質をコ
ードする遺伝子を置換変異した配列を有する遺伝子であ
る。上記動物由来のリボソーム（具体的には６０Ｓラー
ジサブユニット）の構成蛋白質は、好ましくは哺乳動物
由来の蛋白質であり、更に好ましくはヒト由来の蛋白質
である。
【００２６】本発明によるシクロヘキシミド耐性遺伝子
の好適な具体例は、動物細胞リボソームの60Sラージサ
ブユニットのＬ３６a蛋白質またはその機能的に同等な
相同蛋白質であって置換変異によりＣＹＨに耐性となっ
たＬ３６a変異蛋白質またはその相同蛋白質をコードす
る遺伝子である。従って、本発明遺伝子の代表的な態様
は、シクロヘキシミド感受性の動物細胞にシクロヘキシ
ミド耐性を付与する性質を有し、かつ動物由来リボソー
ム蛋白質L36a（好ましくは哺乳類由来、より好ましくは
ヒト由来リボソーム蛋白質L36a）またはその相同蛋白質
をコードする遺伝子を置換変異した配列を有するシクロ
ヘキシミド耐性遺伝子である。ここで、置換変異が導入
される遺伝子がコードする上記蛋白質は宿主となる前記
動物細胞（蛋白質合成阻害剤感受性、代表的にはＣＹＨ
感受性）蛋白質の相同蛋白質であること、もしくは該動
物細胞がＬ３６a相同蛋白質を有していることが好まし
い。本明細書において相同蛋白質とは、二つの関連蛋白
質がそのアミノ酸配列において９０％以上の相同性を有
する蛋白質を意味する。
の好適な具体例は、動物細胞リボソームの60Sラージサ
ブユニットのＬ３６a蛋白質またはその機能的に同等な
相同蛋白質であって置換変異によりＣＹＨに耐性となっ
たＬ３６a変異蛋白質またはその相同蛋白質をコードす
る遺伝子である。従って、本発明遺伝子の代表的な態様
は、シクロヘキシミド感受性の動物細胞にシクロヘキシ
ミド耐性を付与する性質を有し、かつ動物由来リボソー
ム蛋白質L36a（好ましくは哺乳類由来、より好ましくは
ヒト由来リボソーム蛋白質L36a）またはその相同蛋白質
をコードする遺伝子を置換変異した配列を有するシクロ
ヘキシミド耐性遺伝子である。ここで、置換変異が導入
される遺伝子がコードする上記蛋白質は宿主となる前記
動物細胞（蛋白質合成阻害剤感受性、代表的にはＣＹＨ
感受性）蛋白質の相同蛋白質であること、もしくは該動
物細胞がＬ３６a相同蛋白質を有していることが好まし
い。本明細書において相同蛋白質とは、二つの関連蛋白
質がそのアミノ酸配列において９０％以上の相同性を有
する蛋白質を意味する。
【００２７】本発明における上記置換変異の好ましい一
つの具体例は、後記実施例にも示されるように、ヒトｃ
DNAライブラリーから取得したＬ３６a遺伝子がコードす
る蛋白質の5４番目のアミノ酸をプロリンからグルタミ
ンに置換して、CYH耐性遺伝子を構築したものである。
つの具体例は、後記実施例にも示されるように、ヒトｃ
DNAライブラリーから取得したＬ３６a遺伝子がコードす
る蛋白質の5４番目のアミノ酸をプロリンからグルタミ
ンに置換して、CYH耐性遺伝子を構築したものである。
【００２８】また、以下に述べる種々の動物由来の蛋白
質は本発明における上記相同蛋白質に包含されるもので
あり、これらをコードする遺伝子を置換変異したシクロ
ヘキシミド耐性遺伝子はいずれも本発明遺伝子に包含さ
れる。ヒトには、Ｌ３６a遺伝子と９９%の配列同一性
（対応アミノ酸配列において９９％の同一性）を示すL4
4遺伝子が存在し、コードされる３８番目のアミノ酸が
リジン（Ｌ３６aではアルギニン）に置き換わってい
る。この遺伝子はＬ３６a遺伝子と機能および配列にお
いて実質的に同等であり、L44遺伝子も５４番目の対応
アミノ酸を同様にプロリンからグルタミンに置換するこ
とによってCYH耐性遺伝子として機能もしくは使用し得
るといえる。また、マウスやラットのL44遺伝子はヒトL
44遺伝子と全く同一の配列を有しており、ブタのL44遺
伝子は1残基（５２番目の対応アミノ酸配列）欠失して
いるがこれらも機能および配列において同一もしくは実
質的に同一であるといえる。
質は本発明における上記相同蛋白質に包含されるもので
あり、これらをコードする遺伝子を置換変異したシクロ
ヘキシミド耐性遺伝子はいずれも本発明遺伝子に包含さ
れる。ヒトには、Ｌ３６a遺伝子と９９%の配列同一性
（対応アミノ酸配列において９９％の同一性）を示すL4
4遺伝子が存在し、コードされる３８番目のアミノ酸が
リジン（Ｌ３６aではアルギニン）に置き換わってい
る。この遺伝子はＬ３６a遺伝子と機能および配列にお
いて実質的に同等であり、L44遺伝子も５４番目の対応
アミノ酸を同様にプロリンからグルタミンに置換するこ
とによってCYH耐性遺伝子として機能もしくは使用し得
るといえる。また、マウスやラットのL44遺伝子はヒトL
44遺伝子と全く同一の配列を有しており、ブタのL44遺
伝子は1残基（５２番目の対応アミノ酸配列）欠失して
いるがこれらも機能および配列において同一もしくは実
質的に同一であるといえる。
【００２９】以上のように、すでにそのDNA配列が明ら
かにされている哺乳類のL36a遺伝子の相同遺伝子はいず
れもアミノ酸配列の保存性が極めて高いことから、哺乳
類動物由来のL36a相同遺伝子（上記相同蛋白質をコード
する遺伝子）であれば、CYHに対する感受性を決定づけ
るアミノ酸（例えば、L36a蛋白質においては５４番目の
プロリン、ブタのL44蛋白質においては５３番目のプロ
リン）が適切な置換変異（例えばグルタミンに置換）さ
れた遺伝子はCYH耐性遺伝子として用いることが可能で
あるといえる。さらに、哺乳類動物由来でなくともアミ
ノ酸配列の相同性が十分に高く（前述のように９０％以
上）かつCYHに対する感受性を決定づけるアミノ酸（例
えば、L36a蛋白質においては５４番目、ブタのL44蛋白
質においては５３番目）が適切な置換変異（例えば、グ
ルタミン）に置換されていれば、他の動物由来の蛋白質
でも動物細胞に対する本発明CYH耐性マーカー遺伝子と
して使用できるといえる。このことは、前記の本発明選
択方法もしくは明細書に記載された方法、すなわち本発
明シクロヘキシミド耐性遺伝子およびと外来蛋白質遺伝
子を含む発現ベクターをシクロヘキシミド感受性の動物
細胞に導入してこれを培養し、シクロヘキシミド耐性遺
伝子を選択マーカーとして細胞株を選択することを特徴
とするシクロヘキシミド耐性動物細胞株の選択方法、更
に具体的には後記実施例４に記載された選択方法に従っ
て、動物細胞への形質導入実験を実施することにより確
認することができる。
かにされている哺乳類のL36a遺伝子の相同遺伝子はいず
れもアミノ酸配列の保存性が極めて高いことから、哺乳
類動物由来のL36a相同遺伝子（上記相同蛋白質をコード
する遺伝子）であれば、CYHに対する感受性を決定づけ
るアミノ酸（例えば、L36a蛋白質においては５４番目の
プロリン、ブタのL44蛋白質においては５３番目のプロ
リン）が適切な置換変異（例えばグルタミンに置換）さ
れた遺伝子はCYH耐性遺伝子として用いることが可能で
あるといえる。さらに、哺乳類動物由来でなくともアミ
ノ酸配列の相同性が十分に高く（前述のように９０％以
上）かつCYHに対する感受性を決定づけるアミノ酸（例
えば、L36a蛋白質においては５４番目、ブタのL44蛋白
質においては５３番目）が適切な置換変異（例えば、グ
ルタミン）に置換されていれば、他の動物由来の蛋白質
でも動物細胞に対する本発明CYH耐性マーカー遺伝子と
して使用できるといえる。このことは、前記の本発明選
択方法もしくは明細書に記載された方法、すなわち本発
明シクロヘキシミド耐性遺伝子およびと外来蛋白質遺伝
子を含む発現ベクターをシクロヘキシミド感受性の動物
細胞に導入してこれを培養し、シクロヘキシミド耐性遺
伝子を選択マーカーとして細胞株を選択することを特徴
とするシクロヘキシミド耐性動物細胞株の選択方法、更
に具体的には後記実施例４に記載された選択方法に従っ
て、動物細胞への形質導入実験を実施することにより確
認することができる。
【００３０】一方、すでにCYH耐性遺伝子として応用の
報告がある酵母C.utilis由来のL４１遺伝子について
は、ヒトL36a遺伝子とのアミノ酸配列の相同性が７７％
と低く、機能的に相補できるかは不明である。その他C.
elegansやC.maltosaなどでも明らかにされているL41遺
伝子がコードする蛋白質のL３６ａとの相同性も低く、
これらの遺伝子は本発明シクロヘキシミド耐性遺伝子構
築のための遺伝子には包含されない。
報告がある酵母C.utilis由来のL４１遺伝子について
は、ヒトL36a遺伝子とのアミノ酸配列の相同性が７７％
と低く、機能的に相補できるかは不明である。その他C.
elegansやC.maltosaなどでも明らかにされているL41遺
伝子がコードする蛋白質のL３６ａとの相同性も低く、
これらの遺伝子は本発明シクロヘキシミド耐性遺伝子構
築のための遺伝子には包含されない。
【００３１】本発明の別の観点における好ましい態様の
遺伝子は、シクロヘキシミド感受性の動物細胞にシクロ
ヘキシミド耐性を付与する性質を有し、かつ配列番号１
または２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配
列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿
入もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするシクロ
ヘキシミド耐性遺伝子である。ここで、配列番号１はヒ
ト由来のリボソーム蛋白質L３６ａにおける５４番目の
プロリンがグルタミンに置換変異したものであり、ま
た、配列番号２はヒト由来のリボソーム蛋白質L４４に
おける５４番目のプロリンがグルタミンに置換変異した
ものである。この態様において、シクロヘキシミド感受
性の動物細胞にシクロヘキシミド耐性を付与する性質を
有し、かつ上記相同蛋白質をコードする遺伝子について
置換変異した配列を有するシクロヘキシミド耐性遺伝子
はすべて包含される。
遺伝子は、シクロヘキシミド感受性の動物細胞にシクロ
ヘキシミド耐性を付与する性質を有し、かつ配列番号１
または２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配
列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿
入もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするシクロ
ヘキシミド耐性遺伝子である。ここで、配列番号１はヒ
ト由来のリボソーム蛋白質L３６ａにおける５４番目の
プロリンがグルタミンに置換変異したものであり、ま
た、配列番号２はヒト由来のリボソーム蛋白質L４４に
おける５４番目のプロリンがグルタミンに置換変異した
ものである。この態様において、シクロヘキシミド感受
性の動物細胞にシクロヘキシミド耐性を付与する性質を
有し、かつ上記相同蛋白質をコードする遺伝子について
置換変異した配列を有するシクロヘキシミド耐性遺伝子
はすべて包含される。
【００３２】＜シクロヘキシミド耐性遺伝子の構築＞本
発明の代表的態様においては動物細胞がCYHに対して感
受性であることに着目し、CYH耐性遺伝子を新たな形質
転換用のマーカー遺伝子として提供することを目的とし
た。すなわち、動物細胞からリボソーム蛋白質の遺伝子
をクローニングし、その遺伝子を改変することにより、
CYH耐性遺伝子が構築できるかどうか、そのマーカー遺
伝を用いた発現ベクターを構築し、これを用いた外来蛋
白質生産系を開発することを、以下に記載する手段によ
って検討した。以下の記載は、動物由来のリボソームを
構成する蛋白質としてL36a蛋白質を例示したものであ
る。
発明の代表的態様においては動物細胞がCYHに対して感
受性であることに着目し、CYH耐性遺伝子を新たな形質
転換用のマーカー遺伝子として提供することを目的とし
た。すなわち、動物細胞からリボソーム蛋白質の遺伝子
をクローニングし、その遺伝子を改変することにより、
CYH耐性遺伝子が構築できるかどうか、そのマーカー遺
伝を用いた発現ベクターを構築し、これを用いた外来蛋
白質生産系を開発することを、以下に記載する手段によ
って検討した。以下の記載は、動物由来のリボソームを
構成する蛋白質としてL36a蛋白質を例示したものであ
る。
【００３３】本発明を構成するため、まず酵母L41蛋白
質と相同な遺伝子としてヒトL36a蛋白質の遺伝子を単離
クローニングする。具体的には、公知のDNA配列をもと
にオリゴヌクレオチドを合成しプローブとして用いるこ
とにより、ヒトｃDNAライブラリーから当該遺伝子をク
ローニングすれば良い。本発明の実施例においては、Ge
ne trapper cDNA Positive Selection System (Gibco
BRL, Cat. No. 10356-020)を用いてL36a遺伝子のcDNAを
クローニングしたが、他の方法、例えばファージライブ
ラリーやプラスミドライブラリーから、標識したプロー
ブを用いてハイブリダイゼーションによりクローニング
することも可能である。これらの方法は、J.Sambrook,
E.F.Frisch, T.Maniatis著；モレキュラー クローニン
グ第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コール
ドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Ha
rbor Laboratory）発行、１９８９年）に従えば良い。
質と相同な遺伝子としてヒトL36a蛋白質の遺伝子を単離
クローニングする。具体的には、公知のDNA配列をもと
にオリゴヌクレオチドを合成しプローブとして用いるこ
とにより、ヒトｃDNAライブラリーから当該遺伝子をク
ローニングすれば良い。本発明の実施例においては、Ge
ne trapper cDNA Positive Selection System (Gibco
BRL, Cat. No. 10356-020)を用いてL36a遺伝子のcDNAを
クローニングしたが、他の方法、例えばファージライブ
ラリーやプラスミドライブラリーから、標識したプロー
ブを用いてハイブリダイゼーションによりクローニング
することも可能である。これらの方法は、J.Sambrook,
E.F.Frisch, T.Maniatis著；モレキュラー クローニン
グ第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コール
ドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Ha
rbor Laboratory）発行、１９８９年）に従えば良い。
【００３４】クローニングしたL36a遺伝子からCYH耐性
型遺伝子を構築するために、本発明実施例においてはL3
6a遺伝子の５４番目の対応アミノ酸がグルタミンとなる
ようにデザインしたプライマーを用いてL36a遺伝子を鋳
型としたPCRを３回行うことにより、CYH耐性を付与する
CYH耐性遺伝子（マーカー遺伝子）を構築した（配列表
の配列番号１の塩基配列参照）。このようにしてPCRで
増幅された本発明遺伝子は、例えば、TAクローニングキ
ット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Stratagene
社）などの市販のプラスミドベクターを用いてクローニ
ングすることができる。アミノ酸配列を耐性型へと変更
するためには、合目的的な任意の方法が可能であり、例
えばミスマッチプライマーを用いた部位特異的変異導入
法を用いることができる。この方法に関しては前述のモ
レキュラー クローニング第２版に詳述されている。ま
た、本発明遺伝子は、配列番号１または２で示される塩
基配列情報に基づいて、例えばホスファイト・トリエス
テル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 198
4）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うこ
とにより調製することもできる。更に、これらPCR法や
部位特異的変異導入法、化学合成法などの方法を使用
し、公的なDNAデータベースから入手可能なL36a遺伝子
に、機能的に相同な既知遺伝子の配列情報を元にして、
L36a遺伝子の５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が
グルタミンとなるようにアミノ酸変異を導入することに
より、CYH耐性遺伝子を構築することができる。このよ
うにして得られたＤＮＡの塩基配列は、たとえばMaxam-
Gilbert法(Maxam, A. M. and Gilbert, W., Proc. Nat
l. Acad. Sci.,U.S.A.,74,5601977)Sanger法（例えばSa
nger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 197
5、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977）に準じて解析するこ
とにより確認することができる。
型遺伝子を構築するために、本発明実施例においてはL3
6a遺伝子の５４番目の対応アミノ酸がグルタミンとなる
ようにデザインしたプライマーを用いてL36a遺伝子を鋳
型としたPCRを３回行うことにより、CYH耐性を付与する
CYH耐性遺伝子（マーカー遺伝子）を構築した（配列表
の配列番号１の塩基配列参照）。このようにしてPCRで
増幅された本発明遺伝子は、例えば、TAクローニングキ
ット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Stratagene
社）などの市販のプラスミドベクターを用いてクローニ
ングすることができる。アミノ酸配列を耐性型へと変更
するためには、合目的的な任意の方法が可能であり、例
えばミスマッチプライマーを用いた部位特異的変異導入
法を用いることができる。この方法に関しては前述のモ
レキュラー クローニング第２版に詳述されている。ま
た、本発明遺伝子は、配列番号１または２で示される塩
基配列情報に基づいて、例えばホスファイト・トリエス
テル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 198
4）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うこ
とにより調製することもできる。更に、これらPCR法や
部位特異的変異導入法、化学合成法などの方法を使用
し、公的なDNAデータベースから入手可能なL36a遺伝子
に、機能的に相同な既知遺伝子の配列情報を元にして、
L36a遺伝子の５４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が
グルタミンとなるようにアミノ酸変異を導入することに
より、CYH耐性遺伝子を構築することができる。このよ
うにして得られたＤＮＡの塩基配列は、たとえばMaxam-
Gilbert法(Maxam, A. M. and Gilbert, W., Proc. Nat
l. Acad. Sci.,U.S.A.,74,5601977)Sanger法（例えばSa
nger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 197
5、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977）に準じて解析するこ
とにより確認することができる。
【００３５】＜選択マーカー遺伝子を含むベクターの構
築＞本発明は、上記のような蛋白質合成阻害剤耐性遺伝
子（代表的にはCYH耐性遺伝子）を含む組換えベクタ
ー、および蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子と外来蛋白質遺
伝子とを含む発現ベクターにも関する。
築＞本発明は、上記のような蛋白質合成阻害剤耐性遺伝
子（代表的にはCYH耐性遺伝子）を含む組換えベクタ
ー、および蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子と外来蛋白質遺
伝子とを含む発現ベクターにも関する。
【００３６】本発明による上記蛋白質合成阻害剤耐性遺
伝子の宿主細胞での発現には、宿主で作動可能な制御配
列（例えばプロモーター配列及びターミネーター配列）
を作動可能に連結させ、これをベクターに組込むことに
より、本発明による遺伝子を宿主で発現させることがで
きる。ここで作動可能に連結するとは、本発明による遺
伝子が導入される宿主において、制御配列のコントロー
ル下で遺伝子が発現するように制御配列と本発明による
遺伝子を結合させることを意味する。通常はプロモータ
ーを遺伝子の５’上流に、ターミネーターを遺伝子の
３’下流に連結することができる。使用するプロモータ
ーは、形質転換する宿主細胞内でプロモーター活性を示
すものであれば特に制限がない。L36a遺伝子を本来発現
している染色体上のプロモーター領域をその発現に用い
ても良いが、これ以外にも、形質転換用の宿主が動物細
胞である本発明においては、アデノウイルス（Ａｄ）の
初期もしくは後期プロモーター、シミアンウイルス（Ｓ
Ｖ４０）の初期もしくは後期プロモーター、単純ヘルペ
スウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝
子プロモーター、ラウス肉腫ウイルスや、サイトメガロ
ウイルス、マウス乳頭腫ウイルス、ウシパヒローマウイ
ルス、鳥の肉腫ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウ
イルスなどのウイルスのゲノムから得られるプロモータ
ー、哺乳動物由来のプロモーター、例えばアクチンプロ
モーターまたはイムノグロブリンプロモーター、ヒート
ショックプロテインプロモーター、などが利用できる。
伝子の宿主細胞での発現には、宿主で作動可能な制御配
列（例えばプロモーター配列及びターミネーター配列）
を作動可能に連結させ、これをベクターに組込むことに
より、本発明による遺伝子を宿主で発現させることがで
きる。ここで作動可能に連結するとは、本発明による遺
伝子が導入される宿主において、制御配列のコントロー
ル下で遺伝子が発現するように制御配列と本発明による
遺伝子を結合させることを意味する。通常はプロモータ
ーを遺伝子の５’上流に、ターミネーターを遺伝子の
３’下流に連結することができる。使用するプロモータ
ーは、形質転換する宿主細胞内でプロモーター活性を示
すものであれば特に制限がない。L36a遺伝子を本来発現
している染色体上のプロモーター領域をその発現に用い
ても良いが、これ以外にも、形質転換用の宿主が動物細
胞である本発明においては、アデノウイルス（Ａｄ）の
初期もしくは後期プロモーター、シミアンウイルス（Ｓ
Ｖ４０）の初期もしくは後期プロモーター、単純ヘルペ
スウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝
子プロモーター、ラウス肉腫ウイルスや、サイトメガロ
ウイルス、マウス乳頭腫ウイルス、ウシパヒローマウイ
ルス、鳥の肉腫ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウ
イルスなどのウイルスのゲノムから得られるプロモータ
ー、哺乳動物由来のプロモーター、例えばアクチンプロ
モーターまたはイムノグロブリンプロモーター、ヒート
ショックプロテインプロモーター、などが利用できる。
【００３７】本発明による組換えDNAベクターは、CYH耐
性遺伝子が宿主細胞内で発現可能な形で組込まれたベク
ターであれば、特に限定されない。例えばpCIneo（Prom
ega）のように、あらかじめ動物細胞で機能するプロモ
ーター及びターミネーター配列が含まれているベクタ
ー、代表的にはプラスミドに作動可能な形態にCYH耐性
遺伝子を連結することによって構築することが可能であ
る。また、例えばCMV初期遺伝子プロモーターとSV40後
期遺伝子ターミネーターとで作動可能になったCYH耐性
遺伝子を大腸菌複製オリジン(ColE1 ori)およびアンピ
シリン耐性遺伝子を有するプラスミドベクターpUC18(宝
酒造)や、pBluescriptII（Stratagene）、pBR322などの
プラスミドに連結することにより、本発明組換えベクタ
ーを構築することができる。さらに、必要に応じてG418
耐性遺伝子などのその他の選択マーカー遺伝子やdhfr遺
伝子などの遺伝子増幅を可能にする遺伝子などと組み合
わて用いても良い。形質転換のための宿主動物細胞とし
てジヒドロ葉酸還元酵素欠損CHO細胞を用いることによ
って、本発明による選択マーカー遺伝子とdhfr遺伝子及
び外来蛋白遺伝子を含むプラスミド（発現ベクター）を
宿主細胞へ導入後にメトトレキセートによる該プラスミ
ドの遺伝子の効率的な増幅が可能になる。すなわちdhfr
遺伝子配列に物理的に結合している外来遺伝子配列もま
た増幅されることが示されている(Kaufman RJ, Sharp P
A J Mol Biol 25:601 1982、Christman JK, et al. Pr
oc Natl Acad Sci U S A. 79:1815 1982)。また、発現
ベクターには、所望によりシグナル配列を結合させて目
的とする外来遺伝子の発現産物を回収し易くすることも
できる。
性遺伝子が宿主細胞内で発現可能な形で組込まれたベク
ターであれば、特に限定されない。例えばpCIneo（Prom
ega）のように、あらかじめ動物細胞で機能するプロモ
ーター及びターミネーター配列が含まれているベクタ
ー、代表的にはプラスミドに作動可能な形態にCYH耐性
遺伝子を連結することによって構築することが可能であ
る。また、例えばCMV初期遺伝子プロモーターとSV40後
期遺伝子ターミネーターとで作動可能になったCYH耐性
遺伝子を大腸菌複製オリジン(ColE1 ori)およびアンピ
シリン耐性遺伝子を有するプラスミドベクターpUC18(宝
酒造)や、pBluescriptII（Stratagene）、pBR322などの
プラスミドに連結することにより、本発明組換えベクタ
ーを構築することができる。さらに、必要に応じてG418
耐性遺伝子などのその他の選択マーカー遺伝子やdhfr遺
伝子などの遺伝子増幅を可能にする遺伝子などと組み合
わて用いても良い。形質転換のための宿主動物細胞とし
てジヒドロ葉酸還元酵素欠損CHO細胞を用いることによ
って、本発明による選択マーカー遺伝子とdhfr遺伝子及
び外来蛋白遺伝子を含むプラスミド（発現ベクター）を
宿主細胞へ導入後にメトトレキセートによる該プラスミ
ドの遺伝子の効率的な増幅が可能になる。すなわちdhfr
遺伝子配列に物理的に結合している外来遺伝子配列もま
た増幅されることが示されている(Kaufman RJ, Sharp P
A J Mol Biol 25:601 1982、Christman JK, et al. Pr
oc Natl Acad Sci U S A. 79:1815 1982)。また、発現
ベクターには、所望によりシグナル配列を結合させて目
的とする外来遺伝子の発現産物を回収し易くすることも
できる。
【００３８】さらに、本発明による組換えベクターに、
外来遺伝子を高発現する株を容易に選択できるように活
性測定が簡便に行なえるレポーター遺伝子を連結するこ
とも可能である。このレポーター遺伝子としては、例え
ば緑色蛍光蛋白質をコードするＧＦＰ遺伝子などを利用
できる。ＧＦＰ蛋白質の高発現株は、例えば実施例５に
記載されている様にフローサイトメトリーを用いて簡便
に濃縮することができる。組換えベクターおよび発現ベ
クター構築のための一般的方法については、例えば後記
実施例に引用されたモレキュラー・クローニング第２版
等を参照することができる。
外来遺伝子を高発現する株を容易に選択できるように活
性測定が簡便に行なえるレポーター遺伝子を連結するこ
とも可能である。このレポーター遺伝子としては、例え
ば緑色蛍光蛋白質をコードするＧＦＰ遺伝子などを利用
できる。ＧＦＰ蛋白質の高発現株は、例えば実施例５に
記載されている様にフローサイトメトリーを用いて簡便
に濃縮することができる。組換えベクターおよび発現ベ
クター構築のための一般的方法については、例えば後記
実施例に引用されたモレキュラー・クローニング第２版
等を参照することができる。
【００３９】＜本選択マーカー遺伝子により形質導入さ
れうる外来遺伝子＞本発明による上記発現ベクターによ
り、所望のポリペプチドをコードする外来遺伝子を宿主
細胞において高レベルで発現することが可能である。こ
のようなポリペプチドとしては次のようなものが例示さ
れる。
れうる外来遺伝子＞本発明による上記発現ベクターによ
り、所望のポリペプチドをコードする外来遺伝子を宿主
細胞において高レベルで発現することが可能である。こ
のようなポリペプチドとしては次のようなものが例示さ
れる。
【００４０】代表的なポリペプチドは、各種モノクロー
ナル抗体、サイトカイン類（例えば、インターフェロン
（ＩＦＮ）α、β、γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リン
フォトキシン（ＬＴ）、インターロイキン（ＩＬ）１〜
１３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球
・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、
幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、エ
リスロポエチン（ＥＰＯ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（Ｆ
ＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来増殖因
子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、
成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン様成長因子（ＩＧ
Ｆ）ＴＧＦαやＴＧＦβなどのトランスフォーミング成
長因子、など）、ウイルス抗原蛋白質（例えばヒト免疫
不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢ
Ｖ）、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ヘルペスウイル
ス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、成人
Ｔ細胞白血病ウイルス（ＡＴＬＶ）、インフルエンザウ
イルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイル
ス、などの抗原蛋白質など）、各種受容体（例えばＧ蛋
白質共役系受容体（ＧＰＣＲ）、サイトカインの受容
体、核内受容体など）、各種の遺伝子発現制御蛋白質、
スーパーオキシドジスムターゼ、α−１−アンチトリプ
シン、インスリン、プロインスリン、小胞刺激ホルモ
ン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝
固因子（VIIIＣ因子、IX因子、Xa因子組織因子、ウィレ
ブランド因子など）、プロテインＣ等の抗凝固因子、心
房性のナトリウム排泄増加因子、肺サーファクタント、
ウロキナーゼまたはヒト尿若しくは組織型プラスミノー
ゲン活性化因子(t−ＰＡ)等のプラスミノーゲン活性化
因子、ボンベシン、トロンビン、エンケファリナーゼ、
ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(ＭＩＰ−１−ア
ルファ)、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、マ
ウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチ
ビンなどである。
ナル抗体、サイトカイン類（例えば、インターフェロン
（ＩＦＮ）α、β、γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リン
フォトキシン（ＬＴ）、インターロイキン（ＩＬ）１〜
１３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球
・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、
幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、エ
リスロポエチン（ＥＰＯ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、
上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（Ｆ
ＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来増殖因
子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、
成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン様成長因子（ＩＧ
Ｆ）ＴＧＦαやＴＧＦβなどのトランスフォーミング成
長因子、など）、ウイルス抗原蛋白質（例えばヒト免疫
不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢ
Ｖ）、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ヘルペスウイル
ス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、成人
Ｔ細胞白血病ウイルス（ＡＴＬＶ）、インフルエンザウ
イルス、日本脳炎ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイル
ス、などの抗原蛋白質など）、各種受容体（例えばＧ蛋
白質共役系受容体（ＧＰＣＲ）、サイトカインの受容
体、核内受容体など）、各種の遺伝子発現制御蛋白質、
スーパーオキシドジスムターゼ、α−１−アンチトリプ
シン、インスリン、プロインスリン、小胞刺激ホルモ
ン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝
固因子（VIIIＣ因子、IX因子、Xa因子組織因子、ウィレ
ブランド因子など）、プロテインＣ等の抗凝固因子、心
房性のナトリウム排泄増加因子、肺サーファクタント、
ウロキナーゼまたはヒト尿若しくは組織型プラスミノー
ゲン活性化因子(t−ＰＡ)等のプラスミノーゲン活性化
因子、ボンベシン、トロンビン、エンケファリナーゼ、
ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(ＭＩＰ−１−ア
ルファ)、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、マ
ウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチ
ビンなどである。
【００４１】本発明においては、発現ベクターがＣＹＨ
耐性遺伝子と外来蛋白遺伝子を発現可能な形で含む限り
特に制限はない。
耐性遺伝子と外来蛋白遺伝子を発現可能な形で含む限り
特に制限はない。
【００４２】＜本選択マーカー遺伝子により形質転換可
能な宿主細胞＞本選択マーカー遺伝子、すなわち本発明
の蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子（代表的にはシクロヘキ
シミド耐性遺伝子）により、形質導入可能な宿主細胞は
あらゆる動物、特に哺乳動物に由来する蛋白質合成阻害
剤感受性（代表的にはシクロヘキシミド感受性）の細胞
である。例えば、有用な哺乳動物宿主細胞の例として
は、ＳＶ４０でトランスフォームされたサルの腎臓由来
のライン(ＣＯＳ７細胞)；ヒトの胎児の腎臓ライン(２
９３細胞)、ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ細胞)；チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞 (ＣＨＯ細胞、特にCHO
（DHFR-）細胞（ATCC,CRL-9096）)、マウスセルトリー
細胞(ＴＭ４細胞)、サルの腎細胞(ＣＶ１細胞)、アフリ
カングリーンモンキー腎細胞(ＶＥＲＯ細胞)、ヒトの子
宮頚部癌細胞(ＨeLa細胞)、犬の腎細胞(ＭＤＣＫ細
胞)、バッファロラット肝細胞(ＢＲＬ３Ａ細胞)、ヒト
肺細胞(Ｗ１３８細胞)、ヒト肝細胞(Ｈep Ｇ２細胞)、
ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞などがあげられ
る。また、細胞融合用の細胞として用いられるミエロー
マ細胞や、これらの細胞を各種リンパ球や脾細胞等と融
合させることによって得られるハイブリドーマ細胞など
も同様に使用することが可能である。
能な宿主細胞＞本選択マーカー遺伝子、すなわち本発明
の蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子（代表的にはシクロヘキ
シミド耐性遺伝子）により、形質導入可能な宿主細胞は
あらゆる動物、特に哺乳動物に由来する蛋白質合成阻害
剤感受性（代表的にはシクロヘキシミド感受性）の細胞
である。例えば、有用な哺乳動物宿主細胞の例として
は、ＳＶ４０でトランスフォームされたサルの腎臓由来
のライン(ＣＯＳ７細胞)；ヒトの胎児の腎臓ライン(２
９３細胞)、ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ細胞)；チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞 (ＣＨＯ細胞、特にCHO
（DHFR-）細胞（ATCC,CRL-9096）)、マウスセルトリー
細胞(ＴＭ４細胞)、サルの腎細胞(ＣＶ１細胞)、アフリ
カングリーンモンキー腎細胞(ＶＥＲＯ細胞)、ヒトの子
宮頚部癌細胞(ＨeLa細胞)、犬の腎細胞(ＭＤＣＫ細
胞)、バッファロラット肝細胞(ＢＲＬ３Ａ細胞)、ヒト
肺細胞(Ｗ１３８細胞)、ヒト肝細胞(Ｈep Ｇ２細胞)、
ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞などがあげられ
る。また、細胞融合用の細胞として用いられるミエロー
マ細胞や、これらの細胞を各種リンパ球や脾細胞等と融
合させることによって得られるハイブリドーマ細胞など
も同様に使用することが可能である。
【００４３】さらに、本発明の実施において有用な宿主
細胞には多能性胚幹細胞（ＥＳ細胞）が含まれる。ＥＳ
細胞はin vitroで培養した着床前の胚より得ることがで
きる。これらの細胞は培養により増殖させることがで
き、試験管内で分化させることもできる（Evans,N.,J.
らNature 292, 154-156,1981）。このようなＥＳ細胞は
ヒトを始めとする霊長類やウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギな
どの有用家畜動物、ラット、ウサギ、マウス及び数多く
の任意の種に由来しうる。これらのうち、外来蛋白質の
生産宿主となりうる、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの
家畜動物やラットやマウスなどの実験動物由来のＥＳ細
胞は好適な宿主である。当該マーカー遺伝子を用いて選
択される形質導入ＥＳ細胞株においては所望の蛋白質が
高発現される可能性が高く、取得された形質導入ＥＳ細
胞を元に得られる動物個体で所望の蛋白質が高発現する
ことが期待できる。
細胞には多能性胚幹細胞（ＥＳ細胞）が含まれる。ＥＳ
細胞はin vitroで培養した着床前の胚より得ることがで
きる。これらの細胞は培養により増殖させることがで
き、試験管内で分化させることもできる（Evans,N.,J.
らNature 292, 154-156,1981）。このようなＥＳ細胞は
ヒトを始めとする霊長類やウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギな
どの有用家畜動物、ラット、ウサギ、マウス及び数多く
の任意の種に由来しうる。これらのうち、外来蛋白質の
生産宿主となりうる、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの
家畜動物やラットやマウスなどの実験動物由来のＥＳ細
胞は好適な宿主である。当該マーカー遺伝子を用いて選
択される形質導入ＥＳ細胞株においては所望の蛋白質が
高発現される可能性が高く、取得された形質導入ＥＳ細
胞を元に得られる動物個体で所望の蛋白質が高発現する
ことが期待できる。
【００４４】上記動物細胞の中では、チャイニーズハム
スター卵巣由来のＣＨＯ細胞が好ましく、ジヒドロ葉酸
還元酵素欠損ＣＨＯ細胞（DHFR-細胞）がより好まし
い。また、上記の動物細胞は通常蛋白合成阻害剤に感受
性であるが、これは該阻害剤を含む培地で細胞を培養す
ることにより容易に確認できる。上記したような種々の
動物細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション
（ＡＴＣＣ）等から容易に入手可能であり、また市販さ
れていて理化学研究所・細胞開発銀行等から購入するこ
とができる。
スター卵巣由来のＣＨＯ細胞が好ましく、ジヒドロ葉酸
還元酵素欠損ＣＨＯ細胞（DHFR-細胞）がより好まし
い。また、上記の動物細胞は通常蛋白合成阻害剤に感受
性であるが、これは該阻害剤を含む培地で細胞を培養す
ることにより容易に確認できる。上記したような種々の
動物細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション
（ＡＴＣＣ）等から容易に入手可能であり、また市販さ
れていて理化学研究所・細胞開発銀行等から購入するこ
とができる。
【００４５】＜動物細胞への形質導入とCYH耐性形質導
入株の選択＞本発明は、前述したような本発明発現ベク
ターを含む形質転換動物細胞、および、該形質転換動物
細胞を培養し、蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子（代表的に
はシクロヘキシミド耐性遺伝子）を選択マーカーとして
細胞株を選択することを特徴とする蛋白質合成阻害剤耐
性動物細胞株の選択方法、にも関する。代表例における
CYH耐性遺伝子を含んだ本発明発現ベクターDNAの動物細
胞への導入法としては、リン酸カルシウム沈澱法（Ｇra
ham, van der Ｅb,Ｖirology,52：456、1973）の他、マ
イクロインジェクション法（Capecchi, MR, Cell, 22：
479，1980）、エレクトロポレーション法（Zimmermann,
U., Biochim. Biophys. Acta、694:227、1982）、リ
ポソーム法（Mannino, R.J., Gould-Fogerite,S., Bio
Techniques 6:682 1988）など公知の任意の方法を用い
ることができる。いずれの方法で形質導入実験を行った
場合においても、形質導入株の選択は、プラスミドDNA
を動物細胞に形質導入後、通常1‐3日後に培地をCYHを
含む培地に交換して行えば良い。例えば、CHO細胞を宿
主細胞としてリポソーム法によリ、形質導入を行う場合
は、通常次のような操作を行なう。まず、1μｇのプラ
スミドと6μｌのLipofectamine試薬（Gibco BRL, 18324
-012）を混合し、30分間室温で放置した後に、5×105の
ＣＨＯ細胞に対して加える。16時間後に培地を交換して
24時間培養を行った後に細胞を回収する。回収した細胞
を希釈して10cm径dishに再播種してから24時間培養した
後、3μg/mlから10μg/mlの濃度のCYHを含んだ培地に交
換して2〜3週間培養を継続することによってCYH耐性の
形質導入株を選択することができる。
入株の選択＞本発明は、前述したような本発明発現ベク
ターを含む形質転換動物細胞、および、該形質転換動物
細胞を培養し、蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子（代表的に
はシクロヘキシミド耐性遺伝子）を選択マーカーとして
細胞株を選択することを特徴とする蛋白質合成阻害剤耐
性動物細胞株の選択方法、にも関する。代表例における
CYH耐性遺伝子を含んだ本発明発現ベクターDNAの動物細
胞への導入法としては、リン酸カルシウム沈澱法（Ｇra
ham, van der Ｅb,Ｖirology,52：456、1973）の他、マ
イクロインジェクション法（Capecchi, MR, Cell, 22：
479，1980）、エレクトロポレーション法（Zimmermann,
U., Biochim. Biophys. Acta、694:227、1982）、リ
ポソーム法（Mannino, R.J., Gould-Fogerite,S., Bio
Techniques 6:682 1988）など公知の任意の方法を用い
ることができる。いずれの方法で形質導入実験を行った
場合においても、形質導入株の選択は、プラスミドDNA
を動物細胞に形質導入後、通常1‐3日後に培地をCYHを
含む培地に交換して行えば良い。例えば、CHO細胞を宿
主細胞としてリポソーム法によリ、形質導入を行う場合
は、通常次のような操作を行なう。まず、1μｇのプラ
スミドと6μｌのLipofectamine試薬（Gibco BRL, 18324
-012）を混合し、30分間室温で放置した後に、5×105の
ＣＨＯ細胞に対して加える。16時間後に培地を交換して
24時間培養を行った後に細胞を回収する。回収した細胞
を希釈して10cm径dishに再播種してから24時間培養した
後、3μg/mlから10μg/mlの濃度のCYHを含んだ培地に交
換して2〜3週間培養を継続することによってCYH耐性の
形質導入株を選択することができる。
【００４６】ＣＹＨ耐性の形質導入株を非形質導入株か
ら迅速に分離するために、以下の方法を用いることがで
きる。すなわち、形質導入操作後に回収した細胞は希釈
した後、24穴プレート等に播種して培養を行う。ＣＹＨ
を添加した培地に交換して約1週間培養を行った後に、
トリプシン処理により一旦細胞を回収し、再び24穴プレ
ート等に播種してさらに1週間培養を継続する。この回
収＋再播種操作を加えることによって、プレート表面に
付着した非形質導入細胞を除去して形質導入株だけを回
収することが可能になり、安定遺伝子導入株の単離時間
を短縮することが可能である。
ら迅速に分離するために、以下の方法を用いることがで
きる。すなわち、形質導入操作後に回収した細胞は希釈
した後、24穴プレート等に播種して培養を行う。ＣＹＨ
を添加した培地に交換して約1週間培養を行った後に、
トリプシン処理により一旦細胞を回収し、再び24穴プレ
ート等に播種してさらに1週間培養を継続する。この回
収＋再播種操作を加えることによって、プレート表面に
付着した非形質導入細胞を除去して形質導入株だけを回
収することが可能になり、安定遺伝子導入株の単離時間
を短縮することが可能である。
【００４７】本発明は、上記のような本発明形質転換細
胞を培養し、発現された外来蛋白質を培養物から採取す
ることを特徴とする蛋白質の生産方法にも関する。形質
転換体動物細胞の培養は公知の方法で行うことができ、
例えば後記実施例に記載のモレキュラークローニング、
カレントプロトコール等を参照することができる。培地
としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭ
ＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などが
使用できる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養
は通常約３０℃〜４０℃で5%CO２存在下にて約１５〜６
０時間行い、培地を数日ごとに交換しながら培養を継続
することができる。細胞がコンフルエントになるまで増
殖したら、通常0.25%程度のトリプシンPBS溶液を用いて
ここの細胞に分散させ、数倍に希釈して新しい培養容器
に播種し培養を続け、目的とする量まで細胞が増殖した
ら集める。このように継代培養を行うことにより培養ス
ケールを任意のスケールにまで拡大できる。
胞を培養し、発現された外来蛋白質を培養物から採取す
ることを特徴とする蛋白質の生産方法にも関する。形質
転換体動物細胞の培養は公知の方法で行うことができ、
例えば後記実施例に記載のモレキュラークローニング、
カレントプロトコール等を参照することができる。培地
としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭ
ＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などが
使用できる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養
は通常約３０℃〜４０℃で5%CO２存在下にて約１５〜６
０時間行い、培地を数日ごとに交換しながら培養を継続
することができる。細胞がコンフルエントになるまで増
殖したら、通常0.25%程度のトリプシンPBS溶液を用いて
ここの細胞に分散させ、数倍に希釈して新しい培養容器
に播種し培養を続け、目的とする量まで細胞が増殖した
ら集める。このように継代培養を行うことにより培養ス
ケールを任意のスケールにまで拡大できる。
【００４８】導入した遺伝子の発現は、例えば細胞から
回収したRNAを用いたノザン解析やRT-PCRなどの解析、
発現した蛋白質の抗体を用いたELISA解析やウエスタン
解析、蛋白質が酵素である場合には培地中や細胞内の活
性を検出するなどの方法によって確認することができ
る。発現させる外来遺伝子がGFPである場合は、回収し
た細胞をフローサイトメトリーで解析することによりそ
の発現量の解析を行うことができる。GFPの発現量とFAC
S解析で得られる蛍光強度には非常に高い相関があるた
め、蛍光強度をGFP発現量と考えることができる。発現
させる外来遺伝子がアルカリフォスファターゼ遺伝子と
βガラクトシダーゼ遺伝子の場合は、それぞれの酵素活
性を測定することにより、発現量の解析が可能である。
回収したRNAを用いたノザン解析やRT-PCRなどの解析、
発現した蛋白質の抗体を用いたELISA解析やウエスタン
解析、蛋白質が酵素である場合には培地中や細胞内の活
性を検出するなどの方法によって確認することができ
る。発現させる外来遺伝子がGFPである場合は、回収し
た細胞をフローサイトメトリーで解析することによりそ
の発現量の解析を行うことができる。GFPの発現量とFAC
S解析で得られる蛍光強度には非常に高い相関があるた
め、蛍光強度をGFP発現量と考えることができる。発現
させる外来遺伝子がアルカリフォスファターゼ遺伝子と
βガラクトシダーゼ遺伝子の場合は、それぞれの酵素活
性を測定することにより、発現量の解析が可能である。
【００４９】所望の外来蛋白質は培養物（培地および細
胞を含む）から、好ましくは分泌ポリペプチドとして培
地から回収するが、分泌シグナル配列なしに直接発現し
た場合には宿主細胞溶解物からも回収し得る。所望の蛋
白質が、ヒト起源のもの以外の組換え細胞において発現
した場合、目的の生成物はヒト起源の他のタンパク質ま
たはポリペプチドを全く含まない。しかしながら、目的
の生成物を組換え細胞に由来する他のタンパク質または
ポリペプチドから精製し、目的の発現物に関して実質的
に均一な生成物を得ることが望ましい。そのための第一
段階として、通常培地（細胞を含む）または細胞溶解物
を遠心分離し、細胞または細胞破片を除去する。その後
目的の生成物を、混入した他のタンパク質およびポリペ
プチドから蛋白分離精製手段、例えば免疫アフィニティ
ーまたはイオン交換カラム等による分別；エタノール沈
澱；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥ等のカチオン
交換樹脂によるクロマトグラフィー、例えばセファデッ
クスＧ−７５を用いるゲル電気泳動；ＩgＧ等の混入物
を除去するため目的の生産物を結合するプラスミノーゲ
ンカラム、およびプロテインＡセファローズカラムによ
るクロマトグラフィー等により精製する。これらの方法
については、例えばGuide to Protein Purification Me
thods in Enzymology, vol.182, Deutscher編、Academi
c Press等を参照することができる。上述のような本発
明方法により、シクロヘキシミド耐性細胞株を効率的に
選択し、高発現した所望の外来遺伝子の発現産物を精製
物として得ることができる。
胞を含む）から、好ましくは分泌ポリペプチドとして培
地から回収するが、分泌シグナル配列なしに直接発現し
た場合には宿主細胞溶解物からも回収し得る。所望の蛋
白質が、ヒト起源のもの以外の組換え細胞において発現
した場合、目的の生成物はヒト起源の他のタンパク質ま
たはポリペプチドを全く含まない。しかしながら、目的
の生成物を組換え細胞に由来する他のタンパク質または
ポリペプチドから精製し、目的の発現物に関して実質的
に均一な生成物を得ることが望ましい。そのための第一
段階として、通常培地（細胞を含む）または細胞溶解物
を遠心分離し、細胞または細胞破片を除去する。その後
目的の生成物を、混入した他のタンパク質およびポリペ
プチドから蛋白分離精製手段、例えば免疫アフィニティ
ーまたはイオン交換カラム等による分別；エタノール沈
澱；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはＤＥＡＥ等のカチオン
交換樹脂によるクロマトグラフィー、例えばセファデッ
クスＧ−７５を用いるゲル電気泳動；ＩgＧ等の混入物
を除去するため目的の生産物を結合するプラスミノーゲ
ンカラム、およびプロテインＡセファローズカラムによ
るクロマトグラフィー等により精製する。これらの方法
については、例えばGuide to Protein Purification Me
thods in Enzymology, vol.182, Deutscher編、Academi
c Press等を参照することができる。上述のような本発
明方法により、シクロヘキシミド耐性細胞株を効率的に
選択し、高発現した所望の外来遺伝子の発現産物を精製
物として得ることができる。
【００５０】
【実施例】以下は、実施例によって本発明を更に具体的
に説明するためのものであり、本発明の範囲を制限する
ものではない。以降に記述するクローニング等、遺伝子
組換えに関する各種実験技術については、J.Sambrook,
E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング
第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory）発行、１９８９年及びFrederick M. Au
subelら編、Current Protocols発行、Current Protocol
s in Molecular Biology等に記載の遺伝子工学的方法に
準じて行った。
に説明するためのものであり、本発明の範囲を制限する
ものではない。以降に記述するクローニング等、遺伝子
組換えに関する各種実験技術については、J.Sambrook,
E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング
第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory）発行、１９８９年及びFrederick M. Au
subelら編、Current Protocols発行、Current Protocol
s in Molecular Biology等に記載の遺伝子工学的方法に
準じて行った。
【００５１】［実施例１］ヒトL36a遺伝子のクローニン
グ 公的なDNAデータベースを検索することにより、酵母L41
遺伝子と相同なヒトの遺伝子がL36a遺伝子(GI 4506651)
であることを確認した。Candida utilisのL41とL36aの
アミノ酸配列の相同性は図１に示した。L41とL36aの両
方に共通の配列を持つオリゴヌクレオチドHL36G1（5’-
AGA AGT GTG GCA AGC ATC AG-3’ 配列番号３）を化学
合成して、プローブとして用いた。Gene trapper cDNA
Positive Selection System (Gibco BRL, Cat. No. 10
356-020)を用いて、ヒト胎児脳由来のcDNAライブラリー
（Superscript Human Fetal Brain cDNA Library, Life
Technologies, Cat. No. 10662-013）からL36a遺伝子
のcDNAをクローニングした。クローニング操作は添付の
マニュアルに従った。具体的には動物細胞発現用ベクタ
ーpCMV・SPORTのNotI-SalI部位にｃDNAが組み込まれた二
本鎖DNAライブラリーを一本鎖構造に変成させ、ビオチ
ンラベルを施したHL36G1とハイブリッドを形成させた。
ハイブリッド形成後、ストレプトアビジンでコートされ
た磁気ビーズに吸着させることにより、L36aｃDNAクロ
ーンの濃縮を行った。濃縮後非ラベルHL36G1をプライマ
ーとして用いてDNAを二本鎖に再変換し、これを用いて
キットに添付する大腸菌Ultramaxの形質転換を行った。
得られた形質転換体のうち40個のクローンからプラスミ
ドDNAを定法により抽出し、L36aが含まれるクローンの
選抜を行った。この選抜はＰＣＲにより行った。PCR は
Ex Taq ポリメラーゼ（宝酒造社）を用いたPCR（（94℃
で30秒、55℃で1分、72℃で2分）×25サイクル）の条件
で行なった。用いたプライマーは、フォワードプライマ
ーとしてHL36G1、リバースプライマーとしては5’-CTC
CTC CCA GTT CAA AAT GC-3’ (HL36RT1、配列番号４)を
用いた。その結果、40クローン中14クローンにL36a遺伝
子が含まれていることが確認された。これらのプラスミ
ドからｃDNA断片を制限酵素NotI及びSalIで切り出し、
その断片の長さをアガロースゲル電気泳動によって確認
した。さらにこれらのクローンの中から、インサートDN
A断片の長さが長い6クローンについて塩基配列の確認を
行った結果、いずれのクローンもL36a遺伝子の318塩基
からなるORFの全長を含んでいることが明らかにされ
た。
グ 公的なDNAデータベースを検索することにより、酵母L41
遺伝子と相同なヒトの遺伝子がL36a遺伝子(GI 4506651)
であることを確認した。Candida utilisのL41とL36aの
アミノ酸配列の相同性は図１に示した。L41とL36aの両
方に共通の配列を持つオリゴヌクレオチドHL36G1（5’-
AGA AGT GTG GCA AGC ATC AG-3’ 配列番号３）を化学
合成して、プローブとして用いた。Gene trapper cDNA
Positive Selection System (Gibco BRL, Cat. No. 10
356-020)を用いて、ヒト胎児脳由来のcDNAライブラリー
（Superscript Human Fetal Brain cDNA Library, Life
Technologies, Cat. No. 10662-013）からL36a遺伝子
のcDNAをクローニングした。クローニング操作は添付の
マニュアルに従った。具体的には動物細胞発現用ベクタ
ーpCMV・SPORTのNotI-SalI部位にｃDNAが組み込まれた二
本鎖DNAライブラリーを一本鎖構造に変成させ、ビオチ
ンラベルを施したHL36G1とハイブリッドを形成させた。
ハイブリッド形成後、ストレプトアビジンでコートされ
た磁気ビーズに吸着させることにより、L36aｃDNAクロ
ーンの濃縮を行った。濃縮後非ラベルHL36G1をプライマ
ーとして用いてDNAを二本鎖に再変換し、これを用いて
キットに添付する大腸菌Ultramaxの形質転換を行った。
得られた形質転換体のうち40個のクローンからプラスミ
ドDNAを定法により抽出し、L36aが含まれるクローンの
選抜を行った。この選抜はＰＣＲにより行った。PCR は
Ex Taq ポリメラーゼ（宝酒造社）を用いたPCR（（94℃
で30秒、55℃で1分、72℃で2分）×25サイクル）の条件
で行なった。用いたプライマーは、フォワードプライマ
ーとしてHL36G1、リバースプライマーとしては5’-CTC
CTC CCA GTT CAA AAT GC-3’ (HL36RT1、配列番号４)を
用いた。その結果、40クローン中14クローンにL36a遺伝
子が含まれていることが確認された。これらのプラスミ
ドからｃDNA断片を制限酵素NotI及びSalIで切り出し、
その断片の長さをアガロースゲル電気泳動によって確認
した。さらにこれらのクローンの中から、インサートDN
A断片の長さが長い6クローンについて塩基配列の確認を
行った結果、いずれのクローンもL36a遺伝子の318塩基
からなるORFの全長を含んでいることが明らかにされ
た。
【００５２】［実施例２］シクロヘキシミド耐性遺伝子
の構築と機能の確認 実施例１で得られたヒトL36a遺伝子にCYH耐性を付与す
るため、54番目のアミノ酸であるプロリンがグルタミン
になる様な変異の導入を行った。具体的にはORFの167番
目の塩基CをAに変換するために、図２に示す様に4本の
プライマーを化学合成してこれを使用し、3回のPCRを行
った。具体的には、最初にフォワードプライマー１
（5’-GGG TCT AGA ATG GTC AAC GTA CCT AAA AC-3’
配列番号５）とリバースプライマー３（5’-CCG GAA AA
T TTG CTT TGT CTG CCC A-3’ 配列番号６）の組み合
わせ、及びフォワードプライマー４（5’-GGG CAG ACA
AAG CAA ATT TTC CGG-3’ 配列番号７）とリバースプ
ライマー２（5’-GGG TCT AGA TTA GAA CTG GAT CAC TT
G GC-3’ 配列番号８）の組み合わせでL36a遺伝子を鋳
型に用いてPCRを行った。PCR はEx Taq ポリメラーゼ
（宝酒造社）を用いたPCR（（94℃で30秒、55℃で1分、
72℃で2分）×25サイクル）の条件で行なった。得られ
た2種類のPCR産物をHigh Pure PCR Product Purificati
on Kit (Roche社, 1-732-668)を用いて精製した後、こ
れらの混合物を鋳型として、フォワードプライマー１と
リバースプライマー２を用いてPCR（（94℃で30秒、55
℃で1分、72℃で2分）×25サイクル）を行う事により、
両端に制限酵素XbaI認識部位が付加されたCYH耐性のL36
a遺伝子（L36a-CYHR）を得た（配列番号１及び図3）。
増幅された約0.3 kbのDNA断片は、XbaIで切断した後、p
UC18のXbaI部位にクローニングした。ダイターミネータ
ーサイクルシーケンスキット（パーキンエルマー社）を
用いて増幅DNA断片の塩基配列を決定し、得られた遺伝
子の塩基配列を確認した後、L36a-CYHR断片を含むXbaI
断片を動物細胞発現用ベクターpCI-neo（Promega,Cat.
No. E1841）のCMV初期遺伝子プロモーター領域の下流に
あるXbaI部位に挿入し、プラスミドpCI-neo-L36を得
た。構築したL36a-CYHR遺伝子が動物細胞にシクロヘキ
シミド耐性を付与するかどうかを確認するために、チャ
イニーズハムスター由来CHO（DHFR-）細胞（ATCC,CRL-9
096、以下“CHO細胞”と呼ぶ）への形質導入実験を行っ
た。具体的には、分泌性アルカリフォスファターゼSEAP
を含むプラスミドpSEAP2-control（Clontech社, 6052-
1）0.1μｇと共にプラスミドpCI-neo-L36あるいはpCI-n
eo、1μｇをCHO細胞に共形質導入した。形質導入実験
は、実施例４記載の方法に従い、24穴プレートに播種し
て一晩培養した1×105のCHO細胞へ導入した。24時間培
養後に細胞を培地で２回洗浄後、CYHを０,１０mg/mlの
濃度で含む培地に交換して４時間後と８時間後に上清の
一部を回収し、SEAP活性を測定した。４時間後の活性を
１とした場合の８時間後の活性は、pCI-neo-L36では、
2.17（CYH ０mg/ml）、1.44（CYH 10mg/ml）であり、
pCI-neoでは、2.15（CYH ０mg/ml）、1.09（CYH 10mg
/ml）であった(図4)。この結果から、pCI-neo-L36はCHO
細胞にCYH耐性を付与し、プラスミドが導入された細胞
はCYH存在下でも生存し、共導入されたプラスミド上の
レポーター遺伝子を発現することが明らかにされた。
の構築と機能の確認 実施例１で得られたヒトL36a遺伝子にCYH耐性を付与す
るため、54番目のアミノ酸であるプロリンがグルタミン
になる様な変異の導入を行った。具体的にはORFの167番
目の塩基CをAに変換するために、図２に示す様に4本の
プライマーを化学合成してこれを使用し、3回のPCRを行
った。具体的には、最初にフォワードプライマー１
（5’-GGG TCT AGA ATG GTC AAC GTA CCT AAA AC-3’
配列番号５）とリバースプライマー３（5’-CCG GAA AA
T TTG CTT TGT CTG CCC A-3’ 配列番号６）の組み合
わせ、及びフォワードプライマー４（5’-GGG CAG ACA
AAG CAA ATT TTC CGG-3’ 配列番号７）とリバースプ
ライマー２（5’-GGG TCT AGA TTA GAA CTG GAT CAC TT
G GC-3’ 配列番号８）の組み合わせでL36a遺伝子を鋳
型に用いてPCRを行った。PCR はEx Taq ポリメラーゼ
（宝酒造社）を用いたPCR（（94℃で30秒、55℃で1分、
72℃で2分）×25サイクル）の条件で行なった。得られ
た2種類のPCR産物をHigh Pure PCR Product Purificati
on Kit (Roche社, 1-732-668)を用いて精製した後、こ
れらの混合物を鋳型として、フォワードプライマー１と
リバースプライマー２を用いてPCR（（94℃で30秒、55
℃で1分、72℃で2分）×25サイクル）を行う事により、
両端に制限酵素XbaI認識部位が付加されたCYH耐性のL36
a遺伝子（L36a-CYHR）を得た（配列番号１及び図3）。
増幅された約0.3 kbのDNA断片は、XbaIで切断した後、p
UC18のXbaI部位にクローニングした。ダイターミネータ
ーサイクルシーケンスキット（パーキンエルマー社）を
用いて増幅DNA断片の塩基配列を決定し、得られた遺伝
子の塩基配列を確認した後、L36a-CYHR断片を含むXbaI
断片を動物細胞発現用ベクターpCI-neo（Promega,Cat.
No. E1841）のCMV初期遺伝子プロモーター領域の下流に
あるXbaI部位に挿入し、プラスミドpCI-neo-L36を得
た。構築したL36a-CYHR遺伝子が動物細胞にシクロヘキ
シミド耐性を付与するかどうかを確認するために、チャ
イニーズハムスター由来CHO（DHFR-）細胞（ATCC,CRL-9
096、以下“CHO細胞”と呼ぶ）への形質導入実験を行っ
た。具体的には、分泌性アルカリフォスファターゼSEAP
を含むプラスミドpSEAP2-control（Clontech社, 6052-
1）0.1μｇと共にプラスミドpCI-neo-L36あるいはpCI-n
eo、1μｇをCHO細胞に共形質導入した。形質導入実験
は、実施例４記載の方法に従い、24穴プレートに播種し
て一晩培養した1×105のCHO細胞へ導入した。24時間培
養後に細胞を培地で２回洗浄後、CYHを０,１０mg/mlの
濃度で含む培地に交換して４時間後と８時間後に上清の
一部を回収し、SEAP活性を測定した。４時間後の活性を
１とした場合の８時間後の活性は、pCI-neo-L36では、
2.17（CYH ０mg/ml）、1.44（CYH 10mg/ml）であり、
pCI-neoでは、2.15（CYH ０mg/ml）、1.09（CYH 10mg
/ml）であった(図4)。この結果から、pCI-neo-L36はCHO
細胞にCYH耐性を付与し、プラスミドが導入された細胞
はCYH存在下でも生存し、共導入されたプラスミド上の
レポーター遺伝子を発現することが明らかにされた。
【００５３】［実施例３］発現プラスミドの構築 ３種類のレポーター遺伝子をそれぞれpCI-neo-L36のBam
HI部位に、neo遺伝子とは反対方向に導入することによ
り、L36a-CYHRを含む発現ベクターの構築を行った。レ
ポーター遺伝子としては、細胞内に蓄積されるレポータ
ーで、半減期の短い緑色蛍光蛋白質であるd2EGFP (pd2E
GFP-N1由来、Clontech社, 6009-1)及びβガラクトシダ
ーゼ（b-galactosidase; lacZ）遺伝子（pCH110由来、P
harmacia社, 27-4508-01）、及び細胞外に分泌されるア
ルカリフォスファターゼであるSEAP（pSEAP2-control由
来、Clontech社, 6052-1）を使用した。３種類それぞれ
のレポーター遺伝子を導入した発現ベクターの構造は図
５に示したが、それぞれpL36a-neo-GFP、pL36a-neo-lac
Z、pL36a-neo-SEAPと名づけた。L36a-CYHRを含まない事
を除いてpL36a-neo-lacZ、pL36a-neo-SEAPと同じ構造の
ベクターpNeo-SEAP及びpNeo-lacZを対照実験用に構築し
た。これらのプラスミドは次のように構築した。プラス
ミドpd2EGFP-N1をBglIIとBamHIで分解した後、セルフラ
イゲーションすることによりプロモーターとd2EGFP遺伝
子間のマルチクローニング部位を除去した。続いて、こ
のプラスミドをPshBIとAflIIで分解して、CMV初期遺伝
子プロモーター＋d2EGFP遺伝子＋SV40由来ポリA付加シ
グナルを含む1.7kbのDNA断片を切りだした。このフラグ
メントDNAをKlenow酵素により平滑末端とした後、BamHI
リンカー（5’-CCCGGATCCGGG-3’ 宝酒造、4810P）を
付加してからさらにBamHIで分解した後、pCI-neo-L36
のBamHI部位に挿入してpL36a-neo-GFPを構築した。プラ
スミドpCH110は、NcoIで分解してKlenow酵素により平滑
末端とした後、BamHIリンカーを付加した。さらにBamHI
で分解することにより、SV40初期遺伝子プロモーター＋
lacZ遺伝子＋SV40由来ポリA付加シグナルを含む3.9kbの
DNA断片を切りだし、pCI-neo-L36 のBamHI部位に挿入し
てpL36a-neo-lacZを、pCI-neoのBamHI部位に挿入してpN
eo-lacZを構築した。プラスミドpSEAP2-controlは、Sal
Iで分解してKlenow酵素により平滑末端とした後、BglII
リンカー（5’-CAGATCTG-3’ 宝酒造、4621P）を付加
した。さらにBglII とBamHIで分解することにより、SV4
0初期遺伝子プロモーター＋SEAP遺伝子＋SV40由来ポリA
付加シグナル＋SV40由来のエンハンサー配列を含む2.3k
bのDNA断片を切りだし、pCI-neo-L36 のBamHI部位に挿
入してpL36a-neo-SEAPを、pCI-neoのBamHI部位に挿入し
てpNeo-SEAPを構築した。
HI部位に、neo遺伝子とは反対方向に導入することによ
り、L36a-CYHRを含む発現ベクターの構築を行った。レ
ポーター遺伝子としては、細胞内に蓄積されるレポータ
ーで、半減期の短い緑色蛍光蛋白質であるd2EGFP (pd2E
GFP-N1由来、Clontech社, 6009-1)及びβガラクトシダ
ーゼ（b-galactosidase; lacZ）遺伝子（pCH110由来、P
harmacia社, 27-4508-01）、及び細胞外に分泌されるア
ルカリフォスファターゼであるSEAP（pSEAP2-control由
来、Clontech社, 6052-1）を使用した。３種類それぞれ
のレポーター遺伝子を導入した発現ベクターの構造は図
５に示したが、それぞれpL36a-neo-GFP、pL36a-neo-lac
Z、pL36a-neo-SEAPと名づけた。L36a-CYHRを含まない事
を除いてpL36a-neo-lacZ、pL36a-neo-SEAPと同じ構造の
ベクターpNeo-SEAP及びpNeo-lacZを対照実験用に構築し
た。これらのプラスミドは次のように構築した。プラス
ミドpd2EGFP-N1をBglIIとBamHIで分解した後、セルフラ
イゲーションすることによりプロモーターとd2EGFP遺伝
子間のマルチクローニング部位を除去した。続いて、こ
のプラスミドをPshBIとAflIIで分解して、CMV初期遺伝
子プロモーター＋d2EGFP遺伝子＋SV40由来ポリA付加シ
グナルを含む1.7kbのDNA断片を切りだした。このフラグ
メントDNAをKlenow酵素により平滑末端とした後、BamHI
リンカー（5’-CCCGGATCCGGG-3’ 宝酒造、4810P）を
付加してからさらにBamHIで分解した後、pCI-neo-L36
のBamHI部位に挿入してpL36a-neo-GFPを構築した。プラ
スミドpCH110は、NcoIで分解してKlenow酵素により平滑
末端とした後、BamHIリンカーを付加した。さらにBamHI
で分解することにより、SV40初期遺伝子プロモーター＋
lacZ遺伝子＋SV40由来ポリA付加シグナルを含む3.9kbの
DNA断片を切りだし、pCI-neo-L36 のBamHI部位に挿入し
てpL36a-neo-lacZを、pCI-neoのBamHI部位に挿入してpN
eo-lacZを構築した。プラスミドpSEAP2-controlは、Sal
Iで分解してKlenow酵素により平滑末端とした後、BglII
リンカー（5’-CAGATCTG-3’ 宝酒造、4621P）を付加
した。さらにBglII とBamHIで分解することにより、SV4
0初期遺伝子プロモーター＋SEAP遺伝子＋SV40由来ポリA
付加シグナル＋SV40由来のエンハンサー配列を含む2.3k
bのDNA断片を切りだし、pCI-neo-L36 のBamHI部位に挿
入してpL36a-neo-SEAPを、pCI-neoのBamHI部位に挿入し
てpNeo-SEAPを構築した。
【００５４】［実施例４］細胞培養と形質導入実験 CHO細胞培養には抗生物質（Penicillin-Streptomycin,
Gibco BRL, 15070-089）を加えたa-MEM（Gibco BRL, 12
571-063）に終濃度10％でウシ胎仔血清(FCS; Gibco BR
L, 26140-087)を添加して、継代用培地として使用し
た。形質導入実験に用いるCHO細胞は、5×105の密度で1
0cm径の付着細胞培養用dishに播種して培養を行い3日後
に回収した。これを6cm径のdishに5×105播種し24時間
後にリポフェクション法により、トランスフェクション
を行った。具体的には、1μｇのプラスミドと6μｌのLi
pofectamine試薬（Gibco BRL, 18324-012）を混合し、3
0分間室温で放置した後に、抗生物質及び血清未添加の
培地に交換した細胞に滴下した。16時間後に継代用培地
に交換し、さらに24時間培養を行った後細胞を回収し、
CYH耐性マーカー、対照のneoマーカーそれぞれに適する
ように形質導入細胞を選択した。CYH耐性で形質導入株
を選択する場合は、回収した細胞をCYH未添加培地で4倍
に希釈して10cm径dishに再播種した。24時間経過後に培
地をCYH含有（3mg/ml）培地に交換し、さらに2〜3週間
培養を継続した。生成したCYH耐性コロニーを、クロー
ニングリングを使用して単離し、24穴プレートに再播種
後CYH未添加培地で24時間培養した。その後CYH添加培地
に交換して細胞を培養した。また、CYH耐性形質導入株
の単離は、形質導入実験後に、細胞を希釈して24穴プレ
ートに播種することにより、耐性株を単離することが可
能であった。すなわち、回収した細胞を約１０枚の２４
穴プレートに播種してCYH存在下で培養した。CYH感受性
細胞を除去するために培養1週間目で細胞を回収し、再
び24穴プレートに播種してさらに1週間培養することに
より、迅速にCYH耐性株を単離することができた。G418
耐性で形質導入株を選択する場合は、トランスフェクシ
ョン後に回収した細胞をG418（1mg/ml、Gibco BRL, 118
11-049）含有培地で50倍に希釈して、10cm径dishに再播
種を行った。コロニーが生成するまで１〜２週間培養を
行い、上記と同様に単一コロニーをクローニングリング
を使用して単離して24穴プレートに再播種し、G418含有
培地で培養を行った。また、CYH耐性株と同様に、希釈
法によっても耐性株を単離することが可能であった。G4
18耐性では96穴プレートに播種してG418含有培地で１〜
２週間培養を行ってG418耐性株を単離した。
Gibco BRL, 15070-089）を加えたa-MEM（Gibco BRL, 12
571-063）に終濃度10％でウシ胎仔血清(FCS; Gibco BR
L, 26140-087)を添加して、継代用培地として使用し
た。形質導入実験に用いるCHO細胞は、5×105の密度で1
0cm径の付着細胞培養用dishに播種して培養を行い3日後
に回収した。これを6cm径のdishに5×105播種し24時間
後にリポフェクション法により、トランスフェクション
を行った。具体的には、1μｇのプラスミドと6μｌのLi
pofectamine試薬（Gibco BRL, 18324-012）を混合し、3
0分間室温で放置した後に、抗生物質及び血清未添加の
培地に交換した細胞に滴下した。16時間後に継代用培地
に交換し、さらに24時間培養を行った後細胞を回収し、
CYH耐性マーカー、対照のneoマーカーそれぞれに適する
ように形質導入細胞を選択した。CYH耐性で形質導入株
を選択する場合は、回収した細胞をCYH未添加培地で4倍
に希釈して10cm径dishに再播種した。24時間経過後に培
地をCYH含有（3mg/ml）培地に交換し、さらに2〜3週間
培養を継続した。生成したCYH耐性コロニーを、クロー
ニングリングを使用して単離し、24穴プレートに再播種
後CYH未添加培地で24時間培養した。その後CYH添加培地
に交換して細胞を培養した。また、CYH耐性形質導入株
の単離は、形質導入実験後に、細胞を希釈して24穴プレ
ートに播種することにより、耐性株を単離することが可
能であった。すなわち、回収した細胞を約１０枚の２４
穴プレートに播種してCYH存在下で培養した。CYH感受性
細胞を除去するために培養1週間目で細胞を回収し、再
び24穴プレートに播種してさらに1週間培養することに
より、迅速にCYH耐性株を単離することができた。G418
耐性で形質導入株を選択する場合は、トランスフェクシ
ョン後に回収した細胞をG418（1mg/ml、Gibco BRL, 118
11-049）含有培地で50倍に希釈して、10cm径dishに再播
種を行った。コロニーが生成するまで１〜２週間培養を
行い、上記と同様に単一コロニーをクローニングリング
を使用して単離して24穴プレートに再播種し、G418含有
培地で培養を行った。また、CYH耐性株と同様に、希釈
法によっても耐性株を単離することが可能であった。G4
18耐性では96穴プレートに播種してG418含有培地で１〜
２週間培養を行ってG418耐性株を単離した。
【００５５】［実施例５］GFP遺伝子発現の比較 形質導入株はクローニングリングを用いて単離した。CY
H選択の場合、形質導入株を24穴プレートに再播種してC
YH未添加で24時間培養した後CYH添加培地に交換して1週
間培養後、トリプシン処理を行い細胞を回収した。G418
選択の場合は24穴プレートに再播種してG418含有培地で
１週間培養を行った後に細胞を回収した。回収した細胞
は、それぞれ0.5％FCS及びPropidium iodide (PI; Phar
mingen, 66211E)を添加したPBSを用いて105〜107 cells
/mlの細胞懸濁液に調製し、その計数及びGFP発現量の解
析をフローサイトメトリー（FACS; FACScan, BecktonDi
ckinson）を用いて行った。GFPの発現量とFACS解析で得
られる蛍光強度には非常に高い相関があるため、蛍光強
度をGFP発現量と考えることが出来る（Meng, Y. G., 20
00, Subramanian & Srienc, 1996）。具体的には、5×1
04の細胞を測定し、細胞数とGFP由来蛍光強度の分布に
関するヒストグラムを図６に示すように作成する。蛍光
強度の弱い順にM1~M4の4つの領域に分布を分け、M1の領
域に含まれる細胞をGFP未発現細胞の集団、M3及びM4に
含まれる細胞集団をGFP発現陽性の集団とする。蛍光強
度が強すぎると測定レンジを越えてしまうため、結果と
して高発現株の細胞数が低く計数されてしまうことにな
る。これを避けるため、GFP発現量は式１を用いて算出
した細胞数の割合で示した。 （式１）：GFP陽性細胞の割合=（M3-M4領域に含まれる
細胞数）/（M1-M4領域に含まれる細胞数） CYH耐性株については44クローン、及び対照としてpd2EG
FP-N1を導入して得たG418耐性株46クローンについて解
析を行った結果、図７に示した様に、無作為に選んだCY
H耐性株の43％が解析した全てのG418耐性株よりもGFPを
高発現していた。CYH耐性株の方がG418耐性株よりもGFP
遺伝子高発現株が効率良く取れることが確認された。CH
O細胞にpL36-neo-GFPを導入しG418添加培地で選択培養
を行った場合は、pd2EGFP-N1を導入して得られた結果と
同様であったことから、確認されたGFP遺伝子高発現株
取得の高効率化はL36a-CYHR遺伝子とCYHによる選択培養
で特異的に得られる効果であると考えられる（データ示
さず）。
H選択の場合、形質導入株を24穴プレートに再播種してC
YH未添加で24時間培養した後CYH添加培地に交換して1週
間培養後、トリプシン処理を行い細胞を回収した。G418
選択の場合は24穴プレートに再播種してG418含有培地で
１週間培養を行った後に細胞を回収した。回収した細胞
は、それぞれ0.5％FCS及びPropidium iodide (PI; Phar
mingen, 66211E)を添加したPBSを用いて105〜107 cells
/mlの細胞懸濁液に調製し、その計数及びGFP発現量の解
析をフローサイトメトリー（FACS; FACScan, BecktonDi
ckinson）を用いて行った。GFPの発現量とFACS解析で得
られる蛍光強度には非常に高い相関があるため、蛍光強
度をGFP発現量と考えることが出来る（Meng, Y. G., 20
00, Subramanian & Srienc, 1996）。具体的には、5×1
04の細胞を測定し、細胞数とGFP由来蛍光強度の分布に
関するヒストグラムを図６に示すように作成する。蛍光
強度の弱い順にM1~M4の4つの領域に分布を分け、M1の領
域に含まれる細胞をGFP未発現細胞の集団、M3及びM4に
含まれる細胞集団をGFP発現陽性の集団とする。蛍光強
度が強すぎると測定レンジを越えてしまうため、結果と
して高発現株の細胞数が低く計数されてしまうことにな
る。これを避けるため、GFP発現量は式１を用いて算出
した細胞数の割合で示した。 （式１）：GFP陽性細胞の割合=（M3-M4領域に含まれる
細胞数）/（M1-M4領域に含まれる細胞数） CYH耐性株については44クローン、及び対照としてpd2EG
FP-N1を導入して得たG418耐性株46クローンについて解
析を行った結果、図７に示した様に、無作為に選んだCY
H耐性株の43％が解析した全てのG418耐性株よりもGFPを
高発現していた。CYH耐性株の方がG418耐性株よりもGFP
遺伝子高発現株が効率良く取れることが確認された。CH
O細胞にpL36-neo-GFPを導入しG418添加培地で選択培養
を行った場合は、pd2EGFP-N1を導入して得られた結果と
同様であったことから、確認されたGFP遺伝子高発現株
取得の高効率化はL36a-CYHR遺伝子とCYHによる選択培養
で特異的に得られる効果であると考えられる（データ示
さず）。
【００５６】［実施例６］アルカリフォスファターゼ遺
伝子発現の比較 形質導入株は希釈法により単離した。pL36a-neo-SEAPを
細胞に導入してCYH耐性株を、pNeo-SEAPを細胞に導入し
てG418耐性株をそれぞれ50クローン単離し、それぞれ24
穴プレートで90％コンフルエントになるまで選択培地中
で培養を行い、SEAP発現量の解析を行った。SEAP発現量
の測定はすべて3連で以下のようにして行った。各クロ
ーンを培養し、2.5×104の細胞を96穴プレートに播種
後、薬剤を添加した選択培地200μｌ中で48時間培養し
た。各クローンはPBS(-)で洗浄後、細胞懸濁液の細胞濃
度はWST-1 cell proliferation reagent (Boehringer M
annheim, 1-644-807) により計数を行った。培養後の上
清は測定まで-80℃で保存した。SEAP酵素活性の測定はT
he Great Escape SEAP Chemiluminescence Detection K
it (Clontech社, K2041-1)を用いて行った。化学発光は
Dia-iatron社のCT-9000D plate luminometerを使用して
測定した。培地中に含まれるSEAP量は、キットに付属の
標準SEAPを使用して作成した検量線を用いて定量を行っ
た。各クローンのSEAP発現量は、以下の式２によって算
出した。 （式２）：SEAP発現量 (μg/106 cells/day)={培地中の
SEAP量（μg）}×106×(lnN-lnN0)/(N-N0)×2 (days) 各クローンのSEAP発現量を解析したところ、CYH耐性株
では全体の54％のクローンが５mg/106 cells/day以上の
発現量を示したのに対し、G418耐性株ではわずか8%のク
ローンしか同等の発現量を示さなかった。さらに、CYH
耐性株のうち20%が30mg/106 cells/day以上、6%が100mg
/106 cells/day以上の高発現を示すことが明らかにされ
た（図８）。以上より、SEAP遺伝子安定導入細胞株につ
いてもCYH耐性で選択した場合、高発現株を効率良く取
得できることが示された。
伝子発現の比較 形質導入株は希釈法により単離した。pL36a-neo-SEAPを
細胞に導入してCYH耐性株を、pNeo-SEAPを細胞に導入し
てG418耐性株をそれぞれ50クローン単離し、それぞれ24
穴プレートで90％コンフルエントになるまで選択培地中
で培養を行い、SEAP発現量の解析を行った。SEAP発現量
の測定はすべて3連で以下のようにして行った。各クロ
ーンを培養し、2.5×104の細胞を96穴プレートに播種
後、薬剤を添加した選択培地200μｌ中で48時間培養し
た。各クローンはPBS(-)で洗浄後、細胞懸濁液の細胞濃
度はWST-1 cell proliferation reagent (Boehringer M
annheim, 1-644-807) により計数を行った。培養後の上
清は測定まで-80℃で保存した。SEAP酵素活性の測定はT
he Great Escape SEAP Chemiluminescence Detection K
it (Clontech社, K2041-1)を用いて行った。化学発光は
Dia-iatron社のCT-9000D plate luminometerを使用して
測定した。培地中に含まれるSEAP量は、キットに付属の
標準SEAPを使用して作成した検量線を用いて定量を行っ
た。各クローンのSEAP発現量は、以下の式２によって算
出した。 （式２）：SEAP発現量 (μg/106 cells/day)={培地中の
SEAP量（μg）}×106×(lnN-lnN0)/(N-N0)×2 (days) 各クローンのSEAP発現量を解析したところ、CYH耐性株
では全体の54％のクローンが５mg/106 cells/day以上の
発現量を示したのに対し、G418耐性株ではわずか8%のク
ローンしか同等の発現量を示さなかった。さらに、CYH
耐性株のうち20%が30mg/106 cells/day以上、6%が100mg
/106 cells/day以上の高発現を示すことが明らかにされ
た（図８）。以上より、SEAP遺伝子安定導入細胞株につ
いてもCYH耐性で選択した場合、高発現株を効率良く取
得できることが示された。
【００５７】［実施例７］βガラクトシダーゼ遺伝子発
現の比較 形質導入株は希釈法により単離した。pL36a-neo-lacZを
CHO細胞に導入してCYH耐性株を50クローン、pNeo-lacZ
をCHO細胞に導入してG418耐性株を5３クローン単離し
た。β-galactosidaseの活性測定は、Luminescentβ-ga
l detection kit II(Clontech社, K2048-1)を用いて行
った。具体的には、培養した各クローン5×105細胞を6c
m径dishに播種し、2日間、薬剤を添加した選択培地で培
養する。細胞を回収し洗浄後キット添付の溶解液をもち
いて細胞溶解液を調製し、アッセイに使用した。各クロ
ーンのβ-galactosidase発現量を解析したところ、CYH
耐性株の16％が、100ｐg/106 cells/2days以上の活性を
示したのに対し、G418耐性株では同レベルの発現量を示
すクローンは2％だけであった。さらに100ｐg/106 cell
s/2days以上の活性を示すCYH耐性株の中には、1000ｐg/
106 cells/2daysを超える活性を示したクローンもあ
り、lacZ安定導入細胞株についてもCYH耐性で選択した
場合、高発現株を効率良く取得できることが示された
（図９）。
現の比較 形質導入株は希釈法により単離した。pL36a-neo-lacZを
CHO細胞に導入してCYH耐性株を50クローン、pNeo-lacZ
をCHO細胞に導入してG418耐性株を5３クローン単離し
た。β-galactosidaseの活性測定は、Luminescentβ-ga
l detection kit II(Clontech社, K2048-1)を用いて行
った。具体的には、培養した各クローン5×105細胞を6c
m径dishに播種し、2日間、薬剤を添加した選択培地で培
養する。細胞を回収し洗浄後キット添付の溶解液をもち
いて細胞溶解液を調製し、アッセイに使用した。各クロ
ーンのβ-galactosidase発現量を解析したところ、CYH
耐性株の16％が、100ｐg/106 cells/2days以上の活性を
示したのに対し、G418耐性株では同レベルの発現量を示
すクローンは2％だけであった。さらに100ｐg/106 cell
s/2days以上の活性を示すCYH耐性株の中には、1000ｐg/
106 cells/2daysを超える活性を示したクローンもあ
り、lacZ安定導入細胞株についてもCYH耐性で選択した
場合、高発現株を効率良く取得できることが示された
（図９）。
【００５８】［実施例８］細胞増殖速度の測定 CYH耐性形質導入株とG418耐性形質導入株とについて薬
剤添加および非添加条件下での増殖速度を比較した。SE
AP遺伝子が安定導入されたCYH耐性細胞及びG418耐性細
胞、それぞれ15クローンずつを任意に選び、選択培地
（CYH 3mg/ml またはG418 1mg/mlを含む）及び非選択
培地中でそれぞれ継代培養を行った。具体的には、それ
ぞれのクローンについて5×105の細胞を4−５枚の10cm
径細胞培養用dishに播種し、毎日1枚のdishの細胞を回
収し細胞数を計数した。細胞懸濁液中の細胞数計測は、
血球計算板またはWST-1 cell proliferation reagent
(Boehringer Mannheim, 1-644-807)またはFACSを用いて
行った。FACSによる計測は、2%FCSを添加したPBS（-）
に懸濁した細胞を、生細胞はFluorescein diacetate
（和光純薬工業, 067-03311）で、死細胞はPropidium i
odide (PI; Pharmingen, 66211E)で染色した後FACS解析
を行い、緑色のシグナルを持つ細胞のカウント数を計数
した。以上の操作により、それぞれのクローンについて
4−５日間の増殖曲線を作成すると共に一定時間当りの
増殖量を算出した。得られた薬剤耐性株の増殖速度(g)
は、N0を初期細胞数、Nを培養終了時細胞数、tを培養日
数として以下の式３で算出した。 （式３）：g=(lnN-lnN0)/t 世代数(x)は以下の式４を用いて算出した。 （式４）：x=(log10N-log10N0)/log102 倍化時間は細胞の培養時間を世代数で割ることにより算
出した。増殖曲線についてはCYH耐性株とG418耐性株と
もに非選択培地中で増殖が早く、選択培地で増殖が遅く
なる傾向が確認されたが、マーカー遺伝子や薬剤間での
増殖速度に大きな違いは認められなかった（図１０）。
この点をさらに解析するために、CYH耐性株及びG418耐
性株それぞれをのクローンを各培養条件において5×105
の細胞数で10cm径のdishに播種し、3日間培養を行っ
た。培養終了後の細胞数を計数して世代数を算出し、さ
らに培養時間から1継代あたりの平均倍化時間を算出し
た。さらにこの継代操作を数回繰り返すことによって各
クローンごとに選択培地と非選択培地での平均倍化時間
を算出した。CYH耐性株とG418耐性株それぞれ１５クロ
ーンずつの選択培地と非選択培地での平均倍化時間の平
均値を比較したところ、CYH耐性株及びG418耐性株どち
らに関しても、薬剤を含む選択培地での平均倍化時間が
非選択条件に比較して長くなることが示された(図11)。
また、2種類の薬剤耐性株の間で選択条件および非選択
条件下での平均倍化時間に大きな差は認められず、選択
マーカー遺伝子の種類による増殖の差はないものと考え
られた。さらに、非形質転換CHO細胞についても平均倍
化時間を求めたが、形質導入株に対してやや短いことも
示された。以上の検討から、本発明のマーカー遺伝子の
細胞増殖に対する影響は、汎用されているマーカー遺伝
子と同等であるといえる。
剤添加および非添加条件下での増殖速度を比較した。SE
AP遺伝子が安定導入されたCYH耐性細胞及びG418耐性細
胞、それぞれ15クローンずつを任意に選び、選択培地
（CYH 3mg/ml またはG418 1mg/mlを含む）及び非選択
培地中でそれぞれ継代培養を行った。具体的には、それ
ぞれのクローンについて5×105の細胞を4−５枚の10cm
径細胞培養用dishに播種し、毎日1枚のdishの細胞を回
収し細胞数を計数した。細胞懸濁液中の細胞数計測は、
血球計算板またはWST-1 cell proliferation reagent
(Boehringer Mannheim, 1-644-807)またはFACSを用いて
行った。FACSによる計測は、2%FCSを添加したPBS（-）
に懸濁した細胞を、生細胞はFluorescein diacetate
（和光純薬工業, 067-03311）で、死細胞はPropidium i
odide (PI; Pharmingen, 66211E)で染色した後FACS解析
を行い、緑色のシグナルを持つ細胞のカウント数を計数
した。以上の操作により、それぞれのクローンについて
4−５日間の増殖曲線を作成すると共に一定時間当りの
増殖量を算出した。得られた薬剤耐性株の増殖速度(g)
は、N0を初期細胞数、Nを培養終了時細胞数、tを培養日
数として以下の式３で算出した。 （式３）：g=(lnN-lnN0)/t 世代数(x)は以下の式４を用いて算出した。 （式４）：x=(log10N-log10N0)/log102 倍化時間は細胞の培養時間を世代数で割ることにより算
出した。増殖曲線についてはCYH耐性株とG418耐性株と
もに非選択培地中で増殖が早く、選択培地で増殖が遅く
なる傾向が確認されたが、マーカー遺伝子や薬剤間での
増殖速度に大きな違いは認められなかった（図１０）。
この点をさらに解析するために、CYH耐性株及びG418耐
性株それぞれをのクローンを各培養条件において5×105
の細胞数で10cm径のdishに播種し、3日間培養を行っ
た。培養終了後の細胞数を計数して世代数を算出し、さ
らに培養時間から1継代あたりの平均倍化時間を算出し
た。さらにこの継代操作を数回繰り返すことによって各
クローンごとに選択培地と非選択培地での平均倍化時間
を算出した。CYH耐性株とG418耐性株それぞれ１５クロ
ーンずつの選択培地と非選択培地での平均倍化時間の平
均値を比較したところ、CYH耐性株及びG418耐性株どち
らに関しても、薬剤を含む選択培地での平均倍化時間が
非選択条件に比較して長くなることが示された(図11)。
また、2種類の薬剤耐性株の間で選択条件および非選択
条件下での平均倍化時間に大きな差は認められず、選択
マーカー遺伝子の種類による増殖の差はないものと考え
られた。さらに、非形質転換CHO細胞についても平均倍
化時間を求めたが、形質導入株に対してやや短いことも
示された。以上の検討から、本発明のマーカー遺伝子の
細胞増殖に対する影響は、汎用されているマーカー遺伝
子と同等であるといえる。
【００５９】［実施例９］安定導入した遺伝子の安定性 CYH耐性及びG418耐性のSEAP遺伝子導入クローンで、SEA
Pを高発現する6株ずつを5×105の細胞数で10cm径dishに
播種し、非選択培地中で4日間培養を行った。培養後細
胞を回収し、FACSを用いて実施例8記載の方法で細胞数
を計数し、再び5×105の細胞数で10cm径dishに播種し
た。培養上清はSEAPアッセイに供した。以上の継代操作
を8ないし9回行い、各継代時（G418耐性株の継代1回目
を除く）における培地あたりのSEAP発現量を測定するこ
とにより、導入した遺伝子の安定性を確認した。CYH耐
性株のSEAP発現量はいずれもG418耐性株の発現量を大き
く上回っており、非選択培地中で継代を繰り返してもそ
の傾向は変化しなかった（図12）。CYH耐性株のうちSEA
P発現量の高いクローンのなかに継代により発現量が低
下するクローンがあったが、非選択培地中で８回継代し
た後でも、G418耐性SEAP高発現株の継代2回目のSEAP発
現量を上回っていた。以上の結果から、新規CYH耐性マ
ーカーにより異種遺伝子が安定形質導入されたCHO細胞
中では、染色体に組込まれた遺伝子は安定であることが
明らかにされた。このことから、L36a-CYHRのマーカー
遺伝子が、汎用されているneo遺伝子マーカー遺伝子の
利用よりも有用であることが示された。
Pを高発現する6株ずつを5×105の細胞数で10cm径dishに
播種し、非選択培地中で4日間培養を行った。培養後細
胞を回収し、FACSを用いて実施例8記載の方法で細胞数
を計数し、再び5×105の細胞数で10cm径dishに播種し
た。培養上清はSEAPアッセイに供した。以上の継代操作
を8ないし9回行い、各継代時（G418耐性株の継代1回目
を除く）における培地あたりのSEAP発現量を測定するこ
とにより、導入した遺伝子の安定性を確認した。CYH耐
性株のSEAP発現量はいずれもG418耐性株の発現量を大き
く上回っており、非選択培地中で継代を繰り返してもそ
の傾向は変化しなかった（図12）。CYH耐性株のうちSEA
P発現量の高いクローンのなかに継代により発現量が低
下するクローンがあったが、非選択培地中で８回継代し
た後でも、G418耐性SEAP高発現株の継代2回目のSEAP発
現量を上回っていた。以上の結果から、新規CYH耐性マ
ーカーにより異種遺伝子が安定形質導入されたCHO細胞
中では、染色体に組込まれた遺伝子は安定であることが
明らかにされた。このことから、L36a-CYHRのマーカー
遺伝子が、汎用されているneo遺伝子マーカー遺伝子の
利用よりも有用であることが示された。
【００６０】［実施例１０］導入した異種遺伝子のコピ
ー数解析 SEAP遺伝子導入クローンのうち、G418耐性株8クローン
とCYH耐性株12クローンについて、定量PCRによりSEAP遺
伝子のコピー数解析を行った。CHO細胞のゲノムDNAはWi
zard genomic DNA Purification kit (Promega社, A112
0)を用いて調製した。調製したゲノムDNAの濃度は、260
nm吸光度の測定により定量した。さらに1％アガロース
ゲルを用いた電気泳動によりDNAの分解が無いことを確
認した後、定量PCRの鋳型として使用した。定量PCRはTh
e Lightcycler FastStart DNA Master SYBR Green (Roc
he Molecular Biochemicals社、3-003-230)を使用し、
１サイクルにつき95℃で15秒、57℃で5秒、72℃で10秒
の条件で45サイクル行った。用いたプライマーはSEAPフ
ォワード (5’-GGT TAC CAC TCC CAC TGA CTT CC-3’
配列番号9)及びSEAPリバース(5’-GCA ACT TCC AGA CCA
TTG GC-3’ 配列番号10)である。SEAPプライマーによ
る定量PCRで得られた結果を標準化するためにSentrnel
Molecular Beacon b-Actin Detection kit (Straragene
社, 200570)に添付されている、βアクチン用のフォワ
ードプライマー（5’-ATG GGT CAG AAG GAT TCC TA-
3’）及びリバースプライマー（5’-TCC ATG TCG TCC C
AG TT-3’）を使用して同様のPCRを行った。それぞれの
クローンの鋳型DNAについて2種類のプライマーの組み合
わせでPCRを行った。得られたSEAP遺伝子とβアクチン
遺伝子のPCR反応生成物の量について、それぞれ最少の
値を１としてクローン間の相対値を算出した。さらに、
それぞれのクローンのDNAに関してSEAPプライマーで得
られたPCR産物の相対値をβアクチンプライマーで得ら
れたPCR産物の相対値で割ることによって、各クローン
の単位ゲノムDNA量当りの相対的なSEAP遺伝子コピー数
とした。各クローンでの相対的SEAP遺伝子コピー数と、
それらのクローンでのSEAP発現量との関係をグラフにし
たのが図13であるが、遺伝子のコピー数とSEAP発現量に
は相関関係が認められなかった。この結果から、CYH耐
性株で高頻度に認められる遺伝子の高発現はコピー数だ
けでなく、異種遺伝子DNAの染色体への挿入位置やその
他の因子による複合的な効果である可能性が考えられ
た。
ー数解析 SEAP遺伝子導入クローンのうち、G418耐性株8クローン
とCYH耐性株12クローンについて、定量PCRによりSEAP遺
伝子のコピー数解析を行った。CHO細胞のゲノムDNAはWi
zard genomic DNA Purification kit (Promega社, A112
0)を用いて調製した。調製したゲノムDNAの濃度は、260
nm吸光度の測定により定量した。さらに1％アガロース
ゲルを用いた電気泳動によりDNAの分解が無いことを確
認した後、定量PCRの鋳型として使用した。定量PCRはTh
e Lightcycler FastStart DNA Master SYBR Green (Roc
he Molecular Biochemicals社、3-003-230)を使用し、
１サイクルにつき95℃で15秒、57℃で5秒、72℃で10秒
の条件で45サイクル行った。用いたプライマーはSEAPフ
ォワード (5’-GGT TAC CAC TCC CAC TGA CTT CC-3’
配列番号9)及びSEAPリバース(5’-GCA ACT TCC AGA CCA
TTG GC-3’ 配列番号10)である。SEAPプライマーによ
る定量PCRで得られた結果を標準化するためにSentrnel
Molecular Beacon b-Actin Detection kit (Straragene
社, 200570)に添付されている、βアクチン用のフォワ
ードプライマー（5’-ATG GGT CAG AAG GAT TCC TA-
3’）及びリバースプライマー（5’-TCC ATG TCG TCC C
AG TT-3’）を使用して同様のPCRを行った。それぞれの
クローンの鋳型DNAについて2種類のプライマーの組み合
わせでPCRを行った。得られたSEAP遺伝子とβアクチン
遺伝子のPCR反応生成物の量について、それぞれ最少の
値を１としてクローン間の相対値を算出した。さらに、
それぞれのクローンのDNAに関してSEAPプライマーで得
られたPCR産物の相対値をβアクチンプライマーで得ら
れたPCR産物の相対値で割ることによって、各クローン
の単位ゲノムDNA量当りの相対的なSEAP遺伝子コピー数
とした。各クローンでの相対的SEAP遺伝子コピー数と、
それらのクローンでのSEAP発現量との関係をグラフにし
たのが図13であるが、遺伝子のコピー数とSEAP発現量に
は相関関係が認められなかった。この結果から、CYH耐
性株で高頻度に認められる遺伝子の高発現はコピー数だ
けでなく、異種遺伝子DNAの染色体への挿入位置やその
他の因子による複合的な効果である可能性が考えられ
た。
【００６１】
【発明の効果】本発明によれば、特に、新規な選択マー
カー遺伝子（蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子、代表的には
シクロヘキシミド耐性遺伝子）を含むベクターを利用し
て形質導入細胞を選択することによリ、所望の蛋白質を
高レベルで発現する組換え細胞が高頻度で選択される。
このベクターを利用することにより、高発現株を選択す
るためにスクリーニングする必要のあるトランスフェク
トされた細胞の数を減らすことが可能である。また、本
発明により提供される、外来遺伝子を高発現する細胞を
短期間で効率的に取得できる上記ベクターは、遺伝子に
コードされている機能未知の蛋白質の機能解析や、医薬
品等として利用可能な組換え蛋白質の生産系開発に関し
て大きな貢献をすることが期待できる。
カー遺伝子（蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子、代表的には
シクロヘキシミド耐性遺伝子）を含むベクターを利用し
て形質導入細胞を選択することによリ、所望の蛋白質を
高レベルで発現する組換え細胞が高頻度で選択される。
このベクターを利用することにより、高発現株を選択す
るためにスクリーニングする必要のあるトランスフェク
トされた細胞の数を減らすことが可能である。また、本
発明により提供される、外来遺伝子を高発現する細胞を
短期間で効率的に取得できる上記ベクターは、遺伝子に
コードされている機能未知の蛋白質の機能解析や、医薬
品等として利用可能な組換え蛋白質の生産系開発に関し
て大きな貢献をすることが期待できる。
【００６２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kirin Beer Kabushiki Kaisha <120> New vector for animal cells and use thereof <130> 130232 <160> 2 <210> 1 <211> 333 <212> DNA <213> human <223> ribosomal protein L36a gene <400> 1 tctaga atg gtc aac gta cct aaa acc cga aga acc ttc tgt aag aag 48 Met Val Asn Val Pro Lys Thr Arg Arg Thr Phe Cys Lys Lys 5 10 tgt ggc aag cat cag cct cac aaa gtg aca cag tat aag aag ggc aag Cys Gly Lys His Gln Pro His Lys Val Thr Gln Tyr Lys Lys Gly Lys 15 20 25 30 gat tct ttg tat gcc cag gga agg agg cgc tat gat cgg aag cag agt Asp Ser Leu Tyr Ala Gln Gly Arg Arg Arg Tyr Asp Arg Lys Gln Ser 35 40 45 ggc tat ggt ggg cag aca aag caa att ttc cgg aag aag gct aag acc Gly Tyr Gly Gly Gln Thr Lys Gln Ile Phe Arg Lys Lys Ala Lys Thr 50 55 60 aca aag aag att gtg cta agg ctg gaa tgt gtt gag cct aac tgc aga Thr Lys Lys Ile Val Leu Arg Leu Glu Cys Val Glu Pro Asn Cys Arg 65 70 75 tcc aag agg atg ctg gcc att aag aga tgc aag cat ttt gaa ctg gga Ser Lys Arg Met Leu Ala Ile Lys Arg Cys Lys His Phe Glu Leu Gly 80 85 90 gga gat aag aag aga aag ggc caa gtg atc cag ttc taatctaga 333 Gly Asp Lys Lys Arg Lys Gly Gln Val Ile Gln Phe 95 100 105 <210> 2 <211> 333 <212> DNA <213> human <223> ribosomal protein L44 gene <400> 2 tctaga atg gtc aac gta cct aaa acc cga aga acc ttc tgt aag aag 48 Met Val Asn Val Pro Lys Thr Arg Arg Thr Phe Cys Lys Lys 5 10 tgt ggc aag cat cag cct cac aaa gtg aca cag tat aag aag ggc aag Cys Gly Lys His Gln Pro His Lys Val Thr Gln Tyr Lys Lys Gly Lys 15 20 25 30 gat tct ttg tat gcc cag gga agg agg cgc tat gat cgg aag cag agt Asp Ser Leu Tyr Ala Gln Gly Lys Arg Arg Tyr Asp Arg Lys Gln Ser 35 40 45 ggc tat ggt ggg cag aca aag caa att ttc cgg aag aag gct aag acc Gly Tyr Gly Gly Gln Thr Lys Gln Ile Phe Arg Lys Lys Ala Lys Thr 50 55 60 aca aag aag att gtg cta agg ctg gaa tgt gtt gag cct aac tgc aga Thr Lys Lys Ile Val Leu Arg Leu Glu Cys Val Glu Pro Asn Cys Arg 65 70 75 tcc aag agg atg ctg gcc att aag aga tgc aag cat ttt gaa ctg gga Ser Lys Arg Met Leu Ala Ile Lys Arg Cys Lys His Phe Glu Leu Gly 80 85 90 gga gat aag aag aga aag ggc caa gtg atc cag ttc taatctaga 333 Gly Asp Lys Lys Arg Lys Gly Gln Val Ile Gln Phe 95 100 105 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 AGAAGTGTGG CAAGCATCAG 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 CTCCTCCCAG TTCAAAATGC 20 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 GGGTCTAGAA TGGTCAACGT ACCTAAAAC 29 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 CCGGAAAATT TGCTTTGTCT GCCCA 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 GGGCAGACAA AGCAAATTTT CCGG 24 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 GGGTCTAGAT TAGAACTGGA TCACTTGGC 29 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 GGTTACCACT CCCACTGACT TCC 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 GCAACTTCCA GACCATTGGC 20
【図１】ヒトのリボソーム蛋白質L36a(GI 4506651)と酵
母Candida utilisのリボソーム蛋白質L41(GI1255906)の
アミノ酸配列の比較の図である。ヒトL36a蛋白質の54番
目（酵母L41たんぱく質では56番目）のアミノ酸プロリ
ン（四角で囲んである）をグルタミンに置換することに
より、それぞれの蛋白質はシクロヘキシミド耐性型の蛋
白質となる。
母Candida utilisのリボソーム蛋白質L41(GI1255906)の
アミノ酸配列の比較の図である。ヒトL36a蛋白質の54番
目（酵母L41たんぱく質では56番目）のアミノ酸プロリ
ン（四角で囲んである）をグルタミンに置換することに
より、それぞれの蛋白質はシクロヘキシミド耐性型の蛋
白質となる。
【図２】２段階のPCRによるシクロヘキシミド耐性遺伝
子の構築法を示した図である。最初にプライマー１とプ
ライマー３の組み合わせ、及びプライマー４とプライマ
ー２の組み合わせでL36a遺伝子を鋳型に用いてPCRを行
った。プライマー３と４には54番目のアミノ酸プロリン
をグルタミンに置換するために鋳型と１箇所のヌクレオ
チド配列が異なっている。得られた2種類のPCR産物の混
合物を鋳型にしてプライマー１と２の組み合わせで再び
PCRを行うことにより両端に制限酵素XbaI認識部位が付
加され、54番目のアミノ酸プロリンがグルタミンに置換
されたCYH耐性型のL36a遺伝子を得ることができる。
子の構築法を示した図である。最初にプライマー１とプ
ライマー３の組み合わせ、及びプライマー４とプライマ
ー２の組み合わせでL36a遺伝子を鋳型に用いてPCRを行
った。プライマー３と４には54番目のアミノ酸プロリン
をグルタミンに置換するために鋳型と１箇所のヌクレオ
チド配列が異なっている。得られた2種類のPCR産物の混
合物を鋳型にしてプライマー１と２の組み合わせで再び
PCRを行うことにより両端に制限酵素XbaI認識部位が付
加され、54番目のアミノ酸プロリンがグルタミンに置換
されたCYH耐性型のL36a遺伝子を得ることができる。
【図３】CYH耐性型のL36a遺伝子（L36a-CYHR遺伝子）の
DNA配列とコードするポリペプチドのアミノ酸配列を示
す図である。アミノ酸変異を導入した54番目のグルタミ
ンは四角で囲んである。
DNA配列とコードするポリペプチドのアミノ酸配列を示
す図である。アミノ酸変異を導入した54番目のグルタミ
ンは四角で囲んである。
【図４】L36a-CYHR遺伝子がシクロヘキシミド耐性を付
与することを示した図である。L36a-CYHR遺伝子を含む
プラスミドpCI-neo-L36を分泌性アルカリフォスファタ
ーゼSEAPを含むプラスミドpSEAP2-control と共にCHO細
胞に共形質導入した後、24時間後に培地を交換して４時
間後と８時間後に上清の一部を回収し、SEAP活性を測定
した。４時間後の活性を１とした場合の８時間後の活性
を示した。
与することを示した図である。L36a-CYHR遺伝子を含む
プラスミドpCI-neo-L36を分泌性アルカリフォスファタ
ーゼSEAPを含むプラスミドpSEAP2-control と共にCHO細
胞に共形質導入した後、24時間後に培地を交換して４時
間後と８時間後に上清の一部を回収し、SEAP活性を測定
した。４時間後の活性を１とした場合の８時間後の活性
を示した。
【図５】各種プラスミドの構造を示した図である。
【図６】フローサイトメトリーによるGFP発現量の解析
方法を示した図である。縦軸に細胞数、横軸にGFP発現
による蛍光強度を対数で示してある。蛍光強度の弱い順
にM1~M4の4つの領域に分布を分け、M1の領域に含まれる
細胞をGFP未発現細胞の集団、M3及びM4に含まれる細胞
集団をGFP発現陽性の集団とした。
方法を示した図である。縦軸に細胞数、横軸にGFP発現
による蛍光強度を対数で示してある。蛍光強度の弱い順
にM1~M4の4つの領域に分布を分け、M1の領域に含まれる
細胞をGFP未発現細胞の集団、M3及びM4に含まれる細胞
集団をGFP発現陽性の集団とした。
【図７】単離したCYH耐性株とG418耐性株のGFP発現量の
分布を示した図である。pL36a-neo-GFP を導入して得ら
れたCYH耐性株については44クローン、pd2EGFP-N1を導
入して得られたG418耐性株46クローンについて解析を行
った。
分布を示した図である。pL36a-neo-GFP を導入して得ら
れたCYH耐性株については44クローン、pd2EGFP-N1を導
入して得られたG418耐性株46クローンについて解析を行
った。
【図８】単離したCYH耐性株とG418耐性株のアルカリフ
ォスファターゼ発現量の分布を示した図である。pL36a-
neo-SEAP を導入して得られたCYH耐性株、pNeo-SEAPを
導入して得られたG418耐性株それぞれ５０クローンずつ
について解析を行った。
ォスファターゼ発現量の分布を示した図である。pL36a-
neo-SEAP を導入して得られたCYH耐性株、pNeo-SEAPを
導入して得られたG418耐性株それぞれ５０クローンずつ
について解析を行った。
【図９】単離したCYH耐性株とG418耐性株のβガラクト
シダーゼ発現量の分布を示した図である。pL36a-neo-la
cZ を導入して得られたCYH耐性株、pNeo-lacZを導入し
て得られたG418耐性株それぞれ５０クローンずつについ
て解析を行った。
シダーゼ発現量の分布を示した図である。pL36a-neo-la
cZ を導入して得られたCYH耐性株、pNeo-lacZを導入し
て得られたG418耐性株それぞれ５０クローンずつについ
て解析を行った。
【図１０】CYH耐性のアルカリフォスファターゼ発現株
とG418耐性のアルカリフォスファターゼ発現株の増殖曲
線を示した図である。SEAP遺伝子が安定導入されたCYH
耐性株及びG418耐性株それぞれ15クローンずつを任意に
選び、選択培地（CYH 3mg/ml またはG418 1mg/mlを含
む）及び非選択培地中でそれぞれ培養を行った。
とG418耐性のアルカリフォスファターゼ発現株の増殖曲
線を示した図である。SEAP遺伝子が安定導入されたCYH
耐性株及びG418耐性株それぞれ15クローンずつを任意に
選び、選択培地（CYH 3mg/ml またはG418 1mg/mlを含
む）及び非選択培地中でそれぞれ培養を行った。
【図１１】CYH耐性のアルカリフォスファターゼ発現株
とG418耐性のアルカリフォスファターゼ発現株の平均倍
化時間を示した図である。任意に選んだCYH耐性株及びG
418耐性株それぞれ１５クローンずつを選択培地（CYH
3mg/ml またはG418 1mg/mlを含む）及び非選択培地中
でそれぞれ継代培養を行い、各クローンごとに選択培地
と非選択培地での平均倍化時間を算出した。さらにその
倍化時間の平均値を示した。
とG418耐性のアルカリフォスファターゼ発現株の平均倍
化時間を示した図である。任意に選んだCYH耐性株及びG
418耐性株それぞれ１５クローンずつを選択培地（CYH
3mg/ml またはG418 1mg/mlを含む）及び非選択培地中
でそれぞれ継代培養を行い、各クローンごとに選択培地
と非選択培地での平均倍化時間を算出した。さらにその
倍化時間の平均値を示した。
【図１２】CYH耐性株及びG418耐性株のアルカリフォス
ファターゼ発現量の安定性を調べた図である。CYH耐性
株及びG418耐性株それぞれ６クローンずつを選択培地
（CYH 3mg/mlまたはG418 1mg/mlを含む）及び非選択
培地中でそれぞれ継代培養を行い培地あたりのSEAP発現
量を測定することにより、導入した遺伝子の安定性を確
認した。
ファターゼ発現量の安定性を調べた図である。CYH耐性
株及びG418耐性株それぞれ６クローンずつを選択培地
（CYH 3mg/mlまたはG418 1mg/mlを含む）及び非選択
培地中でそれぞれ継代培養を行い培地あたりのSEAP発現
量を測定することにより、導入した遺伝子の安定性を確
認した。
【図１３】CYH耐性株及びG418耐性株のアルカリフォス
ファターゼ発現量と遺伝子のコピー数の関係を示した図
である。SEAP遺伝子導入クローンのうち、G418耐性株8
クローンとCYH耐性株12クローンについて、定量PCRによ
りSEAP遺伝子のコピー数解析を行った。
ファターゼ発現量と遺伝子のコピー数の関係を示した図
である。SEAP遺伝子導入クローンのうち、G418耐性株8
クローンとCYH耐性株12クローンについて、定量PCRによ
りSEAP遺伝子のコピー数解析を行った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 近 藤 恵 二 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麒 麟麦酒株式会社基盤技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 DA02 EA04 FA01 FA10 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ08 QQ13 QR08 QR33 QR42 QR59 QR62 QS05 QS25 QS36 QS38 QX02 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA20 4B065 AA91X AB01 AC10 BA02 BA25 CA24 CA60
Claims (17)
- 【請求項１】蛋白質合成阻害剤に感受性の動物細胞に、
該阻害剤に対する耐性を付与する性質を有し、かつ動物
由来のリボソーム構成蛋白質をコードする遺伝子を置換
変異した配列を有する、蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子。 - 【請求項２】蛋白質合成阻害剤がシクロヘキシミドであ
る、請求項１記載の蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子。 - 【請求項３】シクロヘキシミド感受性の動物細胞にシク
ロヘキシミド耐性を付与する性質を有し、かつ動物由来
リボソーム蛋白質L36aまたはその相同蛋白質をコードす
る遺伝子を置換変異した配列を有する、請求項２記載の
蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子。 - 【請求項４】動物由来のリボソーム構成蛋白質が哺乳動
物由来の蛋白質である、請求項１〜３のいずれか１項記
載の蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子。 - 【請求項５】哺乳動物由来のリボソーム蛋白質L36aにお
ける５４位またはその相同蛋白質における対応位置のア
ミノ酸に対応する塩基配列が置換されている、請求項２
〜４のいずれか１項記載の蛋白質合成阻害剤耐性遺伝
子。 - 【請求項６】置換された５４位のアミノ酸がグルタミン
である、請求項５記載の蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子。 - 【請求項７】相同蛋白質がリボソーム蛋白質L４４であ
る、請求項２〜６のいずれか１項記載の蛋白質合成阻害
剤耐性遺伝子。 - 【請求項８】シクロヘキシミド感受性の動物細胞にシク
ロヘキシミド耐性を付与する性質を有し、かつ配列番号
１または２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸
配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする、蛋
白質合成阻害剤耐性遺伝子。 - 【請求項９】請求項1〜８のいずれか１項記載の遺伝子
を含む組換えベクター。 - 【請求項１０】請求項1〜８のいずれか１項記載の遺伝
子および外来蛋白質構造遺伝子とを発現可能に含む発現
ベクター。 - 【請求項１１】請求項１０記載の発現ベクターを蛋白質
合成阻害剤に感受性の動物細胞に導入してこれを培養
し、蛋白質合成阻害剤耐性遺伝子を選択マーカーとして
細胞株を選択することを特徴とする、蛋白質合成阻害剤
耐性動物細胞株の選択方法。 - 【請求項１２】蛋白質合成阻害剤がシクロヘキシミドで
ある、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】シクロヘキシミド感受性の動物細胞が哺
乳動物由来のものである、請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣
由来のＣＨＯ細胞である、請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】動物細胞がジヒドロ葉酸還元酵素欠損Ｃ
ＨＯ細胞である、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】請求項１０記載の発現ベクターを含む動
物細胞からなる形質転換細胞。 - 【請求項１７】請求項１６記載の形質転換細胞を培養
し、発現された外来蛋白質を培養物から採取することを
特徴とする、蛋白質の生産方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001066925A JP4817514B2 (ja) | 2001-03-09 | 2001-03-09 | 新規動物細胞用ベクターおよびその使用 |
| PCT/JP2002/002201 WO2002072843A1 (fr) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Nouveaux vecteurs pour cellules animales et utilisation de ceux-ci |
| EP02702844A EP1367126B1 (en) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Novel vectors for animal cells and utilization thereof |
| ES02702844T ES2403931T3 (es) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Vectores novedosos para células animales y uso de los mismos |
| US10/471,009 US7064194B2 (en) | 2001-03-09 | 2002-03-08 | Vectors for animal cells and utilization thereof |
| US11/284,905 US7195915B2 (en) | 2001-03-09 | 2005-11-23 | Vectors for animal cells and use thereof |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001066925A JP4817514B2 (ja) | 2001-03-09 | 2001-03-09 | 新規動物細胞用ベクターおよびその使用 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002262879A true JP2002262879A (ja) | 2002-09-17 |
| JP4817514B2 JP4817514B2 (ja) | 2011-11-16 |
Family
ID=18925352
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|---|---|---|---|
| JP2001066925A Expired - Lifetime JP4817514B2 (ja) | 2001-03-09 | 2001-03-09 | 新規動物細胞用ベクターおよびその使用 |
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| EP (1) | EP1367126B1 (ja) |
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| JP2007202490A (ja) * | 2006-02-02 | 2007-08-16 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 動物細胞用新規発現ベクター |
| WO2010143698A1 (ja) | 2009-06-11 | 2010-12-16 | 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 | タンパク質の生産方法 |
| JP2012095674A (ja) * | 2012-02-20 | 2012-05-24 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | 動物細胞用新規発現ベクター |
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| US7393652B2 (en) | 2000-05-10 | 2008-07-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for identifying a chemical compound that directly enhances binding of FKBP12.6 to PKA-phosphorylated type 2 ryanodine receptor (RyR2) |
| US20060293266A1 (en) * | 2000-05-10 | 2006-12-28 | The Trustees Of Columbia | Phosphodiesterase 4D in the ryanodine receptor complex protects against heart failure |
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