JP2002095486A - ヒトカリウムチャンネル１および２タンパク質 - Google Patents
ヒトカリウムチャンネル１および２タンパク質Info
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、ヒトＫ+チャンネルポリペプチド、
およびＫ+チャンネルポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ＲＮＡ）、組換え技術によるポリペプチドを産生する
手順、Ｋ+チャンネルポリペプチドのアゴニスト、なら
びにＡＩＤＳなどの処置に用いられ得るポリペプチドに
対するアンタゴニストを提供することを目的とする。 【解決手段】（ａ）図１の推定アミノ酸配列を有するＫ
+チャンネル１ポリペプチド； （ｂ）図２の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャンネル
２ポリペプチド； （ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５７００号に含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル１ポリペプチド；および （ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０号に含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル２ポリペプチド、からなる群から選択される、単
離されたポリペプチドを提供する。
およびＫ+チャンネルポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ＲＮＡ）、組換え技術によるポリペプチドを産生する
手順、Ｋ+チャンネルポリペプチドのアゴニスト、なら
びにＡＩＤＳなどの処置に用いられ得るポリペプチドに
対するアンタゴニストを提供することを目的とする。 【解決手段】（ａ）図１の推定アミノ酸配列を有するＫ
+チャンネル１ポリペプチド； （ｂ）図２の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャンネル
２ポリペプチド； （ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５７００号に含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル１ポリペプチド；および （ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０号に含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル２ポリペプチド、からなる群から選択される、単
離されたポリペプチドを提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定したポ
リヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチド
およびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの生成に関する。より特
定すると、本発明のポリペプチドは、ヒトカリウムチャ
ンネルタンパク質であり、本明細書中下記でしばしば
「Ｋ+チャンネル１および２ポリペプチド」と称され
る。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻
害することに関する。
リヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチド
およびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの生成に関する。より特
定すると、本発明のポリペプチドは、ヒトカリウムチャ
ンネルタンパク質であり、本明細書中下記でしばしば
「Ｋ+チャンネル１および２ポリペプチド」と称され
る。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻
害することに関する。
【０００２】
【従来の技術】カリウムチャンネルは、おそらくイオン
チャンネルのうちで最も多様な群を形成し、そして神経
および筋肉の興奮性の制御に不可欠である。いくつかの
カリウムチャンネルは膜の脱分極化に応答して開き、他
のカルシウムチャンネルは過分極または細胞内のカルシ
ウムの増加に応答して開く。いくつかのカルシウムチャ
ンネルはまた、伝達物質の結合により、および細胞内キ
ナーゼ、ＧＴＰ結合タンパク質または他の第二のメッセ
ンジャーにより調節され得る。
チャンネルのうちで最も多様な群を形成し、そして神経
および筋肉の興奮性の制御に不可欠である。いくつかの
カリウムチャンネルは膜の脱分極化に応答して開き、他
のカルシウムチャンネルは過分極または細胞内のカルシ
ウムの増加に応答して開く。いくつかのカルシウムチャ
ンネルはまた、伝達物質の結合により、および細胞内キ
ナーゼ、ＧＴＰ結合タンパク質または他の第二のメッセ
ンジャーにより調節され得る。
【０００３】カリウムチャンネルは、他のイオンからカ
リウムを選択するその能力においては類似であるが、活
性化、不活性化および動力学の詳細においては異なる異
種のイオンチャンネルの群である（Ｌａｔｏｒｒｅ，
Ｒ．およびＭｉｌｌｅｒ，Ｃ．、Ｊ． Ｍｅｍｂ． Ｂ
ｉｏｌ．， ７：１１−３０， （１９８３））。それ
らは、例えば、活動電位の再分極、心臓の心拍調節、神
経の破裂、および潜在的な学習ならびに記憶のような多
数の生理機能に有意に寄与するであろう（Ｈｏｄｇｋｉ
ｎ， Ａ．Ｌ．およびＨｕｘｌｅｙ， Ａ．Ｆ．、Ｊ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１７：５００−５４４ （１９
５２））。
リウムを選択するその能力においては類似であるが、活
性化、不活性化および動力学の詳細においては異なる異
種のイオンチャンネルの群である（Ｌａｔｏｒｒｅ，
Ｒ．およびＭｉｌｌｅｒ，Ｃ．、Ｊ． Ｍｅｍｂ． Ｂ
ｉｏｌ．， ７：１１−３０， （１９８３））。それ
らは、例えば、活動電位の再分極、心臓の心拍調節、神
経の破裂、および潜在的な学習ならびに記憶のような多
数の生理機能に有意に寄与するであろう（Ｈｏｄｇｋｉ
ｎ， Ａ．Ｌ．およびＨｕｘｌｅｙ， Ａ．Ｆ．、Ｊ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１７：５００−５４４ （１９
５２））。
【０００４】カリウムチャンネルの機能についての分子
理論が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ科のカリウムチャンネル
のメンバーの分子クローニングにより大いに明らかにさ
れており、Ｓｈａｋｅｒ、Ｓｈａｗ、Ｓｈａｌ、および
Ｓｈａｄが示されている（Ｔｅｍｐｅｌ， Ｂ．Ｌ．
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３７：７７０−７７５ （１
９８７））。これらのカリウムチャンネルの４つすべて
に対する哺乳動物ホモログが、クローニングされている
（Ｔｅｍｐｅｌ， Ｂ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３
２：８３７−８３９ （１９８８））。Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａカリウムチャンネルの特殊型が同定されている。
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける特殊型は、選択的スプラ
イシングにより広範に由来する（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，
Ｔ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３３１：１３７−１４２
（１９８８））。それに対して、哺乳動物カリウムチ
ャンネルの特殊型は、同様のスプライシングが生じるが
一般に異なる遺伝子を表す。これらのチャンネルの生物
物理学的特性は、アミノ酸配列のごく小さな交替で変化
し得る。緩慢な不活性化である、「遅延式整流器」チャ
ンネルと迅速な不活性化である、Ａ型チャンネルとの間
には重要な差異が存在する（Ｗｅｉ， Ａら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ， ２４８：５９９−６０３ （１９９０））。
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａカリウムチャンネルの哺乳動物ホ
モログは、同様のあるいは異なる生物物理学的特性のい
ずれかを示し得る。
理論が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ科のカリウムチャンネル
のメンバーの分子クローニングにより大いに明らかにさ
れており、Ｓｈａｋｅｒ、Ｓｈａｗ、Ｓｈａｌ、および
Ｓｈａｄが示されている（Ｔｅｍｐｅｌ， Ｂ．Ｌ．
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３７：７７０−７７５ （１
９８７））。これらのカリウムチャンネルの４つすべて
に対する哺乳動物ホモログが、クローニングされている
（Ｔｅｍｐｅｌ， Ｂ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３
２：８３７−８３９ （１９８８））。Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａカリウムチャンネルの特殊型が同定されている。
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける特殊型は、選択的スプラ
イシングにより広範に由来する（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，
Ｔ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３３１：１３７−１４２
（１９８８））。それに対して、哺乳動物カリウムチ
ャンネルの特殊型は、同様のスプライシングが生じるが
一般に異なる遺伝子を表す。これらのチャンネルの生物
物理学的特性は、アミノ酸配列のごく小さな交替で変化
し得る。緩慢な不活性化である、「遅延式整流器」チャ
ンネルと迅速な不活性化である、Ａ型チャンネルとの間
には重要な差異が存在する（Ｗｅｉ， Ａら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ， ２４８：５９９−６０３ （１９９０））。
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａカリウムチャンネルの哺乳動物ホ
モログは、同様のあるいは異なる生物物理学的特性のい
ずれかを示し得る。
【０００５】カリウムチャンネルは、正常細胞ホメオス
タシスに関与し、そして種々の疾患状態および免疫応答
に関連する。ナトリウム、カルシウム、およびカリウム
チャンネルと特定の関連性を有すると考えられる疾患
は、自己免疫疾患およびガンのような他の増殖性異常を
包含する。自己免疫疾患は、特に、リュウマチ性関節
炎、１型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性
エリテマトーデス、シェーグレン症候群、混合結合性組
織病を含有する。
タシスに関与し、そして種々の疾患状態および免疫応答
に関連する。ナトリウム、カルシウム、およびカリウム
チャンネルと特定の関連性を有すると考えられる疾患
は、自己免疫疾患およびガンのような他の増殖性異常を
包含する。自己免疫疾患は、特に、リュウマチ性関節
炎、１型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性
エリテマトーデス、シェーグレン症候群、混合結合性組
織病を含有する。
【０００６】いくつかのクラスのカリウムチャンネル
は、膜電位の維持および多様な細胞型の細胞容積の調
節、ならびに神経系における電気的興奮性の調節に関与
する（Ｌｅｗｉｓ， Ｒ．Ｓ．およびＣａｈａｌａｎ，
Ｍ．Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：７７１−７７５
（１９８８））。カリウムチャンネルは、活動電位の
再分極相、ならびにニューロンおよび他の細胞の興奮パ
ターンを制御することが示されている。カリウムの流動
はナトリウムまたはカルシウムの流動よりも多様である
こと、および細胞の外部の刺激に対する応答様式を決定
する中心的な役割も果たすことが示されている。例え
ば、ニューロンがシナプスインプットに応答する調節速
度または遅延速度は、異なるクラスのカリウムチャンネ
ルの存在により強く決定される。カリウムチャンネルの
多様性を生じる分子メカニズムは、１３０ｋｂにわたる
２１個のエキソンを含有し、そして単一の一次転写産物
の選択的スプライシングにより４つの異なるカリウムチ
ャンネルを生じるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｈａｋｅｒ
座において最も理解されている（ＤｅＣｏｕｒｓｅｙ，
Ｔ．Ｅ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８
９：３７９−４０４ （１９８７））。Ｘｅｎｏｐｕｓ
卵母細胞におけるこれらのｃＤＮＡの発現は、異なる生
理的特性とともに電位依存性カリウム流動を生じさせ
る。関連するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａカリウムチャンネル
遺伝子Ｓｈａｂはまた、２つの異なるタンパク質を生じ
る一次転写産物の選択的スプライシングを示す（ＭｃＫ
ｉｎｎｏｎ，Ｄ．およびＣｅｒｅｄｉｇ， Ｒ．、Ｊ．
Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １６４：１８４６−１８６１
（１９８６））。
は、膜電位の維持および多様な細胞型の細胞容積の調
節、ならびに神経系における電気的興奮性の調節に関与
する（Ｌｅｗｉｓ， Ｒ．Ｓ．およびＣａｈａｌａｎ，
Ｍ．Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：７７１−７７５
（１９８８））。カリウムチャンネルは、活動電位の
再分極相、ならびにニューロンおよび他の細胞の興奮パ
ターンを制御することが示されている。カリウムの流動
はナトリウムまたはカルシウムの流動よりも多様である
こと、および細胞の外部の刺激に対する応答様式を決定
する中心的な役割も果たすことが示されている。例え
ば、ニューロンがシナプスインプットに応答する調節速
度または遅延速度は、異なるクラスのカリウムチャンネ
ルの存在により強く決定される。カリウムチャンネルの
多様性を生じる分子メカニズムは、１３０ｋｂにわたる
２１個のエキソンを含有し、そして単一の一次転写産物
の選択的スプライシングにより４つの異なるカリウムチ
ャンネルを生じるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｈａｋｅｒ
座において最も理解されている（ＤｅＣｏｕｒｓｅｙ，
Ｔ．Ｅ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８
９：３７９−４０４ （１９８７））。Ｘｅｎｏｐｕｓ
卵母細胞におけるこれらのｃＤＮＡの発現は、異なる生
理的特性とともに電位依存性カリウム流動を生じさせ
る。関連するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａカリウムチャンネル
遺伝子Ｓｈａｂはまた、２つの異なるタンパク質を生じ
る一次転写産物の選択的スプライシングを示す（ＭｃＫ
ｉｎｎｏｎ，Ｄ．およびＣｅｒｅｄｉｇ， Ｒ．、Ｊ．
Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １６４：１８４６−１８６１
（１９８６））。
【０００７】ＰＣＴ出願番号ＷＯ ９２／０２６３４号
は、ＭＫ３遺伝子のカリウムチャンネル発現産物または
機能的に生物活性なその等価物、およびその使用（特
に、免疫応答および免疫応答を調節またはブロックする
物質の同定と組み合わせて）を開示している。
は、ＭＫ３遺伝子のカリウムチャンネル発現産物または
機能的に生物活性なその等価物、およびその使用（特
に、免疫応答および免疫応答を調節またはブロックする
物質の同定と組み合わせて）を開示している。
【０００８】哺乳動物の脳に単独に局在する新規なカリ
ウムチャンネルが同定され、クローニングされ、そして
配列が決定されている。ならびに、ラットの舌の有郭乳
頭から調整されたｃＤＮＡライブラリーを利用して、ｃ
ｄｒｋが示されている。このｃｄｒｋチャンネルは、Ｓ
ｈａｂのサブファミリーのメンバーであるようであり、
ｃｄｒｋ１に最も酷似する。このｃｄｒｋチャンネル
は、多様な被刺激性組織において重要であり得る（Ｈｗ
ａｎｇ， Ｐ．Ｍ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ， ８：４７３−
４８１ （１９９２））。
ウムチャンネルが同定され、クローニングされ、そして
配列が決定されている。ならびに、ラットの舌の有郭乳
頭から調整されたｃＤＮＡライブラリーを利用して、ｃ
ｄｒｋが示されている。このｃｄｒｋチャンネルは、Ｓ
ｈａｂのサブファミリーのメンバーであるようであり、
ｃｄｒｋ１に最も酷似する。このｃｄｒｋチャンネル
は、多様な被刺激性組織において重要であり得る（Ｈｗ
ａｎｇ， Ｐ．Ｍ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ， ８：４７３−
４８１ （１９９２））。
【０００９】多様なカリウムチャンネル構成要素が、Ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｈａｋｅｒ座での選択的スプラ
イシングにより産生されている（Ｓｃｈｗａｒｚ，
Ｔ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３３１−１３７−１４２
（１９８８））。
ｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｈａｋｅｒ座での選択的スプラ
イシングにより産生されている（Ｓｃｈｗａｒｚ，
Ｔ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３３１−１３７−１４２
（１９８８））。
【００１０】ＲＣＫカリウムチャンネルファミリーのメ
ンバーは、ラット神経系において特異的に発現されてい
る。ＲＣＫカリウムチャンネルファミリーの４つのメン
バーをコードするｍＲＮＡ（ＲＣＫ１、ＲＣＫ３、ＲＣ
Ｋ４およびＲＣＫ５と名付けられた）は、特異的なＲＮ
Ａプローブを用いたＲＮＡブロットハイブリダイゼーシ
ョン実験により分析されている（Ｂｅｃｋｈ， Ｓ．お
よびＰｏｎｇｓ， Ｏ．、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ， ９：７７７−７８２（１９９０））。
ンバーは、ラット神経系において特異的に発現されてい
る。ＲＣＫカリウムチャンネルファミリーの４つのメン
バーをコードするｍＲＮＡ（ＲＣＫ１、ＲＣＫ３、ＲＣ
Ｋ４およびＲＣＫ５と名付けられた）は、特異的なＲＮ
Ａプローブを用いたＲＮＡブロットハイブリダイゼーシ
ョン実験により分析されている（Ｂｅｃｋｈ， Ｓ．お
よびＰｏｎｇｓ， Ｏ．、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ， ９：７７７−７８２（１９９０））。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトＫ+チ
ャンネルポリペプチド、およびこのようなＫ+チャンネ
ルポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、組換え
技術によるこのようなポリペプチドを産生する手順、て
んかん、発作、高血圧症、ぜん息、パーキンソン病、精
神分裂症、不安、鬱病、および神経変性の処置に用いら
れ得るこのようなＫ +チャンネルポリペプチドのアゴニ
スト、ならびにＡＩＤＳ、全身性エリテマトーデス、糖
尿病、多発性硬化症、およびガンの処置に用いられ得る
このようなポリペプチドに対するアンタゴニストを提供
することを目的とする。
ャンネルポリペプチド、およびこのようなＫ+チャンネ
ルポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、組換え
技術によるこのようなポリペプチドを産生する手順、て
んかん、発作、高血圧症、ぜん息、パーキンソン病、精
神分裂症、不安、鬱病、および神経変性の処置に用いら
れ得るこのようなＫ +チャンネルポリペプチドのアゴニ
スト、ならびにＡＩＤＳ、全身性エリテマトーデス、糖
尿病、多発性硬化症、およびガンの処置に用いられ得る
このようなポリペプチドに対するアンタゴニストを提供
することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】１つの局面において、本
発明は、 （ａ）図１の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャンネル
１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるい
は該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘
導体； （ｂ）図２の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャンネル
２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるい
は該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘
導体； （ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５７００号に含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、ま
たは誘導体；および （ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０号に含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、ま
たは誘導体、からなる群から選択される、単離されたポ
リペプチドを提供する。
発明は、 （ａ）図１の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャンネル
１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるい
は該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘
導体； （ｂ）図２の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャンネル
２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるい
は該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘
導体； （ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５７００号に含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、ま
たは誘導体；および （ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０号に含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、ま
たは誘導体、からなる群から選択される、単離されたポ
リペプチドを提供する。
【００１３】好適な実施形態において、本発明の上記ポ
リヌクレオチドがＤＮＡであり得る。
リヌクレオチドがＤＮＡであり得る。
【００１４】好適な実施形態において、本発明の上記ポ
リヌクレオチドがＲＮＡであり得る。
リヌクレオチドがＲＮＡであり得る。
【００１５】好適な実施形態において、本発明の上記ポ
リヌクレオチドがゲノムＤＮＡであり得る。
リヌクレオチドがゲノムＤＮＡであり得る。
【００１６】さらに好適な実施形態において、本発明の
上記ポリヌクレオチドが図１および図２の推定アミノ酸
配列を有するＫ+チャンネル１ポリペプチドをコードし
得る。
上記ポリヌクレオチドが図１および図２の推定アミノ酸
配列を有するＫ+チャンネル１ポリペプチドをコードし
得る。
【００１７】さらに好適な実施形態において、本発明の
上記ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託番号第７５７００
号のｃＤＮＡでコードされるＫ+チャンネル１ポリペプ
チドをコードし得る。
上記ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託番号第７５７００
号のｃＤＮＡでコードされるＫ+チャンネル１ポリペプ
チドをコードし得る。
【００１８】さらに好適な実施形態において、本発明の
上記ポリヌクレオチドが図２の推定アミノ酸配列を有す
るＫ+チャンネル２ポリペプチドをコードし得る。
上記ポリヌクレオチドが図２の推定アミノ酸配列を有す
るＫ+チャンネル２ポリペプチドをコードし得る。
【００１９】さらに好適な実施形態において、本発明の
上記ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０
号として寄託されるＫ+チャンネル２ポリペプチドをコ
ードする配列を有し得る。
上記ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０
号として寄託されるＫ+チャンネル２ポリペプチドをコ
ードする配列を有し得る。
【００２０】さらに好適な実施形態において、本発明
は、上記のＤＮＡを含むベクターを提供し得る。
は、上記のＤＮＡを含むベクターを提供し得る。
【００２１】さらに好適な実施形態において、本発明
は、上記のベクターを用いて遺伝的に操作された宿主細
胞を提供し得る。
は、上記のベクターを用いて遺伝的に操作された宿主細
胞を提供し得る。
【００２２】別の局面において、本発明は、上記の宿主
細胞から上記ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを
発現させる工程を包含する、ポリペプチドを生成するた
めのプロセスを提供し得る。
細胞から上記ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを
発現させる工程を包含する、ポリペプチドを生成するた
めのプロセスを提供し得る。
【００２３】別の局面において、本発明は、上記のベク
ターを用いて細胞を遺伝的に操作する工程を包含する、
ポリペプチドを発現し得る細胞を生成するためのプロセ
スを提供し得る。
ターを用いて細胞を遺伝的に操作する工程を包含する、
ポリペプチドを発現し得る細胞を生成するためのプロセ
スを提供し得る。
【００２４】別の局面において、本発明は、上記のＤＮ
Ａにハイブリダイズ可能であり、かつＫ+チャンネル１
ポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードする、
単離されたＤＮＡを提供し得る。
Ａにハイブリダイズ可能であり、かつＫ+チャンネル１
ポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードする、
単離されたＤＮＡを提供し得る。
【００２５】別の局面において、本発明は、上記のＤＮ
Ａにハイブリダイズ可能であり、かつＫ+チャンネル２
ポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードする、
単離されたＤＮＡを提供し得る。
Ａにハイブリダイズ可能であり、かつＫ+チャンネル２
ポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードする、
単離されたＤＮＡを提供し得る。
【００２６】別の局面において、本発明は、（ｉ）図１
の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャンネル１ポリペプ
チド、ならびにそのフラグメント、そのアナログ、およ
びその誘導体；（ｉｉ）図２の推定アミノ酸配列を有す
るＫ+チャンネル２ポリペプチド、ならびにそのフラグ
メント、そのアナログ、およびその誘導体；（ｉｉｉ）
ＡＴＣＣ寄託番号第７５７００号のｃＤＮＡによりコー
ドされるＫ+チャンネル１ポリペプチド、ならびに該ポ
リペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体；
および（ｉｖ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０号のｃＤ
ＮＡによりコードされるＫ+チャンネル２ポリペプチ
ド、ならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナロ
グ、および誘導体、からなる群から選択される、ポリペ
プチドを提供し得る。
の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャンネル１ポリペプ
チド、ならびにそのフラグメント、そのアナログ、およ
びその誘導体；（ｉｉ）図２の推定アミノ酸配列を有す
るＫ+チャンネル２ポリペプチド、ならびにそのフラグ
メント、そのアナログ、およびその誘導体；（ｉｉｉ）
ＡＴＣＣ寄託番号第７５７００号のｃＤＮＡによりコー
ドされるＫ+チャンネル１ポリペプチド、ならびに該ポ
リペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体；
および（ｉｖ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０号のｃＤ
ＮＡによりコードされるＫ+チャンネル２ポリペプチ
ド、ならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナロ
グ、および誘導体、からなる群から選択される、ポリペ
プチドを提供し得る。
【００２７】好適な実施形態において、本発明の上記ポ
リペプチドが図１の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル１ポリペプチドであり得る。
リペプチドが図１の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル１ポリペプチドであり得る。
【００２８】好適な実施形態において、本発明の上記ポ
リペプチドが図２の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル２ポリペプチドであり得る。
リペプチドが図２の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル２ポリペプチドであり得る。
【００２９】別の局面において、本発明は、上記のポリ
ペプチドに対する抗体を提供し得る。
ペプチドに対する抗体を提供し得る。
【００３０】別の局面において、本発明は、上記のポリ
ペプチドに対するアゴニストを提供し得る。
ペプチドに対するアゴニストを提供し得る。
【００３１】別の局面において、本発明は、上記のポリ
ペプチドに対するアンタゴニストを提供し得る。
ペプチドに対するアンタゴニストを提供し得る。
【００３２】別の局面において、本発明は、Ｋ+チャン
ネル１ポリペプチドに対するアゴニストの必要を有する
患者の処置のための方法であって、患者に治療有効量の
上記のアゴニストを投与する工程を包含する、方法を提
供し得る。
ネル１ポリペプチドに対するアゴニストの必要を有する
患者の処置のための方法であって、患者に治療有効量の
上記のアゴニストを投与する工程を包含する、方法を提
供し得る。
【００３３】別の局面において、本発明は、Ｋ+チャン
ネル２ポリペプチドに対するアゴニストの必要を有する
患者の処置のための方法であって、患者に治療有効量の
上記のアゴニストを投与する工程を包含する、方法を提
供し得る。
ネル２ポリペプチドに対するアゴニストの必要を有する
患者の処置のための方法であって、患者に治療有効量の
上記のアゴニストを投与する工程を包含する、方法を提
供し得る。
【００３４】別の局面において、本発明は、Ｋ+チャン
ネル１ポリペプチドを阻害する必要を有する患者の処置
のための方法であって、該患者に治療有効量の上記のア
ンタゴニスト／インヒビターを投与する工程、を包含す
る、方法を提供し得る。
ネル１ポリペプチドを阻害する必要を有する患者の処置
のための方法であって、該患者に治療有効量の上記のア
ンタゴニスト／インヒビターを投与する工程、を包含す
る、方法を提供し得る。
【００３５】別の局面において、本発明は、Ｋ+チャン
ネル２ポリペプチドを阻害する必要を有する患者の処置
のための方法であって、患者に治療有効量の上記のアン
タゴニストを投与する工程、を包含する、方法を提供し
得る。
ネル２ポリペプチドを阻害する必要を有する患者の処置
のための方法であって、患者に治療有効量の上記のアン
タゴニストを投与する工程、を包含する、方法を提供し
得る。
【００３６】別の局面において、本発明は、Ｋ+チャン
ネル発現に調節効果を有する分子を同定するための方法
であって、Ｋ+チャンネル遺伝子の機能性Ｋ+チャンネル
発現産物を産生する発現系を提供する工程；産物と、産
物の生物活性におけるその調節効果を決定するための１
つ以上の分子とを接触させる工程；およびＫ+チャンネ
ル発現を調節し得る候補物を該分子より選択する工程、
を包含する、方法を提供し得る。
ネル発現に調節効果を有する分子を同定するための方法
であって、Ｋ+チャンネル遺伝子の機能性Ｋ+チャンネル
発現産物を産生する発現系を提供する工程；産物と、産
物の生物活性におけるその調節効果を決定するための１
つ以上の分子とを接触させる工程；およびＫ+チャンネ
ル発現を調節し得る候補物を該分子より選択する工程、
を包含する、方法を提供し得る。
【００３７】
【発明の実施の形態】本発明の１つの局面によれば、Ｋ
+チャンネルタンパク質、ならびにそのフラグメント、
アナログ、および誘導体である新規の成熟ポリペプチド
が提供される。本発明のポリペプチドはヒト起源であ
る。
+チャンネルタンパク質、ならびにそのフラグメント、
アナログ、および誘導体である新規の成熟ポリペプチド
が提供される。本発明のポリペプチドはヒト起源であ
る。
【００３８】本発明の別の局面によれば、このようなポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまた
はＲＮＡ）が提供される。
リペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまた
はＲＮＡ）が提供される。
【００３９】本発明のなおさらなる局面によれば、組換
え技術によってこのようなポリペプチドを産生するプロ
セスが提供される。
え技術によってこのようなポリペプチドを産生するプロ
セスが提供される。
【００４０】本発明のなおさらなる局面によれば、Ｋ+
チャンネルポリペプチドのアゴニストが提供され、この
アゴニストは例えば、高血圧症、てんかん、発作、ぜん
息、パーキンソン病、精神分裂症、不安、鬱病および神
経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を処置
するための治療目的のために用いられ得る。
チャンネルポリペプチドのアゴニストが提供され、この
アゴニストは例えば、高血圧症、てんかん、発作、ぜん
息、パーキンソン病、精神分裂症、不安、鬱病および神
経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を処置
するための治療目的のために用いられ得る。
【００４１】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドに対する抗体が提供され、この抗体
は自己免疫疾患およびガンの検出のための診断アッセイ
の一部として用いられ得る。
ようなポリペプチドに対する抗体が提供され、この抗体
は自己免疫疾患およびガンの検出のための診断アッセイ
の一部として用いられ得る。
【００４２】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドに対するアンタゴニスト／インヒビ
ターが提供され、このアンタゴニスト／インヒビターは
例えば、偏頭痛、自己免疫疾患、ガン、および移植片拒
絶の処置において、このようなポリペプチドの作用を阻
害するために用いられ得る。
ようなポリペプチドに対するアンタゴニスト／インヒビ
ターが提供され、このアンタゴニスト／インヒビターは
例えば、偏頭痛、自己免疫疾患、ガン、および移植片拒
絶の処置において、このようなポリペプチドの作用を阻
害するために用いられ得る。
【００４３】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示より、当業者に明確であるべきである。
書中の教示より、当業者に明確であるべきである。
【００４４】本発明の局面によれば、図１の推定アミノ
酸配列を有する成熟Ｋ+チャンネル１ポリペプチドをコ
ードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）、または
１９９４年３月４日にＡＴＣＣ寄託番号第７５７００号
として寄託されるクローンのｃＤＮＡによりコードされ
る成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリ
ヌクレオチド）が提供される。
酸配列を有する成熟Ｋ+チャンネル１ポリペプチドをコ
ードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）、または
１９９４年３月４日にＡＴＣＣ寄託番号第７５７００号
として寄託されるクローンのｃＤＮＡによりコードされ
る成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリ
ヌクレオチド）が提供される。
【００４５】本発明の別の局面によれば、図２の推定ア
ミノ酸配列を有する成熟Ｋ+チャンネル２ポリペプチド
をコードする単離された核酸、または１９９４年７月１
５日にＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０号として寄託され
るクローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードする単離された核酸が提供される。
ミノ酸配列を有する成熟Ｋ+チャンネル２ポリペプチド
をコードする単離された核酸、または１９９４年７月１
５日にＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０号として寄託され
るクローンのｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードする単離された核酸が提供される。
【００４６】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、脳、骨格筋、および胎盤組織より得られ
得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの脳由来のｃ
ＤＮＡライブラリーにおいて発見された。それらは構造
的に、Ｋ+チャンネル遺伝子ファミリーと関連する。
Ｋ+チャンネル１ポリペプチドは、約５１３アミノ酸残
基のポリペプチドをコードするオープンリーディングフ
レームを含有する。このポリペプチドは、ｄｒｋ１タン
パク質に対して、４００アミノ酸の範囲にわたり、約４
０％の同一性および６５％の類似性を有し、高度な相同
性を示す。
クレオチドは、脳、骨格筋、および胎盤組織より得られ
得る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの脳由来のｃ
ＤＮＡライブラリーにおいて発見された。それらは構造
的に、Ｋ+チャンネル遺伝子ファミリーと関連する。
Ｋ+チャンネル１ポリペプチドは、約５１３アミノ酸残
基のポリペプチドをコードするオープンリーディングフ
レームを含有する。このポリペプチドは、ｄｒｋ１タン
パク質に対して、４００アミノ酸の範囲にわたり、約４
０％の同一性および６５％の類似性を有し、高度な相同
性を示す。
【００４７】本発明のＫ+チャンネル２ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドは、ヒトの脳由来のｃＤＮ
Ａライブラリーにおいて発見された。それらは構造的
に、Ｋ +チャンネル遺伝子ファミリーに関連する。Ｋ+チ
ャンネル２ポリペプチドは、約４９４アミノ酸残基のポ
リペプチドをコードするオープンリーディングフレーム
を含有する。このポリペプチドは、ヒトＤＲＫ１タンパ
ク質に対して、４８８アミノ酸の範囲にわたり、約４０
％の同一性および６６％の類似性を有し、高度な相同性
を示す。
コードするポリヌクレオチドは、ヒトの脳由来のｃＤＮ
Ａライブラリーにおいて発見された。それらは構造的
に、Ｋ +チャンネル遺伝子ファミリーに関連する。Ｋ+チ
ャンネル２ポリペプチドは、約４９４アミノ酸残基のポ
リペプチドをコードするオープンリーディングフレーム
を含有する。このポリペプチドは、ヒトＤＲＫ１タンパ
ク質に対して、４８８アミノ酸の範囲にわたり、約４０
％の同一性および６６％の類似性を有し、高度な相同性
を示す。
【００４８】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡ（このＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、および合成ＤＮＡを包含する）の形態であり得る。
ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖は
コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得
る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１
および図２に示すコード配列または寄託したクローンの
コード配列と同一であり得、あるいはそのコード配列
が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１お
よび図２のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポ
リペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。
態またはＤＮＡ（このＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、および合成ＤＮＡを包含する）の形態であり得る。
ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖は
コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得
る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１
および図２に示すコード配列または寄託したクローンの
コード配列と同一であり得、あるいはそのコード配列
が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１お
よび図２のＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポ
リペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。
【００４９】図１および図２の成熟ポリペプチドまたは
寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドは、以下を包含し得る：
成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチド
のコード配列およびリーダー配列または分泌配列のよう
なさらなるコード配列；成熟ポリペプチド（および必要
に応じて、さらなるコード配列）のコード配列および非
コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチ
ドのコード配列の５’および／または３’非コード配
列）。
寄託したｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドは、以下を包含し得る：
成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチド
のコード配列およびリーダー配列または分泌配列のよう
なさらなるコード配列；成熟ポリペプチド（および必要
に応じて、さらなるコード配列）のコード配列および非
コード配列（例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチ
ドのコード配列の５’および／または３’非コード配
列）。
【００５０】したがって、用語「ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列
のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード
配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチ
ドを包含する。
するポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列
のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード
配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチ
ドを包含する。
【００５１】本発明はさらに、図１および図２の推定ア
ミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクロー
ンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグ
メント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書
中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌク
レオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然の対立遺
伝子変異体またはポリヌクレオチドの非天然の変異体で
あり得る。
ミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクロー
ンのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグ
メント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書
中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌク
レオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然の対立遺
伝子変異体またはポリヌクレオチドの非天然の変異体で
あり得る。
【００５２】したがって、本発明は、図１および図２に
示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクロー
ンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポ
リヌクレオチドの変異体を包含する。この変異体は、図
１および図２のポリペプチドまたは寄託したクローンの
ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体、またはアナログをコードする。このような
ヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、およ
び付加または挿入変異体を包含する。
示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託したクロー
ンのｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポ
リヌクレオチドの変異体を包含する。この変異体は、図
１および図２のポリペプチドまたは寄託したクローンの
ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、誘導体、またはアナログをコードする。このような
ヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、およ
び付加または挿入変異体を包含する。
【００５３】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１および図２に示すコード配列または寄
託したクローンのコード配列の天然の対立遺伝子変異体
であるコード配列を有し得る。当該分野で公知であるよ
うに、対立遺伝子変異体は、１つ以上のヌクレオチドの
置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配
列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチド
の機能を実質的には変化させない。
レオチドは、図１および図２に示すコード配列または寄
託したクローンのコード配列の天然の対立遺伝子変異体
であるコード配列を有し得る。当該分野で公知であるよ
うに、対立遺伝子変異体は、１つ以上のヌクレオチドの
置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配
列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチド
の機能を実質的には変化させない。
【００５４】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合ではマーカーに融合された成熟
ポリペプチドの精製を提供するｐＱＥ−９ベクターによ
り供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。また
は、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、
ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、ヘマグルチニン
（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザ
ヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する
（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ、３７：７６７
（１９８４））。
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合ではマーカーに融合された成熟
ポリペプチドの精製を提供するｐＱＥ−９ベクターによ
り供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。また
は、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、
ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、ヘマグルチニン
（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザ
ヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する
（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ、３７：７６７
（１９８４））。
【００５５】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％および好ましくは７０％の同一性が存在する場合、本
明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌ
クレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いら
れる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイ
ゼーションが配列間に少なくとも９５％および好ましく
は少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じ
ることをいう。好ましい実施態様において本明細書中上
記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドは、図１および図２のｃＤＮＡまたは寄託したｃ
ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に
同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペ
プチドをコードする。
％および好ましくは７０％の同一性が存在する場合、本
明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌ
クレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いら
れる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイ
ゼーションが配列間に少なくとも９５％および好ましく
は少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じ
ることをいう。好ましい実施態様において本明細書中上
記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドは、図１および図２のｃＤＮＡまたは寄託したｃ
ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に
同じ生物学的機能または生物学的活性を保持するポリペ
プチドをコードする。
【００５６】本明細書中でいう寄託物（１つまたは複
数）は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これ
らの寄託物は、当業者への便宜上のみ提供され、そして
米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされることを
容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオ
チドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用さ
れており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる
矛盾の場合も制御されている。寄託物を製造し、使用
し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、
そしてこのような実施許諾はこれによって与えられるわ
けではない。
数）は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これ
らの寄託物は、当業者への便宜上のみ提供され、そして
米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされることを
容認するものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオ
チドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用さ
れており、そして本明細書中の配列の記載とのいかなる
矛盾の場合も制御されている。寄託物を製造し、使用
し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、
そしてこのような実施許諾はこれによって与えられるわ
けではない。
【００５７】本発明はさらに、図１および図２の推定ア
ミノ酸配列を有するまたは寄託したｃＤＮＡによりコー
ドされるアミノ酸配列を有するＫ+チャンネルポリペプ
チド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメン
ト、アナログ、および誘導体に関する。
ミノ酸配列を有するまたは寄託したｃＤＮＡによりコー
ドされるアミノ酸配列を有するＫ+チャンネルポリペプ
チド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメン
ト、アナログ、および誘導体に関する。
【００５８】用語「フラグメント」、「誘導体」、およ
び「アナログ」は、図１および図２のポリペプチドまた
は寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを
いう場合は、このようなポリペプチドと本質的に同じ生
物学的機能または生物学的活性を保持するか、あるいは
Ｋ+チャンネルポリペプチドのリガンドに結合する能力
を保持するがこのようなポリペプチドの可溶性形態であ
り、そして、それゆえ、何の機能も引き出さないかのい
ずれかのポリペプチドであることを意味する。
び「アナログ」は、図１および図２のポリペプチドまた
は寄託したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを
いう場合は、このようなポリペプチドと本質的に同じ生
物学的機能または生物学的活性を保持するか、あるいは
Ｋ+チャンネルポリペプチドのリガンドに結合する能力
を保持するがこのようなポリペプチドの可溶性形態であ
り、そして、それゆえ、何の機能も引き出さないかのい
ずれかのポリペプチドであることを意味する。
【００５９】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドで
あり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
チド、天然のポリペプチド、または合成ポリペプチドで
あり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
【００６０】図１および図２のポリペプチドまたは寄託
したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグ
メント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）その中で１
つ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基
（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこ
のような置換されるアミノ酸残基が、この遺伝コードに
よりコードされるアミノ酸残基であり得るかまたはあり
得ないフラグメント、誘導体、またはアナログ、または
（ｉｉ）その中で１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含
有するフラグメント、誘導体、またはアナログ、または
（ｉｉｉ）その中で成熟ポリペプチドがポリペプチドの
半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリ
コール）のような別の化合物に融合されているフラグメ
ント、誘導体、またはアナログ、または（ｉｖ）その中
で成熟ポリペプチドにさらなるアミノ酸（例えば、リー
ダー配列または分泌配列あるいは成熟ポリペプチドの精
製に用いられる配列）が融合されるフラグメント、誘導
体、またはアナログであり得る。このようなフラグメン
ト、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示か
ら、当業者の範囲内にあると考えられる。
したｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグ
メント、誘導体、またはアナログは、（ｉ）その中で１
つ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基
（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこ
のような置換されるアミノ酸残基が、この遺伝コードに
よりコードされるアミノ酸残基であり得るかまたはあり
得ないフラグメント、誘導体、またはアナログ、または
（ｉｉ）その中で１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含
有するフラグメント、誘導体、またはアナログ、または
（ｉｉｉ）その中で成熟ポリペプチドがポリペプチドの
半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリ
コール）のような別の化合物に融合されているフラグメ
ント、誘導体、またはアナログ、または（ｉｖ）その中
で成熟ポリペプチドにさらなるアミノ酸（例えば、リー
ダー配列または分泌配列あるいは成熟ポリペプチドの精
製に用いられる配列）が融合されるフラグメント、誘導
体、またはアナログであり得る。このようなフラグメン
ト、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示か
ら、当業者の範囲内にあると考えられる。
【００６１】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均質に精製される。
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均質に精製される。
【００６２】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドは、単離されないが、天然系において共存する物
質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドが、単離される。このような
ポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および
／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドは、組成物の一部であり得、そしてさらにこのような
ベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではない
ため単離され得る。
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドは、単離されないが、天然系において共存する物
質の幾らかまたは全部から分離された同一のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドが、単離される。このような
ポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および
／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドは、組成物の一部であり得、そしてさらにこのような
ベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではない
ため単離され得る。
【００６３】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術によって本発明のポ
リペプチドを生成することに関する。
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術によって本発明のポ
リペプチドを生成することに関する。
【００６４】宿主細胞は、本発明のベクター（これは例
えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり
得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換ま
たはトランスフェクト）される。ベクターは、例えば、
プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり
得る。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、
形質転換体の選択、またはＫ+チャンネルタンパク質遺
伝子の増幅のために適切に改変した従来の栄養培地中で
培養され得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）
は、発現のために選択される宿主細胞で以前に使用され
た条件であり、そして当業者には明らかである。
えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり
得る）を用いて遺伝子操作（形質導入または形質転換ま
たはトランスフェクト）される。ベクターは、例えば、
プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり
得る。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、
形質転換体の選択、またはＫ+チャンネルタンパク質遺
伝子の増幅のために適切に改変した従来の栄養培地中で
培養され得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）
は、発現のために選択される宿主細胞で以前に使用され
た条件であり、そして当業者には明らかである。
【００６５】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを生成するために用いられ得る。し
たがって、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチド
を発現するための種々の発現ベクターのいずれかに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、お
よび合成ＤＮＡ配列を包含し、例えば、ＳＶ４０の誘導
体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウィ
ルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮ
Ａの組み合わせから得られるベクター、ワクシニア、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のよう
なウイルスＤＮＡである。しかし、宿主において複製可
能で、そして存続可能である限り、任意の他のプラスミ
ドまたはベクターも使用され得る。
によりポリペプチドを生成するために用いられ得る。し
たがって、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチド
を発現するための種々の発現ベクターのいずれかに含ま
れ得る。このようなベクターは、染色体、非染色体、お
よび合成ＤＮＡ配列を包含し、例えば、ＳＶ４０の誘導
体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウィ
ルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮ
Ａの組み合わせから得られるベクター、ワクシニア、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のよう
なウイルスＤＮＡである。しかし、宿主において複製可
能で、そして存続可能である限り、任意の他のプラスミ
ドまたはベクターも使用され得る。
【００６６】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は当該分野
で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位
（単数または複数）に挿入される。このような手順およ
び他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられ
る。
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は当該分野
で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位
（単数または複数）に挿入される。このような手順およ
び他の手順は、当業者に公知の範囲内であると考えられ
る。
【００６７】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発
現制御配列（１つまたは複数）（プロモーター）に作動
可能に連結され、ｍＲＮＡの合成を指示する。このよう
なプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ
得る：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、λファージＰLプロモータ
ー、および原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそ
のウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知であ
る他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始の
ためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを
含む。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配
列を含み得る。
現制御配列（１つまたは複数）（プロモーター）に作動
可能に連結され、ｍＲＮＡの合成を指示する。このよう
なプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ
得る：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、λファージＰLプロモータ
ー、および原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそ
のウイルス内で遺伝子の発現を制御することが公知であ
る他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始の
ためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを
含む。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配
列を含み得る。
【００６８】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダク
ターゼまたはネオマイシン耐性、またはＥ． ｃｏｌｉ
におけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐
性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダク
ターゼまたはネオマイシン耐性、またはＥ． ｃｏｌｉ
におけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐
性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含む。
【００６９】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含む
ベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク
質を発現させるために用いられ得る。
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含む
ベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク
質を発現させるために用いられ得る。
【００７０】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆
虫細胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｆ
９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９
３、またはＢｏｗｅｓ黒色腫）；植物細胞など。適切な
宿主の選択は、本明細書中の教示により当業者の範囲内
であると考えられる。
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆
虫細胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｆ
９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９
３、またはＢｏｗｅｓ黒色腫）；植物細胞など。適切な
宿主の選択は、本明細書中の教示により当業者の範囲内
であると考えられる。
【００７１】さらに詳細には、本発明はまた、上で広範
に記載した１以上の配列を含む組換え構築物を包含す
る。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクター
またはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中
には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されてい
る。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物はさ
らに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、
プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベクタ
ーおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして
購入可能である。以下のベクターが例として提供され
る。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９
（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐ
ｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、
ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
真核生物性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４
４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐ
ＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ （Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）。しかし、宿主において複製可能で、そし
て存続可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベ
クターも使用され得る。
に記載した１以上の配列を含む組換え構築物を包含す
る。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクター
またはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中
には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されてい
る。この実施態様の好ましい局面によれば、構築物はさ
らに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、
プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベクタ
ーおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして
購入可能である。以下のベクターが例として提供され
る。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９
（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐ
ｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、
ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
真核生物性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４
４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐ
ＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ （Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）。しかし、宿主において複製可能で、そし
て存続可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベ
クターも使用され得る。
【００７２】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐ
ＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特によく知られ
た細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ
７、ｇｐｔ、λＰR、ＰL、およびｔｒｐを包含する。真
核プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナ
ーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウイル
ス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩを包
含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、
十分に当業者のレベルの範囲内にある。
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐ
ＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特によく知られ
た細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ
７、ｇｐｔ、λＰR、ＰL、およびｔｒｐを包含する。真
核プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナ
ーゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウイル
ス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩを包
含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、
十分に当業者のレベルの範囲内にある。
【００７３】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生
物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または原核
生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿
主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、またはエレクトロポレーションにより達成され得る
（Ｄａｖｉｓ， Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ， Ｍ．、Ｂａｔ
ｔｅｙ， Ｉ．、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８６）。
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生
物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または原核
生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿
主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、またはエレクトロポレーションにより達成され得る
（Ｄａｖｉｓ， Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ， Ｍ．、Ｂａｔ
ｔｅｙ， Ｉ．、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８６）。
【００７４】宿主細胞中の構築物は、組換え配列により
コードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法
で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、
従来のペプチド合成機により合成的に生成され得る。
コードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法
で使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、
従来のペプチド合成機により合成的に生成され得る。
【００７５】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタン
パク質を生成するために、本発明のＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを使用して用いられ得る。原核生物宿主およ
び真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用されている）に記載さ
れている。
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、このようなタン
パク質を生成するために、本発明のＤＮＡ構築物に由来
するＲＮＡを使用して用いられ得る。原核生物宿主およ
び真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）（この開示
は、本明細書中に参考として援用されている）に記載さ
れている。
【００７６】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用因子であり、通常は約１０〜約３００
ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその転写を
増大させる。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０
エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウ
イルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後
期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーを包含する。
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用因子であり、通常は約１０〜約３００
ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその転写を
増大させる。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０
エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウ
イルスの早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後
期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス
エンハンサーを包含する。
【００７７】一般に、組換え発現ベクターは、複製起点
および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー
（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子お
よびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）お
よび下流の構造配列の転写を指示する、高発現遺伝子に
由来するプロモーターを含有する。このようなプロモー
ターは、特に解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼ、
または熱ショックタンパク質）をコードするオペロンに
由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳
終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質を細
胞周辺腔または細胞外培地へ分泌することを指示し得る
リーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じ
て、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換
え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末
端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
および宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー
（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子お
よびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）お
よび下流の構造配列の転写を指示する、高発現遺伝子に
由来するプロモーターを含有する。このようなプロモー
ターは、特に解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼ、
または熱ショックタンパク質）をコードするオペロンに
由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳
終止配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質を細
胞周辺腔または細胞外培地へ分泌することを指示し得る
リーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じ
て、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換
え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末
端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００７８】細菌での使用に有用な発現ベクターは、機
能的なプロモーターと作動可能な読みとり相で、所望の
タンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を適切な翻訳開
始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入すること
により構築される。ベクターは、１以上の表現型選択マ
ーカー、ならびに、ベクターの維持を確実にするため、
および所望の場合に宿主内での増幅を提供するために複
製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿
主は、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象と
して用いられ得る。
能的なプロモーターと作動可能な読みとり相で、所望の
タンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を適切な翻訳開
始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿入すること
により構築される。ベクターは、１以上の表現型選択マ
ーカー、ならびに、ベクターの維持を確実にするため、
および所望の場合に宿主内での増幅を提供するために複
製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿
主は、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象と
して用いられ得る。
【００７９】代表的な、しかし限定されない例として、
細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニ
ングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の
遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択
マーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。このような
市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐ
ｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）
を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適
切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み
合わされる。
細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニ
ングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の
遺伝エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択
マーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。このような
市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐ
ｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）
を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適
切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み
合わされる。
【００８０】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモータ
ーは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により脱抑制され、そして細胞はさらなる期間培養
される。
密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモータ
ーは、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により脱抑制され、そして細胞はさらなる期間培養
される。
【００８１】細胞は、代表的には遠心分離により回収さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞
は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、また
は細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により
破砕され得る。このような方法は、当該分野において周
知である。
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞
は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、また
は細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により
破砕され得る。このような方法は、当該分野において周
知である。
【００８２】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ、２３： １
７５（１９８１）に記載されているサル腎臓繊維芽細胞
のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る
他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅ
Ｌａ、およびＢＨＫ細胞株）を包含する。哺乳動物発現
ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエン
ハンサー、ならびにまた、任意の必要なリボソーム結合
部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およ
びスプライスアクセプター部位、転写終止配列、および
５’フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０のスプラ
イス部位、およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ
配列は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために
使用され得る。
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ、２３： １
７５（１９８１）に記載されているサル腎臓繊維芽細胞
のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る
他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅ
Ｌａ、およびＢＨＫ細胞株）を包含する。哺乳動物発現
ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエン
ハンサー、ならびにまた、任意の必要なリボソーム結合
部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およ
びスプライスアクセプター部位、転写終止配列、および
５’フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０のスプラ
イス部位、およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ
配列は、必要な非転写遺伝エレメントを提供するために
使用され得る。
【００８３】Ｋ+チャンネルポリペプチドは、以下の方
法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製さ
れる。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー、およびレクチンクロマトグラフィーが包含される。
必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌ
ｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質の立体配置を完全に
するために使用され得る。最終的に、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工程に用いら
れ得る。
法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製さ
れる。これらの方法には、硫安沈殿またはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー、およびレクチンクロマトグラフィーが包含される。
必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（ｒｅｆｏｌ
ｄｉｎｇ）工程が、成熟タンパク質の立体配置を完全に
するために使用され得る。最終的に、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製工程に用いら
れ得る。
【００８４】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物
中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細
胞）から組換え技術により生成され得る。組換え産生手
順に用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチド
は、哺乳動物または他の真核生物性の糖質でグリコシル
化してもよく、あるいはグリコシル化しなくてもよい。
本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸
残基を含み得る。
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物
中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細
胞）から組換え技術により生成され得る。組換え産生手
順に用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチド
は、哺乳動物または他の真核生物性の糖質でグリコシル
化してもよく、あるいはグリコシル化しなくてもよい。
本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸
残基を含み得る。
【００８５】本発明は、本発明のＫ+チャンネルポリペ
プチドにおける調節効果（例えば、薬剤、アゴニストま
たはアンタゴニスト）を有する分子の同定のアッセイに
関する。このようなアッセイは、本発明のＤＮＡにコー
ドされる機能的Ｋ+チャンネル発現産物を産生する発現
系を提供する工程、１つ以上の分子をこの発現系または
この発現系の産物に接触させ、産物の生物活性における
その調節効果を決定する工程、およびＫ+チャンネル発
現を調節可能な候補物をこれらの分子より選択する工程
を包含する。
プチドにおける調節効果（例えば、薬剤、アゴニストま
たはアンタゴニスト）を有する分子の同定のアッセイに
関する。このようなアッセイは、本発明のＤＮＡにコー
ドされる機能的Ｋ+チャンネル発現産物を産生する発現
系を提供する工程、１つ以上の分子をこの発現系または
この発現系の産物に接触させ、産物の生物活性における
その調節効果を決定する工程、およびＫ+チャンネル発
現を調節可能な候補物をこれらの分子より選択する工程
を包含する。
【００８６】Ｋ+チャンネルオープナーのアンタゴニス
ト（上記方法により同定されるアンタゴニストを含む）
は、Ｋ+チャンネルオープナーであり、Ｋ+イオンの流動
を増加し、それゆえ、てんかん、発作、高血圧症、ぜん
息、パーキンソン病、精神分裂症、不安、鬱病および神
経衰弱の処置に有効である。本出願人は、これら治療的
利用を裏付ける科学的理論を限定することを望まない
が、脳、神経系および心筋におけるＫ+チャンネルタン
パク質の高レベルの局在化、本発明のＫ+チャンネルを
介するＫ+イオンの流動は、イオン平衡およびそれと同
時に生じる治療結果を提供する。
ト（上記方法により同定されるアンタゴニストを含む）
は、Ｋ+チャンネルオープナーであり、Ｋ+イオンの流動
を増加し、それゆえ、てんかん、発作、高血圧症、ぜん
息、パーキンソン病、精神分裂症、不安、鬱病および神
経衰弱の処置に有効である。本出願人は、これら治療的
利用を裏付ける科学的理論を限定することを望まない
が、脳、神経系および心筋におけるＫ+チャンネルタン
パク質の高レベルの局在化、本発明のＫ+チャンネルを
介するＫ+イオンの流動は、イオン平衡およびそれと同
時に生じる治療結果を提供する。
【００８７】本発明のＫ+チャンネルポリペプチドに対
する潜在的アンタゴニストは、Ｋ+チャンネルポリペプ
チドに対する抗体、またはいくつかの場合、Ｋ+チャン
ネルポリペプチドに結合し、そしてＫ+イオンがチャン
ネルを通過しないようにポリペプチドのコンフォメーシ
ョンを変えるオリゴヌクレオチドを包含する。可溶性Ｋ
+チャンネル１ポリペプチドはまた、血流に投与し、遊
離Ｋ+イオンに結合させ、そしてその結果、インビボに
おいて遊離Ｋ+イオン濃度を減少させることにより、ア
ンタゴニストとして用いられ得る。
する潜在的アンタゴニストは、Ｋ+チャンネルポリペプ
チドに対する抗体、またはいくつかの場合、Ｋ+チャン
ネルポリペプチドに結合し、そしてＫ+イオンがチャン
ネルを通過しないようにポリペプチドのコンフォメーシ
ョンを変えるオリゴヌクレオチドを包含する。可溶性Ｋ
+チャンネル１ポリペプチドはまた、血流に投与し、遊
離Ｋ+イオンに結合させ、そしてその結果、インビボに
おいて遊離Ｋ+イオン濃度を減少させることにより、ア
ンタゴニストとして用いられ得る。
【００８８】潜在的アンタゴニストはまた、アンチセン
ス技術により産生されるアンチセンス構築体を含む。ア
ンチセンス技術は、三重らせん形成などを介した遺伝子
発現の制御をする。Ｋ+チャンネルの数は、三重らせん
形成あるいはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介し遺
伝子発現を制御するアンチセンス技術（ともに、ポリヌ
クレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡに結合することに基づ
く方法）を介して減少し得る。例えば、本発明の成熟ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コ
ード部分は、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領
域に相補的に設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃ
ｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６：３０７３ （１９
７９）； Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４
１：４５６ （１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ， ２５１： １３６０ （１９９１）参
照）、それにより、転写およびＫ+チャンネルポリペプ
チドの産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌク
レオチドはインビボでｍＲＮＡとハイブリダイズし、そ
してｍＲＮＡ分子のＫ +チャンネルポリペプチドへの翻
訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ、Ｊ．
Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ５６：５６０ （１９９
１）； Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８
８））。アンチセンス構築物は、当該分野において公知
の手順により、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがイン
ビボで発現し得るように細胞へ送達され得る。
ス技術により産生されるアンチセンス構築体を含む。ア
ンチセンス技術は、三重らせん形成などを介した遺伝子
発現の制御をする。Ｋ+チャンネルの数は、三重らせん
形成あるいはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介し遺
伝子発現を制御するアンチセンス技術（ともに、ポリヌ
クレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡに結合することに基づ
く方法）を介して減少し得る。例えば、本発明の成熟ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コ
ード部分は、長さ約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領
域に相補的に設計され（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃ
ｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６：３０７３ （１９
７９）； Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４
１：４５６ （１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ， ２５１： １３６０ （１９９１）参
照）、それにより、転写およびＫ+チャンネルポリペプ
チドの産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌク
レオチドはインビボでｍＲＮＡとハイブリダイズし、そ
してｍＲＮＡ分子のＫ +チャンネルポリペプチドへの翻
訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ、Ｊ．
Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ５６：５６０ （１９９
１）； Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８
８））。アンチセンス構築物は、当該分野において公知
の手順により、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがイン
ビボで発現し得るように細胞へ送達され得る。
【００８９】潜在的アンタゴニストの他の例は、Ｋ+チ
ャンネルポリペプチドに結合し、そしてＫ+チャンネル
ポリペプチドの開口部を塞ぎ、それにより、Ｋ+イオン
のチャンネル通過を不可能にし、その結果、正常な生物
学的活性を妨害する小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕ
ｌｅ）を包含する。小分子の例は、小ペプチドまたはペ
プチド様分子を包含するが、これらに制限されない。
ャンネルポリペプチドに結合し、そしてＫ+チャンネル
ポリペプチドの開口部を塞ぎ、それにより、Ｋ+イオン
のチャンネル通過を不可能にし、その結果、正常な生物
学的活性を妨害する小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕ
ｌｅ）を包含する。小分子の例は、小ペプチドまたはペ
プチド様分子を包含するが、これらに制限されない。
【００９０】Ｋ+チャンネルポリペプチドにおいて効果
を発揮するアンタゴニストは、直接殺傷するかまたは自
己抗体を産生するかのいずれかにより標的組織を破壊す
る免疫系の異常細胞から生ずる自己免疫疾患を処置する
ために用いられ得る。正常な免疫応答において、Ｋ+チ
ャンネルタンパク質のｎチャンネル型は、正常Ｔ細胞に
おいて１０倍以上増加される。それゆえ、アンタゴニス
ト／インヒビターは、ＡＩＤＳ、全身性エリテマトーデ
ス、糖尿病、多発性硬化症、および移植抗原に対するリ
ンパ球媒介免疫応答を処置するために用いられ得る。ア
ンタゴニスト／インヒビターはまた、ガンおよび腫瘍
（これらは免疫学的因子と類似の関連を有する）のよう
な細胞増殖性病態の処置にも用いられ得る。アンタゴニ
スト／インヒビターは、例えば、本明細書中において以
下に記載される、薬学的に受容可能なキャリアと共に組
成物中に用いられ得る。
を発揮するアンタゴニストは、直接殺傷するかまたは自
己抗体を産生するかのいずれかにより標的組織を破壊す
る免疫系の異常細胞から生ずる自己免疫疾患を処置する
ために用いられ得る。正常な免疫応答において、Ｋ+チ
ャンネルタンパク質のｎチャンネル型は、正常Ｔ細胞に
おいて１０倍以上増加される。それゆえ、アンタゴニス
ト／インヒビターは、ＡＩＤＳ、全身性エリテマトーデ
ス、糖尿病、多発性硬化症、および移植抗原に対するリ
ンパ球媒介免疫応答を処置するために用いられ得る。ア
ンタゴニスト／インヒビターはまた、ガンおよび腫瘍
（これらは免疫学的因子と類似の関連を有する）のよう
な細胞増殖性病態の処置にも用いられ得る。アンタゴニ
スト／インヒビターは、例えば、本明細書中において以
下に記載される、薬学的に受容可能なキャリアと共に組
成物中に用いられ得る。
【００９１】本発明のＫ+チャンネルポリペプチドのア
ゴニストまたはアンタゴニストは、適切な薬学的キャリ
アと組み合わせて用いられ、薬学的組成物を構成し得
る。このような組成物は、状況に応じて治療有効量のア
ゴニストまたはアンタゴニスト、および薬学的に受容可
能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリア
としては、生理食塩液、緩衝化生理食塩液、デキストロ
ース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの
組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処
方は、投与の態様に合わせるべきである。
ゴニストまたはアンタゴニストは、適切な薬学的キャリ
アと組み合わせて用いられ、薬学的組成物を構成し得
る。このような組成物は、状況に応じて治療有効量のア
ゴニストまたはアンタゴニスト、および薬学的に受容可
能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリア
としては、生理食塩液、緩衝化生理食塩液、デキストロ
ース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの
組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処
方は、投与の態様に合わせるべきである。
【００９２】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
以上の成分で満たされた１以上の容器を含む薬学的パッ
クまたはキットを提供する。このような容器に関して、
薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統
制する政府機関により規定された形式の製品表示をし
得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使
用、または販売における機関による認可を表す。さら
に、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物と併用し
て用いられ得る。
以上の成分で満たされた１以上の容器を含む薬学的パッ
クまたはキットを提供する。このような容器に関して、
薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統
制する政府機関により規定された形式の製品表示をし
得、この製品表示はヒトへの投与についての製造、使
用、または販売における機関による認可を表す。さら
に、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物と併用し
て用いられ得る。
【００９３】薬剤組成物は、静脈内、腹膜内、筋肉内、
皮下、鼻腔内および皮内経路のような簡便な様式で投与
され得る。組成物は、特異症状の処置および／または予
防に効果的な量で投与される。一般に、組成物は少なく
とも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そして多く
の場合、それらは１日に約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない
量で投与される。多くの場合、日用量は、１日に約１０
μｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重量であり、投与
経路、症状などが考慮される。
皮下、鼻腔内および皮内経路のような簡便な様式で投与
され得る。組成物は、特異症状の処置および／または予
防に効果的な量で投与される。一般に、組成物は少なく
とも約１０μｇ／ｋｇ体重の量で投与され、そして多く
の場合、それらは１日に約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない
量で投与される。多くの場合、日用量は、１日に約１０
μｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重量であり、投与
経路、症状などが考慮される。
【００９４】ポリペプチドであるアゴニストまたはアン
タゴニストは、本発明により、インビボにおけるこのよ
うなポリペプチドの発現により用いられ得、これはしば
しば、「遺伝子治療」と称される。
タゴニストは、本発明により、インビボにおけるこのよ
うなポリペプチドの発現により用いられ得、これはしば
しば、「遺伝子治療」と称される。
【００９５】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、
当該分野で公知の手順によって操作され得る。
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者
に提供される。このような方法は当該分野で周知であ
る。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用により、
当該分野で公知の手順によって操作され得る。
【００９６】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビ
ボで細胞を操作し、そしてインビボでポリペプチドを発
現するために患者に投与され得る。このような方法によ
り本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法
または他の方法は、本発明の教示により当業者には明ら
かである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクル
は、レトロウイルス粒子以外のもの（例えば、アデノウ
イルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組
み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用さ
れ得る。
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビ
ボで細胞を操作し、そしてインビボでポリペプチドを発
現するために患者に投与され得る。このような方法によ
り本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法
または他の方法は、本発明の教示により当業者には明ら
かである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクル
は、レトロウイルス粒子以外のもの（例えば、アデノウ
イルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組
み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用さ
れ得る。
【００９７】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
であり得る。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の
位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダ
イズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能
な、実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標
識試薬はほとんどない。本発明に記載の染色体へのＤＮ
Ａのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子
とを相関させることにおいて重要な、第１の工程であ
る。
であり得る。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の
位置を特異的に標的化し、そしてその位置でハイブリダ
イズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。現在、染色体位置の標識に利用可能
な、実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標
識試薬はほとんどない。本発明に記載の染色体へのＤＮ
Ａのマッピングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子
とを相関させることにおいて重要な、第１の工程であ
る。
【００９８】簡略に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。ｃＤＮＡのコン
ピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソ
ンにまたがらず、したがって増幅プロセスを複雑化しな
いプライマーを迅速に選択するために使用される。次い
で、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有す
る体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用さ
れる。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するこれ
らのハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。ｃＤＮＡのコン
ピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多いエキソ
ンにまたがらず、したがって増幅プロセスを複雑化しな
いプライマーを迅速に選択するために使用される。次い
で、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有す
る体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用さ
れる。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するこれ
らのハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。
【００９９】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプラ
イマーと共に使用して、特定の染色体由来のフラグメン
トのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンの
プールを用いて部分的位置決め（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚ
ａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップするため
に同様に使用され得る他のマッピング戦略は、インサイ
チュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメ
トリーで選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体で
のプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡラ
イブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションに
よるプレ選択を包含する。
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプラ
イマーと共に使用して、特定の染色体由来のフラグメン
トのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローンの
プールを用いて部分的位置決め（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚ
ａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップするため
に同様に使用され得る他のマッピング戦略は、インサイ
チュハイブリダイゼーション、標識したフローサイトメ
トリーで選別した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体で
のプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡラ
イブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションに
よるプレ選択を包含する。
【０１００】ｃＤＮＡクローンの中期染色体展開物への
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用さ
れ得る。この技術は、５００または６００塩基ほどの短
いｃＤＮＡで使用され得る；しかし、２，０００ｂｐよ
りも大きいクローンの方が、簡便な検出に十分なシグナ
ル強度で特有の染色体位置に結合しやすい。ＦＩＳＨ
は、ＥＳＴが由来するクローンの使用を必要とし、そし
てこのクローンは長いほど好ましい。例えば、２，００
０ｂｐが良好であり、４，０００ｂｐはより良好であ
り、そして４，０００ｂｐを超える長さは、適度な時間
で（ａ ｒｅｓｏｎａｂｌｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｔｉｍｅ）良好な結果を得るためには、
おそらく必ずしも必要でない。この技術の総説として
は、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
ｓ： ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ． Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参照のこと。
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用さ
れ得る。この技術は、５００または６００塩基ほどの短
いｃＤＮＡで使用され得る；しかし、２，０００ｂｐよ
りも大きいクローンの方が、簡便な検出に十分なシグナ
ル強度で特有の染色体位置に結合しやすい。ＦＩＳＨ
は、ＥＳＴが由来するクローンの使用を必要とし、そし
てこのクローンは長いほど好ましい。例えば、２，００
０ｂｐが良好であり、４，０００ｂｐはより良好であ
り、そして４，０００ｂｐを超える長さは、適度な時間
で（ａ ｒｅｓｏｎａｂｌｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｔｉｍｅ）良好な結果を得るためには、
おそらく必ずしも必要でない。この技術の総説として
は、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
ｓ： ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ． Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）を参照のこと。
【０１０１】一旦配列が正確な染色体位置にマップされ
ると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝子地図の
データと相関させ得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅ
ｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ に見出される（Ｊｏｈ
ｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌ
ｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンライン
で入手可能である）。
ると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝子地図の
データと相関させ得る。このようなデータは、例えば、
Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅ
ｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ に見出される（Ｊｏｈ
ｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌ
ｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンライン
で入手可能である）。
【０１０２】物理的マッピングおよび遺伝的マッピング
技術の現在の解析を用いると、疾患に関する染色体領域
に正確に局在するｃＤＮＡは、５０と５００との間の潜
在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩
基のマッピング解析、および２０ｋｂあたり１遺伝子と
仮定する。） このポリペプチド、そのフラグメント、または他の誘導
体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現す
る細胞は、それらに対する抗体を生成させるための免疫
原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリ
クローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗
体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ラ
イブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の
手順が、このような抗体およびフラグメントの生成のた
めに使用され得る。
技術の現在の解析を用いると、疾患に関する染色体領域
に正確に局在するｃＤＮＡは、５０と５００との間の潜
在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガ塩
基のマッピング解析、および２０ｋｂあたり１遺伝子と
仮定する。） このポリペプチド、そのフラグメント、または他の誘導
体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現す
る細胞は、それらに対する抗体を生成させるための免疫
原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリ
クローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗
体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ラ
イブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の
手順が、このような抗体およびフラグメントの生成のた
めに使用され得る。
【０１０３】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られ得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次い
で、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体
に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ
ントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチ
ド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。
次いで、このような抗体は、ポリペプチドを発現する組
織からそのポリペプチドを単離するために使用され得
る。
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られ得る。この動物は、好ましくはヒトではない。次い
で、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体
に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ
ントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチ
ド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。
次いで、このような抗体は、ポリペプチドを発現する組
織からそのポリペプチドを単離するために使用され得
る。
【０１０４】モノクローナル抗体の調製のために、細胞
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎ
ａｔｕｒｅ、２５６： ４９５−４９７）、トリオーマ
技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ
ら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を生成する
ためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８
５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ
ｎｄ ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．
Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、７７−９６頁）が挙げられる。
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎ
ａｔｕｒｅ、２５６： ４９５−４９７）、トリオーマ
技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ
ら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を生成する
ためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８
５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ
ｎｄ ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．
Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、７７−９６頁）が挙げられる。
【０１０５】単鎖抗体を生成するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。
【０１０６】本発明の他の局面によれば、Ｋ+チャンネ
ル発現に媒介されるＴ細胞の活性化に関連する病状の診
断のためのアッセイが提供される。このアッセイは、試
験個体から得られるＫ+チャンネルを含むＴ細胞を提供
する工程、Ｔ細胞集団の中から活性化Ｔ細胞を同定する
工程、そして本発明の遺伝子をコードするＤＮＡの機能
的に生物活性を有する産物に基づく標識法を用いてＫ+
チャンネル発現を測定することにより、総Ｔ細胞集団に
対するＴ細胞の活性化を測定する工程を包含する。この
アッセイは、自己免疫疾患およびガンを検出することに
用いられ得る。なぜなら、これら病態に関連するＴ細胞
は、増加した数のＫ+チャンネルを有するからである。
ル発現に媒介されるＴ細胞の活性化に関連する病状の診
断のためのアッセイが提供される。このアッセイは、試
験個体から得られるＫ+チャンネルを含むＴ細胞を提供
する工程、Ｔ細胞集団の中から活性化Ｔ細胞を同定する
工程、そして本発明の遺伝子をコードするＤＮＡの機能
的に生物活性を有する産物に基づく標識法を用いてＫ+
チャンネル発現を測定することにより、総Ｔ細胞集団に
対するＴ細胞の活性化を測定する工程を包含する。この
アッセイは、自己免疫疾患およびガンを検出することに
用いられ得る。なぜなら、これら病態に関連するＴ細胞
は、増加した数のＫ+チャンネルを有するからである。
【０１０７】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことを理解されたい。すべての部または量は、他
に明記しない限り重量基準である。
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことを理解されたい。すべての部または量は、他
に明記しない限り重量基準である。
【０１０８】以下の実施例の理解を容易にするために、
現れる頻度の高い特定の方法および／または用語を記載
する。
現れる頻度の高い特定の方法および／または用語を記載
する。
【０１０９】「プラスミド」は、小文字のｐの前および
／または後の大文字および／または数字により示され
る。本明細書中の出発プラスミドは、市販されており、
制限基準なく公的に入手可能であり、または公表された
手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得る。
さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当
該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
／または後の大文字および／または数字により示され
る。本明細書中の出発プラスミドは、市販されており、
制限基準なく公的に入手可能であり、または公表された
手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得る。
さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当
該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。
【０１１０】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントが約２単位の酵素とともに
約２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築
のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表
的には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素
を用い、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵
素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により
特定される。３７℃での約１時間のインキュベーション
時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書
に従って変動し得る。消化後、反応物をポリアクリルア
ミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離
する。
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントが約２単位の酵素とともに
約２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築
のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表
的には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素
を用い、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵
素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により
特定される。３７℃での約１時間のインキュベーション
時間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書
に従って変動し得る。消化後、反応物をポリアクリルア
ミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離
する。
【０１１１】切断されたフラグメントのサイズ分離は、
Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．、８：４０５７ （１９８０）により記載
された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われ
る。
Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．、８：４０５７ （１９８０）により記載
された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われ
る。
【０１１２】「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドに
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。
【０１１３】「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．ら、前出、１４６頁）。
他に提供されていなければ、連結は、ほぼ等モル量の連
結されるべきＤＮＡフラグメント０．５μｇあたり１０
単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）ととも
に、公知の緩衝液および条件を用いて達成され得る。
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．ら、前出、１４６頁）。
他に提供されていなければ、連結は、ほぼ等モル量の連
結されるべきＤＮＡフラグメント０．５μｇあたり１０
単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）ととも
に、公知の緩衝液および条件を用いて達成され得る。
【０１１４】他に記載しない限り、形質転換はＧｒａｈ
ａｍ Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒＥｂ， Ａ．、Ｖｉｒ
ｏｌ．、５２：４５６−４５７ （１９７３）の方法に
記載されるように行った。
ａｍ Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒＥｂ， Ａ．、Ｖｉｒ
ｏｌ．、５２：４５６−４５７ （１９７３）の方法に
記載されるように行った。
【０１１５】
【実施例】（実施例１） （Ｋ+チャンネル１タンパク質の細菌発現および精製）
本発明のＫ+チャンネル１ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第７５７００号）を、５’
およびプロセスされたＫ+チャンネル１タンパク質（シ
グナルペプチド配列を除く）およびＫ+チャンネルタン
パク質遺伝子の３’に対するベクター配列に対応するＰ
ＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅
を行った。Ｋ+チャンネル１タンパク質に対応するさら
なるヌクレオチドを、５’および３’配列それぞれに添
加した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列
５’ ＧＡＣＴＡＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴ
ＴＡＣＣＧＧＧ ３’を有し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限酵
素部位、続いてタンパク質コドンの推定末端アミノ酸か
ら開始する１７ヌクレオチドのコード配列を含む。３’
配列、３’ ＧＡＡＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＧＣＧＣＴＣ
ＡＧＴＣＡＴＴＧＴＣ５’は、Ｘｂａ Ｉ制限酵素部位
に相補的な配列を含み、続いて１８ヌクレオチドのＫ+
チャンネル１タンパク質ＤＮＡ挿入部の３’に位置する
非コード配列、そしてＫ+チャンネル１タンパク質ＤＮ
Ａ挿入部の３’に位置するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ＋ベクター配列を含む。制限酵素部位は、細菌発現ベ
クターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ． ９２５
９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，
ＣＡ， ９１３１１）の制限酵素部位に対応する。ｐ
ＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起
点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御可能プロモーター／オペレ
ーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６
−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位をコードする。次い
で、ｐＱＥ−９をＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉで
切断する。増殖配列をｐＱＥ−９に連結し、そしてヒス
チジンタグおよびＲＢＳをコードする配列に関してフレ
ームに挿入する。次いで、連結混合物を用いて、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｍ１５／ｒｅｐ４株（Ｍ１５／ｒｅｐ４の商
標でＱｉａｇｅｎから入手可能）をＳａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１
９８９）に記載の方法により形質転換する。Ｍ１５／ｒ
ｅｐ４は、プラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピーを含
み、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、そしてカナマイシ
ン耐性（Ｋａｎr）も与える。形質転換体はＬＢプレー
ト上で増殖するそれらの能力により同定され、そしてア
ンピシリン／カナマイシン耐性コロニーが選択された。
プラスミドＤＮＡを、制限アッセイにより単離確認す
る。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μ
ｇ／ｍｌ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）との両方を補充
したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖さ
せた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて１：１００〜１：２５０の
比で大きな培養物に接種する。細胞を、６００の光学密
度（Ｏ．Ｄ．600）が０．４と０．６との間になるまで
増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−
Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を加えて１ｍＭの最終
濃度にした。ＩＰＴＧはｌａｃＩリプレッサーを不活性
化することにより、遺伝子発現を増加させるためのＰ／
Ｏの解放（ｃｌｅａｒ）を誘導する。細胞をさらに３〜
４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により採取
した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６Ｍグア
ニジンＨＣｌで可溶化する。澄明後、可溶化されたＫ+
チャンネルタンパク質を、６−Ｈｉｓタグを含むタンパ
ク質により堅く結合させる条件下でニッケルキレートカ
ラムでのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製す
る（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７−１８４ （１９８
４））。 Ｋ+チャンネル１タンパク質を、６Ｍグアニ
ジンＨＣｌ ｐＨ５．０でカラムから溶出し、そして再
生の目的のために、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭ
リン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元型）、
および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に調整する。この
溶液で１２時間インキュベーションした後、タンパク質
を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透析した。
本発明のＫ+チャンネル１ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第７５７００号）を、５’
およびプロセスされたＫ+チャンネル１タンパク質（シ
グナルペプチド配列を除く）およびＫ+チャンネルタン
パク質遺伝子の３’に対するベクター配列に対応するＰ
ＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅
を行った。Ｋ+チャンネル１タンパク質に対応するさら
なるヌクレオチドを、５’および３’配列それぞれに添
加した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列
５’ ＧＡＣＴＡＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴ
ＴＡＣＣＧＧＧ ３’を有し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限酵
素部位、続いてタンパク質コドンの推定末端アミノ酸か
ら開始する１７ヌクレオチドのコード配列を含む。３’
配列、３’ ＧＡＡＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＧＣＧＣＴＣ
ＡＧＴＣＡＴＴＧＴＣ５’は、Ｘｂａ Ｉ制限酵素部位
に相補的な配列を含み、続いて１８ヌクレオチドのＫ+
チャンネル１タンパク質ＤＮＡ挿入部の３’に位置する
非コード配列、そしてＫ+チャンネル１タンパク質ＤＮ
Ａ挿入部の３’に位置するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ＋ベクター配列を含む。制限酵素部位は、細菌発現ベ
クターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ． ９２５
９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，
ＣＡ， ９１３１１）の制限酵素部位に対応する。ｐ
ＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起
点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御可能プロモーター／オペレ
ーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６
−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位をコードする。次い
で、ｐＱＥ−９をＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａ Ｉで
切断する。増殖配列をｐＱＥ−９に連結し、そしてヒス
チジンタグおよびＲＢＳをコードする配列に関してフレ
ームに挿入する。次いで、連結混合物を用いて、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｍ１５／ｒｅｐ４株（Ｍ１５／ｒｅｐ４の商
標でＱｉａｇｅｎから入手可能）をＳａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１
９８９）に記載の方法により形質転換する。Ｍ１５／ｒ
ｅｐ４は、プラスミドｐＲＥＰ４の多数のコピーを含
み、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、そしてカナマイシ
ン耐性（Ｋａｎr）も与える。形質転換体はＬＢプレー
ト上で増殖するそれらの能力により同定され、そしてア
ンピシリン／カナマイシン耐性コロニーが選択された。
プラスミドＤＮＡを、制限アッセイにより単離確認す
る。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μ
ｇ／ｍｌ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）との両方を補充
したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖さ
せた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて１：１００〜１：２５０の
比で大きな培養物に接種する。細胞を、６００の光学密
度（Ｏ．Ｄ．600）が０．４と０．６との間になるまで
増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−
Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を加えて１ｍＭの最終
濃度にした。ＩＰＴＧはｌａｃＩリプレッサーを不活性
化することにより、遺伝子発現を増加させるためのＰ／
Ｏの解放（ｃｌｅａｒ）を誘導する。細胞をさらに３〜
４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により採取
した。細胞ペレットをカオトロピック剤である６Ｍグア
ニジンＨＣｌで可溶化する。澄明後、可溶化されたＫ+
チャンネルタンパク質を、６−Ｈｉｓタグを含むタンパ
ク質により堅く結合させる条件下でニッケルキレートカ
ラムでのクロマトグラフィーによりこの溶液から精製す
る（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７−１８４ （１９８
４））。 Ｋ+チャンネル１タンパク質を、６Ｍグアニ
ジンＨＣｌ ｐＨ５．０でカラムから溶出し、そして再
生の目的のために、３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭ
リン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタチオン（還元型）、
および２ｍＭグルタチオン（酸化型）に調整する。この
溶液で１２時間インキュベーションした後、タンパク質
を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透析した。
【０１１６】（実施例２） （バキュロウィルス発現系を用いるＫ+チャンネル１タ
ンパク質のクローニングおよび発現）全長のＫ+チャン
ネル１タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄
託番号第７５７００号）を、その遺伝子の５’および
３’配列に相補的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて増幅した。
ンパク質のクローニングおよび発現）全長のＫ+チャン
ネル１タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄
託番号第７５７００号）を、その遺伝子の５’および
３’配列に相補的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて増幅した。
【０１１７】５’プライマーは、配列５’ ＣＧＧＧＡ
ＴＣＣＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＡ
３’を有し、ＢａｍＨ１制限酵素部位、続いて真核生
物における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する４
ヌクレオチド（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８
７， １９６， ９４７−９５０， Ｋｏｚａｋ，
Ｍ．）、そしてすぐ後方に先のＫ+チャンネル１遺伝子
の１８ヌクレオチド（翻訳開始コドン「ＡＴＧ」が下線
される）を含む。
ＴＣＣＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＡ
３’を有し、ＢａｍＨ１制限酵素部位、続いて真核生
物における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する４
ヌクレオチド（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８
７， １９６， ９４７−９５０， Ｋｏｚａｋ，
Ｍ．）、そしてすぐ後方に先のＫ+チャンネル１遺伝子
の１８ヌクレオチド（翻訳開始コドン「ＡＴＧ」が下線
される）を含む。
【０１１８】３’プライマーは、配列５’ ＣＧＧＧＡ
ＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴ
３’を有し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１の切断
部位およびＫ+チャンネル１遺伝子の３’非翻訳配列に
相補的な１８ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販の
入手可能なキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」 ＢＩＯ１
０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ．）を用
いて、１％アガロースゲルより単離した。次いで、フラ
グメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨ１で消化し、そ
して市販の入手可能なキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」
ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
Ｃａ．）を用いて、１％アガロースゲルより精製した。
このフラグメントを、Ｆ２と称する。
ＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴ
３’を有し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１の切断
部位およびＫ+チャンネル１遺伝子の３’非翻訳配列に
相補的な１８ヌクレオチドを含む。増幅配列を、市販の
入手可能なキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」 ＢＩＯ１
０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ．）を用
いて、１％アガロースゲルより単離した。次いで、フラ
グメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨ１で消化し、そ
して市販の入手可能なキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」
ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
Ｃａ．）を用いて、１％アガロースゲルより精製した。
このフラグメントを、Ｆ２と称する。
【０１１９】ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクター
の改変体、下記に記述）をバキュロウィルス発現系を用
いるＫ+チャンネル１タンパク質の発現のために用いる
（総説については、Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ．および
Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｅ． １９８７， Ａ ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔ ｃｅ
ｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘ
ａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．
１５５５を参照のこと）。この発現ベクターは、Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウ
ィルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強いポリヘドリンプロモータ
ー、続いて制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１の認識部
位を含む。シミアンウィルス（ＳＶ）４０のポリアデニ
ル化部位は、効率的なポリアデニル化のために用いられ
る。組換えウィルスを容易に選択するために、Ｅ． ｃ
ｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリ
ン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリン
プロモーターと同方向に挿入した。このポリヘドリン配
列は、コトランスフェクト野生型ウィルスＤＮＡの細胞
媒介相同組換えのためのウィルス配列により両端で隣接
した。多くの他のバキュロウィルスベクターが、ｐＲＧ
１の代わりに用いられ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐ
ＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ，
Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ， １７０：３１−３９）。
の改変体、下記に記述）をバキュロウィルス発現系を用
いるＫ+チャンネル１タンパク質の発現のために用いる
（総説については、Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ．および
Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｅ． １９８７， Ａ ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔ ｃｅ
ｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘ
ａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．
１５５５を参照のこと）。この発現ベクターは、Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウ
ィルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強いポリヘドリンプロモータ
ー、続いて制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１の認識部
位を含む。シミアンウィルス（ＳＶ）４０のポリアデニ
ル化部位は、効率的なポリアデニル化のために用いられ
る。組換えウィルスを容易に選択するために、Ｅ． ｃ
ｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリ
ン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリン
プロモーターと同方向に挿入した。このポリヘドリン配
列は、コトランスフェクト野生型ウィルスＤＮＡの細胞
媒介相同組換えのためのウィルス配列により両端で隣接
した。多くの他のバキュロウィルスベクターが、ｐＲＧ
１の代わりに用いられ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐ
ＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ，
Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ， １７０：３１−３９）。
【０１２０】プラスミドは制限酵素ＢａｍＨ１で消化さ
れ、次いで当該分野で公知の方法により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを１
％アガロースゲルより単離し、そして再度１％アガロー
スゲルで精製した。このベクターＤＮＡをＶ２と称す
る。
れ、次いで当該分野で公知の方法により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを１
％アガロースゲルより単離し、そして再度１％アガロー
スゲルで精製した。このベクターＤＮＡをＶ２と称す
る。
【０１２１】フラグメントＦ２および脱リン酸化プラス
ミドＶ２を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。次いで、
Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株を形質転換し、そして酵
素ＢａｍＨ１を用いてＫ+チャンネル１遺伝子を有する
プラスミド（ｐＢａｃｋ+ ｃｈａｎｎｅｌ １）を含む
細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列を、Ｄ
ＮＡ配列決定により確認した。
ミドＶ２を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。次いで、
Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株を形質転換し、そして酵
素ＢａｍＨ１を用いてＫ+チャンネル１遺伝子を有する
プラスミド（ｐＢａｃｋ+ ｃｈａｎｎｅｌ １）を含む
細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列を、Ｄ
ＮＡ配列決定により確認した。
【０１２２】５μｇのプラスミドｐＢａｃｋ+ ｃｈａｎ
ｎｅｌ １を、１．０μｇの市販の入手可能な線状バキ
ュロウィルス（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌ
ｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，
ＳａｎＤｉｅｇｏ， ＣＡ．）で、リポフェクション法
（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：７４１３−７４１７
（１９８７））を用いてコトランスフェクトした。
ｎｅｌ １を、１．０μｇの市販の入手可能な線状バキ
ュロウィルス（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌ
ｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，
ＳａｎＤｉｅｇｏ， ＣＡ．）で、リポフェクション法
（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：７４１３−７４１７
（１９８７））を用いてコトランスフェクトした。
【０１２３】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウィルス
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃｋ+ ｃｈａｎ
ｎｅｌ １を、５０μｌの血清非含有グレース培地（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を含むマイクロタイタ
ープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０μ
ｌリポフェクチンと９０μｌのグレース培地を添加し、
混合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。
次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非含
有グレース培地１ｍｌとともに３５ｍｍ組織培養プレー
ト内に接種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１７１１）に滴下した。プレートを、新たに加えられた
溶液を混合するために、前後に振とうした。次いでプレ
ートを、２７℃で５時間インキュベートした。５時間
後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、
そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース
昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻
し、そして２７℃で４日間培養を続けた。
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃｋ+ ｃｈａｎ
ｎｅｌ １を、５０μｌの血清非含有グレース培地（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を含むマイクロタイタ
ープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０μ
ｌリポフェクチンと９０μｌのグレース培地を添加し、
混合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。
次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非含
有グレース培地１ｍｌとともに３５ｍｍ組織培養プレー
ト内に接種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１７１１）に滴下した。プレートを、新たに加えられた
溶液を混合するために、前後に振とうした。次いでプレ
ートを、２７℃で５時間インキュベートした。５時間
後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、
そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース
昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻
し、そして２７℃で４日間培養を続けた。
【０１２４】４日後、その上清を回収し、そしてＳｕｍ
ｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（上述）の記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法として、青く染色された
プラークの容易な単離を可能にする、「ＢｌｕｅＧａ
ｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロー
スゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述
はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細
胞培養およびバキュロウィルス学の使用者ガイド（９〜
１０頁）でも見つけられ得る）。
ｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（上述）の記載と同様にプラ
ークアッセイを行った。改変法として、青く染色された
プラークの容易な単離を可能にする、「ＢｌｕｅＧａ
ｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロー
スゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述
はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細
胞培養およびバキュロウィルス学の使用者ガイド（９〜
１０頁）でも見つけられ得る）。
【０１２５】４日後、ウィルスの連続希釈物を細胞に加
え、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウィルスを含む寒天
を、２００μｌのグレース培地を含むエッペンドルフチ
ューブで再懸濁した。寒天を、簡単な遠心分離により除
去し、そして組換えバキュロウィルスを含む上清を、３
５ｍｍ皿で接種されたＳｆ９細胞に感染するために用い
た。４日後、これらの培養皿の上清を回収し、次いで４
℃で保存した。
え、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウィルスを含む寒天
を、２００μｌのグレース培地を含むエッペンドルフチ
ューブで再懸濁した。寒天を、簡単な遠心分離により除
去し、そして組換えバキュロウィルスを含む上清を、３
５ｍｍ皿で接種されたＳｆ９細胞に感染するために用い
た。４日後、これらの培養皿の上清を回収し、次いで４
℃で保存した。
【０１２６】Ｓｆ９細胞を、１０％加熱不活性化ＦＢＳ
を補充したグレース培地中で培養した。細胞を、感染多
重度（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウィルスＶ−Ｋ+チ
ャンネル１で感染させた。６時間後、その培地を除去
し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９
００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置換した。
４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣ
ｉの35Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。
細胞を、さらに１６時間インキュベートし、その後細胞
を遠心分離により回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びオートラジオグラフィーにより標識されたタンパク質
を可視化した。
を補充したグレース培地中で培養した。細胞を、感染多
重度（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウィルスＶ−Ｋ+チ
ャンネル１で感染させた。６時間後、その培地を除去
し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９
００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置換した。
４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣ
ｉの35Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。
細胞を、さらに１６時間インキュベートし、その後細胞
を遠心分離により回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びオートラジオグラフィーにより標識されたタンパク質
を可視化した。
【０１２７】（実施例３） （ＣＯＳ細胞における組換えＫ+チャンネル１タンパク
質の発現）プラスミド、ｐＫ＋ ｃｈａｎｎｅｌ １
ＨＡの発現を、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）により誘導する。ベクターｐｃＤＮＡ
Ｉ／Ａｍｐは、１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリ
ン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、４）ポリリ
ンカー領域、ＳＶ４０イントロンそしてポリアデニル化
部位が続くＣＭＶプロモーター、を含有する。完全なＫ
+チャンネル１タンパク質、およびその３’末端にイン
フレームで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラ
グメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化
した。それゆえ、組換えタンパク質発現はＣＭＶプロモ
ーター下で制御される。ＨＡタグは、前述のインフルエ
ンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応す
る（Ｉ． Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ． Ｎｉｍａｎ、Ｒ． Ｈ
ｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ． Ｃｏ
ｎｎｏｌｌｙ、およびＲ． Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４，
Ｃｅｌｌ ３７， ７６７）。本発明者らの標的タン
パク質に対するＨＡタグ融合物は、ＨＡエピトープを認
識する抗体による組換えタンパク質の容易な検出を可能
にする。
質の発現）プラスミド、ｐＫ＋ ｃｈａｎｎｅｌ １
ＨＡの発現を、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）により誘導する。ベクターｐｃＤＮＡ
Ｉ／Ａｍｐは、１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリ
ン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、４）ポリリ
ンカー領域、ＳＶ４０イントロンそしてポリアデニル化
部位が続くＣＭＶプロモーター、を含有する。完全なＫ
+チャンネル１タンパク質、およびその３’末端にイン
フレームで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラ
グメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化
した。それゆえ、組換えタンパク質発現はＣＭＶプロモ
ーター下で制御される。ＨＡタグは、前述のインフルエ
ンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応す
る（Ｉ． Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ． Ｎｉｍａｎ、Ｒ． Ｈ
ｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ． Ｃｏ
ｎｎｏｌｌｙ、およびＲ． Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４，
Ｃｅｌｌ ３７， ７６７）。本発明者らの標的タン
パク質に対するＨＡタグ融合物は、ＨＡエピトープを認
識する抗体による組換えタンパク質の容易な検出を可能
にする。
【０１２８】プラスミド構築戦略を以下に記述する：Ｋ
+チャンネル１タンパク質をコードするＤＮＡ配列（Ａ
ＴＣＣ寄託番号第７５７００号）を、２つのプライマー
を用いてクローン化された全長の遺伝子上のＰＣＲによ
り構築した。：５’プライマー５’ ＧＴＣＣＡＡＧＣ
ＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＡＣＣＣＧＧ
Ａ ３’は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位、続いて開始コドン
より始まるＫ+チャンネル１コード配列の１８ヌクレオ
チドを含む；３’配列５’ ＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣ
ＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧ
ＧＴＡＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴ ３’
は、Ｘｈｏ Ｉ部位、翻訳停止コドン、ＨＡタグ、およ
びＫ+チャンネル１コード配列の最後の１５ヌクレオチ
ド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。そ
れゆえ、ＰＣＲ産物は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位、Ｋ+チ
ャンネル１コード配列、続いてインフレーム融合ＨＡタ
グ、ＨＡタグに隣接する翻訳終止停止コドン、およびＸ
ｈｏ Ｉ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントお
よびベクター（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）を、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＸｈｏ Ｉ制限酵素により消化し、そして
連結した。連結混合物を、Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ， １１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉ
ｎｅｓ Ｒｏａｄ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２
０３７より入手可能）に形質転換し、形質転換培養物を
アンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニ
ーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体より単離
し、そして正しいフラグメントの存在を制限分析で試験
した。組換えＫ+チャンネル１組換え体の発現のため
に、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法により発
現ベクターでトランスフェクトした（Ｊ． Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ、Ｅ． Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８
９））。Ｋ+チャンネル１ ＨＡタンパク質の発現を、
放射能標識および免疫沈澱法により検出した。（Ｅ．
Ｈａｒｌｏｗ， Ｄ． Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８８））。細胞を、ト
ランスフェクションの２日後、35Ｓ−システインで８時
間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界
面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１
％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４
０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．
５））で溶解した。（Ｗｉｌｓｏｎ， Ｉ．ら、同上
３７：７６７ （１９８４））。細胞溶解物および培養
培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体により沈
殿させた。沈澱したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルにより分析した。
+チャンネル１タンパク質をコードするＤＮＡ配列（Ａ
ＴＣＣ寄託番号第７５７００号）を、２つのプライマー
を用いてクローン化された全長の遺伝子上のＰＣＲによ
り構築した。：５’プライマー５’ ＧＴＣＣＡＡＧＣ
ＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＡＣＣＣＧＧ
Ａ ３’は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位、続いて開始コドン
より始まるＫ+チャンネル１コード配列の１８ヌクレオ
チドを含む；３’配列５’ ＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣ
ＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧ
ＧＴＡＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴ ３’
は、Ｘｈｏ Ｉ部位、翻訳停止コドン、ＨＡタグ、およ
びＫ+チャンネル１コード配列の最後の１５ヌクレオチ
ド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。そ
れゆえ、ＰＣＲ産物は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位、Ｋ+チ
ャンネル１コード配列、続いてインフレーム融合ＨＡタ
グ、ＨＡタグに隣接する翻訳終止停止コドン、およびＸ
ｈｏ Ｉ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントお
よびベクター（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）を、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＸｈｏ Ｉ制限酵素により消化し、そして
連結した。連結混合物を、Ｅ． ｃｏｌｉ ＳＵＲＥ株
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ， １１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉ
ｎｅｓ Ｒｏａｄ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２
０３７より入手可能）に形質転換し、形質転換培養物を
アンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニ
ーを選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体より単離
し、そして正しいフラグメントの存在を制限分析で試験
した。組換えＫ+チャンネル１組換え体の発現のため
に、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮ法により発
現ベクターでトランスフェクトした（Ｊ． Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ、Ｅ． Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８
９））。Ｋ+チャンネル１ ＨＡタンパク質の発現を、
放射能標識および免疫沈澱法により検出した。（Ｅ．
Ｈａｒｌｏｗ， Ｄ． Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８８））。細胞を、ト
ランスフェクションの２日後、35Ｓ−システインで８時
間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界
面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１
％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４
０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．
５））で溶解した。（Ｗｉｌｓｏｎ， Ｉ．ら、同上
３７：７６７ （１９８４））。細胞溶解物および培養
培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体により沈
殿させた。沈澱したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルにより分析した。
【０１２９】（実施例４） （バキュロウィルス発現系を用いるＫ+チャンネル２タ
ンパク質のクローニングおよび発現）全長のＫ+チャン
ネル２タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄
託番号第７５８３０号）を、遺伝子の５’および３’配
列に相補的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用
いて増幅した。
ンパク質のクローニングおよび発現）全長のＫ+チャン
ネル２タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄
託番号第７５８３０号）を、遺伝子の５’および３’配
列に相補的なＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用
いて増幅した。
【０１３０】５’プライマーは、配列５’ ＣＧＧＧＡ
ＴＣＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＡＧ
３’を有し、ＢａｍＨ１制限酵素部位、続いて真核生
物における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する４
ヌクレオチド（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８
７， １９６， ９４７−９５０， Ｋｏｚａｋ，
Ｍ．）、そしてすぐ後方に先のＫ+チャンネル２遺伝子
の１８ヌクレオチド（翻訳開始コドン「ＡＴＧ」が下線
される）を含む。
ＴＣＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＡＧ
３’を有し、ＢａｍＨ１制限酵素部位、続いて真核生
物における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する４
ヌクレオチド（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８
７， １９６， ９４７−９５０， Ｋｏｚａｋ，
Ｍ．）、そしてすぐ後方に先のＫ+チャンネル２遺伝子
の１８ヌクレオチド（翻訳開始コドン「ＡＴＧ」が下線
される）を含む。
【０１３１】３’プライマーは、配列５’ ＣＧＧＧＡ
ＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＧＡＧ
３’を有し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１の切断
部位およびＫ+チャンネル２遺伝子の３’非翻訳配列に
相補的な１８ヌクレオチドを含む。増幅遺伝子を、市販
の入手可能なキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」 ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ．）
を用いて、１％アガロースゲルより単離した。次いで、
フラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨ１で消化
し、そして１％アガロースゲルで再度精製した。このフ
ラグメントを、Ｆ２と称する。
ＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＧＡＧ
３’を有し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１の切断
部位およびＫ+チャンネル２遺伝子の３’非翻訳配列に
相補的な１８ヌクレオチドを含む。増幅遺伝子を、市販
の入手可能なキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」 ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ．）
を用いて、１％アガロースゲルより単離した。次いで、
フラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨ１で消化
し、そして１％アガロースゲルで再度精製した。このフ
ラグメントを、Ｆ２と称する。
【０１３２】ベクターｐＲＧ１（ｐＶＬ９４１ベクター
の改変体、下記に記述）をバキュロウィルス発現系を用
いるＫ+チャンネル２タンパク質の発現のために用いる
（総説について、Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ．およびＳ
ｍｉｔｈ， Ｇ．Ｅ． １９８７， Ａ ｍａｎｕａｌ
ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒ
ｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔ ｃｅｌ
ｌ ｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘａ
ｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． １
５５５を参照のこと）。この発現ベクターは、Ａｕｔｏ
ｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィ
ルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強いポリヘドリンプロモータ
ー、続いて制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１の認識部
位を含む。シミアンウィルス（ＳＶ）４０のポリアデニ
ル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。
組換えウィルスを容易に選択するために、Ｅ． ｃｏｌ
ｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺
伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリンプロ
モーターと同方向に挿入した。ポリヘドリン配列を、コ
トランスフェクト野生型ウィルスＤＮＡの細胞媒介相同
組換えのためのウィルス配列により両端で隣接した。多
くの他のバキュロウィルスベクターが、ｐＲＧ１の代わ
りに用いられ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４
１およびｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ， Ｖ．
Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ，１７０：３１−３９）。
の改変体、下記に記述）をバキュロウィルス発現系を用
いるＫ+チャンネル２タンパク質の発現のために用いる
（総説について、Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ．およびＳ
ｍｉｔｈ， Ｇ．Ｅ． １９８７， Ａ ｍａｎｕａｌ
ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒ
ｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔ ｃｅｌ
ｌ ｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘａ
ｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． １
５５５を参照のこと）。この発現ベクターは、Ａｕｔｏ
ｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィ
ルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強いポリヘドリンプロモータ
ー、続いて制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１の認識部
位を含む。シミアンウィルス（ＳＶ）４０のポリアデニ
ル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。
組換えウィルスを容易に選択するために、Ｅ． ｃｏｌ
ｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン遺
伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリンプロ
モーターと同方向に挿入した。ポリヘドリン配列を、コ
トランスフェクト野生型ウィルスＤＮＡの細胞媒介相同
組換えのためのウィルス配列により両端で隣接した。多
くの他のバキュロウィルスベクターが、ｐＲＧ１の代わ
りに用いられ得る。例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４
１およびｐＡｃＩＭ１である（Ｌｕｃｋｏｗ， Ｖ．
Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ， Ｍ．Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ，１７０：３１−３９）。
【０１３３】プラスミドは制限酵素ＢａｍＨ１で消化さ
れ、次いで当該分野で公知の方法により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを１
％アガロースゲルより単離し、そして再度１％アガロー
スゲルで精製した。このベクターＤＮＡをＶ２と称す
る。
れ、次いで当該分野で公知の方法により仔ウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、ＤＮＡを１
％アガロースゲルより単離し、そして再度１％アガロー
スゲルで精製した。このベクターＤＮＡをＶ２と称す
る。
【０１３４】フラグメントＦ２および脱リン酸化プラス
ミドＶ２を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。次い
で、Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株を形質転換し、そし
て酵素ＢａｍＨ１を用いて、Ｋ+チャンネル２遺伝子を
有するプラスミド（ｐＢａｃｋ+ ｃｈａｎｎｅｌ ２）
を含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列
を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
ミドＶ２を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。次い
で、Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株を形質転換し、そし
て酵素ＢａｍＨ１を用いて、Ｋ+チャンネル２遺伝子を
有するプラスミド（ｐＢａｃｋ+ ｃｈａｎｎｅｌ ２）
を含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列
を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１３５】５μｇのプラスミドｐＢａｃｋ+ ｃｈａｎ
ｎｅｌ ２を、１．０μｇの市販の入手可能な線状バキ
ュロウィルス（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌ
ｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，
ＳａｎＤｉｅｇｏ， ＣＡ．）で、リポフェクション法
（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：７４１３−７４１７
（１９８７））を用いてコトランスフェクトした。
ｎｅｌ ２を、１．０μｇの市販の入手可能な線状バキ
ュロウィルス（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌ
ｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，
ＳａｎＤｉｅｇｏ， ＣＡ．）で、リポフェクション法
（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：７４１３−７４１７
（１９８７））を用いてコトランスフェクトした。
【０１３６】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウィルス
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃｋ+ ｃｈａｎ
ｎｅｌ ２を、５０μｌの血清非含有グレース培地（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を含むマイクロタイタ
ープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０μ
ｌリポフェクチンと９０μｌのグレース培地を添加し、
混合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。
次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非含
有グレース培地１ｍｌを含む３５ｍｍ組織培養プレート
内に接種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
７１１）に滴下した。プレートを、新たに加えられた溶
液を混合するために、前後に振とうした。次いでプレー
トを、２７℃で５時間インキュベートした。５時間後、
トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そし
て１０％ウシ胎児血清を含む１ｍｌのグレース昆虫培地
を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そし
て２７℃で４日間培養を続けた。
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃｋ+ ｃｈａｎ
ｎｅｌ ２を、５０μｌの血清非含有グレース培地（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を含むマイクロタイタ
ープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、１０μ
ｌリポフェクチンと９０μｌのグレース培地を添加し、
混合し、そして室温にて１５分間インキュベートした。
次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清非含
有グレース培地１ｍｌを含む３５ｍｍ組織培養プレート
内に接種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
７１１）に滴下した。プレートを、新たに加えられた溶
液を混合するために、前後に振とうした。次いでプレー
トを、２７℃で５時間インキュベートした。５時間後、
トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そし
て１０％ウシ胎児血清を含む１ｍｌのグレース昆虫培地
を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そし
て２７℃で４日間培養を続けた。
【０１３７】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（上述）の記載と同様にプラーク
アッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラ
ークの容易な単離を可能にする、「ＢｌｕｅＧａｌ」
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲルを
用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養法お
よびバキュロウィルス学の使用者ガイド（９〜１０頁）
でも見つけられ得る）。
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（上述）の記載と同様にプラーク
アッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラ
ークの容易な単離を可能にする、「ＢｌｕｅＧａｌ」
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲルを
用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養法お
よびバキュロウィルス学の使用者ガイド（９〜１０頁）
でも見つけられ得る）。
【０１３８】４日後、ウィルスの連続希釈物を細胞に加
え、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウィルスを含む寒天
を、２００ｌのグレース培地を含むエッペンドルフチュ
ーブで再懸濁した。寒天を、簡単な遠心分離により除去
し、そして組換えバキュロウィルスを含む上清を、３５
ｍｍ皿で接種されたＳｆ９細胞に感染するために用い
た。４日後、これらの培養皿の上清を回収し、次いで４
℃で保存した。
え、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペット
のチップで拾った。次いで、組換えウィルスを含む寒天
を、２００ｌのグレース培地を含むエッペンドルフチュ
ーブで再懸濁した。寒天を、簡単な遠心分離により除去
し、そして組換えバキュロウィルスを含む上清を、３５
ｍｍ皿で接種されたＳｆ９細胞に感染するために用い
た。４日後、これらの培養皿の上清を回収し、次いで４
℃で保存した。
【０１３９】Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳを
補充したグレース培地中で培養した。細胞を、感染多重
度（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウィルスＶ−Ｋ+チャ
ンネル２で感染させた。６時間後、その培地を除去し、
そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００
ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎ
ｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置換した。４２
時間後、５μＣｉの 35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの
35Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細胞
を、さらに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠
心分離により回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオ
ートラジオグラフィーにより標識されたタンパク質を可
視化した。
補充したグレース培地中で培養した。細胞を、感染多重
度（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウィルスＶ−Ｋ+チャ
ンネル２で感染させた。６時間後、その培地を除去し、
そしてメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００
ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎ
ｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置換した。４２
時間後、５μＣｉの 35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの
35Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した。細胞
を、さらに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠
心分離により回収し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオ
ートラジオグラフィーにより標識されたタンパク質を可
視化した。
【０１４０】（実施例５） （ＣＯＳ細胞における組換えＫ+チャンネル２タンパク
質の発現）プラスミド、ｐＫ＋ ｃｈａｎｎｅｌ ２
ＨＡの発現を、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）により誘導する。ベクターｐｃＤＮＡ
Ｉ／Ａｍｐは、１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリ
ン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、４）ポリリ
ンカー領域、ＳＶ４０イントロンそしてポリアデニル化
部位が続くＣＭＶプロモーター、を含有する。完全なＫ
+チャンネル２タンパク質、およびその３’末端にイン
フレームで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラ
グメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化
した。それゆえ、組換えタンパク質発現はＣＭＶプロモ
ーター下で制御される。ＨＡタグは、前述のインフルエ
ンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応す
る（Ｉ． Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ． Ｎｉｍａｎ、Ｒ． Ｈ
ｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ． Ｃｏ
ｎｎｏｌｌｙ、およびＲ． Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４，
Ｃｅｌｌ ３７， ７６７）。本発明者らの標的タン
パク質に対するＨＡタグ融合物は、ＨＡエピトープを認
識する抗体による組換えタンパク質の容易な検出を可能
にする。
質の発現）プラスミド、ｐＫ＋ ｃｈａｎｎｅｌ ２
ＨＡの発現を、ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）により誘導する。ベクターｐｃＤＮＡ
Ｉ／Ａｍｐは、１）ＳＶ４０複製起点、２）アンピシリ
ン耐性遺伝子、３）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、４）ポリリ
ンカー領域、ＳＶ４０イントロンそしてポリアデニル化
部位が続くＣＭＶプロモーター、を含有する。完全なＫ
+チャンネル２タンパク質、およびその３’末端にイン
フレームで融合されたＨＡタグをコードするＤＮＡフラ
グメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化
した。それゆえ、組換えタンパク質発現はＣＭＶプロモ
ーター下で制御される。ＨＡタグは、前述のインフルエ
ンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応す
る（Ｉ． Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ． Ｎｉｍａｎ、Ｒ． Ｈ
ｅｉｇｈｔｅｎ、Ａ Ｃｈｅｒｅｎｓｏｎ、Ｍ． Ｃｏ
ｎｎｏｌｌｙ、およびＲ． Ｌｅｒｎｅｒ、１９８４，
Ｃｅｌｌ ３７， ７６７）。本発明者らの標的タン
パク質に対するＨＡタグ融合物は、ＨＡエピトープを認
識する抗体による組換えタンパク質の容易な検出を可能
にする。
【０１４１】プラスミド構築戦略を以下に記述する：Ｋ
+チャンネル２タンパク質をコードするＤＮＡ配列（Ａ
ＴＣＣ寄託番号第７５８３０号）を、２つのプライマー
を用いてクローン化された全長の遺伝子上のＰＣＲによ
り構築した。：５’プライマー５’ ＧＴＣＣＡＡＧＣ
ＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＡ
Ｇ ３’は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位、続いて、開始コド
ンより始まるＫ+チャンネル２コード配列の１８ヌクレ
オチドを含む；３’配列５’ ＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧＴ
ＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧ
ＧＧＴＡＧＣＡＣＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧ
３’は、Ｘｈｏ Ｉ部位、翻訳停止コドン、ＨＡタ
グ、およびＫ+チャンネル２コード配列の最後の１８ヌ
クレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を
含む。それゆえ、ＰＣＲ産物は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部
位、Ｋ+チャンネル２コード配列、続いてインフレーム
融合ＨＡタグ、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コド
ン、およびＸｈｏ Ｉ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフ
ラグメントおよびベクター（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）
を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｈｏ Ｉ制限酵素により
消化し、そして連結した。連結混合物を、Ｅ． ｃｏｌ
ｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏ
ｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ， Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ， ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質転換し、
形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、
そして耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形
質転換体より単離し、そして正しいフラグメントの存在
を制限分析で試験した。組換えＫ+チャンネル２組換え
体の発現のために、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲ
ＡＮ法により発現ベクターでトランスフェクトした
（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．
Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ， （１９８９））。 Ｋ+チャンネル２ＨＡタン
パク質の発現を、放射能標識および免疫沈澱法により検
出した。（Ｅ． Ｈａｒｌｏｗ， Ｄ． Ｌａｎｅ，
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８
８））。細胞を、トランスフェクションの２日後、35Ｓ
−システインで８時間標識した。次いで培養培地を回収
し、そして細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤ
Ｓ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭＴ
ｒｉｓ（ｐＨ７．５））で溶解した。（Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｉ．ら、同上 ３７：７６７ （１９８４））。細胞
溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ特異モノクローナ
ル抗体により沈澱させた。沈澱したタンパク質を１５％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析した。
+チャンネル２タンパク質をコードするＤＮＡ配列（Ａ
ＴＣＣ寄託番号第７５８３０号）を、２つのプライマー
を用いてクローン化された全長の遺伝子上のＰＣＲによ
り構築した。：５’プライマー５’ ＧＴＣＣＡＡＧＣ
ＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＡ
Ｇ ３’は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位、続いて、開始コド
ンより始まるＫ+チャンネル２コード配列の１８ヌクレ
オチドを含む；３’配列５’ ＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧＴ
ＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧ
ＧＧＴＡＧＣＡＣＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧ
３’は、Ｘｈｏ Ｉ部位、翻訳停止コドン、ＨＡタ
グ、およびＫ+チャンネル２コード配列の最後の１８ヌ
クレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を
含む。それゆえ、ＰＣＲ産物は、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部
位、Ｋ+チャンネル２コード配列、続いてインフレーム
融合ＨＡタグ、ＨＡタグに隣接する翻訳終結停止コド
ン、およびＸｈｏ Ｉ部位を含む。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフ
ラグメントおよびベクター（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）
を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｈｏ Ｉ制限酵素により
消化し、そして連結した。連結混合物を、Ｅ． ｃｏｌ
ｉ ＳＵＲＥ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏ
ｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ， Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ， ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質転換し、
形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、
そして耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡを形
質転換体より単離し、そして正しいフラグメントの存在
を制限分析で試験した。組換えＫ+チャンネル２組換え
体の発現のために、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲ
ＡＮ法により発現ベクターでトランスフェクトした
（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．
Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ， （１９８９））。 Ｋ+チャンネル２ＨＡタン
パク質の発現を、放射能標識および免疫沈澱法により検
出した。（Ｅ． Ｈａｒｌｏｗ， Ｄ． Ｌａｎｅ，
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， （１９８
８））。細胞を、トランスフェクションの２日後、35Ｓ
−システインで８時間標識した。次いで培養培地を回収
し、そして細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液（１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤ
Ｓ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭＴ
ｒｉｓ（ｐＨ７．５））で溶解した。（Ｗｉｌｓｏｎ，
Ｉ．ら、同上 ３７：７６７ （１９８４））。細胞
溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ特異モノクローナ
ル抗体により沈澱させた。沈澱したタンパク質を１５％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析した。
【０１４２】本発明の多くの改変および変形が、上記の
教示を考慮すれば可能であり、したがって、特に記載が
なければ、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施さ
れ得る。
教示を考慮すれば可能であり、したがって、特に記載が
なければ、添付の請求の範囲の範囲内で本発明は実施さ
れ得る。
【０１４３】以下の図面は、本発明の実施態様の例証で
あり、そして請求の範囲に包含されるような発明の範囲
を限定することを意図しない。
あり、そして請求の範囲に包含されるような発明の範囲
を限定することを意図しない。
【０１４４】
【発明の効果】本発明により、ヒトＫ+チャンネルポリ
ペプチド、およびこのようなＫ+チャンネルポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、組換え技術によるこ
のようなポリペプチドを産生する手順、てんかん、発
作、高血圧症、ぜん息、パーキンソン病、精神分裂症、
不安、鬱病、および神経変性の処置に用いられ得るこの
ようなＫ+チャンネルポリペプチドのアゴニスト、なら
びにＡＩＤＳ、全身性エリテマトーデス、糖尿病、多発
性硬化症、およびガンの処置に用いられ得るこのような
ポリペプチドに対するアンタゴニストを提供が提供され
る。
ペプチド、およびこのようなＫ+チャンネルポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、組換え技術によるこ
のようなポリペプチドを産生する手順、てんかん、発
作、高血圧症、ぜん息、パーキンソン病、精神分裂症、
不安、鬱病、および神経変性の処置に用いられ得るこの
ようなＫ+チャンネルポリペプチドのアゴニスト、なら
びにＡＩＤＳ、全身性エリテマトーデス、糖尿病、多発
性硬化症、およびガンの処置に用いられ得るこのような
ポリペプチドに対するアンタゴニストを提供が提供され
る。
【０１４５】
【０１４６】
【表１】
【０１４７】
【表２】
【０１４８】
【表３】
【０１４９】
【表４】
【０１５０】
【表５】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｃは、推定成熟Ｋ+チャンネル１タ
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。アミノ酸の標準１字略字を用いる。
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。アミノ酸の標準１字略字を用いる。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｃは、推定成熟Ｋ+チャンネル１タ
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。アミノ酸の標準１字略字を用いる。
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。アミノ酸の標準１字略字を用いる。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｃは、推定成熟Ｋ+チャンネル１タ
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。アミノ酸の標準１字略字を用いる。
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。アミノ酸の標準１字略字を用いる。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｅは、推定成熟Ｋ+チャンネル２タ
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｅは、推定成熟Ｋ+チャンネル２タ
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｅは、推定成熟Ｋ+チャンネル２タ
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｅは、推定成熟Ｋ+チャンネル２タ
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。
【図２Ｅ】図２Ａ〜Ｅは、推定成熟Ｋ+チャンネル２タ
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。
ンパク質のｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示
す。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｃは、Ｋ+チャンネル２タンパク質
（上段）とヒトＤＲＫ１タンパク質（下段）との間のア
ミノ酸の相同性を示す。
（上段）とヒトＤＲＫ１タンパク質（下段）との間のア
ミノ酸の相同性を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｃは、Ｋ+チャンネル２タンパク質
（上段）とヒトＤＲＫ１タンパク質（下段）との間のア
ミノ酸の相同性を示す。
（上段）とヒトＤＲＫ１タンパク質（下段）との間のア
ミノ酸の相同性を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｃは、Ｋ+チャンネル２タンパク質
（上段）とヒトＤＲＫ１タンパク質（下段）との間のア
ミノ酸の相同性を示す。
（上段）とヒトＤＲＫ１タンパク質（下段）との間のア
ミノ酸の相同性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/10 ４Ｈ０４５ 25/10 25/12 25/12 25/16 25/16 25/18 25/18 25/22 25/22 25/24 25/24 31/18 31/18 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (71)出願人 597018381 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 イ リー アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ガイザースバーグ， ホワード ランデ ィング ドライブ 16125 (72)発明者 マーク ディー． アダムス アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ノース ポタマック， ダフィーフ ド ライブ 15205 (72)発明者 オーウェン アール． ホワイト アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ガイザースバーグ， クインス オーチ ャード ブールバード ナンバー202 886 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 FA02 GA11 GA13 HA01 4B063 QA01 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AG01 AG26 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA17 NA14 ZA012 ZA022 ZA062 ZA122 ZA182 ZA222 ZA422 ZA592 ZB262 ZC352 ZC552 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 EA20 FA74
Claims (25)
- 【請求項１】 （ａ）図１Ａ〜Ｃの推定アミノ酸配列を
有するＫ+チャンネル１ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメン
ト、アナログ、または誘導体； （ｂ）図２Ａ〜Ｅの推定アミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、ま
たは誘導体； （ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５７００号に含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、ま
たは誘導体；および （ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０号に含まれるｃＤ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＫ+チャ
ンネル２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
あるいは該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、ま
たは誘導体、からなる群から選択される、単離されたポ
リペプチド。 - 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、
請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、
請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡで
ある、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドが図１および図２
の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャンネル１ポリペプ
チドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチ
ド。 - 【請求項６】 前記ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託番
号第７５７００号のｃＤＮＡでコードされるＫ+チャン
ネル１ポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポ
リヌクレオチド。 - 【請求項７】 前記ポリヌクレオチドが図２の推定アミ
ノ酸配列を有するＫ +チャンネル２ポリペプチドをコー
ドする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項８】 ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０号として
寄託されるＫ+チャンネル２ポリペプチドをコードする
配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項９】 請求項２に記載のＤＮＡを含むベクタ
ー。 - 【請求項１０】 請求項９に記載のベクターを用いて遺
伝的に操作された宿主細胞。 - 【請求項１１】 ポリペプチドを生成するためのプロセ
スであって、請求項１０に記載の宿主細胞から前記ＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチドを発現させる工程、
を包含する、プロセス。 - 【請求項１２】 ポリペプチドを発現し得る細胞を生成
するためのプロセスであって、請求項９に記載のベクタ
ーを用いて細胞を遺伝的に操作する工程、を包含する、
プロセス。 - 【請求項１３】 請求項２に記載のＤＮＡにハイブリダ
イズ可能であり、かつＫ+チャンネル１ポリペプチド活
性を有するポリペプチドをコードする、単離されたＤＮ
Ａ。 - 【請求項１４】 請求項２に記載のＤＮＡにハイブリダ
イズ可能であり、かつＫ+チャンネル２ポリペプチド活
性を有するポリペプチドをコードする、単離されたＤＮ
Ａ。 - 【請求項１５】 （ｉ）図１の推定アミノ酸配列を有す
るＫ+チャンネル１ポリペプチド、ならびにそのフラグ
メント、そのアナログ、およびその誘導体； （ｉｉ）図２の推定アミノ酸配列を有するＫ+チャンネ
ル２ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、そのア
ナログ、およびその誘導体；（ｉｉｉ）ＡＴＣＣ寄託番
号第７５７００号のｃＤＮＡによりコードされるＫ+チ
ャンネル１ポリペプチド、ならびに該ポリペプチドのフ
ラグメント、アナログ、および誘導体；および（ｉｖ）
ＡＴＣＣ寄託番号第７５８３０号のｃＤＮＡによりコー
ドされるＫ +チャンネル２ポリペプチド、ならびに該ポ
リペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体、
からなる群から選択される、ポリペプチド。 - 【請求項１６】 前記ポリペプチドが図１の推定アミノ
酸配列を有するＫ+チャンネル１ポリペプチドである、
請求項１５に記載のポリペプチド。 - 【請求項１７】 前記ポリペプチドが図２の推定アミノ
酸配列を有するＫ+チャンネル２ポリペプチドである、
請求項１５に記載のポリペプチド。 - 【請求項１８】 請求項１５に記載のポリペプチドに対
する抗体。 - 【請求項１９】 請求項１５に記載のポリペプチドに対
するアゴニスト。 - 【請求項２０】 請求項１５に記載のポリペプチドに対
するアンタゴニスト。 - 【請求項２１】 Ｋ+チャンネル１ポリペプチドに対す
るアゴニストの必要を有する患者の処置のための方法で
あって、該患者に治療有効量の請求項１９に記載のアゴ
ニストを投与する工程、を包含する、方法。 - 【請求項２２】 Ｋ+チャンネル２ポリペプチドに対す
るアゴニストの必要を有する患者の処置のための方法で
あって、該患者に治療有効量の請求項１９に記載のアゴ
ニストを投与する工程、を包含する、方法。 - 【請求項２３】 Ｋ+チャンネル１ポリペプチドを阻害
する必要を有する患者の処置のための方法であって、該
患者に治療有効量の請求項２０に記載のアンタゴニスト
／インヒビターを投与する工程、を包含する、方法。 - 【請求項２４】 Ｋ+チャンネル２ポリペプチドを阻害
する必要を有する患者の処置のための方法であって、該
患者に治療有効量の請求項２０に記載のアンタゴニスト
を投与する工程、を包含する、方法。 - 【請求項２５】 Ｋ+チャンネル発現に調節効果を有す
る分子を同定するための方法であって、Ｋ+チャンネル
遺伝子の機能性Ｋ+チャンネル発現産物を産生する発現
系を提供する工程；該産物と、該産物の生物活性におけ
るその調節効果を決定するための１つ以上の分子とを接
触させる工程；および該Ｋ+チャンネル発現を調節し得
る候補物を該分子より選択する工程、を包含する、方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001226832A JP2002095486A (ja) | 2001-07-26 | 2001-07-26 | ヒトカリウムチャンネル１および２タンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001226832A JP2002095486A (ja) | 2001-07-26 | 2001-07-26 | ヒトカリウムチャンネル１および２タンパク質 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8505703A Division JPH10504714A (ja) | 1994-07-28 | 1994-07-28 | ヒトカリウムチャンネル１および２タンパク質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002095486A true JP2002095486A (ja) | 2002-04-02 |
Family
ID=19059584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001226832A Pending JP2002095486A (ja) | 2001-07-26 | 2001-07-26 | ヒトカリウムチャンネル１および２タンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002095486A (ja) |
-
2001
- 2001-07-26 JP JP2001226832A patent/JP2002095486A/ja active Pending
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
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