JPH10150993A - 新規ｇ−蛋白結合受容体ｈｌｔｅｘ１１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｇ−蛋白結合受容体（ＨＬＴＥＸ１１）のポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。 【解決手段】 （ａ）配列番号：２のアミノ酸１から３
３９までを含むポリペプチドをコードしているポリヌク
レオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポ
リヌクレオチド； （ｂ）遺伝コードの縮重により、配列番号：２のアミノ
酸と同じアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
相補的なポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
の少なくとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオ
チドからなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリ
ヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一部には、新たに
同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；該ポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導
体；該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドおよびそれ
らの変種および誘導体の製造方法、該ポリペプチドのア
ンタゴニストおよびアゴニスト；ならびにポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、変種、誘導体、アゴニストおよび
アンタゴニストの使用に関する。詳細には、これらの点
および他の点において、本発明は、Ｇ−蛋白結合受容体
（以下「ＨＬＴＥＸ１１」という）のポリヌクレオチド
およびポリペプチドに関する。本発明は、新たに同定さ
れたポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、かかるポリヌクレオチドお
よびポリペプチドの使用、ならびにかかるポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの製造に関する。より詳細に
は、本発明ポリペプチドはＧ−蛋白結合受容体である。
また本発明は、かかるポリペプチドの作用の阻害または
活性化にも関する。

【０００２】

【従来の技術】医学的に重要な生物学的プロセスは、Ｇ
−蛋白および／または第２のメッセンジャー、例えばｃ
ＡＭＰを包含するシグナル変換経路に関与している蛋白
によって媒介されることがよく知られている（Lefkowit
z,Nature,1991,351:353-354）。本明細書においては、
これらの蛋白を、Ｇ−蛋白またはＰＰＧ蛋白に関する経
路に関与する蛋白という。これらの蛋白のいくつかの例
は、ＧＰＣ受容体、例えばアドレナリン作動性薬剤およ
びドーパミンに対するものを包含する（Kobilka,B.K.,e
t al.,Proc.Natl Acad.Sci.,USA,1987,84:46-50;Kobilk
a,B.K.,et al.,Science,1987,238:650-656;Bunzow,J.
R.,Nature,1988,336:783-787）。Ｇ−蛋白自体は、例え
ば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホ
スホジエステラーゼ、およびアクチェーター蛋白、例え
ばプロテインキナーゼＡおよびプロテオインキナーゼＣ
のようなエフェクター蛋白である（Simon,M.I.,et al.,
Science,1991,1991,252:802-808）。

【０００３】例えば、シグナル変換の１の形態におい
て、ホルモン結合の効果は細胞内の酵素であるアデニレ
ートシクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の
活性化はヌクレオチドＧＴＰの存在に依存する。さらに
ＧＴＰはホルモン結合にも影響する。Ｇ−蛋白はホルモ
ン受容体をアデニレートシクラーゼに結合させる。Ｇ−
蛋白は、ホルモン受容体により活性化された場合、ＧＴ
Ｐを結合ＧＤＰと交換することが示されている。次い
で、Ｇ−蛋白担持形態は活性化されたアデニレートシク
ラーゼに結合する。Ｇ−蛋白自体により触媒されるＧＴ
ＰのＧＤＰへの加水分解により、Ｇ−蛋白はその基底不
活性形態に戻る。かくして、Ｇ−蛋白は、受容体からエ
フェクターへのシグナルを中継する中間体、ならびにシ
グナル発生期間を調節する時計としての２つの作用を行
う。

【０００４】Ｇ−蛋白結合受容体の蛋白遺伝子スーパー
ファミリーは、７個の推定上の膜貫通ドメインを有する
ことにより特徴づけられている。ドメインは、細胞外ま
たは細胞質ループにより結合されている膜貫通α−ヘリ
ックスを示すものと考えられている。Ｇ−蛋白結合受容
体は、例えば、ホルモン、ウイルス、成長因子および神
経受容体のごとき広範な生物学的活性受容体を包含す
る。

【０００５】Ｇ−蛋白結合蛋白は、少なくとも８個の異
なる親水性ループに結合している、これらの７個の保存
された疎水的部分（約２０個ないし３０個のアミノ酸）
を含むものとして特徴づけられている。結合受容体のＧ
−蛋白ファミリーは、精神病および神経学的疾病の治療
に用いる神経遮断薬に結合するドーパミン受容体を包含
する。このファミリーのメンバーの他の例は、カルシト
ニン、アドレナリン作動薬、エンドセリン、ｃＡＭＰ、
アデノシン、ムスカリン作動性薬、アセチルコリン、セ
ロトニン、ヒスタミン、スロンビン、キニン、卵胞刺激
ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１受容体、ロド
プシン、オドラント、サイトメガロウイルス受容体等を
包含する。

【０００６】大部分のＧ−蛋白結合受容体は、最初の２
個の細胞外ループのそれぞれに１個の保存されたシステ
イン残基を有し、それらはジスルフィド結合を形成し、
機能的蛋白構造を安定化すると考えられている。７個の
膜貫通領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３，ＴＭ４、ＴＭ
５、ＴＭ６、ＴＭ７と呼ばれる。ＴＭ３はシグナル変換
に関与している。

【０００７】システイン残基のホスホリレーションおよ
びリピデーション（パルミチレーションまたはファルネ
シレーション）は、いくつかのＧ−蛋白結合受容体のシ
グナル変換に影響しうる。大部分のＧ−蛋白結合受容体
は、３番目の細胞質ループおよび／またはカルボキシ末
端において潜在的なホスホリレーション部位を含んでい
る。β−アドレナリン受容体のごとき数種のＧ−蛋白結
合受容体については、プロテインキナーゼＡおよび／ま
たは特異的受容体キナーゼによるホスホリレーションは
受容体の感受性をなくす。

【０００８】いくつかの受容体について、Ｇ−蛋白結合
受容体のリガンド結合部位は、数個のＧ−蛋白結合受容
体の膜貫通ドメインにより形成される親水性ソケットを
含むと考えられており、該ソケットはＧ−蛋白結合受容
体の疎水性残基により囲まれている。各Ｇ−蛋白結合受
容体膜貫通ヘリックスの親水性部位は、内側に向いてい
ると考えられ、極性リガンド結合部位を形成すると考え
られる。ＴＭ３は、ＴＭ３アスパラギン酸残基のごとき
リガンド結合部位を有するものとして、数個のＧ−蛋白
結合受容体に関連している。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６の
アスパラギンおよびＴＭ６またはＴＭ７のフェニルアラ
ニンまたはチロシンもリガンド結合に関連している。

【０００９】Ｇ−蛋白結合受容体は、細胞内において、
ヘテロ三量体Ｇ−蛋白により種々の細胞内酵素、イオン
チャンネルおよびトランスポーターに結合しうる（例え
ば、Johnson et al.,Endoc.Rev.,1989,10:317-331参
照）。異なるＧ−蛋白のα−サブユニットは優先的に特
定のエフェクターを刺激して細胞中の種々の生物学的機
能を転調させる。Ｇ−蛋白結合受容体の細胞質残基のホ
スホリレーションは、いくつかのＧ−蛋白結合受容体へ
のＧ−蛋白結合の調節に関する重要な機構であると確認
されている。Ｇ−蛋白結合受容体は哺乳動物宿主中の多
くの部位で見いだされる。

【００１０】種々の医学的症状に対する薬剤の開発のた
めに、特定のＧ−蛋白結合受容体が標的とされている。
過去１５年にわたり、７個の膜貫通（７ ＴＭ）受容体
を標的とする約１５０種の治療薬が市場に導入された。
このことは、これらの受容体が、治療標的としての確立
され証明された歴史を有することを示す。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】ヒト・白血球由来の血
小板活性化因子受容体分子クローニングおよび発現が行
われた（Nakamura,M.,et al.J.Biol.Chem.,1991,266(3
0):20400）。ニワトリの活性化Ｔ細胞において誘導され
たＧ−蛋白結合受容体も同定されている（Kaplan,M.H.e
t al.,J.Immunol.,1993,151:628）。しかしながら、明
らかに、機能不全または疾病の予防、改善または修正に
おいて役割を果たすさらなるＧ−蛋白結合受容体の同定
および特徴づけに対する必要性がある。

【００１２】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
上記事情に鑑み、本発明は、ポリペプチド、詳細には、
図２に示すアミノ酸配列と他の蛋白（例えば、活性化Ｔ
細胞において誘導されたニワトリ・Ｇ−蛋白結合受容
体、およびヒト・血小板活性化因子受容体）の既知アミ
ノ酸配列との間の類似性により新規Ｇ−蛋白結合受容体
ＨＬＴＥＸ１１であると同定されるポリペプチドを提供
することを１の目的とする。

【００１３】さらに、ＨＬＴＥＸ１１をコードするポリ
ヌクレオチド、詳細には、本明細書で配列番号：２とし
て示されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供することが本発明の目的である。

【００１４】本発明の特に好ましい具体例において、該
ポリヌクレオチドは、図１に示す配列中のヒト・ＨＬＴ
ＥＸ１１をコードする領域を含む。

【００１５】本発明の態様によれば、ＡＴＣＣ受託番号
９８１３０中に含まれるヒト・ｃＤＮＡにより発現され
うる成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供
される。

【００１６】本発明の態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡを包含するヒト・ＨＬＴＥＸ１１をコ
ードする単離核酸分子が提供され、さらに本発明態様の
具体例において、その生物学的に、診断上、臨床的にま
たは治療的に有用な変種、アナログ、あるいは上記変
種、アナログおよび誘導体のフラグメントを包含するそ
れらの誘導体が提供される。

【００１７】ヒト・ＨＬＴＥＸ１１の天然に存在する対
立遺伝子変種は本発明の特に好ましい具体例に含まれ
る。

【００１８】治療目的、例えば、アテローム性動脈硬
化、炎症、および感染、詳細には特にＡＩＤＳのごとき
ウイルス感染の治療に用いられる、ＨＬＴＥＸ１１ポリ
ヌクレオチド、詳細にはヒト・ＨＬＴＥＸ１１ポリペプ
チドを提供することも本発明の目的である。

【００１９】本発明の態様によれば、本明細書において
ＨＬＴＥＸ１１と呼ばれるヒト由来の新規ポリペプチ
ド、ならびにその生物学的、診断上または治療上有用な
フラグメント、変種およびその誘導体、フラグメントの
変種および誘導体、および上記のもののアナログが提供
される。

【００２０】ヒト・ＰＢＨ１遺伝子の天然に存在する対
立遺伝子によりコードされるヒト・ＨＬＴＥＸ１１の変
種が本発明のこの態様の特に好ましい具体例に含まれ
る。

【００２１】本発明のもう１つの態様によれば、本発明
受容体ポリペプチドに結合してこれを活性化または阻害
する化合物、ならびに血小板活性化因子（ＰＡＦ）のご
とき受容体リガンドのスクリーニング方法も提供され
る。

【００２２】上記ポリペプチド、ポリペプチドフラグメ
ント、変種および誘導体、変種および誘導体のフラグメ
ント、ならびにそれらのアナログの製造方法を提供する
ことが本発明のもう１つの目的である。本発明のこの態
様の好ましい具体例において、発現可能に導入された外
来のヒト・ＨＬＴＥＸ１１をコードしているポリヌクレ
オチドを有する宿主細胞を、宿主中でのヒト・ＨＬＴＥ
Ｘ１１の発現のための条件下で培養し、次いで、発現し
たポリペプチドを回収することを特徴とする、上記ＨＬ
ＴＥＸ１１ポリペプチドの製造方法が提供される。

【００２３】本発明のもう１つの目的によれば、特に、
研究、生物学、臨床および治療目的に、上記ポリペプチ
ドおよびポリヌクレオチドを用いる製品、組成物、手順
および方法が提供される。

【００２４】本発明の特定の好ましい具体例によれば、
特に、他の事に使用する製品、組成物および方法も提供
され、他の事とは：ＨＬＴＥＸ１１ポリペプチドまたは
ＨＬＴＥＸ１１をコードしているｍＲＮＡを調べること
による細胞中のＨＬＴＥＸ１１発現の評価；本明細書開
示のＨＬＴＥＸ１１ポリペプチドまたはポリヌクレオチ
ドに細胞を曝露することによるインビトロ、エクスビボ
またはインビボでの、とりわけアテローム性動脈硬化、
炎症、および感染、詳細にはＡＩＤＳのごときウイルス
感染の治療；ＨＬＴＥＸ１１遺伝子における欠失のごと
き遺伝学的変種および変状のアッセイ；およびＨＬＴＥ
Ｘ１１機能の増大またはＨＬＴＥＸ１１機能不全の治癒
のための器官へのＨＬＴＥＸ１１ポリペプチドまたはそ
の活性フラグメントまたはポリヌクレオチドの投与であ
る。

【００２５】本発明のもう１つの具体例によれば、ＨＬ
ＴＥＸ１１の発現低下に関連する症状の治療のために本
発明受容体ポリペプチドを刺激するかかる活性化化合物
の使用方法が提供される。

【００２６】本発明のもう１つの態様によれば、ＨＬＴ
ＥＸ１１の過剰発現に関連する症状の治療のためにかか
る阻害化合物を使用する方法も提供される。

【００２７】本発明のもう１つの態様によれば、本発明
ＨＬＴＥＸ１１の少なくとも１個のドメインについての
保存的アミノ酸置換を有するフラグメント、コンセンサ
スフラグメントおよび／または配列である、非天然合
成、単離および／または組み換えＨＬＴＥＸ１１ポリペ
プチドが提供され、その結果、受容体はＨＬＴＥＸ１１
リガンドに結合でき、あるいはＨＬＴＥＸ１１リガンド
結合を定性的または定量的に転調させうる。

【００２８】本発明のさらにもう１つの態様によれば、
予想される生物学的特性のため、リガンドに結合するこ
とまたはリガンド結合を転調させることによりＨＬＴＥ
Ｘ１１機能に対する潜在的モジュレーターとして有用で
ありうる合成または組み換えＨＬＴＥＸ１１ポリペプチ
ド、その保存的置換物および誘導体、それらに対する抗
体、抗−イディオタイプ抗体、ならびに組成物および方
法が提供され、それらを診断、治療および／または研究
用に用いることができる。

【００２９】本発明のこの態様および他の態様の特定の
好ましい具体例において、ヒト・ＨＬＴＥＸ１１配列と
ハイブリダイゼーションするプローブが提供される。

【００３０】本発明のさらにもう１つの目的は、種々の
ＨＬＴＥＸ１１またはそのフラグメントを阻害または模
倣するように、受容体タイプおよびサブタイプとして設
計された合成、単離もしくは組み換えポリペプチドを提
供することである。

【００３１】本発明のこの態様のさらなる好ましい具体
例において、ＨＬＴＥＸ１１ポリペプチドに対する抗体
が提供される。この点において、特定の好ましい具体例
において、抗体はＨＬＴＥＸ１１に対して非常に選択的
である。

【００３２】本発明のさらなる態様において、ＨＬＴＥ
Ｘ１１アゴニストが提供される。ＨＬＴＥＸ１１を模倣
し、ＨＬＴＥＸ１１−結合分子または受容体分子に結合
し、ＨＬＴＥＸ１１により誘導される応答を誘発または
増大させる分子は好ましいアゴニストに含まれる。ＨＬ
ＴＥＸ１１またはＨＬＴＥＸ１１ポリペプチド、あるい
はＨＬＴＥＸ１１活性を有する他のモジュレーターと相
互作用し、そのことによりＨＬＴＥＸ１１の１つの効果
またはＨＬＴＥＸ１１の１つよりも多い効果を有効なら
しめ、あるいは増大させる分子も好ましいアゴニストに
含まれる。

【００３３】本発明のもう１つの態様によれば、ＨＬＴ
ＥＸ１１アンタゴニストが提供される。ＨＬＴＥＸ１１
を模倣してＨＬＴＥＸ１１受容体または結合分子に結合
するがＨＬＴＥＸ１１により誘導される１つの応答また
はＨＬＴＥＸ１１により誘導される１つよりも多い応答
を誘発しないものは好ましいアンタゴニストに含まれ
る。ＨＬＴＥＸ１１と結合または相互作用してＨＬＴＥ
Ｘ１１の１つの効果またはＨＬＴＥＸ１１の１つよりも
多い効果を阻害し、あるいはＨＬＴＥＸ１１の発現を妨
げる分子も好ましいアンタゴニストに含まれる。

【００３４】本発明のさらなる態様において、インビト
ロで細胞に、エクスビボで細胞に、さらにはインビボで
細胞に投与される、あるいは多細胞器官に投与されるＨ
ＬＴＥＸ１１ポリヌクレオチドまたはＨＬＴＥＸ１１ポ
リペプチドを含んでなる組成物が提供される。本発明の
この態様の特定の好ましい具体例において、組成物は、
疾病の治療のための宿主生物中でのＨＬＴＥＸ１１ポリ
ペプチド発現のためのＨＬＴＥＸ１１ポリヌクレオチド
を含んでなる。この点に関して、変化した内在ＨＬＴＥ
Ｘ１１活性に関連した機能不全の治療のためのヒト患者
における発現が特に好ましい。

【００３５】本発明の他の態様、特徴、利点および態様
は下記説明から当業者に明らかとなろう。しかしなが
ら、下記説明および特定の実施例は、本発明の好ましい
具体例を示すものであるが、説明のためだけのものであ
ることを理解すべきである。本発明の精神の範囲内での
種々の変更および修飾は、下記説明を読み、本開示の他
の部分を読めば当業者に容易に明らかとなろう。

【００３６】用語集 下記の説明は本明細書、特に実施例における特定の用語
の理解を容易にするためのものである。「ＤＮＡの消
化」とは、ＤＮＡ中の特定配列にのみ作用する制限酵素
でのＤＮＡの触媒的開裂をいう。本明細書の種々の制限
酵素は市販されており、それらの反応条件、コファクタ
ーおよび使用される他の必要物は知られており、当業者
にとり日常的である。

【００３７】分析目的には、典型的には、２０μｌの反
応バッファー中で１μｇのＤＮＡフラグメントを約２ユ
ニットの酵素で消化する。プラスミド構築用のＤＮＡフ
ラグメントの単離目的には、典型的には、反応規模に応
じて反応体積を増加させて５ないし５０μｌのＤＮＡを
２０ないし２５０ユニットの酵素で消化する。

【００３８】個々の制限酵素に適するバッファーおよび
基質量は標準的な研究室用マニュアル、例えば、後に引
用する文献に記載されており、それらは市販業者により
詳述されている。

【００３９】３７℃で１時間のインキュベーション時間
を通常使用するが、標準的手順、販売者の指示および個
々の反応に応じて条件を変化させてもよい。消化後、反
応物を分析することができ、当業者にとり日常的な既知
方法を用いてアガロースまたはポリアクリルアミドゲル
ゲルによりフラグメントを精製することができる。

【００４０】「遺伝学的エレメント」とは、一般的に
は、ポリペプチドをコードしている領域、あるいは転写
または翻訳または宿主細胞におけるポリペプチドの発現
にとり重要な他のプロセスを調節する領域を含んでなる
ポリヌクレオチドを意味し、あるいはポリペプチドをコ
ードしている領域および発現調節領域に作動可能に連結
された領域の両方を含んでなるポリヌクレオチドを意味
する。

【００４１】遺伝学的エレメントはベクター中に含まれ
ていてもよく、ベクターはエピソームエレメントとして
複製するものであり、すなわち、宿主細胞ゲノムとは物
理的に独立した分子として複製するものである。遺伝学
的エレメントは、真核細胞におけるメトトレキセート選
択によりトランスフェクションされたＤＮＡの増幅期間
中に生じるようなミニ染色体に含まれていてもよい。遺
伝学的エレメントは宿主細胞ゲノムに含まれていてもよ
く、それらは天然の状態でなないが、特に、精製ＤＮＡ
またはベクター中の形態で単離、クローニングおよび宿
主細胞中へ導入される。

【００４２】「単離」とは、「人の手」によって天然状
態から変化させられていることを意味し、すなわち、天
然において単離される場合には、本来の環境から変化さ
せられ、あるいは本来の環境から除去されること、ある
いはその両方を意味する。例えば、天然状態の生きた動
物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドは「単離」されていないが、天然状態における共存
物質から分離されている同じポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは、本明細書の用語によれば「単離」された
ものである。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、用
語「単離」は、それが天然において存在している染色体
および細胞から分離されていることを意味する。

【００４３】単離の一部として、あるいは単離後に、例
えば、突然変異により融合蛋白を得るために、そして宿
主中での増殖または発現のために、かかるポリヌクレオ
チドをＤＮＡのごとき他のポリヌクレオチドに結合させ
ることができる。単離ポリヌクレオチドは、単独または
ベクターのごとき他のポリヌクレオチドと結合されて、
培養細胞または生物そのものに導入されうる。培養宿主
細胞または生物そのものへ導入された場合、本明細書の
用語によれば、かかるＤＮＡはやはり単離されるもので
ある。なぜなら、それらは天然に存在する形態でなく、
あるいは天然環境に存在するものでないからである。同
様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例え
ば、培地処方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの
例えば細胞中への導入のための溶液、化学反応または酵
素反応のための組成物または溶液（それらは天然には存
在しない組成のものであり、その中で単離ポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドは本明細書にいう単離された状
態となっている）の中に存在していてもよい。

【００４４】「連結」とは、しばしば２本鎖ＤＮＡであ
る２個またはそれ以上のポリヌクレオチド間のホスホジ
エステル結合形成プロセスをいう。連結方法は当該分野
においてよく知られており、連結プロトコールは標準的
な研究室用マニュアルおよび文献に記載されており、例
えば、Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,A LABORATO
RY MANUAL,2nd Ed;Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,Cold Spring Harbor,New York(1989)（「Sambrook」
という）および下で引用するManiatis et al.,の１４６
頁に記載されている。

【００４５】「オリゴヌクレオチド」とは比較的短いポ
リヌクレオチドをいう。しばしば、該用語は１本鎖デオ
キシリボヌクレオチドをいうが、１本鎖または２本鎖リ
ボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよびと
りわけ２本鎖ＤＮＡも指すことがある。

【００４６】１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド
のごときオリゴヌクレオチドは、しばしば、自動オリゴ
ヌクレオチド合成のごとき化学的方法により合成され
る。しかしながら、オリゴヌクレオチドを種々の方法に
より製造することができ、それらはインビトロ組み換え
ＤＮＡによる方法ならびに細胞および生物におけるＤＮ
Ａ発現による方法を包含する。

【００４７】化学合成されたＤＮＡは、典型的には最初
に５’リン酸を欠く形で得られる。かかるオリゴヌクレ
オチドの５’末端は、典型的には組み換えＤＮＡ分子を
得るためにＤＮＡリガーゼを用いる連結反応によるホス
ホジエステル結合形成の基質ではない。かかるオリゴヌ
クレオチドの連結が所望の場合には、キナーゼおよびＡ
ＴＰを用いるような標準的方法によりリン酸を付加する
ことができる。

【００４８】一般的には、化学合成されたオリゴヌクレ
オチドの３’末端は遊離ヒドロキシル基を有し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼのごときリガーゼの存在下で、他のオリ
ゴヌクレオチドのごとき他のポリヌクレオチドの５’ホ
スフェートとの間にホスホジエステル結合を容易に形成
する。よく知られているように、所望ならば、連結の前
に他のポリヌクレオチドの５’ホスフェートを除去する
ことによりこの反応を選択的に防止することができる。

【００４９】「プラスミド」は、宿主細胞の染色体の一
部とはならずに安定に遺伝する遺伝学的エレメントであ
る。プラスミドは、細胞複製中におけるその複製および
安定な遺伝を保証し、医学、農学および環境的に重要な
生成物をコードしていてもよい分子をコードしている。
例えば、プラスミドは、病原性細菌の毒性をおおいに増
大させるトキシンをコードしていてもよい。またプラス
ミドは、抗生物質耐性を付与する遺伝子をコードしてい
てもよい。プラスミドは、組み換え遺伝子をクローン化
し発現するのに使用するベクターとして分子生物学にお
いて広く用いられている。一般的には本明細書において
「プラスミド」は、当業者によく知られた慣用的命名法
により、大文字および／または数字が前および／または
後に続く小文字の「ｐ」により命名される。本明細書開
示の出発プラスミドは市販のもの、制限なく公的に利用
可能なものであるか、あるいはよく知られた公表された
方法を用いて利用可能なプラスミドから日常的に構築可
能なものである。本発明により使用可能な多くのプラス
ミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターはよ
く知られており、当業者が容易に入手できるものであ
る。そのうえ、当業者は、本発明における使用に適する
どのような数のプラスミドであっても容易に構築するこ
とができる。本発明におけるかかるプラスミドならびに
他のベクターの特性、構築および使用は、本開示から当
業者に容易に明らかとなろう。

【００５０】一般的には、「ポリヌクレオチド」とはポ
リリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチ
ドをいい、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮ
ＡまたはＤＮＡであってよい。よって、本明細書の用語
ポリヌクレオチドは、特に、１本鎖および２本鎖ＤＮ
Ａ、１本鎖および２本鎖領域の混ざったＤＮＡ、１本鎖
および２本鎖ＲＮＡ、および１本鎖および２本鎖領域の
混ざったＲＮＡをいい、より典型的には、２本鎖のもの
または１本鎖および２本鎖領域の混ざったものをいう。
さらに、本明細書の用語ポリヌクレオチドは、ＲＮＡま
たはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含んで
なる３本鎖をいう。かかる領域中の鎖は同じ分子由来で
あってもよく、また異なる分子由来であってもよい。そ
の領域は１つまたはそれ以上の分子の全体を含みうる
が、典型的には、いくつかの分子の１の領域を含む。３
本鎖らせん領域の分子の１つは、しばしば、１のオリゴ
ヌクレオチドである。さらに本明細書の用語ポリヌクレ
オチドは、１個またはそれ以上の修飾塩基を含む上記Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを包含する。よって、安定性または他
の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡは、本明細書にいう「ポリヌクレオチド」である。
そのうえ、例えばイノシンまたはトリチウム化された修
飾塩基のごとき普通でない塩基を含んでなるＤＮＡまた
はＲＮＡも本明細書にいうポリヌクレオチドである。当
業者に知られた多くの有用な目的の非常に多くの修飾が
ＤＮＡおよびＲＮＡについて行われていることが認識さ
れよう。本明細書の用語ポリヌクレオチドは、かかる化
学的に、酵素的、あるいは代謝的に修飾された形態のポ
リヌクレオチド、ならびに、特にウイルスの特徴および
単一・複合細胞を包含する細胞の特徴を示すＤＮＡおよ
びＲＮＡの化学的形態を包含する。

【００５１】本明細書の用語「ポリペプチド」を以下に
説明する。ポリペプチドの基本的構造はよく知られてお
り、当該分野の多数の教科書および他の刊行物に記載さ
れている。この点からすると、用語ポリペプチドは、ペ
プチド結合により互いに直鎖状に結合した２個またはそ
れ以上のアミノ酸を含んでなるペプチドまたは蛋白をい
うために用いられる。本明細書において該用語は短鎖
（当該分野において通常にはペプチド、オリゴペプチド
およびオリゴマーという）および長鎖（当該分野におい
て一般的には蛋白といい、種々のタイプがある）の両方
をいう。

【００５２】ポリペプチドは、しばしば２０個の天然ア
ミノ酸といわれるもの以外のアミノ酸を含み、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のごとき天然プロセスのみ
ならず当該分野でよく知られた化学的修飾法によっても
末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸を一定のポリペ
プチド中で修飾できることが理解されよう。ポリペプチ
ドにおいて自然に起こる普通の修飾でさえも、ここに挙
げるには膨大すぎるが、それらは基本的な教科書および
さらに詳細な研究論文に記載されており、さらには膨大
な研究文献にも記載されており、それらは当業者によく
知られている。

【００５３】本発明ポリペプチド中に存在してもよい知
られている修飾のうち、少しの例を挙げると、アセチル
化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導
体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、
架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共
有結合による架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタ
ミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、
グリコシレーション、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシ
ル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋
白分解的プロセッシング、ホスホリレーション、プレニ
レーション、ラセミ化、セレノイレーション、硫酸化、
アルギニン化のごとき転移−ＲＮＡにより媒介される蛋
白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーションがあ
る。かかる修飾は当業者によく知られており、科学文献
に非常に詳細に記載されている。いくつかの特によく行
われる修飾、例えばグリコシレーション、脂質付加は、
PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2ndE
d.,T.E.Creighton,W.H.Freemen and Company,New York
(1993)のごとき最も基本的な教科書に記載されている。
多くの詳細なレビューがこの問題について利用でき、例
えば、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF P
ROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York(19
83)中、Wold,F.,Posttranslational Protein Modificat
ions:Prespectives and Prospects,pgs.1-12；Seifter
et al.,Analysis for protein modifications and nonp
rotein cofactors,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)お
よびRattman et al.,Protein Synthesis:Posttranslati
onalModifications and Aging.Ann.N.Y.Acad.Sci.663:4
8-62(1992)にある。

【００５４】よく知られていることであるが、上記した
ように、ポリペプチドは常に完全に直鎖状であるとは限
らないことが理解されよう。例えば、一般的には、天然
に起こるプロセッシングおよび自然には起こらない人間
による操作を包含する翻訳後の出来事の結果として、ポ
リペプチドは至る所で分枝しており、また、分枝ありま
たはなしで環状であったりする。非翻訳的天然プロセス
および全くの合成法によっても、環状、分枝、および分
枝つき環状のポリペプチドが合成されうる。

【００５５】ポリペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびア
ミノ末端およびカルボキシル末端を包含するポリペプチ
ドのいずれの場所においても修飾が起こり得る。実際、
ポリペプチド中のアミノまたはカルボキシル基、あるい
はそれら両方の共有結合によるブロックは、天然および
合成ポリペプチドにおいてよく起こるものであり、かか
る修飾が本発明ポリペプチド中に存在してもよい。例え
ば、蛋白分解プロセッシングの前にイー・コリ（E.col
i）において作られるポリペプチドのアミノ末端残基は
ほとんど例外なくＮ−ホルミルメチオニンである。

【００５６】ポリペプチドにおいて生じる修飾は、しば
しば、それがいかにして作られるのかという機能であろ
う。例えば、宿主中でクローンされた遺伝子を発現する
ことにより作られるポリペプチドは、宿主細胞翻訳後修
飾能およびポリペプチドのアミノ末端に存在する修飾シ
グナルによって、修飾の性質および程度の大部分が決定
される。例えば、よく知られているように、グリコシレ
ーションは、しばしば、E.coliのごとき細菌細胞におい
ては起こらない。したがって、グリコシレーションが望
まれる場合には、ポリペプチドをグリコシレーションす
る宿主中、一般的には真核細胞中で発現すべきである。
昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物と同じ翻訳後グリコシ
レーションを行うので、昆虫細胞発現系は、特に無傷の
グリコシレーションパターンを有する哺乳動物蛋白を効
率よく発現するために開発されてきた。

【００５７】同じタイプの修飾が一定のポリペプチドに
おいて同じ部位またはいくぶん異なった部位においてい
くつか存在しうることが理解されよう。また、一定のポ
リペプチドは多くのタイプの修飾を含みうる。

【００５８】一般的には本明細書の用語「ポリペプチ
ド」は、かかる修飾すべてを含み、詳細には、宿主細胞
中でポリヌクレオチドを発現させることにより合成され
るポリペプチド中に存在する修飾物を含む。

【００５９】本明細書の用語ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドの「変種」とは、もとのポリヌクレオチドま
たはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドをいう。この意味において変種は本開示の以
下の部分およびいずれかの部分においてより詳細に説明
される。変種は、もとのポリヌクレオチドとはヌクレオ
チド配列が異なるポリヌクレオチドを包含する。一般的
には、相違は、もとのヌクレオチド配列と変種ヌクレオ
チド配列が全体的に極めて類似し、多くの領域において
同一であるようなものに限られる。

【００６０】下記のごとく、変種におけるヌクレオチド
配列の変化がサイレントであってもよい。すなわち、そ
れらは、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸
を変化させなくてもよい。変化がこのタイプのサイレン
ト変化に限定される場合、変種はもとのポリペプチドと
同じアミノ酸配列をコードしているであろう。また、下
記のごとく、変種におけるヌクレオチド配列の変化が、
もとのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列を変化させたものであってもよい。下
記のごとく、かかるヌクレオチド変化は、もとの配列に
よりコードされるポリペプチド中のアミノ酸置換、付
加、欠失、融合および切断を引き起こし得る。

【００６１】また変種は、もとのポリペプチドとはアミ
ノ酸配列が異なるポリペプチドも包含する。一般的に
は、相違は、もとのアミノ酸配列と変種アミノ酸配列が
全体的に極めて類似し、多くの領域において同一である
ようなものに限られる。

【００６２】変種ともとのポリペプチドとは、１個また
はそれ以上の置換、付加、欠失、融合および切断により
アミノ酸配列が異なっていてもよく、それらはいずれの
組み合わせにおいて存在してもよい。

【００６３】本明細書の用語「融合蛋白」は、２種の、
しばしば無関係な融合遺伝子またはそれらのフラグメン
トによりコードされている蛋白である。ＥＰ−Ａ−Ｏ４
６４５３３（カナダ対応２０４５８６９）には、別のヒ
ト・蛋白またはその一部分と結合した免疫グロブリン分
子の不変領域の種々の部分を含む融合蛋白が開示されて
いる。いくつかの場合において、融合蛋白の一部として
免疫グロブリンＦｃ領域を用いることは、例えば、改善
された薬物動態特性を得る治療および診断において有用
である（ＥＰ−Ａ０２３２２６２）。一方、ある種の使
用については、融合蛋白が発現され、検出され、精製さ
れた後にＦｃ部分を欠失できることが好ましい。したが
って、融合蛋白の構成成分を開裂可能な連結領域に化学
的または酵素的に結合させることが望ましい。このよう
な場合とは、Ｆｃ部分は治療および診断における使用を
妨げることがわかっているような場合であり、例えば、
融合蛋白を免疫のための抗原として用いる場合である。
薬剤の発見において、例えば、ｓｈＩＬ−５−αのごと
きヒト・蛋白をＦｃ部分と融合させて、ｈＩＬ−５のア
ンタゴニストを同定するための高処理量スクリーニング
に用いる。D.Bennett et al.,Journal of Molecular Re
cognition,1995,8:52-58；およびK.Johansonet al.,The
Journal of Biological Chemistry,1995,270(16):9459
-9471参照。

【００６４】よって、本発明は、ＨＬＴＥＸ１１または
その一部分、および種々のサブクラス（ＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫グロブリンの重鎖または軽
鎖の不変領域の種々の部分を含む、遺伝子操作による可
溶性融合蛋白にも関する。ヒト・ＩｇＧ、詳細にはＩｇ
Ｇ１の重鎖の不変領域が免疫グロブリンとして好ましい
（ヒンジ領域で融合が起こる）。１の具体例において、
血液凝固因子Ｘａで開裂されうる開裂配列を含ませるこ
とのみにより、Ｆｃ部分を除去することができる。さら
に本発明は、遺伝子操作によるこれらの融合蛋白の製造
方法、ならびに診断および治療における融合蛋白の使用
に関する。本発明のさらなる態様は、かかる融合蛋白を
コードしているポリヌクレオチドに関する。

【００６５】膜結合受容体は融合蛋白の形成において特
に有用である。一般的には、かかる受容体は、３つの異
なる構造領域（細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およ
び細胞質ドメイン）を有することにより特徴づけられ
る。本発明は、これらの領域の１つまたはそれ以上を融
合蛋白の構成成分として使用することを企図する。かか
る融合蛋白法の例はＷＯ９４／２９４５８およびＷＯ９
４／２２９１４に見いだされる。

【００６６】「結合分子」（あるいは「相互作用分子」
または「受容体構成成分因子」とも呼ばれる）は、本発
明受容体ポリペプチドに特異的に結合またはこれと相互
作用するリガンドを包含する分子をいう。かかる結合分
子は本発明の一部分をなす。結合分子は、本発明ポリペ
プチドに特異的に結合する抗体および抗体由来の試薬の
ごとき天然に存在しないものであってもよい。

【００６７】当該技術分野で知られた用語である、２つ
のポリペプチド間の「類似性」は、１のポリペプチドア
ミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換をもう１つの
ポリペプチドの配列と比較することにより決定される。
そのうえ、当該技術分野で知られた用語である「同一
性」とは、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレ
オチド間の配列関連性の程度を意味し、かかる２つの配
列間の合致により決定される。同一性および類似性は両
方とも容易に計算されうる（Computational Molecular
Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New
York,1988;Biocomputing Informations and Genome Pro
jects,Smith,D.W.,ed,Academic Press,NewYork,1993;Co
mputer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.
M.and Griffin,H.G.,eds,Humana Press,New Jersey,199
4;Srquence Analysis in Molecular Biology,von Heinj
e,G.,Academic Press,1987；およびSequence Analysis
Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.eds.,M Stockton P
ress,New York,1991）。２つのポリヌクレオチドまたは
ポリペプチド間の同一性および類似性の多くの測定方法
が存在するが、用語「同一性」および「類似性」は当業
者によく知られている（Sequence Analysis in Molecul
ar Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;Seque
nce Analysis Primer, Gribskov,M.and Devereux,J.ed
s.,M StocktonPress,New York,1991；およびCarillo,
H.,and Lipmn,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(198
8)）。２つの配列間の同一性または類似性の決定に広く
用いられる方法は、Carillo,H.,and Lipmn,D.,SIAM J.A
pplied Math.,48:1073(1988)に開示されたものを包含す
るが、これに限らない。同一性を決定するための好まし
い方法は、試験される２つの配列間の合致が最大となる
ように設計される。同一性および類似性を決定する方法
はコンピュータープログラムにおいて集成されている。
２つの配列間の同一性および類似性の決定に好ましいコ
ンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケ
ージ（Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12
(1):387(1984)）、BLASTP,BLASTAN,FASTA（Atschul,S.
F.et al.,J.Molec.Biol.215:403(1990)）を包含する
が、これらに限らない。

【００６８】発明の詳細な説明 本発明は、以下に詳細に説明するように、特に新規ＨＬ
ＴＥＸ１１ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関す
る。詳細には、本発明は、アミノ酸配列の相同性によ
り、活性化Ｔ細胞において誘導されたニワトリ・Ｇ−蛋
白結合受容体およびヒト・血小板活性化因子受容体ポリ
ペプチドに関連する新規ヒト・ＨＬＴＥＸ１１のポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特
に、図１および図２に示すヌクレオチドおよびアミノ酸
配列を有するＨＬＴＥＸ１１、ならびにＡＴＣＣ受託番
号９８１３０（本明細書では「寄託クローン」または
「寄託クローンのｃＤＮＡ」という）中のヒト・ｃＤＮ
ＡのＨＬＴＥＸ１１ヌクレオチド配列およびそれにより
コードされるアミノ酸配列に関する。図１および図２に
示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列は寄託クローンの
ｃＤＮＡを配列決定することにより得られたことが理解
されるであろう。それゆえ、寄託クローンの配列は二者
の不一致について支配的であり、図１および図２に対す
る言及は寄託クローンのヒト・ｃＤＮＡの配列への言及
を包含する。

【００６９】ポリヌクレオチド本発明の１の態様によれ
ば、図２の推定アミノ酸配列を有するＨＬＴＥＸ１１ポ
リペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供さ
れる。

【００７０】図１に示すポリヌクレオチド配列のごとき
本明細書の情報を用いれば、脾臓または睾丸由来の細胞
を出発物質として得られるｍＲＮＡを用いるｃＤＮＡク
ローニングのための方法のごとき標準的クローニングお
よびスクリーニング法を用いてヒト・ＨＬＴＥＸ１１ポ
リペプチドをコードしている本発明ポリヌクレオチドを
得ることができる。本発明の説明として、前著のＨＬＴ
ＥＸ１１遺伝子はヒト・脾臓プラスミドｃＤＮＡライブ
ラリーから単離されたものである。最初に、ヒト・Ｔ細
胞リンパ腫ｃＤＮＡライブラリーから調製されたｃＤＮ
Ａライブラリーより部分配列を得た。この配列を用い
て、部分クローンの５’末端卑近のプライマーを設計し
て全長のクローンを単離した。３’プライマーも作成
し、５’プライマーと組み合わせて用いて９個の異なる
ヒト・組織プラスミドｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングした。これらのうち、脾臓および睾丸のライブラ
リーのみがＨＬＴＥＸ１１遺伝子を含んでいた。

【００７１】寄託クローン中のヒト・ＨＬＴＥＸ１１を
コードしているｃＤＮＡの配列決定の結果により示され
るように、本発明ヒト・ＨＬＴＥＸ１１は、活性化Ｔ細
胞および血小板において発現される他の蛋白に構造的に
関連している。このようにして得られたｃＤＮＡ配列を
図１に示す。それは、推定分子量約３８ｋＤａの、約３
３９個のアミノ酸からなる蛋白をコードしている読み枠
を含んでいる。最初の約２０個のアミノ酸は推定上のリ
ーダー配列である。該蛋白は、他の既知蛋白のなかで
も、活性化Ｔ細胞において誘導されたニワトリ・Ｇ−蛋
白結合受容体ならびにヒト・血小板活性化因子受容体蛋
白に対して高い相同性を有する。図１のＨＬＴＥＸ１１
は、活性化Ｔ細胞において誘導されたニワトリ・Ｇ−蛋
白結合受容体の遺伝子配列全体に対して約３４％の同一
性および５６％の類似性を有し、ヒト・血小板活性化因
子受容体蛋白の遺伝子配列全体に対して約３６％の同一
性を有し、５４％の類似性を有する。

【００７２】本発明ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのご
ときＲＮＡ形態であってもよく、あるいは例えばクロー
ニングまたは化学合成法またはそれらの組み合わせによ
り得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含するＤＮ
Ａ形態であってもよい。ＤＮＡは２本鎖または１本鎖で
あってよい。１本鎖ＤＮＡはコーディング鎖（センス鎖
としても知られる）であってもよく、あるいは非コーデ
ィング鎖（アンチ−センス鎖としても知られる）であっ
てもよい。

【００７３】ポリペプチドをコードしているコーディン
グ配列は、図１、配列番号：１に示すポリヌクレオチド
のコーディング鎖と同じであってもよい。コーディング
鎖は別の配列を有するポリヌクレオチドであってもよ
く、それは、遺伝コードの縮重の結果として図２、配列
番号：２のポリペプチドをコードしているものであって
もよい。

【００７４】図２のポリペプチドをコードしている本発
明ポリヌクレオチドは、それらにより示されるポリペプ
チドに関するコーディング配列；当該ポリペプチド配列
およびリーダー配列または分泌配列（プレ−またはプロ
−またはプレプロ−蛋白配列）をコードしているような
付加的配列に関するコーディング配列；さらなる非コー
ディング配列（例えば、イントロンおよび転写されるが
翻訳されない非コーディング５’および３’配列（転
写、ｍＲＮＡプロセッシング−スプライシングおよびポ
リアデニレーションシグナルを包含−リボソーム結合お
よびｍＲＮＡ安定性において役割を果たす）；さらなる
コーディング配列（さらなる官能基を提供するさらなる
ようなアミノ酸をコードしている）を伴った上記の付加
的配列を有するあるいは有していないポリペプチドに関
するコーディング配列（これらに限らない）を包含して
もよい。よって、例えば、ポリペプチドがペプチドのご
ときマーカー配列に融合していてもよく、該マーカー配
列は融合ポリペプチドの精製を容易にするものであって
よい。本発明のこの態様の特定の好ましい具体例におい
て、マーカー配列は、特にｐＱＥベクター（Qiagen,In
c）中のタグのごときヘキサヒスチジンペプチドであ
り、それらの多くが市販されている。例えば、Gentz et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 86,821-824(1989)に記
載のごとく、ヘキサヒスチジンは融合蛋白の精製を便利
にする。ＨＡタグはインフルエンザ・ヘマグルチニン蛋
白に対応するものであり、例えば、Wilson et al.,Cell
37:767(1984)に記載されている。

【００７５】上記によれば、本明細書の用語「ポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポ
リペプチド、詳細には、図２に示すアミノ酸配列を有す
るヒト・ＨＬＴＥＸ１１をコードしている配列を含むポ
リヌクレオチドを包含する。該用語は、さらなる領域
（コーディングおよび／または非コーディング配列を含
んでいてもよい）を伴ったポリペプチド（例えば、イン
トロンにより分断されている）をコードしている単一の
連続領域または不連続領域を含むポリヌクレオチドを包
含する。

【００７６】さらに本発明は、上記ポリヌクレオチドの
変種に関する。該変種は図２の推定アミノ酸配列を有す
るポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体
をコードしている。ポリヌクレオチドの変種は、天然に
存在する対立遺伝子変種のごとき天然に存在する変種で
あってもよく、あるいは天然に存在することが知られて
いない変種であってもよい。かかるポリヌクレオチドの
非天然変種を、ポリヌクレオチド、細胞または生物に適
用される突然変異法を包含する突然変異法により作成し
てもよい。

【００７７】この点において、ヌクレオチド置換、欠失
または付加によって上記ポリヌクレオチドと異なる変種
も「変種」に含まれる。置換、欠失または付加には１個
またはそれ以上のヌクレオチドが関与しうる。変種はコ
ーディング配列または非コーディング配列あるいはそれ
らの両方において変化していてもよい。コーディング配
列の変化が保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失ま
たは付加を生じるものであってもよい。

【００７８】この点において本発明の特に好ましい具体
例は、図２に示すＨＬＴＥＸ１１のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；そ
の変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならび
にその変種、アナログおよび誘導体のフラグメントであ
る。この点において、ＨＬＴＥＸ１１変種、アナログ、
誘導体およびフラグメント、ならびにそのフラグメント
の変種、アナログおよび誘導体をコードしているポリヌ
クレオチドであって、図２のＨＬＴＥＸ１１ポリペプチ
ドのアミノ酸配列を有するものがさらに特に好ましく、
該アミノ酸中、いくつかの、少数の、５ないし１０個、
１ないし５個、１ないし３、２、１個または０個のアミ
ノ酸残基が置換、欠失または付加されており、あるいは
それらが組み合わされている。これらのうち特に好まし
いのは、サイレント置換、付加および欠失であり、それ
らはＨＬＴＥＸ１１の特性および活性を変化させない。
また、この点において、保存的置換が特に好ましい。置
換を有しない図２のアミノ酸配列を有しているポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチドが最も好まし
い。

【００７９】本発明のさらに好ましい具体例は、図２に
示すアミノ酸配列を有するＨＬＴＥＸ１１ポリペプチド
をコードしているポリヌクレオチドに対して少なくとも
７０％同一であるポリヌクレオチド、およびかかるポリ
ヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。ある
いはまた、本明細書記載のライブラリーから得られるヒ
ト・ｃＤＮＡのＨＬＴＥＸ１１ポリペプチドをコードし
ているポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％同一
である領域を含むポリヌクレオチドおよびそれに相補的
なポリヌクレオチドが非常に好ましい。この点におい
て、上記ポリペプチドに対して少なくとも９０％同一で
あるポリヌクレオチドが特に好ましく、特に好ましいの
は、少なくとも９５％同一のものである。さらにそのう
え、少なくとも９７％同一のものが非常に好ましく、少
なくとも９８ないし９９％同一のものが特に非常に好ま
しく、少なくとも９９％のものが最も好ましい。

【００８０】そのうえ、この点において特に好ましい具
体例は、図１のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ドのいずれかと実質的に同じ生物学的機能または活性を
保持しているポリペプチドをコードしているポリヌクレ
オチドである。

【００８１】さらに本発明は、本明細書において上で述
べた配列とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチ
ドに関する。この点において本発明は、特に、厳密な条
件下で本明細書において上で述べた配列とハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドに関する。本明細書の
用語「厳密な条件」とは、少なくとも９５％、好ましく
は少なくとも９７％同一である配列間においてのみハイ
ブリダイゼーションが起こることを意味する。

【００８２】ポリヌクレオチドは、当該蛋白およびさら
なるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸、あるい
はポリペプチドに対するさらなる内部アミノ酸（ペプチ
ド形態が１種よりも多いポリペプチド鎖を有する場合）
であるポリペプチドをコードしていてもよい。かかる配
列は、前駆体から個々の形態への蛋白のプロセッシング
において役割を果たしている可能性があり、蛋白輸送を
容易にする可能性があり、蛋白半減期を延長または短縮
する可能性があり、あるいは特に、アッセイまたは製造
のために蛋白の取り扱いを容易にする可能性もある。in
situにおける一般的な場合には、細胞酵素により、さ
らなるアミノ酸がプロセッシングにより蛋白から除去さ
れうる。１またはそれ以上のプロ配列に融合した特別の
形態のポリペプチドを有する前駆体蛋白は、そのポリペ
プチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去さ
れる場合、一般的にはかかる不活性前駆体が活性化され
る。プロ配列のいくつかまたはすべてが活性化前に除去
される。一般的にはかかる前駆体はプロ蛋白と呼ばれ
る。

【００８３】まとめると、本発明ポリヌクレオチドは、
蛋白、蛋白およびリーダー配列（プレ蛋白ともいわれ
る）、プレ蛋白のリーダー配列でない１個またはそれ以
上のプロ配列を有する蛋白の前駆体、あるいは１個また
はそれ以上のプロ配列（一般的には、活性形態または他
の形態のポリペプチドを生じるプロセッシング工程の間
に除去される）を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプ
ロ蛋白をコードしていてもよい。

【００８４】寄託物 ヒト・ＨＬＴＥＸ１１ ｃＤＮＡの寄託は、American Ty
pe Culture Collection,12301 Park Lawn Drive,Rockvi
lle,Maryland 20852,USAに、１９９６年８月８日に寄託
され、受託番号９８１３０を付与された。本明細書にお
いてヒト・ｃＤＮＡ寄託物を「寄託クローン」または
「寄託クローンのｃＤＮＡ」という。寄託材料は、イー
・コリ（E.coli）のｐＣＭＶＳｐｏｒｔＨＬＴＥＸ１１
（ＭＭ２９４株）からなり、全長のＨＬＴＥＸ１１ ｃ
ＤＮＡを含んでいる。

【００８５】寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際
承認に関するブダペスト条約の条件下でなされている。
特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最終
的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ
提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.１１２条のもとに要求される
ような、寄託が実施可能要件であることを承認するもの
ではない。寄託材料中の含まれるポリヌクレオチドの配
列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列は、本明細書の配列の記載との矛盾が起こっ
た場合に支配的である。寄託物を製造、使用または販売
するためにはライセンスが必要であるが、そのようなラ
イセンスはここでは賦与されていない。

【００８６】ポリペプチドさらに本発明は、図２、配列
番号：２の推定アミノ酸配列を有するヒト・ＨＬＴＥＸ
１１ポリペプチドに関する。

【００８７】また本発明は、これらのポリペプチドのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フ
ラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図２
のポリペプチドについていう場合、かかるポリペプチド
と本質的に同じ生物学的機能または活性を保持している
ポリペプチドを意味する。よって、アナログは、プロ蛋
白部分の開裂により活性化されて活性ポリペプチドを生
じうるプロ蛋白を包含する。

【００８８】本発明ポリペプチドは組み換えポリペプチ
ド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであって
もよい。特定の好ましい具体例において、本発明ポリペ
プチドは組み換えポリペプチドである。

【００８９】図２のポリペプチドのフラグメント、誘導
体またはアナログは以下のものである：（ｉ）１個また
はそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミ
ノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換さ
れており、かかる置換アミノ酸残基は遺伝コードにより
コードされているものであっても、コードされていない
ものであってもよく、あるいは（ｉｉ）１個またはそれ
以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉ
ｉｉ）ポリペプチドの半減期を延長させるような別の化
合物（例えば、ポリエチレングリコール）にポリペプチ
ドが融合しているもの、あるいは（ｉｖ）リーダーまた
は分泌配列、またはポリペプチドの精製に用いられる配
列、またはプロ蛋白配列のごときさらなるアミノ酸がポ
リペプチドに融合しているもの。かかるフラグメント、
誘導体およびアナログは、本明細書の教示から当業者の
範囲内であると考えられる。

【００９０】この点において、図２に示すＨＬＴＥＸ１
１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、ア
ナログ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグ
メントの変種、アナログおよび誘導体は本発明の特に好
ましい具体例に属する。あるいはまた、この点におい
て、本発明の特に好ましい具体例は、ＨＬＴＥＸ１１の
アミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナロ
グ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグメン
トの変種、アナログおよび誘導体である。

【００９１】保存的アミノ酸置換によって元のものとは
異なる変種も好ましい変種に属する。かかる置換は、ポ
リペプチド中のあるアミノ酸を同様の特性の別のアミノ
酸で置換するものである。典型的に見られるのは、脂肪
族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間での
相互置換；水酸基を有するＳｅｒおよびＴｈｒの相互置
換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの相互置換、アミド残
基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基性残基Ｌｙｓおよ
びＡｒｇの置換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間
の置換である。

【００９２】この点において、いくつかの、少数の、５
ないし１０個の、１ないし５個の、１ないし３、２、１
個の、または０個のアミノ酸残基が置換、欠失または付
加（あるいはそれらのいずれかの組み合わせ）されてい
る図２のＨＬＴＥＸ１１ポリペプチドのアミノ酸配列を
有する変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、な
らびに該フラグメントの変種、アナログおよび誘導体が
さらに特に好ましい。ＨＬＴＥＸ１１の特性および活性
を変化させないサイレント置換、付加および欠失がこれ
らのうちで特に好ましい。また、この点において、保存
的置換が特に好ましい。置換のない図２のアミノ酸配列
を有するポリペプチドがもっとも非常に好ましい。

【００９３】好ましくは、本発明ポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドは単離形態で提供され、好ましくは均一
にまで精製されている。

【００９４】本発明ポリペプチドは、配列番号：２のポ
リペプチド（詳細には成熟ポリペプチド）ならびに配列
番号：２のポリペプチドに対して少なくとも７０％の同
一性を有し、より好ましくは配列番号：２のポリペプチ
ドに対して少なくとも９０％の類似性（より好ましくは
少なくとも９０％の同一性）を有し、さらにより好まし
くは配列番号：２のポリペプチドに対して少なくとも９
５％の類似性（さらに好ましくは少なくとも９５％の同
一性）を有するポリペプチドを包含し、また、かかるポ
リペプチドの部分も包含する（ポリペプチドに対するか
かる部分は一般的には少なくとも３０個のアミノ酸、よ
り好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含む）。

【００９５】本発明ポリペプチドのフラグメントまたは
部分を、ペプチド合成による対応する全長のポリペプチ
ドの合成に使用してもよい。それゆえ、フラグメントを
全長のポリペプチドの製造のための中間体として使用し
てもよい。本発明ポリペプチドのフラグメントまたは部
分を用いて本発明の全長のポリヌクレオチドを合成して
もよい。フラグメントは「フリー−スタンディング（fr
ee-standing）」、すなわち、他のアミノ酸またはポリ
ペプチドの一部でなく、それらに融合していないもので
あってよく、あるいはかかるフラグメントが大きなポリ
ペプチド中に含まれていて、その一部分または領域とな
っていてもよい。大きなポリペプチド中に含まれている
場合、現在議論中のフラグメントは、最も好ましくは単
一の連続した領域を形成する。しかしながら、単一のよ
り大きなポリペプチド中にいくつかのフラグメントが含
まれていてもよい。例えば、特定の好ましい具体例は、
宿主における発現のために設計された前駆体ポリペプチ
ド中に含まれていて、ＨＬＴＥＸ１１フラグメントのア
ミノ末端に融合した異種プレおよびプロ−ポリペプチド
領域ならびに該フラグメントのカルボキシル末端に融合
したさらなる領域を有している本発明ＨＬＴＥＸ１１ポ
リペプチドのフラグメントに関する。それゆえ、本明細
書における意味の１の態様において、フラグメントと
は、ＨＬＴＥＸ１１由来の融合ポリペプチドまたは融合
蛋白の一部または部分をいう。

【００９６】本発明ポリペプチドフラグメントの典型例
として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０個、
１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし７５
個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０ないし
１００個および７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸のものを挙げることができる。

【００９７】この文脈において、「約」とは、特に列挙
した範囲、ならびに数個、少数、５、４、３、２、１個
のアミノ酸の分だけ大きいまたは小さい範囲（上限また
は下限、あるいはそれらの両方の範囲において）を包含
する。例えば、この文脈において、約４０ないし９０個
のアミノ酸は、４０プラスマイナス数個、少数、５、
４、３、２、１個から、９０プラスマイナス数個、少
数、５、４、３、２、１個までのポリペプチドフラグメ
ントを意味し、すなわち、広くは４０マイナス数個から
９０プラス数個のアミノ酸、狭くは４０プラス数個から
９０マイナス数個のアミノ酸の範囲である。この点にお
いて、列挙した範囲プラスまたはマイナス５個程度のア
ミノ酸（上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲
において）が非常に好ましい。列挙した範囲プラスまた
はマイナス３個程度のアミノ酸（上限または下限、ある
いはそれらの両方の範囲において）が特に非常に好まし
い。列挙した範囲プラスまたはマイナス１個程度のアミ
ノ酸（上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲に
おいて）または列挙した範囲そのものが特に非常に好ま
しい。この点において、約５ないし１５個、１０ないし
２０個、１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１な
いし７５個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５
０ないし１００個および７５ないし１００個、９０ない
し１１５個、１００ないし１２５個、および１１０ない
し１１３個のアミノ酸の長さのフラグメントが最も好ま
しい。

【００９８】ＨＬＴＥＸ１１の切断された変異種は本発
明の特に好ましいフラグメントに含まれる。切断された
変異種は、図２のアミノ酸配列を有するＨＬＴＥＸ１１
ポリペプチド、あるいはその変種または誘導体を包含す
るが、アミノ末端を含む連続した一連の残基（すなわ
ち、連続した領域、部分または一部分）の欠失、あるい
はカルボキシル末端を含む連続した一連の残基の欠失、
あるいは二重切断変異種（double truncation mutant
s）中にあるような２つの連続した残基の欠失（１つは
アミノ末端を含み、もう１つはカルボキシル末端を含
む）は除く。本発明の特に好ましい膜結合受容体のフラ
グメントは、細胞外ドメイン（それに付随する膜貫通お
よび細胞質ドメインは伴わない）ならびに膜貫通領域の
欠失（細胞外ドメインは細胞質ドメインに直接融合す
る）を含む可溶性形態の受容体を包含する。例えば、公
開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／０３６２０参照。あるい
はまた、本発明フラグメントは、膜貫通領域のみの欠失
ならびに細胞質ドメインの少なくとも一部の保持を含ん
でいてもよく、あるいはＷＯ９６／０４３８２に記載さ
れたような別の細胞質ドメインの少なくとも一部が融合
していてもよい。上に示したサイズ範囲のフラグメント
も切断されたフラグメントの好ましい具体例であり、一
般的にはそれらはフラグメントのなかでも特に好ましい
ものである。

【００９９】本発明のこの態様において、ＨＬＴＥＸ１
１ポリペプチドの構造的または機能的属性によって特徴
づけられるフラグメントも好ましい。この点において本
発明の好ましい具体例は、ＨＬＴＥＸ１１ポリペプチド
のアルファ−ヘリックスおよびアルファ−ヘリックス形
成領域（「アルファ−領域」）、ベータ−シートおよび
ベータ−シート形成領域（「ベータ−領域」）、ターン
およびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよ
びコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、
疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領
域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性イ
ンデックス領域を含んでなるフラグメントを包含する。

【０１００】この点において、いくつかの上記特徴のご
ときいくつかの構造的特徴を合わせたＨＬＴＥＸ１１の
領域を含んでなるフラグメントは、非常に好ましいフラ
グメントに属する。この点において、図２の、約１０な
いし約２０個、約４０ないし約５０個、約７０ないし約
９０個および約１００ないし約１１３個の残基により決
定される領域（そのすべてが、ターン領域、親水性領
域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性イ
ンデックス領域の特徴を顕著に有するアミノ酸組成によ
り特徴づけられる）は特に非常に好ましい領域である。
かかる領域は大きなポリペプチド中に含まれていてもよ
く、あるいは上記のごとくそれら自体本発明の好ましい
フラグメントでありうる。この段落の用語「約」は一般
的なフラグメントに関して上で説明した意味を有する。

【０１０１】さらに好ましい領域はＨＬＴＥＸ１１の活
性を媒介する領域である。この点において、ＨＬＴＥＸ
１１の化学的、生物学的活性または他の活性（類似活性
または改善された活性を包含、望ましくない活性は減じ
られている）を有するフラグメントが最も好ましい。こ
の点において、活性化Ｔ細胞において誘導されたニワト
リ・Ｇ−蛋白結合受容体およびヒト・血小板活性化因子
受容体のごとき関連ポリペプチドの活性領域に対して、
配列または位置、あるいは配列および位置の両方につい
ての相同物である領域を含むフラグメントが非常に好ま
しい。

【０１０２】さらに本発明は、特に、上記フラグメント
をコードしているポリヌクレオチド、該フラグメントを
コードしているポリヌクレオチドにハイブリダイゼーシ
ョンするポリヌクレオチド、詳細には厳密な条件下でハ
イブリダイゼーションするもの、および該フラグメント
をコードしているポリペプチドを増幅するためのＰＣＲ
プライマーのごときポリヌクレオチドに関することが理
解されよう。これらの点において、好ましいポリヌクレ
オチドは上記のような好ましいフラグメントに対応する
ポリヌクレオチドである。

【０１０３】ベクター、宿主細胞、発現 また、本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、本発明ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞
および組み換え法による本発明ポリペプチドの製造に関
する。

【０１０４】宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチ
ドを含むようにして、本発明ポリペプチドを発現させる
ことができる。例えば、感染、形質導入、トランスフェ
クション、トランスベクションおよび形質転換のよく知
られた方法を用いてポリヌクレオチドを宿主細胞中に導
入してもよい。ポリヌクレオチドを単独または他のポリ
ヌクレオチドとともに導入してもよい。かかる他のポリ
ヌクレオチドを本発明ポリヌクレオチドとは別個に、同
時に、あるいは本発明ポリヌクレオチドと結合して導入
してもよい。よって、例えば、哺乳動物細胞において同
時トランスフェクションおよび選択のための標準的方法
を用いて、例えば、本発明ポリヌクレオチドを、選択可
能マーカーをコードしているもう１つの別個のポリペプ
チドとともに宿主細胞中にトランスフェクションしても
よい。この場合、一般的には、ポリヌクレオチドは宿主
細胞ゲノム中に安定に取り込まれるであろう。

【０１０５】別法として、宿主中での増殖のための選択
可能マーカーを含むベクターにポリヌクレオチドを結合
させてもよい。上記方法によりベクター構築物を宿主細
胞中に導入してもよい。一般的には、プラスミドベクタ
ーを、リン酸カルシウム沈殿のごとき沈殿中、あるいは
荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入する。エレク
トロポレーションを用いてポリヌクレオチドを細胞中に
導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、それ
をインビトロでパッケージングし、あるいはパッケージ
ング細胞中に導入することができ、パッケージングされ
たウイルスを細胞中にトランスダクションすることがで
きる。本発明によるポリヌクレオチドの製造および細胞
中へのポリヌクレオチドの導入に適した広範囲の方法は
当業者によく知られており、日常的なものである。かか
る方法は上記Sambrook et al.の文献にようやく記載さ
れたものであり、その文献はこれらの方法を詳述する多
くの研究室マニュアルの説明である。

【０１０６】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、１本鎖もしくは２本鎖のフ
ァージベクター、１本鎖もしくは２本鎖のＲＮＡまたは
ＤＮＡウイルスベクターであってよい。細胞中へのＤＮ
ＡおよびＲＮＡ導入のためのよく知られた方法によっ
て、かかるベクターをポリヌクレオチドとして、好まし
くはＤＮＡとして細胞中に導入することができる。ファ
ージおよびウイルスベクターの場合、感染および形質導
入のためのよく知られた方法によって、好ましくは、パ
ッケージングされ、あるいはカプセル封入されたウイル
スとしてベクターを細胞中に導入する。ウイルスベクタ
ーは複製可能であってもよく、複製欠陥であってもよ
い。後者の場合、一般的にはウイルス増殖は相補的宿主
細胞においてのみ起こるであろう。

【０１０７】特定の態様において、本発明ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの発現用ベクターが特に好まし
い。一般的には、かかるベクターは、発現されるべきポ
リヌクレオチドに作動可能に連結された宿主中での発現
に効果的なシス−作用性制御領域を含んでなる。適当な
トランス−作用性因子は宿主によっても提供され、ある
いは相補的ベクターによっても提供され、あるいは宿主
中への導入によりベクター自身により提供される。

【０１０８】この点において、特定の好ましい具体例に
おいて、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異
的発現は誘導可能な発現であってもよく、あるいはある
種のタイプの細胞においてのみ起こる発現であってもよ
く、あるいは誘導可能および細胞特異的の両方であって
もよい。温度および栄養添加物のごとき操作容易な環境
因子による発現に関して誘導されうるベクターが、特に
好ましい誘導可能ベクターである。原核細胞および真核
細胞において使用される構成的発現ベクターおよび誘導
可能発現ベクターを包含する本発明のこの態様に適した
種々のベクターは当業者によく知られており、日常的に
使用されている。

【０１０９】遺伝子操作された宿主細胞を慣用的な培地
で培養することができ、特にプロモーターの活性化、形
質転換体の選択または遺伝子の増幅に関して、適宜、培
地を修飾してもよい。発現用に選択された宿主細胞に関
して以前使用されていた温度、ｐＨ等の培養条件は、一
般的には、当業者に明らかであるように、本発明ポリペ
プチドの発現に適するであろう。

【０１１０】非常に多種にわたる発現ベクターを用いて
本発明ポリペプチドを発現させることができる。かかる
ベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来の
ベクター、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、バ
クテリオファージ由来のベクター、酵母エピソーム由来
のベクター、酵母染色体エレメント由来のベクター、バ
クイロウイルスのごときウイルス、類人猿ウイルス４０
（「ＳＶ４０」）のごときパポーバウイルス、ワクシニ
アウイルス、アデノウイルス、フォウルポックスウイル
ス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来のも
の、ならびにコスミドおよびファージミドのごときプラ
スミドおよびバクテリオファージの遺伝エレメント由来
のベクターのごときそれらの組み合わせ由来のベクター
を包含し、それらすべてを本発明のこの態様による発現
に使用できる。この点において、一般的には、宿主細胞
中でのポリヌクレオチドの維持、増殖または発現に適し
たベクターを発現に用いることができる。

【０１１１】種々のよく知られた日常的方法のいずれに
よっても適当なＤＮＡ配列をベクター中に挿入すること
ができる。一般的には、発現させるＤＮＡ配列および発
現ベクターを１種またはそれ以上の制限酵素で開裂し、
次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて制限フラグメン
トを結合させることにより、発現させるＤＮＡ配列を発
現ベクターに結合させる。この目的に用いることのでき
る制限的開裂および連結の手順は当業者によく知られて
おり、日常的なものである。この点において、別法を用
いる発現ベクターの構築のための適当な手順も当業者に
よく知られており、本明細書の他の場所で引用している
Sambrook et al.の文献に非常に詳細に説明されてい
る。

【０１１２】発現ベクター中のＤＮＡ配列を適当な発現
制御配列（例えば、ｍＲＮＡ転写を指令するプロモータ
ーを包含）に作動可能に連結する。かかるプロモーター
の典型例は、ファージラムダＰＬプロモーター、E.coli
のlac、trpおよびtacプロモーター、ＳＶ４０初期およ
び後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲプロ
モーターを包含するが、それらは当業者によく知られて
いるもののほんの例示に過ぎない。ここで述べなかった
多くのプロモーターも本発明のこの態様に適し、それら
は当業者によく知られており、本明細書で説明され、実
施例に示されたようにして容易に使用されうることが理
解されるであろう。

【０１１３】一般的には、発現構築物は、転写される領
域に転写開始部位および終止部位を有し、さらに翻訳の
ためのリボソーム結合部位を含むであろう。構築物によ
り発現される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳さ
れるべきポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧ
を、さらに終わりの部分に適当に位置している終止コド
ンを含むであろう。

【０１１４】さらに、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般的には、多
くの通常行われる手順によれば、かかる領域は、特に、
リプレッサー結合部位およびエンハンサーのごとき転写
調節により作動するものであろう。

【０１１５】一般的には、増殖および発現のためのベク
ターは選択可能マーカーを含むであろう。選択可能マー
カー遺伝子は、形質転換宿主細胞の選択のための表現型
上の特徴を与える。好ましいマーカーは、真核細胞用の
ジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、E.
coliおよび他の細菌用のテトラサイクリンまたはアンピ
シリン耐性遺伝子を包含するがこれらに限らない。

【０１１６】所望ポリペプチドの宿主中での発現に適し
た種々の既知方法を用いて、上記のような適当なＤＮＡ
配列ならびに適当なプロモーター、さらに他の適当な制
御配列を含むベクターを適当な宿主中に導入することが
できる。適当な宿主の典型例は、E.coli、ストレプトミ
セス（Streptomyces）およびサルモネラ・チフィムリウ
ム（Salmonella typhimurium）細胞のごとき細菌細胞；
酵母細胞のごとき真菌細胞；ショウジョウバエ S2およ
びスポドプテラ（Spodoptera） Sf9細胞のごとき昆虫細
胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよびボウズ（Bowes）メラノーマ
細胞のごとき動物細胞；ならびに植物細胞を包含する。
多種の発現構築物用宿主がよく知られており、当業者は
本開示により本発明のこの態様におけるポリペプチドの
発現のための宿主を容易に選択することができよう。

【０１１７】より詳細には、本発明は、発現構築物のご
とき組み換え構築物も包含し、それらは１種またはそれ
以上の上記配列を含んでなる。構築物は、本発明のかか
る配列が挿入されたプラスミドまたはウイルスベクター
のごときベクターを含む。配列を順方向または逆方向に
挿入することができる。この点において、特定の好まし
い具体例において、構築物はさらに、例えば該配列に作
動可能に連結されたプロモーターを包含する調節配列を
含んでなる。多数の適当なベクターおよびプロモーター
が当業者に知られており、本発明における使用に適した
多くのベクターが市販されている。

【０１１８】市販されている下記ベクターを例示する。
それらのうち、細菌での使用に適するのはｐＱＥ７０、
ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（Qiagenから市販）；ｐＢ
Ｓベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクタ
ー、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ
４６Ａ（Stratageneから市販）；ならびにｐｔｒｃ９９
ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４
０、ｐＲＩＴ５（Pharmaciaから市販）である。それら
のうち、好ましい真核細胞ベクターはｐＷＬＮＥＯ、ｐ
ＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（St
ratageneから市販）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、
ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Pharmaciaから市販）であ
る。これらのベクターは多くの市販ベクターの例示のた
めにのみ挙げたのであり、それらは本発明のこの態様に
より使用するために当業者によく知られたものである。
例えば、宿主中における本発明ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適する他
のプラスミドまたはベクターを本発明のこの態様に使用
してもよいことが理解されよう。

【０１１９】制限部位または候補プロモーターフラグメ
ント（すなわち、プロモーターを含み得るフラグメン
ト）導入部位の下流のクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニットのごとき、プ
ロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含むベ
クターを用いてプロモーター領域をいずれの所望遺伝子
からも選択できる。よく知られているように、ベクター
中のｃａｔ遺伝子上流の制限部位中へのプロモーター含
有フラグメントの導入はＣＡＴ活性の発生を引き起こ
し、それを標準的ＣＡＴアッセイにより検出することが
できる。この目的に適するベクターはよく知られてお
り、容易に入手できる。２種のかかるベクターはｐＫＫ
２３２−８およびｐＣＭ７である。よって、本発明ポリ
ヌクレオチドの発現用のプロモーターはよく知られてい
て容易に入手できるものを包含するだけでなく、レポー
ター遺伝子を用いて上記方法により容易に得ることので
きるプロモーターも包含する。

【０１２０】E.coli lacIおよびlacZおよびT3およびT7
プロモーター、gptプロモーター、ラムダPR、PLプロモ
ーターならびにtrpプロモーターは、本発明によるポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した既知細
菌プロモーターに属する。サイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）即時初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプ
ロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、例
えばラウス（Rous）サルコーマウイルス（ＲＳＶ）のご
ときレトロウイルスＬＴＲｓのプロモーター、ならびに
マウス・メタロチオネイン−Ｉプロモーターのごときメ
タロチオネインプロモーターは、この点において適する
知られている真核細胞プロモーターに含まれる。

【０１２１】宿主細胞中での発現に適するベクターおよ
びプロモーターの選択はよく知られた手順であり、発現
ベクターの構築、宿主中へのベクターの導入および宿主
における発現に関する精妙な方法は当業者にとり日常的
なものである。

【０１２２】また本発明は、上記構築物を含む宿主細胞
に関する。宿主細胞は哺乳動物細胞のごとき高等真核細
胞であってもよく、あるいは酵母細胞のごとき下等真核
細胞であってもよく、また、宿主細胞は細菌細胞のごと
き原核細胞であってもよい。

【０１２３】リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェ
クション、カチオン性脂質により媒介されるトランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、トランスダクシ
ョン、感染または他の方法により宿主細胞中への構築物
の導入を行うことができる。かかる方法は多くの標準的
研究室マニュアルに記載されている。

【０１２４】宿主中の構築物を慣用的方法で使用して、
組み換え配列によりコードされた遺伝子産物を得ること
ができる。別法として、慣用的ペプチド合成装置により
本発明ポリペプチドを合成的に得ることもできる。

【０１２５】適当なプロモーターの制御下で、哺乳動物
細胞、酵母、細菌、または他の細胞において成熟蛋白を
発現させることができる。本発明ＤＮＡ構築物由来のＲ
ＮＡを用いる無細胞翻訳系を用いてかかる蛋白を得るこ
ともできる。原核宿主および真核宿主についての使用に
適するクローニングベクターおよび発現ベクターは上で
引用したSambrook et al.により記載されている。

【０１２６】一般的には、組み換え発現ベクターは、複
製開始点、下流構造配列の転写を指令する高発現遺伝子
由来のプロモーター、およびベクターに細胞を曝露した
後のベクター含有細胞の単離を可能にする選択可能マー
カーを含むであろう。特に、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼ（ＰＧＫ）のごとき糖分解酵素、ａ−ファクタ
ー、ホスファターゼ、および熱ショック蛋白をコードし
ている遺伝子由来のプロモーターが適当なプロモーター
である。選択可能マーカーは、E.coliのアンピシリン耐
性遺伝子およびエス・セレビシエ（S.cerevisiae）のｔ
ｒｐ１遺伝子を包含する。

【０１２７】ベクター中にエンハンサー配列を挿入する
ことにより、本発明ポリペプチドをコードしているＤＮ
Ａの高等真核細胞による転写を増大させることができ
る。エンハンサーはＤＮＡのシス−作用性エレメントで
あり、通常には、約１０ないし３００ｂｐであり、特定
の宿主細胞タイプにおけるプロモーターの転写活性を増
大するように作用する。エンハンサーの例は、複製開始
点の後期側１００ないし２７０ｂｐに位置するＳＶ４０
エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモータ
ー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサ
ー、ならびにアデノウイルスエンハンサーを包含する。

【０１２８】一般的には、本発明ポリペプチドの異種構
造配列をコードしている本発明ポリヌクレオチドを標準
的方法を用いてベクター中に挿入してそれが発現用プロ
モーターに作動可能に連結されるようにする。転写開始
部位がリボソーム結合部位の５’付近に位置するように
ポリヌクレオチドを置く。リボソーム結合部位は、発現
されるポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧの５’であ
る。一般的には、開始コドン（通常にはＡＵＧ）から始
まる他の読み枠は存在せず、他の読み枠はリボソーム結
合部位と開始ＡＵＧとの間には存在しないであろう。ま
た、一般的には、ポリペプチド末端に翻訳終止コドンが
存在し、転写される領域の３’末端に適当に分散して存
在するポリアデニレーションシグナルおよび転写終止シ
グナルが存在するであろう。

【０１２９】翻訳された蛋白の小胞体ルーメン中、ペリ
プラスム空間中または細胞外環境中への分泌のために、
適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチド中に含ま
せることができる。シグナルはポリペプチドに対する内
在性のものであってもよく、あるいは異種シグナルであ
ってもよい。

【０１３０】ポリペプチドを、融合蛋白のごとき修飾形
態で発現させてもよく、それは分泌シグナルのみならず
さらなる異種機能領域を含んでいてもよい。よって、例
えば、さらなるアミノ酸の領域、詳細には荷電アミノ酸
の領域をポリペプチドのＮ末端に付加して宿主細胞中、
精製中またはさらなる取り扱いおよび保存中の安定性お
よび維持を改善してもよい。また、精製を容易にする領
域をポリペプチドに付加してもよい。最終的なポリペプ
チドの調製の前にかかる領域を除去することができる。
特に、分泌または外分泌を引き起こすための、安定性を
改善するための、そして精製を容易にするためのペプチ
ド部分のポリペプチドへの付加は当業者によく知られて
いる日常的方法である。

【０１３１】本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの増殖、維持または発現に適した原核宿主は、エシェ
リシア・コリ（Escherichia coli）、バチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtilis）およびサルモネラ・チフィ
ムリウム（Salmonella typhimurium）を包含する。シュ
ードモナス（Pseudomonas）、ストレプトミセス（Strep
tomyces）およびスタフィロコッカス（Staphylococcu
s）の種々の種はこの点において適当な宿主である。そ
のうえ、この点において当業者に知られている他の多く
の宿主も使用可能である。

【０１３２】典型的であるが限定的でない例として、細
菌用途の有用発現ベクターは、選択可能マーカーおよび
市販プラスミド（よく知られたクローニングベクターｐ
ＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝学的エレメン
トを含んでなる）由来の細菌の複製開始点を含んでな
る。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３
（Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden）および
ＧＥＭ１（Promega Biotec,Madison,WI,USA）を包含す
る。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプロモ
ーターおよび発現すべき構造配列と結合する。

【０１３３】適当な宿主株の形質転換および適当な細胞
密度までの宿主株の増殖の後、選択したプロモーターが
誘導可能である場合には、適当な手段（例えば、温度シ
フトまたは化学誘導剤への曝露）によりそれを誘導し、
適当時間細胞を培養する。典型的には、次いで、細胞を
遠心分離により集め、物理的または化学的手段により破
壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製に供する。

【０１３４】凍結−融解繰り返し、ソニケーション、機
械的破壊を包含する慣用的方法、あるいは当業者によく
知られた細胞溶解剤の使用により、蛋白発現に使用する
微生物細胞を破壊することができる。かかる方法は 当
業者によく知られている。

【０１３５】同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現
に使用することができる。哺乳動物発現系の例は、Gluz
man et al.,Cell 23:175(1981)に記載されたサル・腎臓
線維芽細胞ＣＯＳ−７細胞系を包含する。適合するベク
ターを発現させうる他の細胞系は、例えば、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ヒト・腎臓２９３およびＢ
ＨＫ細胞を包含する。

【０１３６】哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適
当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプ
ライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、
および発現に必要とされる５’隣接非転写配列を含んで
なる。この点において、特定の好ましい具体例におい
て、ＳＶ４０スプライス部位由来のＤＮＡ配列、および
ＳＶ４０ポリアデニレーション部位が、これらのタイプ
の所望の非転写遺伝学的エレメントとして用いられる。

【０１３７】硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、
酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーお
よびレクチンクロマトグラフィーを包含するよく知られ
た方法により、ＨＬＴＥＸ１１ポリペプチドを組み換え
細胞培養物から回収し、精製することができる。最も好
ましくは、高品質液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を精製に用いる。単離または精製中にポリペプチドが変
性している場合には、蛋白の再生のためのよく知られた
方法を用いて活性コンホーメーションを再生することが
できる。

【０１３８】本発明ポリペプチドは、天然の精製ポリペ
プチド、化学合成法により得られるポリペプチド、細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を包含す
る原核細胞または真核細胞から組み換え法により得られ
るポリペプチドを包含する。組み換え法に使用する宿主
によっては、本発明ポリペプチドはグリコシレーション
されていてもよく、されていなくてもよい。さらに、い
くつかの場合、宿主によるプロセスの結果として本発明
ポリペプチドは最初の修飾されたメチオニン残基を含み
うる。

【０１３９】本発明に従って、ＨＬＴＥＸ１１ポリヌク
レオチドおよびポリペプチドを種々の適用例、詳細には
ＨＬＴＥＸ１１の化学的および生物学的特性を用いる適
用例に使用することができる。さらなる適用例は、細
胞、組織および器官の疾病の診断および治療に関する。
本発明のこれらの態様を以下の議論によってさらに説明
する。

【０１４０】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明は、例えば診断試薬としての相補的ポリヌクレオ
チドの検出のためのＨＬＴＥＸ１１ポリヌクレオチドの
使用に関する。機能不全に関連した変異形態のＨＬＴＥ
Ｘ１１の検出は、ＨＬＴＥＸ１１の発現低下、発現過剰
または変化した発現から生じる疾病の診断またはかかる
疾病に対する感受性に関する診断に付加しうる、あるい
はかかる診断を明確化しうる診断道具を提供するであろ
う。ヒト・ＨＬＴＥＸ１１遺伝子における変異を有する
個体を、種々の方法により、ＤＮＡレベルにおいて検出
することができる。診断のための核酸を、患者の細胞、
体液（例えば、血液、尿、唾液）、生検および剖検材料
から得ることができる。ゲノムＤＮＡを検出用に直接使
用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲ（Saiki etal.,
Nature,324:163-166(1986)）を用いることにより酵素的
に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じように
使用してもよい。一例として、ＨＬＴＥＸ１１をコード
している核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いてＨＬ
ＴＥＸ１１の発現および変異を同定および分析すること
ができる。例えば、正常遺伝子型との比較における増幅
生成物のサイズの変化により、欠失および挿入を検出す
ることができる。増幅したＤＮＡを標識ＨＬＴＥＸ１１
ＲＮＡとハイブリダイゼーションさせることにより、
あるいは別法として放射性標識ＨＬＴＥＸ１１アンチセ
ンスＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションさせることに
より点突然変異を同定することができる。好ましくは、
ＲＮａｓｅ Ａ消化または融点温度の相違により、マッ
チした配列とミスマッチ２本鎖とを識別することができ
る。

【０１４１】直接ＤＮＡ配列決定により、もとの遺伝子
と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明らかとな
りうる。さらに、クローンされたＤＮＡセグメントをプ
ローブとして用いて特定のＤＮＡ配列を検出してもよ
い。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適当に用いることによ
り、かかる方法の感度をおおいに向上させることができ
る。例えば、配列決定プライマーを、２本鎖ＰＣＲ生成
物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型分子とと
もに使用する。放射性標識を用いる慣用的方法により、
あるいは蛍光タグを用いる自動配列決定法により配列決
定を行う。

【０１４２】変性剤有りまたは無しにおけるゲル中のＤ
ＮＡの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、
ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝学的試験を行うことがで
きる。高分解能ゲル電気泳動により、小規模な配列の欠
失および挿入を可視化することができる。個々の融点ま
たは部分的に融解する温度によってＤＮＡフラグメント
がゲル中の異なる位置において移動が阻止される変性ホ
ルムアミドグラジエントゲル上で異なる配列のＤＮＡフ
ラグメントを識別することができる（例えば、Myers et
al.,Science,230:1242(1985)参照）。

【０１４３】ＲＮａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレ
アーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の
位置における配列の変化も明らかとなる（例えば、Cott
on et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(198
5)）。

【０１４４】よって、ハイブリダイゼーション、ＲＮａ
ｓｅ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限
酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型性（ＲＦ
ＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングの
ごとき方法により、特定のＤＮＡ配列の検出を行うこと
ができる。

【０１４５】より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定以外にも、in situ分析によって突然変異を検出
することができる。

【０１４６】本発明のさらなる態様によれば、アテロー
ム性動脈硬化、再狭窄、卒中、炎症性疾患、および感
染、特にＨＩＶ−１のごときウイルス感染、またはこれ
らの疾病に対する感受性の決定方法が提供される。ＨＬ
ＴＥＸ１１遺伝子中の変異は、アテローム性動脈硬化、
再狭窄、卒中、炎症性疾患、および感染、特にＨＩＶ−
１のごときウイルス感染に対する感受性を示しうるもの
であり、上記核酸配列をかかる感受性の確認のためのア
ッセイ用いてもよい。よって、例えば、該アッセイを用
いて上記ヒト・ＨＬＴＥＸ１１遺伝子における変異、例
えば、欠失、切断、挿入、フレームシフト等（かかる変
異はアテローム性動脈硬化、再狭窄、卒中、炎症性疾
患、および感染、特にＨＩＶ−１のごときウイルス感染
に対する感受性を示すものである）を決定してもよい。

【０１４７】例えば、ＤＮＡ配列決定アッセイを用いて
変異を確認することができる。血液試料（これに限らな
い）を包含する組織試料をヒト患者から得る。当該分野
で知られた方法により試料を処理してＲＮＡを捕捉す
る。ｍＲＮＡに存在するポリアデノシン伸長部分にハイ
ブリダイゼーションするポリチミジン残基からなるオリ
ゴヌクレオチドプライマーを添加することにより、第１
鎖ｃＤＮＡをＲＮＡ試料から合成する。逆転写酵素およ
びデオキシリボヌクレオチドを添加して第１鎖ｃＤＮＡ
を合成する。本発明ＤＮＡ修復蛋白のＤＮＡ配列に基づ
いてプライマー配列を合成する。一般的には、プライマ
ー配列は少なくとも１５個の連続した塩基を含んでな
り、少なくとも３０個またはちょうど５０個の連続した
塩基を含んでいてもよい。

【０１４８】ＲＴ−ＰＣＲを用いて変異を検出すること
もできる。ＲＴ−ＰＣＲを、自動検出システム、例え
ば、GeneScanのごときシステムと組み合わせて用いるこ
とが特に好ましい。一例として、ＨＬＴＥＸ１１をコー
ドしている核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて変
異を同定し分析することができる。典型的なプライマー
の例はGene Trapper PrimersまたはＰＣＲセンスプライ
マー： ５’ＧＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＣＴＧ３’（配列番号：３） ５’ＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＣＣＴ３’（配列番号：４） およびＰＣＲアンチセンスプライマー： ５’ＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＧ３’（配列番号：５） を包含する。

【０１４９】正常な遺伝子型と比較した場合の増幅生成
物のサイズの変化により、欠失および挿入を検出するこ
とができる。増幅ＤＮＡを放射性標識ＲＮＡと、あるい
は別法として放射性標識アンチセンスＤＮＡ配列とハイ
ブリダイゼーションさせることにより、点突然変異を同
定することができる。ＲＮａｓｅ消化または融解温度の
相違により、完全にマッチした配列をミスマッチ二本鎖
から識別することができる。

【０１５０】上記プライマーを、患者からの試料より単
離したＨＬＴＥＸ１１ ｃＤＮＡの増幅に用いることが
できる。また本発明は、５’および／または３’末端か
ら１、２、３または４個のヌクレオチドが除去されたプ
ライマーに関する。かかるプライマーを用いて患者から
単離した遺伝子を増幅して、次いで、遺伝子を種々の方
法に供してＤＮＡ配列を調べることができる。このよう
にして、ＤＮＡ配列における変異を診断することができ
る。in situ分析により変異を検出することもできる。

【０１５１】染色体アッセイ 本発明配列は染色体の同定にも価値がある。配列は個々
のヒト・染色体上の特定位置に特別に標的化されてお
り、これとハイブリダイゼーションしうる。そのうえ、
染色体上の特定部位を同定する必要性が現在ある。実際
の配列データ（繰り返し多型性）に基づいて染色体をマ
ーキングする少数の試薬が染色体のマーキングに現在利
用できる。本発明による染色体へのＤＮＡのマッピング
は、配列を疾病関連遺伝子と関連づけることにおいて重
要な最初の工程である。

【０１５２】簡単に説明すると、ｃＤＮＡからＰＣＲプ
ライマー（好ましくは１５ないし２５ｂｐ）を調製する
ことにより、配列を染色体にマッピングすることができ
る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター分析を用
いてゲノムＤＮＡ中の１つよりも多いエキソンにまたが
らないプライマーを迅速に選択し、かくして、増幅を複
雑化する。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト
染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリー
ニングに用いる。プライマーに対応したヒト遺伝子を含
有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じるで
あろう。

【０１５３】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、個々のＤＮＡを個々の染色体に帰属するための迅速
な手順である。類似の方法で同じオリゴヌクレオチドプ
ライマーに関して本発明を用いて、特定の染色体由来の
フラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプ
ールに関して下位の位置決めを行うことができる。染色
体へのマッピングに同様に用いることのできる他のマッ
ピング法は、in situハイブリダイゼーション、標識フ
ロー−ストアド（flow-stored）染色体に関するプレス
クリーニングおよび染色体特異的ｃＤＮＡライブラリー
を構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセ
レクションを包含する。

【０１５４】中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡク
ローンの蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）を用いて、正確な染色体位置を一工程で知ることが
できる。この方法を５０または６０ｂｐ程度の短いｃＤ
ＮＡとともに用いることができる。この方法に関するレ
ビューについては、Verma et al.,HUMAN CHROMOSOME:A
MANUAL OF BASIC TECHNIQUES,Pergamon Press,New York
(1988)参照。

【０１５５】この方法をいかにして行うかについての例
として、ＨＬＴＥＸ１１ ＤＮＡを消化し、QIAEX II Ｄ
ＮＡ精製キット（Qiagen,Inc,Chastworth,CA）を用いて
精製し、Super Cos1コスミドベクター（Stratagene,La
Jolla,CA）に連結する。Qiagenプラスミド精製キット
（Qiagen Inc.,Chastworth,CA）を用いてＤＮＡを精製
し、ビオチン−ｄＡＴＰ存在下でBioNick Labellingキ
ット（GibcoBRL,Life Technologies Inc.,Gaithersbur
g,MD）を用いるニックトランスレーションにより１ｍｇ
を標識する。ONCOR Light Hybridizationキット（Onco
r,Gaithersburg,MD）を用いてスライドグラス上でin si
tuハイブリダイゼーションを行って、中期染色体上の単
一コピー配列を検出する。２０％ ＦＣＳ、３％ ＰＨＡ
およびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰ
ＭＩ １６４０中で正常ドナー末梢血を３日間培養し、
１０^-7Ｍメトトレキセートとともに１７時間同調させ、
次いで、補足物なしのＲＰＭＩで２回洗浄する。次い
で、細胞を１０^-3Ｍチミジンとともに７時間インキュベ
ーションする。２０分インキュベーション後、コルセミ
ド（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて細胞を中期に分裂停止
させ、次いで、３７℃において７５ｍＭ ＫＣｌ中で１
５分低張溶解させる。次いで、遠心分離により細胞ペレ
ット集め、Carnoyの固定液（３：１ メタノール／酢
酸）で固定する。

【０１５６】１滴の細胞懸濁液をスライドグラスに滴下
し、懸濁液を風乾することにより中期細胞塗布試料を調
製する。ヒト・胎盤ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）でブロッキ
ングしつつ、１００ｎｇのプローブ（ハイブリダイゼー
ションミックス（５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、１
％デキストラン硫酸）１０ｍｌ中に懸濁）を添加するこ
とによりハイブリダイゼーションを行う。７０℃の水浴
中で１０分間プローブ混合物を変性させ、３７℃で１時
間インキュベーションし、次いで、あらかじめ３７℃に
暖めておいたスライドグラス試料上に置き（スライドグ
ラス試料は、前以て７０℃で７０％ホルムアミド／２ｘ
ＳＳＣ中で変性させておく）、エタノールシリーズで脱
水し、次いで、４℃に冷却する。次いで、スライドグラ
ス試料を加湿チャンバ中３７℃で１６時間インキュベー
ションし、４１℃で１０分間５０％ホルムアミド／２ｘ
ＳＳＣ中、次いで、３７℃で７分間２ｘＳＳＣ中で洗浄
する。製造者のプロトコールに従ってスライドグラス試
料をＦＩＴＣ−アビジン（Oncor,Gaithersburg,MD）と
ともにインキュベーションすることによりハイブリダイ
ゼーションプローブを検出する。マウンティング培地
（mounting medium）中に懸濁されたヨウ化プロプリジ
ウムを用いて染色体を対比染色する。Leitz ORTHOPLAN
2-エピ蛍光顕微鏡を用いてスライドグラス試料を可視化
する。ImageneticsコンピューターおよびMacIntoshプリ
ンターを用いて５つのコンピューター画像を得る。

【０１５７】配列が正確な染色体位置にマッピングされ
たら、遺伝学的地図のデータを用いて染色体上の配列の
物理的位置を修正することができる。かかるデータは、
例えば、V.McKusick,Mendelian Inheritance in Man（J
ohns Hopkins University Welch Medical Libraryより
オンラインで利用可能）に見いだされる。次いで、連関
分析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により、同
じ染色体にマッピングされた遺伝子と疾病との関連を確
認する。

【０１５８】次に、疾病にかかっている個体および疾病
にかかっていない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の
相違を決定することが必要である。疾病にかかっている
個体の一部または全部において変異が観察されるが正常
個体においては変異が観察されない場合には、その変異
は疾病の病因である可能性がある。

【０１５９】物理的マッピングおよび遺伝学的マッピン
グ法の現在の分離能によれば、疾病に関連した染色体領
域に正確に位置決めされるｃＤＮＡは５０ないし５００
個の潜在的病因遺伝子のうち１つでありうる（１メガベ
ースのマッピング分離能とし、２０ｋｂにつき１個の遺
伝子と仮定）。

【０１６０】ポリペプチドアッセイ 本発明は、細胞および組織中のＨＬＴＥＸ１１蛋白レベ
ルの検出のための定量および診断アッセイのごとき診断
アッセイにも関する。かかるアッセイは定量的であって
も、定性的であってもよい。よって、例えば、正常対照
組織試料と比較して本発明ＨＬＴＥＸ１１蛋白の過剰発
現を検出するための本発明診断アッセイを用いて、例え
ばアテローム性動脈硬化、再狭窄、卒中、炎症性疾患、
またはウイルス（詳細にはＨＩＶ−１）感染のごとき感
染のごとき疾病の存在を検出してもよい。宿主由来の試
料中の本発明ＨＬＴＥＸ１１蛋白のごとき蛋白のレベル
を決定するのに用いることのできるアッセイ法は当業者
によく知られている。かかるアッセイ法は、ラジオイム
ノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分
析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。これらのう
ち、ＥＬＩＳＡがしばしば好ましい。主にＥＬＩＳＡア
ッセイは、ＨＬＴＥＸ１１に対して特異的な抗体、好ま
しくはモノクローナル抗体を調製することを特徴とす
る。さらに、一般的には、モノクローナル抗体に結合す
るレポーター抗体を調製する。レポーター抗体は、放射
性試薬、蛍光試薬または酵素試薬検のごとき検出可能試
薬に結合しているが、この実施例ではセイヨウワサビ・
ペルオキシダーゼ酵素に結合している。

【０１６１】ＥＬＩＳＡを行うために試料を宿主から取
り、試料中の蛋白を結合する固体支持体、例えば、ポリ
スチレンディッシュ上でインキュベーションする。次い
で、ウシ・血清アルブミンのごとき非特異的蛋白ととも
にインキュベーションすることによりディッシュ上の遊
離の蛋白結合部位を被覆する。次に、モノクローナル抗
体をディッシュ中でインキュベーションし、その間にモ
ノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合し
ているＨＬＴＥＸ１１蛋白に結合する。未結合モノクロ
ーナル抗体をバッファーで洗浄除去する。セイヨウワサ
ビ・ペルオキシダーゼに連結されたレポーター抗体をデ
ィッシュ中に置き、レポーター抗体とＨＬＴＥＸ１１に
結合しているモノクローナル抗体との結合を生じさせ
る。次いで、未結合レポーター抗体を洗浄除去する。次
いで、発色基質を包含するペルオキシダーゼ活性のため
の試薬をディッシュに添加する。１次抗体および２次抗
体によりＨＬＴＥＸ１１に結合し、固定化されているペ
ルオキシダーゼは着色反応生成物を生じる。一定時間の
発色量は試料中のＨＬＴＥＸ１１蛋白量を示す。典型的
には、標準曲線を参照して定量結果を得る。

【０１６２】固体支持体に結合したＨＬＴＥＸ１１特異
的抗体および標識ＨＬＴＥＸ１１および宿主由来の試料
が固体支持体上に通される競争アッセイを用いてもよ
い。固体支持体に結合した検出標識量は試料中のＨＬＴ
ＥＸ１１量と相関関係を有しうる。

【０１６３】抗体 ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導
体、またはそれらのアナログ、またはそれらを発現する
細胞を免疫原として用いてそれらに対する抗体を作るこ
とができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル
またはモノクローナル抗体であってよい。また本発明
は、キメラ、１本鎖およびヒト化抗体ならびにＦａｂフ
ラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーも生成物を
包含する。当該分野で知られた種々の方法をかかる抗体
およびフラグメントの製造に用いてもよい。

【０１６４】当業者によく知られた種々の手段により、
本発明配列に対応したポリペプチドに対して生成した抗
体を得ることができる。例えば、１の具体例において、
ポリペプチドを動物、好ましくは非ヒトに直接注射す
る。次いで、そのようにして得られた抗体はポリペプチ
ド自体と結合するであろう。このようにして、ポリペプ
チドのフラグメントのみをコードする配列を用いて無傷
のポリペプチド全体に結合する抗体を得ることさえでき
る。次いで、かかる抗体を用いて、ポリペプチドを発現
する組織からそのポリペプチドを単離することができ
る。

【０１６５】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的な細胞系の培養により得られる抗体を製造する方法を
用いることができる。例は、ハイブリドーマ法（Kohler
andMilstein Nature 1975 256:495-497）、トリオーマ
法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al.,Im
munology Today 1983 4:72）およびヒト・モノクローナ
ル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Co
le et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.
Alan R.Liss,Inc,pp 77-96(1985)）を包含する。

【０１６６】１本鎖抗体の製造に関して記載された方法
（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用して、本発
明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する１本鎖抗体を
製造することができる。また、トランスジェニックマウ
スまたは他の哺乳動物のごとき他の生物を用いて、本発
明の免疫原性ポリペプチド生成物に対するヒト化抗体を
発現させてもよい。

【０１６７】上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現す
るクローンを単離または同定してもよく、あるいはアフ
ィニティークロマトグラフィーによる単離および／また
は精製のための固体支持体への抗体の結合により本発明
ポリペプチドを精製してもよい。

【０１６８】さらに、ＨＬＴＥＸ１１に対する抗体を用
いて、とりわけ、アテローム性動脈硬化、再狭窄、卒中
および炎症（慢性および急性）を抑制してもよい。ＨＬ
ＴＥＸ１１を抑制する抗体は、ウイルス結合およびウイ
ルス感染の抑制、詳細にはＨＩＶ−１結合および感染に
おいても有用である。

【０１６９】ＨＬＴＥＸ１１結合分子およびアッセイ さらに本発明は、ＨＬＴＥＸ１１に結合する受容体分子
のごとき分子の同定方法も提供する。当業者に知られた
多くの方法、例えば、ＰＡＦを用いるパンニング（pann
ing）およびＦＡＣＳソーティングにより、受容体蛋白
のごときＨＬＴＥＸ１１に結合する蛋白をコードしてい
る遺伝子を同定することができる。かかる方法は多くの
研究室用マニュアル、例えば、Coligan et al.,Current
Protocoles in Immunology 1(2)：第５章（１９９１
年）に記載されている。

【０１７０】例えば、発現クローニングをこの目的に用
いてもよい。この目的のために、ＨＬＴＥＸ１１に応答
する細胞からポリアデニル化ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ
ライブラリーをこのＲＮＡから作成し、ライブラリーを
プールに分割し、ＨＬＴＥＸ１１に応答しない細胞中に
各プールをトランスフェクションする。次いで、形質転
換細胞を標識ＨＬＴＥＸ１１に曝露する（放射性ヨウ素
化または部位特異的プロテインキナーゼ認識部位を含め
ることといった標準的方法を包含する種々のよく知られ
た方法によりＨＬＴＥＸ１１を標識することができ
る）。曝露後、細胞を固定し、ＨＬＴＥＸ１１の結合を
測定する。便利には、これらの手順をスライドガラス上
で行う。

【０１７１】ＨＬＴＥＸ１１結合細胞を生じるｃＤＮＡ
についてプールを同定する。これらの陽性物からサブ−
プール（sub-pool）を調製し、宿主細胞中にトランスフ
ェクションし、上記のごとくスクリーニングする。反復
サブ−プーリングおよび再スクリーニングプロセスを用
いて、推定上受容体分子のごとき結合分子をコードして
いる１種またはそれ以上のクローンを単離することがで
きる。

【０１７２】別法として、ＰＡＦのごとき標識リガンド
を、リガンドが結合する分子を発現する細胞から調製し
た膜または膜抽出物のごとき細胞抽出物に光親和性結合
させることもできる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）により架橋材料を分離し、Ｘ線フィルムに
曝露する。リガンド−受容体を含む標識複合体を切断
し、ペプチドフラグメントにまで分解し、蛋白微小配列
決定に供することができる。微小配列決定から得られた
アミノ酸配列を用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングして受容体分子をコードしている遺伝子を同定
するためのユニークな、または縮重したオリゴヌクレオ
チドプローブを設計することができる。

【０１７３】本発明ポリペプチドを用いて、細胞中また
は無細胞調製物中において、受容体分子のごときＨＬＴ
ＥＸ１１結合分子の結合能を評価することもできる。

【０１７４】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 本発明受容体ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴ
ニストとして作用する化合物のスクリーニング法におい
て本発明ＨＬＴＥＸ１１を用いてもよい。アゴニスト
は、ＨＬＴＥＸ１１の本来の生物学的機能を増大させ、
あるいはＨＬＴＥＸ１１と類似の様式で機能する化合物
であり、アンタゴニストは、かかる機能を低下または除
去する。また本発明は、細胞上のＨＬＴＥＸ１１の作用
（例えば、受容体分子のごときＨＬＴＥＸ１１結合分子
との相互作用）を促進またはブロックする化合物を同定
するスクリーニング法も提供する。

【０１７５】一般的には、かかるスクリーニング法は、
表面に本発明受容体ポリペプチドを発現する適当な細胞
を用意することを包含する。かかる細胞は哺乳動物、酵
母、ショウジョウバエまたはイー・コリ（E.coli）由来
の細胞を包含する。

【０１７６】１の具体例において、本発明受容体をコー
ドしているポリヌクレオチドを用いて細胞をトランスフ
ェクションし、そのことによりＨＬＴＥＸ１１を発現さ
せる。次いで、発現された受容体を試験化合物と接触さ
せて結合、機能的応答の刺激または阻害を観察する。

【０１７７】１のかかるスクリーニング法は、トランス
フェクションされて本発明Ｇ−蛋白結合受容体ＨＬＴＥ
Ｘ１１を発現するようになった黒色素胞の使用を包含す
る。かかるスクリーニング法はＰＣＴ ＷＯ９２／０１
８１０（１９９２年２月６日公開）に記載されている。
この方法において、受容体をコードしている黒色素胞を
受容体リガンド（ＰＡＦのごとき）およびスクリーニン
グすべき化合物の両方に接触させることにより、本発明
受容体ポリペプチドの活性化を阻害する化合物を決定す
ることができる。リガンドにより発生したシグナルの阻
害は、化合物がその受容体に対して潜在的なアンタゴニ
ストであること、すなわち、その化合物が受容体活性化
を阻害することを示す。かかる細胞をスクリーニングす
べき化合物に接触させ、かかる化合物がシグナルを発生
するかどうか、すなわち、受容体を活性化するかどうか
を決定することにより、受容体を活性化する化合物の決
定に当該スクリーニングを用いてもよい。

【０１７８】他のスクリーニング法は、ＨＬＴＥＸ１１
を発現する細胞を、例えば、トランスフェクションされ
たＣＨＯ細胞を、受容体活性化により引き起こされる細
胞外ｐＨ変化のごときシグナル応答測定系において使用
することを包含する。この方法において、本発明受容体
ポリペプチドを発現する細胞に化合物を接触させ、次い
で、第２のメッセンジャー応答、例えばシグナル変換ま
たはｐＨ変化を測定して潜在的に化合物が受容体を活性
化または阻害するかどうかを決定してもよい。

【０１７９】もう１つのかかるスクリーニング法は、Ｈ
ＬＴＥＸ１１をコードしているＲＮＡをアフリカツメガ
エル・卵母細胞に導入して一時的に受容体を発現させる
ことを包含する。次いで、受容卵母細胞をＰＡＦのごと
き受容体リガンドと接触させ、化合物をスクリーニング
し、次いで、受容体活性化を阻害すると考えられる化合
物のスクリーニングにおいて、シグナル（例えば、プロ
トン、ならびに他のイオンシグナル、詳細にはカルシウ
ムイオンシグナル）の阻害または活性化を決定してもよ
い。

【０１８０】もう１つのスクリーニング法は、例えばホ
スホリパーゼＣまたはＤまたは他の蛋白に受容体が結合
しているＨＬＴＥＸ１１を発現させることを包含する。
かかる細胞の典型例として、内皮細胞、平滑筋細胞、胚
の腎細胞等が挙げられる。受容体活性化または受容体活
性化の阻害を第２のシグナル（例えば、ホスホリパーゼ
または他の活性化／発現された蛋白）から検出すること
により、上記のごとくスクリーニングを行ってもよい。

【０１８１】もう１つの方法は、表面に受容体を有する
細胞への標識リガンド（例えばＰＡＦ）の結合に対する
阻害を調べることによる、本発明受容体ポリペプチドの
活性化を阻害する化合物のスクリーニングを包含する。
かかる方法は、ＨＬＴＥＸ１１をコードしているＤＮＡ
で真核細胞細胞をトランスフェクションして細胞が受容
体を表面に発現するようにし、ＰＡＦのごとき既知リガ
ンドの標識形態の存在下で細胞を化合物と接触させるこ
とを包含する。例えば放射活性によりリガンドを標識す
ることができる。受容体に結合した標識リガンドの量
は、例えばシンチレーションカウンティングにより測定
される。化合物が受容体に結合する際に、受容体に結合
する標識リガンドの減少が認められるならば、受容体へ
の標識リガンドの結合は阻害されている。

【０１８２】別法として、膜または膜標品のごときその
調製物のような細胞コンパートメントを、ＨＬＴＥＸ１
１により転調されたシグナリングもしくは調節経路の分
子であってＨＬＴＥＸ１１に結合する分子を発現する細
胞から調製してもよい。ＨＬＴＥＸ１１アゴニストまた
はアンタゴニスト候補分子の存在下または不存在下にお
いて調製物を標識ＨＬＴＥＸ１１とともにインキュベー
ションする。結合分子に結合する候補分子の能力は、標
識リガンドの結合低下に反映される。不必要に、すなわ
ちＨＬＴＥＸ１１結合分子への結合に対するＨＬＴＥＸ
１１の効果を誘導せずに結合する分子は、良好なアンタ
ゴニストである可能性が最も高い。よく結合し、ＨＬＴ
ＥＸ１１と同じ効果またはＨＬＴＥＸ１１に密接に関連
した効果を誘導する分子はアゴニストである。

【０１８３】例えば、候補分子と細胞または細胞調製物
との相互作用後第２のメッセンジャー系の活性化を調
べ、次いで、ＨＬＴＥＸ１１またはＨＬＴＥＸ１１と同
じ効果を誘導する分子の効果と比較することにより、潜
在的アゴニストのＨＬＴＥＸ１１様効果を測定してもよ
い。この点に関して有用でありうる第２のメッセンジャ
ー系は、ＡＭＰグアニレートシクラーゼ、イオンチャン
ネルまたはホスホイノシチド加水分解の系を包含する
が、これらに限らない。

【０１８４】ＨＬＴＥＸ１１アンタゴニストを探すアッ
セイのもう１つの例は、競争的阻害アッセイに適した条
件下でＨＬＴＥＸ１１と潜在的アゴニストを膜結合ＨＬ
ＴＥＸ１１受容体分子または組み換えＨＬＴＥＸ１１受
容体分子と結合させる競争アッセイである。受容体分子
に結合しているＨＬＴＥＸ１１分子数を正確に決定して
潜在的アンタゴニストに有効性を評価できるようにする
ために、例えば放射活性によりＨＬＴＥＸ１１を標識す
ることができる。

【０１８５】ＨＬＴＥＸ１１は哺乳動物細胞に遍在して
おり、多くの異常を包含する多くの生物学的機能に関与
している。したがって、ＨＬＴＥＸ１１を刺激する化合
物および薬剤、ならびにＨＬＴＥＸ１１機能を阻害しう
る化合物および薬剤を見いだすことが望ましい。

【０１８６】例えば、ＨＬＴＥＸ１１を活性化する化合
物を、癌および感染症の治療のごとき目的に用いてもよ
い。

【０１８７】一般的には、ＨＬＴＥＸ１１活性化を阻害
する化合物を、種々の治療目的、例えば、卒中、アテロ
ーム性動脈硬化、再狭窄および炎症（慢性および急性）
の治療に用いてもよい。ＨＬＴＥＸ１１を阻害する化合
物は、ウイルス結合およびウイルス感染、詳細にはＨＩ
Ｖ−１結合および感染の阻害にも有用である。

【０１８８】ＨＬＴＥＸ１１に対する抗体を用いてＨＬ
ＴＥＸ１１活性に拮抗させてもよい。通常には抗体の抗
原結合部位に結合するユニークな決定基を認識する抗イ
ディオタイプ抗体を包含する。また潜在的なアンタゴニ
スト化合物は、ＨＬＴＥＸ１１のリガンドに密接に関連
した蛋白、すなわちリガンドのフラグメントであって、
生物学的機能を失っていてＨＬＴＥＸ１１に結合しても
応答を生じないものを包含する。例えば、ＰＡＦのフラ
グメントはＨＬＴＥＸ１１のアンタゴニストとして有用
であると考えられる。

【０１８９】アンチセンス法を用いることにより調製さ
れるアンチセンス構築物を用いて、三重らせん形成また
はアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより遺伝子発現
を制御してもよく、両方の方法とも、ＤＮＡもしくはＲ
ＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づくものである。
例えば、本発明ポリペプチドをコードしているポリヌク
レオチドの５’コーディング部分を用いて、長さ約１０
ないし４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計してもよい。転写に関与する遺伝子の領域に
相補的であるようにＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し
（三重らせん−Lee et al.,Nucleic Acids Research 6:
3073(1979)；Dervan et al.,Science 251:1360(1991)参
照）、そのことによりＨＬＴＥＸ１１の転写および生成
を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
は、インビボにおいてｍＲＮＡにハイブリダイゼーショ
ンし、ｍＲＮＡ分子のＨＬＴＥＸ１１への翻訳をブロッ
クする（Okano,J.Neurochem.56:560(1991)；OLIGONUCLE
OTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION,
CRC Press,Boca Raton,FL(1988)）。上記オリゴヌクレ
オチドを細胞に送達して、アンチセンスＲＮＡまたはＤ
ＮＡがインビボにおいて発現されてＨＬＴＥＸ１１の生
成を阻害するようにすることもできる。

【０１９０】潜在的アンタゴニストは、ポリペプチドの
結合部位に結合し、これを占領し、そのことにより受容
体分子のごとき細胞性結合分子の結合を防止して正常な
生物学的活性を妨げる小型分子を包含する。小型分子の
例は、小型有機分子、ペプチドまたはペプチド様分子を
包含するが、これらに限らない。

【０１９１】可溶性形態のＨＬＴＥＸ１１、例えば受容
体のフラグメントを用いて、本発明ポリペプチドに対す
るリガンドに結合させ、リガンドが膜結合ＨＬＴＥＸ１
１と相互作用することを防止することにより受容体活性
化を阻害してもよい。

【０１９２】さらに本発明は、過剰なＨＬＴＥＸ１１活
性に関連した異常な症状の治療方法であって、リガンド
のＨＬＴＥＸ１１への結合をブロックすることにより、
あるいは第２のシグナルを阻害することにより活性化を
阻害するに有効量の上記阻害剤化合物を医薬上許容され
る担体とともに対象に投与し、そのことにより異常な症
状を改善することを特徴とする方法を提供する。

【０１９３】また本発明は、ＨＬＴＥＸ１１活性の発現
不足に関連した異常な症状の治療方法であって、上記の
ごとく本発明受容体ポリペプチドを活性化する治療上有
効量の化合物を医薬上許容される担体とともに対象に投
与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴
とする方法を提供する。

【０１９４】可溶性形態のＨＬＴＥＸ１１、およびかか
る受容体を活性化または阻害する化合物を、適当な医薬
担体と混合して使用してもよい。かかる組成物は、治療
上有効量のポリペプチドまたは化合物、および医薬上許
容される担体または賦形剤を含んでなる。かかる担体
は、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロース、
水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物
を包含するが、これらに限らない。処方は投与方法に適
合させるべきである。

【０１９５】組成物およびキット また本発明は、上記ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストを含んで
なる組成物に関する。よって、細胞、組織または生物に
ついて使用される未滅菌または滅菌担体、例えば、対象
への投与に適した医薬担体と組み合わせて本発明ポリペ
プチドを用いてもよい。かかる組成物は、例えば、媒
体、添加物または治療上有効量の本発明ポリペプチド、
および医薬上許容される担体または賦形剤を含んでな
る。かかる担体は、セイライン、緩衝化セイライン、デ
キストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそ
れらの混合物を包含するが、これらに限らない。処方は
投与モードに適合すべきである。

【０１９６】さらに本発明は、上記本発明組成物の１種
またはそれ以上の成分を充填した１個またはそれ以上の
容器を含んでなる医薬パックおよびキットに関する。か
かる容器については、医薬または生物学的製品の製造、
使用または販売を規制している政府当局により指示され
た形態であり、ヒトへの投与のための製品の製造、使用
または販売に対する当局による認可を反映したものであ
る。

【０１９７】投与 本発明ポリペプチドおよび他の化合物を単独で、あるい
は治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて使用し
てよい。

【０１９８】効果的で便利な方法、例えば、特に、局
所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、
鼻腔内または皮内ルートによる投与を包含する方法で医
薬組成物を投与してよい。

【０１９９】一般的には、医薬組成物を、個々の徴候ま
たは徴候（複数）の治療または予防の有効な量で投与す
る。一般的には、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量
で組成物を投与する。大部分の場合、１日につき約８ｍ
ｇ／ｋｇ体重を超えない量で組成物が投与されるであろ
う。好ましくは、大部分の場合、１日につき用量は約１
０μｇ／ｋｇ体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重である。症
状、その重さ、投与経路、合併症等を考慮して、各治療
様式についての標準的方法および症状により最適用量が
決定されることが理解されよう。

【０２００】遺伝子治療 インビボにおいて、すなわちしばしば「遺伝子治療」と
呼ばれる治療様式においてポリペプチドを発現させるこ
とにより、ＨＬＴＥＸ１１ポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニ
ストを本発明に従って使用することができる。

【０２０１】よって、例えば、ポリペプチドをコードし
ているＤＮＡまたはＲＮＡのごときポリヌクレオチドで
患者からの細胞をエクスビボで処理し、次いで、ポリペ
プチドで治療すべき患者に処理細胞を与えてもよい。例
えば、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮＡを含
むレトロウイルスプラスミドベクターの使用により細胞
をエクスビボで処理してもよい。かかる方法は当該分野
においてよく知られており、本発明におけるそれらの使
用は本明細書の教示から明らかである。

【０２０２】同様に、当該分野において知られた方法に
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、上記のように複製
欠陥レトロウイルスベクター中での発現のために本発明
ポリヌクレオチドを処理してもよい。次いで、レトロウ
イルス発現構築物を単離し、パッケージング細胞中に導
入し、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮＡを含
むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入して、
パッケージング細胞が対象遺伝子を含有する感染性ウイ
ルス粒子を産生するようにすることができる。インビボ
での細胞の処理およびインビボでのポリペプチドの発現
のためにこれらのプロデューサー細胞を患者に投与する
ことができる。本発明ポリペプチドを投与するためのこ
れらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者
に明らかなはずである。

【０２０３】本明細書において上で述べたレトロウイル
スプラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モ
ロニーマウス・白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラ
ウスサルコーマウイルス、ハーベイサルコーマウイル
ス、トリ・白血病ウイルス、テナガザル・白血病ウイル
ス、ヒト・免疫不全ウイルスのごときレトロウイルス、
アデノウイルス、ミエロプロリファレイティブサルコー
マウイルス（Myeloproliferative Sarcomavirus）、お
よび哺乳動物腫瘍ウイルスを包含するが、これらに限ら
ない。１の具体例において、レトロウイルスプラスミド
ベクターはモロニーマウス・白血病ウイルス由来のもの
である。

【０２０４】かかるベクターは、本発明ポリペプチド発
現のための１個またはそれ以上のプロモーターを含むで
あろう。使用できる適当なプロモーターは、レトロウイ
ルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびMiller et
al.,Biotechniques 7:980-990(1989)に記載されたＣＭ
Ｖプロモーター、または他のいずれかのプロモーター
（例えば、ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、およ
びβ−アクチンプロモーター（これらに限らない）を包
含する真核細胞プロモーターのごとき細胞プロモータ
ー）を包含するが、これらに限らない。使用できる他の
ウイルスのプロモーターは、アデノウイルスプロモータ
ー、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ
１９パルボウイルスプロモーターを包含するが、これら
に限らない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に
含まれる教示から当業者に明らかであろう。

【０２０５】本発明ポリペプチドをコードしている核酸
配列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろ
う。使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス
大後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモータ
ー；またはＣＭＶプロモーターのごとき異種プロモータ
ー；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；Ｍ
ＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターのご
とき誘導可能プロモーター；熱ショックプロモーター；
アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒ
ト・グロビンプロモーター；単純ヘルペスウイルスのチ
ミジンキナーゼプロモーターのごときウイルスのチミジ
ンキナーゼプロモーター；レトロウイルスのＬＴＲ（本
明細書で上で述べた修飾レトロウイルスＬＴＲを包
含）；β−アクチンプロモーター；およびヒト・成長ホ
ルモンプロモーターを包含するが、これらに限らない。
プロモーターは、本発明ポリペプチドをコードしている
遺伝子を制御する無傷のプロモーターであってもよい。

【０２０６】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッキング細胞系に形質導入してプロデューサー細胞
系を得る。トランスフェクションされうるパッキング細
胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−Ａ
Ｍ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ
２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅ
ｎｖＡｍ１２、およびMiller,A.,Human Gene Therapy
1:5-14(1990)に記載されたＤＡＮ細胞系を包含するが、
これらに限らない。当該分野で知られたいずれかの手段
によりベクターをパッケージング細胞中に形質導入して
もよい。かかる手段は、エレクトロポレーション、リポ
ソームの使用、ＣａＰＯ₄沈殿を包含するが、これらに
限らない。１の別法において、レトロウイルスベクター
をリポソーム中に封入し、あるいは脂質と結合させ、次
いで、宿主に投与してもよい。

【０２０７】プロデューサー細胞系は感染性レトロウイ
ルスベクター粒子を生じるであろうし、該粒子はポリペ
プチドをコードしている核酸配列を含んでいる。次い
で、かかるレトロウイルスベクター粒子を用いて、イン
ビトロまたはインビボのいずれかにおいて真核細胞に形
質導入してもよい。形質導入された真核細胞はポリペプ
チドをコードしている核酸配列を発現するであろう。形
質導入されうる真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ
細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽
細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細
胞を包含するが、これらに限らない。

【０２０８】

【実施例】下記実施例により本発明をさらに説明する。
実施例は、個々の具体例を参照することにより、本発明
の説明のためだけに提供される。これらの例示は、本発
明の特定の態様を説明するが、開示された発明の範囲を
何ら限定するものでない。本明細書に用いる特定の用語
はすでに上で説明してある。特記しない限り、すべての
実施例は、当業者によく知られた日常的な標準的方法を
用いて行われたものである。上で引用したSambrookらの
標準的な研究室用マニュアルに記載されているようにし
て下記実施例の日常的な分子生物学の方法を行うことが
できる。

【０２０９】特記しないかぎり、下記実施例に示すすべ
ての部または量は重量によるものである。特記しないか
ぎり、Sambrookおよび多くの他の文献、例えば、Goedde
l et al.,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)による文献
に記載のアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）の標準的方法を用いて下記実施例にお
けるフラグメントのサイズによる分離を行った。特記し
ない限り、標準的バッファー、インキュベーション温度
および時間、ほぼ等モル量の連結すべきＤＮＡフラグメ
ント、ならびに０．５μｇのＤＮＡにつき約１０ユニッ
トのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて連
結反応を行った。

【０２１０】実施例１ ヒト・ＨＬＴＥＸ１１のクロー
ニング Gibco BRL Life Technologies,Gaithersburg,MDから得
たジーン・トラッパー（Gene Trapper）法を用いて、新
規７−膜貫通蛋白をコードしている全長のＨＬＴＥＸ１
１遺伝子をヒト・脾臓プラスミドｃＤＮＡライブラリー
から単離した。まず、ヒト・Ｔ細胞リンパ腫から調製し
たｃＤＮＡライブラリーに由来する部分ＥＳＴ配列を、
新規７ＴＭ蛋白を潜在的にコードしているものとＥＳＴ
データベースにおいて同定した。このＥＳＴ配列から部
分クローンの５’末端付近のプライマーを設計してGene
Trapper法とともに用いるようにし、全長の遺伝子クロ
ーンを得た。Gene Trapperは、スクリーニングのための
プラスミドｃＤＮＡライブラリーを必要とするので（存
在するＴ細胞リンパシ腫ｃＤＮＡライブラリーはファー
ジ中にある）、５’プライマーとともに３’プライマー
を作成し使用して、ＢＲＬから市販されている９種の異
なるヒト・組織プラスミドｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングし、この遺伝子がこれらの他のライブラリー
のいずれかに存在するかどうかを調べた。９種のｃＤＮ
Ａライブラリーのうち、脾臓および睾丸のライブラリー
のみが、我々の対象とする遺伝子を含んでおり、脾臓ラ
イブラリーは睾丸ライブラリーよりもずっと多くの遺伝
子源を示した。Gene Trapperを用いて多くの陽性クロー
ンを脾臓ライブラリーから抽出した。２つの長いクロー
ンを配列決定し、完全遺伝子を含むことがわかった。両
ローンからの配列データを編集して図１に示すＤＮＡ配
列を決定した。ＤＮＡ配列中の最長の読み枠は、図２に
示す３３９個のアミノ酸からなる蛋白をコードしている
と推定される。蛋白配列のブラスト・サーチ（Blast se
arch）により、該配列が他の７−膜貫通蛋白に対して有
意な相同性を有することが示される。確認された最大の
相同性は、活性化Ｔ細胞において誘導されたニワトリ・
Ｇ−蛋白結合受容体ならびにヒト・血小板活性化因子受
容体に対するものであった。

【０２１１】実施例２ バキュロウイルス発現系におけ
るヒト・ＨＬＴＥＸ１１のクローニングおよび発現 既知方法により、遺伝子の５’および３’配列に対応す
るＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、寄託
クローン中の全長のヒト・ＨＬＴＥＸ１１蛋白をコード
しているｃＤＮＡ配列を増幅する。

【０２１２】下記のごとく発現ベクター中に挿入後、ヒ
ト・ＨＬＴＥＸ１１をコードしている増幅フラグメント
の５’末端は有効なシグナルペプチドを提供する。Koza
k,M.,J.Mol.Biol.,1987,196:947-950に記載されている
ような真核細胞における翻訳開始のための有効なシグナ
ルは、適当には、構築物のベクター部分に存在している
ものである。

【０２１３】増幅されたフラグメントを、市販キッ
ト（"Geneclean" BIO 101 Inc,La Jolla,CA）を用いて
１％アガロースゲルから単離する。次いで、そのフラグ
メントをＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、再度
１％アガロースゲルで精製する。このフラグメントを本
明細書ではＦ２と命名する。

【０２１４】Summers et al.,A MANUAL OF METHODS FOR
BACULOVIRUS VECTORS AND INSECTCELL CULTURE PROCED
URES,Texas Agricultural Experimental Station Bulle
tinNo.1555(1987)に記載のごとき標準的方法を用い、ベ
クターｐＲＧ１を用いてＨＬＴＥＸ１１蛋白をバキュロ
ウイルス発現系において発現させた。この発現ベクター
は、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa cal
ifornica）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力
なポリヘドリンプロモーターを含んでおり、慣用的な制
限部位が付されたものである。Ｎ末端メチオニンを含む
ＡｃＭＮＰＶｇｐ６７のシグナルペプチドはＢａｍＨＩ
部位のすぐ上流に位置している。類人猿ウイルス４０
（ＳＶ４０）のポリアデニレーション部位を有効なポリ
アデニル化のために使用した。組み換えウイルスの選択
容易化のために、イー・コリ由来のベータ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同じ方向に
挿入し、その後にポリヘドリン遺伝子のポリアデニレー
ション部位が続く。ポリヘドリン配列は、細胞により媒
介される野生型ウイルスＤＮＡとの同種組み換えに関す
るウイルス配列に対して、両サイドにおいて隣接してお
り、クローン化されたポリヌクレオチドを発現する生き
たウイルスを生じさせる。

【０２１５】ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃ
ＩＭ１のごとき他の多くのバキュロウイルスを、ｐＡ２
−ＧＰのかわりに用いることができるであろうし、当業
者は、必要に応じて、構築物がイン−フレームＡＵＧお
よびシグナルペプチドのごとき転写、翻訳、トラフィッ
キング（Trafficking）等のための適当に存在するシグ
ナルを提供することを容易に理解するであろう。

【０２１６】当該分野において知られた日常的方法を用
いて、制限酵素ＥｃｏＲＩでプラスミドを消化し、次い
で、子ウシ・腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化す
る。次いで、市販キット（"Geneclean" BIO 101 Inc,La
Jolla,CA）を用いてＤＮＡを１％アガロースから単離
する。このベクターＤＮＡを本明細書ではＶ２と命名す
る。

【０２１７】フラグメントＦ２および脱リン酸化プラス
ミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。
イー・コリＨＢ１０１細胞を連結混合物で形質転換し、
培養プレート上に広げる。ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを
用いる個々のクローン由来のＤＮＡ消化、次いで、ゲル
電気泳動による消化生成物の分析により、細菌はヒト・
ＨＬＴＥＸ１１遺伝子を含むプラスミドを含有すること
が同定される。クローン化フラグメントの配列をＤＮＡ
配列決定により確認する。本明細書において、このプラ
スミドをpBacG-Protein Coupled Receptor HLTEX11と命
名する。

【０２１８】Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
1987,84:7413-7417に記載のリポフェクチン法を用い
て、５マイクログラムのpBacG-Protein Coupled Recept
or HLTEX11を１．０μｇの市販直鎖状バキュロウイルス
ＤＮＡ（”BaculoGold^TM baculovirus DNA”,Pharminge
n,San Diego,CA）とともに同時形質転換する。１マイク
ログラムのBaculoGold^TMウイルスＤＮＡおよび５μｇの
プラスミドpBacG-Protein Coupled Receptor HLTEX11
を、５０μｌの無血清Grace培地（Life Technologies I
nc.,Gaithersburg,MD）の入ったマイクロタイタープレ
ートの滅菌済みウェル中で混合する。その後、１０μｌ
のリポフェクチンおよび９０μｌのGrace培地を添加
し、混合し、室温で１５分インキュベーションする。次
いで、トランスフェクション混合物を、Ｓｆ９昆虫細胞
（ATCC CRL 1711）（１ｍｌの血清不含Grace培地ととも
に３５ｍｍ組織培養プレートに撒種）に滴下する。プレ
ートを元に戻し、新たに添加した溶液を強制混合する。
次いで、プレートを２７℃で５時間インキュベーション
する。５時間後、トランスフェクション溶液をプレート
から除去し、１０％ウシ胎児血清を補足したGrace昆虫
培地１ｍｌを添加する。プレートをインキュベーション
に戻し、２７℃で４日間インキュベーションする。

【０２１９】４日後、上清を集め、Summers and Smith
（すでに引用）により記載されたようにプラークアッセ
イを行う。"Blue Gal"（Life Technologies Inc.,Gaith
ersburg）を含むアガロースゲルを用いてgal-発現クロ
ーン（青色染色プラークを生じる）の同定および単離を
容易にする（このタイプの「プラークアッセイ」につい
ての詳細な説明は、Life Technologies Inc.,Gaithersb
urgにより配布されている、昆虫細胞培養およびバキュ
ロウイルス学に関する案内の９〜１０頁に見いだされ
る）。

【０２２０】４日後、系列希釈物を細胞に添加する。適
当なインキュベーション後、青色染色プラークをエッペ
ンドルフピペットチップを用いて拾う。次いで、組み換
えウイルス含有寒天を、２００μｌのGrace培地を入れ
たエッペンドルフチューブ中に再懸濁する。短時間遠心
分離することにより寒天を除去し、組み換えバキュロウ
イルス含有上清を用いてＳｆ９細胞（３５ｍｍディッシ
ュに撒種されている）に感染させる。４日後、これらの
培養ディッシュの上清を集め、４℃で保存する。制限マ
ッピングおよび配列決定を包含するＤＮＡ分析により、
正しく挿入されたＨＬＴＥＸ１１を含有するクローンを
同定する。

【０２２１】１０％熱不活性化ＦＢＳを補足したGrace
培地でＳｆ９細胞を増殖させる。感染の多重度（ＭＯ
Ｉ）約２（約１ないし約３）で組み換えバキュロウイル
スＶ−ＨＬＴＥＸ１１に細胞を感染させる。６時間後、
培地を除去し、メチオニンおよびシステインを含まない
ＳＦ９００ ＩＩ培地に置き換える。４２時間後、５μ
Ｃｉの³⁵Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの³⁵Ｓシステイ
ン（Amersham,ArlingtonHeights,ILから市販）を添加す
る。さらに細胞を１６時間インキュベーションし、次い
で、細胞を遠心分離により集め、溶解し、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびオートラジオグラフィーにより標識蛋白を可
視化する。

【０２２２】実施例３ ＣＯＳ細胞におけるＨＬＴＥＸ
１１の発現 発現プラスミドＨＬＴＥＸ１１ ＨＡを、ＨＬＴＥＸ１
１をコードしているｃＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ
Ｉ／Ａｍｐ（Invitrogen,Inc.,SanDiego,CA）中にクロ
ーニングすることにより作成する。

【０２２３】発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは、
（１）イー・コリおよび他の原核細胞における増殖に効
果的なイー・コリの複製開始点；（２）プラスミド含有
原核細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；
（３）真核細胞における増殖のためのＳＶ４０複製開始
点；（４）ｃＤＮＡを便利にＣＭＶプロモーター発現調
節下に置き、ポリリンカー中の制限部位を用いてＳＶ４
０イントロンおよびポリアデニレーションシグナルに作
動可能に連結できるように配置されたＣＭＶプロモータ
ー、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン、およびポリア
デニル化シグナルを含む。

【０２２４】ＨＬＴＥＸ１１前駆体全体およびＨＡタグ
（その３’末端に読み枠を合わせて融合）をコードして
いるＤＮＡフラグメントをベクターのポリリンカー領域
中に組み込み、組み換え蛋白発現がＣＭＶプロモーター
により指令されるようにする。ＨＡタグはインフルエン
ザのヘマグルチニン蛋白由来のエピトープ（Wilson et
al.,Cell,1984,37:767）に対応する。標的蛋白へのＨＡ
タグの融合は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いる
組み換え蛋白の検出を容易にする。

【０２２５】プラスミド構築法は以下のごとし。イー・
コリおよびエス・フギペルダ（S.fugiperda）における
発現のための発現ベクターの構築についてすでに説明し
たように、慣用的制限部位を含むプライマーを用いて寄
託クローンのＨＬＴＥＸ１１ ｃＤＮＡを増幅する。発
現されるＧ−蛋白結合受容体ＨＬＴＥＸ１１の精製およ
び特徴づけを容易にするために、プライマーの１つは上
記ヘマグルチニンタグ（ＨＡタグ）を含んでいる。ＰＣ
Ｒ増幅に適するプライマーを既知方法を用いて選択す
る。ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクター
ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを消化し、次いで、連結する。連
結混合物をイー・コリＳＵＲＥ株（Stratagene,La Joll
a,CA 92037から市販）中に形質転換する。形質転換培養
物をアンピシリン培地プレート上に撒き、次いで、イン
キュベーションしてアンピシリン耐性コロニーを増殖さ
せる。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、制
限分析およびゲルによるサイズ測定によりＨＬＴＥＸ１
１をコードしているフラグメントを探す。

【０２２６】組み換えＨＬＴＥＸ１１の発現のために、
DEAE-DEXTRAN（例えば、Sambrook et alに記載）を用い
て、上記のごとくＣＯＳ細胞を発現ベクターでトランス
フェクションする。ベクターによるＨＬＴＥＸ１１発現
条件下で細胞をインキュベーションする。

【０２２７】例えば、Harlow et al.,ANTIBODIES:A LAB
ORATORY MANUAL,2nd Ed,;Cold Sprong Harbor Laborato
ry Press,Cold Spring Harbor,New York(1988)に記載の
方法を用いて、放射性標識および免疫沈降によりＨＬＴ
ＥＸ１１ ＨＡ融合蛋白を検出する。この目的のため
に、トランスフェクションから２日後に、³⁵Ｓ−システ
イン含有培地で８時間インキュベーションすることによ
り細胞を標識する。細胞および培地を集め、細胞を洗浄
し、上で引用したWilson et alに記載されたように界面
活性剤含有ＲＩＰＡバッファー（150mM NaCl、0.1% SDS、
1% NP-40、0.5% DOC、50mM TRIS,pH7.5）で溶解する。Ｈ
Ａ特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および
培地から蛋白を沈殿させる。次いで、沈殿した蛋白をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジオグラフィーによ
り分析する。予想サイズの発現生成物が細胞溶解物中に
見られ、それは負の対照中には見られない。

【０２２８】実施例４：ヒト・ＨＬＴＥＸ１１の遺伝子
治療発現 皮膚生検により線維芽細胞を対象から得る。得られた組
織を組織培養培地中に置き、小片に分離する。小さな組
織塊を組織培養フラスコの濡れた表面に置き、各フラス
コに約１０片を置く。フラスコを転置し、フラスコの蓋
をかたく閉めて室温で一晩置く。室温で２４時間後、フ
ラスコを転置すると組織塊はフラスコの底に固定された
ままであり、新鮮培地を添加する（例えば、１０％ Ｆ
ＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する
Ham's F12培地）。次いで、適当には組織を１週間３７
℃でインキュベーションする。次いで、新鮮培地を添加
し、引き続き数日おきに培地を交換する。さらに２週間
培養後、線維芽細胞の単層が現れる。単層をトリプシン
処理し、大きなフラスコに移す。

【０２２９】発現すべきフラグメントをクローン化する
ために制限酵素を用いて遺伝子治療用ベクターを消化す
る。消化されたベクターを子ウシ・小腸ホスファターゼ
で処理して自己連結を防止する。デホスホリレーション
された直鎖状ベクターをアガロースゲル上で分画し、精
製する。

【０２３０】ＨＬＴＥＸ１１ ｃＤＮＡ、または本発明
の活性ポリペプチドを発現しうるそのいずれかの部分を
単離する。必要ならば、ベクター中への組み込みのため
にフラグメントの末端を修飾する。例えば、５’オーバ
ーハング末端をＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端
を作成してもよい。３’オーバーハング末端をＳ１ヌク
レアーゼを用いて除去してもよい。Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼを用いてリンカーを平滑末端に連結してもよい。連結
反応混合物を用いてE.coliを形質転換し、次いで、その
E.coliをカナマイシン含有寒天上にプレーティングす
る。カナマイシン耐性表現型および制限分析により、ベ
クターが正しく挿入された遺伝子を有することが確認さ
れる。

【０２３１】１０％ウシ・血清（ＣＳ）、ペニシリンお
よびストレプトマイシンを含有するDulbecco's Modifie
d Eagles Medium（ＤＭＥＭ）中でパッケージング細胞
を組織培養において増殖させて集密とする。標準的方法
によりＨＬＴＥＸ１１遺伝子を含有するベクターをパッ
ケージング細胞中に導入する。ＨＬＴＥＸ１１遺伝子を
含んでいる感染性ウイルス粒子をパッケージング細胞
（今度はプロデューサー細胞という）から集める。

【０２３２】新鮮培地をプロデューサー細胞に添加し、
適当なインキュベーション時間後、集密プロデューサー
細胞のプレートから培地を集める。感染性ウイルス粒子
を含んでいる培地をMilliporeフィルイターで濾過して
浮遊プロデューサー細胞を除去する。次いで、濾過した
培地を用いて線維芽細胞に感染させる。線維芽細胞の亜
集密（sub-confluent）プレートから培地を除去し、濾
過した培地にすばやく置き換える。POLYBRENE（Aldrich
Chemical Co.,Milwaukee,WI）を培地に含ませて形質導
入を容易にする。適当なインキュベーション後、培地を
除去し、新鮮培地に置き換える。ウイルス力価が高い場
合には、実質的にすべての線維芽細胞が感染しており、
選択は不要であろう。力価が低い場合には、neoまたはh
isのごとき選択可能マーカーを有するレトロウイルスベ
クターを用いてエクスパンジョン用の形質導入された細
胞を選択する必要がある。

【０２３３】次いで、処理された線維芽細胞を、そのま
ま、あるいはCYTODEX3ビーズのごとき微小担体ビーズ上
で集密となるまで増殖した後、ラットに注射することが
できる。注射された線維芽細胞はＨＬＴＥＸ１１を産生
し、その蛋白の生物学的作用は宿主にまで伝達されてい
る。

【０２３４】実施例５ 哺乳動物細胞系における受容体
の一時的発現 受容体発現を最大にするために、ｐＣＤＮ発現ベクター
（Aiyar,N.et al.,Molecular and Cellular Biochemist
ry,1994,131:75-86）中に挿入する前に５’および３’
非翻訳領域（ＵＴＲｓ）を受容体ｃＤＮＡから除去す
る。ＰＣＲを用いてｃＤＮＡをトリミングするので、発
現の前に日常的な配列決定法によりＤＮＡ配列を日常的
に確認する。

【０２３５】最初に、デキスラン硫酸法を用いてＣＯＳ
細胞における一時的トランスフェクションを行う。この
方法において、１ｘ１０⁷個のＣＯＳ細胞を２４５ｘ２
４５ｍｍの組織培養プレート中で２４時間増殖させて５
０〜７０％集密とする。細胞をＰＢＳで洗浄し、次い
で、１０％ Neuserumおよび１％グルタミン、ＤＥデキ
ストランおよびクロロキンを含有するＣＭＥＭ培地中で
１００μｇのＨＬＴＥＸ１１ ｃＤＮＡでトランスフェ
クションし、３時間インキュベーションする。次いで、
１０％ＤＭＳＯを用いて細胞にショックを与え、１０％
ウシ胎児血清、１％グルタミンを含有するＤＭＥＭ培地
で洗浄し、３日間インキュベーションする。

【０２３６】実施例６ 受容体を用いるリガンド結合研
究 上記のごとくＨＬＴＥＸ１１をＣＯＳ細胞において一時
的に発現させる。膜を調製し、ヨウ素かＰＡＦを用いて
結合の研究を開始する。陽性対照として、ＰＡＦに応答
することが知られている受容体を含むＣＨＯＣ細胞由来
の膜を用いる。

【０２３７】実施例７ 異なる細胞タイプにおけるｍＲ
ＮＡ発現 よく知られたチオシアン酸グアニジニウム−フェノール
法、次いでオリゴｄＴカラムを用いてを用いて種々の細
胞タイプからポリＡ⁺ＲＮＡを単離する。鋳型複写装置
（Schreier & Schuell,Keene,NH）を用いてＲＮＡドッ
トブロット分析を行って均一なドットサイズとする。
０．５μｇのＲＮＡを用いてポリＡ⁺ＲＮＡを適用す
る。１Ｍ ホルムアミドとしてＲＮＡ試料を変性させ、
５５℃で１５分加熱する。試料を２０倍体積の３Ｍ Ｎ
ａＣｌ（０．３Ｍ クエン酸三ナトリウムを含有）中に
希釈し、おだやかに吸引しながらニトロセルロースフィ
ルターに適用する。さらなる希釈液でフィルターを洗浄
し、８０℃で２時間焼き付け、次いで、５０％ホルムア
ミド、５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハーツ、０．１％ ＳＤ
Ｓおよび１００μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ中の高い厳密さ
の下で、ＨＬＴＥＸ１１から生成した標識プローブにハ
イブリダイゼーションさせる。５０において０．１ｘＳ
ＳＣ、０．１％ ＳＤＳでブロットを洗浄し、−７０℃
で４８時間Ｘ線フィルムに曝す。ホスホ−イメージング
（Phospho-imaging）分析を用いてドットの定量を行
い、データ（相対光学単位（ＯＤ単位））を決定する。

【０２３８】

【配列表】

【０２３９】（１）一般的情報： （ｉ）出願人：Winnie Chan、Derk J.Bergama、Cathetine
E.Ellis （ii）発明の名称：新規Ｇ−蛋白結合受容体ＨＬＴＥＸ
１１ （iii）配列の数：５ （iv）連絡先： （Ａ）宛て名：SmithKline Beecham Corporation （Ｂ）通り名：709 Sweedland Road,P.O.Box 1539 （Ｃ）都市名：King of Prussia （Ｄ）州名：PA （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−０９３９ （v）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：３．５インチディスケット、容量
１．４４Ｍｂ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ４８６ （Ｃ）作動システム：WINDOWS FOR WORKGROUPS （Ｄ）ソフトウェア：MICROSOFT WORD （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：まだ付与されていない （Ｂ）出願日：これと同日 （Ｃ）分類： （vii）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （viii）代理人等の情報： （Ａ）氏名：Wiliam T.Han （Ｂ）登録番号：３４３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＡＴＧ５００２５ （xi）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０ ２７０ ５２１９ （Ｂ）ファックス番号：６１０ ２７０ ４０２６

【０２４０】（２）配列番号：１に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５２９ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｖｉ）アンチセンス：なし （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１ AGGTACGCCT GCAGGTACCG GTCCGGAATT CCCGGGTCGA CCCACGCGTC 50 CGGTTATCAG CAGGATCCAT GCCGCCAGAG TAAAGCTTTC TACCCTTTAC 100 TCCCTGCAAA GAAACAAGAG TGCTTATCCC AGCTAAGCTC CAGGGTTAAA 150 ACTCTATGCT GGTCATTCCC TTCAGGATTT GGCACTCACC AACATACCCT 200 TCTTTCAAGT GAAAAGGCAT CTCTTTTAAT GGTCCTGACC TTTGGAATAG 250 GAAGCATGTA CCCTGGACAG AGCACTTCAA ACTAGAGGAA CCATAAATCC 300 ATGGCTAACC TTGACAAATA CACTGAAACA TTCAAGATGG GTAGCAACAG 350 TACCAGCACT GCTGAGATTT ACTGTAATGT CACTAATGTG AAATTTCAAT 400 ACTCCCTCTA TGCAACCACC TATATCCTCA TATTCATTCC TGGTCTTCTG 450 GCTAACAGTG CAGCCTTGTG GGTTCTGTGC CGCTTCATCA GCAAGAAAAA 500 TAAAGCCATC ATTTTCATGA TCAACCTCTC TGTGGCTGAC CTTGCTCATG 550 TATTATCTTT ACCCCTCCGG ATTTACTATT ACATCAGCCA CCACTGGCCT 600 TTCCAGAGAG CCCTTTGCCT GCTCTGCTTC TACCTGAAGT ATCTCAACAT 650 GTATGCCAGC ATTTGTTTCC TGACGTGCAT CAGTCTTCAA AGGTGCTTTT 700 TTCTCCTCAA GCCCTTCAGG GCCAGAGACT GGAAGCGTAG GTACGATGTG 750 GGCATCAGTG CTGCCATCTG GATCGTTGTG GGGACTGCCT GTTTGCCATT 800 TCCCATCCTG AGAAGCACAG ACTTAAACAA CAACAAGTCC TGCTTTGCTG 850 ATCTTGGATA CAAGCAAATG AATGCAGTTG CGTTGGTCGG GATGATTACA 900 GTTGCTGAGC TTGCAGGATT TGTGATCCCA GTGATCATCA TCGCATGGTG 950 TACCTGGAAA ACTACTATAT CCTTGAGACA GCCACCAATG GCTTTCCAAG 1000 GGATCAGTGA GAGGCAGAAA GCACTGCGGA TGGTGTTCAT GTGTGCTGCA 1050 GTCTTCTTCA TCTGCTTCAC TCCCTATCAT ATTAACTTTA TTTTTTACAC 1100 CATGGTAAAG GAAACCATCA TTAGCAGTTG TCCCGTTGTC CGAATCGCAC 1150 TGTATTTCCA CCCTTTTTGC CTGTGCCTTG CAAGTCTCTG CTGCCTTTTG 1200 GATCCAATTC TTTATTACTT TATGGCTTCA GAGTTTCGTG ACCAACTATC 1250 CCGCCATGGC AGTTCTGTGA CCCGCTCCCG CCTCATGAGC AAGGAGAGTG 1300 GTTCATCAAT GATTGGCTAA AATTAAGATA TCTCTTTAAT TACGCCTTTG 1350 TTTACCTACG TTCCTTGTCT TTTTCCAAAG GCCAGAATTG TCAACCAATT 1400 TCTTTAATTG AACATTGTAA AAAACAGGAA TAAGTACTTT TGTGTAATAT 1450 TCACAGTCAA CAGGGGTGTG ATGGTGAAGG CAGAGTGTGA AAAACGTGAG 1500 AGAGGAAGAG AAAATAGATT TACCTGATT 1529

【０２４１】（２）配列番号：２に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３４４ （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２ Arg Asn His Lys Ser Met Ala Asn Leu Asp Lys Tyr Thr Glu Thr 1 5 10 15 Phe Lys Met Gly Ser Asn Ser Thr Ser Thr Ala Glu Ile Tyr Cys 20 25 30 Asn Val Thr Asn Val Lys Phe Gln Tyr Ser Leu Tyr Ala Thr Thr 35 40 45 Tyr Ile Leu Ile Phe Ile Pro Gly Leu Leu Ala Asn Ser Ala Ala 50 55 60 Leu Trp Val Leu Cys Arg Phe Ile Ser Lys Lys Asn Lys Ala Ile 65 70 75 Ile Phe Met Ile Asn Leu Ser Val Ala Asp Leu Ala His Val Leu 80 85 90 Ser Leu Pro Leu Arg Ile Tyr Tyr Tyr Ile Ser His His Trp Pro 95 100 105 Phe Gln Arg Ala Leu Cys Leu Leu Cys Phe Tyr Leu Lys Tyr Leu 110 115 120 Asn Met Tyr Ala Ser Ile Cys Phe Leu Thr Cys Ile Ser Leu Gln 125 130 135 Arg Cys Phe Phe Leu Leu Lys Pro Phe Arg Ala Arg Asp Trp Lys 140 145 150 Arg Arg Tyr Asp Val Gly Ile Ser Ala Ala Ile Trp Ile Val Val 155 160 165 Gly Thr Ala Cys Leu Pro Phe Pro Ile Leu Arg Ser Thr Asp Leu 170 175 180 Asn Asn Asn Lys Ser Cys Phe Ala Asp Leu Gly Tyr Lys Gln Met 185 190 195 Asn Ala Val Ala Leu Val Gly Met Ile Thr Val Ala Glu Leu Ala 200 205 210 Gly Phe Val Ile Pro Val Ile Ile Ile Ala Trp Cys Thr Trp Lys 215 220 225 Thr Thr Ile Ser Leu Arg Gln Pro Pro Met Ala Phe Gln Gly Ile 230 235 240 Ser Glu Arg Gln Lys Ala Leu Arg Met Val Phe Met Cys Ala Ala 245 250 255 Val Phe Phe Ile Cys Phe Thr Pro Tyr His Ile Asn Phe Ile Phe 260 265 270 Tyr Thr Met Val Lys Glu Thr Ile Ile Ser Ser Cys Pro Val Val 275 280 285 Arg Ile Ala Leu Tyr Phe His Pro Phe Cys Leu Cys Leu Ala Ser 290 295 300 Leu Cys Cys Leu Leu Asp Pro Ile Leu Tyr Tyr Phe Met Ala Ser 305 310 315 Glu Phe Arg Asp Gln Leu Ser Arg His Gly Ser Ser Val Thr Arg 320 325 330 Ser Arg Leu Met Ser Lys Glu Ser Gly Ser Ser Met Ile Gly 335 340

【０２４２】（２）配列番号：３に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｖｉ）アンチセンス：なし （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３ GGATGGTGTT CATGTGTGCT G 21

【０２４３】（２）配列番号：４に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｖｉ）アンチセンス：なし （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４ CTTCATCTGC TTCACTCCCT 20

【０２４４】（２）配列番号：５に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｖｉ）アンチセンス：あり （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５ ＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧ ＣＣＡＴＧＧＣＧＧＧ
２０

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ヒト・ＨＬＴＥＸ１１のヌクレオチ
ド配列を示す図である。

【図２】 図２は、ヒト・ＨＬＴＥＸ１１の推定アミノ
酸配列を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＥ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＹＤ ＡＤＥ 37/02 ＡＢＥ 39/395 ＡＤＹ ＡＤＥ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ダーク・ジェイ・バーグスマ アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、アイリッシュ・ロード271番 (72)発明者 キャサリン・イー・エリス アメリカ合衆国08028ニュージャージー州 グラスボロー、フォーダム・プレイス831 番

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：２のアミノ酸１から３
   ３９までを含むポリペプチドをコードしているポリヌク
   レオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポ
   リヌクレオチド； （ｂ）遺伝コードの縮重により、配列番号：２のアミノ
   酸と同じアミノ酸をコードしているポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
   相補的なポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオ
   チドからなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリ
   ヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号：１に示すヌクレオチドを含む
   請求項２のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号：１に示すヌクレオチド１から
   １５２９までを含む請求項２のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸１から３３９ま
   でを含むポリペプチドをコードしている請求項２のポリ
   ヌクレオチド。
7. 【請求項７】 （ａ）ＡＴＣＣ受託番号９８１３０中に
   含まれるヒト・ｃＤＮＡにより発現されるのと同じ成熟
   ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対し
   て少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチ
   ド； （ｂ）遺伝コードの縮重により、ＡＴＣＣ受託番号９８
   １３０中に含まれるヒト・ｃＤＮＡにより発現されるの
   と同じ成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
   チド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
   相補的なポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも１５個の連続した塩基を含むポリヌクレオ
   チドからなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリ
   ヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項２のＤＮＡを含むベクター。
9. 【請求項９】 請求項８のベクターを含む宿主細胞。
10. 【請求項１０】 該ＤＮＡによりコードされるポリペプ
    チドを請求項９の宿主細胞から発現させることを特徴と
    するポリペプチドの製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項８のベクターで細胞を形質転換
    またはトランスフェクションして、該ベクター中に含ま
    れるヒト・ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを
    細胞が発現するようにすることを特徴とする、ポリペプ
    チドを発現する細胞の製造方法。
12. 【請求項１２】 配列番号：２のアミノ酸１から３３９
    までに対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列
    を含むポリペプチド。
13. 【請求項１３】 配列番号：２に示すアミノ酸配列を含
    むポリペプチド。
14. 【請求項１４】 請求項１２のポリペプチドのアゴニス
    ト。
15. 【請求項１５】 請求項１２のポリペプチドに対する抗
    体。
16. 【請求項１６】 請求項１２のポリペプチドのアンタゴ
    ニスト。
17. 【請求項１７】 治療上有効量の請求項１２のポリペプ
    チドを患者に投与することを特徴とする、ＨＬＴＥＸ１
    １を必要とする患者の治療方法。
18. 【請求項１８】 該ポリペプチドをコードしていて該ポ
    リペプチドをインビボで発現するＤＮＡを患者に提供す
    ることにより治療上有効量のポリペプチドが投与される
    請求項１７の方法。
19. 【請求項１９】 治療上有効量の請求項１６のアンタゴ
    ニストを患者に投与することを特徴とする、ＨＬＴＥＸ
    １１ポリペプチドを阻害することを必要とする患者の治
    療方法。
20. 【請求項２０】 請求項１２のポリペプチドの発現に関
    連した疾病または該疾病に対する感受性の診断方法であ
    って、該ポリペプチドをコードしている核酸配列中の変
    異を決定することを特徴とする診断方法。
21. 【請求項２１】 宿主由来の試料中の請求項１２のポリ
    ペプチドの存在について分析を行うことを特徴とする診
    断方法。
22. 【請求項２２】 ポリペプチドに対する受容体を細胞表
    面に発現する細胞を、受容体への結合を可能にする条件
    下でスクリーニングすべき化合物と接触させること（受
    容体は、受容体への化合物の結合に応答して検出可能シ
    グナルを発することのできる第２の成分に結合してい
    る）；次いで化合物と受容体との相互作用により生じる
    シグナルの存在または不存在を検出することにより、化
    合物が受容体に結合するかどうか、そして受容体を活性
    化または阻害するかどうかを決定することを特徴とす
    る、請求項１２のポリペプチドに対する受容体に結合
    し、これを活性化または阻害する化合物の同定方法。