JP2002051769A

JP2002051769A - 遊離脂肪酸の測定に有用な液状試薬

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Publication number: JP2002051769A
Application number: JP2000245032A
Authority: JP
Inventors: Mina Fukuhara; 美奈福原; Naoto Matsuyama; 直人松山; Masaharu Takayama; 正治高山; Koji Mizuno; 耕治水野
Original assignee: Azwell Inc
Current assignee: Azwell Inc
Priority date: 2000-08-11
Filing date: 2000-08-11
Publication date: 2002-02-19

Abstract

(57)【要約】【課題】液状で長期間安定なＮＥＦＡ測定用試薬およ
びそれを用いた簡便且つ正確なＮＥＦＡ測定方法の提
供。【解決手段】ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ、ＥＧＴＡ等のキレ
ート剤をＣｏＡ安定化剤として含有するＣｏＡ含有溶
液、該溶液を含むＮＥＦＡ測定用第一試薬。ＡＣＯの安
定化に有効な量の陰イオン性界面活性剤、好ましくは、
さらにＡＣＯの安定化に有効な量のＦＡＤを含有するＡ
ＣＯ含有溶液。さらにＮＥＭを含有し、且つＮＥＭの安
定化に有効なｐＨに調整されてなる上記ＡＣＯ含有溶
液、該溶液を含むＮＥＦＡ測定用第二試薬。該第一およ
び／または第二試薬を含んでなるＮＥＦＡ測定用キット
および該キットを用いたＮＥＦＡ測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素を用いた遊離
脂肪酸（以下、ＮＥＦＡという）測定試薬の構成成分で
あるコエンザイムＡ（以下、ＣｏＡという）、アシルコ
エンザイムＡオキシダーゼ（以下、ＡＣＯという）、Ｎ
−エチルマレイミド（以下、ＮＥＭという）を安定化し
た、液状で長期保存可能な試薬およびその製造方法、並
びにそれらを用いたＮＥＦＡの測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来の自動分析試薬の市販キットは、凍
結乾燥品と溶解液の組み合わせとして供給され、使用時
に溶解して測定に用いてきた。ところが、凍結乾燥品の
場合、試薬調製の煩雑さに加えて、調製時のミスにより
誤った測定結果が得られたり、溶解後の有効期間が短い
（安定性に欠ける）といった問題があった。従って、最
近の臨床検査においては、そのような問題を回避すべ
く、液状試薬の使用が主流となってきている。

【０００３】ＮＥＦＡの定量法として、まず第一試薬中
で、Ｍｇ⁺⁺やＭｎ⁺⁺等の２価金属イオンおよびアデノシ
ン５'-三リン酸（以下、ＡＴＰという）の共存下でアシ
ルコエンザイムＡシンテターゼ（以下、ＡＣＳという）
の作用により、ＣｏＡと試料中のＮＥＦＡからアシルＣ
ｏＡを産生させる第一工程、および第二試薬中で、ＮＥ
Ｍの存在下でＡＣＯの作用によりアシルＣｏＡを酸化す
ることにより生じる過酸化水素を、ペルオキシダーゼと
発色性基質を組み合わせて定量する第二工程からなる方
法が広く採用されている。

【０００４】しかしながら、ＮＥＦＡ測定試薬には不安
定な成分が多く含まれるため、液状化は困難であるとさ
れてきた。例えば、ＣｏＡを含む従来公知のＮＥＦＡ測
定用第一試薬は、一旦溶解してしまうと、その有効期間
は冷蔵で５〜１５日程度であった。さらに、ＮＥＭは中
性付近より高ｐＨの領域では不安定となり、またＡＣＯ
はＮＥＭによって変性を受けるため、一旦ＮＥＭとＡＣ
Ｏとを中性付近の溶液中で共存させると、両者とも急激
に安定性が低下してしまう。そのため、ＮＥＭとＡＣＯ
の共存溶液は、長期間にわたって測定試薬としての性能
を維持することが困難であるとされ、従来はＮＥＭを強
酸性溶液中に保存し、ＡＣＯは凍結乾燥して保存すると
いうように、ＮＥＭとＡＣＯを別々に保存してそれらの
安定性を確保するのが一般的であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、酵素を用い
たＮＥＦＡ測定法において、特に不安定な成分である、
第一試薬中のＣｏＡと第二試薬中のＮＥＭおよびＡＣＯ
を安定化し、長期間にわたって測定の性能を維持できる
安定なＮＥＦＡ測定用液状試薬を提供することを目的と
する。さらに、本発明は、これらの試薬を用いて、より
簡便且つ正確なＮＥＦＡ測定方法を提供することを目的
とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ジエチレン
トリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸（以下、ＤＴＰＡと
いう）、トリエチレンテトラミン-N,N,N',N'',N''',
N'''-六酢酸（以下、ＴＴＨＡという）およびO,O'-ビス
（2-アミノエチル）エチレングリコール-N,N,N',N'-四
酢酸（以下、ＥＧＴＡという）から選ばれるキレート剤
を１種以上第一試薬に共存させることにより、ＣｏＡを
安定化できることを見出した。また、本発明者らは、フ
ラビンアデニンジヌクレオチド（以下、ＦＡＤという）
を共存させることにより、ＡＣＯをより酸性側において
も安定化し得ることを見出した。さらに、該溶液の濁り
防止用として、ＡＣＯ反応を妨げない界面活性剤を添加
したところ、意外にも該界面活性剤は濁り防止効果に加
えて、ＡＣＯをさらに安定化する効果を有することが明
らかとなった。そこで、ＦＡＤと界面活性剤を添加する
とともに、第二試薬のｐＨをＡＣＯの保存安定性に適す
るｐＨ範囲でより酸性側に調整することによって、同時
にＮＥＭを安定化することにも成功して、本発明を完成
するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、ＣｏＡ含有溶液に、
ＣｏＡの安定化に有効な量の、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡおよ
びＥＧＴＡからなる群より選択される１種以上のキレー
ト剤を添加することにより、液状試薬として使用し得る
程度にＣｏＡを安定化する方法を提供する。当該方法に
より産生される溶液は、ＡＣＳおよびＡＴＰをさらに配
合することにより、ＮＥＦＡ測定用の第一試薬として使
用することができる。

【０００８】また、本発明は、ＡＣＯおよびＮＥＭを含
有する溶液のｐＨをＮＥＭの安定化に有効な値に調整
し、さらに、当該ｐＨにおいてＡＣＯを安定化するのに
有効な量の１種以上のＡＣＯ安定化剤、特にＦＡＤおよ
び／または界面活性剤を添加することにより、液状試薬
として使用し得る程度にＡＣＯおよびＮＥＭを安定化す
る方法を提供する。該ＡＣＯ安定化剤の作用により、Ａ
ＣＯはより酸性側且つＮＥＭの共存下においても安定化
される。したがって、ＡＣＯの保存安定性が確保される
範囲内でｐＨをより酸性側に下げることによって、同時
にＮＥＭをも安定化させることが可能となる。このよう
にして得られるＮＥＭおよびＡＣＯ含有溶液は、さらに
過酸化水素定量用試薬を配合させることにより、ＮＥＦ
Ａ測定用の第二試薬として使用することができる。

【０００９】さらに、本発明は、本発明の安定化された
ＣｏＡ含有溶液にＡＣＳおよびＡＴＰをさらに含有する
溶液を第一試薬とし、本発明の安定化されたＮＥＭおよ
びＡＣＯ含有溶液に過酸化水素定量用試薬をさらに含有
する溶液を第二試薬として含むＮＥＦＡ測定用キット、
並びに該キットを用いたＮＥＦＡの測定方法を提供す
る。本発明のキットは、従来品と異なり、凍結乾燥品を
用時溶解して使用する手間が省かれることにより、より
簡便、迅速且つ正確なＮＥＦＡの測定を可能とする。

【００１０】また、本発明は、従来公知のＮＥＦＡ測定
用試薬の用時調製後の安定化にも応用することができ
る。すなわち、従来公知のＮＥＦＡ測定用試薬の凍結乾
燥物および／またはその溶解液に予め本発明の安定化剤
を添加しておくことにより、凍結乾燥物の溶解後の安定
性を改善することができる。

【００１１】本明細書においては、以下の略語を使用す
ることもある。 EDTA 2NH₄ エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸二アンモニウム EDTA 2Li エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸二リチウム EDTA Mn エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸マンガン二ナトリウム EDTA Mg エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸マグネシウム二ナトリウム EDTA Ba エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸バリウム二ナトリウム EDTA 4Na エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸四ナトリウム EDTA Co エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸コバルト二ナトリウム EDTA Ni エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸ニッケル二ナトリウム EDTA 3K エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸三カリウム EDTA Zn エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸亜鉛二ナトリウム EDTA 2Na エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸二ナトリウム Methyl-EDTA 1,2-ジアミノプロパン-N,N,N'N'-四酢酸 EDTA-OH N-(2-ヒドロキシエチル)エチレンジアミン-N,N',N'-三酢酸 CyDTA トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N''-四酢酸 EDDP エチレンジアミン-N,N'-ジプロピオン酸二塩酸 HIDA N-(2-ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸 EDDA エチレンジアミン-N,N'-二酢酸 DHEG N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン DTPA-OH 1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン-N,N,N',N'-四酢酸 NTP ニトリロ三プロピオン酸 HDTA ヘキサメチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸 EDDPO エチレンジアミン-N,N'-ビス(メチレンフォスフォン酸) NTA ニトリロ三酢酸 IDA イミノ二酢酸 EDTPO エチレンジアミン-N,N,N',N'-テトラキス(メチレンフォスフォン酸) NTPO ニトリロトリスメチレンフォスフォン酸三ナトリウム

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明のＣｏＡ含有溶液は、Ｃｏ
Ａ、並びにＣｏＡの安定化剤としてＤＴＰＡ、ＴＴＨＡ
およびＥＧＴＡのうちの１種以上のキレート剤を含有す
る。ＣｏＡの濃度は、該溶液が使用される酵素反応に適
した範囲であれば特に制限はない。キレート剤の濃度
は、ＣｏＡを安定化するのに有効な量であれば特に制限
はなく、使用するキレート剤の種類によっても異なる
が、例えば、ＤＴＰＡの場合、０．１ｍＭ以上で且つ保
存温度で析出しない濃度が挙げられる。本発明のＣｏＡ
含有溶液をＮＥＦＡ測定用の第一試薬の調製に用いる場
合、同時に添加される２価金属イオンより低い濃度であ
ればよい。より好ましくは、ＤＴＰＡの使用濃度は０．
２５〜１０ｍＭである。尚、ここで「ＣｏＡを安定化す
るのに有効な量」とは、例えば、実用試験において、液
状試薬を苛酷条件下（２５℃，２７日間あるいは３７
℃，５日間）で保存後も液状試薬としての性能を担保し
得るのに有効な量を意味し、また、「安定である」と
は、実用試験において、液状試薬を上記苛酷条件下で保
存後、調製直後の約７０％以上の反応性残存率を保持す
ることをいう。

【００１３】本発明のＣｏＡ含有溶液のｐＨは、該溶液
が使用される酵素反応に適した範囲であり、ＣｏＡおよ
び他の含有成分に悪影響を及ぼさず、且つキレート剤に
よる該溶液の安定化に適した範囲である限り特に制限は
ない。

【００１４】本発明のＮＥＦＡ測定用第一試薬は、本発
明のＣｏＡ含有溶液に加えて、ＡＣＳおよびＡＴＰをさ
らに含有する。ＡＣＳおよびＡＴＰの濃度は試料中のＮ
ＥＦＡをアシルＣｏＡに変換するのに十分な量であれば
特に制限はない。また、ＡＣＳは２価カチオン要求性で
あるので、本発明のＮＥＦＡ測定用第一試薬は、Ｍ
ｇ ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺等の２価金属イオンをさらに含有する。該
２価金属イオンの濃度はＣｏＡ含有溶液に添加されるキ
レート剤よりも高濃度であって、ＡＣＳがＮＥＦＡをア
シルＣｏＡに変換するのに十分な濃度であれば特に制限
はない。

【００１５】本発明のＮＥＭおよびＡＣＯ含有溶液は、
ＮＥＭの安定化に有効なｐＨを有し、且つ当該ｐＨにお
いてＡＣＯを安定化するのに有効な量の１種以上のＡＣ
Ｏ安定化剤を含有する。ＮＥＭおよびＡＣＯの濃度は、
該溶液が使用される酵素反応に適した範囲であれば特に
制限はなく、例えば、ＮＥＭが０．１〜２０ｍＭ、ＡＣ
Ｏが１〜１００Ｕ／ｍＬである。

【００１６】本発明のＡＣＯ安定化剤としては、ＦＡＤ
または界面活性剤が挙げられる。ＦＡＤの使用濃度はＡ
ＣＯを安定化するのに有効な量であれば特に制限はない
が、例えば、１０μＭ以上、より好ましくは１００〜２
０００μＭの濃度が挙げられる。尚、ここで「ＡＣＯを
安定化するのに有効な量」とは、例えば、実用試験にお
いて、液状試薬を苛酷条件下（２５℃，２７日間あるい
は３７℃，５日間）で保存後も液状試薬としての性能を
担保し得るのに有効な量を意味し、また、「安定であ
る」とは、実用試験において、液状試薬を上記苛酷条件
下で保存後、調製直後の約７０％以上の反応性残存率を
保持することをいう。

【００１７】界面活性剤の種類はＡＣＯの反応を阻害し
ない限り特に限定されないが、好ましくは陰イオン性界
面活性剤、より好ましくは、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニル
エーテル硫酸、ポリオキシエチレンジアルキルアリルエ
ーテル硫酸、ポリオキシエチレンアルケニルアリルエー
テル硫酸およびそれらの塩であり、これらのうちの１種
を単独で使用してもよいし、２種以上を混合して使用し
てもよい。より具体的には、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル硫酸塩［例：ハイテノール１８Ｅ（第一工業
製薬（株）製）；エマール２０Ｃおよび２０Ａ，レベノ
ールＷＸ（以上、花王（株）製）］、ポリオキシエチレ
ンアルキルフェニルエーテル硫酸［例：ハイテノールＮ
−１７（第一工業製薬（株）製）；エマールＮＣ，レベ
ノールＷＺ（以上、花王（株）製）］、ポリオキシエチ
レンジアルキルアリルエーテル硫酸［例：ハイテノール
ＮＥ−１５（第一工業製薬（株）製）］、ポリオキシエ
チレンアルケニルアリルエーテル硫酸［例：ハイテノー
ルＮＦ−１３（第一工業製薬（株）製）］等が挙げられ
る。界面活性剤の使用濃度もＡＣＯを安定化するのに有
効な量で且つＡＣＯの反応および測定に悪影響を及ぼさ
ない範囲であれば特に制限はなく、界面活性剤の種類に
よっても異なるが、例えば、ハイテノール１８Ｅの場
合、０．０５重量％以上、好ましくは０．１〜１．０重
量％である。

【００１８】界面活性剤の添加により、同時に溶液の濁
り防止が達成される。例えば、ハイテノール１８Ｅを用
いた場合、濁り防止効果は０．０５重量％以上で達成さ
れる。

【００１９】本発明の好ましい実施態様においては、Ｆ
ＡＤおよび陰イオン性界面活性剤の両方をＡＣＯ安定化
剤として配合する。

【００２０】本発明のＮＥＭおよびＡＣＯ含有溶液のｐ
Ｈは、ＡＣＯ安定化剤を配合することにより酸性側に拡
がったＡＣＯの安定ｐＨ範囲内で、ＮＥＭの安定化に有
効なｐＨに調整される。好ましくは、本発明のＮＥＭお
よびＡＣＯ含有溶液のｐＨは５．５〜６．８、より好ま
しくは６．０〜６．４である。尚、ここで「ＮＥＭを安
定化するのに有効なｐＨ」とは、例えば、実用試験にお
いて、液状試薬を苛酷条件下（２５℃，２７日間あるい
は３７℃，５日間）で保存後も液状試薬としての性能を
担保し得るのに有効なｐＨを意味し、また、「安定であ
る」とは、実用試験において、液状試薬を上記苛酷条件
下で保存後、調製直後の約３０％以上の反応性残存率を
保持することをいう。

【００２１】本発明のＮＥＦＡ測定用第二試薬は、本発
明のＮＥＭおよびＡＣＯ含有溶液に加えて、過酸化水素
定量用試薬をさらに含有する。該過酸化水素定量用試薬
は従来公知のいかなる種類の試薬であってもよいが、好
ましくはペルオキシダーゼおよび発色性基質である水素
供与体から構成されるものであり、例えば、西洋ワサビ
由来ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）と、N-エ
チル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-m-トルイ
ジンナトリウム（以下、ＴＯＯＳという）の組み合わせ
が挙げられる。

【００２２】本発明のＮＥＦＡ測定用キットは、第一試
薬として、本発明のＮＥＦＡ測定用第一試薬、および／
または第二試薬として、本発明のＮＥＦＡ測定用第二試
薬を含む。本発明の第一または第二試薬のいずれか一方
のみを含む場合には、本発明のＮＥＦＡ測定用キット
は、例えば、従来公知のＮＥＦＡ測定用第二または第一
試薬とそれぞれ組み合わせてキット化することができ
る。

【００２３】本発明のＮＥＦＡ測定方法は、試料に、Ｎ
ＥＦＡをアシルＣｏＡに変換する反応用の試薬、好まし
くは本発明のＮＥＦＡ測定用第一試薬を添加して、試料
中のＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換し、次いで、アシル
ＣｏＡを酸化して過酸化水素を生成する反応用の試薬お
よび生成した過酸化水素を定量するための試薬を含んで
なる試薬、好ましくは本発明のＮＥＦＡ測定用第二試薬
を該反応液に添加し、生成した過酸化水素を定量するこ
とを特徴とする（但し、少なくとも本発明のＮＥＦＡ測
定用第一または第二試薬のいずれか一方を使用する）。
本発明のＮＥＦＡ測定用第一または第二試薬を使用しな
い場合、ＮＥＦＡをアシルＣｏＡに変換する反応用の試
薬、並びにアシルＣｏＡを酸化して過酸化水素を生成す
る反応用の試薬および生成した過酸化水素を定量するた
めの試薬を含んでなる試薬は、それぞれ従来公知のＮＥ
ＦＡ測定用第一および第二試薬であってよい。

【００２４】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範
囲を何ら限定するものではない。

【００２５】実施例１キレート剤によるＣｏＡの安定
化ＮＥＦＡ値１，０００μＥｑ／Ｌ（＝ｍｍｏｌ／Ｌ）の
コントロール血清（セラクリアＬＰ；（株）アズウェル
製）を実用試験のサンプルとして使用した。試験用ＮＥ
ＦＡ測定第一試薬として、６０ｍＭトリスヒドロキシ
メチルアミノメタン（以下、Ｔｒｉｓという）、１．１
ｍＭ 4-アミノアンチピリン、１．２ｍＭアデノシン
５'−三リン酸二ナトリウム三水和物（オリエンタル酵
母工業（株）製）、１．２ｍＭコエンザイムＡ三リチ
ウム（オリエンタル酵母工業（株）製）、０．２５Ｕ／
ｍＬＡＣＳ（旭化成工業（株）製）、１ｍＭ各種キ
レート剤（（株）同仁化学研究所およびナカライテスク
（株）製）および１．２５ｍＭ塩化マグネシウムを含
有するｐＨ７．６の溶液を用いた。ＮＥＦＡ測定第二試
薬として、ネスコートＮＥＦＡ−Ｖ２（ＮＥＦＡ測定自
動分析用キット；（株）アズウェル製）のＲ２を、能書
に従って用時調製して用いた。各種キレート剤を添加し
た試験用第一試薬の反応性は、日立７１７０自動分析装
置を用いて以下のようにして測定した。試料３μＬに第
一試薬２００μＬを添加し、３７℃で５分間反応後、第
二試薬５０μＬを添加して、さらに３７℃、５分間反応
させ、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで、測光ポ
イント１６から３４の吸光度変化を求めた。試験用第一
試薬の調製当日と、２５℃にて１４および２８日間保存
後のものについて、上記操作により試料を測定し、調製
当日の試験用第一試薬の反応性を１００％として、２５
℃にて１４および２８日間保存後のものの残存率（％）
を求めた。その結果を表１の反応性残存率の欄に示す。

【００２６】実用試験と同時に、各種キレート剤を添加
した第一試薬中のＣｏＡ量を、日立７１７０自動分析装
置を用いて以下のように測定した。第一試薬１５μＬに
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１８０μＬを添
加し、３７℃で１分２０秒反応後、２５ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭ 2,2-ジチオジピリジ
ンおよび０．２５％ N,N-ジメチルホルムアミドを含む
溶液１８０μＬを添加して、さらに３７℃、８分４０秒
反応させ、主波長３４０ｎｍで、測光ポイント５から３
４の吸光度変化を求めた。試験用第一試薬の調製当日
と、２５℃にて２１日間保存後のものについて上記方法
により同様に測定し、調製当日の試験用第一試薬のＣｏ
Ａ量を１００％として、２５℃にて２１日間保存後のも
のの残存率（％）を求めた。その結果を表１のＣｏＡ量
残存率の欄に示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】表１に示す結果から明らかなように、ＥＤ
ＴＡを添加した場合に比べ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡまたは
ＥＧＴＡを添加した場合、実用試験における第一試薬の
反応性残存率（安定性）およびＣｏＡ残存率が有意に高
かった。

【００２９】実施例２ＦＡＤによるＡＣＯの安定化ＮＥＦＡ値２，３００μＥｑ／Ｌのコントロール血清
［セラクリアＬＰ（（株）アズウェル製）にＮＥＦＡを
添加することにより調製したもの］を実用試験のサンプ
ルとして使用した。ＮＥＦＡ測定第一試薬として、ネス
コートＮＥＦＡ−Ｖ２（ＮＥＦＡ測定自動分析用キッ
ト；（株）アズウェル製）のＲ１を、能書に従って用時
調製して用いた。試験用ＮＥＦＡ測定第二試薬として、
１０ｍＭリン酸緩衝液、６ｍｇ／ｍＬＴＯＯＳ、４
ｍＭＮＥＭ、１Ｕ／ｍＬＨＲＰ（東洋紡績（株）
製）、６０Ｕ／ｍＬＡＣＯ（旭化成工業（株）製）、
０〜２，０００μＭＦＡＤおよび０．６％ハイテノ
ール１８Ｅ（第一工業化学（株）製）を含有するｐＨ
６．０の溶液を調製し、３７℃で７日間保存した。試験
用第二試薬の反応性は、実施例１に記載の方法で測定し
た。試験用第二試薬の調製当日と、３７℃にて７日日間
保存後のものについて、上記操作により試料を測定し、
調製当日の試験用第二試薬の反応性を１００％として、
３７℃にて７日間保存後のものの反応性残存率（％）を
求めた。その結果を表２の反応性残存率の欄に示す。

【００３０】また、第二試薬中のＡＣＯの活性を、日立
７１７０自動分析装置を用いて以下のように測定した。
第二試薬１５μＬに２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ８．０）０．２ｍＬ、１５ｍＭ４−アミノア
ンチピリン溶液０．１ｍＬ、０．２％ＴＯＯＳ溶液
０．１ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬＨＲＰ溶液０．１ｍＬ、５
ｍＭパルミトイルＣｏＡ溶液（１０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄
−ＮａＯＨ，ｐＨ７．０で溶解）０．１ｍＬ、１％ト
リトンＸ−１００溶液０．１ｍＬおよび蒸留水０．３ｍ
Ｌを含む溶液１８０μＬを添加し、３７℃で１０分間反
応させ、主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで、測光
ポイント５から１５の吸光度変化を求めた。試験用第二
試薬の調製当日と、３７℃にて７日間保存後のものにつ
いて上記方法により同様に測定し、調製当日の試験用第
二試薬のＡＣＯ活性を１００％として、３７℃にて７日
間保存後のものの残存率（％）を求めた。その結果を表
２のＡＣＯ活性残存率の欄に示す。

【００３１】

【表２】

【００３２】ＦＡＤの添加濃度依存的にＡＣＯの安定性
が高くなり、実用試験における第二試薬の反応性残存率
（安定性）も高くなった。

【００３３】実施例３界面活性剤によるＡＣＯの安定
化ＮＥＦＡ値２，３００μＥｑ／Ｌのコントロール血清
［セラクリアＬＰ（（株）アズウェル製）にＮＥＦＡを
添加することにより調製したもの］を実用試験のサンプ
ルとして使用した。ＮＥＦＡ測定第一試薬として、ネス
コートＮＥＦＡ−Ｖ２（ＮＥＦＡ測定自動分析用キッ
ト；（株）アズウェル製）のＲ１を、能書に従って用時
調製して用いた。試験用ＮＥＦＡ測定第二試薬として、
１０ｍＭリン酸緩衝液、６ｍｇ／ｍＬＴＯＯＳ、４
ｍＭＮＥＭ、１Ｕ／ｍＬＨＲＰ（東洋紡績（株）
製）、６０Ｕ／ｍＬＡＣＯ（旭化成工業（株）製）、
２，０００μＭＦＡＤおよび表３においては０．５％
の各種界面活性剤（第一工業化学（株）製または和光純
薬工業（株）製）、表４においては０〜１．０％ハイ
テノール１８Ｅ（第一工業化学（株）製）を含有するｐ
Ｈ６．０の溶液を調製し、３７℃で５日間保存した。試
験用第二試薬の反応性は、実施例１に記載の方法で測定
した。試験用第二試薬の調製当日と、３７℃にて５日間
保存後のものについて、上記操作により試料を測定し、
調製当日の試験用第二試薬の反応性を１００％として、
３７℃にて５日間保存後のものの残存率（％）を求め
た。その結果を表３および表４の反応性残存率の欄に示
す。

【００３４】また、第二試薬中のＡＣＯの活性を実施例
２記載の方法で測定した。すなわち、試験用第二試薬の
調製当日と、３７℃にて５日間保存後のものについて同
様に測定し、調製当日の試験用第二試薬のＡＣＯ活性を
１００％として、３７℃にて５日間保存後のものの残存
率（％）を求めた。その結果を表３および表４のＡＣＯ
活性残存率の欄に示す。

【００３５】

【表３】

【００３６】

【表４】

【００３７】ハイテノール１８Ｅ（化学名：ポリオキシ
エチレンアルキルエーテル硫酸エステルアンモニウ
ム）、ハイテノールＮ−１７（化学名：ポリオキシエチ
レンアルキルフェニルエーテル硫酸エステルアンモニウ
ム）、ハイテノールＮＥ−１５（化学名：ポリオキシエ
チレンジアルキルアリルエーテル硫酸エステルアンモニ
ウム）およびハイテノールＮＦ−１３（化学名：ポリオ
キシエチレンアルケニルアリルエーテル硫酸エステルア
ンモニウム）を添加した場合、実用試験における第二試
薬の反応性残存率およびＡＣＯ活性の残存率が高く、ま
た、第二試薬の濁りも回避することができた。特に、ハ
イテノール１８Ｅには、より高いＡＣＯ安定化効果が認
められた。

【００３８】実施例４ＮＥＭとＡＣＯが共存可能なｐ
Ｈの検討ＮＥＭおよびＡＣＯを長期間安定化できる至適ｐＨを検
討した。ＮＥＦＡ値２，２００μＥｑ／Ｌのコントロー
ル血清［セラクリアＬＰ（（株）アズウェル製）にＮＥ
ＦＡを添加することにより調製したもの］を実用試験の
サンプルとして使用した。ＮＥＦＡ測定第一試薬とし
て、ネスコートＮＥＦＡ−Ｖ２（ＮＥＦＡ測定自動分析
用キット；（株）アズウェル製）のＲ１を、能書に従っ
て用時調製して用いた。試験用ＮＥＦＡ測定第二試薬と
して、１０ｍＭリン酸緩衝液、６ｍｇ／ｍＬＴＯＯ
Ｓ、４ｍＭＮＥＭ、１Ｕ／ｍＬＨＲＰ（東洋紡績
（株）製）、６０Ｕ／ｍＬＡＣＯ（旭化成工業（株）
製）、表５においては６００μＭ、表６においては２，
０００μＭのＦＡＤおよび０．５％ハイテノール１８
Ｅ（第一工業化学（株）製）を含有する各種ｐＨの溶液
を調製し、２５℃で２７日間または３７℃で６日間保存
した。試験用第二試薬の反応性は、実施例１に記載の方
法で測定した。試験用第二試薬の調製当日と、２５℃に
て２７日間または３７℃にて６日間保存後のものについ
て、上記操作により試料を測定し、調製当日の試験用第
二試薬の反応性を１００％として、２５℃にて２７日間
または３７℃にて６日間保存後のものの反応性残存率
（％）を求めた。その結果を表５および表６の反応性残
存率の欄に示す。

【００３９】同時に、第二試薬中のＡＣＯの活性を実施
例２記載の方法で測定した。さらに、第二試薬中のＮＥ
Ｍ量を、日立７１７０自動分析装置を用いて以下のよう
に測定した。試験用第二試薬１５μＬに０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０）および０．２〜０．５ｍＭ N-
アセチルシステインを含む溶液１８０μＬを添加し、３
７℃で１分２０秒反応後、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）、２５０ｍＭ 2,2-ジチオジピリジン、０．
２５％ N,N-ジメチルホルムアミドを含む溶液１８０μ
Ｌを添加して、さらに３７℃、８分４０秒反応させ、主
波長３４０ｎｍで、測光ポイント５から３４の吸光度変
化を求めた。ＡＣＯ活性およびＮＥＭ量を、試験用第二
試薬の調製当日と、３７℃にて６日間保存後のものにつ
いて同様に測定し、調製当日の試験用第二試薬のＡＣＯ
活性およびＮＥＭ量のそれぞれを１００％として、３７
℃にて６日間保存後のものの残存率（％）を求めた。そ
の結果を表５および表６のＡＣＯ活性残存率およびＮＥ
Ｍ量残存率の欄にそれぞれ示す。

【００４０】

【表５】

【００４１】

【表６】

【００４２】第二試薬のｐＨを６．０〜６．４に調整す
ることによって、２５℃、２７日間または３７℃、６日
間の保存後も、第二試薬の残存反応率が高く、ＡＣＯ、
ＮＥＭともに試薬の性能を発揮するのに必要な量を保持
することができた。

【００４３】

【発明の効果】上述のように、ＣｏＡ安定化剤として、
ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡまたはＥＧＴＡ等のキレート剤を添
加することにより、ＮＥＦＡ測定における第一試薬の性
能を液状で長期間安定に保持することができる。また、
ＮＥＭの安定化に有効なｐＨ範囲内で、１種以上のＡＣ
Ｏ安定化剤を添加することにより、ＮＥＦＡ測定におけ
る第二試薬の性能を液状で長期間安定に保持することが
できる。さらに、これら第一試薬と第二試薬を用いるこ
とにより、液状で長期間安定なＮＥＦＡ測定用キットを
提供することが可能となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｇ０１Ｎ 35/00 Ｇ０１Ｎ 35/00 Ｃ (72)発明者水野耕治京都府京都市西京区大原野西境谷町２−１ −４−201 Ｆターム(参考） 2G045 BA02 BB29 DA60 FA26 FB01 GC10 2G058 BB02 BB07 BB09 GA02 4B050 CC07 HH04 KK06 KK13 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ73 QR03 QR43 QR53 QR65 QS08 QS28 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コエンザイムＡ、並びにコエンザイムＡ
の安定化に有効な量の、ジエチレントリアミン-N,N,N',
N'',N''-五酢酸、トリエチレンテトラミン-N,N,N',N'',
N''',N'''-六酢酸およびO,O'-ビス(2-アミノエチル)エ
チレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸からなる群より選
択される１種以上の化合物を含有する、液状試薬として
使用し得る程度にコエンザイムＡが安定化された溶液。
【請求項２】アシルコエンザイムＡシンテターゼおよ
びアデノシン５'-三リン酸をさらに含有する請求項１記
載の溶液。
【請求項３】アシルコエンザイムＡオキシダーゼの安
定化に有効な量の陰イオン性界面活性剤を含有する、液
状試薬として使用し得る程度にアシルコエンザイムＡオ
キシダーゼが安定化された溶液。
【請求項４】さらに、アシルコエンザイムＡオキシダ
ーゼの安定化に有効な量のフラビンアデニンジヌクレオ
チドを含有する請求項３記載の溶液。
【請求項５】アシルコエンザイムＡオキシダーゼおよ
びＮ−エチルマレイミドを含有する溶液であって、Ｎ−
エチルマレイミドの安定化に有効なｐＨを有する請求項
３または４記載の溶液。
【請求項６】該陰イオン性界面活性剤が、ポリオキシ
エチレンアルキルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンア
ルキルフェニルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンジア
ルキルアリルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンアルケ
ニルアリルエーテル硫酸およびそれらの塩からなる群よ
り選択される１種以上の化合物である、請求項３〜５の
いずれかに記載の溶液。
【請求項７】フラビンアデニンジヌクレオチドを、１
００μＭ以上含有することを特徴とする請求項４〜６の
いずれかに記載の溶液。
【請求項８】ｐＨが６．８以下である請求項５〜７の
いずれかに記載の溶液。
【請求項９】過酸化水素定量用試薬をさらに含有する
請求項３〜８のいずれかに記載の溶液。
【請求項１０】該過酸化水素定量用試薬が、ペルオキ
シダーゼおよび発色性基質である水素供与体を含む請求
項９記載の溶液。
【請求項１１】遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに
変換する反応用の試薬、並びに請求項９または１０記載
の溶液を含む遊離脂肪酸測定用キット。
【請求項１２】遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに
変換する反応用の試薬が、請求項２記載の溶液である、
請求項１１記載のキット。
【請求項１３】コエンザイムＡ含有溶液に、コエンザ
イムＡの安定化に有効な量の、ジエチレントリアミン-
N,N,N',N'',N''-五酢酸、トリエチレンテトラミン-N,N,
N',N'',N''',N'''-六酢酸およびO,O'-ビス(2-アミノエ
チル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸からなる群
より選択される１種以上の化合物を添加することを特徴
とする、液状試薬として使用し得る程度にコエンザイム
Ａを安定化する方法。
【請求項１４】該溶液がアシルコエンザイムＡシンテ
ターゼおよびアデノシン５'-三リン酸をさらに含有する
ものである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】アシルコエンザイムＡオキシダーゼの
安定化に有効な量の陰イオン性界面活性剤を添加するこ
とを特徴とする、液状試薬として使用し得る程度にアシ
ルコエンザイムＡオキシダーゼを安定化する方法。
【請求項１６】さらに、アシルコエンザイムＡオキシ
ダーゼの安定化に有効な量のフラビンアデニンジヌクレ
オチドを添加することを特徴とする、請求項１５記載の
方法。
【請求項１７】アシルコエンザイムＡオキシダーゼお
よびＮ−エチルマレイミドを含有する溶液を安定化する
方法であって、該溶液をＮ−エチルマレイミドの安定化
に有効なｐＨに調整することを特徴とする、請求項１５
または１６記載の方法。
【請求項１８】該陰イオン性界面活性剤が、ポリオキ
シエチレンアルキルエーテル硫酸、ポリオキシエチレン
アルキルフェニルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンジ
アルキルアリルエーテル硫酸、ポリオキシエチレンアル
ケニルアリルエーテル硫酸およびそれらの塩からなる群
より選択される１種以上の化合物である、請求項１５〜
１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】フラビンアデニンジヌクレオチドを１
００μＭ以上含有することを特徴とする請求項１６〜１
８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】ｐＨが６．８以下である請求項１７〜
１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】該溶液が過酸化水素定量用試薬をさら
に含有するものである請求項１５〜２０のいずれかに記
載の方法。
【請求項２２】該過酸化水素定量用試薬が、ペルオキ
シダーゼおよび発色性基質である水素供与体を含む請求
項２１記載の方法。
【請求項２３】試料に、遊離脂肪酸をアシルコエンザ
イムＡに変換する反応用の試薬および請求項９または１
０記載の溶液を順次添加し、生成した過酸化水素を定量
することを特徴とする、該試料溶液中の遊離脂肪酸の測
定方法。
【請求項２４】遊離脂肪酸をアシルコエンザイムＡに
変換する反応用の試薬が、請求項２記載の溶液である、
請求項２３記載の方法。