JP2001525669A

JP2001525669A - 細胞遊走の阻害のための方法および構築物

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Publication number: JP2001525669A
Application number: JP54907798A
Authority: JP
Inventors: フベルツスアンドレアスクアクス、パウルス; ヘンドリクスフェルヘイエン、ヨハン
Original assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Current assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Priority date: 1997-05-12
Filing date: 1998-05-11
Publication date: 2001-12-11
Also published as: EP0981606A2; NO995564D0; NZ500656A; CA2289117A1; WO1998051788A3; WO1998051788A2; NO995564L; AU7553698A

Abstract

(57)【要約】哺乳類細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なベクターからなる組換え核酸分子であり、該ベクターは結合機能を有するドメインおよびエフェクター機能を有するドメインからなる発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸挿入物を含む。結合機能を有するドメインは受容体結合ドメインからなり、エフェクター機能を有するドメインは酵素的活性、とくにプロテアーゼ阻害剤活性を有する。該ベクターは、哺乳類細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なウイルス（たとえば、アデノウイルスまたはレトロウイルス）または非ウイルスベクターである。発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸挿入物は細胞または組織特異的プロモータの制御下にある。局所的タンパク質分解活性、細胞外マトリックスの分解、細胞遊走、細胞浸潤、または組織リモデリングを防止するための方法であり、該組換え核酸分子を用いて、それによってコードされるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の局所発現を得るために、関連の細胞またはそれらの環境にある細胞をトランスフェクションまたは形質導入することからなる方法。発現および産生されたハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の任意の回収のために、該組換え核酸分子を用いて哺乳類細胞をトランスフェクションまたは形質導入することにより該ハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質を産生するための方法。

Description

【発明の詳細な説明】細胞遊走の阻害のための方法および構築物発明の分野本発明は、細胞遊走および／または組織のリモデリングがおきる疾患の治療のための治療手段および治療方法の分野にある。さらに、本発明はバイオテクノロジー、とくに組換えＤＮＡ技術および遺伝子治療の分野にある。発明の背景細胞の遊走は、腫瘍転移、創傷の治癒、再狭窄、新脈管形成、またはリウマチ性関節炎など、組織リモデリングがおきる多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて、必須の段階である。遊走細胞は、周辺の細胞外マトリックスを通らなければならない。細胞外マトリックス成分の限定されたタンパク質分解性の分解が、細胞遊走中にしばしばみられる。この細胞遊走を媒介するために、遊走細胞は、プラスミノーゲン活性化因子、金属プロテアーゼ、またはエラスターゼなどのタンパク質分解酵素を産生するか、または細胞の直接的環境(directenviron ment)から調達する。たとえば、腫瘍転移または創傷の治癒中の細胞遊走の誘導は、しばしばこれらの酵素産生の誘導に関連する。病態生理学的条件下の細胞遊走におけるタンパク質分解酵素の関与がよく認められているが、これらのタンパク質分解酵素を阻害することにより細胞遊走を阻害するための試みはほとんどなされていない。プロテアーゼ阻害剤の限られた使用に対する可能な説明は、これらのタンパク質分解酵素が病理的かつ生理学的な多くのプロセス（フィブリン溶解、創傷の治癒、増殖因子の活性などを含む）に関与するという事実、全身的に適用されたプロテアーゼ阻害剤によるこれらのプロテアーゼ系の阻害が強い副作用を有しうるか、または局所の細胞遊走プロセスに強い作用をもたらすことなしに阻害化合物の拡散または除去に至り得るという事実である。細胞遊走および組織のリモデリングを妨げるプロテアーゼ阻害剤の使用における他の問題は、これらのプロセスを媒介するプロテアーゼが細胞表面の受容体に結合できることである。このように、タンパク質分解酵素は本阻害剤の作用に対して保護されている細胞周囲の微小環境において局所的に活性でありうる。ｕ−ＰＡ（アミノ末端断片(aminoterminal fragment)、すなわちＡＴＦ）の受容体結合部とインビトロで産生される尿のトリプシン阻害剤との間の抱合体がインビトロで腫瘍細胞の遊走を阻害することが開示された（コバヤシ(Kobayashi) 、ゴトウ(Gotoh)、ヒラシマ(Hirashima)、フジエ(Fujie)、スギノ(Sugino)、およびテラオ(Terao)、インビトロの腫瘍細胞浸潤におけるヒトのウロキナーゼと尿のトリプシン阻害剤との抱合体の阻害効果(Inhibitory effect of a conjugat e between human urokinase and urinary trypsin inhibitor on tumor cellinv asion in vitro.)、J．Biol．Chem.(1995)270,8361-8366)。これらの著者達が用いる抱合体は、単離されたＡＴＦ断片とトリプシン阻害剤を混合することにより合成的につくられる。最近、これらの抱合体も組換え的に産生されうることが開示された（ＷＯ第９７／２５４２２号）。酵母で組換え的に産生させるための、受容体結合のｕ−ＰＡ断片およびその阻害剤ＰＡＩ−２からなる同様の構築物が、ＷＯ第９２／０２５５３号（ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１３２２）で腫瘍細胞遊走を阻害するために記載されている。このように、細胞表面の特異的受容体であるウロキナーゼ受容体に結合し得るプロテアーゼ阻害剤がつくられ、この阻害剤は細胞遊走を阻害できる（インビトロ）。インビボでのこれらの構築物の使用に関して、課題は、インビボにおける所望の作用部位への適用およびそこでのより長い滞留である。発明の要旨本発明は、哺乳類の、たとえばヒトの、細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なベクターからなる組換え核酸分子を提供する。前記ベクターは、結合機能をもつドメインおよびエフェクター機能をもつドメインからなる発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸の挿入物(i nsertion)を含む。本明細書において、結合機能をもつドメインは、好ましくは受容体結合ドメインを含み、エフェクター機能をもつドメインは、好ましくは酵素的活性を有し、もっとも好ましくはプロテアーゼ阻害剤活性を有する。好ましくは、受容体結合ドメインは、ウロキナーゼのウロキナーゼ受容体結合ドメイン、上皮増殖因子の受容体結合ドメイン、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ α₂−マクログロブリン受容体）に結合する受容体関連タンパク質、およびＶＬＤＬ受容体からなる群より選択される。好ましくは、エフェクター機能をもつドメインは、プロテアーゼ阻害剤の活性を有し、そのプロテアーゼ阻害剤または活性部を含み、該プロテアーゼ阻害剤は、（ウシの）膵臓のトリプシン阻害剤、（ウシの）脾臓のトリプシン阻害剤、尿のトリプシン阻害剤、マトリックス金属プロテアーゼ１の組織の阻害剤、マトリックス金属プロテアーゼ２の組織の阻害剤、マトリックス金属プロテアーゼ３の組織の阻害剤、およびエラスターゼ阻害剤からなる群より選択される。エフェクター機能をもつドメインは、２つ以上の異なるプロテアーゼ阻害剤（の活性部）、または２つ以上のプロテアーゼ阻害剤（の活性部）のコピー、または両方を含む。好ましくは、ベクターは、哺乳類の細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なウイルスベクターおよび非ウイルスベクターからなる群より選択される。ベクターは、ヒトの細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターでもよい。発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸の挿入物は、内皮細胞特異的プロモータ、または血管平滑筋細胞特異的プロモータ、または肝臓特異的プロモータなどの細胞または組織特異的プロモータの制御下にあり得る。さらに本発明は、局所のタンパク質分解活性、細胞外マトリックス分解、細胞遊走、細胞浸潤、または組織のリモデリングを防止するための方法であり、本明細書で定義される組換え核酸分子によってコードされるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の局所的発現を得るために、関連の細胞またはそれらの環境にある細胞を該核酸分子でトランスフェクションまたは形質導入することからなる方法を提供する。また、本発明は、結合機能をもつドメインおよびエフェクター機能をもつドメインからなるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質を産生するための方法であり、本明細書で定義される組換え核酸分子によってコードされるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の発現を得るために、哺乳類の細胞をを該核酸分子でトランスフェクションまたは形質導入し、産生される該ハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質を任意に回収することからなる方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、プラスミドのｐＣＲＩＩ−ｕＰＡ（左）およびｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ（右）を概略的に表す。図２は、プラスミドのｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ−ＢＰＴＩを概略的に表す。図３は、プラスミドのｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩを概略的に表す。図４は、タンパク質分解のマトリックス分解実験の結果を示す。本発明の詳細な説明本発明は、機能タンパク質の局所的作用を誘導するために、ならびに全身的作用および／または拡散を防止するために、受容体結合ドメインをこのタンパク質に結合させた、ハイブリッドタンパク質の使用に関する。とくに本発明は、発現ベクターによるトランスフェクションまたは形質導入後に標的細胞としての細胞部分集団によって産生されるようなハイブリッドタンパク質に関する。より明確には、本発明は、遊走または浸潤細胞の表面でのプロテアーゼの阻害による細胞遊走および組織リモデリングの防止のために、受容体結合ドメインおよびプロテアーゼ阻害剤ドメインからなるハイブリッドタンパク質をコードする発現ベクターの使用に関する。本発明で記載される方法および構築物は、細胞遊走および／または組織リモデリングが起きる疾患の治療として適用されうる。本発明は、先行技術にしたがう前述の阻害剤の使用に関与するいくつかのネガティブな側面の解決に取り組む。遊走細胞自身または近接の環境(immediateenvironment)にある細胞によるタンパク質の産生により、標的細胞の直接的環境における局所的な高濃度のハイブリッドタンパク質が得られる。この産生は、ハイブリッドタンパク質をコードする適切なベクターによる一定の細胞部分集団のトランスフェクションまたは形質導入により誘導され得る。この目的のため、組換えアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、プラスミドベクターなどを使用して良い。ハイブリッドタンパク質（その受容体結合ドメイン）を標的細胞の細胞表面に結合させることにより、阻害剤の拡散および全身的副作用が防止される。このハイブリッドタンパク質の局所的発現もまた全身的副作用の減少に寄与し、一方、該タンパク質の拡散のネガティブな作用は、作用が要求される部位での産生により低減する。たとえば新脈管形成中に遊走しやすい内皮細胞などの細胞の特異的な部分集団におけるハイブリッドタンパク質の局所的発現は、細胞型特異的または組織特異的発現ベクターを用いて促進され、該タンパク質の発現は、細胞型特異的または組織特異的制御因子を備えたプロモータの制御下にある。細胞表面受容体にプロテアーゼ阻害剤が結合することで、該阻害剤は、分子標的、すなわち細胞表面に結合したタンパク質分解酵素に密接して局在できる。細胞周囲の微小環境におけるタンパク質分解活性の局所的阻害が、この方法で達成され得る。プロテアーゼ阻害剤が、ウロキナーゼ受容体などのタンパク質分解酵素に対する細胞表面受容体に結合することは、さらなる阻害的作用を有し得る。細胞遊走を強く阻害し得る受容体へのｕ−ＰＡの結合を遮断することが示されるようにタンパク質分解酵素の受容体への結合が防止され、それゆえこの酵素の作用は強く低減される。発現ベクターが該コードＤＮＡ配列を含む、ハイブリッドタンパク質は、細胞表面受容体に結合し、続いて内在化することのない領域を含む。この目的のために使用され得る受容体結合ドメインは、たとえばウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子のｕ−ＰＡＲ結合ドメイン、上皮増殖因子、α₂−マクログロブリン受容体とも呼ばれるＬＤＬ−Ｒ関連タンパク質(LRP)に結合する受容体関連タンパク質(RAP)、およびＶＬＤＬ受容体の受容体結合ドメインである。コードされたハイブリッドタンパク質の阻害剤部分は、アプロチニンまたはトラシロール（登録商標）とも呼ばれるウシ膵臓トリプシン阻害剤、尿のトリプシン阻害剤などの他のトリプシン阻害剤、金属プロテアーゼＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、およびＴＩＭＰ−３の組織阻害剤などのマトリックスを分解する金属プロテアーゼに対する阻害剤などの多様なプロテアーゼ阻害剤またはそれらの変異体からなる。また、エラスターゼなどの他のプロテアーゼに対する阻害剤は、ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターへの組み込みに非常に適している。たとえば、阻害剤部分、または異なる阻害剤の組み合わせ、またはそれらの誘導体である、ハイブリッドタンパク質の機能タンパク質部分をコードするＤＮＡ配列の多重コピーが、発現ベクターのＤＮＡ構築物へ組み込まれる。他の非常に興味ある可能性としては、標的細胞の局所環境においてその作用を行使し得るいかなる機能的タンパク質、たとえば増殖因子の活性化または他の、たとえば血管調節成分の活性化に関与するプロテアーゼを適用するために、ハイブリッド受容体結合タンパク質をコードする発現ベクターなどの使用である。機能タンパク質またはハイブリッドタンパク質のタンパク質ドメインの作用は、受容体結合ドメインを標的細胞の表面にある受容体に結合させることにより、標的細胞の直接的な微小環境(direct microenvironment)に局在させられる。標的細胞の直接的環境における、または標的細胞自身による、ハイブリッドタンパク質の産生は、非ウイルスの、またはアデノウイルスの、またはレトロウイルスのベクター系に基づく発現ベクターの使用によるこれらの細胞のトランスフェクションまたは形質導入により得られる。特異的な細胞または組織のタイプにおける発現は、発現ベクターでの特異的なプロモータエレメントの使用により達成し得る。たとえば、内皮細胞に特異的な発現のために、ヒトまたはマウスのプレプロエンドセリン遺伝子（それぞれＨＵＭＥＤＮ１ＢおよびＭＭＵ０７９８２、遺伝子配列データバンク(GENBANK)）のプロモータ領域（のエレメント）が使用され、血管平滑筋細胞に特異的な発現のために、ヒトの血管平滑筋α−アクチン遺伝子（ＨＵＭＡＣＴＳＡ、遺伝子配列データバンク）のプロモータ領域（のエレメント）が使用され、肝臓に特異的な発現のために、ヒトのアルブミン遺伝子（ＨＵＭＡＬＢＧＣ、遺伝子配列データバンク）のプロモータが使用され得る。これらのベクターの局所輸送は、カテーテル、ベクターまたは標的輸送系を含む典型的に適用されるゲルなどの、通常使用される様々な方法を用いて行なわれる。たとえば、血管形成後の再狭窄および管壁のリモデリングを防止するための管壁への部位特異的輸送に対して、特別なカテーテルが使用され得る。現在、ハイドロゲルを含むベクターで被覆された二重バルーンカテーテル、チャネル(cha nneled)バルーンカテーテル、多針(multipleneedle)カテーテル、およびバルーンカテーテルが、管壁に特異的な輸送に使用され得る。ベクターを管壁に直接輸送するための他の方法には、被覆剤を含むベクターで被覆されたステントの使用、血管の外部にハイドロゲルを含むベクターの塗布、または移植手術中に血管への直接的なイクスビボ(ex vivo)輸送がある。再注射前のレトロウイルスベクターを用いる増殖細胞のイクスビボ形質導入もまた、作用が要求される部位にベクター構築物を輸送するために使用され得る。本件出願は、つぎの実施例を参照しながら、以下にさらに詳細に記載されるだろう。これらの実施例は単に本発明を説明するために役立つものであり、本発明を限定するものではないことが特筆される。実施例１以下の本明細書でＡＴＦと呼ばれるウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子(u -PA)のアミノ末端断片である、アミノ酸１〜１３８番をコードする発現プラスミドは、以下のオリゴヌクレオチド5'-cccgggcttttttccatctgcgcagtc-3'および5'- agggtcaccaaggaagagaatggc-3'によるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、全長のｕ−ＰＡに対して発現ベクター中の１３９から４０１までのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を欠失させることにより構築され得る。ＰＣＲによる増幅後、新しく形成されたＤＮＡ断片は、発現プラスミドの環状性質に戻すためにライゲーションにより環状化され得る。この方法で、ＡＴＦ、および終止コドンを含むＣ末端の１１アミノ酸残基をコードする発現プラスミドが構築され得る。ついでｕ−ＰＡＡＴＦ断片をコードする、このように形成されたＤＮＡ構築物の配列が決定され、構築手順の間に導入される可能な変異に対する対照としての推定配列と比較される。ＰＣＲを使用してｐＣＲＩＩ−ｕＰＡ由来の構築物ｐＣＲＩＩ−ＡＴＦが図１に示される。図１では、ライン間に示される領域がＰＣＲ増幅中に除去され、ＡＴＦプラスミドを得た。プラスミドｐＣＲＩＩ−ｕＰＡは左に、プラスミドｐＣＴＩＩ−ＡＴＦは右に示される。実施例２ウシの大動脈内皮細胞から単離されたゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ反応を行なうことにより、ウシ膵臓トリプシン阻害剤(BPTI)のアミノ酸残基３６〜９３およびウシ脾臓トリプシン阻害剤(BSTI)の相同なアミノ酸残基をコードするＤＮＡ断片が単離され得、該ＰＣＲ反応では以下のオリゴヌクレオチド：公表された配列（遺伝子配列データバンク、ＢＴＢＰＴＩＧ）にしたがってＢＰＴＩ遺伝子の２５０９から２５３３のヌクレオチドに相当する5'-tcgcgacctgacttctgcctagagc-3 '（クローニングの目的用に（下線の）ＮｒｕＩ部位を導入するため、オリゴヌクレオチドの５'領域にイタリックで示される改変あり）、ならびに公表された配列（遺伝子配列データバンク、ＢＴＢＰＴＩＧ）にしたがってＢＳＴＩ遺伝子の２４４２から２４６２のヌクレオチド、ならびにＢＰＴＩ遺伝子の２６７７から２７０４およびＢＳＴＩ遺伝子の２６１０から２６３６のヌクレオチドに対応する5'-ggtcacccagggcccaatattaccacc-3'(（下線の）ＢｓｔＥＩＩおよびＳｓｐＩ部位をそれぞれ導入するため、示されたヌクレオチド（イタリック体）で改変 )を用いる。ついで、増幅したＤＮＡ断片は適切なプラスミドベクター、ｐＣＲＩＩまたはｐＵＣ１３へクローニングし、ついで、単離されたクローンでの増幅されたＤＮＡ断片の正確な配列は、非常に高い相同度を有するＢＰＴＩおよびＢＳＴＩを識別するために分析された。実施例３下記のオリゴヌクレオチド：（遺伝子配列データバンクＨＳＴＩＭＰＲの配列にしたがって）ヒトＴＩＭＰ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド４１から６５に相当する5'-agagagacaccagagaacccaccat-3'およびヌクレオチド７４０から７５５までに相当する5'-tcattgtccggaagaaagatgggag-3'を用いて、ヒトの包皮線維芽細胞から単離された全ＲＮＡに対して逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行なうことにより、金属プロテアーゼタイプ１のヒト組織阻害剤の１から２０７のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片が単離される。増幅されたＤＮＡ断片は、適切な宿主ベクターであるｐＵＣ１３へクローニングされ、単離されたクローン中の増幅されたＤＮＡ断片の正確な配列が分析された。実施例４ＡＴＦ．ＢＰＴＩハイブリッドタンパク質をコードする配列を含む組換えアデノウイルスの構築のために、この配列は、アデノウイルスベクターの構築物アダプターおよび発現プラスミドｐＭＡＤ５でクローニングされる。このプラスミドは、野生型アデノウイルスタイプ５ＤＮＡ配列の部分、後期主要プロモータ(MLP )、およびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含み、組換えアデノウイルスを構築するために発現ベクターまたはシャトルベクターとして使用され得る。このプラスミドは、下記のようにプラスミドｐＭＬＰ１０から得られた。まず、ｐＭＬＰ１０−ｌｉｎは、制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩ、ＳｐｌＩ、ＳｎａＢｌ、ＳｐｅＩ、ＡｓｕＩＩ、およびＭｕｎＩに対する唯一の部位を備えた合成ＤＮＡ断片をｐＭＬＰ１０のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することによって構築された。続いて、Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド３３２８から８９１４にわたるアデノウイルスＢｇｌＩＩ断片をｐＭＬＰ１０−ｌｉｎのＭｕｎＩ部位に挿入した。最後に、テトラサイクリン耐性遺伝子を不活性化させるために、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を欠失させ、プラスミドｐＭＡＤ５を得た。ＡＴＦ．ＢＰＴＩ配列をＭＬＰプロモータおよびポリＡシグナル間でｐＭＡＤ５プラスミドにクローニングするために、下記の方策がとられた。ＵＰＡｃＤＮＡの１３７３塩基対断片がクローニングされたｐＣＲＩＩプラスミドを出発材料として、ｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミドを作製するため、実施例１に記載するようにオリゴヌクレオチド5'-cccgggcttttttccatctgcgcagtc-3' （下線のＳｍａＩ部位およびイタリック変形のヌクレオチド）および5'-agggtca cc aaggaagagaatggc-3'(下線のＢｓｔＥＩＩ部位およびイタリック変形のヌクレオチド)をもちいたＰＣＲ反応を行なった（図１参照）。次に、このｐＣＲＩＩ −ＡＴＦプラスミドを制限酵素のＳｍａＩおよびＢｓｔｅＩＩで消化した。平行して、ｐＣＲＩＩ−ＢＰＴＩプラスミドを制限酵素のＮｒｕＩおよびＢｓｔｅＩＩで消化し、ＢＰＴＩを含有する断片をｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミドへクローニングした（図２参照）。構築物ｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ−ＢＰＴＩが図２で示される。次の段階で、ＡＴＦ−ＢＰＴＩ配列がｐＭＡＤ５にクローニングされた。これは、制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳｐｅＩでｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ−ＢＰＴＩプラスミドを消化し、ＡＴＦ−ＢＰＴＩをコードするＤＮＡ断片を単離し、この断片をＳｎａＢＩおよびＳｐｅＩで消化されたｐＭＡＤ５プラスミドでクローニングすることによってなされた。クローニングは、制限分析および配列分析によって試験された。ＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイルスベクターの構築用のｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩシャトルベクターが図３に示される。実施例５ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩのために、実施例４に記載の同様な方法で、ＢＳＴＩ遺伝子を含むプラスミド（ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＳＴＩ）が、ｐＣＲＩＩ−ＢＰＴＩプラスミドのかわりにｐＣＲＩＩ−ＢＳＴＩプラスミドを用いて構築された。実施例６ＡＴＦ−ＴＩＭＰ１ハイブリッドタンパク質をコードする配列を含む組換えアデノウイルスの構築のために、この配列は、発現プラスミドｐＭＡＤ５へクローニングされる。このプラスミドは、野生型アデノウイルスタイプ５ＤＮＡ配列の部分、後期主要プロモータ(MLP)、およびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含み、組換えアデノウイルスを構築するために発現ベクターまたはシャトルベクターとして使用され得る。ＡＴＦ−ＴＩＭＰ１配列をＭＬＰプロモータおよびポリＡシグナル間でｐＭＡＤ５プラスミドにクローニングするために、下記の方策がとられた。ｕＰＡｃＤＮＡの１３７３塩基対断片がクローニングされたｐＣＲＩＩプラスミドを出発材料として、ｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミドを作製するため、実施例１に記載するようにオリゴヌクレオチド5'-ccc gggcttttttccatctgcgcagtc-3'および5'-agggtcaccaaggaagagaatggc-3'をもちいたＰＣＲ反応を行なった（図１参照）。次に、このｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミドを制限酵素のＳｍａＩおよびＢｓｔｅＩＩで消化した。並行して、シグナルペプチドおよび終止コドンを欠いた成熟タンパク質の１から１８４のアミノ酸残基をコードするｐＵＣ１３−ＴＩＭＰ１でＴＩＭＰ１のｃＤＮＡの断片が、下記のオリゴヌクレオチド5'-tcgcgatgcacctgtgtcccacc-3'および5'-ggtcacccaaatattggctatgtgggaccgcaggg-3'を用いて増幅された。これらのオリゴヌクレオチドは制限酵素のＮｒｕＩ（１番目のオリゴヌクレオチド、下線）、およびＢｓｔＥＩＩ、およびＳｓｐ１（２番目のオリゴヌクレオチド、下線）に対する認識部位をそれぞれ含み、これらの部位はクローニングの手順に必要である。増幅されたＤＮＡ断片は、ｐＣＲＩＩベクターへクローニングされ、ｐＣＲＩＩ−ＴＩＭＰ１と呼ばれた。続いて、このベクターを制限酵素のＮｒｕＩおよびＢｓｔｅＩＩで消化し、ＴＩＭＰ１を含むＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミドへクローニングした(図１参照)。次の段階で、ＡＴＦ−ＴＩＭＰ配列がｐＭＡＤ５にクローニングされた。これは、制限酵素のＥｃｏＲＶおよびＳｐｅＩでｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ−ＴＩＭＰプラスミドを消化し、ＡＴＦ−ＴＩＭＰをコードするＤＮＡ断片を単離し、この断片をＳｎａｂＩおよびＳｐｅＩで消化されたｐＭＡＤ５プラスミドでクローニングすることによってなされた。クローニングは、制限分析および配列分析によって試験された。ＡＴＦ．ＴＩＭＰ１ハイブリッドタンパク質をコードする配列を含む組換えアデノウイルスの構築のために、この配列は、発現プラスミドのｐＭＡＤ５へクローニングされる。このプラスミドは、野生型アデノウイルスタイプ５ＤＮＡ配列の部分、後期主要プロモータ(MLP)、およびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含み、組換えアデノウイルスを構築するために発現ベクターまたはシャトルベクターとして使用され得る。ＡＴＦ．ＴＩＭＰ１配列をＭＬＰプロモータおよびポリＡシグナル間でｐＭＡＤ５プラスミドにクローニングするために、下記の方策がとられた。ｕＰＡｃＤＮＡの１３７３塩基対断片がクローニングされたｐＣＲＩＩプラスミドを出発材料として、ｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミドを作製するため、実施例１に記載するようにオリゴヌクレオチド5'-cccgggcttttttccatctgcgcagtc-3' および5'-agggtcaccaaggaagagaatggc-3'をもちいたＰＣＲ反応を行なった（図１参照）。次に、このｐＣＲＩＩ−ＡＴＦプラスミドにおいて、オリゴヌクレオチド5'-aatattattgaacttcatcaagttcc-3'および5'-gactctagagcaaaaatgacaaccag-3' を用いてＰＣＲ反応を行ない、得られたＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩクローニングベクターへクローニングした。この方法で、ｕ−ＰＡのシグナルペプチドが除去され、ＳｓｐＩ制限酵素認識部位が導入される（下線）。得られたプラスミドＤＮＡをｐＣＲＩＩＡＴＦ^★と呼ぶ。平行して、シグナルペプチドを含むが、終止コドンを欠いたＴＩＭＰ−１タンパク質の−２３から１８４のアミノ酸残基をコードするｐＵＣ１３−ＴＩＭＰ１へＴＩＭＰ１のｃＤＮＡの断片が、オリゴヌクレオチド5'-agagagacaccagagaacc caccat-3'および制限酵素Ｓｓｐ１（下線）の認識部位を含む5'-aatattggctatct gggaccgcagg-3'を用いて増幅され、ｐＣＲＩＩクローニングベクターへクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＩＭＰ１^★と呼ぶ。続いて、このベクターを制限酵素のＳｓｐＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ＴＩＭＰ１を含むＤＮＡ断片をＥｃｏＲＶ−ＳｓｐＩで消化したｐＣＲＩＩ−ＡＴＦ^★ プラスミドでクローニングした。得られたＴＩＭＰ−ＡＴＦＤＮＡ断片を含むプラスミドはｐＣＲＩＩ−ＴＩＭＰ−ＡＴＦと呼ばれた。次の段階で、ＴＩＭＰ −ＡＴＦ配列をｐＭＡＤ５へクローニングした。これは、制限酵素のＥｃｏＲＶおよびＳｐｅＩでｐＣＲＩＩ−ＴＩＭＰ−ＡＴＦプラスミドを消化し、ＴＩＭＰ −ＡＴＦをコードするＤＮＡ断片を単離し、この断片をＳｎａｂＩおよびＳｐｅＩで消化されたｐＭＡＤ５プラスミドでクローニングすることによってなされた。クローニングは、制限分析および配列分析によって試験された。実施例７ＡＴＦドメインに連結させたＢＰＴＩユニットの多重コピーを含むハイブリッドタンパク質をコードするベクターが構築された。これらの多重ＢＰＴＩベクターを構築するために、以下の方策がとられる。実施例４に記載されたｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩは、制限酵素のＳｓｐＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化される。この方法で、ベクターは、ＢＰＴＩ配列の末端の読み取り枠中で正確に開かれる。実施例２に記載されるｐＣＲＩＩ−ＢＰＴＩプラスミドはＮｒｕＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化され、１つの平滑末端(NruI) を備えたＢＰＴＩをコードするＤＮＡ断片を得る。その断片をＳｓｐＩＢｓｔＥＩＩｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩベクターに一方向にクローニングした。したがって、ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩ−ＢＰＴＩという名の構築されたプラスミドは、組換えアデノウイルスの構築のためにシャトルベクターとして使用された。このアプローチは、多重ＢＰＴＩドメインを含むベクターを構築するために多数回反復され得る。実施例８ＡＴＦドメインに連結させたＢＰＴＩユニットおよびＴＩＭＰ１ユニットの両方を含むハイブリッドタンパク質をコードするベクターが構築された。このＢＰＴＩ−ＴＩＭＰベクターを構築するために、以下の方策がとられる。実施例４に記載されたｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩは、制限酵素のＳｓｐＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化される。この方法で、ベクターは、ＢＰＴＩ配列直後で開かれる。実施例６に記載されるｐＣＲＩＩ−ＴＩＭＰプラスミドはＮｒｕＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化され、１つの平滑末端を備えたＴＩＭＰ１をコードするＤＮＡ断片を得る。その断片をＳｓｐＩＢｓｔＥＩＩｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩベクターにクローニングした。したがって、ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩ−ＴＩＭＰという名の構築されたプラスミドは、組換えアデノウイルスの構築用にシャトルベクターとして使用された。実施例９ｐＭＡＤ５による細胞のトランスフェクション後または組換え複製欠損性のＡＴＦ−ＢＰＴＩをコードするアデノウイルスによる形質導入後に機能的ＡＴＦ− ＢＰＴＩハイブリッドタンパク質の産生をモニターするために、下記の試験が実施された。ｐＭＡＤ５−ＡＴＦ−ＢＰＴＩでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞によるハイブリッドＡＴＦ−ＢＰＴＩタンパク質の産生が、ｕ−ＰＡのアミノ末端断片であるＡＴＦを認識するｕＰＡＥＬＩＳＡを用いて分析された。ｐＭＡＤ５ −ＡＴＦ−ＢＰＴＩプラスミド（５０〜１００ｎｇ／ｍｌ／２４時間）によるＣＨＯ細胞の一過性のトランスフェクション後およびＡＴＦ−ＢＰＴＩをコードするアデノウイルスベクター（１．５μｇ／ｍｌ／２４時間まで）による形質導入後の両方で、ＡＴＦ−ＢＰＴＩの産生は明確に検出されるものであった。ＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイルスで形質導入されたＣＨＯ細胞の細胞培地をウェスタンブロッティング技術を用いて分析した。電気泳動およびブロッティング後に、（トラシロール（登録商標）に対して生じた）ｕ−ＰＡまたはＢＰＴＩに対するポリクローナル抗体を用いて、並行のフィルターを分析した。両方のフィルターにおいて、約２０ｋＤａの同じ予想される位置にシグナルが検出された。これは、実際に産生されたタンパク質がｕ−ＰＡおよびＢＰＴＩの断片を含み、したがってハイブリッドタンパク質が産生されることを示している。ＡＴＦ−ＢＰＴＩウイルスに感染したＣＨＯ細胞（約１．８μｇ／ｍｌ）の希釈培地を用いて、ＡＴＦ−ＢＰＴＩタンパク質のプラスミン活性の阻害剤としての機能が、まず溶液中で分析された。それらはプラスミン（１ｎＭ）とインキュベートし、色素基質を用いてプラスミンの活性を測定した。トラシロール（登録商標）の希釈は、対照参考として使用された。ＡＴＦ−ＢＰＴＩ培地によるプラスミン阻害は、非常に効果的であり、培地を１０００Ｘに希釈することにより（すなわち１００ｎＭＡＴＦ−ＢＰＴＩ）１ｎＭプラスミンの活性を５０％阻害し、同様の阻害が１００ｎＭのトラシロール（登録商標）で観察された。したがって、ＡＴＦ−ＢＰＴＩの活性は、市販で入手できるトラシロール（登録商標、バイエル(Bayer)、ドイツ）の活性に匹敵する。ヒトｕＰＡ受容体遺伝子でトランスフェクションされている、またはされていないマウス細胞系統を用いて、ｕ−ＰＡ受容体(uPAR)とＡＴＦドメインの相互作用を経て、細胞表面に結合するプラスミンに対する阻害剤としてのＡＴＦ−ＢＰＴＩの機能が試験された。これらの細胞をＡＴＦ−ＢＰＴＩウイルスで感染させたＣＨＯ細胞の希釈培地で６時間インキュベートした。ｕＰＡＲでトランスフェクションされた細胞およびヒトｕＰＡＲを欠いた親マウスの細胞から細胞抽出物を作製した。細胞抽出物を作製する前に、短い酸処理が並行の培養に施された（ｐＨ３、３分）。この処理により、ｕ−ＰＡ受容体に結合するｕ−ＰＡまたはＡＴＦのいずれも除去される。細胞抽出物は１ｎＭのプラスミンとインキュベートし、プラスミン活性が測定された。プラスミン活性は、ｕ−ＰＡＲを含む細胞系統の細胞抽出物によってのみ阻害され得る。ｕ−ＰＡ受容体を欠いた親の細胞系統の細胞抽出物および酸で処理されたｕ−ＰＡＲを含む細胞系統においては、酸処理プラスミン活性の阻害は観察されなかった。これは明らかにＡＴＦ−ＢＰＴＩがｕ−ＰＡＲ結合プラスミン阻害剤として機能し得ることを示す。表１実施例１０たとえば新脈管形成時に内皮細胞の遊走を特異的に阻害するために、アデノウイルスベクターにおけるＡＴＦ−ＢＰＴＩをコードするＤＮＡ前のヒトのプレプロエンドセリン１遺伝子のプロモータ配列（ＨＵＭＥＤＮ１Ｂ（遺伝子配列データバンク）のヌクレオチド２１８０〜３６８０）をクローニングすることにより、内皮細胞におけるＡＴＦ−ＢＰＴＩの細胞特異的発現が到達される。この方法で、ＡＴＦ−ＢＰＴＩハイブリッドタンパク質の高度な上皮細胞特異的発現が得られる。実施例１１細胞外マトリックスのタンパク質分解性の分解は、多くの細胞遊走および組織リモデリングのプロセスにおいて重要な段階である。このタンパク質分解性のマトリックス分解は、ウロキナーゼタイプのプラスミノゲン活性によって媒介されることがしばしば見られる。ＡＴＦ−ＢＰＴＩをコードするアデノウイルスによる感染がプラスミン媒介性細胞外マトリックス分解を阻害し得るかどうかを試験するために、ヒトの滑膜細胞を用いて実験が行なわれた。これらの細胞は、ウシ軟骨物質にある³Ｈで標識された細胞外マトリックス上に播種されると同時に、ＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイルスにより感染された。マトリックス分解の強い阻害がウイルス処理された細胞で観察され（図４）、マトリックス分解がＡＴＦ− ＢＰＴＩをコードするウイルスによる感染細胞により阻害され得ることを示している。図４は、プラスミノゲンの存在下におけるヒトの滑膜による軟骨マトリックスの分解を示す。マトリックスを対照培地（レーン１）、滑膜細胞（レーン２）、ＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイルスで感染された滑膜細胞（レーン３）、およびトラシロール（登録商標）（１００ＫＩＵ／ｍｌ）とインキュベートした滑膜細胞（レーン４）でインキュベートした。実施例１２再狭窄のプロセスにおいて、平滑筋細胞の遊走および管壁リモデリングは、細胞外マトリックス成分のプラスミン媒介性タンパク質分解が関与する重要な出来事である。このプロセスにおいて妨害用の一般的なプラスミン阻害剤のインビボ適用は、全身的な副作用を有し得る。遊走細胞の表面にプラスミン阻害剤を適用することにより、これらの副作用が防止され得る。たとえば移植された「冠状動脈バイパス」移植片において、新脈管内膜(neointima)の形成が予期されうる部位でのＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイルスによる血管壁の感染は、局所的にＡＴＦ−ＢＰＴＩがを産生するための理想的方法であり、したがって遊走（平滑筋）細胞の直接的環境においてプラスミン活性を阻害し、結果として新脈管内膜形成が低減する。新脈管内膜の形成が非常に現実的に模擬され得るモデルシステムであるヒトの伏在静脈器官の培養を用いて、この原理が試験された。ＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイルスで感染された、または感染されていない並行の培養において、３および４週間後に新脈管内膜の形成が分析された。非処理の組織において、明確な新脈管内膜の形成が観察された。１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌＡＴＦ−ＢＰＴＩアデノウイルスで処理された組織において、新脈管内膜形成の強い阻害が観察された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年６月２５日（１９９９．６．２５）【補正内容】請求の範囲（請求項１８および１９を追加。これに伴い、請求項１８および１９の項番号を２０および２１に調整（内容に変更なし）。） 18．ヒトなどの哺乳類細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用な該ベクターからなる組換え核酸分子であって、前記ベクターが結合機能を有するドメインおよびエフェクター機能を有するドメインからなる発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸挿入物を含み、結合機能を有する該ドメインが細胞表面受容体結合ドメインである組換え核酸分子。 19．ヒトなどの哺乳類細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なベクターからなる組換え核酸分子であって、前記ベクターが発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸挿入物を含み、該核酸挿入物がウロキナーゼのウロキナーゼ受容体結合ドメイン、上皮増殖因子、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（α₂−マクログロブリン受容体）に結合する受容体関連タンパク質、およびＶＬＤＬ受容体の受容体結合ドメインと、プロテアーゼ阻害剤またはその活性部からなるプロテアーゼ阻害剤活性を有するドメインとからなる群より選択される受容体結合ドメインとからなり、該プロテアーゼ阻害剤が（ウシの）膵臓トリプシン阻害剤、（ウシの）脾臓トリプシン阻害剤、尿のトリプシン阻害剤、マトリックスの金属プロテアーゼ１の組織阻害剤、マトリックスの金属プロテアーゼ２の組織阻害剤、マトリックスの金属プロテアーゼ３の組織阻害剤、およびエラスターゼ阻害剤からなる群より選択されてなる組換え核酸分子。 20．局所的タンパク質分解活性、細胞外マトリックスの分解、細胞遊走、細胞浸潤、または組織リモデリングを防止するための方法であって、請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第８項、第９項、第１０項、第１１項、第１２項、第１３項、第１４項、第１５項、第１６項、第１７項、第１８項または第１９項記載の組換え核酸分子を用いて、該核酸分子によってコードされるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の局所発現を得るために、関与する細胞またはそれらの環境にある細胞をトランスフェクションまたは形質導入することからなる方法。 21．結合機能を有するドメインおよびエフェクター機能を有するドメインからなるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質を産生するための方法であり、請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第８項、第９項、第１０項、第１１項、第１２項、第１３項、第１４項、第１５項、第１６項、第１７項、第１８項または第１９項記載の組換え核酸分子を用いて、該核酸分子によってコードされるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の発現を得るために、哺乳類の細胞をトランスフェクションまたは形質導入し、産生されたハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質を任意的に回収することからなる方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者フェルヘイエン、ヨハンヘンドリクスオランダ国、エヌエル―2651 ヴェーベーベルケルエンロデンリース、フェルジストラート 14

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトなどの哺乳類細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なベクターからなる組換え核酸分子であって、前記ベクターが結合機能を有するドメインおよびエフェクター機能を有するドメインからなる発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸挿入物を含んでなる組換え核酸分子。２．前記結合機能を有するドメインが受容体結合ドメインからなる請求の範囲第１項記載の組換え核酸分子。３．前記受容体結合ドメインがウロキナーゼのウロキナーゼ受容体結合ドメイン、上皮増殖因子、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（α₂−マクログロブリン受容体）に結合する受容体関連タンパク質、およびＶＬＤＬ受容体の受容体結合ドメインからなる群より選択される請求の範囲第２項記載の組換え核酸分子。４．前記受容体結合ドメインがウロキナーゼ受容体に結合できるウロキナーゼのアミノ末端部からなる請求の範囲第２項記載の組換え核酸分子。５．前記受容体結合ドメインがウロキナーゼのアミノ酸残基１から１３５からなる請求の範囲第２項記載の組換え核酸分子。６．エフェクター機能を有する前記ドメインが酵素的に活性なドメインである請求の範囲第１項記載の組換え核酸分子。７．エフェクター機能を有する前記ドメインがプロテアーゼ阻害活性を有する請求の範囲第１項記載の組換え核酸分子。８．プロテアーゼ阻害活性を有する前記ドメインがプロテアーゼ阻害剤またはその活性部からなり、該プロテアーゼ阻害剤が（ウシの）膵臓トリプシン阻害剤、（ウシの）脾臓トリプシン阻害剤、尿のトリプシン阻害剤、マトリックス金属プロテアーゼ１の組織阻害剤、マトリックス金属プロテアーゼ２の組織阻害剤、マトリックス金属プロテアーゼ３の組織阻害剤、およびエラスターゼ阻害剤からなる群より選択される請求の範囲第７項記載の組換え核酸分子。９．プロテアーゼ阻害剤活性を有する前記ドメインがウシの成熟膵臓トリプシン阻害剤（のアミノ酸残基５３から９４）からなる請求の範囲第７項記載の組換え核酸分子。 10．プロテアーゼ阻害剤活性を有する前記ドメインがウシの脾臓トリプシン阻害剤からなる請求の範囲第７項記載の組換え核酸分子。 11．プロテアーゼ阻害剤活性を有する前記ドメインがマトリックス金属プロテアーゼの組織阻害剤からなる請求の範囲第７項記載の組換え核酸分子。 12．エフェクター機能を有する前記ドメインが２つ以上の異なるプロテアーゼ阻害剤（の活性部）、プロテアーゼ阻害剤の２つ以上のコピー（の活性部）、または両方からなる請求の範囲第１項記載の組換え核酸分子。 13．前記ベクターが哺乳類細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なウイルスおよび非ウイルスベクターからなる群より選択される請求の範囲第１項記載の組換え核酸分子。 14．前記ベクターがヒトの細胞のトランスフェクションまたは形質導入に有用なアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである請求の範囲第１項記載の組換え核酸分子。 15．前記ベクターがシャトルベクターｐＭＡＤ５に基づくアデノウイルスベクターである請求の範囲第１項記載の組換え核酸分子。 16．発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする前記核酸挿入物が細胞または組織特異的プロモータの制御下にある請求の範囲第１項記載の組換え核酸分子。 17．発現可能なハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質をコードする前記核酸挿入物が内皮細胞特異的プロモータ、または血管の平滑筋細胞特異的プロモータ、または肝臓特異的プロモータの制御下にある請求の範囲第１項記載の組換え核酸分子。 18．局所的タンパク質分解活性、細胞外マトリックスの分解、細胞遊走、細胞浸潤、または組織リモデリングを防止するための方法であって、請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第８項、第９項、第１０項、第１１項、第１２項、第１３項、第１４項、第１５項、第１６項または第１７項記載の組換え核酸分子を用いて、該核酸分子によってコードされるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の局所発現を得るために、関与する細胞またはそれらの環境にある細胞をトランスフェクションまたは形質導入することからなる方法。 19．結合機能を有するドメインおよびエフェクター機能を有するドメインからなるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質を産生するための方法であり、請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第８項、第９項、第１０項、第１１項、第１２項、第１３項、第１４項、第１５項、第１６項または第１７項記載の組換え核酸分子を用いて、該核酸分子によってコードされるハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質の発現を得るために、哺乳類の細胞をトランスフェクションまたは形質導入し、産生されたハイブリッドのポリペプチドまたはタンパク質を任意的に回収することからなる方法。