JP2001511885A

JP2001511885A - 抗―線維症剤アッセイ

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Publication number: JP2001511885A
Application number: JP51969898A
Authority: JP
Inventors: ジエフリー，シー・ゲーシン; ゴシユースカ，アンナ
Original assignee: Ethicon Inc
Current assignee: Ethicon Inc
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2001-08-14
Also published as: EP0956036A4; DE69734894T2; EP0956036A1; CA2269711A1; ES2253788T3; EP0956036B1; DE69734894D1; AU740052B2; ATE312620T1; WO1998017304A1; AU6810798A

Abstract

(57)【要約】抗−瘢痕化及び抗−線維症剤をスクリーニングするための新規な方法が開発された。この方法は簡便であり、再現性があり、そして多数の新規な潜在的抗−線維症剤をスクリーニングするために採用することができるはずである。この方法はＢＡＥＣ／ＢＡＳＭＣ共培養系と共通の特徴を有するが、より高感度であり、そして有効な方法を開発するために多数のクローン系をスクリーニングする必要がない。この系では、共培養系と同様に、いくつかの独立した機構によりＬ−ＴＧＦ−β１の活性化が起こり、それらはＭ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体への潜在型複合体の結合、トロンボスポンジン及び／または組織II型トランスグルタミナーゼを含む。しかし、共培養系と異なり、このマクロファージに依存する系はプラスミンを含まないようである。この方法を用いて、（送達手段としてのＩＧＦＢＰ−２と別個にまたは組み合わせて用いられる）ＩＧＦ−II、組織II型トランスグルタミナーゼインヒビター及び（ヒドロコルチゾンのような）抗炎症剤のような潜在的新規抗−線維症剤を同定した。マンノース６−リン酸の可能性のある新規な作用機構が提示され、それはＭ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡのダウンレギュレーションに基づく。

Description

【発明の詳細な説明】抗−線維症剤アッセイ発明の背景トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）は強力な増殖調節タンパク質であり且つ様々な線維症（瘢痕化）疾患に関与する重要な分子である。大部分の細胞はＴＧＦ−β１を主に不活性高分子量型の潜在型ＴＧＦ−β（Ｌ−ＴＧＦ− β）で分泌する。潜在型ＴＧＦ−βはカルボキシル末端の成熟ＴＧＦ−βと非共有結合的に結合したアミノ末端の潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）からなる。潜在性関連ペプチドは別の構造的に関係のないタンパク質の潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質（ＬＴＢＰ）にジスルフィド結合しており、それはＴＧＦ−β１のプロセシング及び分泌に役割を果たす（１）。ＴＧＦ−β活性を調節する主要な機構は、その分子の生物学的活性型への潜在型のプロセシングを制御する因子により起こる。物理化学的活性化は両極端のｐＨ、熱、カオトロピック試薬（ドデシル硫酸ナトリウム、尿素）及び脱グリコシル化により起こることができる（２、３、４、５）。インビボでの活性化はより複雑であり、十分に理解されていない。細胞性活性化はまず周皮細胞または平滑筋細胞のいずれかと毛細血管内皮細胞との共培養物により実施された（６、７）。この方法は同じ種からの２つの細胞型の相互作用を必要とする。活性化はプラスミン／セリンプロテアーゼインヒビターにより妨げられるので、活性化は明らかにプラスミンにより媒介される（８）。細胞性活性化はＴＧＦ−βの潜在型のＬＡＰ成分上に見いだされるマンノース−６−リン酸分子（１０）を介して潜在型ＴＧＦ−βがマンノース−６−リン酸／インシュリン様増殖因子II受容体に結合することを必要とすると考えられる（９）。組織II型トランスグルタミナーゼもこの細胞依存性モデルにおける活性化のための必要条件として示されており、それは潜在型ＴＧＦ−βをマトリックス分子に架橋するように機能することができる（１１）。活性化の最後の条件はＬＴＢＰを含む。ＬＴＢＰは潜在型ＴＧＦ−β複合体を細胞表面上に集めるために必要であり、そこで続いておそらく組織トランスグルタミナーゼ及び／またはプラスミンによりそれが活性化されることが提示されている（１２）。３個の異なるＬＴＢＰが同定及びクローン化されており（１３−１５）、それは特定の組織部位または細胞型と潜在型ＴＧＦ−β複合体の相互作用を細胞が制御することができる潜在的機構を示すことができる。さらに、細胞外マトリックス結合糖タンパク質であるトロンボスポンジンへの潜在型複合体の結合によりこれらの機構とは別に起こるＴＧＦ−β活性化の報告がある（１６、１７）。共培養物を調製しなければ通常の培養条件下でＬ−ＴＧＦ−βは活性化されないが、特定の薬剤の添加により交配型の培養物（ｈｏｍｏｔｙｐｉｃｃｕｌｔｕｒｅｓ）の細胞を誘導して活性ＴＧＦ−βを形成することができる。これらの薬剤の中にはレチノイドがあり、それらは角質細胞、内皮細胞及び破骨細胞において潜在型ＴＧＦ−β１の活性化を誘導する（１８、１９、２０）。レチノイドにより誘導されるＴＧＦ−β１の活性化はプラスミンに依存する（１８、１９）。抗−エストロゲン（タモキシフェンまたはトレミフィン（ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ））は胎児繊維芽細胞及び乳癌細胞において活性ＴＧＦ−βの生産を誘導した（２１）。インビトロでウシ動脈または毛細血管内皮細胞をｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）にさらすことも明らかにプラスミンに依存する機構によりＴＧＦ−βの活性化をもたらした（２２）。増殖領域肋骨軟骨（Ｇｒｏｗｔｈｚｏｎｅｃｏｓｔｏｃｈｏｎｄｒａｌ）軟骨細胞マトリックス小胞は１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３とインキュベートした場合に細胞外マトリックス小胞膜へのビタミンの直接作用により潜在型ＴＧＦ−βを活性化することができた（２３）。さらに、ヒト前立腺上皮細胞（２４）、黒色腫細胞系（２５）及びグリオブラストーマ細胞（２６）からのならし培地中に少量の活性ＴＧＦ−β１を検出できたという報告があるが；しかしながら、この活性化の機構は理解されていない。現在まで、活性型ＴＧＦ−β１を生成する系はいずれもＴＧＦ−β１の潜在性を維持する潜在能力を有する薬剤のスクリーニングモデルとして利用されていない。共培養法は詳細に研究されており、この系においてＴＧＦ−β１の活性化を招く機構は解明された。しかしながら、この共培養法は再現性を欠き、そして有効な系を生み出すために多数の細胞クローンをスクリーニングする強い要求がある。これらの研究の目的はＴＧＦ−βの活性化を妨げる潜在能力を有する分子を次にスクリーニングするためのＴＧＦ−β活性化の新規なインビトロモデルを開発することであった。ＴＧＦ−βは瘢痕化及び線維症疾患における重要な因子であることが示されているので、そのようなアッセイにおいて活性があることが示される薬剤はインビボで抗−線維症剤及び抗−瘢痕化剤として機能すると予想される。発明の要約抗−瘢痕化及び抗−線維症剤のような瘢痕形成のモジュレーターをスクリーニング及び同定するために新規な方法が開発された。この方法は簡便であり、再現性があり、そして多数のモジュレーター化合物をスクリーニングして新規な潜在的抗−線維化剤を同定するためにそれを採用できるはずである。この方法はウシ動脈内皮細胞／ウシ動脈平滑筋細胞（ＢＡＥＣ／ＢＡＳＭＣ）共培養系と共通の特徴を有するが、より高感度であり、そして有効な方法を開発するために多数のクローン系をスクリーニングする必要がない。この新規な系では、共培養系と同様に、Ｌ−ＴＧＦ−β１の活性化はいくつかの独立した機構により起こり、それらはマンノース−６−リン酸／インシュリン様増殖因子−II（Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−II）受容体への潜在型複合体の結合、トロンボスポンジン及び／または組織II型トランスグルタミナーゼを含む。しかし、共培養系と異なり、このマクロファージに依存する系はプラスミンを含まないようである。この方法を用いて、（送達媒体としてのインシュリン様増殖因子結合タンパク質−２（ＩＧＦＢＰ−２）と別個にまたは組み合わせて用いられる）ＩＧＦ−II として定義されるインシュリン様増殖因子−II、組織II型トランスグルタミナーゼインヒビター及び（ヒドロコルチゾンのような）抗炎症剤のような潜在的新規抗−線維症剤を同定した。Ｍ６Ｐの新規な作用機構が本明細書に提示されており、それはＭ６Ｐ／ＩＧＦ −II受容体及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡのダウンレギュレーションに基づく。図面の簡単な説明図１．マクロファージによるＴＧＦ−β１の活性化が示される。図２．マクロファージにおけるＴＧＦ−β１のｍＲＮＡの発現が示される。図３．ヒドロコルチゾンで処理したマクロファージにおける組織トランスグルタミナーゼIIのｍＲＮＡの発現が示される。発明の詳細な説明材料Ｄ−マンノース６−リン酸、α−Ｄ（＋）マンノース１−リン酸（Ｍ１Ｐ）、モノダンシルカダベリン（ＤＣＡ；組織II型トランスグルタミナーゼ、ＴＧａｓｅIIの基質競合物）、シスタミン（ＴＧａｓｅIIの活性部位特異的インヒビター）、プトレッシン−２塩酸塩、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシドオキシド）、サルモネラアボルタスアクイ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓａｑｕｉ）からのＬＰＳ（リポ多糖）、全トランス形レチノイン酸（ＲＡ）及びヒドロコルチゾンをＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−内毒素フリーをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。レチノイン酸及びヒドロコルチゾンのストック溶液をエタノール中に調製した。ストック溶液を培養培地中に連続希釈して０．５％の最終濃度を得た。この濃度のエタノールはＴＧＦ−β１の生産または活性化をもたらさなかった。モノダンシルカダベリンストック溶液をＤＭＳＯ中に調製した。実験条件に用いたＤＭＳＯの最終濃度（１：１０００）はＴＧＦ−βの生産または活性化に対して影響がなかった（データは示さない）。組み換えヒトＩＧＦ−IIをＢａｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．から購入した。ヒトウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）に対するモノクローナル中和抗体をＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｉｎｃ．から購入した。モノクローナル抗−ヒトトロンボスポンジン中和抗体（クローンＩ，Ａ４．１）をＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。組み換えヒト潜在型ＴＧＦ−β１（ｒＨＬＴＧＦ−β１）をＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから購入した。ＳｅａＫｅｍＧＴＧアガロースはＦＭＣ，ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓからであった。ＲＮＡサイズマーカー、φＸ１７４ＤＮＡ／Ｈａｅ IIIマーカー及びＴＧＦ−β１ＥＬＩＳＡキットをＰｒｏｍｅｇａから購入した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^TM（商標）II ＲｎａｓｅＨ逆転写酵素をＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓから購入した。ＲＮｅａｓｙＲＮＡ抽出キットをＱｉａｇｅｎから購入した。全ての細胞培養培地をＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）をＨｙＣｌｏｎｅから購入した。ＳＶ−４０でトランスフォームされたマウス腹膜マクロファージＩＣ−２１、ヒト胎児皮膚繊維芽細胞（１５０２）、ヒト新生児繊維芽細胞（４３ＳＫ）及びヒト前立腺腺癌細胞系をＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。ヒト黒色腫細胞系Ｂｏｗｅｓ及びＨＭＢ−２をＪｏｓｅｆＢｉｚｉｋ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）から受け取った。ウシ動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）及びウシ動脈平滑筋細胞（ＢＡＳＭＣ）をＣｅｌｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎから購入した。精製されたラットＩＧＦＢＰ− １及び２（インシュリン様増殖因子結合タンパク質）をＢｅｖｅｒｌｙＰｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙ博士（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から得た。実験方法細胞培養ＳＶ−４０でトランスフォームされたマウス腹膜マクロファージＩＣ−２１を１０％ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。培養物を１００ｍｍ皿に接種し、３７℃で５％ＣＯ₂中で増殖させた。培地を２日間隔で交換した。１０％ウシ胎仔血清を補足したＤＭＥＭ中６ｍＭＨｅｐｅｓ、５０Ｉ．Ｕ．／ｍｌのペニシリン及び５０ｍｃｇ／ｍｌのストレプトマイシンの存在下でヒト胎児及び新生児皮膚繊維芽細胞を増殖させた。培養物を１００ｍｍ皿に接種し、３７℃で５％ＣＯ₂中で増殖させた。２ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸、５％ＦＢＳ及び抗生物質を補足したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）中でヒト黒色腫細胞系Ｂｏｗｅｓ及びＨＭＢ−２を維持した。それらの細胞を１００ｍｍ皿に接種し、３７℃で５％ＣＯ₂中で増殖させた。ヒト前立腺腺癌細胞系を７％ＦＢＳを補足したＦ１２ＫＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘ中で増殖させ、１００ｍｍ皿に接種し、３７℃で５％ＣＯ₂中で増殖させた。ウシ動脈内皮細胞を１０％ＣＳ、グルタミン及び抗生物質を補足したＤＭＥＭ中で維持した。平滑筋細胞を１０％仔ウシ血清、グルタミン及び抗生物質を補足したアルファＭＥＭ中で培養した。それらを１００ｍｍ皿に接種し、３７℃で５％ＣＯ₂中で増殖させた。ＢＡＥＣ及びＢＡＳＭＣからのならし培地（ＣＭ）調製ならし培地の調整方法は以前に記述された（２２）。簡潔に言えば、レチノイド実験では、ＢＡＥＣ細胞を３５ｍｍ皿で融合するまで増殖させた。培養物をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）ですすぎ、０．１％のＢＳＡ及びレチノイン酸（１０ μＭ）またはビヒクル（０．５％エタノール）を含有する１ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中でインキュベートした。インキュベーションを２４時間実施した。培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、次に１ｍｌのＤＭＥＭ／０．１％ＢＳＡ中でさらに１２時間インキュベートしてならし培地を生成した。ならし培地を遠心分離し、ＴＧＦ−β１評価のＥＬＩＳＡアッセイに用いた。共培養実験では、ＢＡＥＣ及びＢＡＳＭＣを別個に３５ｍｍ皿にＤＭＥＭ／１０％ＣＳ（仔ウシ血清）中４ｘ１０⁴細胞の密度で接種するかまたは同じ３５ｍｍ皿中に３．２ｘ１０⁵ＢＡＥＣ及び０．８ｘ１０⁵ＢＡＳＭＣで接種した。細胞付着（約２時間）後に細胞をＰＢＳですすぎ、１ｍｌのＤＭＥＭ／０．１％ＢＳＡ中で６時間インキュベートしてならし培地を生成した。ならし培地を遠心分離し、ＥＬＩＳＡアッセイに用いた。癌細胞からのならし培地の調製黒色腫細胞（Ｂｏｗｅｓ及びＨＭＢ−２）並びに前立腺腺癌細胞を１００ｍｍ皿中で融合するまで増殖させた。培地を吸引し、培養物をＰＢＳで洗浄し、０．１％ＢＳＡを含有する適切な無血清培地を２４時間添加した。培地を集め、ＥＬＩＳＡによる次のＴＧＦ−β１評価のために保存した。マクロファージ活性化アッセイリポ多糖（ＬＰＳ）でのマクロファージの活性化培養したマクロファージを３ｍｌのＰＢＳで皿から取り出した。ＰＢＳを１０％ＦＢＳを含有する１５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０で調整した。細胞を数え、次に１００ｍｍプレート中に１ｘ１０⁶細胞／皿で接種した。培養したマクロファージが約７０％の融合に達すると（２−３日）それらをＰＢＳで洗浄し、５％ＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍｌＬＰＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地を添加した（図１）。ＬＰＳでの２４時間の活性化後に細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄した。この時点で融合した胎児皮膚繊維芽細胞からのならし培地を集め、マクロファージを含有する各皿中に５ｍｌを分配した。細胞をさらに２４時間インキュベートし、培地を集め、６００ｘｇで１０分間遠心分離し、ＥＬＩＳＡによるＴＧＦ−β１評価まで４℃で保存した。各条件を二重に実施した。ＰＢＳで洗浄した細胞を全ＲＮＡ抽出のために集めた。マクロファージ活性化アッセイのための胎児皮膚繊維芽細胞からのならし培地の調製胎児皮膚繊維芽細胞を１００ｍｌ皿中に１ｘ１０⁶細胞／皿で接種した。細胞を融合するまで増殖させた（２−３日）。培養物をＰＢＳで洗浄し、新しい培地、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭまたは無血清条件のためのＡＩＭ−Ｖ培地（無血清培地）のいずれかを２４時間添加した（図１）。潜在型ＴＧＦ−β１の均質なプールを得るために、培地を集めて合わせた。培地の収集はマクロファージアッセイにおける添加のすぐ前に実施した。マクロファージ及び胎児繊維芽細胞の共培養マクロファージ及び胎児繊維芽細胞を共培養する実験のために、それら２つの細胞型を１ｘ１０⁶の胎児繊維芽細胞及び０．８ｘ１０⁶マクロファージの密度で１００ｍｍ皿に接種した。細胞付着（約２時間）後に細胞をＰＢＳですすぎ、１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０／５％ＦＢＳ、＋／−ＬＰＳ中で２４時間インキュベートしてならし培地を生成した。ならし培地を上記のように遠心分離し、ＥＬＩＳＡアッセイに用いた。マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）でのヒト新生児繊維芽細胞の処理ヒト新生児繊維芽細胞を１ｘ１０⁶細胞／皿で１００ｍｍ皿に接種した。細胞が融合するとそれらをＰＢＳで洗浄し、培養物を無血清条件で異なる濃度のＭ６Ｐ（１、１０、５０、１００及び２００μＭ）で２４及び４８時間処理した。さらに、細胞を２つの濃度のマンノース１−リン酸（Ｍ１Ｐ）（１００及び２００ μＭ）で２４及び４８時間処理した。全ＲＮＡを抽出し、半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＭ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体、ＴＧＦ−β １及びＴＧＦ−β受容体Ｉ型ｍＲＮＡの発現に関して評価した。各処理を二重に実施し、それぞれの分析を実施した。ＴＧＦ−β１のＥＬＩＳＡＰｒｏｍｅｇａキットを用いてＥＬＩＳＡ試験を実施し、製造業者により与えられるプロトコルに従った。１０％ＦＢＳを含有する細胞懸濁液のアリコートを活性型及び全ＴＧＦ−β１の測定のためにそれぞれ１：４または１：２０に希釈した。無血清ならし培地を活性型ＴＧＦ−β１には希釈せずに、そして全ＴＧＦ−β１には１０倍希釈してアッセイした。各測定を二重に実施した。マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍで発色を調べた。全ＲＮＡ抽出細胞をＰＢＳで洗浄し、続いてキット（ＲＮｅａｓｙＲＮＡ抽出キット）に提供される抽出バッファーを添加した。溶解した細胞を皿からこすり取り、マイクロチューブに集めた。サンプルは分析まで−７０℃で冷凍されるかまたは製造業者のプロトコルに従って直接評価された。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度を測定し、そして臭化エチジウムで染色した変性ホルムアルデヒドアガロースゲルによりＲＮＡの完全性を評価した。ノーザンブロット分析以前に記述されたように（２７）ノーザンブロット分析を実施した。簡潔に言えば、全ＲＮＡサンプル（５μｇ）をホルムアルデヒド−ＭＯＰＳバッファー中に希釈し、ＲＮＡサイズマーカーと一緒に変性１．２％ＳｅａＫｅｍＧＴＧアガロースゲルでの電気泳動に供した。ＲＮＡを毛管移動によりニトロセルロース膜に移した。１０％デキストラン硫酸、２ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ（０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．００５Ｍエチレンジアミン四酢酸）／０．１％ＳＤＳ及び２５０μｇ／ｍｌの剪断したサケ精巣ＤＮＡを含有する溶液中４２℃で３時間ブロットをプレハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション溶液は³²ＰｄＣＴＰで標識したＤＮＡプローブ及び１５０μｇ／ｍｌのサケ精巣ＤＮＡを含むことを除いて本質的に同じであった。ハイブリダイゼーションを４２℃で１６時間実施した。ハイブリダイゼーション後の洗浄工程を以下のように実施した：２ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）で６５℃で１５分間を２回、２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃で３０分間を１回、そして０．１ｘＳＳＣで６５℃で１０分間を１回。増感スクリーンを用いて−８０ ℃で２日間ブロットをＸ線フィルムに感光させた。ハイブリダイゼーションのために用いたプローブを逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により調製した。ｃＤＮＡプローブの放射性標識化を以前に記述されたように（２７）ニックトランスレーションにより実施した。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応全ＲＮＡを転写するために用いた方法は以前に詳細に記述された（２８）。簡潔に言えば、１ｘ逆転写酵素バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ₂）、１０ｍＭＤＴＴ（ジチオトレイトール）、２．５ｍＭの各ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド）、１００μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ（リボヌクレアーゼインヒビター）、２００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^TM（商標）ＲＮａｓｅＨ逆転写酵素、０．１μｇのオリゴ（ｄＴ）_12-18及び１μｇの全ＲＮＡを含有する２５μｌの全容量で反応を実施した。インキュベーションを４２℃で１時間実施し、そして等容量の冷水の添加により停止した。第一鎖ｃＤＮＡ反応の一部をＰＣＲに用い、それを１６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチン、２００μＭの各ｄＮＴＰ、各１μＭのセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド並びに２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する２５μｌ中で実施した。増幅を３５サイクル実施した。各サイクルは９５℃で１分の変性、５５℃（用いたオリゴヌクレオチド対に対して最適）で２分のアニーリング及び７２℃で３分の伸長からなった。最終サイクルでは伸長は７分であった。反応生成物を２％アガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウム染色で視覚化した。φＸ１７４ＤＮＡ／ＨａｅIIIマーカーを用いて大きさを決定した。ＰＣＲ産物の特異性を確かめるために制限消化を実施した。臭化エチジウム染色したゲルの定量分析のためにデンシトメーター測定を用いた。以下の実施例は本発明を例示するが、しかしながらそれらに本発明を限定しない。実施例本発明のモデルが抗−線維症（抗−瘢痕化）剤をスクリーニング及び同定するための迅速な方法としての可能性を有することが示される。また、この系はＴＧＦ−β１活性化に関与する機構の解明にも有用であり、そしてＴＧＦ−β１とトロンボスポンジン、ＩＧＦ及びＴＧａｓｅIIのような損傷環境中に存在する他の分子の間の相互作用の性質に関する我々の理解を増すことができる。実施例１．レチノイン酸（ＲＡ）で処理したＢＡＥＣレチノイン酸（ＲＡ）で処理したＢＡＥＣが検出できる量の活性型ＴＧＦ−β １を生産することが報告されている（１９）。抗−線維症分子のスクリーニング系としてこの方法を用いるために予備実験を実施した。しかしながら、未処理のＢＡＥＣ細胞でさえ活性型ＴＧＦ−β１を生産することが観察された（表１）。細胞集団の不均質性によりこれを説明することができ；少数の混入細胞、すなわち、平滑筋細胞がこの結果に寄与した可能性がある。ＲＡまたはビヒクル（エタノール）の存在下で、細胞は同じような量の活性型ＴＧＦ−β１を生成した（表１）。マンノース６−リン酸はＭ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体へのＴＧＦ−βの結合と競合することによりＴＧＦ−β１の活性化を妨げることが示されている（９）。しかしながら、この系で１００μＭの濃度で試験した場合にＭ６Ｐは、Ｍ１Ｐと同様に、著しい阻害作用がなかった（表１）。これらの結果から、この方法が抗−線維症分子を評価するために十分ではない可能性があることが示される。比較実施例２．ＢＡＥＣ及びＢＡＳＭＣ系の共培養抗−線維症剤をスクリーニングするために公開された共培養系を採用する目的で予備実験を実施した。この系はプラスミン依存性であることが知られており、そして２−５％の活性型ＴＧＦ−βを生成することが示されている（２２）。我々のやり方では、ウシ動脈内皮細胞及びウシ動脈平滑筋細胞の共培養はＥＬＩＳＡにより測定した場合に８．２％までの活性型ＴＧＦ−βを生成した（表１）。共培養中に観察された問題の一つはアッセイの非常に低い再現性であった。さらに、数継代接種後に細胞はＴＧＦ−β１を活性化する能力を完全に失った。共培養は有効な系を開発するために内皮及び平滑筋細胞のいくつかのクローンのスクリーニングを必要とするのでこれは意外ではない。マンノース６−リン酸は１００μＭで試験した場合にこのアッセイにおけるＴＧＦ−β１活性化を著しく阻害しなかった。従って、この系をさらに続行しないと決定した。表１．ＢＡＥＣ＋／−ＢＡＳＭＣ＋／−ＲＡによるＴＧＦ−β１の活性化表略語：ＢＡＥＣ−ウシ動脈内皮細胞ＲＡ−レチノイン酸Ｍ６Ｐ−マンノース−６−リン酸Ｍ１Ｐ−マンノース−１−リン酸癌細胞によるＴＧＦ−β１活性化経路の特性決定ヒト乳癌、いくつかの黒色腫細胞系及び前立腺腺癌細胞系のような癌細胞が構成的に生物学的活性型ＴＧＦ−β１を培養培地中に放出することが示されている（２４、２５、２９）。交配型の細胞培養系はその簡便さのために有益であるので、ＴＧＦ−β１活性化の方法として癌細胞を用いることを試みた。黒色腫細胞系ＢｏｗｅｓはＨＭＢ−２細胞より実質的に多くの活性型ＴＧＦ−β１を分泌し、そして全ＴＧＦ−β１に比較した活性型のパーセンテージはそれぞれ約２９．３％及び４．２％であることが示された。ヒト前立腺腺癌細胞は黒色腫細胞系より少ない活性型ＴＧＦ−β１を生産した（表２）。表２．癌細胞によるＴＧＦ−β１の活性化共培養と異なり、Ｍ６Ｐ、ＤＣＡ及び抗−トロンボスポンジン抗体は黒色腫または前立腺癌細胞のいずれにおいてもＴＧＦ−β１活性化に対して影響がないことが示された（表３）。これらの結果から、ＴＧＦ−β１の活性化がＭ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体、ＴＧａｓｅIIまたはトロンボスポンジンと関係なく起こることが示された。癌細胞によるＴＧＦ−β１の活性化が細胞内でまたはＬ−ＴＧＦ−β１の細胞外プロセシングにより起こるかどうかを決定するために、胎児繊維芽細胞（Ｌ− ＴＧＦ−β１の供給源）からのならし培地を黒色腫細胞に添加した。しかしながら、ＴＧＦ−β１のさらなる活性化はなく、それにより、細胞外よりむしろ細胞内の機構が潜在型分子のプロセシングに関与することが示唆された（表３）。表３．黒色腫及び前立腺腺癌細胞によるＴＧＦ−β１活性化の特性決定表略語：Ｍ６Ｐ−マンノース−６−リン酸ＤＣＡ−ダンシルカダベリンマクロファージによるＴＧＦ−β活性化ＬＰＳで処理したマクロファージが未処理の細胞より高いレベルのＴＧａｓｅ IIのｍＲＮＡを発現しているという以前の研究からの結果は、これらの細胞がＴＧａｓｅIIに依存する機構によりＴＧＦ−β１を活性化することができる可能性があることを示した。この仮説を試験するために、潜在型ＴＧＦ−β１の供給源として胎児繊維芽細胞ならし培地の存在下でマクロファージをＬＰＳで処理した。マクロファージにより生産される全ＴＧＦ−β１のレベルは繊維芽細胞ならし培地で観察されるレベル（１７８６ｐｇ／ｍｌ）に比較して比較的低い（１０％ＦＢＳの存在下で６４４ｐｇ／ｍｌ）のでこの系への潜在型外因性ＴＧＦ−β １の添加はアッセイの感度を上げることができると推測された。マクロファージ（ＭＱ）は主に潜在型でＴＧＦ−β１を分泌した（表４）。細胞をＬＰＳで処理した場合（ＭＱ＋ＬＰＳ）、活性型ＴＧＦ−β１のレベルはＥＬＩＳＡの検出限界以下であった。同様に、血清の存在下（ＦＦ−ＣＭ）及び無血清培地中（ＦＦ−ＣＭＳＦ）の両方で、胎児繊維芽細胞からのならし培地中の活性型ＴＧＦ−β１のレベル（ＦＦ−ＣＭ）はほとんど検出不可能であった（それぞれ、７．２及び５．７ｐｇ／ｍｌ）。それに対して、マクロファージに繊維芽細胞ならし培地を添加すると（ＭＱ＋ＦＦ−ＣＭ）活性型ＴＧＦ−β１のレベルの１０倍の誘導をもたらした（表４）。繊維芽細胞ならし培地とのインキュベーション前にマクロファージをＬＰＳで処理するとＴＧＦ−β１のさらなる活性化をもたらした（ＭＱ＋ＬＰＳ＋ＦＦ−ＣＭ）。無血清条件でも活性化は起こった（ＭＱ＋ＦＦ−ＣＭＳＦ）。興味深いことに、ＬＰＳでの前処理はＴＧＦ−β１の活性化の割合を高めなかった（表４）。これは血清補因子がＬＰＳによる活性化に重要であることを示すことができる。表４．マクロファージによるＴＧＦ−β１活性化表略語：ＭＱ−マクロファージＬＰＳ−リポ多糖ＦＦ−胎児繊維芽細胞ＦＦ−ＣＭ−胎児繊維芽細胞ならし培地ＳＦ−無血清マクロファージアッセイにおける繊維芽細胞ならし培地の必要条件を決定するために、精製された組み換え潜在型ＴＧＦ−β１での培地の置換を試験した。ＬＰＳでの処理を省いた場合、３．３％のみのｒＨＬＴＧＦ−β１がマクロファージにより活性化された（表５）。潜在型ＴＧＦ−β１にさらす前にマクロファージをＬＰＳで処理した場合、活性化はより高く、１２．２％に達した（表５）。これは本発明の系の感度をＬＰＳにより操作できる可能性があること及び活性化のために最初に用いた潜在型ＴＧＦ−β１の量を最大効果に関して滴定できる可能性があることを示す。表５．マクロファージによるｒＨＬＴＧＦ−β１の活性化表略語：ＬＰＳ−リポ多糖ｒＨＬＴＧＦ−β１−組み換えヒト潜在型ＴＧＦ−β１マクロファージ及び胎児繊維芽細胞の共培養もＴＧＦ−β１の活性化をもたらした。活性型ＴＧＦ−β１のレベルはそれぞれＬＰＳ未処理で１６．０ｐｇ／ｍｌ、そしてＬＰＳで処理したマクロファージで１４．４ｐｇ／ｍｌであった（表６）。活性型ＴＧＦ−β１のレベルは比較的低かったので、この系をさらに続けなかった。表６．マクロファージ及び胎児繊維芽細胞の共培養によるＴＧＦ−β１の活性化表略語：ＬＰＳ−リポ多糖ここに記述する実験は本発明のＴＧＦ−β１活性化の新規なインビトロモデルを特性化する。このモデルはマウスのトランスフォームされたマクロファージ及び繊維芽細胞ならし培地を用いるかまたは組み換え潜在型として与えられる潜在型ＴＧＦ−β１を活性化するそれらの能力を利用する。本発明のモデルは現在の系よりいくつかの利点を与える。現在まで、共培養モデルが最も特定及び特性化された系であった。しかしながら、本発明のモデルはより高い感度を与え、そして活性型ＴＧＦ−β１の生成に関して共培養系より効率がよい。共培養系で報告された活性型ＴＧＦ−β１の濃度は約１５−５０ｐｇ／ｍｌである（２２）。これは共培養ならし培地中に存在する全ＴＧＦ−β１の２−５％のみに相当する（２２）。本発明の方法でマクロファージにより生成される活性型ＴＧＦ−β１の量は１０倍まで高く、そして全ＴＧＦ−β１の１２％までに相当する。本発明の方法は簡便であり、そして交配型の細胞培養に基づく。それに対して共培養モデルでは、２つの細胞型が存在しなければならず、そして多数の条件が満たされなければならない。平滑筋細胞の単層の１−２ｍｍ上の面での内皮細胞の共培養は活性型ＴＧＦ−β１を生産することができないので（３５）、活性型ＴＧＦ−β１を生産するためにそれらの細胞型は接触するかまたは非常に接近していなければならない。ウシ動脈内皮細胞はヒトまたは豚のいずれかの平滑筋細胞の存在下で潜在型ＴＧＦ−β１を活性化しないので（３６）強い種特異性が存在するようである。マクロファージにより活性化される潜在型ＴＧＦ−β１の供給源は繊維芽細胞ならし培地に限定されないので、本発明のこの方法の感度を操作することができるはずである。組み換え潜在型ＴＧＦ−β１も同様に活性型に転化された。共培養系の一つの主要な不都合な点は再現性の欠如である。有効な方法を開発するためには多数のＢＡＥＣ及びＳＭＣ細胞クローンをスクリーニングする必要がある。数集団倍加後に細胞を置き換える必要があるので、このことは多数の細胞クローンの単離及びそれに続く手間のかかる試験を必要とする。それに反して、本発明に用いられるトランスフォームされたマクロファージは連続培養することができ、そして日常分析のために容易に利用できる。共培養モデルのもう一つの制限は、この系が水または仔ウシ血清に由来する組織培養培地中のＬＰＳの存在下で活性型ＴＧＦ−β１を生産できないことである（３７）。組織培養培地中に見いだされるＬＰＳはウシ動脈内皮細胞におけるＴＧａｓｅII及びＴＧＦ−β１のｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートすると報告された（３７）。このため、活性型ＴＧＦ−β１を生成するために組織培養培地及び血清の各バッチをＬＰＳの存在に関して試験する必要性が生じる。それに反して、本開示はＬＰＳで誘導されたマクロファージが未処理の細胞より高いレベルのＴＧａｓｅIIを発現することを示した。これはマクロファージではＴＧａｓｅ IIレベルのアップレギュレーションによりＬＰＳがＴＧＦ−β１の活性化を誘導し、一方、内皮細胞ではＴＧａｓｅIIのダウンレギュレーションによりそれがＴＧＦ−β１の活性化を抑制することを示すことができる。また、本発明の方法が共培養系より用途が多いことも明らかである。実施例３マクロファージアッセイにおけるＴＧＦ−β１の活性化の機構該アッセイにおけるＴＧＦ−β１の活性化に関与する機構がＢＡＥＣ及びＢＡＳＭＣの共培養に対して記述されたものと同様であるかどうかを決定することを試みた。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体、ＴＧａｓｅII、トロンボスポンジン及びプラスミンに依存する機構を含むいくつかの別の機構を試験した。それらの結果から、共培養と同様に１００及び５０μＭのＭ６ＰはＴＧＦ−β１活性化をそれぞれコントロールレベルの３２．９％±１１．５及び６９．６％±１．７７まで阻害することが示された（表７）。予想されるように、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体に結合しないＭ１Ｐはこの活性化を妨げなかった（表７）。ダンシルカダベリン（ＤＣＡ）は１００μＭで試験した場合に活性型ＴＧＦ− βのレベルをコントロールレベルの１８．３％±１．５５まで減少したので強いインヒビターであった（表６）。それに反して、Ｍ６Ｐとの組み合わせで試験したシスタミンはＴＧＦ−β１活性化に対して付加作用を示さなかった（表６）。試験した２つの異なる濃度（５０及び１００μＭ）でプトレッシンも活性型ＴＧＦ−β１がそれぞれコントロールレベルの３３．４％±２８．８及び８０．６％±１５．５に減少したのでいくらかの阻害作用を有した。興味深いことに、Ｍ６Ｐ及びプトレッシンの両方の組み合わせ（それぞれ、５０μＭ及び１００μＭ）はＴＧＦ−β１活性化に対して付加阻害作用がなかった（表７）。共培養系と異なり、４００ｎｇ／ｍｌで試験したウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）に対する抗体は本発明のアッセイ方法においていかなる作用も示さなかった（表７）。これはプラスミンが本発明のモデルにおけるＴＧＦ−β１の活性化に関与しないことを示す。一方、トロンボスポンジンに対する抗体はＴＧＦ−β１活性化をコントロールの６４．１％±６．０まで阻害し、それによりトロンボスポンジンがこの活性化に役割を果たすことが示唆された。表７．Ｍ６Ｐ、ＴＧａｓｅIIインヒビター等によるＴＧＦ−β１活性化の阻害表略語：Ｍ６Ｐ−マンノース−６−リン酸Ｍ１Ｐ−マンノース−１−リン酸抗−ＰＡ−プラスミノーゲンアクチベーターに対する抗体抗−ＴＳＰ−トロンボスポンジンに対する抗体本発明のモデル方法におけるＴＧＦ−β１の活性化に関与する機構は、共培養またはＲＡで処理したＢＡＥＣもしくは角質細胞のいずれかを用いる交配型の細胞培養系に対して記述されたものに類似している。マクロファージアッセイにおけるＭ６Ｐの存在は、共培養系と同様に、潜在型ＴＧＦ−β１のその活性型への転化を妨げたので、機構の一つの特徴はＭ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体と潜在型ＴＧＦ−β複合体の相互作用である。共培養系で記述された第二の機構は組織ＴＧａｓｅIIを含んだ。本発明のアッセイ方法の結果から、この酵素のインヒビターの存在が活性型ＴＧＦ−β１の生成を妨げることが示され、それはＴＧａｓｅIIがこの活性化に役割を果たすことを示す。潜在型ＴＧＦ−β１とトロンボスポンジンの分子相互作用は共培養系において生物学的活性を引き出すために十分である。同様に、本発明の方法において、トロンボスポンジンに対する抗体は活性型ＴＧＦ−β１の著しい抑制をもたらし、トロンボスポンジンが潜在型の活性化に寄与できることを示している。プラスミンは共培養系においてＴＧＦ−β１の活性化のために必要であることが示されている。ｕＰＡに対する抗体は共培養物では活性型ＴＧＦ−β１の生産を効率よく妨げるが、それらは本発明のアッセイ方法では効果がなかった。このことはマクロファージがプラスミン活性に関係のない機構によりＴＧＦ−β１を活性化できることを示す。マクロファージアッセイにおける異なる処理後に全ＴＧＦ−β１レベルを評価し、そして異なる処置により全ＴＧＦ−β１が著しく影響を受けないことが明らかであった（表８）。表８．マクロファージアッセイにおける異なる処理後の全ＴＧＦ−β１の濃度表略語：ＬＰＳ−リポ多糖ＣＭ−ならし培地Ｍ６Ｐ−マンノース−６−リン酸ＤＣＡ−ダンシルカダベリン同様に、ＴＧＦ−β１のｍＲＮＡのレベルはノーザンブロットにより測定した場合にＰＢＳ、ＬＰＳのみでのマクロファージの処理またはＭ６ＰもしくはＤＣＡとＬＰＳの組み合わせた処理にかかわらず同じままであった（図２）。実施例４マクロファージアッセイにおける潜在的抗−線維症剤の試験本発明のアッセイ方法を用いていくつかの新規な潜在的抗−線維症分子を同定した。ＩＧＦ−IIでのＭ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体の占有はＬＡＰ上のＭ６Ｐがこの受容体に結合することを立体的に阻害できるはずであるので、ＴＧＦ−β１活性化に対するＩＧＦ−IIの作用を調べた。ＩＧＦ−IIがＴＧＦ−β１活性化を阻害することが示された。ＩＧＦＢＰ−１は遊離リガンドを細胞受容体と競合することによりこの阻害を取り消すことができたのでその作用は特異的であった。一方、ＩＧＦＢＰ−２はこの系におけるＩＧＦ−IIの作用に対して何の影響もなかった。これはＩＧＦＢＰ−１がＩＧＦによる機能のより強力なインヒビターであるという以前のインビボ及びインビトロでの実験からの結果と一致する（３２）。ＩＧＦＢＰ−２はＴＧＦ−β１活性化に対するＩＧＦ−IIの阻害作用を妨げなかったので、ＩＧＦ−IIの作用を可能にしながらＩＧＦ−IIの分解を防ぐことによりインビボでのＩＧＦ−IIの送達手段としてそれを用いることができる。ＩＧＦ−IIは５ｎＭでは有効ではなかったが、より高い濃度（１５及び３０ｎＭ）はＴＧＦ−β１活性化に対して投与量に依存する阻害作用があった（表９）。さらに、一定濃度のＭ６Ｐ（５０μＭ）で増加する濃度のＩＧＦ−II（５ないし３０ｎＭ）を試験した。それらの結果から、最適阻害作用が１５ｎＭのＩＧＦ −IIで得られること（表９）及び活性型ＴＧＦ−β１のレベルがコントロールの３８．７％まで減少すること（表９）が示された。表９．ＩＧＦファミリーによるＴＧＦ−β１活性化の阻害表略語：ＩＧＦ−II−インシュリン様増殖因子−II Ｍ６Ｐ−マンノース−６−リン酸ＩＧＦ−IIはＩＧＦＢＰと結合した複合体形として循環中または組織内に存在する（３０、３１）ので、２つの低分子量型のＩＧＦＢＰのＩＧＦＢＰ−１及び２をＩＧＦ−IIの阻害作用に影響を及ぼすそれらの能力に関して試験した。Ｍ６Ｐと別個にまたは組み合わせて試験した場合、ＩＧＦＢＰ１及び２はいかなる著しい阻害作用も示さなかった(表１０)。しかしながら、ＩＧＦＢＰ−１はＴＧＦ−β１活性化に対するＩＧＦ−IIによる阻害作用を取り消すことができたが、ＩＧＦＢＰ−２はそうではなかった。ＩＧＦＢＰＩ及び２をＭ６ＰとＩＧＦ−IIの組み合わせで試験した場合にこれらの結果が確かめられた（表１０）。これらの結果はＩＧＦＢＰ−１がＩＧＦＢＰ−２よりＩＧＦによる機能の強力なインヒビターであるという以前の結果と一致する（３２）。表１０．ＩＧＦ−II並びにＩＧＦＢＰ１及び２によるＴＧＦ−β１活性化の阻害表略語：ＩＧＦ−II−インシュリン様増殖因子−II Ｍ６Ｐ−マンノース−６−リン酸ＩＧＦＢＰ−１−インシュリン様増殖因子結合タンパク質−１ＩＧＦＢＰ−２−インシュリン様増殖因子結合タンパク質−２成人（瘢痕化）損傷治癒において見られる炎症反応とは対照的に胎児（無瘢痕）損傷治癒は損傷部位での炎症反応と関係しないので（３３）、炎症反応のレベルを調整することにより活性型ＴＧＦ−β１のレベルを調節することができ、そしておそらく廠痕の量を制御することができるはずであると仮説を立てた。抗−炎症剤を活性型ＴＧＦ−β１のレベルを調整するそれらの能力に関して本発明のアッセイの方法で試験した。１μＭ濃度のヒドロコルチゾンがＴＧＦ−β １活性化をコントロールの６４．０％まで阻害することが明らかであった（表１１）。表１１．ヒドロコルチゾンによるＴＧＦ−β１の阻害この阻害の機構を同定するために、１μＭのヒドロコルチゾンで処理したマクロファージにおけるＴＧａｓｅIIのｍＲＮＡのレベルを評価した。ＲＴ−ＰＣＲ産物のデンシトメーター測定分析（図３）から、ＴＧａｓｅIIのｍＲＮＡのレベルがこの処理により３７．５％に減少することが示された。この研究の重要な結果の一つはヒドロコルチゾンの潜在的抗−線維症作用である。この薬剤でのマクロファージの処理はＴＧａｓｅII ｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートしたので、ヒドロコルチゾンがＴＧａｓｅIIに依存する機構によりその抗−線維症作用を発揮することが可能である。抗−炎症剤のインビボ使用は炎症侵潤物のレベルを減少するだけでなくＴＧＦ−βを初めとする付随する高レベルの増殖因子を減らし、さらに瘢痕形成に影響を及ぼすという付加価値を有する可能性がある。本発明のアッセイ方法により、ＴＧａｓｅIIインヒビター、Ｍ６Ｐ、ＩＧＦ− II及び抗炎症剤のヒドロコルチゾンを初めとする数種類の分子に対して活性型ＴＧＦ−β１の減少が示された。この新規なアッセイにおけるマクロファージの条件は重要な潜在的抗−瘢痕化治療である抗炎症剤の評価を可能にする。共培養系ではそのような細胞がないために抗−炎症剤を試験するためにそれを用いることができない。Ｍ６Ｐ−抗−瘢痕化機構さらに、Ｍ６Ｐの作用の新規な機構を本明細書において報告する。Ｍ６Ｐでの処理後に培養繊維芽細胞においてＭ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体及びＴＧＦ−β１のｍＲＮＡのレベルのダウンレギュレーションが起こる。さらに、ＭＩＰはそのような結果を示さなかったので、ｍＲＮＡレベルの減少はアイソフォーム特異的であるようである。Ｍ６Ｐの作用の形態を特性化するためにさらなる実験を考案した。初期研究から、Ｍ６Ｐで処理した損傷内のＭ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体のレベルが損傷後３日目でダウンレギュレートされることが示されている。これはＭ６ＰがＴＧＦ−β １活性化のインヒビターとしてその機能を発揮することができる別の機構を与えることができる。いくつかの投与量のＭ６Ｐ（１、１０、５０、１００及び２００μＭ）で２４及び４８時間処理したヒト新生児繊維芽細胞においてＭ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体のｍＲＮＡの発現を評価した。２４時間の処理後に１−１００μＭのＭ６Ｐで発現は影響を受けなかった。しかしながら、２００μＭのＭ６Ｐでの処理は受容体のｍＲＮＡのダウンレギュレーションをもたらした（表１３）。４８時間後に５０−２００μＭのＭ６Ｐで減少が見られた（表１３）。Ｍ６Ｐ処理後にＴＧＦ−β１ｍＲＮＡのレベルを調べた場合に同様なダウンレギュレーションが見られた。一方、ＴＧＦ− β受容体Ｉ型ｍＲＮＡのレベルは処理の期間中変化しなかった。２つの最も高い濃度（１００及び２００μＭ）で試験したマンノース１−リン酸は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体及びＴＧＦ−β１ｍＲＮＡレベルの両方に対して何の影響も示さなかった。表１３．ＲＴ−ＰＣＲにより測定された新生児繊維芽細胞におけるＭ６Ｐ／ＩＧＦ−II受容体及びＴＧＦ−β１ｃＤＮＡの発現

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/36 Ｇ０１Ｎ 33/15 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）モジュレーター化合物を含有する胎児繊維芽細胞からのならし細胞培養培地とＬＰＳにより刺激されたマクロファージをインキュベートし；そして（ｂ）マクロファージにより生産された活性型ＴＧＦ−β１の量を測定することを含んでなる、瘢痕組織形成のモジュレーターの同定方法。２．（ａ）モジュレーター化合物を含有する胎児繊維芽細胞からのならし細胞培養培地とＬＰＳにより刺激されたマクロファージをインキュベートし；そして（ｂ）マクロファージにより生産された活性型ＴＧＦ−β１の量を測定することを含んでなる、潜在型ＴＧＦ−β１活性化のモジュレーターの同定方法。３．（ａ）モジュレーター化合物を含有する胎児繊維芽細胞からのならし細胞培養培地とＬＰＳにより刺激されたマクロファージをインキュベートし；そして（ｂ）マクロファージにより生産された活性型ＴＧＦ−β１の量を測定することを含んでなる、生物学的活性型ＴＧＦ−β１生産のモジュレーターの同定方法。４．瘢痕形成を調整するための請求の範囲１の方法で活性のあるモジュレーター化合物の使用。５．潜在型ＴＧＦ−β１活性化を調整するための請求の範囲２の方法で活性のあるモジュレーター化合物の使用。６．生物学的活性型ＴＧＦ−β１生産を調整するための請求の範囲３の方法で活性のあるモジュレーター化合物の使用。７．モジュレーター化合物がインシュリン様増殖因子IIである請求の範囲４のモジュレーター化合物。８．モジュレーター化合物がインシュリン様増殖因子IIである請求の範囲５のモジュレーター化合物。９．モジュレーター化合物がインシュリン様増殖因子IIである請求の範囲６のモジュレーター化合物。１０．瘢痕形成を抑制するためのインシュリン様増殖因子IIの使用。１１．生物学的活性型ＴＧＦ−β１生産を抑制するためのインシュリン様増殖因子IIの使用。１２．インシュリン様増殖因子II結合タンパク質と組み合わせたインシュリン様増殖因子IIの請求の範囲１０または１１の使用。１３．請求の範囲１−９のいずれかのモジュレーター化合物でのそのような処置を必要とする患者の処置方法。１４．請求の範囲１０、１１または１２のインシュリン様増殖因子IIでのそのような処置を必要とする患者の処置方法。