ES2253788T3

ES2253788T3 - Ensayo de agente anti-fibrotico.

Info

Publication number: ES2253788T3
Application number: ES97949342T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey C. Geesin; Anna Gosiewska
Original assignee: Ethicon Inc
Current assignee: Ethicon Inc
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2017-10-24
Also published as: EP0956036A1; AU740052B2; EP0956036B1; AU6810798A; DE69734894T2; DE69734894D1; JP2001511885A; CA2269711A1; EP0956036A4; ATE312620T1; WO1998017304A1

Abstract

SE HA DESARROLLADO UN NUEVO PROCEDIMIENTO PARA SELECCIONAR AGENTES ANTICICATRIZANTES Y ANTIFIBROTICOS. ESTE PROCEDIMIENTO OFRECE SIMPLICIDAD, ES REPRODUCIBLE Y PUEDE ADOPTARSE PARA SELECCIONAR UN GRAN NUMERO DE NUEVOS AGENTES POTENCIALMENTE ANTIFIBROTICOS. ESTE PROCEDIMIENTO TIENE CARACTERISTICAS EN COMUN CON EL SISTEMA DE CO-CULTIVO BAEC/BASMC, PERO ES MAS SENSIBLE Y NO REQUIERE LA SELECCION DE UN GRAN NUMERO DE LINEAS CLONALES PARA DESARROLLAR UN PROCEDIMIENTO EFECTIVO. EN ESTE SISTEMA, DE FORMA SIMILAR CON EL SISTEMA DE CO-CULTIVO, LA ACTIVACION DEL L-TGF- BE 1 SE PRODUCE MEDIANTE VARIOS MECANISMOS INDEPENDIENTES QUE COMPRENDEN LA UNION DEL COMPLEJO LATENTE CON LOS RECEPTORES M6P/IGF-II, LA TROMBOSPONDINA Y/O LA TRANSGLUTAMINASA DE TEJIDOS DE TIPO II. PERO, EN CONTRASTE CON EL SISTEMA DE CO-CULTIVO, ESTE SISTEMA DEPENDIENTE DE LOS MACROFAGOS NO PARECE INVOLUCRAR A LA PLASMINA. UTILIZANDO ESTE PROCEDIMIENTO, SE IDENTIFICARON NUEVOS AGENTES ANTIFIBROTICOS TALES COMO EL IGF-2 (UTILIZADO SEPARADAMENTE O EN COMBINACION CON EL IGFBP2 COMO VEHICULO DE ADMINISTRACION), LOS INHIBIDORES DE LA TRANSGLUTAMINASA DE TEJIDOS DE TIPO II Y AGENTES ANTIINFLAMATORIOS (TALES COMO LA HIDROCORTISONA). SE HA PROPUESTO UN NUEVO MECANISMO POTENCIAL DE ACCION PARA LA MANOSA 6-FOSFATO QUE SE BASA EN LA DESREGULACION DEL RECEPTOR DEL M6P/IGF-II Y TGF- BE 1 MARN.

Description

Ensayo de agente anti-fibrótico.

Antecedentes de la invención

El Factor de Crecimiento Transformante \beta (TGF-\beta) es un proteína reguladora del crecimiento potente y una molécula clave implicada en diversos trastornos fibróticos (cicatrización). La mayoría de las células secretan TGF-\beta1 en una forma de peso molecular alta predominantemente inactiva, TGF-\beta latente (L-TGF-\beta). TGF-\beta latente está compuesto de un péptido asociado a la latencia amino-terminal (LAP) asociado de manera no covalente al TGF-\beta maduro carboxi-terminal. El péptido asociado a latencia está unido por puentes disulfuro a una segunda proteína no relacionada estructuralmente, la proteína de unión a TGF-\beta latente (LTBP), que juega un papel en el procesamiento y secreción de TGF-\beta1 (1).

Un mecanismo principal para regular la actividad de TGF-\beta sucede a través de factores que controlan el procesamiento de la forma latente a la biológicamente activa de la molécula. La activación fisicoquímica puede suceder por extremos de pH, calor, agentes caotrópicos (dodecil sulfato sódico, urea) y desglicosilación (2, 3, 4, 5). La activación in vivo es más compleja y no está bien entendida.

La activación mediada por células se consiguió por primera vez por co-cultivos de pericitos o células de músculo liso con células del endotelio capilar (6, 7). Este procedimiento requiere la interacción de dos tipos celulares de la misma especie. La activación aparentemente está mediada por plasmina ya que la activación se bloquea por inhibidores de plasmina/serín proteasa (8). La activación celular se cree que requiere la unión del TGF-\beta latente al receptor de manosa-6-fosfato/factor de crecimiento II tipo insulina (9) mediante las moléculas de manosa-6-fosfato encontradas en el componente LAP de la forma latente de TGF-\beta (10). La transglutaminasa de tipo II tisular también se ha mostrado como un requisito para la activación en este modelo dependiente de células que puede funcionar para entrecruzar el TGF-\beta latente con las moléculas de matriz (11). El requisito final para la activación implica LTBP. Se ha propuesto que LTBP es necesaria para concentrar el complejo TGF-\beta latente en la superficie celular donde se activa posteriormente, supuestamente por transglutaminasa tisular y/o plasmina (12). Se han identificado y clonado tres diferentes LTBP (13-15) que pueden indicar un mecanismo potencial por el que las células pueden controlar las interacciones de los complejos de TGF-\beta latente con sitios tisulares o tipos celulares específicos. Además, hay informes de que la activación de TGF-\beta sucede independientemente de estos mecanismos por la unión del complejo latente a trombospondina, una glicoproteína asociada a matriz extracelular (16,
17).

Aunque L-TGF-\beta no se activa en condiciones normales de cultivo salvo que se preparen co-cultivos, las células en cultivos homotípicos pueden inducirse para formar TGF-\beta activo por aplicación de agentes específicos. Entre estos agentes están los retinoides, que inducen la activación de TGF-\beta1 latente en queratinocitos, células endoteliales y osteoclastos (18, 19, 20). La activación de TGF-\beta1 inducida por retinoides es dependiente de plasmina (18, 19). Los anti-estrógenos (tamoxifeno o toremifina) indujeron la producción de TGF-\beta activo en fibroblastos fetales y células de carcinoma de mama (21). La exposición de células del endotelio arterial o capilar bovino a bFGF (Factor de Crecimiento de Fibroblastos básico) in vitro también provocó la activación de TGF-\beta aparentemente por un mecanismo dependiente de plasmina (22). Las vesículas de matriz de condrocitos osteocondrales de la zona de crecimiento fueron capaces de activar TGF-\beta latente cuando se incubaron con 1,25-dihidroxi vitamina D3 a través de la acción directa de la vitamina sobre la membrana de la vesícula de la matriz extracelular (23). Además, hay informes de que pequeñas cantidades de TGF-\beta1 activo podrían detectarse en medios condicionados de células epiteliales de próstata humanas (24), líneas celulares de melanoma (25) y células de glioblastoma (26); sin embargo, el mecanismo de esta activación aún no se entiende.

Hasta la fecha, ninguno de los sistemas que generan TGF-\beta1 activo se ha utilizado como modelo de exploración para agentes con capacidad potencial de sostener la latencia de TGF-\beta1. El procedimiento de co-cultivo se ha estudiado ampliamente y se dilucidaron los mecanismos responsables de la activación de TGF-\beta1 en este sistema. Sin embargo, este procedimiento de co-cultivo carece de reproducibilidad y tiene el importante requisito de exploración de grandes cantidades de clones celulares para producir un sistema eficaz.

El objetivo de estos estudios fue desarrollar un nuevo modelo in vitro para la activación de TGF-\beta para la exploración posterior de moléculas con capacidades potenciales de impedir esta activación. Como TGF-\beta ha demostrado se un factor clave en cicatrización y trastornos fibróticos, se esperaría que los agentes que demostraron ser activos en dicho ensayo funcionaran como anti-fibróticos y anti-cicatrizantes in vivo.

Sumario de la invención

Se ha desarrollado un nuevo procedimiento para explorar e identificar moduladores de la formación de cicatriz, tal como agentes anti-cicatrizantes y anti-fibróticos. Este procedimiento ofrece simplicidad, es reproducible y podría adoptarse para explorar grandes cantidades de compuestos moduladores para identificar nuevos agentes anti-fibróticos potenciales.

Este procedimiento tiene características en común con el sistema de co-cultivo de células del endotelio arterial bovino/células del músculo liso arterial bovino (BAEC/BASMC), pero es más sensible y no requiere explorar grandes cantidades de líneas clonales para desarrollar un procedimiento eficaz.

En este nuevo sistema, similar al sistema de co-cultivo, la activación de L-TGF-\beta1 sucede por varios mecanismos independientes que implican la unión del complejo latente a receptores de manosa-6-fosfato/factor de crecimiento-II tipo insulina (M6P/IGF-II), trombospondina y/o transglutaminasa tisular de tipo II. Pero, al contrario del sistema de co-cultivo, este sistema dependiente de macrófagos no parece implicar plasmina.

Usando este procedimiento, se identificaron nuevos agentes anti-fibróticos potenciales, tales como factor de crecimiento II de tipo insulina definido como IGF-II, (usado por separado o en combinación con la proteína-2 de unión al factor de crecimiento tipo insulina (IGFBP-2) como vehículo de suministro), inhibidores de transglutaminasa tisular de tipo II y agentes anti-inflamatorios (tales como hidrocortisona).

Se ha propuesto un nuevo mecanismo de acción para M6P en este documento que se basa en la regulación negativa del receptor de M6P/IGF-II y el ARNm de TGF-\beta1.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Se muestra la activación de TGF-\beta1 por macrófagos.

Figura 2. Se muestra la expresión de ARNm para TGF-\beta1 en macrófagos.

Figura 3. Se muestra la expresión de ARNm para Transglutaminasa II tisular en macrófagos tratados con hidrocortisona.

Descripción detallada de la invención Materiales

Se obtuvieron de Sigma Chemicals D-manosa 6-fosfato, alfa-D(+) manosa 1-fosfato (M1P), monodansilcadaverina (DCA; sustrato competidor para transglutaminasa tisular de tipo II, TGasa II), cistamina (inhibidor dirigido de sitio activo de TGasa II), putrescina-diclorhidrato, DMSO (óxido de dimetil sulfóxido), LPS (lipopolisacárido) de Salmonella abortus equi, ácido retinoico todo trans (RA) e hidrocortisona. La albúmina de suero bovina (BSA)-libre de endotoxina se adquirió de Calbiochem. Las soluciones madre de ácido retinoico e hidrocortisona se prepararon en etanol. Las soluciones madre se diluyeron en serie en medio de cultivo para producir una concentración final del 0,5%. Esta concentración de etanol provocó la producción o activación de TGF-\beta1. La solución madre de monodansilcadaverina se preparó en DMSO. La concentración final de DMSO (1:1000) usada en las condiciones experimentales no tuvo efectos sobre la producción o activación de TGF \beta (datos no mostrados). IGF-II humano recombinante se adquirió de Bachem, Inc. Los anticuerpos neutralizantes monoclonales frente al activador de plasminógeno uroquinasa humano (uPA) se obtuvieron de American Diagnostica, Inc. El anticuerpo neutralizante monoclonal anti-trombospondina humana (clon I,A4.1) se adquirió de Life Technologies. El TGF-\beta1 latente humano recombinante (rHLTGF-\beta1) se obtuvo de R & D Systems. La agarosa Sea Kem GTG era de FMC, Bio Products. Los marcadores de tamaño de ARN, los marcadores Q X 174 DNA/Hae III y el kit de ELISA para TGF-\beta1 se adquirieron de Promega. La Transcriptasa Inversa SuperScript^{TM} II Rnase H^{-} se obtuvo de Life Technologies. La ADN Polimerasa AmpliTaq se obtuvo de Perkin Elmer Cetus. El kit de extracción de ARN RNeasy se adquirió de Qiagen. Todos los medios de cultivo celular se adquirieron de Life Technologies. El Suero Bovino Fetal (FBS) se obtuvo de HyClone. Los macrófagos peritoneales de ratón IC-21 transformados con SV-40, fibroblastos dérmicos fetales humanos (1502), fibroblastos neonatos humanos (43 SK) y una línea celular de adenocarcinoma de próstata humana se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Las líneas celulares de melanoma humanas de Bowes y HMB-2 se recibieron de Josef Bizik (Bratislava). Las células del endotelio arterial bovino (BAEC) y las células del músculo liso arterial bovino (BASMC) se obtuvieron de Cell Application. Las IGFBP-1 y 2 (Proteína de Unión al Factor de Crecimiento tipo Insulina) de rata purificadas se obtuvieron de Dr. Beverly Peterkofsky (NIH, Bethesda,
MD).

Procedimientos experimentales Cultivo celular

Se mantuvieron macrófagos peritoneales IC-21 de ratón transformados con SV-40 en RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%. Los cultivos se sembraron en placas de 100 mm y se hicieron crecer en CO_{2} al 5% a 37ºC. El medio se cambió a intervalos de 2 días. Se hicieron crecer fibroblastos dérmicos fetales y neonatos humanos en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% en presencia de Hepes 6 mM, 50 I.U./ml de penicilina y 50 mcg/ml de estreptomicina. Los cultivos se sembraron en placas de 100 mm y se hicieron crecer en CO_{2} al 5% a 37ºC. Las líneas celulares de melanoma humanas de Bowes y HMB-2 se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (MEM) suplementado con glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales al 1%, FBS al 5% y antibióticos. Las células se sembraron en placas de 100 mm y se hicieron crecer en CO_{2} al 5% a 37ºC. Las líneas celulares de adenocarcinoma de próstata humanas se hicieron crecer en Mezcla Nutriente F 12K suplementada con FBS al 7%, se sembraron en placas de 100 mm y se hicieron crecer en CO_{2} al 5% a 37ºC. Las células del endotelio arterial bovino se mantuvieron en DMEM suplementado con CS al 10%, glutamina y antibióticos. Las células de músculo liso se cultivaron en MEM alfa suplementado con suero de ternera al 10%, glutamina y antibióticos. Se sembraron en placas de 100 mm y se hicieron crecer en CO_{2} al 5% a 37ºC.

Preparación de medios condicionados (CM) a partir de BAEC y BASMC

Los procedimientos para la preparación de medios condicionados se han descrito previamente (22). Brevemente, para el experimento de retinoide, las células BAEC se hicieron crecer hasta confluencia en placas de 35 mm. Los cultivos se aclararon con PBS (Solución Salina Tamponada con Fosfato), y se incubaron en 1 ml de DMEM libre de suero que contenía BSA al 0,1% y ácido retinoico (10 \muM) o vehículo (etanol al 0,5%). La incubación se realizó durante 24 h. El medio se aspiró, las células se lavaron con PBS y después se incubaron en 1 ml de DMEM/BSA al 0,1% durante 12 h adicionales para producir medio condicionado. Los medios condicionados se centrifugaron y usaron en el ensayo de ELISA para la evaluación de TGF-\beta1.

Para experimentos de co-cultivo, se sembraron BAEC y BASMC por separado en placas de 35 mm a una densidad de 40 x 10^{4} células en DMEM/CS (Suero de Ternera) al 10% o 3,2 x 10^{5} BAEC y 0,8 x 10^{5} BASMC en las mismas placas de 35 mm. Después de la unión celular (aproximadamente 2 h) las células se aclararon con PBS y se incubaron en 1 ml de DMEM/BSA al 0,1% durante 6 h para producir medios condicionados. Los Medios Condicionados se centrifugaron y se usaron en el ensayo de ELISA.

Preparación de medios condicionados a partir de células cancerosas

Se hicieron crecer células de melanoma (Bowes y HMB-2) y de adenocarcinoma de próstata en placas de 100 mm hasta confluencia. Los medios se aspiraron, los cultivos se lavaron con PBS y se aplicó medio libre de suero apropiado que contenía BSA al 0,1% durante 24 h. Los medios se recogieron y se almacenaron para su posterior evaluación de TGF-\beta1 por ELISA.

Ensayo de activación de macrófagos Activación de macrófagos con lipopolisacáridos (LPS)

Los macrófagos cultivados se quitaron de la placa con 3 ml de PBS. El PBS se equilibró con 15 ml de RPMI-1640 que contenía FBS al 10%. Las células se contaron y después se sembraron en placas de 100 mm a 1 x 10^{6} células/placa. Cuando los macrófagos cultivados alcanzaron aproximadamente un 70% de confluencia (2-3 días) se lavaron con PBS y se aplicaron medio RPMI-1640 que contenía FBS al 5% y 10 ng/ml de LPS (Figura 1). Después de 24 h de activación con LPS, las células se lavaron suavemente con PBS. En este punto, el medio condicionado de los fibroblastos dérmicos fetales confluyentes se recogió y se distribuyeron 5 ml en cada placa que contenía macrófagos. Las células se incubaron durante 24 h adicionales, se recogieron los medios, se depositaron por centrifugación a 600 x g durante 10 min y se almacenaron a 4ºC antes de la evaluación de TGF-\beta1 por ELISA. Cada condición se hizo por duplicado. Las células, lavadas con PBS, se recogieron para una extracción de ARN total.

Preparación de medios condicionados a partir de fibroblastos dérmicos fetales para el ensayo de activación de macrófagos

Los fibroblastos dérmicos fetales se sembraron en placas de 100 mm a 1 x 10^{6} células/placa. Las células se hicieron crecer hasta confluencia (2-3 días). Los cultivos se lavaron con PBS y se aplicó medio fresco, DMEM suplementado con FBS al 10% o medio AIM-V (un medio libre de suero) para condiciones libres de suero durante 24 h (Figura 1). El medio se recogió y se combinó para obtener una combinación homogénea de TGF-\beta1 latente. La recogida del medio se hizo justo antes de la aplicación en el ensayo de macrófagos.

Co-cultivo de macrófagos y fibroblastos fetales

Para los experimentos en los que se co-cultivaron macrófagos y fibroblastos fetales, los dos tipos celulares se sembraron en placas de 100 mm a una densidad de 1 x 10^{6} fibroblastos fetales y 0,8 x 10^{6} macrófagos. Después de la unión celular (aproximadamente 2 h) las células se aclararon con PBS y se incubaron en 10 ml de RPMI-1640/FBS al 5%, +/-LPS durante 24 h para producir medios condicionados. Los medios condicionados se centrifugaron como se ha descrito anteriormente y se usaron en el ensayo de ELISA.

Tratamiento de fibroblastos neonatos humanos con Manosa 6-Fosfato (M6P)

Se sembraron fibroblastos neonatos humanos en placas de 100 mm a 1 x 10^{6} células/pocillo. Cuando las células alcanzaron confluencia se lavaron con PBS y los cultivos se trataron con diferentes concentraciones de M6P (1, 10, 50, 100, y 200 \muM) durante 24 y 48 h en condiciones libres de suero. Además, las células se trataron con dos concentraciones de Manosa 1-Fosfato (M1P) (100 y 200 \muM) durante 24 y 48 horas. El ARN total se extrajo y se evaluó para la expresión de los ARNm del receptor de M6P/IGF-II, el receptor de TGF-\beta1 y de tipo I de TGF-\beta por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa semi-cuantitativa (RT-PCR). Cada tratamiento se realizó por duplicado y se realizaron análisis repetitivos.

ELISA para TGF-\beta1

Se realizaron ensayos ELISA usando un kit Promega y se siguió el protocolo proporcionado por el fabricante. Se diluyeron 1:4 ó 1:20 alícuotas de los sobrenadantes celulares que contenían FBS al 10% para medir TGF-\beta1 activo y total, respectivamente. Se ensayaron los medios condicionados libres de suero sin diluir para TGF-\beta1 total y diluidos 10 veces para TGF-\beta1 total. Cada medida se realizó por duplicado. El desarrollo de color se controló con el uso de un lector de microplaca (Molecular Devices) a 450 nm.

Extracción de ARN total

Las células se lavaron con PBS, seguido de la adición del tampón de extracción proporcionado con el kit (kit de extracción de ARN RNeasy). Las células lisadas se rasparon de la placa y se recogieron en microtubos. Las muestras se congelaron a -70ºC antes del análisis o se evaluaron directamente siguiendo el protocolo del fabricante. Se midió la absorbancia a 260 nm y 280 nm y se evaluó la integridad del ARN por geles de agarosa con formaldehído desnaturalizante teñidos con bromuro de etidio.

Análisis de transferencia de Northern

El análisis de transferencia de Northern se realizó como se ha descrito previamente (27). Brevemente, las muestras de ARN total (5 \mug) se diluyeron en formaldehído-tampón MOPS y se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa Sea Kem GTG al 1,2% desnaturalizante junto con marcadores de tamaño de ARN. El ARN se transfirió a una membrana de nitrocelulosa por transferencia capilar. Las manchas de transferencia se prehibridaron durante 3 h a 42ºC en una solución que contenía sulfato de dextrano al 10%, solución de Denhardt 2 x, formamida al 50%, 5 x SSPE (cloruro sódico 0,75 M, fosfato sódico 0,05 M, ácido etilendiaminotetraacético 0,005 M)/SDS al 0,1%, y 250 \mug/ml de ADN de testículo de salmón partido. La solución de hibridación fue esencialmente la misma excepto en que se incluyó una sonda de ADN marcada con ^{32}P dCTP y 150 \mug/ml de ADN de testículo de salmón. La hibridación se realizó durante 16 h a 42ºC. Las etapas de lavado después de la hibridación se realizaron del siguiente modo: dos veces durante 15 min con 2 x SSC (cloruro sódico 0,75 M, citrato sódico 0,075 M) a 65ºC, una durante 30 min con 2 x SSC/SDS al 0,1% a 65ºC y uno durante 10 min con 0,1 x SSC a 65ºC. Las manchas de transferencia se expusieron a una película de rayos X con pantallas de intensificación durante 2 días a
-80ºC.

La sonda usada para la hibridación se preparó por Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa (RT-PCR). El radiomarcaje de las sondas de ADNc se realizó por traslado de mella como se ha descrito previamente (27).

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa

El procedimiento usado para transcribir el ARN total se describió en detalle previamente (28). Brevemente, la reacción se realizó en un volumen total de 25 \mul que contenía tampón de transcriptasa inversa 1 x (Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, KCl 75 mM, MgCl_{2} 3 mM), DTT 10 mM (Ditiotreitol), 2,5 mM de cada dNTP (Desoxinucleótidos), 100 \mug/ml de BSA acetilada, 4 unidades de rRNasin (inhibidor de ribonucleasa), 200 unidades de Transcriptasa Inversa SuperScript^{TM} RNase H^{-}, 0,1 \mug de oligo (dT)_{12-18} y 1 mg de ARN total. La incubación se realizó durante 1 h a 42ºC y se terminó por la adición de un volumen igual de agua fría.

Se usó una parte de la primera reacción de la cadena de ADNc en PCR, que se realizó en 25 \mul que contenían Tris-HCl 16 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01%, 200 \muM de cada dNTP, 1 \muM de cada oligonucleótido con sentido y antisentido y 2,5 unidades de ADN polimerasa AmpliTaq. La amplificación se realizó durante 35 ciclos. Cada ciclo constaba de: desnaturalización 1 min a 95ºC; hibridación a 55ºC (óptimo para el par de oligonucleótidos usados) durante 2 min; y elongación a 72ºC, 3 min. Para el ciclo de elongación final fue 7 min. Los productos de reacción se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Los tamaños se determinaron usando marcadores Q X 174 DNA/Hae III. Las digestiones con enzimas de restricción se realizaron para confirmar la especificidad de los productos de PCR. Se usó densitometría para análisis cuantitativo de los geles teñidos con bromuro de etidio.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención sin, sin embargo, limitar la misma a los mismos.

Ejemplos

Se demostrará que el modelo de la invención tiene potencial como procedimiento rápido para explorar e identificar agentes anti-fibróticos (anti-cicatrizantes). Este sistema también será útil para dilucidar los mecanismos implicados en la activación de TGF-\beta1, y pueden aumentar el entendimiento de la naturaleza de las interacciones entre TGF-\beta1 y otras moléculas presentes en el medio de una herida tal como trombospondina, IGF y TGasa II.

\newpage

Ejemplo 1 BAEC tratadas con Ácido Retinoico (RA)

Se ha informado de que BAEC tratadas con ácido retinoico (RA) producen cantidades detectables de TGF-\beta1 activo (19). Los experimentos preliminares se realizaron para aplicar este procedimiento como sistema de exploración para moléculas anti-fibróticas. Sin embargo, se observó que incluso células BAEC no tratadas producían TGF-\beta1 activo (Tabla 1). Esto podría explicarse por la heterogeneidad de la población celular; es posible que una pequeña cantidad de células contaminantes, es decir, células de músculo liso, contribuyeran a este efecto. En presencia de RA o vehículo (etanol), las células generaron cantidades similares de TGF-\beta1 activo (Tabla 1). La Manosa 6-Fosfato ha demostrado bloquear la activación de TGF-\beta1 compitiendo con la unión de TGF-\beta al receptor de M6P/IGF-II (9). Sin embargo, cuando se ensaya a una concentración de 100 mM en este sistema, M6P no tuvo efectos inhibidores significativos, similares a M1P (Tabla 1). Estos resultados indican que el procedimiento puede no ser suficiente para evaluar moléculas anti-fibróticas.

Ejemplo Comparativo 2

Sistema de co-cultivo de BAEC y BASMC

Los experimentos preliminares se realizaron con el objetivo de adoptar el sistema de co-cultivo publicado para explorar agentes anti-fibróticos. Se sabe que este sistema es dependiente de plasmina y ha demostrado generar un 2-5% de TGF-\beta activo (22). El co-cultivo de células del endotelio arterial bovino y células del músculo liso arterial bovino generó hasta un 8,2% de TGF-\beta activo (Tabla 1) medido por ELISA. Uno de los problemas observados durante el co-cultivo fue la muy baja reproducibilidad del ensayo. Además, después de pocos pases, las células perdieron completamente su capacidad de activar TGF-\beta1. Esto no fue sorprendente ya que el co-cultivo requiere la exploración de varios clones de células endoteliales y del músculo liso para desarrollar un sistema eficaz. La Manosa 6-Fosfato, cuando se ensayó a 100 \muM, no inhibió significativamente la activación de TGF-\beta1 en este ensayo. Por lo tanto, se decidió no proceder más con este sistema.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Activación de TGF-\beta1 por BAEC+/-BASCM+/-RA

Células	TGF-\beta1 activo (pg/ml)	TGF-\beta1 total (pg/ml)	% Activo

BAEC solo	274	3100	8,9
BAEC+ETOH	315	3324	9,5
BAEC+RA (10 \muM)	276	2667	10,3
BAEC+RA+M6P	287	3544	8,1
BAEC+RA+M1P	280	3686	7,6
Co-cultivo	56	687	8,2
Co-cultivo+M6P	58	770	7,5

\vskip1.000000\baselineskip

Abreviaturas de la Tabla

BAEC-células del endotelio arterial bovino

RA-ácido retinoico

M6P-manosa-6-fosfato

M1P-manosa-1-fosfato

Caracterización de la vía de activación de TGF-\beta1 por células cancerosas

Se ha demostrado que las células cancerosas, tales como cáncer de mama humano, algunas líneas celulares de melanoma y líneas celulares de adenocarcinoma de próstata, liberan de manera constitutiva TGF-\beta1 biológicamente activo en el medio de cultivo (24, 25, 29). Como el sistema de cultivo celular homotípico sería de ventaja debido a su simplicidad, se hizo un intento de aplicar células cancerosas como procedimiento para la activación de TGF-\beta1. Se demostró que la línea celular de melanoma de Bowes secretaba TGF-\beta1 sustancialmente más activo que células HMB-2 y el porcentaje de TGF-\beta1 activo con relación al total, fue aproximadamente del 29,3% y el 4,2%, respectivamente. Las células de adenocarcinoma de próstata humanas produjeron TGF-\beta1 menos activo que las líneas celulares de melanoma (Tabla 2).

TABLA 2 Activación de TGF-\beta1 por células cancerosas

Células	TGF-\beta1 activo (pg/ml)	TGF-\beta1 total (pg/ml)	% Activo

Melanoma de Bowes	198	675	29,3
Melanoma HMB-2	46	1007	4,6
Células de Adenocarcinoma	18	815	2,2
de Próstata Humanas

\vskip1.000000\baselineskip

En contraste con el co-cultivo, se demostró que M6P, DCA y anticuerpos anti-trombospondina no tenían efecto sobre la activación de TGF-\beta1 en células de melanoma o de cáncer de próstata (Tabla 3). Estos resultados indicaron que la activación de TGF-\beta1 sucedía independientemente del receptor de M6P/IGF-II, TGasa II o trombospondina.

Para determinar si la activación de TGF-\beta1 por células cancerosas sucede de manera intracelular o mediante procesamiento extracelular de L-TGF-\beta1, se aplicaron medios condicionados de fibroblastos fetales (fuente de L-TGF-\beta1) a células de melanoma. Sin embargo, no hubo activación adicional de TGF-\beta1 que sugiriera que el mecanismo intracelular, en lugar del extracelular, está implicado en el procesamiento de la molécula latente (Tabla 3).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Caracterización de la activación de TGF-\beta1 por células de melanoma y adenocarcinoma de próstata

Mecanismo	Tratamiento	% TGF-\beta1 Activo (STD)
BOWES
Receptor de M6P/IGF II	M6P 100 \muM	113,5 (3,5)
Transglutaminasa Tipo II	DCA 100 \muM	145 (0,34)
Trombospondina	Anti-Trombospondina dil 1:1500	85,9 (27)
Activación extracelular	AIM-V/1502	94,1 (8,4)
HMB-2
Receptor de M6P/IGF II	M6P 100 \muM	108,4 (17,9)
Transglutaminasa Tipo II	DCA 100 \muM	110,7 (7,5)
Trombospondina	Anti-Trombospondina dil 1:1500	97,2 (18,0)
Activación extracelular	AIM-V/1502	90,9 (11,7)
Células de adenocarcinoma
Receptor de M6P/IGF II	M6P 100 \muM	91,8 (8,5)
Transglutaminasa Tipo II	DCA 100 \muM	91,1 (3,0)
Trombospondina	Anti-Trombospondina dil 1:1500	107,1 (8,6)

\vskip1.000000\baselineskip

Abreviaturas de la Tabla

M6P-manosa-6-fosfato

DCA-dansilcadaverina

Activación de TGF-\beta por macrófagos

La observación de estudios previos de que macrófagos tratados con LPS estaban expresando niveles más altos de ARNm para TGasa II que células no tratadas indicó que estas células pueden ser capaces de la activación de TGF-\beta1 por un mecanismo dependiente de TGasa II. Para ensayar esta hipótesis, los macrófagos se trataron con LPS en presencia de medios condicionados con fibroblastos fetales como fuente de TGF-\beta1 latente. Se especuló que la adición de TGF-\beta1 exógeno latente en este sistema puede aumentar la sensibilidad del ensayo ya que el nivel de TGF-\beta1 total producido por macrófagos es relativamente bajo (644 pg/ml en presencia de FBS al 10%) en comparación con el nivel observado de medios condicionados con fibroblastos (1786 pg/ml).

Los macrófagos (MQ) secretaron TGF-\beta1 predominantemente en forma latente (Tabla 4). Cuando las células se trataron con LPS (MQ+LPS) el nivel de TGF-\beta1 activo estuvo por debajo del límite de detección de ELISA. De manera similar, el nivel de TGF-\beta1 activo en medios condicionados de fibroblastos fetales (FF-CM), tanto en presencia de suero (FF-CM) como en medios libres de suero (FF-CM SF) fue casi indetectable (7,2 y 5,7 pg/ml, respectivamente). En contraste, aplicando medios condicionados con fibroblastos a los macrófagos (MQ+FF-CM) se provocó una inducción de 10 veces en el nivel de TGF-\beta1 activo (Tabla 4). El tratamiento de macrófagos con LPS antes de la incubación con medios condicionados con fibroblastos provocó una activación adicional de TGF-\beta1 (MQ+LPS+FF-CM).

La activación también sucedió en condiciones libres de suero (MQ+FF-CM SF). Es interesante observar que el pretratamiento con LPS no potenció la proporción de activación de TGF-\beta1 (Tabla 4). Esto puede indicar que los cofactores del suero son importantes en la activación mediada por LPS.

TABLA 4 Activación de TGF-\beta1 por macrófagos

	Tratamiento	TGF-\beta1 activo (pg/ml)

	MQ	No detectable
	MQ+LPS	No detectable
	FF-CM	7,2
	MQ+FF-CM	71,1
	MQ+LPS+FF-CM	154
	FF-CM (SF)	5,7
	MQ+FF-CM (sf)	98,3
	MQ+LPS+FF-CM (SF)	93,3

Abreviaturas de la Tabla

MQ-macrófagos

LPS-lipopolisacáridos

FF-fibroblasto fetal

FF-CM-medios condicionados con fibroblasto fetal

SF-libre de suero

La sustitución en los medios con forma latente recombinante purificada de TGF-\beta1 se ensayó en un intento de determinar las necesidades para los medios condicionados con fibroblastos en el ensayo de macrófagos. Sólo el 3,3% de rHLTGF-\beta1 se activó por macrófagos cuando el tratamiento con LPS se omitió (Tabla 5). Cuando se trataron los macrófagos con LPS antes de la exposición de TGF-\beta1 latente, la activación fue más alta y alcanzó el 12,2% (Tabla 5). Esto indica que la sensibilidad del sistema de la invención podría manipularse por LPS y que las cantidades de TGF-\beta1 latente usadas inicialmente para la activación podrían titularse para efectos máximos.

TABLA 5 Activación de rHLTGF-\beta1 por macrófagos

Tratamiento	TGF-\beta1 activo (pg/ml)	TGF-\beta1 total (pg/ml)	% activo

Sin LPS, 200 pg/ml de rHLTGF-\beta1	10,9 (7,2)	324 (7,2)	3,3
LPS, 200 pg/ml de rHLTGF-\beta1	48,8 (3,5)	399 (44,5)	12,2

Abreviaturas de la Tabla

LPS-lipopolisacárido

rHLTGF-\beta1-TGF-\beta1 latente humano recombinante

El co-cultivo de macrófagos y fibroblastos fetales provocó la activación de TGF-\beta1. El nivel de TGF-\beta1 activo fue de 16,0 pg/ml en macrófagos no tratados con LPS y 14,4 pg/ml en macrófagos tratados con LPS, respectivamente (Tabla 6). Como el nivel de TGF-\beta1 activo fue relativamente bajo, este sistema no se aplicó más.

TABLA 6 Activación de TGF-\beta1 por co-cultivos de macrófagos y fibroblastos fetales

Tratamiento	TGF-\beta1 activo (pg/ml)	TGF-\beta1 total (pg/ml)	% activo

No tratado	16,0 (1,4)	2535	0,6
Tratado con LPS	14,4 (0,2)	2459	0,6

Abreviaturas de la Tabla

LPS-lipopolisacárido

Los experimentos descritos aquí caracterizan un nuevo modelo in vitro para la activación de TGF-\beta1 de la presente invención. El modelo utiliza macrófagos transformados de ratón y su capacidad para activar TGF-\beta1 latente suministrado con medio condicionado con fibroblastos o como una forma latente recombinante. El modelo de la invención ofrece varias ventajas sobre los sistemas existentes. Hasta la fecha, el modelo de co-cultivo fue el sistema más definido y caracterizado. Sin embargo, este modelo de la invención ofrece sensibilidad más alta y es más eficaz en términos de generación de TGF-\beta1 activo que el sistema de co-cultivo. La concentración de TGF-\beta1 activo presentada para el sistema de co-cultivo es aproximadamente 15-50 pg/ml (22). Esto representa sólo un 2-5% del total de TGF-\beta1 presente en medio condicionado de co-cultivo (22). La cantidad de TGF-\beta1 activo generada por macrófagos en el procedimiento de la presente invención es hasta 10 veces más alta y representa hasta un 12% del total de TGF-\beta1.

El procedimiento de la presente invención es simple y se basa en el cultivo celular homotípico. En contraste, en el modelo de co-cultivo, deben estar presentes dos tipos celulares y deben satisfacerse varios requisitos. Los tipos celulares deben estar en contacto o en proximidad muy cercana para producir TGF-\beta1 activo ya que el co-cultivo de células endoteliales sobre una superficie de 1-2 mm por encima de un monocapa de células de músculo liso no logra producir TGF-\beta1 activo (35). Parece que existe una fuerte especificidad de especie ya que las células del endotelio arterial bovino no activan TGF-\beta1 latente en presencia de células de músculo liso humanas o de cerdo (36). La sensibilidad de este procedimiento de la presente invención podría manipularse ya que la fuente de TGF-\beta1 latente que se activa por macrófagos no se limita a medios condicionados con fibroblastos.

El TGF-\beta1 latente recombinante también se convirtió a la forma activa. Una desventaja principal del sistema de co-cultivo es la ausencia de reproducibilidad. Se necesita explorar grandes cantidades de clones celulares BAEC y SMC para desarrollar un procedimiento eficaz. Esto requiere el aislamiento de varios clones celulares y posterior ensayo laborioso ya que las células, después de doblar varias veces la población, necesitan remplazarse. En contraste, los macrófagos transformados usados en la presente invención son capaces de cultivo continuo y están fácilmente disponibles para análisis de rutina.

Otra limitación del modelo de co-cultivo es el hecho de que este sistema no logra producir TGF-\beta1 activo en presencia de LPS en el medio de cultivo tisular (37) obtenido del agua o suero de ternera. Se informó de que el LPS encontrado en el medio de cultivo tisular regulaba negativamente los niveles de ARNm para TGasa II y TGF-\beta1 en células del endotelio arterial bovino (37). Esto crea una necesidad de ensayar cada conjunto de medio de cultivo tisular y suero para la presencia de LPS para generar TGF-\beta1 activo. En contraste, la presente descripción mostró que los macrófagos inducidos por LPS expresaban niveles más altos de TGasa II que células no tratadas. Esto puede indicar que LPS induce la activación de TGF-\beta1 a través de la regulación positiva de los niveles de TGasa II en macrófagos mientras que suprime la activación de TGF-\beta1 regulando negativamente TGasa II en células endoteliales. También es evidente que el procedimiento de la presente invención es más versátil que el sistema de co-cultivo.

Ejemplo 3 Los mecanismos de activación de TGF-\beta1 en ensayo de macrófagos

Se hizo un intento para determinar si los mecanismos implicados en la activación de TGF-\beta1 son similares a los descritos para co-cultivos de BAEC y BASMC. Se ensayaron varios mecanismos alternativos, que implicaron el receptor de M6P/IGF-II, TGasa II, trombospondina y mecanismos dependientes de plasmina. Los resultados mostraron que, de manera similar al co-cultivo, M6P a 100 y 50 \muM inhibió la activación de TGF-\beta1 al 32,9% \pm 11,5 y 69,6% \pm 1,77 de niveles de control, respectivamente (Tabla 7). Como se esperaba, M1P, que no se une al receptor de M6P/IGF-II, no impidió esta activación (Tabla 7).

La dansilcadaverina (DCA), cuando se ensayó a 100 \muM, fue un inhibidor fuerte ya que el nivel de TGF-\beta activo disminuyó al 18,3% \pm 1,55 de niveles de control (Tabla 6). En contraste, la cistamina, que se ensayó en combinación con M6P no mostró efecto aditivo sobre la activación de TGF-\beta1 (Tabla 6).

La putrescina, a dos concentraciones diferentes ensayadas (50 y 100 \muM), también tuvo algún efecto inhibidor ya que TGF-\beta1 activo disminuyó al 33,4% \pm 28,8 y 80,6 \pm 15,5 de niveles de control, respectivamente. Es interesante observar que la combinación de ambos, M6P y putrescina (50 \muM y 100 \muM, respectivamente) no tuvo efecto inhibidor aditivo sobre la activación de TGF-\beta1 (Tabla 7).

En contraste con el sistema de co-cultivo, un anticuerpo frente al activador de plasminógeno uroquinasa (uPa) ensayado a 400 ng/ml no mostró ningún efecto en el procedimiento del ensayo de la presente invención (Tabla 7). Esto indica que la plasmina no está implicada en la activación de TGF-\beta1 en este modelo de la invención. Por otro lado, un anticuerpo frente a trombospondina inhibió la activación de TGF-\beta1 al 64,1% \pm 6,0 de control (Tabla 7) lo que sugirió que la trombospondina juega un papel en esta activación.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7 Inhibición de la activación de TGF-\beta1 por M6P, inhibidores de TGasa II y otros

	Tratamiento	% de Control (STD)

	M6P 50 \muM	69,6 (1,7)
	M6P 100 \muM	32,9 (11,5)
	M1P 100 \muM	85,9 (28,2)
	Dansilcadaverina 100 \muM	18,3 (1,6)
	Putrescina 50 \muM	33,4 (28,8)
	Putrescina 100 \muM	80,6 (15,5)
	M6P 50 \muM+Putrescina 100 \muM	57,4 (6,8)
	M6P 50 \muM+Cistamina 100 \muM	65,8 (11,3)
	400 ng/ml de Anti-PA	105,0 (4,8)
	Anti-TSP dil 1:1500	64,1 (6,0)

\vskip1.000000\baselineskip

Abreviaturas de la Tabla

M6P-manosa-6-fosfato

M1P-manosa-1-fosfato

Anti-PS-anticuerpo frente al activador de plasminógeno

Anti-TSP-anticuerpo frente a trombospondina

Los mecanismos implicados en la activación de TGF-\beta1 en el procedimiento modelo de la presente invención son similares a los descritos para el sistema de co-cultivo o cultivo celular homotípico empleando BAEC o queratinocitos tratados con RA. Un aspecto del mecanismo es la interacción del complejo TGF-\beta latente con el receptor de M6P/IGF-II ya que la presencia de M6P en el ensayo de macrófagos, similar al sistema de co-cultivo, bloqueó la conversión de TGF-\beta1 latente a su forma activa. El segundo mecanismo descrito en el sistema de co-cultivo implicó Tgasa II tisular. Los resultados del procedimiento de ensayo de la presente invención mostraron que la presencia de inhibidores de esta enzima evitaba la generación de TGF-\beta1 activo lo que indica que TGasa II juega un papel en esta activación. La interacción molecular de la trombospondina con TGF-\beta1 latente es suficiente para provocar actividad biológica en el sistema de co-cultivo. De manera similar, en el procedimiento de la presente invención, los anticuerpos frente a trombospondina provocaron una supresión significativa de TGF-\beta1 activo que indica que la trombospondina puede contribuir a la activación de la forma latente. La plasmina ha demostrado ser necesaria para la activación de TGF-\beta1 en el sistema de co-cultivo. Los anticuerpos frente a uPA bloquearon de manera eficaz la producción de TGF-\beta1 activo en co-cultivos, pero no fueron eficaces en el procedimiento de ensayo de la presente invención. Esto indica que los macrófagos pueden activar TGF-\beta1 por un mecanismo independiente de actividad plasmina.

Los niveles totales de TGF-\beta1 se evaluaron después de diferentes tratamientos en el ensayo de macrófagos y fue evidente que el TGF-\beta1 total no se vio afectado de manera significativa por los diferentes tratamientos (Tabla 8).

TABLA 8 La concentración de TGF-\beta1 total después de diferentes tratamientos en el ensayo de macrófagos

Tratamiento	TGF-\beta1 total (STD) (pg/ml)
LPS+CM	2418,7 (246)
M6P (100 \muM)	2472,6 (374,5)
DCA (100 \muM)	2302 (219,3)

LPS+CM (libre de suero)	1454,9 (76,7)
M6P 100 \muM	1649,8 (71,7)

Abreviaturas de la Tabla

LPS-lipopolisacárido

CM-medios condicionados

M6P-manosa-6-fosfato

DCA-dansilcadaverina

De manera similar, los niveles de ARNm para TGF-\beta1 permanecieron igual independientemente del tratamiento de los macrófagos con PBS, LPS solo o tratamientos de LPS con M6P o DCA medido por transferencia de Northern (Figura 2).

Ejemplo 4 Ensayo de agentes anti-fibróticos potenciales en el ensayo de macrófagos

Usando el procedimiento de ensayo de la presente invención, se identificaron varias moléculas anti-fibróticas potenciales nuevas. El efecto de IGF-II sobre la activación de TGF-\beta1 se investigó ya que la ocupación del receptor de M6P/IGF-II con IGF-II podría inhibir estéricamente la unión de M6P en LAP a este receptor. Se demostró que IGF-II inhibía la activación de TGF-\beta1. El efecto era específico ya que IGFBP-1 fue capaz de invertir esta inhibición compitiendo con el receptor celular para el ligando libre. Por otro lado, IGFBP-2 no tuvo efecto sobre la acción de IGF-II en este sistema. Esto concuerda con los resultados de experimentos in vivo e in vitro previos de que IGFBP-1 es un inhibidor más potente de las funciones mediadas por IGF (32). Como IGFBP-2 no impidió los efectos inhibidores de IGF-II sobre la activación de TGF-\beta1, puede usarse como un vehículo de suministro para IGF-II in vivo protegiendo frente a la degradación de IGF-II mientras que permite la acción de IGF-II.

Aunque IGF-II no fue eficaz a 5 nM, concentraciones más altas (15 y 30 nM) tuvieron un efecto inhibidor dependiente de dosis sobre la activación de TGF-\beta1 (Tabla 9). Además, se ensayaron concentraciones en aumento de IGF-II (5 a 30 nM) con concentración constante de M6P (50 \muM). Los resultados demostraron que el efecto inhibidor óptimo se consiguió con 15 nM de IGF-II (Tabla 9) y el nivel de TGF-\beta1 activo disminuyó al 38,7% de control (Tabla 9).

TABLA 9 Inhibición de la activación de TGF-\beta1 por la familia de IGF

	Tratamiento	% de control (STD)

	IGF-II 5 nM	105,6 (12,4)
	IGF-II 15 nM	65,1 (10,8)
	IGF-II 30 nM	54,3 (17,6)
	IGF-II 5 nM+M6P 50 \muM	62,2 (15,5)
	IGF-II 15 nM+M6P 50 \muM	38,7 (10,4)
	IGF-II 30 nM+M6P 50 \muM	51,4 (17,6)
	M6P 50 \muM	69,6 (1,7)

Abreviaturas de la Tabla

IGF-II-factor de crecimiento-II tipo insulina

M6P-manosa-6-fosfato

Como IGF-II existe en circulación o en los tejidos como una forma compleja asociada a IGFBP (30, 31), se ensayaron dos formas de bajo peso molecular de IGFBP, IGFBP-1 y 2 para su capacidad de afectar a la acción inhibidora de IGF-II. Cuando se ensayaron por separado o en combinación con M6P, IGFBP 1 y 2 no mostraron ningún efecto inhibidor significativo (Tabla 10). Sin embargo, IGFBP-1, pero no IGFBP-2, fue capaz de invertir el efecto inhibidor mediado por IGF-II sobre la activación de TGF-\beta1. Estos resultados se confirmaron cuando se ensayaron IGFBP 1 y 2 en la combinación de IGF-II con M6P (Tabla 10). Estos resultados están de acuerdo con los descubrimientos previos de que IGFBP-1 es un inhibidor más potente de las funciones

\hbox{mediadas por IGF que IGFBP-2
(32).}

TABLA 10 Inhibición de la activación de TGF-\beta1 por IGF-II e IGFBP 1 y 2

Tratamiento	% de control (STD)
IGF-II (15 nM)	65,1 (10,8)
M6P (50 \muM)	69,6 (1,7)

IGFBP-1 (2 ng/ml)	76,4 (8,7)
IGFBP-2 (2 ng/ml)	77,9 (4,5)

IGFBP-1+M6P	77,4 (2,4)
IGFBP-2+M6P	70,9 (0,5)

IGFBP-1+IGF-II	97,6 (11,8)
IGFBP-2+IGF-II	55,5 (9,3)

IGFBP-1+IGF-II+M6P	76,5 (14,9)
IGFBP-2+IGF-II+M6P	35,5 (27,3)

Abreviaturas de la Tabla

IGF-II-factor de crecimiento-II tipo insulina

M6P-manosa-6-fosfato

IGFBP-1-proteína de unión-1 al factor de crecimiento tipo insulina

IGFBP-2-proteína de unión-2 al factor de crecimiento tipo insulina

Como la curación de heridas fetales (sin cicatriz) está asociada a reacción no inflamatoria en el sitio de la herida, en oposición a la respuesta inflamatoria observada en la curación de heridas en adultos (cicatrización) (33) se planteó la hipótesis de que modulando el nivel de respuesta inflamatoria se podría regular el nivel de TGF-\beta1 activo y supuestamente la calidad de la cicatriz.

Se ensayaron los agentes anti-inflamatorios en el procedimiento del ensayo de la presente invención para su capacidad de modular los niveles de activación de TGF-\beta1. Fue evidente que la hidrocortisona a una concentración 1 \muM inhibió la activación de TGF-\beta1 al 64,0% de control (Tabla 11).

TABLA 11 Inhibición de TGF-\beta1 por hidrocortisona

	Concentración	% de control (STD)
Hidrocortisona	1 \muM	64,0 (0,4)

\vskip1.000000\baselineskip

En un intento de identificar el mecanismo de esta inhibición, el nivel de ARNm se evaluó para TGasa II en macrófagos tratados con hidrocortisona 1 \muM. El análisis densitométrico de productos de RT-PCR (Figura 3) reveló que el nivel de ARNm para TGasa II se redujo al 37,5% por este tratamiento.

Uno de los importantes descubrimientos de este estudio es la acción anti-fibrótica potencial de hidrocortisona. Como el tratamiento de macrófagos con este agente reguló negativamente los niveles de ARNm de TGasa II, es posible que la hidrocortisona ejerza su acción anti-fibrótica a través de un mecanismo dependiente de TGasa II. El uso in vivo de anti-inflamatorios puede tener el valor añadido de no sólo reducir el nivel de infiltrado inflamatorio, sino también reducir los niveles acompañantes altos de factores de crecimiento incluyendo TGF-\beta1 y afectar adicionalmente a la formación de cicatriz.

El procedimiento de ensayo de la presente invención demostró la reducción de TGF-\beta1 activo para varias clases de moléculas, incluyendo inhibidores de TGasa II, M6P, IGF-II y el agente anti-inflamatorio, hidrocortisona. La necesidad de macrófagos en este nuevo ensayo permite la evaluación de agentes anti-inflamatorios que representan importantes terapias anti-cicatrizantes potenciales. La ausencia de dichas células en el sistema de co-cultivo no permitiría su uso para ensayar anti-inflamatorios.

Mecanismo anti-cicatrizante con M6P

Además, se informa de un nuevo mecanismo de acción para M6P en este documento. La regulación negativa del nivel de ARNm sucede para el receptor de M6P/IGF-II y TGF-\beta1 en fibroblastos cultivados después de tratamiento con M6P. Además, la disminución en los niveles de ARNm parece ser específica de isoforma ya que M1P no muestra dichos efectos.

Se diseñaron experimentos adicionales con el objetivo de caracterizar el modo de acción de M6P. Los estudios iniciales han demostrado que los niveles de receptores de M6P/IGF-II en las heridas tratadas con M6P se regulaban negativamente 3 días después de hacerse la herida. Esto puede proporcionar otro mecanismo por el que M6P puede ejercer su función como inhibidor de la activación de TGF-\beta1. La expresión de ARNm para el receptor de M6P/IGF-II se evaluó en fibroblastos de seres humanos neonatos tratados con varias dosis de M6P (1, 10, 50, 100 y 200 \muM) durante 24 y 48 horas. La expresión no se vio afectada con 1-100 \muM de M6P después de 24 h de tratamiento. Sin embargo, el tratamiento con 200 \muM de M6P provocó la regulación negativa del ARNm para el receptor (Tabla 13). Después de 48 h, se observó la disminución con 50-200 \muM de M6P (Tabla 13). Se observó una regulación negativa similar cuando el nivel de ARNm de TGF-\beta1 se investigaba después de tratamiento con M6P. Por otro lado, el nivel de ARNm del receptor de tipo I de TGF-\beta permanecía sin cambiar durante el transcurso de tiempo de tratamiento. La Manosa 1-Fosfato, ensayada a las dos concentraciones más altas (100 y 200 \muM), no mostró efectos sobre el receptor de M6P/IGF-II ni los niveles de ARNm de TGF-\beta1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 13 La expresión del receptor de M6P/IGF-II y ADNc de TGF-\beta1 en fibroblastos de neonato medida por RT-PCR

M6P (\muM)	Receptor de M6P/IGF-II 24 h	48 h	TGF-\beta1 24 h	48 h
1	98,4 (20,6)	112,8 (21,4)	80,9 (11,1)	86,3 (15,9)
10	86,1 (3,2)	108 (7,1)	116,2 (25,1)	78,8 (26,5)
50	74 (36,6)	59,3 (1,4)	119,3 (24,4)	75 (42,4)
100	85,4 (25)	42,2 (3,2)	95,6 (31)	57,5 (15,9)
200	57,5 (5,2)	39,6 (1,3)	62,5 (27,7)	28,8 (23)

Referencias

1. K. Miyazono, A Olofsson, P. Colosetti, C.H. Heldin. A role of the latent TGF-\beta-binding protein in the assembly and secretion of TGF-\beta1. EMBO J. 10: 1091-1101.

2. P.D. Brown, L.M. Wakefield, A.D. Levinson, M.B. Sporn. Physiochemical activation of recombinant latent transforming growth factor-betas 1, 2 and 3. Growth Factors.1990, 3:35-43.

3. K. Miyazono, C.H. Heldin. Role for carbohydrate structures in TGF-\beta1 latency. Nature 1989, 338: 158-160.

4. K. Miyazano, U. Hellman, C. Wernstedt, C.H. Heldin. Latent high molecular weight complex of transforming growth factor \beta1; purification from human platelets and structural characterization. J. Biol. Chem. 1988, 263: 6407-6415.

5. R. Pircher, P. Jullien, D.A. Lowrence. \beta-transforming growth factor is stored in human blood platelets as a latent high molecular weight complex. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989, 163: 56-63.

6. A. Orlidge, P.A.D'Amore. Inhibition of capillary endothelial cell growth by pericytes and smooth muscle cells. J. Cell Biol. 1987, 105: 1455-1462.

7. A.A. Antonelli-Orlidge, K.B. Saunders, S.R. Smith, P.D'Amore. An activated form of transforming growth factor beta is produced by co-cultures of endothelial cells and pericytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989, 86: 4544-4548.

8. Y. Sato, R. Tsuboi, R. Lyons, H. Moses, D.B. Rifkin. Characterization of the activation of latent TGF-\beta by co-cultures of endothelial cells and pericytes or smooth muscle cells. J. Cell Biol. 1990, 111: 757-763.

9. P.A. Denis, D.B. Rifkin. Cellular activation of latent TGF-\beta requires binding to the cation independent mannose-6-phosphate/insulin-like growth factor type II receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991, 88: 580-584.

10. A.F. Purchio, J.A. Cooper, A.M. Brunner, M.N. Lioubin, L.E. Gentry, K.S. Kovacina, R.A. Roth, H. Marquardt. Identification of mannose-6-phosphate in two asparagine-linked sugar chains of recombinant transforming growth factor-b1 precursor. J. Biol. Chem. 1988. 263: 14211-14215.

11. S. Kojima, K. Nara, D.B. Rifkin. Requirement for transglutaminase in the activation of latent transforming growth factor-\beta in bovine endothelial cells. J. Cell. Biol. 1993, 121, 2: 439-448.

12. R. Flaumenhaft, M. Abe, Y. Sato, K. Miyazono, J. Harpel, C.H. Heldin, D.B. Rifkin. Role of latent-TGF-\beta binding protein in the activation of latent TGF-\beta by co-cultures of endothelial and smooth muscle cells. J. Cell Biol. 1993, 4: 995-1002.

13. T. Kanzaki, A.Olofsson, A. Moren, Ch. Wernsted, U. Hellman, K. Miyazano, L. Claesson-Welsh, C-H. Heldin. TGF-\beta1 binding protein: a component of the large latent complex of TGF-\beta with multiple repeat sequences. Cell, 1990, 61: 1051-1061.

14. A. Moren, A. Anders, G. Stenman, P. Sahlin, T. Kanzaki, L. Claesson-Welsh, P.Ten Dijke, K. Miyazano, C-H. Heldin. Identification and characterization of LTBP-2, a novel latent transforming growth factor-\beta-binding protein. J. Biol. Chem. 1994, 269: 32469-32478.

15. W. Yin, E. Smiley, J. Germiller, R.P. Mecham, J.B. Florer, R.J. Wenstrup, J. Bonadio. Isoloation of a novel transforming growth factor-\beta binding protein gene (LTBP-3). J. Biol. Chem. 1995, 270: 10147-10160.

16. S. Schultz-Cherry, J.E. Murphy-Ullrich. Thrombospondin causes activation of latent transforming growth factor-\beta secreted by endothelial cells by a novel mechanism. J Cell Biol. 1993, 122: 923-932.

17. S. Schultz-Cherry, H. Chen, D.F. Mosher, T.M. Misenheimer, H.C. Krutzsch, D.D. Roberts, J.E. Murphy-Ullrich. Regulation of transforming factor-\beta activation by discrete sequences of thrombospondin 1. J. Biol. Chem. 1995, 270: 7304-7310.

18. A.B. Glick. K.C. Flanders, D. Danielpour, S.H. Yuspa, M.B. Sporn. Retinoic acid induces transforming growth factor \beta-2 in cultured keratinocytes and mouse epidermis. Cell Regulation 1989, 1: 87-97.

19. S. Kojima, D.B. Rifkin. Mechanism of retinoid-induced activation of latent transforming growth factor-\beta in bovine endothelial cells. J. Cell Biol. 1993, 155: 323-332.

20. R.O.C. Oreffo, G.R. Mundy, S.M. Seyedin, L.F. Bonewald. Activation of the bone-derived latent TGF beta complex by isolated osteoclasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 158: 817-823.

21. A.A. Colletta, L.M. Wakefield, V. Howell, K.E.P. van Roozendaal, D. Danielpour, S.R. Ebbs, M.B. Sporn, M. Baum. Anti-estrogens induce the secretion of active transforming growth factor beta from human fetal fibroblasts. Br. J. Cancer, 1990, 62: 405-409.

22. R. Flaumenhaft, M. Abe, Y. Sato, K. Miyazano, J. Harpel, C-H. Heldin, D.B. Rifkin. Role of latent TGF-\beta binding protein in the activation of latent TGF-\beta by co-cultures of endothelial and smooth muscle cells. J. Cell Biol. 1992, 118: 901-909.

23. B. Boyan, Z. Schwartz, S. Park-Snyder, D.D. Dean, F. Yang, D. Twardzik, L.F. Bonewald. Latent transforming growth factor-\beta is produced by chondrocytes and activated by extracellular matrix vesicles upon exposure to 1,25-(OH)_{2}D_{3}. J. Biol. Chem. 1994, 269: 28374-28381.

24. J. Mitchen, D. Bletzinger, R Rago, G. Wilding. Use of microfluorimetric assay to measure proliferative response of mink lung cells to purified TGF-\beta and to TGFb activity found in prostate cell conditioned medium. In vitro Cell Dev. Biol.-Animal. 1995, 31: 692-697.

25. J. Bizik, D. Felnerova, M. Grofova, A. Vaheri. Active transforming growth factor-\beta in human melanoma cell lines: no evidence for plasmin-related activation of latent TGF-\beta. In press.

26. D. Huber, A. Fontana, S. Bodmer. Activation of human platelet-derived latent transforming growth factor-\beta1 by human glioblastoma cells. Biochem. J. 1991, 277: 165-173.

27. K. Takeda, A. Gosiewska, B. Peterkofsky. Similar, but not identical, modulation of expression of extracellular matrix components during in vitro and in vivo aging of human skin fibroblasts. J. Cell. Physiol. 1992, 153: 450-459.

28. A. Gosiewska, F. Mahmoodian, B. Peterkofsky. Gene expression of iron-related proteins during iron deficiency caused by scurvy in guinea pigs. Arch. Biochem. Biophys. 1996, 325: 295-303.

29. C. Knabee, M.E. Lippman, L.M. Wakefield, K.C. Flanders, A. Kasid, R. Derynck, R.B. Dickson. Evidence that transforming growth factor-\beta is a hormonally regulated negative growth factor in human breast cancer cells. Cell, 1987, 48: 417-428.

30. J.I. Jones, D.R. Clemmons. Insulin-like growth factors and their binding proteins: biological actions. Endocrinology. 1995, 16: 3-34.

31. R.E. Humbel. Insulin-like growth factors I and II. Eur.J. Biochem. 1990, 190: 445-462.

32. A. Gosiewska, S. Wilson, D. Kwon, B. Peterkofsky. Evidence for an in vivo role of insulin-like growth factor-binding protein-1 and -2 as inhibitors of collagen gene expression in vitamin C-deficient guinea pigs. 1994, Endocrinology, 134: 1329-1339.

33. F.W. Frantz, D.A. Bettinger, J.H. Haynes, D.E. Johnson, K.M. Harvey, H.P. Dalton, D.R. Yager, R.F. Diegelmann, I.K. Cohen. Biology of fetal repair: The presence of bacteria in fetal wounds induces an adult-like healing response. J. Pediatric Surg. 1993, 28, 428-434.

34. M.K. Christensen, M. Meldal, K. Bock. Synthesis of mannose 6-phosphate-containing disaccharide threonine building blocks and their use in solid-phase glycopeptide synthesis. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1993, 1: 1453-1460.

35. R. Flaumenhaft, S. Kjima, M. Abe, D.R. Rifkin. Activation of transforming growth factor\beta. Advances Pharm. 1993, 24: 51-76.

36. Y. Sato, D.B. Rifkin. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of latent transforming growth factor-\beta1-like molecule by plasmin during co-culture. J Cell Biol. 1989, 109: 309-315

37. S. Kojima, R Vernooy, D. Moscatelli, H. Amanuma, D.R Rifkin. Lipopolysaccharide inhibits activation of latent transforming growth factor-\beta in bovine endothelial cells. J. Cell. Physiol. 1995, 163: 210-219.

Claims

1. Un procedimiento para identificar moduladores de la formación de tejido cicatricial que comprende:

(a) incubar macrófagos estimulados con LPS con una fuente exógena de TGF-\beta1 latente que contiene un compuesto modulador; y

(b) medir la cantidad de TGF-\beta1 activo producido por los macrófagos.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los macrófagos son macrófagos peritoneales IC-21 de ratón transformados con SV-40.

3. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la fuente del TGF-\beta1 latente exógeno es un medio de cultivo celular condicionado de fibroblastos fetales.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el medio de cultivo celular contiene suero.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que la fuente del TGF-\beta1 latente exógeno es una forma latente recombinante de TGF-\beta1.