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JP2001507944A - 悪性細胞に対する、ｏｎｃタンパク質を含む、免疫毒素 - Google Patents

悪性細胞に対する、ｏｎｃタンパク質を含む、免疫毒素

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JP2001507944A JP54830198A JP54830198A JP2001507944A JP 2001507944 A JP2001507944 A JP 2001507944A JP 54830198 A JP54830198 A JP 54830198A JP 54830198 A JP54830198 A JP 54830198A JP 2001507944 A JP2001507944 A JP 2001507944A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、所定の表面マーカーおよびそれらをコードする核酸構築物を有する悪性細胞を効果的に殺傷する、免疫毒素に関する。これらの試薬は、選択した腫瘍細胞と特異的に結合し得る抗体に連結したリボ核酸分解活性を有するRana pipiensタンパク質に由来する毒性部分を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 悪性細胞に対する、oncタンパク質を含む、免疫毒素 関連出願に対する相互参照 本出願は、1997年5月2日に出願された米国特許仮出願第60/046,895号の継続出 願であり、そして優先権を主張する。 合衆国後援の研究または開発 適用されない。 発明の背景 リシン、ジフテリア毒素、およびPseudomonas毒素のような植物および細菌由 来の毒性酵素は、細胞型特異的殺傷試薬を生じるために抗体またはレセプター結 合リガンドに結合している（Youleら，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA 77:5483(1 980)；Gillilandら，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA 77:4539(1980)；Krolickら ，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA 77:5419(1980)）。細胞認識部分が必ずしも抗 体ではないという事実に関係なく、これらに関する毒素は、一般的に免疫毒素と して公知である。これらのハイブリッドタンパク質は、抗体または分子のリガン ド部分が認識するレセプターまたは細胞表面マーカーを発現する細胞を殺傷する 。 適切な条件下で、特定のレセプターまたは細胞表面マーカーに依存して、毒素 はサイトゾルに入り、タンパク質合成機構を不活化し、そして標的細胞の殺傷を 引き起こす。免疫毒素は、細胞培養物中および動物モデルで増殖するガン細胞に 非常に細胞傷害性であることが示されており、その播種性のため、伝統的な外科 手術技術によって処置可能でない血液およびリンパ媒介性悪性腫瘍、ならびに腹 膜内腔のような制限された区画における固体腫瘍を処置するためのこれらの試薬 の可能性を証明する（Griffinら，IMMUNOTOXINS，p 433，Boston/Dordrecht/Lan caster，Kluwer Academic Publishers(1988)；Vitettaら，Science 238:1098 (1987)；Fitzgeraldら，J．Na'tl Cancer Inst．81:1455(1989)によって総説さ れる）。伝統的化学療法は、いくつかのガン状熊の処置に有効であるが、化学療 法化合物の全身毒性による望ましくない副作用を示す。 したがって、ガン治療のための理想的な候補は、患者のガン細胞に選択的に細 胞傷害性であるが非ガン細胞に対して無害のままである免疫毒素である。しかし 、この型の抗腫瘍治療の利用は、免疫毒素を含む外来タンパク質に対する患者の 免疫応答の発現によって妨害されている。マウスモノクローナル抗体（Sawlerら ，J．Immunol．135:1530(1985)；Schroffら，Cancer Res．45:879(1985)）およ び抗毒素抗体に対する免疫応答は、免疫毒素で処置した動物およびヒトの両方で 検出されている（Rybakら，Immunol．and Allergy Clinics of North America 1 1(2):359(1991)；Harkonenら，Cancer Res．47:1377(1987)；Hertler，A．IMMUN OTOXINS p.475，Kluwer Academic Publishers，Boston/Dordrecht/Lancaster(19 88)）。ヒト化技術の進歩は、免疫毒素の抗体部分に関連するいくらかの免疫原 性を緩和した（Birdら，Science 242:423(1988)；Hustonら，Proc．Na'tl．Acad ．Sci．USA 85:5879(1988)；Wardら，Nature 341:544(1989)；およびJonesら，N ature 314:522(1986)）。しかし、患者の免疫抑制以外の、毒性部分の免疫原性 に対抗する解決法は見いだされていない(Khazaeliら，Proceedings of AACR 29: 418(1988)）。したがって、免疫毒素の毒性部分の免疫原性を減少させるが所定 の表面マーカーを有する細胞を選択的に殺傷する能力を保持する方法および組成 物に対する必要性が継続して存在している。 Ｂ細胞リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫の一般的規定内に属し、そしてリンパ 系内の播種性腫瘍または固体腫瘍であり得る。悪性Ｂ細胞における表面マーカー であるCD22に対して惹起されている放射標識されたヒト化マウス抗体（LymphoCi deTM）は、Ｂ細胞リンパ腫についての処置として現在臨床試験中である（Immuno medics，Inc.，Press Release，http://www.immunomedic.com/theral.html）。A mlotら，Blood 82:2624-2633(1993)；Sausvilleら，Blood 85:3457-3465(1995) ；Grossbardら，Blood 81:2263-2271(1993)；Grossbardら，Clin．Oncol．11:72 6-737(1993)も参照のこと。これまで、いくつかの抗腫瘍応答が注目されている が、正常組織に対する免疫毒素媒介毒性によって、しばしば治療レベルでの 投薬が抑制されている。CD22の他に、CD19およびCD40のようないくつかのＢ細胞 特異的抗原は、リシンＡ鎖のような植物毒素およびPseudomonas外毒素Ａ（PE） のような細菌毒素を用いて作製された免疫毒素によって標的化されている。Ucku nら，Blood 79:2201-2214(1992)；Ghetieら，Cancer Res．51:5876-5880(1991) ；Franciscoら，Cancer Res．55:3099-3104(1995)。 腫瘍細胞に対するRNase Aの細胞傷害性は、1960年代および1970年代に行われ た研究から十分に文献に示されている。初期の研究は、Roth，Cancer Res．23:6 57(1963)に総説される。これらの初期の研究の関連は、Rana pipiensの卵母細胞 からの抗腫瘍タンパク質が、ウシ膵臓RNase Aに相同であるという発見によって 確認されている（Ardeltら，J．Biol．Chem．256:245(1991)）。P-30タンパク質 （および本明細書でoncタンパク質といわれる）を、インビトロで（Darzynkiewi czら，Cell Tissue Kinet．21:169(1988)；Mikulskiら，Cell Tissue Kinet．23 :237（1990））および動物モデルで（Mikulskiら，J．Nat'l．Cancer Inst．82: 151(1990)）ガン細胞に対する抗増殖／細胞傷害性効果に基づいてRana pipens初 期胚の抽出物から単離した。種々の固体腫瘍を有する患者におけるoncタンパク 質の第III相ヒト臨床試験は、現在進行中である。 発明の要旨 本発明は、悪性Ｂ細胞および他の悪性細胞を殺傷するために有用である免疫毒 素に関し、そしてＢ細胞上の表面マーカーおよび免疫毒素をコードする核酸構築 物に関する。これらの試薬は、選択された腫瘍細胞との特異的結合を可能にする 抗体に連結されたリボ核酸分解(ribonucleolytic)活性を有するRana pipiensタ ンパク質に由来する毒性部分を含む。 発明者らは、これらの特定の免疫毒素が、ヒトRNase相対物よりもまたは毒素 自体よりも悪性Ｂ細胞に対して2000倍以上まで活性である、非常に驚くべき特性 を有することを見いだした。さらに、以下により詳細に記載されるように、播種 性腫瘍に対してインビボで投与された場合、それらの使用は、劇的に低下した副 作用を生じた。これらの非常に効果的であるが、見かけ上非毒性の、Ｂ細胞リン パ腫のような遍在性疾患に対する免疫毒素は、このような疾患にかかっている患 者に対する新たなかつ刺激的な治療選択を提示する。 本発明の目的は、所定の表面マーカーを有する細胞を選択的に殺傷する細胞傷 害性RNase（oncタンパク質）免疫毒素を提供することである。これらの免疫毒素 は、最小の免疫原性であり、そして現在公知の免疫毒素よりも少ない全身毒性を 生じる。特に、本発明の目的は、腫瘍細胞上の特異的マーカーを認識するヒト化 抗体に連結されたリボ核酸分解活性を有するタンパク質フラグメントを含む免疫 毒素を直接提供することである。 他の実施態様では、本発明は、本発明の免疫毒素および薬学的に受容可能なキ ャリアを含む薬学的組成物に関する。 さらなる実施態様では、本発明は、細胞を選択的に殺傷する方法に関する。こ の方法は、モノクローナル抗体が、腫瘍細胞上の表面マーカーに結合し、それに よって毒性oncタンパク質に細胞を殺傷させるような条件下で、本発明の選択的 免疫毒素と、殺傷されるべき腫瘍細胞とを接触させる工程を包含する。 本発明の種々の他の目的および利点は、本発明の以下の説明から明らかである 。 図面の説明 細胞（LL2によって認識されるCD22マーカーを有さない）に対してより細胞傷害 性であることを示す。 Nよりもタンパク質合成がより阻害的であることを示す。EDNは、本文に記載のよ うにヒト非毒性RNaseである。 ンパク質合成がより阻害的であることを示す。 疫毒素ほど迅速にDaudi細胞のリソソームによって分解されないことを証明する 。 図5Aは、細胞に保持されるRNase物質の割合を示し、そして図5Bは、分解されそ して上清に放出されるRNase物質の割合を示す。 られる。 す生存グラフである。５×106Daudi細胞を、マウスに腹腔内移植した。24時間後 、マウスを500μgの示された化合物で静脈内処理した。 完全に防御したことを示す生存グラフである。マウスを、500μgの示された化合 物(100μgを５日間毎日)を用いて移植の24時間後に処理した。 当たり２時間毎に４回で５日間投与した。矢印は、各それぞれの処理でのマウス は４日目に死亡が見られ、そして50mg/kg IT-dgRTAで処理したマウスは７日目に 死亡が見られた。 発明の詳細な説明 本発明は、RNaseタンパク質、特にＢ細胞に対し指向された免疫毒素における 毒性部分としてRana pipensに由来するRNaseの使用に関する。本発明の免疫毒素 試薬は、タンパク質および選択された腫瘍細胞表面マーカーに特異的に結合する 抗体を含む。以下に詳述した研究では、oncタンパク質は、CD22またはCD74に対 する抗体およびヒト非毒性RNaseを含む他の免疫毒素よりもはるかに優れている ことが示される。oncタンパク質に基づく免疫毒素は、Ｂ細胞リンパ腫および白 血病のような悪性Ｂ細胞、ならびに神経芽細胞腫のような他の悪性腫瘍に対する 強力な薬剤である。 定義 用語「抗体」または「抗体ペプチド」とは、ポリクローナルおよびモノクロー ナル抗体、標的抗原に結合する免疫グロブリン分子の全体の免疫グロブリンまた は抗体もしくは任意の機能的フラグメントをいい、以下により詳細に定義される 。このような機能的実体の例には、完全な抗体分子、Fv、一本鎖Fv、相補性決定 領域（CDR）、ＶL（軽鎖可変領域）、ＶH（重鎖可変領域）、Fab、F(ab)2'のよ うな抗体フラグメント、およびそれらの任意の組み合わせ、あるいは標的抗原に 結合し得る免疫グロブリンペプチドの任意の他の機能的部分が挙げられる。 抗体は、例えば、完全なままの免疫グロブリンとして、または種々のペプチダ ーゼでの切断によって産生される多数の十分に特徴づけられたフラグメントとし て存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィ ド結合下で抗体を切断して、F(ab)2 'を産生し、これはそれ自体がジスルフィド 結合によってＶH-ＣHIに連結された軽鎖であるFabのダイマーである。F(ab)2'は 、ヒンジ領域においてジスルフィド結合を破壊する穏和な条件下で還元され得、 それによってF(ab)2'ダイマーをFab'モノマーに変換する。Fab'モノマーは、本 質的にヒンジ領域の一部を有するFabである（FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY，第3版， W.E．Paul編，Raven Press，N.Y．(1993)を参照のこと）。種々の抗体フラグメ ントは、完全なままの抗体の切断によって定義されるが、当業者は、このような フラグメントが、化学的にまたは組換えDNA方法論のいずれかを利用して、新規 に合成され得ることを理解する。したがって、本明細書で使用される場合、用語 抗体はまた、抗体全体の改変によって産生されるか、または組換えDNA方法論を 使用して新規に合成されるフラグメントのいずれかの抗体フラグメントを含む。 本発明については、抗体は、抗原と相互作用するならば、抗原「と反応性であ る」かまたは抗原「に結合する」。この相互作用は、２つのリアクタントが一緒 になって産物を形成する化学反応に類似する。抗体−抗原相互作用の場合には、 相互作用の産物は、抗体−抗原複合体である。本発明の免疫グロブリンに結合す る好ましい抗原は、CD22およびCD74細胞表面マーカーである。 用語「結合特異性」、「抗体に特異的に結合する」、または「特異的に免疫反 応性である」とは、タンパク質または炭水化物をいう場合、タンパク質および他 の生物学的薬剤の異種集団の存在下でタンパク質または炭水化物の存在の決定因 子である結合反応をいう。したがって、指示されたイムノアッセイ条件下で、特 定された抗体は、特定のタンパク質または炭水化物に結合し、そして試料に存在 する他のタンパク質または炭水化物に有意な量で結合しない。このような条件下 で抗体への特異的結合は、特定のタンパク質または炭水化物に対するその特異性 について選択された抗体を必要とし得る。例えば、CD22抗原に対して惹起された 抗体は、CD22タンパク質と特異的に免疫反応性でありそして他のタンパク質と免 疫反応性でない抗体を提供するために選択され得る。種々のイムノアッセイ形式 は、特定のタンパク質または炭水化物と特異的に免疫反応性の抗体を選択するた めに使用され得る。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク質または炭 水化物と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために日常的に使用される。特異 的免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ形式および条件の説 明については、HarlowおよびLane，ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Sp ring Harbor Publication，New York(1988)を参照のこと。 用語「ヒト化」とは、定常領域が、ヒト免疫グロブリンに対して少なくとも約 80％以上の相同性を有する抗体をいう。さらに、マウスのような非ヒト可変領域 アミノ酸残基のいくつかは、ヒト起源のアミノ酸残基を含むように改変され得る 。 ヒト化抗体は、「新形態を備えた」抗体といわれている。相補性決定領域（CD R）の操作は、ヒト化抗体を達成する１つの方法である。例えば、Jonesら，Natu re 321:522(1988)およびRiechmannら，Nature 332:323(1988)を参照のこと、両 方とも参考として本明細書に援用される。ヒト化抗体に関する総説文献について は、WinterおよびMilstein，Nature 349:293(1991)を参照のこと、これは参考と して本明細書に援用される。 用語「単離された」または「実質的に精製された」とは、核酸またはタンパク 質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然の状態で結合される他の細 胞成分を本質的に含まないことを示す。好ましくは、均質であるが、乾燥または 水溶液のいずれかであり得る。純度および均質性は、代表的には、ポリアクリル アミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を 使用して決定される。調製物に存在する優勢な種であるタンパク質が、実質的に 精製される。 特に、単離されたoncタンパク質遺伝子は、その遺伝子に隣接しそしてoncタン パク質以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離さ れる。用語「精製された」とは、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおい て本質的に１つのバンドを生じることを示す。特に、核酸またはタンパク質が、 少なくとも85％純粋、より好ましくは少なくとも95％純粋、および最も好ましく は少なくとも99％純粋であることを意味する。用語「核酸」とは、一本鎖または 二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポ リマーをいい、そして他に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと類 似の方法で機能し得る天然のヌクレオチドの公知のアナログを包含する。 本発明の免疫毒素の文脈において用語「連結される」とは、ジスルフィド結合 ；水素結合；静電結合；組換え融合；およびコンホメーション結合（例えば、抗 体−抗原およびビオチン−アビジン結合）を含む共有結合による部分（代表的に は抗体および毒素）の連結を包含する。 用語「測定可能なリボ核酸分解活性」または「顕著なリボ核酸分解活性」とは 、タンパク質合成が、[35S]メチオニンの酸沈殿可能なタンパク質への組込みに よって測定される場合に阻害される、ウサギ網状赤血球溶解物アッセイに添加さ れる場合40ng/mL以下のIC50を有する分子をいう。IC50は、アッセイでタンパク 質合成を50％阻害するために必要なタンパク質の濃度である。溶解物アッセイは 、Promega Corporation，Madison，WIから市販されるPromega溶解物アッセイキ ットで記載のように行われ得る。高分子量RNAおよびtRNAを使用するリボ核酸分 解活性は、刊行されたプロトコルに従って過塩素酸可溶性ヌクレオチドの形成に よって37℃で決定される（Newton，D.L．ら，Biochemistry 35:545-553(1996)） 。ポリ(A,C)UpGおよびポリＵでは、リボ核酸分解活性は、DepriscoらならびにLi bonatiおよびFloridi（Deprisco，R．ら，Biochimica Biophysica Acta 788:356 -363(1984)；Libonati，M．ら，European J．Biochem．8:81-87(1969)）に従っ てアッセイされる。活性は、260nmでの吸光度における経時的な増加を測定する ことによってアッセイされる。インキュベーション混合物（1mLの10mMイミダゾ ール、0.1M NaCl、pH6.5またはpH7）は、25℃で基質および適切な量の酵素溶液 を含む。インビトロ翻訳アッセイ（St．Clair，D.K.ら，Proc．Na'tl．Acad．Sc i．USA 84:8330-8334(1987)）および（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5 -ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾリルブルー；MTT）を使用する細胞 生存性アッセイ（Mossman，T.，J．Immunol．Methods 65:55-63(1983)）は、既 に記載されたように行われる（Pearson，J.W.ら，J．Na'tl Cancer Inst．83:13 86-1391(1991)）。 用語「をコードする核酸」または「をコードする核酸配列」とは、特定のタン パク質またはペプチドの発現を指示する核酸をいう。核酸配列は、RNAに転写さ れるDNA鎖配列およびタンパク質に翻訳されるRNA配列の両方を含む。核酸配列は 、全長核酸配列ならびに全長配列に由来するより短い配列の両方を含む。特定の 核酸配列が、特異的宿主細胞でコドン選択を提供するために導入され得る天然の ままの配列の縮重コドンを含むことが理解される。核酸は、個々の一本鎖または 二重鎖形態のいずれかとしてセンスおよびアンチセンス鎖の両方を含む。 用語「oncタンパク質」とは、初めはP-30タンパク質と命名されそして最初にD arzynkiewiczら，Cell Tissue Kinet．21:169(1988)に記載された、配列番号１ に記載される配列を有するタンパク質のような、Rana pipiensに由来するRNaseA をいう。このタンパク質の記載は、米国特許第5,559,212号に見いだされ得る。 用語「天然のoncタンパク質」とは、Rana pipiens卵母細胞から精製された、 天然の形態のタンパク質をいう。用語「組換えoncタンパク質」とは、組換え手 段によって産生されたタンパク質をいう。これらの組換えタンパク質およびその 核酸配列の好ましい実施態様は、PCT出願第PCT/US97/02588号に記載される。onc タンパク質はまた、核酸およびアミノ酸配列の両方の改変を含むが、測定可能な リボ核分解活性を有することが理解される。 「onc由来の」アミノ酸配列には、oncアミノ酸配列のアミノ酸位置１（Gluにp yroGluを置換する）、２、３、４、５、６、７、８、11、12、13、14、15、16、 18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、41、42、43、44、45、46、47、50、52、54、56、59、60、61、62、63、64、 65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、76、80、81、82、84、85、86、87、 91、92、93、95、または96の配列（配列番号１）で始まる配列の群から選択され る６つのアミノ酸の連続する配列に同一の６つの連続するアミノ酸の少なくとも １つのストリングを含むものが含まれる。 用語「薬学的組成物」とは、種々の調製物の処方物をいう。非経口処方物が公 知であり、そして本発明での使用に好ましい。免疫毒素の治療的有効量を含む処 方物は、滅菌液体溶液、液体懸濁液、または凍結乾燥された型のいずれかであり 、そして必要に応じて安定化剤または賦形剤を含む。凍結乾燥した組成物は、適 切な希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、0.3％グリシンなどで、約0.01mg/ kg宿主体重から10mg/kg以上までのレベルで、再構成される。 代表的には、免疫毒素を含む薬学的組成物は、１日のみまたは毎日の静脈内注 入によって数日間のいずれかで治療的有効量で投与される。 本発明の免疫毒素は、注射によって、最も好ましくは静脈内に、しかしまた、 筋肉内に、皮下に、莢膜内に、腹腔内に、血管腔に、または関節に、例えば、関 節内注射によって、全身投与され得る。用量は、用いられる免疫毒素の特性、例 えば、医師の技術範囲内で公知である、その活性および生物学的半減期、処方物 中の免疫毒素の濃度、投与部位および速度、関連する患者の臨床的耐容性、患者 を苦しめるガンの程度などに依存する。 本発明の免疫毒素は、溶液中で投与され得る。溶液のpHは、pH5〜9.5、好まし くはpH6.5〜7.5の範囲であるべきである。免疫毒素またはその誘導体は、リン酸 塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン-HCl、またはクエン酸塩などのよう な適切な薬学的に受容可能な緩衝液を有する溶液中にあるべきである。緩衝液濃 度は、1〜100mMの範囲であるべきである。免疫グロブリンの溶液はまた、50〜15 0mMの濃度で、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムのような塩を含み得る。アル ブミン、グロブリン、デタージェント、ゼラチン、プロタミン、またはプロタミ ンの塩のような安定化剤の有効量はまた、免疫毒素を含む溶液にまたは溶液が調 製される組成物に含まれ得、そして添加され得る。免疫毒素の全身投与は、代表 的には、抗体のヒト化形態が使用されるならば、２〜３日後とまたは週に１回行 われる。あるいは、毎日の投与が有用である。通常、投与は、筋肉内注射または 血管内注入のいずれかによる。 投与はまた、鼻内または他の経口投与経路によるものであり得る。免疫毒素は また、血液を含むある組織に配置された、マイクロスフェア、リポソーム、また は他のマイクロパーティクル送達システムによって投与され得る。 免疫毒素はまた、肺への局在化送達を達成するためにエアロゾルによって投与 され得る。これは、免疫毒素またはその誘導体を含む水性エアロゾル、リポソー ム調製物、または固体粒子を調製することによって達成される。非水性（例えば 、フルオロカーボン噴射剤）懸濁液が使用され得る。好ましくは、超音波噴霧器 が、エアロゾルの調製に使用される。超音波噴霧器は、免疫毒素の分解を生じ得 る剪断に、抗体またはその誘導体を曝露することを最小にする。 通常、水性エアロゾルは、従来の薬学的に受容可能なキャリアおよび安定化剤 とともに免疫毒素の水性溶液または懸濁液を処方することによって製造される。 キャリアおよび安定化剤は、特定の免疫毒素についての必要条件に依存して変化 な無害のタンパク質、またはソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリ シンのようなアミノ酸、緩衝剤、塩、糖、または糖アルコールが含まれる。処方 物は滅菌される。エアロゾルは、一般的に、等張溶液から調製される。 用語「組換えDNA」、「組換え核酸」、または「組換え的に産生したDNA」とは 、天然のまたは内因性供給源から単離され、そして天然に存在する隣接または内 部ヌクレオチドを付加、欠失、または変化させることによって、化学的または酵 素的のいずれかで改変されたDNAをいう。隣接するヌクレオチドは、ヌクレオチ ドの記載された配列またはサブ配列の上流または下流のいずれかにあるヌクレオ チドであるが、内部ヌクレオチドは、記載された配列またはサブ配列内に存在す るヌクレオチドである。 用語「組換え手段」とは、タンパク質が単離され、タンパク質をコードするcD NA配列が同定され、そして発現ベクター中に挿入される技術をいう。次いで、ベ クターは、細胞に導入され、そして細胞はタンパク質を発現する。組換え手段は また、融合タンパク質の発現、タンパク質の構成的発現、またはタンパク質の誘 導性発現のための１つのベクターへの、種々の供給源からのコードまたはプロモ ーターDNAの連結を包含する。 用語「組換えタンパク質」、「組換え的に産生されたタンパク質」、または 「組換え的に産生された免疫毒素」とは、タンパク質を発現し得るDNAの内因性 コピーを有さない非天然細胞を使用して産生されるペプチドまたはタンパク質を いう。細胞は、適切な核酸配列の導入によって遺伝学的に変化されているので、 タンパク質を産生する。組換えタンパク質は、タンパク質を産生する細胞と正常 に結合するタンパク質および他の細胞下成分との結合で見いだされない。 用語「選択的細胞傷害性試薬」とは、例えば、生物内の、異なる細胞の集団に 添加される場合、細胞のいくつかの物理学的特徴に基づいて、すなわち、細胞傷 害性試薬が結合し、次いでインターナリゼーションされる表面リガンドまたはマ ーカーに基づいて、集団中の細胞の１つのタイプを殺傷する化合物をいう。 用語「単鎖抗体」とは、抗体の機能的フラグメントをコードする遺伝情報が、 DNAの単一の連続する長さに位置する抗体をいう。単鎖抗体の完全な説明につい ては、Bireら，Science 242:423(1988)およびHustonら，Proc．Nat'l．Acad．Sc i．USA 85:5879(1988)を参照のこと。 用語「表面マーカー」とは、細胞の表面に存在するタンパク質、炭水化物、ま たは糖タンパク質をいう。細胞の異なるタイプは、異なる細胞表面マーカーを発 現し、したがって細胞は、細胞表面マーカーの存在によって同定され得る。例え ば、悪性Ｂ細胞は、CD22を過剰発現する。したがって、CD22を認識する抗体の結 合は、その細胞をＢ細胞として同定する。以下に記載のCD74は、Ｂ細胞上で見ら れる細胞表面マーカーおよび他の悪性細胞の選択群の例である。 本発明の免疫毒素の種々の使用には、タンパク質の毒性作用によって排除され 得る特異的ヒト細胞によって引き起こされる種々の疾患症状が含まれる。本発明 の免疫結合体についての１つの好ましい適用は、CD22を発現する悪性Ｂ細胞の処 置である。Ｂ細胞の代表的悪性疾患には、急性リンパ性白血球（ALL）、慢性Ｂ リンパ性白血病（B-CLL）、慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫、AIDS-関連 リンパ腫、および濾胞性リンパ腫、ならびに毛状細胞白血病が挙げられる。CD74 に対する本明細書に記載の免疫毒素は、黒色腫、神経芽細胞腫、および骨髄腫細 胞の阻害および処置に有用である。 本発明の好ましい細胞傷害性試薬は、ヒト非毒性RNAseのEDNに連結した同じ抗 体から構成される比較試薬よりも、Ｂ細胞マーカーを有する標的細胞に対して少 なくとも100倍、好ましくは少なくとも500倍、および最も好ましくは少なくとも 1000倍を上まわる細胞傷害性である。 Ａ．細胞表面マーカーに対する抗体 抗体とは、アナライト（抗原）を特異的に結合しそして認識する、免疫グロブ リン遺伝子またはそのフラグメントによって実質的にコードされるポリペプチド をいう。認識された免疫グロブリン遺伝子には、カッパー、ラムダ、アルファ、 ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免 疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパーまたはラムダのい ずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、または イプシロンとして分類され、これらは順に、それぞれ、免疫グロブリンクラスIg G、IgM、IgA、IgD、およびIgEを定義する。 例示的な免疫グロブリン(抗体)構造ユニットは、テトラマーを含む。各テトラ マーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽」 鎖（約25kD）および１つの「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN-末端は、主 として抗原認識を担う約100〜10以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語可 変軽鎖(VL)およ可変重鎖(V４H)とは、それぞれこれらの軽鎖および重鎖をいう。 モノクローナル抗体を産生するための種々の方法は、当該技術分野で公知であ る。例えば、Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES;PRINCIPLES AND PRACTICE，Acade mic Press，第2版(1986)；ならびにHarlowおよびLaneを参照のこと。ヒトＢ細胞 に対するまたはこれと反応性であるモノクローナル抗体は、マウスを免疫するた めの免疫原の組み合わせを使用しそして所望の抗原を発現する細胞に対するハイ ブリドーマ上清をスクリーニングすることによって、あるいは目的の抗原に対す るモノクローナル抗体に特異的であるように設計されたスクリーニングアッセイ によって、得られる。本発明の抗体についてスクリーニングするために有用な細 胞株は、容易に入手可能または得られる。このような細胞には、バーキットリン パ腫細胞株Daudi、CA-46、およびRajiが挙げられる。 CD22は、Igスーパーファミリーに属する系統制限されたＢ細胞抗原であり、こ れは、急性リンパ性白血病(B-ALL)、慢性Ｂリンパ性細胞(B-CLL)、バーキットリ ンパ腫のようなＢリンパ腫細胞、AIDS-関連リンパ肺、および濾胞性リンパ腫、 ならびに毛様細胞白血病を含むがこれらに限定されない多くのタイプの悪性Ｂ細 胞の表面上で、ならびに正常成熟Ｂリンパ球上で発現される。CD22は、Ｂ細胞発 生の初期段階で発現されず、幹細胞または末期段階の血漿細胞の表面上でも見い だされない。Vaickusら，Crit．Rev．Oncol/Hematol．11:267-297(1991)。さら に、脱落した抗原は、正常ヒト血清またはCLLの患者からの血清で検出されない 。Liら，Cell．Immunol．118:85-99(1989)。 CD74は、MHCクラスII関連不変鎖(Ii)としても公知であり、これは、Ｂ細胞、 マクロファージ、単球、および他のMHCクラスII陽性細胞で見いだされる。上記 に列挙した悪性Ｂ細胞の他に、CD74はまた、神経芽細胞腫、黒色腫、および骨髄 腫細胞で見いだされる。 例えば、Ｂ細胞に対するモノクローナル抗体の産生は、以下によって達成され る：1)ヒトＢ細胞での免疫処置、次いでNishimuraら，Eur．J．Immunol．18:747 (1988)（参考として本明細書に援用される）に記載されるのと同様の方法で構築 されるヒトＢ細胞抗原でトランスフェクトされた非ヒト細胞株に対する反応性に ついての、得られるハイブリドーマのスクリーニング；2)ヒトＢ細胞抗原でトラ ンスフェクトした（好ましくは免疫処置されるべき動物に自己由来の）非ヒト細 胞株での免疫処置、次いでヒトＢ細胞株に対する反応性についての、得られるハ イブリドーマのスクリーニング；3)ヒトＢ細胞抗原を発現するヒトまたは非ヒト 細胞株での免疫処置、次いでヒトＢ細胞株との現存する抗Ｂ細胞モノクローナル 抗体の反応性をブロックする能力についての、得られるハイブリドーマのスクリ ーニング；4)ヒトＢ細胞抗原を発現するヒトまたは非ヒト細胞株での免疫処置、 次いで精製された天然のまたは組換えＢ細胞抗原との反応性についての、得られ るハイブリドーマのスクリーニング；および5)ヒトＢ細胞抗原の組換え誘導体で の免疫処置、次いでヒトＢ細胞株に対する反応性についての、得られるハイブリ ドーマのスクリーニング。この開示の総説について、当業者は、本発明で使用さ れ得る抗体を惹起する他の方法を理解する。 組換えDNA方法論は、本発明の好ましい抗体を合成するために使用される。例 えば、ヒトにおける使用についての免疫毒素の好ましい抗体部分は、ヒト可変領 域フレームワークおよびヒト定常領域と組み合わされたマウス相補性決定領域（ CDR）のみを含むＢ細胞抗原に対する「ヒト化」抗体である。 ヒト化技術は、当該技術分野で周知である。例えば、PCT出願公開番号WO 87/0 2671；米国特許第4,816,567号；EP特許出願0173494；Jonesら，Nature 321:522( 1986)；およびVerhoeyenら，Science 239:1534(1988)を参照のこと。CDRの操作 は、ヒト化抗体を達成する方法である。例えば、Jonesら，Nature 321:522(1988 )およびRiechmannら，Nature 332:323(1988)を参照のこと。ヒト化抗体に関する 総説文献については、WinterおよびMilstein，Nature 349:293(1991)を参照のこ と。 ヒト化の他に、本発明の抗体部分は、単鎖抗体である。本発明の１つの局面で は、単鎖抗体は、親ハイブリドーマ細胞株からクローニングされる。 モノクローナル抗体のFv領域は、同じ一般的ストラテジーを使用してクローニ ングされる。代表的には、例えば、ハイブリドーマ細胞から抽出されるポリ(A)+ RNAは、プライマーとしてランダムヘキサマーを使用して逆転写される。ＶHおよ びＶLドメインは、２つのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって別々に増幅され る。重鎖配列は、重鎖のアミノ末端タンパク質配列に従って設計される5'末端プ ライマー、およびコンセンサス免疫グロブリン定常領域配列に従った3'末端プラ イマーを使用して増幅される（Kabatら，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGI CAL INTEREST，第5版，U.S．Department of Health and Human Services，Publi c Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)）。 軽鎖Fv領域は、軽鎖のアミノ末端タンパク質配列に従って設計された5'末端プラ イマーおよびプライマーC-カッパとの組み合わせで使用して増幅される。当業者 は、使用され得る他の適切なプライマーを認識する。 粗PCR産物は、当業者に周知であり市販の適切なクローニングベクターにサブ クローニングされる。正確なサイズのDNAインサートを含むクローンは、例えば 、アガロースゲル電気泳動で同定される。次いで、重鎖または軽鎖コード領域の ヌクレオチド配列は、クローニング部位に隣接した配列決定プライマーを使用し て ト，United States Biochemical Corp.，Cleveland，OH）を使用して、DNAを配 列決定することを容易にする。 当業者は、Fv領域について提供される配列情報を利用して、これらの配列をコ ードする核酸が、当業者に周知の多くの方法を使用して得られることを理解する 。したがって、Fv領域をコードするDNAは、任意の適切な方法によって調製され 、この方法には、例えば、リガーゼ連鎖反応（LCR）（WuおよびWallace，Genomi cs 4:560(1989)、Landegrenら，Science 241:1077(1988)、およびBarringerら， Gene 89:117(1990)を参照のこと）、転写増幅（Kwohら，Proc．Na'tl．Acad．Sc i．USA 86:1173(1989)を参照のこと）、自己持続配列複製（Guatelliら，Proc． Nat'l．Acad．Sci．USA 87:1874(1990)を参照のこと）のような増幅技術、適切 な配列のクローニングおよび制限、またはNarangら，Meth．Enzymol．68:90(197 9)のホスホトリエステル方法；Brownら，Meth．Enzymol．68:109(1979)のホスホ ジエステル方法；Beaucageら，Tetra．Lett．22:1859(1981)のジエチルホスホロ アミダイト方法；および米国特許第4,458,066号の固体支持体方法のような方法 による直接的化学合成が挙げられる。 単鎖抗体をコードする核酸配列は、当該技術分野で周知の技術によって同定さ れる（Sambrookらを参照のこと）。簡単にいえば、上記のDNA産物は、電気泳動 Amersham）にトランスファーされ、そしてストリンジェント条件下で適切なプロ ーブとハイブリダイズされる。プローブは、所望の配列内に埋め込まれるフラグ メントの核酸配列を含むべきである。 DNA配列が化学的に合成される場合、単鎖オリゴヌクレオチドが生じる。これ は、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、またはテンプレートとし て単鎖を使用するDNAポリメラーゼを用いる重合化によって、二本鎖DNAに変換さ れ得る。単鎖Fv領域の全体を化学的に合成することは可能であるが、後で一緒に ライゲートされる多くのより短い配列（約100〜150塩基）を合成することが好ま しい。 あるいは、サブ配列はクローニングされ得、そして適切なサブ配列は、適切な 制限酵素を使用して切断される。次いで、フラグメントは、所望のDNA配列を産 生するためにライゲートされ得る。 一旦、Fv可変軽鎖および重鎖DNAが得られると、配列は、当業者に周知の技術 を使用して、直接的にまたはペプチドリンカーをコードするDNA配列を介しての いずれかで、一緒にライゲートされ得る。したがって、完全な配列は、単鎖抗体 の形態でFvドメインをコードする。 あるいは、Ｂ細胞に対する抗体は、例えば、免疫学的試薬の供給業者から市販 される（例えば、Ancell Corp.，Bayport，MN(RFB4)；Becton Dickinson，San J ose，CA；The Binding Site，Inc.，San Diego，CA；CalTag Laboratories，Sou th San Francisco，CA；Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN ；Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；およびZymed，Foster City，CA）。RFB 4は、他の抗体と比較した場合、驚くべき効率を有する本発明の好ましい抗体で ある。これは特徴づけられており、そしてFitzGeraldらが「Recombinant RFB4 I mmunotoxins Exhibit Potent Cytotoxic Activity for CD-22 Bearing Cells An d Tumors」と題する1998年3月19日に出願されたPCT特許出願、ならびにMansfiel dら，Bioconj．Chem．7:557(1996)；Mansfieldら，Biochem．Soc．Trans．25:70 9(1997)；およびMasfieldら，Blood 90:2020（1997）（これらのすべてはその全 体が本明細書に援用される）に記載される。 Ｂ．細胞傷害性oncタンパク質 本願は、Rana pipiensからのoncタンパク質についての新しい使用を開示する 。Rana pipiens oncタンパク質は、質量分析法で約12,000ダルトンの分子量、お よび9.5と10.5との間の等電点を有するRana pipiensの卵および／または胚に由 来する実質的に純粋なタンパク質である。Alfacell Corporation，Bloomfield， よっても例示される。 本発明については好ましくは、oncタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ 酸配列を有するタンパク質である。 本発明で使用されるoncタンパク質は、膵臓RNaseファミリーのモノマーメンバ ーでありそしてインターナリゼーションするリガンドなして特定のガン細胞に毒 性であるので、免疫毒素構築物に使用される他のRNaseと独特に比較される（米 国特許第5,559,212号を参照のこと）。しかし、Ｂ細胞に対する抗体に結合した 場合、oncタンパク質の細胞傷害性が、2,000倍にまで劇的に増加することは、本 発明の発見である。ガン細胞に対する細胞傷害性にもかかわらず、患者の毒性お よび免疫原性は、この特定の免疫毒素の効率および毒素の小さいサイズのため、 低いと予測される。 配列番号１が、本明細書で提供される配列の機能的有利点に実質的に影響を及 ぼさないように変更され得ることは、当業者に理解される。例えば、グリシンお よびアラニンは、代表的には、アスパラギン酸およびグルタミン酸ならびにアス パラギンおよびグルタミンのように交換可能であると考えられる。配列の機能的 有利点が維持される任意のこのような改変は、配列番号１に記載の配列によって 包含されることが意図される。 本明細書に記載されそして請求される代表的な組換えoncタンパク質は、配列 番号２を含むように定義される。本発明の組換えoncタンパク質は、天然のoncタ ンパク質と比較して類似の測定可能なリボ核酸分解活性を有する。しかし、当業 者は、onc配列の多くの異なる変更が、天然のoncタンパク質とほぼ同じ測定可能 なリボ核酸分解活性を有するoncタンパク質をコードすることを認識する。 好ましい組換えoncタンパク質、組換えoncタンパク質の改変体、および組換え oncタンパク質を合成するための技術の説明については、PCT出願第PCT/US97/025 88号を参照のこと、これは参考として本明細書に援用される。 Ｃ．免疫毒素 毒性部分および抗体は、化学作用によってまたは組換え手段によって結合され 得る（Rybakら，Tumor Targeting 1:141(1995)を参照のこと）。化学的改変には 、例えば、タンパク質化学の分野で周知である方法によって、直接的または連結 化合物を介してのいずれかで、互いに部分を連結する目的のための誘導体化が含 まれる。現在好ましい化学的結合の実施態様では、毒性部分および認識部分を連 結する手段は、２つの部分間の分子間ジスルフィド結合の形成に最終的に寄与す るヘテロ二官能性カップリング試薬を含む。本発明についてこの能力に有用であ る他のタイプのカップリング試薬は、例えば、米国特許4,545,985に記載され る。あるいは、分子間ジスルフィドは、天然に存在するまたは遺伝子操作によっ て挿入される各部分でシステイン間で便利に形成され得る。部分を連結する手段 はまた、ヘテロ二官能性架橋試薬または特異的低pH切断可能架橋剤または特異的 プロテアーゼ切断可能リンカー間のチオエーテル結合、あるいは他の切断可能ま たは切断可能でない化学結合を使用し得る。免疫毒素の部分を連結する手段はま た、標準的ペプチド合成化学または組換え手段によって別々に合成される部分間 に形成されるペプチジル結合を含み得る。 本発明のタンパク質部分の可能な化学的改変はまた、周知の方法に従って、循 環系における滞留時間を延長しそして免疫原性を減少させるためのポリエチレン グリコール（PEG）での誘導体化が含まれる（例えば、Lisiら，Applied Biochem ．4:19(1982)；Beauchampら，Anal．Biochem．131:25(1982)；およびGoodsonら ，Bio/Technology 8:343(1990)を参照のこと）。 免疫毒素のタンパク質の可能な遺伝子操作改変は、組換えDNA技術によって誘 導される単一遺伝子から発現される単鎖多機能性生合成タンパク質へのそれぞれ の関連の機能的ドメインの組み合わせを含む。（例えば、PCT公表出願WO/88/093 44を参照のこと）。さらに、組換えDNA技術は、組換えoncタンパク質および抗体 を連結するために使用され得る。したがって、免疫毒素は、oncタンパク質の一 方の末端で始まりそして抗体で終わる融合されたタンパク質を含み得る。 組換え融合タンパク質を産生する方法は、当業者に周知である。したがって、 例えば、Chaudharyら，Nature 339:394(1989)；Batraら，J．Biol．Chem．265:1 5198(1990)；Batraら，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA 86:8545(1989)；Chaudhar yら，Proc．Na'tl．Acad．Sci．USA 87:1066（1990）(すべては参考として援用 される)は、種々の単鎖抗体−毒素融合タンパク質の調製を記載する。 一般的に、免疫毒素融合タンパク質を産生する工程は、Fv軽鎖および重鎖なら びに使用されるoncタンパク質をコードするDNAを別々に調製する工程を包含する 。２つの配列は、特定の所望の融合タンパク質をコードする構築物を形成するた めにプラスミドまたは他のベクター中で組み合わされる。より単純なアプローチ は、所望のoncタンパク質を既にコードする構築物中に、特定のFv領域をコード するDNAを挿入する工程を包含する。 したがって、例えば、抗Ｂ細胞単鎖抗体／oncタンパク質免疫毒素をコードす るDNAは、所望のoncタンパク質またはその逆をコードするDNAを既に含む構築物 中に、抗体ＶHおよびＶL鎖（Fv領域）をコードするDNAに挿入する工程によって 、最も容易に調製される。Fv領域をコードするDNA配列は、当業者に周知の技術 を使用して構築物に挿入される。 哺乳動物細胞は、抗体−サイトカイン（Hoogenboomら，Biochem．Biophys．Ac ta 1096:345(1991)；Hoogenboomら，Mol．Immunol．28:1027(1991)）および抗体 −酵素（Casadeiら，Proc．Na'tl．Acad．Sci．USA 87:2047(1990)；Williamsら 、Gene 43:319(1986)）のようなハイブリッド分子を発現しそして分泌するため に使用されている。一部は、外来タンパク質の免疫原性は、組換えタンパク質に 存在する間違ったグリコシル化パターンによる。したがって、真核生物細胞株は 、発現されたタンパク質がグリコシル化されるので、原核生物細胞よりも好まし い。ヒト由来細胞株は、これらの細胞が末端グリコシドとしてシアル酸を組み込 む点で特に好ましい。ハムスターCHOおよびBHK、ならびにHEK-293ヒト線維芽細 胞株のような細胞株は、組換えヒトタンパク質を発現させるために使用されてい る。 本発明の免疫毒素のタンパク質部分の他の遺伝子操作改変は、タンパク質のサ イズを減少させるため、または溶解性に影響を及ぼす配列変化（例えば、システ インからセリン）もしくはグリコシル化部位のような、産生もしくは利用性を容 易にする他のパラメータを改変させるための、機能的に不必要なドメインの欠失 を含む。当業者は、タンパク質の多くの追加の周知の化学的および遺伝子改変が 、本発明の細胞傷害性試薬のように、非経口投与が意図される任意のタンパク質 に有利に適用され得ることを理解する。 本発明の好ましい免疫毒素は、毒性部分として配列番号１のアミノ酸配列を有 するタンパク質、および目的の細胞上の特異的細胞表面マーカーを結合するヒト 化抗体（より好ましくはＢ細胞に対する）を含む融合タンパク質である。oncタ ンパク質と抗体との間の融合タンパク質のこの独特の遺伝子結合の構築は、化学 的に結合した抗体／oncタンパク質結合体の異種性を排除する。これは、免疫毒 素の増加した効力および減少した免疫原性に寄与し得ると考えられる。 本発明は、本明細書に記載の新規タンパク質をコードする核酸構築物を含む。 核酸構築物は、適切なベクターに組み込まれる場合、宿主中で複製し得るもので ある。構築物は、プロモーターおよびエンハンサーのような構築物の発現に影響 を及ぼし得る他の配列に連結され得る。 本発明の免疫毒素は、腫瘍細胞の選択的殺傷に利用され得る。この方法は、選 択的に殺傷されるべき細胞のタイプで特異的または優先的に見られる細胞表面マ ーカーに結合する抗体の適切な選択に基づく。例えば、本発明の免疫毒素は、多 くが当該技術分野で公知である腫瘍細胞特異的表面マーカーに結合する抗体を含 むものを包含する。ヒト適用について好ましい実施態様では、抗体は、悪性を示 すＢ細胞を優先的に結合するヒト化単鎖タンパク質またはその改変形態である。 Ｄ．薬学的組成物 本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリア中に本発明の免疫毒素を含む薬学 的組成物に関する。治療的適用では、組成物は、疾患およびその合併症を治癒ま たは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で、疾患に苦しむ患者に投与さ れる。これを達成するために適切な量は、治療的有効量として定義される。この 使用に有効な量は、疾患の重篤度および患者の健康の一般状態に依存する。 好都合には、薬学的組成物は、非経口投与に適切である。本発明の免疫毒素は 、他の免疫毒素について当該技術分野で公知の方法に従って、例えば、体の種々 の部分で腫瘍を処置するための、異なる目的に適切な種々の手段によって投与さ れ得る。（例えば、Rybakら，Human Cancer Immunology，IMMUNOLOGY AND ALLER GY CLINICS OF AMERICA，W.B．Saunders，1990、およびそれに引用される参考文 献を参照のこと）。したがって、本発明はまた、本発明の免疫毒素および薬学的 に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物、特に、投与の上記の手段に適切であ るこのような組成物に関する。 組成物の単回または複数回投与は、患者によって必要とされおよび耐容される ような投与量および頻度に依存して投与され得る。いずれにしても、組成物は、 患者を効果的に処置するために本発明のタンパク質の十分量を提供すべきである 。 好ましくは、投与のための組成物は、普通、薬学的に受容可能なキャリア、好 ましくは水性キャリアに溶解された単鎖抗体およびoncタンパク質を含む融合タ ンパク質の溶液を含む。種々の水性キャリア、例えば、緩衝化生理食塩水などが 使用され得る。これらの溶液は、滅菌されており、そして一般的に望ましくない 物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得 る。組成物は、pH調節および緩衝化剤、毒性調節剤などのようなほぼ生理学的条 件に必要とされるような薬学的に受容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム 、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含み 得る。これらの処方物中の融合タンパク質の濃度は、広く変化し得、そして選択 された投与の特定の態様および患者の必要性に従って、主として液体容量、粘度 、体重などに基づいて選択される。 したがって、静脈内投与について代表的な薬学的組成物は、約0.01〜100mg/患 者/日である。0.1〜約1000mg/患者/日までの投与量は、特に、薬物が、腫瘍また は腫瘍がある器官へのような、遮断された部位におよび血流中以外に投与される 場合、使用され得る。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者 に公知であるかまたは明らかであり、そしてREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIEN CE，第15版，Mack Publishing Co.，Easton，PA，(1980)のような刊行物により 詳細に記載される。 さらに、本発明は、抗体の結合を可能にする条件下で殺傷されるべき細胞の表 面上の標的に特異的な抗体を有する本発明の選択的免疫毒素を使用する、細胞を 選択的に殺傷する方法に関する。細胞上の表面マーカーへの抗体の結合は、試薬 のoncタンパク質に細胞を選択的に殺傷させる。本発明のこの方法は、例えば、 照射によって骨髄除去を受けている患者への移植前の骨髄において、望ましくな いタイプの細胞を選択的に殺傷することによる、インビトロでの細胞分離に使用 され得る。 実施例 して抗体が腫瘍細胞、特にＢ細胞を認識する免疫毒素によって例示される。 実施例１：Rana pipiens からの天然のoncタンパク質および組み換えoncタンパク 質の産生 Ａ．天然のoncタンパク質の単離および精製 Rana pipiensからの卵母細胞の単離、卵のインビトロ受精、ならびにカエル胚 からの天然のoncタンパク質の単離および精製を記載する技術は、米国特許第5,5 59,212号および第5,728,805号に非常に詳述され、これらは両方とも参考として 本明細書に援用される。 Ｂ．組換えoncタンパク質の産生およびアッセイ 組換えoncタンパク質の産生を、PCT出願PCT/US97/02588に記載のように行った 。高分子量RNAおよびtRNAを使用するリボ核酸分解活性を、刊行されたプロトコ ル、Newtonら，J．Neurosci．14:538(1994)に従って、過塩素酸可溶性ヌクレオ チドの形成によって37℃にて決定した（Newtonら，Biochem．35:545(1996)を参 照のこと）。ポリ(A,C)、UpG、およびポリＵで、リボヌクレアーゼ活性を、Libo natiら，Biochim．et Biophys．Acta 788:356(1984)、ならびにLibonatiおよびF loridi，Eur．J．Biochem．8:81(1969)に従って分光光度法でアッセイした。簡 単にいえば、活性を、260nmでの吸光度の増加を測定することによってアッセイ した。インキュベーション混合物（1mLの10mMイミダゾール、0.1M NaCl、pH6.5 またはpH7）は、25℃にて基質および適切な量の酵素を含んでいた。MossmanのMT T方法を使用して、インビトロ翻訳アッセイ（St．Clairら，Proc．Nat'l．Acad ．Sci．USA 84:8330(1987))、および細胞生存率アッセイ（Pearsonら，J．Na'tl Cancer Inst．83:1386(1991)）を、既述のように行った。 実施例２：onc タンパク質の化学分析および組成 上記の天然のoncタンパク質は、化学的に十分特徴づけられている。天然のonc タンパク質と同じくらい十分に機能的であるために、組換えoncタンパク質が、 以下に記載のような化学的性質および構造を有するべきであると考えられる。 天然のoncタンパク質を、（タンパク質の均質性をアッセイするために使用さ れる標準試験によって確立されるように）均質まで精製した。電気泳動によって 、 天然のoncタンパク質の分子量を、約14,500ダルトンであると決定した。天然のo ncタンパク質の分子量を示す、列挙されたアミノ酸配列（以下を参照のこと）に 基づく分子量の算出は、11,860ダルトンであるべきである。しかし、金属イオン が、それらを除去するためのすべての努力にもかかわらずタンパク質に結合され 得、そして異なる同位体が含まれ得るので、質量分析法によって決定される天然 のoncタンパク質の分子量は12,430ダルトンであった。この矛盾を考慮して、質 量分析法によって決定される場合の製薬の分子量は、約12,000ダルトンであると 考えた。天然のoncタンパク質の等電点（pI）を、等電点電気泳動によって決定 した場合、約9.5と10.5との間であることを見いだした。天然のoncタンパク質の アミノ末端基をブロックし、そして本質的に炭水化物を含まないことを見いだし た（アントロンおよびオルシノール方法によって決定した場合）。 表１は、天然のoncタンパク質のアミノ酸組成を示す。 注１：トレオニン、システイン／２、およびメチオニンは、加水分解中に部分 的に破壊され、そしてこの値はこのような部分破壊のため正確ではない。 注２：この値は、不完全な加水分解のため正確ではない。 注３：トリプトファンは、破壊されるので、タンパク質の酸加水分解で検出さ れ得ず、そして結果として決定されずと示される。しかし、紫外スペクトルの分 析は、１分子当たり１つのトリプトファン残基の存在を示した。 天然のoncタンパク質を配列決定した。天然のタンパク質のN-末端はピログル タミン酸（＜Glu）である。これは、直接配列決定に必要な遊離アミノ基を欠き 、したがってタンパク質のN-末端を「ブロックする」グルタミン酸の環化誘導体 である。分子のアミノ末端を、既に引用されたPCT/US97/02588に記載のように分 子の組換え産生を容易にするように変更した。細胞傷害性RNaseの好ましいアミ ノ酸配列を、配列番号１に示す。 Ａ．材料および方法 lfacell Corp.から得て、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）に溶解した。少 なくとも１mg/mLのストック溶液を、アッセイについて希釈物を調製するまで、 −20℃で凍結させたままにした。すべての他の試薬を、既述の供給源から購入し た（Rybakら，J．Biol．Chem．266:21202(1991)；Newtonら，J．Biol．Chem．26 7:19572(1992)；Mikulskiら，Cell Tissue Kinet．23:237(1990)、これは参考と して本明細書に援用される）。 LL2は、ヒトＢ細胞上のCD22を認識しこれに特異的に結合するマウスモノクロ ーナル抗体である。LL2抗体を、Immunomedics，Inc．(Morris Plains，NJ)から 得た。RFB4もまた、CD22に結合するマウスモノクローナル抗体である。この抗体 は、Ancell Corp.を含む多くのソースから入手可能である。 ３つのバーキットリンパ腫細胞株（Daudi(ATCC CCL 213)、CA 46(ATCC CRL 16 48)、およびRaji(ATCC CCL 86)）を、10％ウシ胎仔血清（FCS）、２mMグルタミ ン、１mMピルビン酸ナトリウム、および10μg/mLゲンタマイシンを含むRPMI 164 0培地中で増殖した。ヒト皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞株であるHUT 102（ATCC TIB 1 62）も、補充したRPMI培地中で増殖した。すべての細胞を、５％C02湿潤雰囲気 中で37℃にてインキュベートした。 ジスルフィド連結した結合体を、以下の改変とともに、Newtonら，J．Biol．C hem．267:19572(1992)に記載のように調製した。抗体（12.5nmol）を、100mMホ ウ酸ナトリウム、pH8.5中の250nmol 2-イミノチオランおよび2.5mM5,5'ジチオビ ス(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）とともに、最終容量＜0.5mLで室温にて１時間イ ンキュベートした。反応混合物を、緩衝液Ａ（0.1M NaClを含む0.1M NaPO4，p アプライした。 トール（DTT）とともに２mMの最終DTT濃度で室温にて１時間還元し、そして緩衝 チオエーテル連結した結合体を、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスク シンイミドエステル（MBS）を使用して、Rybakら，Drug Delivery 1:3(1993)お よびNewtonら，In'tl J．Oncology 8:1095(1996)に従って調製した。簡単にいえ ば、LL2抗体（２mg）を、５倍モル過剰のMBS（ストック溶液、DMF中30mM）と ともに室温にて10分間インキュベートした。反応内容物を、緩衝液Ａで平衡化し 析し、次いで25mM DTT（最終濃度）とともに室温にて30分間インキュベーション そしてピーク画分をプールし、そしてMBS抗体に添加した。反応物を、室温にて 調製物中に存在するタンパク質の量を、UV分光法によって、次いで277nmで以 (1％)＝7.3；および免疫毒素、ε(1％)＝10。 元した免疫毒素のゲル電気泳動によって決定した。ゲルを、Image（NIH公共のド メインソフトウエア）を使用して分析した。 成分タンパク質を証明する還元条件下でSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 体結合体は、複数の高分子量形態からなった。チオール−ジスルフィド交換反応 における架橋基の反応性は、結合体の異種性を説明し得る。免疫毒素は、１〜２ 得、そして遊離抗体を含まないので、顕著な量の遊離抗体を含まないようであっ た。 ので、RFB4を含む免疫毒素はまた、悪性Ｂ細胞に対して細胞傷害性である。した 実施例４：インビトロ細胞生存率研究 タンパク質合成を、Rybakら，J．Biol．Chem．266:21202(1991)に記載のよう に測定した。細胞を３μCiの[3H]ウリジンでパルスした以外は、同じプロトコル を使用して、RNA合成を測定した。細胞数を、血球計数盤での直接計数によって 決定した。細胞のアリコートを、等容量の0.5％トリパンブルー排除染料ととも に５分間インキュベートし、そして生存細胞をスコアした。MTT比色アッセイ（M ossman，T.，J．Immunol．Methods 65:55(1983)）を、記載のように行った（Mik ulskiら，Cell Tissue Kinet．23:237(1990)）。 阻害についてのIC50を、表４に示す。 24時間後にＢ細胞においてタンパク質合成を50％阻害するために必要とされる より感受性であった。図１を参照のこと。 と比較して、24時間後にＢ細胞リンパ腫細胞に対して細胞傷害性ではなかった。 免疫毒素が、毒性部分が、ヒト非毒性RNase、好酸球由来神経毒（EDN）（図５） 、またはヒト膵臓RNase（図６）のいずれかである免疫毒素よりも、非常に効果 的であったことを証明する。 図５では、LL2またはLL1抗体を、上記のようにEDNに結合し、そしてDaujiまた はCA 46バーキットリンパ腫細胞でアッセイした。[]LL1およびLL2免疫毒素は、 免疫毒素が抗体およびRNase部分に分解されるリソソームに送達されると考えら れる。RNaseは、リソソームを離れて、そしてリボソーム活性を妨害するサイト 定される。したがって、サイトゾルにはいるタンパク質は、インタクトのままの 細胞毒素である。約75％のタンパク質合成のみを、LL2-膵臓RNaseの添加によってブロックした。 ソームによって分解されないという仮説を試験するために、125-I標識したLL2お よびLL2免疫毒素を、Daudi細胞に添加した。図７に示され得るように、指示し 5-I標識したタンパク質を含み、これは、免疫毒素を、LL2-EDNおよびLL2単独よ で分解されないようである。 素の毒性を媒介するという仮説を試験するために、免疫毒素を、過剰のLL2抗体 udi細胞で観察される細胞傷害性は、等モル量のLL2によって逆転した。これらの 介し得ることを示す。 seudomonas外毒素およびLL2-ドキソルビシン免疫毒素で処置した。 作用（死亡）を引き起こさなかった。比較として、マウスを、同様にPseudomona s外毒素のドメインIIの変異体に結合したLL2で処置した。見出され得るように、 この免疫毒素は致死性であった。したがって、免疫毒素の毒性部分としてのONCO 容されるようである。 *Kreitmanら，Cancer Res．53:819（1993） QD=毎日 QOD=隔日 ルビシンの効果を示す。マウスに、５×105Daudi細胞を静脈内で移植した。24時 間後、処置を、毎日５回の等用量で始めた。ドキソルビシン免疫毒素を静脈内注 較して、マウスの生存を著しく増強した。 ５×106DaudiＢリンパ腫細胞を静脈内に移植したSCIDマウスでは、腹腔内に注 ナル抗体LL2単独で処置したマウスと比較して、マウスの生存を延長することを 証明した。図７は、PBSで処置したすべての動物が、重篤なＢ細胞リンパ腫を発 症し、そして35日目までに屠殺したことを示す。LL2で処置した動物の全てを、 リンパ腫のため37日目までに屠殺した。他方では、免疫毒素で処置した動物の全 ては、37日にわたって生存した。免疫毒素で処置した最後の動物を、46日目に屠 殺した。 を腹腔内に100μg/投与/日で処置したSCIDマウスが、100日以上生存したことを 集団は、時間枠内に疾患のいくつかの徴候を示した。PBSコントロール群につい 存した。 実験の経過中に体重が増加した。RFB4は、Pseudomonas外毒素フラグメントに結 合した場合、免疫毒素が１日当たりに１回のみ与えられるマウスモデルにおいて １mg/kgのLD50を有した（Mansfieldら，Bioconj．Chem．7:557(1996)）。 びにLL2-Pseudomonas外毒素およびLL2-ドキソルビシンの免疫毒素と比較して、 であり、もしあるとしても副作用はほとんどないことを示す。 本明細書中、上記の特許および特許出願を含むすべての刊行物は、参考として 本明細書に援用される。 上記の発明は、明確さおよび理解の目的のためにいくらか詳細に説明されてい る。形態および詳細の種々の組み合わせもまた、本発明の範囲から逸脱せずに行 われ得ることは明らかである。
【手続補正書】 【提出日】平成１２年６月１２日（２０００．６．１２） 【補正内容】 請求の範囲 １．Ｂ細胞に特異的な表面マーカーに対する抗体に連結した測定可能なリボ核 酸分解活性を有するｏｎｃタンパク質を含む、選択的細胞傷害性試薬。 ２．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請 求項１に記載の試薬。 ３．前記ｏｎｃタンパク質が組換え手段によって産生される、請求項１に記載 の試薬。 ４．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、請 求項３に記載の試薬。 ５．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号２として同定された核酸分子によって コードされる、請求項３に記載の試薬。 ６．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の試薬。 ７．前記モノクローナル抗体がヒト化される、請求項６に記載の試薬。 ８．前記モノクローナル抗体が単鎖抗体である、請求項７に記載の試薬。 ９．前記抗体が、Ｂ細胞リンパ腫に特異的である、請求項１に記載の試薬。 １０．前記抗体が、ＲＦＢ４およびＬＬ２からなる群より選択される、請求項 ９に記載の試薬。 １１．前記表面マーカーがＣＤ２２である、請求項１に記載の試薬。 １２．前記表面マーカーがＣＤ７４である、請求項１に記載の試薬。 １３．前記抗体がＬＬ１である、請求項１２に記載の試薬。 １４．前記ｏｎｃタンパク質が、組換え融合によって前記抗体に結合される、 請求項１に記載の試薬。 １５．請求項１に記載の試薬をコードする、核酸配列。 １６．Ｂ細胞に特異的な細胞表面マーカーに対する抗体に連結した測定可能な リボ核酸分解活性を有するｏｎｃタンパク質を含む選択的細胞傷害性試薬を、薬 学的に受容可能なキャリアとともに含む、薬学的組成物。 １７．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、 請求項１６に記載の薬学的組成物。 １８．前記ｏｎｃタンパク質が組換え手段によって産生される、請求項１６に 記載の薬学的組成物。 １９．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、 請求項１８に記載の薬学的組成物。 ２０．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号２として同定された核酸分子によっ てコードされる、請求項１８に記載の薬学的組成物。 ２１．前記ｏｎｃタンパク質が、組換え手段によって前記抗体に結合される、 請求項１６に記載の薬学的組成物。 ２２．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の薬学的組成 物。 ２３．前記モノクローナル抗体がヒト化される、請求項２２に記載の薬学的組 成物。 ２４．前記モノクローナル抗体が単鎖抗体である、請求項２３に記載の薬学的 組成物。 ２５．前記抗体が、Ｂ細胞リンパ腫上に存在する表面マーカーに対する、請求 項１６に記載の薬学的組成物。 ２６．前記抗体が、ＲＦＢ４、ＬＬ１、およびＬＬ２からなる群より選択され る、請求項２５に記載の薬学的組成物。 ２７．Ｂ細胞に特異的な細胞表面マーカーに対する抗体に連結した測定可能な リボ核酸分解活性を有するｏｎｃタンパク質を含む選択的細胞傷害性試薬と、殺 傷させるべき細胞とを接触させる工程を包含する、悪性Ｂ細胞を殺傷する方法。 ２８．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、 請求項２７に記載の方法。 ２９．前記ｏｎｃタンパク質が組換え手段によって産生される、請求項２７に 記載の方法。 ３０．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、 請求項２９に記載の方法。 ３１．前記ｏｎｃタンパク質が、配列番号２として同定された核酸分子によっ てコードされる、請求項２９に記載の方法。 ３２．前記細胞表面マーカーがＣＤ２２である、請求項２７に記載の方法。 ３３．ＣＤ７４に対する抗体に連結した測定可能なリボ核酸分解活性を有する ｏｎｃタンパク質を含む選択的組換え細胞傷害性試薬と、殺傷させるべき細胞と を接触させる工程を包含する、ＣＤ７４細胞表面マーカーを有する悪性細胞を殺 傷する方法。 ３４．前記殺傷させるべき細胞が、神経芽細胞腫、黒色腫、および骨髄腫から なる群より選択される、請求項３３に記載の方法。 ３５．前記抗体がＬＬ２である、請求項３２に記載の方法。 ３６．前記細胞表面マーカーがＣＤ７４である、請求項２７に記載の方法。 ３７．前記抗体がＬＬ１である、請求項３６に記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｎ 9/22 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ライバック，スザンナ エム. アメリカ合衆国 メリーランド 20855, フレッデリック，ラウンド ヒル ロード 7411ビー (72)発明者 ニュートン，ダイアン エル. アメリカ合衆国 メリーランド 20855, ロックビル，ニュー ベッドフォード ド ライブ 15904 (72)発明者 ゴールデンバーグ，デイビッド エム. アメリカ合衆国 ニュージャージー 07945，メンドハム，プレザント バレー ロード 330

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．Ｂ細胞に特異的な表面マーカーに対する抗体に連結した測定可能なリボ核 酸分解活性を有するoncタンパク質を含む、選択的細胞傷害性試薬。 ２．前記oncタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求 項１に記載の試薬。 ３．前記oncタンパク質が組換え手段によって産生される、請求項１に記載の 試薬。 ４．前記oncタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、請求 項３に記載の試薬。 ５．前記oncタンパク質が、配列番号２として同定された核酸分子によってコ ードされる、請求項３に記載の試薬。 ６．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の試薬。 ７．前記モノクローナル抗体がヒト化される、請求項６に記載の試薬。 ８．前記モノクローナル抗体が単鎖抗体である、請求項７に記載の試薬。 ９．前記抗体が、Ｂ細胞リンパ腫に特異的である、請求項１に記載の試薬。 １０．前記抗体が、RFB4およびLL2からなる群より選択される、請求項９に記 載の試薬。 １１．前記表面マーカーがCD22である、請求項１に記載の試薬。 １２．前記表面マーカーがCD74である、請求項１に記載の試薬。 １３．前記抗体がLL1である、請求項１２に記載の試薬。 １４．前記oncタンパク質が、組換え融合によって前記抗体に結合される、請 求項１に記載の試薬。 １５．請求項１に記載の試薬をコードする、核酸配列。 １６．Ｂ細胞に特異的な細胞表面マーカーに対する抗体に連結した測定可能な リボ核酸分解活性を有するoncタンパク質を含む選択的細胞傷害性試薬を、薬学 的に受容可能なキャリアとともに含む、薬学的組成物。 １７．前記oncタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請 求項１６に記載の薬学的組成物。 １８．前記oncタンパク質が組換え手段によって産生される、請求項１６に記 載の薬学的組成物。 １９．前記oncタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、請 求項１８に記載の薬学的組成物。 ２０．前記oncタンパク質が、配列番号２として同定された核酸分子によって コードされる、請求項１８に記載の薬学的組成物。 ２１．前記oncタンパク質が、組換え手段によって前記抗体に結合される、請 求項１６に記載の薬学的組成物。 ２２．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の薬学的組成 物。 ２３．前記モノクローナル抗体がヒト化される、請求項２２に記載の薬学的組 成物。 ２４．前記モノクローナル抗体が単鎖抗体である、請求項２３に記載の薬学的 組成物。 ２５．前記抗体が、Ｂ細胞リンパ腫上に存在する表面マーカーに対する、請求 項１６に記載の薬学的組成物。 ２６．前記抗体が、RFB4、LL1、およびLL2からなる群より選択される、請求項 ２５に記載の薬学的組成物。 ２７．Ｂ細胞に特異的な細胞表面マーカーに対する抗体に連結した測定可能な リボ核酸分解活性を有するoncタンパク質を含む選択的細胞傷害性試薬と、殺傷 させるべき細胞とを接触させる工程を包含する、悪性Ｂ細胞を殺傷する方法。 ２８．前記oncタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請 求項２７に記載の方法。 ２９．前記oncタンパク質が組換え手段によって産生される、請求項２７に記 載の方法。 ３０．前記oncタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、請 求項２９に記載の方法。 ３１．前記oncタンパク質が、配列番号２として同定された核酸分子によって コードされる、請求項２９に記載の方法。 ３２．前記細胞表面マーカーがCD22である、請求項２７に記載の方法。 ３３．CD74に対する抗体に連結した測定可能なリボ核酸分解活性を有するonc タンパク質を含む選択的組換え細胞傷害性試薬と、殺傷させるべき細胞とを接触 させる工程を包含する、CD74細胞表面マーカーを有する悪性細胞を殺傷する方法 。 ３４．前記殺傷させるべき細胞が、神経芽細胞腫、黒色腫、および骨髄腫から なる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
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