JP2001506481A - ブラジキニンｂ▲下１▼レセプターをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 哺乳動物からブラジキニンＢ₁レセプターをコードするＤＮＡをクローニング及び特性決定した。組換えレセプターはｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジン及び他のＢ₁特異的リガンドと結合するレセプターを形成することができる。ＤＮＡは活性組換えタンパク質を産生する組換え宿主細胞で発現された。更に、組換え宿主細胞を利用してレセプター活性のモジュレーターの同定方法を確立し、レセプターモジュレーターを同定する。

Description

【発明の詳細な説明】 ブラジキニンＢ₁レセプターをコードするＤＮＡ 発明の背景 ２種の哺乳動物ブラジキニンレセプターサブタイプＢ₁及びＢ₂がその薬理特性 に基づいて定義されている（Ａ．Ｄｒａｙ， Ｍ．Ｐｅｒｋｉｎｓ， ＴＩＮＳ １６，９９−１０４（１９９３）， Ｄ．Ｐｒｏｕｄ， Ａ．Ｐ．Ｋａｐｌａ ｎ， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６，４９−８３（ １９８８））。ノナペプチドブラジキニン（ＢＫ）とデカペプチドＬｙｓ−ＢＫ （カリジン）はカリクレインのタンパク分解作用により高分子量タンパク質前駆 物質キニノーゲンから遊離される。これらのペプチドホルモンは速やかに分解す るため、局所効果を媒介すると予想される。ＢＫとカリジンはいずれもＢ₂レセ プターである。従って、これらのＢ₂レセプターアゴニストはカルボキシペプチ ダーゼにより分解されてＢ₁レセプターアゴニストｄｅｓ−Ａｒｇ⁹ＢＫ及びｄｅ ｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンを生じるか、又はアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に より分解されて不活性ペプチドを生じる。化合物がタンパク分解によりＢ₂から Ｂ₁へと変換する現象は、内在 キニンアゴニストだけでなく、数種の合成ペプチドアンタゴニストでも観察され ている（Ｋ．Ｗｉｒｔｈら， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈ ａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０５，２１７−２１８（１９９１）， Ｄ．Ｒｅｇｏ ｌｉら， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ ｙ １２７，２１９−２２４（１９８６））。ＢＫとカリジンは効力の等しいア ゴニストとしてＢ₂ブラジキニンレセプターサブタイプに作用する。他方、ＢＫ はＢ₁ブラジキニンレセプターサブタイプには完全に不活性である。Ｂ₁レセプタ ーを試験するためにｄｅｓ−Ａｒｇ⁹ＢＫが慣用的に使用されているが、Ｂ₁レセ プターの最も強力なアゴニストはｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンであると思われる（ Ｄ．Ｒｅｇｏｌｉら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａ ｃｏｌｏｇｙ １２７，２１９−２２４（１９８６））。 ブラジキニンとカリジンは平滑筋とある種のニューロンに存在するＢ₂レセプ ターを介して作用し、顕著な低血圧症を発症し、疼痛及び炎症の強力なメディエ ーターである（Ａ．Ｄｒａｙ，前出； Ｄ．Ｐｒｏｕｄ，前出）。他方、Ｂ₁レ セプターは大部分の正常組織では検出されておらず、主に病態生理状態 で作用すると思われる（Ａ．Ｄｒａｙ，前出）。Ｂ₁レセプターは元々、長期ｅ ｘ ｖｉｖｏインキュベーション後のみにウサギ大動脈片で観察されたｄｅｓ− Ａｒｇ⁹ＢＫに対する収縮性応答を通して発見された（Ｄ．Ｒｅｇｏｌｉ， Ｊ ．Ｂａｒａｂｅ， Ｗ．Ｋ．Ｐａｒｋ， Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５５，８５ ５−８６７（１９７７）； Ｄ．Ｒｅｇｏｌｉ， Ｆ．Ｍａｒｃｅａｕ， Ｊ． Ｂａｒａｂｅ， Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏ ｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５６，６７４−６７７（１９７８） ； Ｄ．Ｒｅｇｏｌｉ， Ｊ．Ｂａｒａｂｅ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ ｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２，１−４６（１９８０））。Ｂ₁レセプターのｄｅ ｎｏｖｏ合成はｉｎ ｖｉｖｏでは細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）で処理後（Ｄ．Ｃ ．Ｒｅｇｏｌｉ， Ｒ．Ｍａｒｃｅａｕ， Ｊ．Ｌａｖｉｇｎｅ， Ｅｕｒｏｐ ｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７１，１０５−１ １５（１９８１））及び抗原関節炎の動物モデル（Ｓ．Ｇ．Ｆａｒｍｅｒ，Ｂ． Ａ．ＭｃＭｉｌｌａｎ， Ｓ．Ｎ．Ｍｅｅｋｅｒ， Ｒ．Ｍ．Ｂｕｒｃｈ，Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｃｔｉｏｎ ３４，１９１−１ ９３（１９９１））で報告されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によると、インタ ーロイキン−１（ＩＬ−１）及びＩＬ−２をはじめとする多数のサイトカインが Ｂ₁レセプターの発現を誘導するメディエーターであると示唆されている（Ｄ． Ｒｅｇｏｌｉ，前出；Ｄ．Ｄｅｂｌｏｉｓ，Ｊ．Ｂｏｕｔｈｉｌｌｉｅｒ， Ｆ ．Ｍａｒｃｅａｕ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃ ｏｌｏｇｙ ９３，９６９−９７７（１９８８）； Ｄ．ｄｅＢｌｏｉｓ，Ｊ． Ｂｏｕｔｈｉｌｌｉｅｒ， Ｆ．Ｍａｒｃｅａｕ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎ ａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １０３，１０５７−１０６６（１９９ １）；Ｄ．ｄｅＢｌｏｉｓ， Ｊ．Ｂｏｕｔｈｉｌｌｉｅｒ， Ｒ．Ｍａｒｃｅ ａｕ， Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １７，１８７−１９８（１９ ８９））。これらの結果と、マウスマクロファージでＢ₁ブラジキニンレセプタ ーが活性化するとサイトカインを放出するという知見（Ｒ．Ｍ．Ｂｕｒｃｈ，Ｊ ．Ｒ．Ｃｏｎｎｏｒ， Ｃ．Ｗ．Ｔｉｆｆａｎｙ，Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｃ ｔｉｏｎ ２７，２５８−２６０ （１９８９）； Ｃ．Ｗ．Ｔｉｆｆａｎｙ， Ｒ．Ｍ．Ｂｕｒｃｈ， ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ２４７，１８９−１９２（１９８９））を結び付けると、Ｂ₁ レセプターは慢性炎症の重要なメディエーターであると予想される。有意義な ことに、Ｂ₁ブラジキニンレセプターアンタゴニストｄｅｓ−Ａｒｇ⁹［Ｌｅｕ⁸ ］ＢＫは継続炎症の動物モデルで痛覚過敏を緩和することが最近判明した（Ａ． Ｄｒａｙ，前出； Ｍ．Ｎ．Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｄ．Ｋｅｌｌｙ， Ｂｒｉｔｉ ｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１０，１４４１− １４４４（１９９３）； Ｍ．Ｎ．Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｅ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ａ．Ｄｒａｙ， Ｐａｉｎ ５３，１９１−１９７（１９９３））。このよう に、一連の報告からＢ₁ブラジキニンレセプターは炎症の病態生理に関与してい ると考えられる。Ｂ₁及びＢ₂レセプターはいずれも腎機能で生理的役割を果たし 得るが、健康な組織におけるＢ₁レセプターの役割についてはほとんど知られて いない（Ｎ．−Ｅ．Ｒｈａｌｅｂら， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ ｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １６２，４１９−４２７（１９８９）； Ｍ． Ｌｏｒｔｉｅ， Ｄ．Ｒｅｇｏｌｉ， Ｎ．−Ｅ．Ｒｈ ａｌｅｂ， Ｇ．Ｅ．Ｐｌａｎｔｅ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ ｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２６２，Ｒ７２−Ｒ７６（１９９２））。このよう にＢ₁レセプターは病理状態で明白に誘導され得るので、慢性炎症の治療にＢ₁レ セプターアンタゴニストを使用できるのではないかと予想される。Ｂ₂ブラジキ ニンレセプターのクローニングの結果、このレセプターはＧタンパク質に結合し たレセプターのスーパーファミリーの１員であることが判明した（Ａ．Ｅ．Ｍｃ Ｅａｃｈｅｒｎら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，７７２４ −７７２８（１９９１）； Ｓ．Ｊ．Ｐｏｗｅｌｌら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １５ ，４３５−４３８（１９９３）； Ｊ．Ｆ．Ｈｅｓｓ， Ｊ．Ａ．Ｂｏｒｋｏｗ ｓｋｉ， Ｇ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ， Ｃ．Ｄ．Ｓｔｒａｄｅｒ， Ｒ．Ｗ．Ｒａｎ ｓｏｍ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８ ４，２６０−２６８（１９９２）； Ｄ．Ｅｇｇｅｒｉｃｋｘ， Ｅ．Ｒａｓｐ ｅ， Ｄ．Ｂｅｒｔｒａｎｄ， Ｇ．Ｖａｓｓａｒｔ， Ｍ．Ｐａｒｍｅｎｔｉ ｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８７，１３０ ６−１３１３（１９９２））。ラットＢ₂ブラジキニン レセプターはアフリカツメガエル卵母細胞発現系（Ａ．Ｅ．ＭｃＥａｃｈｅｒｎ ら，前出）を使用してクローニングされ、この発現系は、Ｂ₂レセプターがＧタ ンパク質を介して作用してホスホリパーゼＣを活性化し、Ｃａ²⁺移動を可能にす ることを利用するものであった（Ｒ．Ｍ．Ｂｕｒｃｈ， Ｊ．Ａｘｅｌｒｏｄ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，６３７４−６３７８（１９８ ７）； Ｓ．Ｒ．Ｓｌｉｖｋａ， Ｐ．Ａ．Ｉｎｓｅｌ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ ２６３，１４６４０−１４６４７（１９８８））。最近では、ウサギ大動 脈及びラットメサンギウム培養細胞中のＢ₁ブラジキニンレセプターがホスホリ パーゼＣを活性化し、Ｃａ²⁺移動を生じることも報告されている（Ｋ．Ａ．Ｓｃ ｈｎｅｃｋ，前出； Ｍ．Ｉｓｓａｎｄｏｕ， Ｊ．−Ｍ．Ｄａｒｂｏｎ， Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５９，９ ２６３−９２６８（１９９１）； Ｍ．Ｍ．Ｔｒｏｐｅａ， Ｄ．Ｇｕｍｍｅｌ ｔ， Ｍ．Ｓ．Ｈｅｒｚｉｇ，Ｌ．Ｍ．Ｆ．Ｌｅｅｂ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇ， Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ ｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２６４，９３０− ９３７（１９９３））。更に、ヒト繊維芽細胞系ＷＩ−３８からのｍＲＮＡをア フリカツメガエルＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉs卵母細胞に注入した処、Ｂ₁及び Ｂ₂両者のブラジキニンレセプター活性が検出された（Ｅ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｍ．Ｊ．Ｃｏｎｄｅｒ， Ｓ．Ｂｅｖａｎ， Ｐ．ＭｃＩｎｔｙｒｅ， Ｍ． Ｗｅｂｂ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５８，２ ４３−２４９（１９９２））。２種のブラジキニンレセプターサブタイプのリガ ンドが似ているので、Ｂ₁及びＢ₂レセプター遺伝子は似ていると予想される。し かし、ゲノムサザン分析の結果によると、これらの２種のレセプターは高度に相 同ではない（Ａ．Ｅ．ＭｃＥａｃｈｅｒｎら，前出； Ｊ．Ｆ．Ｈｅｓｓら，Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５，１−８（１９９４））。 そこで、ヒトＢ₁レセプターをクローニングするために、本発明者らはＣａ²⁺移 動の指標として光タンパク質エクオリンを使用してアフリカツメガエル卵母細胞 による発現クローニングストラテジーに従った（Ｋ．Ｓａｎｄｂｅｒｇ， Ａ． Ｊ．Ｍａｒｋｗｉｃｋ， Ｄ．Ｐ．Ｔｒｉｎｈ， Ｋ．Ｊ．Ｃａｔｔ， ＦＥＢ Ｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２４１，１７７−１８０ （１９８８）； Ｅ．Ｇｉｌａｄｉ， Ｅ．Ｒ．Ｓｐｉｎｄｅｌ， ＢｉｏＴｅ ｃｈｎｉｑｕｅｓ １０，７４４−７４７（１９９１））。本発明者らは、Ｂ₂ ブラジキニンレセプターと３６％相同のアミノ酸配列をもつ、Ｇタンパク質に結 合したレセプターをコードするｃＤＮＡクローンを単離した。哺乳動物細胞で発 現されたこのクローン化レセプターの薬理特性から、このレセプターはＢ₁ブラ ジキニンレセプターであると確証される。発明の概要 ブラジキニンＢ₁レセプターをクローニングし、発現させ、特性を決定した。 組換え発現系を使用し、該レセプターをコードする機能的ＤＮＡクローンを単離 した。タンパク質の薬理的及び構造的特性と、アミノ酸配列及びヌクレオチド配 列を開示する。組換えタンパク質はレセプターのモジュレーターを同定するのに 有用である。この方法で同定されたモジュレーターは治療薬として有用である。 本明細書に記載するモジュレーターの非限定的な例としては、アゴニスト、アン タゴニスト、サプレッサー及びインデューサーが挙げられる。図面の簡単な説明 図１は、ヒトブラジキニンレセプターＢ₁のＤＮＡ配列を示す。 図２は、ヒトブラジキニンレセプタ−Ｂ₁のアミノ酸配列を示す。 図３は、１００ｎＭブラジキニン（白棒）及び２０ｎＭｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリ ジン（斜線棒）に応答する相対光単位をフラクション数の増加（サイズの減少） と共に示す。スクロース勾配サイズ分画したＩＬ−１βで誘導した等量のＩＭＲ −９０ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを卵母細胞に注入し、ブラジキニンアゴニストで攻 撃した。１００ｎＭブラジキニンで得られた相対光単位を５０で割り、２組のデ ータを同一グラフ上にプロットした。同様の勾配で分画したＲＮＡサイズマーカ ーを示すグラフも図面の上部に示す。 図４Ａ及びＢは、２０ｎＭｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンに応答する個体卵母細胞 のルミノメーターグラフを示す。ＡはＩＬ−１βで誘導したＩＭＲ−９０細胞か ら単離した全ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを使用して得られたシグナルを示す。Ｂはク ローン３３Ｅ９ｃＲＮＡを使用して得られたシグナルを示す。 図５は、ヒトＢ₁ブラジキニンレセプターを発現するＣＯＳ−７細胞からのＩ ｎＭ［³Ｈ］ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンの置換を化合物の濃度の増加と共に示す 。化合物の記号はｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジン（ｑ）、ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰［Ｌｅｕ⁹ ］カリジン（Δ）、カリジン（＊）、ＨＯＥ１４０（ｕ）、ｄｅｓ−Ａｒｇ⁹ブ ラジキニン（Ｏ）及びブラジキニン（Ｘ）である。詳細な説明 本発明は、Ｂ₁産生細胞から単離されたブラジキニンＢ₁レセプター（Ｂ₁）を コードするＤＮＡに関する。本明細書中で使用するＢ₁とは、Ｂ₁ブラジキニンレ セプターサブタイプとして特異的に機能し得るタンパク質を意味する。 Ｂ₁のアミノ酸及びＤＮＡ配列は従来解明されていなかった。Ｂ₁を産生するこ とが可能な細胞の非限定的な例としては、大動脈平滑筋細胞が挙げられる。Ｂ₁ を産生し得る細胞系の非限定的な例としては、ＩＭＲ−９０及びＷＩ−３８が挙 げられる。本発明に好適な細胞はＩＭＲ−９０細胞である。 他の細胞及び細胞系もＢ₁ｃＤＮＡの単離に使用するのに適している。適切な 細胞の選択は、完全細胞又は細胞抽出物でＢ₁活性をスクリーニングすることに より実施できる。Ｂ₁活 性の検出方法は当該技術分野で公知であり、ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジン、ｄｅｓ −Ａｒｇ⁹ブラジキニン、ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰Ｌｅｕ⁹カリジン及びｄｅｓ−Ａｒｇ⁹ Ｌｅｕ⁸ブラジキニン等のようにＢ₁レセプターサブタイプと反応することが知 られているリガンドと結合する能力を測定するか、又はｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジ ンもしくはｄｅｓ−Ａｒｇ⁹ブラジキニンにより媒介されるホスファチジルイノ シトール加水分解、細胞内貯蔵Ｃａ²⁺の放出もしくはアラキドン酸放出を測定す る。このようなアッセイでＢ₁活性をもつ細胞はＢ₁ＤＮＡの単離に適切であり得 る。 遺伝暗号は縮重しているので、特定アミノ酸をコードするために２種以上のコ ドンを使用することができ、従って、アミノ酸配列は１組の類似ＤＮＡオリゴヌ クレオチドの任意のものによりコードされ得る。このような組のただ１員のみが Ｂ₁配列と同一であり、適当な条件下でミスマッチをもっＤＮＡオリゴヌクレオ チドの存在下であってもＢ₁ＤＮＡとハイブリダイズすることが可能である。条 件が変わってもミスマッチをもっＤＮＡオリゴヌクレオチドは依然としてＢ₁Ｄ ＮＡとハイブリダイズし、Ｂ₁をコードするＤＮＡを同定及び単離することが できる。 特定生物からのＢ₁をコードするＤＮＡを使用して他の生物からＢ₁の相同体を 単離及び精製することもできる。このためには、第１のＢ₁ＤＮＡを適当なハイ ブリダイゼーション条件下でＢ₁の相同体をコードするＤＮＡを含むサンプルと 混合すればよい。ハイブリダイズしたＤＮＡ複合体を単離し、相同ＤＮＡをコー ドするＤＮＡを精製することができる。 特定アミノ酸をコードする種々のコドンには実質量の重複（redundancy）が存 在することが知られている。従って、本発明は同一アミノ酸の最終的翻訳をコー ドする別のコドンを含むＤＮＡ配列にも関する。本明細書の目的では、１個以上 の置換コドンをもつ配列を縮重変異体と定義する。発現されるタンパク質の最終 的な物性を実質的に変えない限り、ＤＮＡ配列又は翻訳タンパク質の突然変異も 本発明の範囲に含まれる。例えば、ロイシンをバリン、リシンをアルギニン、又 はグルタミンをアスパラギンに置換してもポリペプチドの機能性は変わらない。 天然に存在するペプチドとは異なる特性をもつペプチドをコードするように、 ペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変できることは知られている。ＤＮＡ配列 の非限定的な改変方法とし ては、部位特異的突然変異誘発が挙げられる。改変される特性の非限定的な例と しては、基質に対する酵素又はリガンドに対するレセプターの親和性が挙げられ る。 本明細書中で使用するＢ₁の「機能的誘導体」とは、Ｂ₁の生物活性に実質的に 類似する（機能的又は構造的）生物活性をもつ化合物を意味する。「機能的誘導 体」なる用語は、Ｂ₁の「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類 似体」及び「相同体」又は「化学的誘導体」も含む。「フラグメント」なる用語 はＢ₁の任意のポリペプチドサブセツトを意味する。「変異体」なる用語は完全 Ｂ₁分子又はそのフラグメントに構造及び機能が実質的に類似する分子を意味す る。ある分子がＢ₁に「実質的に類似」するのは、双方の分子が実質的に類似の 構造をもつか又は双方の分子が類似の生物活性をもつ場合である。従って、２つ の分子が実質的に類似の活性をもつならば、分子の一方の構造が他方には存在し ないか又は２種のアミノ酸配列が同一でないとしても、これらの分子は変異体で あるとみなされる。 「類似体」なる用語は、完全Ｂ₁分子又はそのフラグメントに機能が実質的に 類似する分子を意味する。 当該技術分野で公知の種々の手順の任意のものを使用してＢ₁ＤＮＡを分子的 にクローニングすることができる。これらの方法の非限定的な例としては、Ｂ₁ を含むｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーを適当な発現ベクター系で構築した後に Ｂ₁遺伝子を直接機能的に発現させる方法がある。別の方法としては、バクテリ オファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したＢ₁を含むｃＤＮＡ又は ゲノムＤＮＡライブラリーをＢ₁サブユニットのアミノ酸配列から設計した標識 オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングする方法がある。付加的方法とし ては、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクターで構築したＢ₁を含 むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーをＢ₁レセプターをコードする部分Ｄ ＮＡでスクリーニングする方法もある。この部分ＤＮＡは、精製Ｂ₁レセプター のアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計を介してＢ₁ＤＮ Ａフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅により得られる。別の方法では、Ｂ₁産生細 胞からＲＮＡを単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系を介してＲ ＮＡをタンパク質に翻訳する。ＲＮＡをペプチド又はタンパク質に翻訳すると、 Ｂ₁タンパク質の少なくとも一部が産生され、例えばＢ₁ レセプタータンパク質の活性又は抗Ｂ₁抗体との免疫反応性により同定すること ができる。この方法では、Ｂ₁産生細胞から単離したＲＮＡのプールにＢ₁タンパ ク質の少なくとも一部をコードするＲＮＡが存在するか否かを分析することがで きる。ＲＮＡプールを更に分画し、非Ｂ₁ＲＮＡからＢ₁ＲＮＡを精製することが できる。この方法により生成されたペプチド又はタンパク質を分析して得られた アミノ酸配列を使用し、Ｂ₁ｃＤＮＡを製造するためのプライマーを提供するこ ともできるし、翻訳に使用されたＲＮＡを分析し、Ｂ₁をコードするヌクレオチ ド配列を提供し、Ｂ₁ｃＤＮＡを製造するためのプローブを作成することもでき る。これらの方法は当該技術分野で公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ． ， Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９に記載されている。 他の型のライブラリー及び他の細胞又は細胞型から構築されたライブラリーも Ｂ₁をコードするＤＮＡを単離するために有 用であり得ることは当業者に容易に理解されよう。他の型のライブラリーの非限 定的な例としては、ＩＭＲ−９０細胞以外の細胞又は細胞系から誘導されるｃＤ ＮＡライブラリー、及びゲノムＤＮＡライブラリーが挙げられる。 Ｂ₁活性をもつ細胞又は細胞系から適切なｃＤＮＡライブラリーを調製できる ことは当業者に容易に理解されよう。Ｂ₁ｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡラ イブラリーを調製するのに使用する細胞又は細胞系の選択は、まず最初に本明細 書中に詳細に記載するリガンド結合アッセイを使用して細胞に随伴するＢ₁活性 を測定することにより実施できる。 ｃＤＮＡライブラリーの調製は当業者に周知の常法により実施することができ る。周知ｃＤＮＡライブラリー構築法は例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， Ｆｒ ｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）に記載されている。 Ｂ₁をコードするＤＮＡは適切なゲノムＤＮＡライブラリー からも単離できることも当業者に容易に理解されよう。ゲノムＤＮＡライブラリ ーの構築は、当業者に周知の常法により実施することができる。周知のゲノムＤ ＮＡライブラリー構築法は例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）に記載されている。 上記方法によりＢ₁遺伝子をクローニングするためには、Ｂ₁のアミノ酸配列が 必要であり得る。このためには、Ｂ₁タンパク質を精製し、手動配列決定又は自 動配列決定装置により部分アミノ酸配列を決定する。部分Ｂ₁ＤＮＡフラグメン トのＰＣＲ増幅用プライマーを作成するためには、全アミノ酸配列を決定する必 要はなく、タンパク質から６〜８アミノ酸の２つの領域の直鎖配列を決定する。 適切なアミノ酸配列が同定されたら、これらの配列をコードすることが可能な ＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重しているので、特定アミノ酸をコードす るために２種以上のコドン を使用することができ、従って、アミノ酸配列は１組の類似ＤＮＡオリゴヌクレ オチドの任意のものによりコードされ得る。このような組のただ１員のみがＢ₁ 配列と同一であり、適当な条件下でミスマッチをもつＤＮＡオリゴヌクレオチド の存在下であってもＢ₁ＤＮＡとハイブリダイズすることができる。条件が変わ ってもミスマッチをもつＤＮＡオリゴヌクレオチドは依然としてＢ₁ＤＮＡとハ イブリダイズし、Ｂ₁をコードするＤＮＡを同定及び単離することができる。 精製された生物学的に活性なＢ₁は数種の異なる物理的形態をとり得る。Ｂ₁は 発生期の完全長即ちプロセシングされていないポリペプチドとして存在してもよ いし、部分的にプロセシングされたポリペプチド又はプロセシングされたポリペ プチドの組み合わせとして存在してもよい。発生期の完全長Ｂ₁ポリペプチドは 、そのフラグメントの形成をもたらす特異的タンパク分解開裂により翻訳後修飾 され得る。１つのフラグメント又は複数のフラグメントの物理的会合はＢ₁に関 連する完全生物活性（ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジン及びｄｅｓ−Ａｒｇ⁹ブラジキ ニンの特異的結合）をもち得るが、Ｂ₁活性の程度は個々のＢ₁フラグメント及び 物理的に会合するＢ₁ポリペプチドフラ グメント間で相違し得る。 天然源、又は本明細書に記載する精製方法によって組換え宿主、から得られる 実質的に純粋な形態のＢ₁は、単一ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドで あることが認められる。Ｂ₁ポリペプチドは約４０．４ｋＤａの見かけの分子量 をもつことが判明した。 本明細書に記載する方法により得られるクローン化Ｂ₁ＤＮＡは、適切なプロ モーター及び他の適切な転写調節要素を含む発現ベクターに分子クローニングす ることにより組換えによって発現させることができ、原核又は真核宿主細胞に移 入し、組換えＢ₁を製造することができる。このような操作方法はＳａｍｂｒｏ ｏｋ，Ｊ．ら，前出に詳細に記載されており、当該技術分野で周知である。 本明細書では、発現ベクターは遺伝子のクローン化コピーの転写と適当な宿主 におけるそのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義される。このような ベクターは、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、菌類細胞及び動物細胞等の種々 の宿主で真核遺伝子を発現させるために使用することができる。 特別に設計されたベクターは、細菌−酵母又は細菌−動物細 胞又は細菌−菌類細胞又は細菌−無脊椎動物細胞等の宿主間でＤＮＡのシャトル ベクターとして機能できる。適当に構築された発現ベクターは、宿主細胞におけ る自律複製の複製起点、選択マーカー、制限数の有用な制限酵素部位、高コピー 数のための可能な因子(potential)及び活性プロモーターを含む。プロモーター は、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡと結合させてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配 列として定義される。強力なプロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロ モーターである。発現ベクターの非限定的な例としては、クローニングベクター 、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミド又はウイルスが挙げ られる。 種々の哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞で組換えＢ₁を発現させ ることができる。組換えＢ₁発現に適切な市販の哺乳動物発現ベクターの非限定 的な例としては、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰ Ｖ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２ −１２）（ＡＴＣ Ｃ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ａ ＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａ ｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及びλＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が挙げられる 。 種々の細菌発現ベクターを使用して細菌細胞で組換えＢ₁を発現させることが できる。組換えＢ₁発現に適切な市販の細菌発現ベクターの非限定的な例として は、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、λｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、 ｐｃＤＮＡII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）が挙げられる。 種々の菌類細胞発現ベクターを使用して菌類細胞で組換えＢ₁を発現させるこ とができる。組換えＢ₁発現に適切な市販の菌類細胞発現ベクターの非限定的な 例としては、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。 種々の昆虫細胞発現ベクターを使用して昆虫細胞で組換えＢ₁を発現させるこ とができる。組換えＢ₁発現に適切な市販の昆虫細胞発現ベクターの非限定的な 例としては、ｐＢｌｕｅ ＢａｃIII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。 Ｂ₁をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを使用して組換え宿主細胞でＢ₁を 発現させることができる。組換え宿主細胞は原核又は真核細胞のいずれでもよく 、非限定的な例としては大腸菌等の細菌、酵母等の菌類細胞、非限定的な例とし てヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯動物起源の細胞系を含む哺乳動物細胞、並び に非限定的な例としてショウジョウバエ及びカイコに由来する細胞系を含む昆虫 細胞が挙げられる。哺乳動物種に由来する適切な市販細胞系の非限定的な例とし ては、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ^-）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊ ｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ −１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５ １）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）が挙げ られる。 発現ベクターは、非限定的な例として形質転換、トランスフェクション、リポ フェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーション等の多数の方法 の任意のものを利用して宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを含む 細胞をクローニングにより増殖させ、個々に分析してＢ₁タンパク質を産生する か否かを判定する。Ｂ₁発現宿主細胞クローンの同定は数種の手段により実施す ることができ、非限定的な例としては抗Ｂ₁抗体との免疫反応性や、宿主細胞に 関連するＢ₁活性の存在（例えば、Ｂ₁特異的リガンド結合や、Ｂ₁特異的リガン ドとレセプターの反応により媒介される応答として定義されるシグナル形質導入 等）が挙げられる。 Ｂ₁ＤＮＡの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで製造された合成ｍＲＮＡ又は天然ｍ ＲＮＡを使用しても実施できる。合成ｍＲＮＡ又はＢ₁産生細胞から単離された ｍＲＮＡは、非限定的な例としてコムギ胚芽抽出物、網状赤血球抽出物等の種々 の無細胞系で有効に翻訳することができ、また、非限定的な例としてカエル卵母 細胞へのマイクロインジェクション等の細胞依存系でも有効に翻訳することがで き、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが好適である。 最適レベルのＢ₁活性及び／又はＢ₁タンパク質をもたらすＢ₁ＤＮＡ配列を決 定するためにＢ₁ＤＮＡ分子を構築することができ、このような分子の非限定的 な例としては、（約４０．４ｋＤａ＝約塩基２０９〜約塩基１２６７のタンパク 質をコードする）Ｂ₁ＤＮＡの完全長オープンリーディングフレーム及びＢ₁タン パク質をコードするＤＮＡの一部を含む数種の構築物等が挙げられる。全構築物 はＢ₁ＤＮＡの５’又は３’非翻訳領域を全く含まないように設計してもよいし 、その全部又は一部を含むように設計してもよい。Ｂ₁活性及びタンパク質発現 レベルは、これらの構築物を適当な宿主細胞に単独及び組み合わせて導入後に測 定することができる。トランジェントアッセイで最適発現を生じるＢ₁ＤＮＡカ セットの決定後、このＢ₁ＤＮＡ構築物を種々の発現ベクターに移し、非限定的 な例として哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌及び酵母細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）等の宿主細胞で発現させる。 トランスフェトした宿主細胞及びマイクロインジェクトした卵母細胞は次の方 法によりＢ₁レセプター活性レベルとＢ₁タンパク質レベルを定量することができ る。Ｂ₁レセプター活性の１試験方法は、特異的リガンドの結合の直接測定であ る。組 換え宿主細胞の場合には、Ｂ₁ＤＮＡを含むプラスミドのトランスフェクション 又は同時トランスフェクションにより実施される。卵母細胞の場合には、Ｂ₁の 合成又は天然ＲＮＡを注入する。発現を可能にするに十分な時間の経過後、Ｂ₁ 活性を測定する。Ｂ₁活性の１検出方法は、Ｂ₁ＤＮＡをトランスフェクトした宿 主細胞又はＢ₁ＲＮＡを注入した卵母細胞から調製した完全細胞又は細胞溶解物 中のＢ₁活性を直接測定する。Ｂ₁活性は、Ｂ₁レセプターの特徴を表す特異的リ ガンド結合又はＢ₁ＤＮＡもしくはＲＮＡを発現する宿主細胞中でＢ₁特異的モジ ュレーターにより媒介されるカルシウム移動もしくはホスファチジルイノシトー ル加水分解に対する応答により測定される。本明細書中に記載するモジュレータ ーの非限定的な例としては、アゴニスト、アンタゴニスト、サプレッサー及びイ ンデューサーが挙げられる。 組換え宿主細胞でＢ₁の発現後、Ｂ₁タンパク質を回収すると精製形態のＢ₁が 得られる。数種のＢ₁精製法が利用でき、使用に適している。本明細書中に記載 するように、組換えＢ₁は塩析、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除ク ロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー及 び疎水性相互作用クロマトグラフィーを種々に組み合わせるか又は個々に適用す ることにより細胞溶解物及び抽出物から精製することができる。 更に、組換えＢ₁は発生期の完全長Ｂ₁又はＢ₁のポリペプチドフラグメントに 特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体から作成した免疫アフィニティ ーカラムを使用することにより他の細胞タンパク質から分離することができる。 Ｂ₁に対する単一特異抗体は、Ｂ₁に対して反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清 から精製されるか、又はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５ ６，４９５−４９７（１９７５）の方法を使用してＢ₁に反応性のモノクローナ ル抗体として調製される。本明細書中で使用する単一特異抗体は、Ｂ₁に対して 均一結合特徴をもつ単一抗体種又は多重抗体種として定義される。本明細書中で 使用する均一結合とは、抗体種が上述のように特定抗原又はエピトープ（例えば Ｂ₁に関連するもの）と結合できることを意味する。Ｂ₁特異抗体は免疫アジュバ ントの存在下又は不在下で適当な濃度のＢ₁でマウス、ラット、モルモット、ウ サギ、ヤギ、ウマ等の動物、好ましくはウサギを免疫することにより製造される 。 最初の免疫前に免疫前血清を採取する。許容可能な免疫アジュバントと共に約 ０．１μｇ〜約１０００μｇのＢ₁を各動物に投与する。このような許容可能な 免疫アジュバントの非限定的な例としては、フロイント完全、フロイント不完全 、ミョウバン沈降物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍとｔＲＮ Ａを含む油中水エマルジョンが挙げられる。初期免疫は、好ましくはフロイント 完全アジュバント中のＢ₁を皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）又は両者の経路で多 重部位に投与する。各動物を一定間隔、好ましくは毎週採血し、抗体力価を測定 する。初期免疫後に動物にブースター注射してもよいし、しなくてもよい。ブー スター注射する動物は一般に同一経路でフロイント不完全アジュバント中の等量 の抗原を投与する。ブースター注射は、最大力価が得られるまで約３週間間隔で 行う。各ブースター免疫から約７日後又は単独免疫後毎週動物から採血して血清 を採取し、アリコートを約−２０℃で保存する。 Ｂ₁に対して反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウス、好ま しくはＢａｌｂ／ｃをＢ₁で免疫することにより製造される。上述のように等量 の許容可能なアジュバントに加えた約０．５ｍｌ緩衝液又は塩類溶液中の約０． １μｇ〜 約１０μｇ、好ましくは約１μｇのＢ₁をＩＰ又はＳＣ経路でマウスに免疫する 。フロイント完全アジュバントが好適である。マウスに０日目に初期免疫し、約 ３〜約３０週間放置する。免疫したマウスに、リン酸緩衝塩類溶液等の緩衝溶液 中の約０．１〜約１０μｇのＢ₁を静脈内（ＩＶ）経路により１回以上ブースタ ー免疫する。抗体陽性マウスからリンパ球を得るが、好ましくは免疫したマウス から当業者に公知の常法により脾臓を取り出すことにより脾リンパ球を得る。安 定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下で脾リンパ球を適当な融合パート ナー、好ましくはミエローマ細胞と混合することによりハイブリドーマ細胞を製 造する。融合パートナーの非限定的な例としては、マウスミエローマＰ３／ＮＳ １／Ａｇ４−１、ＭＰＣ−１１、Ｓ−１９４及びＳｐ２／０が挙げられ、Ｓｐ２ ／０が好適である。抗体産生細胞とミエローマ細胞を分子量約１０００、濃度約 ３０％〜約５０％のポリエチレングリコール中で融合する。融合ハイブリドーマ 細胞を当業者に公知の手順でヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補 充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させることにより選択 する。約１４、１８及び２１日目に増殖陽性ウェルから上清液を 集め、抗原としてＢ₁を使用して固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）等の イムノアッセイにより抗体産生をスクリーニングする。培養液を更にオクタロニ −沈降アッセイで試験し、ｍＡｂのイソタイプを判定する。抗体陽性ウェルから のハイブリドーマ細胞をＴｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎ ｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＫｒｕｓｅとＰａｔｅｒｓｏｎ編，Ａｃａｄｅ ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７３に所収のＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ Ａｇ ａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓの軟寒天法等の方法によりクローニングする。 モノクローナル抗体は、プリスタンで初期免疫感作したＢａｌｂ／ｃマウスに 初期感作から約４日後に約０．５ｍｌ／マウスの割合で約２×１０⁶〜約６×１ ０⁶個のハイブリドーマ細胞を注射することによりｉｎ ｖｉｖｏ製造される。 細胞移入から約８〜１２日後に腹水を採取し、当業者に公知の方法によりモノク ローナル抗体を精製する。 抗Ｂ₁ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ製造は、約２％のウシ胎児血清を含有するＤ ＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させ、十分な量の特異的ｍＡｂを得ることによ り行われる。ｍＡｂを当業者に公知の方法により精製する。 腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価は、非限定的な例として沈降、受動 凝集、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法等の種 々の血清学的又は免疫学的アッセイにより測定される。体液又は組織及び細胞抽 出物中のＢ₁の存在を検出するのにも同様のアッセイが使用される。 単一特異抗体の上記製造方法を使用してＢ₁ポリペプチドフラグメント又は発 生期の完全長Ｂ₁ポリペプチドに特異的な抗体を製造できることは当業者に容易 に理解されよう。特に、完全に機能的なレセプター又はそのフラグメントに特異 的な単一特異抗体を製造できることは当業者に容易に理解されよう。 Ｂ₁抗体アフィニティーカラムは、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有 結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化されたゲ ル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を加えることによ り作成される。次に、スペーサーアームとのアミド結合を介して抗体をゲルと結 合させる。次に残りの活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８） でクエンチする。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６） で洗浄して未結合抗体又は不純物タンパク質を除去する。次にリン酸緩衝塩類 溶液（ｐＨ７．３）でカラムを平衡化し、Ｂ₁を含む細胞培養上清又は細胞抽出 物をゆっくりとカラムに通す。次に、光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンド まで低下するまでカラムをリン酸緩衝塩類溶液で洗浄し、次いでタンパク質を０ ．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶離する。次に精製されたＢ₁タンパ ク質をリン酸緩衝塩類溶液で透析する。 ヒト胚繊維芽細胞系ＩＭＲ−９０がＢ₁ブラジキニンレセプターサブタイプを 発現することは既に報告されている（Ｒ．Ｈ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｍ．Ｗａ ｌｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５９，９２６３−９２６８（１９８４））。更に詳細な薬理的特性決定の結果 、細胞１個当たりＢ₁アゴニスト［³Ｈ］ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンに対する高親 和性結合部位約５０００個と、Ｂ₂アゴニスト［³Ｈ］ブラジキニンに対する高親 和性結合部位約７０，０００個の存在が判明した。ＩＭＲ−９０細胞中で発現さ れるＢ₁レセプターがｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンに応答してＣａ²⁺を移動させる 能力は、ＦＵＲＡ−２を指標として使用して立証された。更に、ＩＭＲ−９０細 胞をサイトカインＩＬ−１βで処理した処、Ｂ₁ブラジキニンレセプターの数を 約７倍に刺激することが判明した。これらのデータに基づき、ＩＬ−１βで誘導 したＩＭＲ−９０を発現クローニング用ｍＲＮＡ源として使用した。 ヒトＢ₁ブラジキニンレセプターをコードするｃＤＮＡクローンを発現クロー ニングによりＩＭＲ−９０繊維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離した。ＩＭ Ｒ−９０に由来するＲＮＡを注入したアフリカツメガエルＸｅｎｏｐｕｓ ｌａ ｅｖｉｓ卵母細胞でＣａ²⁺移動を媒介するＢ₁レセプターアゴニストｄｅｓ−Ａ ｒｇ¹⁰カリジンの能力の指標として光タンパク質エクオリンを使用した。Ｇタン パク質に結合したレセプターの特徴をもつ約３５３アミノ酸タンパク質をコード するオープンリーディングフレームを含む約１３０７ｂｐインサートをもつ単一 クローンを単離した。Ｂ₁ブラジキニンレセプターのアミノ酸配列はＢ₂ブラジキ ニンレセプターのアミノ酸配列に約３６％相同である。ＣＯＳ−７細胞で発現さ れるＢ₁ブラジキニンレセプターは、［³Ｈ］ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンに対して 高い親和性結合を示し、ブラジキニンに対して低い親和性を示す。Ｂ₁レセプタ ーアンタゴニストｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰［Ｌｅｕ⁹］カリジンはクローン化レセプタ ーからの［³Ｈ］ｄｅｓ− Ａｒｇ¹⁰カリジンに有効に置換するが、Ｂ₂レセプターアンタゴニストＨＯＥ１ ４０（Ｈｏｃｋ，Ｆ．Ｊ．ら， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈ ａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １０２，７６９−７７３（１９９１））はそうではない 。従って、発現されたレセプターはＢ₁レセプターサブタイプの薬理特徴をもつ 。Ｂ₁ブラジキニンレセプターは慢性炎症及び痛覚過敏に関連付けられており、 他方、Ｂ₂レセプターは急性炎症及び痛覚応答を媒介すると思われる。クローン 化ヒトＢ₁ブラジキニンレセプターを入手できる結果として、痛覚過敏等のＢ₁媒 介疾患及び症状、並びに急性及び慢性炎症過程に有用なモジュレーターを同定す ることができる。 本発明は更に、Ｂ₁をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現及びＢ₁タンパク質の ｉｎ ｖｉｖｏ機能を調節する化合物のスクリーニング方法にも関する。これら の活性を調節する化合物はＤＮＡＮＲＮＡ、ペプチド、タンパク質又は非タンパ ク性有機分子であり得る。化合物は、Ｂ₁をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの 発現又はＢ₁タンパク質の機能を増加又は低下させることにより調節することが できる。Ｂ₁をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現又はＢ₁タンパク質の機能 を調節する化 合物は種々のアッセイにより検出することができる。アッセイは単純な「イエス ／ノー」アッセイにより発現又は機能の変化の有無を判定することができる。ア ッセイは、試験サンプルの発現又は機能を標準サンプルの発現又は機能レベルと 比較することにより定量的に行うこともできる。 Ｂ₁ＤＮＡ、Ｂ₁に対する抗体又はＢ₁タンパク質を含むキットを調製すること ができる。このようなキットは、Ｂ₁ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを検出 するため、又はサンプル中のＢ₁タンパク質もしくはペプチドフラグメントの存 在を検出するために使用される。このような特性決定は、非限定的な例として法 廷分析及び疫学試験等の種々の目的に有用である。 本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体は、Ｂ₁ＤＮＡ 、Ｂ₁ＲＮＡ又はＢ₁タンパク質のレベルをスクリーニング及び測定するために使 用することができる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体を利 用してＢ₁の検出及びタイピングに適切なキットを調製できる。このようなキッ トは少なくとも１個の容器を閉鎖空間に保持するのに適した区画キャリヤーを含 む。キャリヤーは更に、Ｂ₁を検出するのに適した組換えＢ₁タンパク質又は抗Ｂ₁ 抗体等の試 薬を含む。キャリヤーは更に、標識抗原又は酵素基質等の検出手段を含んでいて もよい。 Ｂ₁をコードするＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を合成してアンチセ ンス療法に使用することもできる。これらのアンチセンス分子はＤＮＡ、ホスホ ロチオエートやメチルホスホネート等のＤＮＡの安定誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ −アルキルＲＮＡ等のＲＮＡの安定誘導体、又は他のＢ₁アンチセンスオリゴヌ クレオチド類似体であり得る。Ｂ₁アンチセンス分子はマイクロインジェクショ ン、リポソーム封入又はアンチセンス配列を含むベクターからの発現により細胞 に導入することができる。Ｂ₁アンチセンス療法は、Ｂ₁活性を低下させることが 有益である疾患の治療に特に有用であり得る。 Ｂ₁遺伝子療法は標的器官の細胞にＢ₁を導入するために使用することができる 。レシピエント宿主細胞に感染させることによりＢ₁ＤＮＡの移入を媒介するウ イルスベクターにＢ₁遺伝子を連結することができる。適切なウイルスベクター としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウ イルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルス等が挙げられる。あるいは、リガ ンド−ＤＮＡ結合体もしくはアデ ノウイルス−リガンド−ＤＮＡ結合体を使用するレセプター媒介標的ＤＮＡ移入 、リポフェクション膜融合又は直接マイクロインジェクション等の非ウイルス法 によりＢ₁ＤＮＡを遺伝子療法のために細胞に移入してもよい。これらの方法及 びその変法はｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ Ｂ₁遺伝子療法に適切である 。Ｂ₁遺伝子療法は、Ｂ₁活性を増加することが有益である疾患の治療に特に有用 であり得る。 Ｂ₁ＤＮＡ、Ｂ₁ＲＮＡもしくはＢ₁タンパク質を含む医薬的に有用な組成物、 又はＢ₁レセプター活性のモジュレーターは、医薬的に許容可能なキャリヤーの 混合等の公知方法により調製することができる。このようなキャリヤー及び調製 方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉ ｅｎｃｅｓに記載されている。有効な投与に適した医薬的に許容可能な組成物を 形成するためには、このような組成物は有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ又 はモジュレーターを含有する。 本発明の治療用又は診断用組成物は、Ｂ₁関連障害を治療又は診断するために 十分な量を個体に投与する。有効量は個体の症状、体重、性別及び年齢等の種々 の因子により異なる。他の 因子には投与方法もある。 医薬組成物は皮下、局所、経口及び筋肉内等の種々の経路により個体に投与す ることができる。 「化学的誘導体」なる用語は、通常は基本分子を構成しない付加的な化学部分 を含む分子を表す。このような部分は基本分子の溶解度、半減期、吸収等を改善 することができる。あるいは、これらの部分は基本分子の望ましくない副作用を 緩和するか又は基本分子の毒性を低下することができる。このような部分の例は Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを はじめとする種々の文献に記載されている。 本明細書に開示する方法により同定される化合物は、潜在毒性を最小限にしな がらＢ₁レセプター又はその活性の最適阻害を得るために日常的試験により決定 される適当な用量で単独で使用することができる。更に、他の薬剤を同時投与又 は逐次投与するのが望ましい場合もある。 本発明の別の目的は、本発明の新規治療方法で使用するのに適した局所、経口 、全身及び非経口医薬製剤を提供することである。本発明により同定された化合 物をＢ₁レセプターの調節 用活性成分として含有する組成物は、慣用投与用ビヒクル中で多種多様な治療剤 形で投与することができる。例えば、化合物は錠剤、カプセル（各々時限放出及 び徐放製剤を含む）、丸剤、散剤、粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁 液、シロップ及びエマルジョン等の経口剤形で投与してもよいし、注射により投 与してもよい。同様に、いずれも製薬分野で当業者に周知の剤形を使用して静脈 内（ボーラス及び注入の両者）、腹腔内、皮下、閉鎖(occlusion)を伴うかもし くは伴わない局所、又は筋肉内経路で投与してもよい。有効で非毒性量の所望の 化合物をＢ₁調節剤として使用することができる。 製剤の１日用量は０．０１〜１，０００ｍｇ／成人／日の広い範囲をとり得る 。経口投与では、治療すべき患者の症状に合わせて用量を調節するように有効成 分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、 １５．０、２５．０及び５０．０ｍｇを含有するスコアド（scored）又はアンス コアド（unscored）錠剤の形態で投与するのが好ましい。通常は、約０．０００ １ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量レベルで有効量の薬剤を投与 する。用量範囲はより特定的には約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜 １０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。Ｂ₁レセプターモジュレーターの用量は、所望 の効果に達するように組み合わせて調節する。他方、これらの種々の薬剤の用量 を個々に最適化し、各薬剤を単独で使用するよりも症状を軽減するような相乗効 果に達するように組み合わせてもよい。 有利なことには、本発明の化合物は１日に１回投与してもよいし、１日の合計 用量を１日に２、３又は４回に分けて投与してもよい。更に、本発明の化合物は 適切な鼻孔内ビヒクルの局所使用により鼻孔内に投与してもよいし、当業者に周 知の経皮パッチの形態を使用して経皮経路で投与してもよい。経皮送達系として 投与するためには、用量投与は当然のことながら投与期間を通して断続的よりも 連続的に行う。 ２種以上の活性物質を別々の製剤として併用投与するには、活性物質を同時に 投与してもよいし、時間をずらせて各々別々に投与してもよい。 本発明の化合物を使用する投与計画は、患者の型、種、年齢、体重、性別及び 症状、治療すべき症状の重篤度、投与経路、患者の腎及び肝機能、並びに使用す る特定化合物等の種々の因子に応じて選択する。通常の知識をもつ医師及び獣医 であれば、 症状の進行を予防、抑制又は阻止するために必要な薬剤の有効量を容易に決定し 、処方することができよう。毒性を生じずに効力を生じる範囲内の薬剤濃度に最 適精度で達するためには、標的部位の薬剤利用性の速度に基づく投与計画が必要 である。このためには、薬剤の分配、平衡及び排泄を考慮する必要がある。 本発明の方法では、本明細書に詳細に記載する化合物が活性成分を形成でき、 所期投与剤形、即ち経口錠剤、カプセル、エルキシル剤、シロップ等に応じて適 切に選択され且つ慣用医薬プラクティスに従う適切な医薬希釈剤、賦形剤又はキ ャリヤー（本明細書では「キャリヤー」材料と総称する）と混合して投与するの が一般的である。 例えば、錠剤又はカプセル形態で経口投与するには、活性薬剤成分をエタノー ル、グリセロール、水等のような医薬的に許容可能な非毒性経口不活性キャリヤ ーに配合することができる。更に、所望又は必要に応じて適切な結合剤、滑沢剤 、崩壊剤及び着色剤も混合物に配合し得る。適切な結合剤の非限定的な例として は、澱粉、ゼラチン、天然糖類（例えばグルコース又はβ−ラクトース）、トウ モロコシ甘味剤、天然及び合成ゴム （例えばアラビアゴム、トラガカントゴム）、又はアルギン酸ナトリウム、カル ボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ろう等が挙げられる。これ らの剤形で使用される滑沢剤の非限定的な例としては、オレイン酸ナトリウム、 ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢 酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。崩壊剤の非限定的な例としては 、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が挙げられ る。 液体剤形では、活性薬剤成分を合成及び天然ゴム（例えばトラガカントゴム、 アラビアゴム）、メチルセルロース等のような適切な風味入り懸濁剤又は分散剤 に配合することができる。利用可能な他の分散剤にはグリセリン等がある。非経 口投与には、滅菌懸濁液及び溶液が望ましい。静脈内投与が所望される場合には 、一般に適切な保存剤を含有する等張調製物を利用する。 活性薬剤成分を含有する局所調製物は、例えばアルコール類、アロエベラゲル 、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱油、ＰＰＧ２ミリスチル プロピオネート等の当業者に周知の種々のキャリヤー材料と混合し、例えばアル コール溶液、 局所クレンザー、クレンジングクリーム、スキンジェル、スキンローション、及 びクリーム又はジェル調製物中のシャンプーを形成することができる。 本発明の化合物は小さな単ラメラ小胞、大きな単ラメラ小胞及び多重ラメラ小 胞等のリポソーム送達系として投与することもできる。リポソームは、コレステ ロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリン等の種々のリン脂質から形 成することができる。 本発明の化合物は、化合物分子を結合した個々のキャリヤーとしてモノクロー ナル抗体を使用することにより送達することもできる。本発明の化合物は標的可 能な薬剤キャリヤーとしての可溶性ポリマーと結合することもできる。このよう なポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキ シプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミ ドフェノール、又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリ シンが挙げられる。更に、本発明の化合物は薬剤の制御放出を行うのに有用な類 の生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリε−カプロラクトン、ポリヒドロキ シ酪酸、ポリオルトエステル類、ポリアセタール 類、ポリジヒドロピラン類、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架橋又は 両親媒性ブロックコポリマー等と結合することができる。 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に制限され るものではない。 実施例１ ＲＮＡ単離 卵母細胞注入 アフリカツメガエル卵母細胞へのｍＲＮＡ又はｃＲＮＡの注入は確立プロトコ ルの改良により行った（Ａ．Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ ｈ， Ｂ．Ｄ．Ｈａｎｅｓ， Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４； Ｙ．Ｍ ａｓｕら，Ｎａｔｕｒｅ ３２９，８３６−８３８（１９８７））。０．１７％ トリケインで麻酔した白子又は着色Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ（アフリカツ メガエルの１種）から外科的に卵母細胞を取り出した。卵巣葉を切開し、宝石商 摂子で引き裂いた後、コラゲナーゼＢ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）２ｍｇ／ｍｌを含有するＯＲ−２（８２． ５ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂，５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）中に室温で２時間入れ、緩衝液を１時間毎に交換した。単離した 卵母細胞を上清が透明になるまでＯＲ−２で繰り返し洗浄した。５及び６期卵母 細胞を選択し、補充ＯＲ−２（１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂，０．５ｍｇ／ｍｌゲン タマイシン及び０．５ｍＭテオフィリンを含有するＯＲ−２）で一晩培養した。 まず最初に卵母細胞にＨ₂Ｏ中１又は２ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＮＡ４６ｎｌを注 入し、プールサイズが３０クローン未満になったらｃＲＮＡ濃度を４０ｎｇ／ｍ ｌまで低下させた。ＲＮＡはＮａｎｏｊｅｃｔ自動卵母細胞注射器（Ｄｒｕｍｍ ｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して注入し、Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗ ｎマイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用し て注射針を３．５”ドラモンド毛管から引き抜いた。ＲＮＡ注入から２〜３日後 に、従来記載されているように（Ｋ．Ｓａｎｄｂｅｒｇ， Ａ．Ｊ．Ｍａｒｋｗ ｉｃｋ， Ｄ．Ｐ．Ｔｒｉｎｈ， Ｋ．Ｊ．Ｃａｔｔ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅ ｒｓ ２４１， １７７−１８０（１９８８）； Ｅ．Ｇｉｌａｄｉ， Ｅ．Ｒ ．Ｓｐｉｎｄｅｌ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０， ７４４−７４７（１９９１））、４６ｎｌの１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁したエク オリン（Ｆｒｉｄａｙ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）９２ｎｇ を卵母細胞に注入した。翌日、２２５μｌのＯＲ−２を含むマイクロタイター皿 のウェルに入れた各卵母細胞をペプチドアゴニストで攻撃し、ＭＬ３０００マイ クロタイタープレートルミノメーター（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を使用してエクオリ ン光応答を測定した。本明細書の本文と図面の説明に記載したように数種のペプ チド（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で卵母細胞を攻撃した 。 ＩＬ−１βで誘導したＩＭＲ−９０細胞から調製したポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを アフリカツメガエルＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母細胞に注入した結果、Ｂ₁ アゴニストｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジン又はＢ₂アゴニストＢＫに応答してエクオ リンに媒介される発光が生じた（図３）。ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡをスクロース勾 配でサイズ分画し、フラクションを卵母細胞に注入し、卵母細胞がＢＫ又はｄｅ ｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンに応答する能力をアッセイした。Ｂ₁及びＢ₂レセプター転 写産物はサイズ分画により明白に分離した。ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジ ンに対する応答を媒介するｍＲＮＡは１．６〜１．８ｋｂの見かけの寸法を示し 、ＢＫに対する応答を媒介するｍＲＮＡは４．４〜４．６ｋｂの見かけの寸法を 有していた。ブラジキニン応答をコードするｍＲＮＡの見かけの寸法は、Ｂ₂ブ ラジキニンレセプター転写産物の従来決定されている寸法（Ａ．Ｅ．ＭｃＥａｃ ｈｅｒｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，７７２４−７７２ ８（１９９１）； Ｊ．Ｆ．Ｈｅｓｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃ ｏｌｏｇｙ ４５，１−８（１９９４））に一致する。 実施例２ ＲＮＡ分画 １０％ウシ胎児血清、グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、 ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＭＥＭでＩＭＲ− ９０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８６）を増殖させた。ｍＲＮＡ抽出よりも２時 間半前にＩＭＲ−９０細胞を２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔ ｅｍｓ）に暴露した。ＰｏｌｙＡｔｒａｃｔ ｍＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍ ｅｇａ）を使用してこれらの細胞からｍＲＮＡを精製し、Ｈ₂Ｏに２ｍｇ／ｍｌ の濃度で再懸濁した。 １５ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２５％ Ｎ −ラウロイルサルコシン中６→２０％の連続スクロース勾配でＩＭＲ−９０ｍＲ ＮＡをサイズ分画した。ＩＲ−１βで誘導したＩＭＲ−９０細胞からのｍＲＮＡ ４８０μｇを６５℃まで３分間加熱し、すぐに氷冷し、勾配にロードした。ＲＮ Ａを１８℃で１９時間７７，０００×ｇで遠心分離してサイズ分画した。各勾配 からのフラクション（４５０μｌ）を管の底から集め、ＯＤ２６０の吸光度をモ ニターした。フラクションを２回エタノール沈降させ、最終濃度１μｇ／μｌま で再懸濁した。同様の勾配にロードした９．４９〜０．２４Ｋｂ ＲＮＡマーカ ー（ＢＲＬ）８０μｇの移動パターンに基づいてＲＮＡ寸法決定を行った。ライブラリー構築 ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンに対して応答を与えたスクロース勾配からのピーク ＲＮＡフラクションを使用してｃＤＮＡライブラリーを作成した。ライブラリー は、第１鎖ｃＤＮＡ合成を開始するためにランダムヘキサマーとオリゴｄＴの組 み合わせを使用して哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３で構築した。フラクショ ン１４サイズで選択したｍＲＮＡ約３μｇの第１鎖ｃ ＤＮＡ合成は、ランダムヘキサマー５０ｎｇとＮｏｔＩオリゴｄＴオリゴヌクレ オチド４００ｎｇで開始し、ＢＲＬ ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII逆転写酵素（Ｇ ｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で合成した。第２鎖合成後、ＢｓｔＸＩ／ＥｃｏＲＩアダプ ター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を両端に連結し、ｃＤＮＡをＢＲＬ ｃＤＮＡサ イジングカラム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に通した。改変ポリリンカーを含むｐｃ ＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のＢｓｔＸＩ部位 にｃＤＮＡをクローニングした。プラスミドＤＮＡをＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。ライブラリーは１．９ｋｂの平均イン サート寸法をもつインサートを＞９０％含んでいた。 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡを合成するために使用した約５０ ００クローンのプールにライブラリーをプレーティングした。１００μｇ／ｍｌ アンピシリン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒 天プレート上に配置したＣｏｌｏｎｙ／Ｐｌａｑｕｅスクリーンフィルター（Ｎ ＥＮ／Ｄｕｐｏｎｔ）にコロニーをプレーティングした。レプリカフィルターを 作成し、細菌コロニーをＬＢブロス中で 掻き取り、凍結グリセロールストックを調製した。Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡ精製シ ステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してプラスミドＤＮＡを作成した。プラスミド ＤＮＡをＮｏｔＩで直鎖化し、ｍＣＡＰ ＲＮＡキャッピングキット（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ）でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡを合成した。 アフリカツメガエル卵母細胞に注入したｃＲＮＡの２５個のプールのうち、１ １個はｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンに応答してエクオリンに媒介される発光を示し た。最も強い応答を与えたプールを再プレーティングし、約８００クローンから なるプール２５個に分画した。８個のプールはｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンに対す る応答を示した。最強の陽性プールを電気生理学により更に試験し、Ｃａ²⁺感受 性Ｃｌ^-チャネルをモニターした。ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンはＢ₁レセプターア ンタゴニストｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰［Ｌｅｕ］⁹カリジンにより遮断された応答を生 じた。次に、このプールを約２５個の個体クローンからなる３２個のプールにサ ブ分割した。１４及び３４クローンを含む２個の陽性プールが確認された。個体 クローンからｃＲＮＡを調製し、アフリカツメガエル卵母細胞で分析した。３個 の個 体クローンはｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジン応答を誘発することが判明した（図４Ａ 及びＢ）。制限分析、サザンブロッティング及び予備ＤＮＡ配列分析の結果、こ れらの個体クローンは似ていることが判明した。１個のクローン３３Ｅ９を選択 して更にＤＮＡ配列分析、発現及び薬理特性決定した。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ ＳＢ）を使用する手動配列決定又はＡＢＩ３７３Ａシークエンシングユニット（ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用する自動配列決定により両鎖のＤＮＡ配列を 決定した。Ｂ₁レセプターの一次構造 約１３０７ｂｐクローン３３Ｅ９のＤＮＡ配列は約１０５９ｂｐのオープンリ ーディングフレームを含む（図１及び２）。ヌクレオチド約２０９位置の提案さ れる開始メチオニンはＫｏｚａｋ配列（Ｍ．Ｋｏｚａｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０８，２２９−２４１（１９８９））の−３位 でなく＋４位に一致する。約２０８ヌクレオチド推定５’非翻訳配列は、多種多 様のヒトＤＮＡ配列に対して比較的高度のヌクレオチド相同の領域を含み、ヒト 反復要素を示唆する。明白な反復要素は数個の別々に誘導されたｃＤＮＡクロー ン中に検出されたので、ｍＲＮＡ転写産物の真正部分で あると思われる。クローン３３Ｅ９のオープンリーディングフレームとヒトＢ₂ レセプターをコードするＤＮＡ（Ｓ．Ｊ．Ｐｏｗｅｌｌら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １５，４３５−４３８（１９９３）； Ｊ．Ｆ．Ｈｅｓｓ， Ｊ．Ａ．Ｂｏｒｋ ｏｗｓｋｉ， Ｇ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ， Ｃ．Ｄ．Ｓｔｒａｄｅｒ，Ｒ． Ｗ． Ｒａｎｓｏｍ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ ．１８４，２６０−２６８（１９９２）； Ｄ．Ｅｇｇｅｒｉｃｋｘ， Ｅ．Ｒ ａｓｐｅ，Ｄ．Ｂｅｒｔｒａｎｄ， Ｇ．Ｖａｓｓａｒｔ， Ｍ．Ｐａｒｍｅｎ ｔｉｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８７，１ ３０６−１３１３（１９９２））の間のＤＮＡ配列相同は５４％である。これは 、ゲノムサザン分析でこの遺伝子を検出できないことに一致する（Ａ．Ｅ．Ｍｃ Ｅａｃｈｅｒｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，７７２４− ７７２８（１９９１）； Ｊ．Ｆ．Ｈｅｓｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒ ｍａｃｏｌｏｇｙ ４５，１−８（１９９４））。 オープンリーディングフレームによりコードされる提示アミノ酸配列は、Ｂ₂ ブラジキニンレセプターに３６％相同である。 アミノ酸配列の疎水性プロットは、Ｇタンパク質に結合したレセプターの特徴を 表す７個の潜在膜貫通領域を示す（Ｈ．Ｇ．Ｄｏｈｌｍａｎ， Ｊ．Ｔｈｏｒｎ ｅｒ， Ｍ．Ｇ．Ｃａｒｏｎ， Ｒ．Ｊ．Ｌｅｆｃｏｗｉｔｚ， Ａｎｎ．Ｒｅ ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０，６５３−６８８（１９９１）； Ｃ．Ｄ．Ｓｔｒａ ｄｅｒ， Ｉ．Ｓ．Ｓｉｇａｌ， Ｒ．Ａ．Ｆ．Ｄｉｘｏｎ， ＦＡＳＥＢ ３ ，１８２５−１８３２（１９８９））。Ｇタンパク質に結合したほぼ全レセプタ ーで第１及び第２の細胞外ループ間にジスルフィド結合を形成する２個の保存Ｃ ｙｓ残基も配列中に存在する。配列のＮ末端領域には２個の潜在Ｎ結合グリコシ ル化部位が存在し、第２の細胞外ループ領域には１個の推定Ｎ結合グリコシル化 部位が存在する。細胞内ドメイン２とカルボキシ末端尾部には潜在プロテインキ ナーゼＣリン酸化部位が存在する。Ｇタンパクに結合した他のレセプターの類似 の潜在リン酸化部位は、アゴニスト刺激後のレセプターの短期間脱感作に関連付 けられている。 実施例３ Ｂ₁レセプターのゲノムＤＮＡクローニング ヒト包皮繊維芽細胞ＨＳＦ４２細胞から単離したゲノムＤＮ Ａを使用してコスミドｓＣＯＳベクターでヒトゲノムＤＮＡライブラリーを構築 する（Ｃｈａｒｔｒａｉｎ，Ｎ．Ａ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９，６７６５−６７７２（１９９４））。 ヒト細胞のゲノムＤＮＡから構築した組換えＤＮＡライブラリーを各プレート当 たり約３０，０００コロニーの密度でコロニー／プラークスクリーンハイブリダ イゼーショントランスファーメンブラン（Ｄｕｐｏｎｔ／ＮＥＮ）にプレーティ ングする。マスタープレートのレプリカを溶解させ、標準プロトコル（Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ ａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）を使 用してハイブリダイゼーションのために処理する。ＤＮＡをＳｔｒａｔａｌｉｎ ｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で膜とＵＶ架橋する。フィルターを５０％ホル ムアルデヒドハイブリダイゼーション溶液［５×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ ，１００μｇ／ｍｌ ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）］中で放射性標 識プローブと共に４２℃で一晩インキュベートする。［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（３ ０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下でランダムプライムラベリング（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によりヒトＢ₁ブラ ジキニンレセプターのコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントからなるプロ ーブを作成する。フィルターを４２℃で０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳの最終 ストリンジェンシーで洗浄する。陽性サンプルを再スクリーニングし、単一コロ ニーを単離する。陽性コロニーからＤＮＡを調製し、制限酵素で消化し、サザン ブロット分析を行い、サブクローニング用制限フラグメントを同定する。フラグ メントをｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングする。 実施例４ 哺乳動物発現ベクターへのＢ₁ｃＤＮＡのクローニング 哺乳動物細胞発現及び特性決定 Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを使用するエレクトロポレーションに よりＣＯＳ−７細胞でクローン化Ｂ₁ブラジキニンレセプターのトランジェント 発現を行った。トランスフェクションから３日後に、従来の記載通りに完全細胞 結合アッ セイのために細胞を処理する（Ｋ．Ａ．Ｓｃｈｎｅｃｋ， Ｊ．Ｆ．Ｈｅｓｓ， Ｇ．Ｙ．Ｓｔｏｎｅｓｉｆｅｒ， Ｒ．Ｗ．Ｒａｎｓｏｍ， Ｅｕｒｏｐｅａ ｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｃｔｉｏｎ ２６６，２７７−２８２（１９９ ４））か、又は従来の記載通りに膜を調製し（Ｈｕａｎｇ，Ｒ．−Ｒ．Ｃ．， Ｄｅｈａｖｅｎ，Ｒ．Ｎ．， Ｃｈｅｕｎｇ，Ａ．Ｈ．， Ｄｉｅｈｌ，Ｒ．Ｅ ．， Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．Ｆ．， Ｓｔｒａｄｅｒ，Ｃ．Ｄ．， Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３７，３０４−３１０（１９９０））、 次のように放射性リカンド結合を測定した。置換試験は種々の濃度の競合化合物 の存在下で１ｎＭ［ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰］，［３，４−³Ｈ（Ｎ）］−カリジン（ ＮＥＮ）を用いて実施した。結合アッセイは室温で４５分間行った。予め０．３ ％ポリエチレンイミンに短時間浸漬させておいたガラスファイバーフィルター（ Ｉｎｏｔｅｃｈ）上でＩｎｏｔｅｃｈ細胞ハーベスターを使用して濾過すること により反応を停止した。フィルターを各ウェル当たり１ｍｌの冷ＰＢＳで５回洗 浄し、液体シンチレーションカウンターで計数した。別法では、 ０．３％ポリエチレンイミンに予め浸漬させておいたガラスファイバーフィルタ ー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，１２０５ Ｂｅｔａｐｌａｔｅで使用するための印刷 フィルターマット）上でＴｏｍｔｅｃ細胞ハーベスター９６を使用して反応物を 収集した。フィルターを各ウェル当たり合計１０ｍｌの冷１×ＰＢＳで５回洗浄 し、乾燥し、シンチレーション液を入れた袋（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に密封した 。ＬＫＢ１２０５ Ｂｅｔａｐｌａｔｅ液体シンチレーションカウンターを使用 して計数を行った。 Ｂ₁ブラジキニンレセプタークローン３３Ｅ９をＣＯＳ−７細胞にトランスフ ェクトし、発現されたレセプターの薬理特性を決定した。［³Ｈ］ｄｅｓ−Ａｒ ｇ¹⁰カリジンとの飽和結合データのスキャッチャード分析は、約１．０ｎＭのＫ_d と約１２０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質のＢ_maxを示した。モックトランスフェク トしたＣＯＳ−７細胞は［³Ｈ］ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンとの特異結合を含ま ない。 数種のブラジキニンレセプターアゴニスト及びアンタゴニストがクローン化レ セプターからの１ｎＭ［³Ｈ］ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンに置換する能力を調べ た（図５、表１）。クロー ン化レセプターからのブラジキニンによる１ｎＭ［³Ｈ］ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリ ジンの置換のＩＣ₅₀は＞１０μＭである。このレセプターはブラジキニンに対す る親和性が低く且つｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンに対する親和性が高いので、この クローン化ブラジキニンレセプターはＢ₁サブタイプである可能性が強い。競合 結合試験の結果、クローン化ヒトレセプターでキニンアゴニストに対する親和性 の順位はｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジン＞カリジン＞ｄｅｓ−Ａｒｇ⁹ブラジキニン ＞＞ブラジキニンであった。これは、ウサギＢ₁ブラジキニンレセプターで報告 されている力価の順位と非常によく似ており、ＩＭＲ−９０細胞でＢ₁レセプタ ーに観察される順位に一致する（表１）。クローン化ヒトレセプター及びＩＭＲ −９０細胞におけるＢ₁レセプターの両者とも、ウサギ大動脈でＢ₁レセプターに 対して高い親和性をもつと報告されている（Ｋ．Ａ．Ｓｃｈｎｅｃｋ， Ｊ．Ｆ ．Ｈｅｓｓ， Ｇ．Ｙ．Ｓｔｏｎｅｓｉｆｅｒ，Ｒ．Ｗ．Ｒａｎｓｏｍ， Ｅｕ ｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ−Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｃｔｉｏｎ ２６６，２７７−２８ ２（１９９４）； Ｄ．Ｒｅｇｏｌｉ， Ｊ．Ｂａｒａｂｅ， Ｐｈａｒｍａｃ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２，１−４６（１９８０））「従来の」Ｂ₁レセプターアゴニストｄｅｓ−Ａ ｒｇ⁹ブラジキニンに対して比較的低い親和性を示す。ヒト大動脈に存在するＢ₁ ブラジキニンレセプターもｄｅｓ−Ａｒｇ⁹ブラジキニンに対して比較的低い親 和性をもつ（＞１０００ｎＭ， Ｒ．Ｗ．Ｒ，未公開データ）。ウサギではｄｅ ｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンよりもｄｅｓ−Ａｒｇ⁹ブラジキニンに対する親和性のほ うが低いという事実（Ｋ．Ａ．Ｓｃｈｎｅｃｋ， Ｊ．Ｆ．Ｈｅｓｓ， Ｇ．Ｙ ．Ｓｔｏｎｅｓｉｆｅｒ， Ｒ．Ｗ．Ｒａｎｓｏｍ， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏ ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒ ｍａｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｃｔｉｏｎ ２６６，２７７−２８２（１９９４）； Ｄ．Ｒｅｇｏｌｉ， Ｊ．Ｂａｒａｂｅ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２，１−４６（１９８０））と上記結果を結び付けると、Ｂ₁ レセプターに対する最も強力な天然リガンドはｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンであ ると予想される。従って、ここでクローニングしたＢ₁レセプターはウサギ大動 脈中に存在するＢ₁レセプターのヒト相同体であると思われ、ｄｅｓ−Ａｒｇ⁹ブ ラジキニンに対するヒトレセプターの低親和性は種の相違の結果であると思われ る。表１ 一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞（ＣＯＳ３３Ｅ９）におけるク ローン化ヒトＢ₁ブラジキニンレセプターとＩＭＲ−９０細胞（ＩＭＲ−９０） におけるＢ₁レセプターのペプチド結合特性の比較。 上記膜結合アッセイにおける１ｎＭ［³Ｈ］ｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰カリジンの置換 によりＩＣ₅₀を決定した。 数種のブラジキニンレセプターアンタゴニストが１ｎＭ［³Ｈ］ｄｅｓ−Ａｒ ｇ¹⁰カリジンに置換する能力も分析した。クローン化レセプターはＢ₁特異的ア ンタゴニストｄｅｓ−Ａｒｇ¹⁰［Ｌｅｕ⁹］カリジン及びｄｅｓ−Ａｒｇ⁹［Ｌｅ ｕ⁸］ブラジキニンに対して高い親和性結合をもつ（図５、表１）。強力なＢ₂特 異的アンタゴニストＨＯＥ１４０はクローン化レセプターに対して非常に低い親 和性をもつ。他方、ＨＯＥ１４０からＣ末端Ａｒｇを除去すると、Ｂ₁レセプタ ーに予想されるように親和性の有意増加が生じる（Ｋ．Ｗｉｒｔｈら，Ｅｕｒｏ ｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０５，２１７ −２１８（１９９１））。従って、クローン化レセプターとブラジキニンレセプ ターアンタゴニストの相互作用は、Ｂ₁レセプター分類に一致する。 要約すると、本発明者らは発現クローニングストラテジーを利用してヒトＢ₁ ブラジキニンレセプターをコードするクローンを単離した。このレセプターは、 アフリカツメガエル卵母細胞で発現させるとＢ₁レセプターアゴニストｄｅｓ− Ａｒｇ¹⁰カリジンに機能的に応答する能力に基づいて単離した。クローン化レセ プターは、Ｂ₂ブラジキニンレセプターにアミノ酸配 列が最もよく似たＧタンパク質結合レセプターである。哺乳動物細胞で発現させ たクローン化レセプターの薬理特性は、Ｂ₁ブラジキニンレセプター分類の特徴 を表す。 実施例５ 大腸菌発現ベクターへのＢ₁ｃＤＮＡのクローニング 組換えＢ₁は、非限定的な例としてｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）等の大腸菌発 現ベクターにＢ₁発現カセットを移入後に大腸菌で産生される。ｐＥＴベクター は厳密に調節されたバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下にＢ₁発現を 置く。誘導ｌａｃプロモーターにより誘導されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子 の染色体コピーを含む大腸菌宿主にこの構築物を移入後、適当なｌａｃ基質（Ｉ ＰＴＧ）を培養物に加えるとＢ₁の発現が誘導される。Ｂ₁発現レベルは本明細書 に記載するアッセイにより決定される。 Ｂ₁の完全オープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをｐＥＴ１１ ａのＮｄｅＩ部位に挿入する。正方向の構築物を配列分析により同定し、発現宿 主株ＢＬ２１を形質転換するために使用する。その後、形質転換細胞を使用して Ｂ₁タンパク質の産生のために培養物に接種する。培養物は、当業者に 公知の組成のＭ９又はＺＢ培地で増殖させることができる。ＯＤ₆₀₀＝１．５ま で増殖後、３７℃で３時間１ｍＭ ＩＰＴＧでＢ₁の発現を誘導する。 実施例６ 昆虫細胞発現用ベクターへのＢ₁ｃＤＮＡのクローニング Ｓｆ９系の昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ＃１７１１）でｃＤＮＡの高レベル発 現を提供するように、ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムに由来するバキュロウイルス ベクターを設計する。以下の標準方法（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｍａｘｂａｃ Ｍａｎｕａｌ）によりＢ₁ｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウイルスを作成す る。ｐＡＣ３６０及びＢｌｕｅＢａｃベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を含む 種々のバキュロウイルストランスファーベクターのポリヘドリン遺伝子にＢ₁ｃ ＤＮＡ構築物を連結する。バキュロウイルストランスファーベクターと直鎖化Ａ ｃＮＰＶゲノムＤＮＡ［Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．， Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ． １８，５６６７（１９９０）］をＳｆ９細胞に同時トランスフェクション後に相 同的組換えにより組換えバキュロウイルスが生成される。組換えｐＡＣ３６０ウ イルスは感染細胞中の封入体の不在により同定され、組換えｐＢｌｕ ｅＢａｃウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現に基づいて同定される（Ｓｕｍｍ ｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．とＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ ｒｅ Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５）。プラー ク精製後、本明細書に記載のアッセイによりＢ₁発現を測定する。 Ｂ₁の完全オープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅ ＢａｃIIのＢａｍＨＩ部位に挿入する。正方向の構築物を配列分析により同定し 、直鎖ＡｃＮＰＶ野生型ＤＮＡの存在下でＳｆ９細胞にトランスフェクトするた めに使用する。 感染細胞に随伴する真正活性Ｂ₁が見いだされる。活性Ｂ₁を低張液又は界面活 性剤溶解により感染細胞から抽出する。 あるいは、ヒトＢ₁レセプターは誘導メタロチオニンプロモーターの下流でそ の制御下にあるＢ₁レセプターＤＮＡを含むベクターとＧ４１８耐性ネオマイシ ン遺伝子をコードするベクターでＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞を同時トランスフェ クトすることによりショウジョウバエＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞系で発現される 。Ｇ４１８の存在下で増殖後、耐性細胞が得られ、ＣｕＳＯ₄を加えることによ りＢ₁レセプターを発現するよう に誘導される。Ｂ₁レセプターのモジュレーターの同定は、全細胞又は膜調製物 を使用するアッセイにより行われる。 実施例７ 酵母発現ベクターへのＢ₁ｃＤＮＡのクローニング 組換えＢ₁は、異種タンパク質の細胞内又は細胞外発現を誘導するように設計 された発現ベクターに最適Ｂ₁ｃＤＮＡシストロンを挿入後に酵母Ｓ．ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅで産生される。細胞内発現の場合には、ＥｍＢＬｙｅｘ４等のよう なベクターをＢ₁シストロンに連結する［Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ ８，５４３−５４５（１９９０）； Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ．ら ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，４１８９−４１９２（１９８９）］。細胞 外発現では、分泌シグナルを融合する酵母発現ベクターにＢ₁シストロンを連結 する。Ｂ₁発現レベルは本明細書に記載のアッセイにより決定される。 実施例８ 組換えＢ₁の精製 組換えにより産生されたＢ₁は抗体アフィニティークロマトグラフィーにより 精製することができる。 Ｂ₁抗体アフィニティーカラムは、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有 結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予備活性化され たゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗Ｂ₁抗体を加え ることにより作成される。次に、スペーサーアームとのアミド結合を介して抗体 をゲルと結合する。次に残りの活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ ｐＨ８）でクエンチする。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ ２．６）で洗浄し、非結合抗体又は外部タンパク質を除去する。次にカラムをリ ン酸緩衝塩類溶液（ｐＨ７．３）と界面活性等の適当な膜可溶化剤で平衡化し、 可溶化Ｂ₁又はＢ₁サブユニットを含む細胞培養上清又は細胞抽出物をゆっくりと カラムに通す。次に光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドまで低下するまで カラムをリン酸緩衝塩類溶液と界面活性剤で洗浄し、次いでタンパク質を０．２ ３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）と界面活性剤で溶離する。次に精製Ｂ₁タ ンパク質をリン酸緩衝塩類溶液で透析する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】平成８年５月６日（１９９６．５．６） 【補正内容】 請求の範囲 １．ブラジキニンＢ₁レセプター又はその機能的誘導体をコードする単離精製Ｄ ＮＡ分子。 ２．ヌクレオチド配列： （配列番号１）又はその機能的誘導体を有する請求項１に記載の単離精製ＤＮＡ 分子。 ３．前記ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡである請求項１に記載の単離精製ＤＮＡ分子 。 ４．組換え宿主でブラジキニンＢ₁レセプターを発現させるための発現ベクター であって、ブラジキニンＢ₁レセプター又はその機能的誘導体をコードする組換 え遺伝子を含む前記発現ベクター。 ５．発現ベクターがヌクレチオチド配列： （配列番号１）を有するブラジキニンＢ₁レセプター又はその機能的誘導体をコ ードするクローン化遺伝子を含む請求項４に記載の発現ベクター。 ６．発現ベクターがブラジキニンＢ₁レセプターをコードするゲノムＤＮＡを含 む請求項４に記載の発現ベクター。 ７．ブラジキニンＢ₁レセプター又はその機能的誘導体をコードする組換えクロ ーン化遺伝子を含む組換え宿主細胞。 ８．ブラジキニンＢ₁レセプターをコードする前記遺伝子がヌクレチオチド配列 ： （配列番号１）又はその機能的誘導体を有する請求項７に記載の組換え宿主細胞 。 ９．ブラジキニンＢ₁レセプターをコードする前記クローン化遺伝子がゲノムＤ ＮＡである請求項７に記載の組換え宿主細胞。 １０．ブラジキニンＢ₁レセプターとして機能する実質的に純粋な形態のタンパ ク質。 １１．アミノ酸配列： （配列番号２）又はその機能的誘導体を有する請求項１０に記載のタンパク質。 １２．ブラジキニンＢ₁レセプターに対して免疫反応性の単一特異抗体。 １３．抗体がブラジキニンＢ₁レセプターの活性を阻止する請求項１２に記載の 抗体。 １４．組換え宿主細胞におけるブラジキニンＢ₁レセプタータンパク質の発現方 法であって、 （ａ）請求項４に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞に移入する段階と、 （ｂ）発現ベクターからブラジキニンＢ₁レセプタータンパク質を発現させる条 件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む前記方法。 １５．ブラジキニンＢ₁レセプター活性を調節する化合物の同定方法であって、 （ａ）ブラジキニンＢ₁レセプター活性の推定モジュレーターをブラジキニンＢ₁ レセプターと結合する段階と、 （ｂ）レセプターに及ぼすモジュレーターの作用を測定する段階を含む前記方法 。 １６．レセプターに及ぼすモジュレータ−の作用がＢ₁レセプターリガンドの結 合の阻害又は強化である請求項１５に記載の方法。 １７．レセプターに及ぼすモジュレーターの作用がＢ₁レセプターにより媒介さ れるシグナル形質導入の刺激又は阻害である請求項１５に記載の方法。 １８．レセプターに及ぼすモジュレーターの作用がＢ₁レセプターにより媒介さ れるシグナル形質導入であり、前記シグナル形質導入がホスファチジルイノシト ール加水分解、細胞内貯蔵Ｃａ²⁺の放出及びアラキドン酸放出から構成される群 から選択される請求項１７に記載の方法。 １９．ブラジキニンＢ₁レセプターのモジュレーターである請求項１５に記載の 方法で活性な化合物。 ２０．ブラジキニンＢ₁レセプターのアゴニスト又はアンタゴニストである請求 項１５に記載の方法で活性な化合物。 ２１．ブラジキニンＢ₁レセプターの発現モジュレーターである請求項１５に記 載の方法で活性な化合物。 ２２．ブラジキニンＢ₁レセプター活性のモジュレーターである請求項１５に記 載の方法で活性な化合物を含む医薬組成物。 ２３．ブラジキニンＢ₁レセプターにより媒介される症状の治療を必要とする患 者の治療方法であって、請求項１５に記載の方法で活性なブラジキニンＢ₁レセ プター調節化合物を投与することからなる前記方法。 ２４．ブラジキニンＢ₁レセプターにより媒介され且つ痛覚過敏、急性炎症又は 慢性炎症により特徴付けられる症状の治療を必要とする患者の治療方法であって 、請求項１５に記載の方法で活性なブラジキニンＢ₁レセプター調節化合物を投 与することからなる前記方法。 ２５．ブラジキニンＢ₁レセプター活性を調節する化合物の同定方法であって、 （ａ）ブラジキニンＢ₁レセプター活性の推定モジュレーターを、組換えブラジ キニンＢ₁レセプターを発現する細胞と結合する段階と、 （ｂ）レセプターに及ぼすモジュレーターの作用を測定する段階を含む前記方法 。 ２６．段階（ｂ）でレセプターに及ぼすモジュレーターの作用がＢ₁レセプター リガンドの結合の阻害又は強化である請求項２５に記載の方法。 ２７．段階（ｂ）でレセプターに及ぼすモジュレーターの作用がＢ₁レセプター により媒介されるシグナル形質導入の阻害又は強化である請求項２５に記載の方 法。 ２８．シグナル形質導入がホスファチジルイノシトール加水分解、細胞内貯蔵Ｃ ａ²⁺の放出及びアラキドン酸放出から構成される群から選択される請求項２７に 記載の方法。 ２９．ブラジキニンＢ₁レセプターのモジュレーターである請求項２５に記載の 方法で活性な化合物。 ３０．ブラジキニンＢ₁レセプターのアゴニスト又はアンタゴニストである請求 項２５に記載の方法で活性な化合物。 ３１．ブラジキニンＢ₁レセプターの発現モジュレーターである請求項２５に記 載の方法で活性な化合物。 ３２．ブラジキニンＢ₁レセプター活性のモジュレーターである請求項２５に記 載の方法で活性な化合物を含む医薬組成物。 ３３．ブラジキニンＢ₁レセプターにより媒介される症状の治療を必要とする患 者の治療方法であって、請求項２５に記載の方法で活性なブラジキニンＢ₁レセ プター調節化合物を投与することからなる前記方法。 ３４．ブラジキニンＢ₁レセプターにより媒介され且つ痛覚過 敏、急性炎症又は慢性炎症により特徴付けられる症状の治療を必要とする患者の 治療方法であって、請求項２５に記載の方法で活性なブラジキニンＢ₁レセプタ ー調節化合物を投与することからなる前記方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/00 Ａ６１Ｐ 9/02 // Ａ６１Ｐ 9/02 25/04 25/04 29/00 29/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ヘス，ジヨン・ダブリユー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ボルコウスキー，ジヨーゼフ・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ビアリロ，キヤスリーン・ケイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 メンク，ジヨン・ジー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ブラジキニンＢ₁レセプター又はその機能的誘導体をコードする単離精製Ｄ ＮＡ分子。 ２．ヌクレオチド配列： （配列番号１）又はその機能的誘導体を有する請求項１に記載の単離精製ＤＮＡ 分子。 ３．前記ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡである請求項１に記載の単離精製ＤＮＡ分子 。 ４．組換え宿主でブラジキニンＢ₁レセプターを発現させるための発現ベクター であって、ブラジキニンＢ₁レセプター又はその機能的誘導体をコードする組換 え遺伝子を含む前記発現ベクター。 ５．発現ベクターがヌクレチオチド配列： （配列番号１）を有するブラジキニンＢ₁レセプター又はその機能的誘導体をコ ードするクローン化遺伝子を含む請求項４に記載の発現ベクター。 ６．発現ベクターがブラジキニンＢ₁レセプターをコードするゲノムＤＮＡを含 む請求項４に記載の発現ベクター。 ７．ブラジキニンＢ₁レセプター又はその機能的誘導体をコードする組換えクロ ーン化遺伝子を含む組換え宿主細胞。 ８．ブラジキニンＢ₁レセプターをコードする前記遺伝子がヌクレチオチド配列 ： （配列番号１）又はその機能的誘導体を有する請求項７に記載の組換え宿主細胞 。 ９．ブラジキニンＢ₁レセプターをコードする前記クローン化遺伝子がゲノムＤ ＮＡである請求項７に記載の組換え宿主細胞。 １０．ブラジキニンＢ₁レセプターとして機能する実質的に純粋な形態のタンパ ク質。 １１．アミノ酸配列：（配列番号２）又はその機能的誘導体を有する請求項１０に記載のタンパク質。 １２．ブラジキニンＢ₁レセプターに対して免疫反応性の単一特異抗体。 １３．抗体がブラジキニンＢ₁レセプターの活性を阻止する請求項１２に記載の 抗体。 １４．組換え宿主細胞におけるブラジキニンＢ₁レセプタータンパク質の発現方 法であって、 （ａ）請求項４に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞に移入する段階と、 （ｂ）発現ベクターからブラジキニンＢ₁レセプタータンパク質を発現させる条 件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養する段階を含む前記方法。 １５．ブラジキニンＢ₁レセプター活性を調節する化合物の同定方法であって、 （ａ）ブラジキニンＢ₁レセプター活性の推定モジュレーターをブラジキニンＢ₁ レセプターと結合する段階と、 （ｂ）レセプターに及ぼすモジュレーターの作用を測定する段階を含む前記方法 。 １６．レセプターに及ぼすモジュレーターの作用がＢ₁レセプターリガンドの結 合の阻害又は強化である請求項１５に記載の方法。 １７．レセプターに及ぼすモジュレーターの作用がＢ₁レセプターにより媒介さ れるシグナル形質導入の刺激又は阻害である請求項１５に記載の方法。 １８．レセプターに及ぼすモジュレーターの作用がＢ₁レセプターにより媒介さ れるシグナル形質導入であり、前記シグナル形質導入がホスファチジルイノシト ール加水分解、細胞内貯蔵Ｃａ²⁺の放出及びアラキドン酸放出から構成される群 から選択される請求項１７に記載の方法。 １９．ブラジキニンＢ₁レセプターのモジュレーターである請求項１５に記載の 方法で活性な化合物。 ２０．ブラジキニンＢ₁レセプターのアゴニスト又はアンタゴニストである請求 項１５に記載の方法で活性な化合物。 ２１．ブラジキニンＢ₁レセプターの発現モジュレーターである請求項１５に記 載の方法で活性な化合物。 ２２．ブラジキニンＢ₁レセプター活性のモジュレーターである請求項１５に記 載の方法で活性な化合物を含む医薬組成物。 ２３．ブラジキニンＢ₁レセプターにより媒介される症状の治療を必要とする患 者の治療方法であって、請求項１５に記載の方法で活性なブラジキニンＢ₁レセ プター調節化合物を投与することからなる前記方法。 ２４．ブラジキニンＢ₁レセプターにより媒介され且つ痛覚過敏、急性炎症又は 慢性炎症により特徴付けられる症状の治療を必要とする患者の治療方法であって 、請求項１５に記載の方法で活性なブラジキニンＢ₁レセプター調節化合物を投 与することからなる前記方法。 ２５．ブラジキニンＢ₁レセプター活性を調節する化合物の同定方法であって、 （ａ）ブラジキニンＢ₁レセプター活性の推定モジュレーターを、組換えブラジ キニンＢ₁レセプターを発現する細胞と結合する段階と、 （ｂ）レセプターに及ぼすモジュレーターの作用を測定する段階を含む前記方法 。 ２６．段階（ｂ）でレセプターに及ぼすモジュレーターの作用がＢ₁レセプター リガンドの結合の阻害又は強化である請求項２５に記載の方法。 ２７．段階（ｂ）でレセプターに及ぼすモジュレーターの作用がＢ₁レセプター により媒介されるシグナル形質導入の阻害又は強化である請求項２５に記載の方 法。 ２８．シグナル形質導入がホスファチジルイノシトール加水分解、細胞内貯蔵Ｃ ａ²⁺の放出及びアラキドン酸放出から構成される群から選択される請求項２７に 記載の方法。 ２９．ブラジキニンＢ₁レセプターのモジュレーターである請求項２５に記載の 方法で活性な化合物。 ３０．ブラジキニンＢ₁レセプターのアゴニスト又はアンタゴニストである請求 項２５に記載の方法で活性な化合物。 ３１．ブラジキニンＢ₁レセプターの発現モジュレーターである請求項２５に記 載の方法で活性な化合物。 ３２．ブラジキニンＢ₁レセプター活性のモジュレーターである請求項２５に記 載の方法で活性な化合物を含む医薬組成物。 ３３．ブラジキニンＢ₁レセプターにより媒介される症状の治療を必要とする患 者の治療方法であって、請求項２５に記載の方法で活性なブラジキニンＢ₁レセ プター調節化合物を投与することからなる前記方法。 ３４．ブラジキニンＢ₁レセプターにより媒介され且つ痛覚過 敏、急性炎症又は慢性炎症により特徴付けられる症状の治療を必要とする患者の 治療方法であって、請求項２５に記載の方法で活性なブラジキニンＢ₁レセプタ ー調節化合物を投与することからなる前記方法。