JP2001190300A - ウイロイド検出方法およびウイロイド検出に用いるキャプチャープローブ - Google Patents
ウイロイド検出方法およびウイロイド検出に用いるキャプチャープローブInfo
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- JP2001190300A JP2001190300A JP2000010011A JP2000010011A JP2001190300A JP 2001190300 A JP2001190300 A JP 2001190300A JP 2000010011 A JP2000010011 A JP 2000010011A JP 2000010011 A JP2000010011 A JP 2000010011A JP 2001190300 A JP2001190300 A JP 2001190300A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】手間隙をかけずに簡単な操作で、安定して高感
度にウイロイドを検出できるウイロイド検出方法および
ウイロイド検出に用いるキャプチャープローブの提供を
目的とする。 【解決手段】検体となる植物からＲＮＡを抽出する工程
と、既知の複数のウイロイドＲＮＡに共通する塩基配列
部位と相補性を有する塩基配列を備えたキャプチャープ
ローブを用いて、前記抽出されたＲＮＡから、ウイロイ
ドＲＮＡのみを回収する工程と、回収したウイロイドＲ
ＮＡをｃＤＮＡに逆転写したのち遺伝子増幅法により増
幅させる工程とを包含している構成とした。
度にウイロイドを検出できるウイロイド検出方法および
ウイロイド検出に用いるキャプチャープローブの提供を
目的とする。 【解決手段】検体となる植物からＲＮＡを抽出する工程
と、既知の複数のウイロイドＲＮＡに共通する塩基配列
部位と相補性を有する塩基配列を備えたキャプチャープ
ローブを用いて、前記抽出されたＲＮＡから、ウイロイ
ドＲＮＡのみを回収する工程と、回収したウイロイドＲ
ＮＡをｃＤＮＡに逆転写したのち遺伝子増幅法により増
幅させる工程とを包含している構成とした。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウイロイドの検出
方法およびウイロイド検出に用いるキャプチャープロー
ブに関する。
方法およびウイロイド検出に用いるキャプチャープロー
ブに関する。
【０００２】
【従来の技術】ウイロイドは、ウィルスに近い性質を有
している低分子の核酸病原体であり、植物に寄生して、
わい化・奇形の症状を引き起こすことが知られている。
ウイロイドは、分子量が約１０万で、一本鎖の環状ＲＮ
Ａだけからなり、構造たんぱく質を欠いている。
している低分子の核酸病原体であり、植物に寄生して、
わい化・奇形の症状を引き起こすことが知られている。
ウイロイドは、分子量が約１０万で、一本鎖の環状ＲＮ
Ａだけからなり、構造たんぱく質を欠いている。
【０００３】ウイロイドとしては、たとえば、キクに感
染した場合、そのキクの草丈が著しく短くなるととも
に、葉や花も小型化してしまうキクわい化病にかかって
しまうキクわい化病ウイロイド（ＣＳＶｄ）が知られて
いる。したがって、キクの育成に携わる人々にとって
は、キクにウイロイドが感染しているか否かを早期に検
出することを望んでいる。
染した場合、そのキクの草丈が著しく短くなるととも
に、葉や花も小型化してしまうキクわい化病にかかって
しまうキクわい化病ウイロイド（ＣＳＶｄ）が知られて
いる。したがって、キクの育成に携わる人々にとって
は、キクにウイロイドが感染しているか否かを早期に検
出することを望んでいる。
【０００４】しかし、植物に悪影響を及ぼすウイロイド
は、ウィルスの１０分の１程度の大きさしかないため、
顕微鏡で視認することが不可能であり、また、構造たん
ぱく質を欠いていることから抗原性を有さず、抗血清で
検定することもできない。したがって、植物がウイロイ
ドに感染しているか否かの診断は、たとえば、その植物
がキクの場合、診断を行おうとする検体となるキクを、
キク科の中でも病徴の見やすい品種である「ミスルト」
などに接ぎ木し、その病徴で判定するという生物検定に
より行っていた。
は、ウィルスの１０分の１程度の大きさしかないため、
顕微鏡で視認することが不可能であり、また、構造たん
ぱく質を欠いていることから抗原性を有さず、抗血清で
検定することもできない。したがって、植物がウイロイ
ドに感染しているか否かの診断は、たとえば、その植物
がキクの場合、診断を行おうとする検体となるキクを、
キク科の中でも病徴の見やすい品種である「ミスルト」
などに接ぎ木し、その病徴で判定するという生物検定に
より行っていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、生物検定は、
接ぎ木から結果の判定を行うまでに１ヶ月以上も要し手
間隙がかかりすぎてしまうのに加えて、温度や日照条件
などによっても誤差が生じるおそれがあり、さらに、多
大な施設が必要であるという弊害がある。
接ぎ木から結果の判定を行うまでに１ヶ月以上も要し手
間隙がかかりすぎてしまうのに加えて、温度や日照条件
などによっても誤差が生じるおそれがあり、さらに、多
大な施設が必要であるという弊害がある。
【０００６】そこで近年は、上述したような弊害を是正
するため、遺伝子診断技術が開発されてきている。今ま
で開発されてきた遺伝子診断技術としては、検体とす
る植物から抽出した低分子ＲＮＡを電気泳動後、メンブ
ランフィルターに転写し、プローブでハイブリダイズし
検出するノーザンブロットハイブリダイゼーション法、
抽出・精製した低分子ＲＮＡをメンブランフィルター
上に直接スポットして吸着固定し、プローブとハイブリ
ダイズさせて検出するドットブロットハイブリダイゼー
ション法、抽出・精製した低分子ＲＮＡを相補的ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）に逆転写(Reverse Transcription) した
後、Polymerase Chain Reaction により増幅するＲＴ−
ＰＣＲ法（通常増幅産物はアガロース電気泳動でチェッ
クを行う）、ＲＴ−ＰＣＲ法を行った後その増幅産物
をメンブランフィルターやポリスチレンのプレート上で
プローブとハイブリダイズさせ検出するＲＴ−ＰＣＲ−
ハイブリダイゼーション法などが挙げられる。上述した
検出方法のうち、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたときに検出感
度が最も高くなることから、これからの検出方法におけ
る主流になることが期待されている。
するため、遺伝子診断技術が開発されてきている。今ま
で開発されてきた遺伝子診断技術としては、検体とす
る植物から抽出した低分子ＲＮＡを電気泳動後、メンブ
ランフィルターに転写し、プローブでハイブリダイズし
検出するノーザンブロットハイブリダイゼーション法、
抽出・精製した低分子ＲＮＡをメンブランフィルター
上に直接スポットして吸着固定し、プローブとハイブリ
ダイズさせて検出するドットブロットハイブリダイゼー
ション法、抽出・精製した低分子ＲＮＡを相補的ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）に逆転写(Reverse Transcription) した
後、Polymerase Chain Reaction により増幅するＲＴ−
ＰＣＲ法（通常増幅産物はアガロース電気泳動でチェッ
クを行う）、ＲＴ−ＰＣＲ法を行った後その増幅産物
をメンブランフィルターやポリスチレンのプレート上で
プローブとハイブリダイズさせ検出するＲＴ−ＰＣＲ−
ハイブリダイゼーション法などが挙げられる。上述した
検出方法のうち、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたときに検出感
度が最も高くなることから、これからの検出方法におけ
る主流になることが期待されている。
【０００７】しかし、従来から行われていた植物からの
低分子ＲＮＡの抽出方法では、ＲＴ−ＰＣＲ法を行う際
に、増幅を阻害する物質が混入し、ＰＣＲ反応が不安定
であるという弊害が生じてしまう（化学工業日報社：今
月の農業６月号１９９８年Ｐ４２〜４６）。また、低分
子ＲＮＡの抽出工程において阻害物質を取り除くために
は、煩雑な精製工程が必要な上、必ずしも取り除けると
は限らなかった。さらに、精製工程が多ければ、労力・
コスト・時間を要する上に、目的とするウイロイド遺伝
子の収率が低下し、検出感度を著しく低下させていた。
低分子ＲＮＡの抽出方法では、ＲＴ−ＰＣＲ法を行う際
に、増幅を阻害する物質が混入し、ＰＣＲ反応が不安定
であるという弊害が生じてしまう（化学工業日報社：今
月の農業６月号１９９８年Ｐ４２〜４６）。また、低分
子ＲＮＡの抽出工程において阻害物質を取り除くために
は、煩雑な精製工程が必要な上、必ずしも取り除けると
は限らなかった。さらに、精製工程が多ければ、労力・
コスト・時間を要する上に、目的とするウイロイド遺伝
子の収率が低下し、検出感度を著しく低下させていた。
【０００８】そこで、本発明は、上述した問題点に鑑み
て、手間隙をかけずに簡単な操作で行うことができると
ともに、安定して高感度にウイロイドを検出できるウイ
ロイド検出方法およびウイロイド検出に用いるキャプチ
ャープローブの提供を目的としてなされた。
て、手間隙をかけずに簡単な操作で行うことができると
ともに、安定して高感度にウイロイドを検出できるウイ
ロイド検出方法およびウイロイド検出に用いるキャプチ
ャープローブの提供を目的としてなされた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明の請求項１にかかるウイロイド検出方法は、
検体となる植物からＲＮＡを抽出する工程と、既知の複
数のウイロイドＲＮＡに共通する塩基配列部位と相補性
を有する塩基配列を備えたキャプチャープローブを用い
て、前記抽出されたＲＮＡから、ウイロイドＲＮＡのみ
を回収する工程と、回収したウイロイドＲＮＡをｃＤＮ
Ａに逆転写したのち遺伝子増幅法により増幅させる工程
とを包含している構成とした。
に、本発明の請求項１にかかるウイロイド検出方法は、
検体となる植物からＲＮＡを抽出する工程と、既知の複
数のウイロイドＲＮＡに共通する塩基配列部位と相補性
を有する塩基配列を備えたキャプチャープローブを用い
て、前記抽出されたＲＮＡから、ウイロイドＲＮＡのみ
を回収する工程と、回収したウイロイドＲＮＡをｃＤＮ
Ａに逆転写したのち遺伝子増幅法により増幅させる工程
とを包含している構成とした。
【００１０】上記構成において、既知の複数のウイロイ
ドＲＮＡの共通する塩基配列部位とは、キクわい化病ウ
イロイド、他の植物の病原となるウイロイドだけでな
く、さらにウィルス（ＲＮＡのみにより構成されるもの
に限る。）などのＲＮＡの塩基配列に共通する部位も含
む。
ドＲＮＡの共通する塩基配列部位とは、キクわい化病ウ
イロイド、他の植物の病原となるウイロイドだけでな
く、さらにウィルス（ＲＮＡのみにより構成されるもの
に限る。）などのＲＮＡの塩基配列に共通する部位も含
む。
【００１１】また、ウイロイド検出方法においては、検
体となる植物からＲＮＡを抽出する際に、どのような方
法を用いても良く、特に限定されないが、たとえば、有
底の蓋付き筒体に検体を入れるとともに、リン酸バッフ
ァーなどの抽出液およびセラミックボールなどの固形物
を入れ、蓋をした後激しく振盪させることにより、ＲＮ
Ａを抽出する方法を行うようにすると、検体を磨砕する
工程を省略化することが出来るため好ましい。ここで、
有底の蓋付き筒体とは、特に限定されないが、たとえ
ば、市販の生化学に用いる測定用プラスチックチューブ
のキットなどが挙げられる。
体となる植物からＲＮＡを抽出する際に、どのような方
法を用いても良く、特に限定されないが、たとえば、有
底の蓋付き筒体に検体を入れるとともに、リン酸バッフ
ァーなどの抽出液およびセラミックボールなどの固形物
を入れ、蓋をした後激しく振盪させることにより、ＲＮ
Ａを抽出する方法を行うようにすると、検体を磨砕する
工程を省略化することが出来るため好ましい。ここで、
有底の蓋付き筒体とは、特に限定されないが、たとえ
ば、市販の生化学に用いる測定用プラスチックチューブ
のキットなどが挙げられる。
【００１２】さらに、ウイロイドを検出するとき、キャ
プチャープローブの抽出液への混入は、0.1pmol 〜100p
mol の範囲で行うことが好ましい。また、ＲＴ−ＰＣＲ
法を利用するときは、キャプチャープローブの抽出液へ
の混入が0.5 pmol〜３pmolの範囲で十分である。すなわ
ち、キャプチャープローブの混入が0.1pmol 以下である
と、ウイロイドの検出が不十分になるおそれがあり、10
0pmol 以上であっても検出感度は変わらない。
プチャープローブの抽出液への混入は、0.1pmol 〜100p
mol の範囲で行うことが好ましい。また、ＲＴ−ＰＣＲ
法を利用するときは、キャプチャープローブの抽出液へ
の混入が0.5 pmol〜３pmolの範囲で十分である。すなわ
ち、キャプチャープローブの混入が0.1pmol 以下である
と、ウイロイドの検出が不十分になるおそれがあり、10
0pmol 以上であっても検出感度は変わらない。
【００１３】また、本発明の請求項２にかかるキャプチ
ャープローブは、以下の塩基配列（１）により表される
構成とした。 （１）５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＧＧＴＡ
Ｇ−３’ （上記構成においてＣはシトシン、Ａはアデニン、Ｇは
グアニン、Ｔはチミンを示す。） 上記構成において、キャプチャープローブは、以下の式
（２）で表されるように、塩基配列（１）の５’末端に
ビオチンが標識されていることが好ましい。 （２）ビオチン＞５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣ
ＧＧＧＴＡＧ−３’
ャープローブは、以下の塩基配列（１）により表される
構成とした。 （１）５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＧＧＴＡ
Ｇ−３’ （上記構成においてＣはシトシン、Ａはアデニン、Ｇは
グアニン、Ｔはチミンを示す。） 上記構成において、キャプチャープローブは、以下の式
（２）で表されるように、塩基配列（１）の５’末端に
ビオチンが標識されていることが好ましい。 （２）ビオチン＞５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣ
ＧＧＧＴＡＧ−３’
【００１４】
【発明の実施の形態】以下に、本発明にかかるキクわい
化病ウイロイドの検出方法の一実施の形態を説明する。 キクわい化病ウイロイドの検出を行おうとするキク
検体を用意し、このキク検体の葉を採取し、核酸を抽出
する。具体的にはトリス緩衝液やリン酸バッファーなど
の緩衝液からなる抽出液と共に試料を磨砕する。 の工程により得られた磨砕液を遠心分離後、水層
に滲出してきた核酸をアルコールで沈殿させ、この沈殿
物を再度しかるべき塩類濃度の緩衝液に溶解し、ウイロ
イドＲＮＡ共通の塩基配列である中央保存領域と相補性
を有する以下の式（２）により表されるキャプチャープ
ローブを０. ５pmol〜３pmolの範囲で混入する。 （２）ビオチン＞５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣ
ＧＧＧＴＡＧ−３’ （上記構成においてＣはシトシン、Ａはアデニン、Ｇは
グアニン、Ｔはチミンを示す。）
化病ウイロイドの検出方法の一実施の形態を説明する。 キクわい化病ウイロイドの検出を行おうとするキク
検体を用意し、このキク検体の葉を採取し、核酸を抽出
する。具体的にはトリス緩衝液やリン酸バッファーなど
の緩衝液からなる抽出液と共に試料を磨砕する。 の工程により得られた磨砕液を遠心分離後、水層
に滲出してきた核酸をアルコールで沈殿させ、この沈殿
物を再度しかるべき塩類濃度の緩衝液に溶解し、ウイロ
イドＲＮＡ共通の塩基配列である中央保存領域と相補性
を有する以下の式（２）により表されるキャプチャープ
ローブを０. ５pmol〜３pmolの範囲で混入する。 （２）ビオチン＞５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣ
ＧＧＧＴＡＧ−３’ （上記構成においてＣはシトシン、Ａはアデニン、Ｇは
グアニン、Ｔはチミンを示す。）
【００１５】 工程で得られた核酸溶液・キャプチ
ャープローブ混液を３０〜８０℃の温度で１分〜１００
時間攪拌しながら、ウイロイド遺伝子とキャプチャープ
ローブの接着を促し、ウイロイド・キャプチャープロー
ブ複合体を得る。 その後、キャプチャープローブと接着するように製
造された磁性ビーズを工程により得られた液中に投入
し、前記ウイロイド・キャプチャープローブ複合体を磁
性ビーズを使って補足し、ウイロイド・キャプチャープ
ローブ・磁性ビーズ複合体（以下、「磁性ビーズ複合
体」とのみ記す。）を作成する。
ャープローブ混液を３０〜８０℃の温度で１分〜１００
時間攪拌しながら、ウイロイド遺伝子とキャプチャープ
ローブの接着を促し、ウイロイド・キャプチャープロー
ブ複合体を得る。 その後、キャプチャープローブと接着するように製
造された磁性ビーズを工程により得られた液中に投入
し、前記ウイロイド・キャプチャープローブ複合体を磁
性ビーズを使って補足し、ウイロイド・キャプチャープ
ローブ・磁性ビーズ複合体（以下、「磁性ビーズ複合
体」とのみ記す。）を作成する。
【００１６】 工程により作成された磁性ビーズ複
合体を含むチューブ内の溶液に、磁石を近づけることに
より、磁性ビーズ複合体をチューブ側部に集積させ、そ
の後、残液を取り除くことにより磁性ビーズ複合体のみ
を取り出す。なお、上述した工程において、工程にお
ける抽出液は、緩衝液に加えて硫酸ドデシルナトリウム
（以下、「ＳＤＳ」と記す。）などの界面活性剤、メル
カプトエタノールなどの還元剤、フェノール・クロロホ
ルムなどのタンパク質変性剤を供に加えてもよい（ソフ
トサイエンス社、微生物研究法 Ｐ２４１〜Ｐ２４
２）。また、工程における磨砕工程は非常に労力を伴
うため、蓋付きのプラスチックチューブ中に試料、前記
抽出液とセラミックボールなどの固形物を入れ、激しく
振盪させる方法を行うことにより、磨砕工程を省力化す
ることができる。
合体を含むチューブ内の溶液に、磁石を近づけることに
より、磁性ビーズ複合体をチューブ側部に集積させ、そ
の後、残液を取り除くことにより磁性ビーズ複合体のみ
を取り出す。なお、上述した工程において、工程にお
ける抽出液は、緩衝液に加えて硫酸ドデシルナトリウム
（以下、「ＳＤＳ」と記す。）などの界面活性剤、メル
カプトエタノールなどの還元剤、フェノール・クロロホ
ルムなどのタンパク質変性剤を供に加えてもよい（ソフ
トサイエンス社、微生物研究法 Ｐ２４１〜Ｐ２４
２）。また、工程における磨砕工程は非常に労力を伴
うため、蓋付きのプラスチックチューブ中に試料、前記
抽出液とセラミックボールなどの固形物を入れ、激しく
振盪させる方法を行うことにより、磨砕工程を省力化す
ることができる。
【００１７】また、工程におけるキャプチャープロー
ブと磁性ビーズの接着には、ビオチン・ストレプトアビ
ジン結合を利用したもの（例えば、Dynal 社Dynabeads
M-280 Streptavijin）やジゴキシゲニン・抗ジゴキシゲ
ニン結合を利用したもの（例えば、BoehringerMannheim
社AntiDigoxigenin Magnetic Particles) などを使用す
ることができる。このビーズと複合体の接着は０〜５０
℃の温度帯に調整することが必要であり、望ましくは２
０〜３０℃で１分〜１００時間、より望ましくは２０〜
３０℃で１０分〜２時間緩やかに攪拌しながら接着を促
していく。
ブと磁性ビーズの接着には、ビオチン・ストレプトアビ
ジン結合を利用したもの（例えば、Dynal 社Dynabeads
M-280 Streptavijin）やジゴキシゲニン・抗ジゴキシゲ
ニン結合を利用したもの（例えば、BoehringerMannheim
社AntiDigoxigenin Magnetic Particles) などを使用す
ることができる。このビーズと複合体の接着は０〜５０
℃の温度帯に調整することが必要であり、望ましくは２
０〜３０℃で１分〜１００時間、より望ましくは２０〜
３０℃で１０分〜２時間緩やかに攪拌しながら接着を促
していく。
【００１８】このようにして得られた磁性ビーズ複合
体、あるいは前記磁性ビーズ複合体から単離させたウイ
ロイドは、ＲＴ−ＰＣＲやハイブリダイゼーションなど
の分析に供することができ、高感度で安定したウイロイ
ドの検出が可能となる。
体、あるいは前記磁性ビーズ複合体から単離させたウイ
ロイドは、ＲＴ−ＰＣＲやハイブリダイゼーションなど
の分析に供することができ、高感度で安定したウイロイ
ドの検出が可能となる。
【００１９】
【実施例】以下に本発明の実施例を示す。 １．検体磨砕 スプレーギクの葉５０ｍｇをＲＮＡ抽出キットであるFa
stRNA Kit-Green （販売代理店（株）フナコシGL-6040-
06、Bio101社）とＲＮＡ抽出装置であるFastPrep FP120
装置（販売代理店（株）フナコシGL-6000-00、Bio101
社）を用いてマニュアルに従い、全ＲＮＡを抽出した。
stRNA Kit-Green （販売代理店（株）フナコシGL-6040-
06、Bio101社）とＲＮＡ抽出装置であるFastPrep FP120
装置（販売代理店（株）フナコシGL-6000-00、Bio101
社）を用いてマニュアルに従い、全ＲＮＡを抽出した。
【００２０】２．ウイロイドＲＮＡの抽出 １の操作により抽出したＲＮＡを６×ＳＳＣ（0.9MNaC
l、0.09M sodium citrate),0.1 ％ＳＤＳ,1×Denhardt'
s mix(1%(w/v)FicollR ,1%(w/v)PVP polyvinylpyrrolid
one,1%(w/v)Bovin Serum Albumin) からなる抽出液に溶
解した後、２μＬ（5pmol)の以下の式（２) により表さ
れるキャプチャープローブを加えた。 （２）ビオチン＞５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣ
ＧＧＧＴＡＧ−３’ （上記構成において、Ｃはシトシン、Ａはアデニン、Ｇ
はグアニン、Ｔはチミンを表す。） 混液は９５℃、５分間の熱処理の後、５５℃でゆっくり
攪拌しながら１２時間インキュベートした。さらに、２
０μＬ洗浄済みの磁性ビーズ（ダイナビーズ (販売代理
店 (株）ベリタス DB11205、Dynal 社））を加え、２５
℃、２時間ゆっくり攪拌して磁性ビーズ複合体を作成し
た。上記作成したビーズ複合体を、上記磁石を用いる分
離法を用いて、１０mM Tris-HCl、0. 1ｍM EDTA（ｐH
8.0）で２回洗浄した後、２０μＬの蒸留水に再懸濁し
て磁性ビーズ複合体混液を作成した。
l、0.09M sodium citrate),0.1 ％ＳＤＳ,1×Denhardt'
s mix(1%(w/v)FicollR ,1%(w/v)PVP polyvinylpyrrolid
one,1%(w/v)Bovin Serum Albumin) からなる抽出液に溶
解した後、２μＬ（5pmol)の以下の式（２) により表さ
れるキャプチャープローブを加えた。 （２）ビオチン＞５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣ
ＧＧＧＴＡＧ−３’ （上記構成において、Ｃはシトシン、Ａはアデニン、Ｇ
はグアニン、Ｔはチミンを表す。） 混液は９５℃、５分間の熱処理の後、５５℃でゆっくり
攪拌しながら１２時間インキュベートした。さらに、２
０μＬ洗浄済みの磁性ビーズ（ダイナビーズ (販売代理
店 (株）ベリタス DB11205、Dynal 社））を加え、２５
℃、２時間ゆっくり攪拌して磁性ビーズ複合体を作成し
た。上記作成したビーズ複合体を、上記磁石を用いる分
離法を用いて、１０mM Tris-HCl、0. 1ｍM EDTA（ｐH
8.0）で２回洗浄した後、２０μＬの蒸留水に再懸濁し
て磁性ビーズ複合体混液を作成した。
【００２１】３．ＲＴ−ＰＣＲ ＲＴ−ＰＣＲはGeneAmp EZ rTth RNA PCR Kit(PE Appli
ed Biosystems,N808-0179)を用いた。上記10μL の磁性
ビーズ複合体混液、各 1.5μL の15μM プラス鎖、マイ
ナス鎖、10μL のＥＺバッファー、３μL の 5mM dNTPs
(dATP,dCTP,dGTP,dTTPの混合液）、２μL の rTth Poly
merase、５μL の２５ｍM 酢酸マンガン（II)（Mn(OAc)
2）を加え合計50μL とし、RT反応50℃、30分間の後、9
4℃−15秒間、50℃−30秒間の２段階を30サイクルした
後、50℃−７分間反応させDNA を十分伸長させた。増幅
産物はそのうち８μL を４％アガロース(TAKARA NuSiev
e3:1 Agarose)電気泳動し、臭化エチジウム染色後、280
nm の紫外線照射下で増幅産物のバンドを確認した。
ed Biosystems,N808-0179)を用いた。上記10μL の磁性
ビーズ複合体混液、各 1.5μL の15μM プラス鎖、マイ
ナス鎖、10μL のＥＺバッファー、３μL の 5mM dNTPs
(dATP,dCTP,dGTP,dTTPの混合液）、２μL の rTth Poly
merase、５μL の２５ｍM 酢酸マンガン（II)（Mn(OAc)
2）を加え合計50μL とし、RT反応50℃、30分間の後、9
4℃−15秒間、50℃−30秒間の２段階を30サイクルした
後、50℃−７分間反応させDNA を十分伸長させた。増幅
産物はそのうち８μL を４％アガロース(TAKARA NuSiev
e3:1 Agarose)電気泳動し、臭化エチジウム染色後、280
nm の紫外線照射下で増幅産物のバンドを確認した。
【００２２】以上の方法を行うと、キクがウイロイドに
感染しているか否かを短時間で容易に、かつ、高感度で
検出することができた。また、塩基配列が、５’−ＣＡ
ＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＧＧＴＡＧ−３’のキャプ
チャープローブを用いることにより、キクわい化病のウ
イロイドに限らず、他の植物の病原となるウイロイドの
検出も行うことができた。
感染しているか否かを短時間で容易に、かつ、高感度で
検出することができた。また、塩基配列が、５’−ＣＡ
ＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＧＧＴＡＧ−３’のキャプ
チャープローブを用いることにより、キクわい化病のウ
イロイドに限らず、他の植物の病原となるウイロイドの
検出も行うことができた。
【００２３】
【発明の効果】以上のことより、本発明の請求項１に示
したウイロイド検出方法は、検体となる植物からＲＮＡ
を抽出する工程と、ウイロイドＲＮＡの共通する塩基配
列部位と相補性を有する塩基配列をしたキャプチャープ
ローブを用いて、前記抽出したＲＮＡからウイロイドＲ
ＮＡのみを回収する工程と、回収したウイロイドＲＮＡ
をＤＮＡに逆転写したのち遺伝子増幅法により増幅させ
る工程とを包含しているという構成をしているため、容
易な操作で、短時間に高感度なウイロイドの検出を行う
ことができる。
したウイロイド検出方法は、検体となる植物からＲＮＡ
を抽出する工程と、ウイロイドＲＮＡの共通する塩基配
列部位と相補性を有する塩基配列をしたキャプチャープ
ローブを用いて、前記抽出したＲＮＡからウイロイドＲ
ＮＡのみを回収する工程と、回収したウイロイドＲＮＡ
をＤＮＡに逆転写したのち遺伝子増幅法により増幅させ
る工程とを包含しているという構成をしているため、容
易な操作で、短時間に高感度なウイロイドの検出を行う
ことができる。
【００２４】また、本発明の請求項２に示したキャプチ
ャープローブは、ウイロイドＲＮＡ共通の塩基配列であ
る中央保存領域と相補性を有する以下の塩基配列（１）
５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＧＧＴＡＧ−
３’をしているため、検体のＲＮＡから目的とするウイ
ロイドＲＮＡのみを取り出すことができ、かつ、他のウ
イロイドあるいは他の植物に感染しているウイロイドを
取り出す際にも使用できる。
ャープローブは、ウイロイドＲＮＡ共通の塩基配列であ
る中央保存領域と相補性を有する以下の塩基配列（１）
５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＧＧＴＡＧ−
３’をしているため、検体のＲＮＡから目的とするウイ
ロイドＲＮＡのみを取り出すことができ、かつ、他のウ
イロイドあるいは他の植物に感染しているウイロイドを
取り出す際にも使用できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山下 裕子 和歌山県那賀郡桃山町調月396−１ 和歌 山県農業協同組合連合会植物バイオセンタ ー内 (72)発明者 芝 晃丞 和歌山県那賀郡桃山町調月396−１ 和歌 山県農業協同組合連合会植物バイオセンタ ー内 Ｆターム(参考） 4B024 AA07 AA14 CA09 CA11 DA01 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ04 QQ10 QQ52 QR31 QR55 QR83 QS15 QS16 QS25 QX01
Claims (2)
- 【請求項１】検体となる植物からＲＮＡを抽出する工程
と、既知の複数のウイロイドＲＮＡに共通する塩基配列
部位と相補性を有する塩基配列を備えたキャプチャープ
ローブを用いて、前記抽出されたＲＮＡから、ウイロイ
ドＲＮＡのみを回収する工程と、回収したウイロイドＲ
ＮＡをｃＤＮＡに逆転写したのち遺伝子増幅法により増
幅させる工程とを包含しているウイロイド検出方法。 - 【請求項２】以下の塩基配列（１）により表されるウイ
ロイド検出に用いるキャプチャープローブ。 （１）５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＧＧＧＴＡ
Ｇ−３’ （上記構成においてＣはシトシン、Ａはアデニン、Ｇは
グアニン、Ｔはチミンを示す。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000010011A JP2001190300A (ja) | 2000-01-13 | 2000-01-13 | ウイロイド検出方法およびウイロイド検出に用いるキャプチャープローブ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000010011A JP2001190300A (ja) | 2000-01-13 | 2000-01-13 | ウイロイド検出方法およびウイロイド検出に用いるキャプチャープローブ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001190300A true JP2001190300A (ja) | 2001-07-17 |
Family
ID=18538081
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000010011A Pending JP2001190300A (ja) | 2000-01-13 | 2000-01-13 | ウイロイド検出方法およびウイロイド検出に用いるキャプチャープローブ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001190300A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7646186B2 (ja) | 2021-03-12 | 2025-03-17 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 情報処理装置、情報処理方法、及びプログラム |
-
2000
- 2000-01-13 JP JP2000010011A patent/JP2001190300A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7646186B2 (ja) | 2021-03-12 | 2025-03-17 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 情報処理装置、情報処理方法、及びプログラム |
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