JP2001078789A - ライム病関連ボレリアに対する核酸増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ - Google Patents
ライム病関連ボレリアに対する核酸増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明はボレリア核酸の検出に有用なハイブ
リダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、
核酸組成物および方法を開示する。ライム病関連ボレリ
アを選択的に検出し、およびボレリア ヘルムシーから
これらのボレリアを区別するハイブリダイゼーションア
ッセイプローブおよび増幅プライマーが開示される。ボ
レリア ヘルムシーを選択的に検出し、およびライム病
関連ボレリアを検出しない別のハイブリダイゼーション
プローブもまた開示される。 【解決手段】 本発明のの増幅オリゴヌクレオチド、ヘ
ルパーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーショ
ンアッセイプローブは病原性ボレリアの１６Ｓおよび２
３Ｓ ｒＲＮＡ由来である。
リダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、
核酸組成物および方法を開示する。ライム病関連ボレリ
アを選択的に検出し、およびボレリア ヘルムシーから
これらのボレリアを区別するハイブリダイゼーションア
ッセイプローブおよび増幅プライマーが開示される。ボ
レリア ヘルムシーを選択的に検出し、およびライム病
関連ボレリアを検出しない別のハイブリダイゼーション
プローブもまた開示される。 【解決手段】 本発明のの増幅オリゴヌクレオチド、ヘ
ルパーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーショ
ンアッセイプローブは病原性ボレリアの１６Ｓおよび２
３Ｓ ｒＲＮＡ由来である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本明細書に記載および特許請
求される発明は、ライム病に関連するボレリア（Ｂｏｒ
ｒｅｌｉａ）生物体に対する増幅オリゴヌクレオチドお
よび核酸プローブの設計および使用に関し、それらは例
えば、組織試料および体液からの、および培養物からの
試験試料中の生物体の検出を可能にする。
求される発明は、ライム病に関連するボレリア（Ｂｏｒ
ｒｅｌｉａ）生物体に対する増幅オリゴヌクレオチドお
よび核酸プローブの設計および使用に関し、それらは例
えば、組織試料および体液からの、および培養物からの
試験試料中の生物体の検出を可能にする。
【０００２】
【従来の技術】ライム病は北アメリカ、欧州および温帯
気候を持つ世界の他の地域において、しばしば診断され
るヒト疾患であり、最も流行しているダニ媒介疾患であ
る。Ａ．Ｇ．Ｂａｒｂｏｕｒ ＆ Ｄ．Ｆｉｓｈ，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６０：１６１０−１６（１９９３）；
Ｊ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒｅｖ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｄ
ｉｓ．１１：５１４５１−５９（１９８９）；Ａ．Ｃ．
Ｓｔｅｅｒｅ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３１：
５８６−９６（１９８９）を参照されたい。ライム病ま
たはライムボレリア病はボレリアスピロヘータにより引
き起こされる多段階感染である。ボレリア生物体は感染
したマダニ属のダニによりヒトおよび動物へ伝搬され
る。白尾シカおよび白足マウス（ペロミスカス ロイコ
パス）が各々自然における成虫ダニおよび幼虫型の一次
保有体である。
気候を持つ世界の他の地域において、しばしば診断され
るヒト疾患であり、最も流行しているダニ媒介疾患であ
る。Ａ．Ｇ．Ｂａｒｂｏｕｒ ＆ Ｄ．Ｆｉｓｈ，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６０：１６１０−１６（１９９３）；
Ｊ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒｅｖ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｄ
ｉｓ．１１：５１４５１−５９（１９８９）；Ａ．Ｃ．
Ｓｔｅｅｒｅ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３１：
５８６−９６（１９８９）を参照されたい。ライム病ま
たはライムボレリア病はボレリアスピロヘータにより引
き起こされる多段階感染である。ボレリア生物体は感染
したマダニ属のダニによりヒトおよび動物へ伝搬され
る。白尾シカおよび白足マウス（ペロミスカス ロイコ
パス）が各々自然における成虫ダニおよび幼虫型の一次
保有体である。
【０００３】ヒトおよび動物におけるライムボレリア病
の感染は感染の段階に依存して多くの異なった臨床症状
発現を起こす。ヒトの初期感染は通常、遊走性紅斑と称
される特徴的な皮膚発疹を伴うインフルエンザ様の病気
である。遊走性紅斑は遠心的に広がり、通常環状の形を
している。遊走性紅斑は通常、ダニに咬まれた後１−５
週間以内に現れ、数週間または数カ月後に自然に消散す
る。Ｈ．Ｗ．Ｐｆｉｓｔｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３４
３：１０１３（１９９４）を参照されたい。
の感染は感染の段階に依存して多くの異なった臨床症状
発現を起こす。ヒトの初期感染は通常、遊走性紅斑と称
される特徴的な皮膚発疹を伴うインフルエンザ様の病気
である。遊走性紅斑は遠心的に広がり、通常環状の形を
している。遊走性紅斑は通常、ダニに咬まれた後１−５
週間以内に現れ、数週間または数カ月後に自然に消散す
る。Ｈ．Ｗ．Ｐｆｉｓｔｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３４
３：１０１３（１９９４）を参照されたい。
【０００４】ボレリア感染後数週間から数カ月以内に、
感染は脳、神経、眼、関節および心臓を含む種々の器官
に広がるであろう。この感染の広がりは疾患のＩＩ期が
進行状態にあることを示している。ライムボレリア病の
神経学的特色には髄膜神経根神経炎（バンワース症候
群）、髄膜炎、顔面神経の脳神経炎、神経叢神経炎、多
発性単神経炎、および希に、脳炎、脊椎炎、心血管炎、
ＣＳＦリンパ球多サイトーシスが含まれる。
感染は脳、神経、眼、関節および心臓を含む種々の器官
に広がるであろう。この感染の広がりは疾患のＩＩ期が
進行状態にあることを示している。ライムボレリア病の
神経学的特色には髄膜神経根神経炎（バンワース症候
群）、髄膜炎、顔面神経の脳神経炎、神経叢神経炎、多
発性単神経炎、および希に、脳炎、脊椎炎、心血管炎、
ＣＳＦリンパ球多サイトーシスが含まれる。
【０００５】ライム心臓炎は重度の病態であり、一般に
種々の程度の過渡的な房室ブロック、周期障害心筋心臓
炎および心不全を特徴とする。ライム心臓病の共通の徴
候には動悸、胸部不快感、息切れ、運動時のめまい感お
よびアダムス−ストークス発作が含まれる。
種々の程度の過渡的な房室ブロック、周期障害心筋心臓
炎および心不全を特徴とする。ライム心臓病の共通の徴
候には動悸、胸部不快感、息切れ、運動時のめまい感お
よびアダムス−ストークス発作が含まれる。
【０００６】筋骨格系のライムボレリア感染は筋痛炎症
性ではない関節炎、関節炎、筋炎、およびリンパ節症の
ような徴候を起こす。眼へのボレリア感染は結膜炎、虹
彩毛様体炎、脈絡膜炎、瞳孔浮腫を伴う視神経障害、汎
眼球炎のような徴候を起こす。他の器官への感染では肝
腫、肝炎、咳および精巣膨潤が起きるであろう。
性ではない関節炎、関節炎、筋炎、およびリンパ節症の
ような徴候を起こす。眼へのボレリア感染は結膜炎、虹
彩毛様体炎、脈絡膜炎、瞳孔浮腫を伴う視神経障害、汎
眼球炎のような徴候を起こす。他の器官への感染では肝
腫、肝炎、咳および精巣膨潤が起きるであろう。
【０００７】感染して数カ月から数年後、慢性的な器官
障害が起こり、ライムボレリア病がＩＩＩ期に入ったこ
とを示している。この段階の徴候には慢性関節炎、単関
節関節炎、少数関節関節炎、慢性萎縮性先端皮膚炎、脳
炎、筋炎、角膜炎、慢性多発性神経炎および拡張型心筋
症が挙げられる。
障害が起こり、ライムボレリア病がＩＩＩ期に入ったこ
とを示している。この段階の徴候には慢性関節炎、単関
節関節炎、少数関節関節炎、慢性萎縮性先端皮膚炎、脳
炎、筋炎、角膜炎、慢性多発性神経炎および拡張型心筋
症が挙げられる。
【０００８】ライムボレリア病を起こすことが知られて
いるボレリアスピロヘータは最初はボレリア ブルグド
ルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉ）と称されていたが、現在は三つの主なゲノム種に分
類されている。Ｒ．Ｔ．Ｍａｒｃｏｎｉ ＆ Ｃ．Ｆ．
Ｇｕｒｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３
０：２８３０−３４（１９９２）を参照されたい。一つ
の群は種呼称Ｂ．ブルグドルフェリを保持しており、第
二の群はボレリア ガルニー（Ｂｏｒｒｅｌｉａｇａｒ
ｎｉｉ）と名付けられており、第三の群は種の名前が未
だ帰属されていず、ＶＳ４６１と称されている。
いるボレリアスピロヘータは最初はボレリア ブルグド
ルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉ）と称されていたが、現在は三つの主なゲノム種に分
類されている。Ｒ．Ｔ．Ｍａｒｃｏｎｉ ＆ Ｃ．Ｆ．
Ｇｕｒｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３
０：２８３０−３４（１９９２）を参照されたい。一つ
の群は種呼称Ｂ．ブルグドルフェリを保持しており、第
二の群はボレリア ガルニー（Ｂｏｒｒｅｌｉａｇａｒ
ｎｉｉ）と名付けられており、第三の群は種の名前が未
だ帰属されていず、ＶＳ４６１と称されている。
【０００９】別のボレリア種、Ｂ．ヘルムシー（ｈｅｒ
ｍｓｉｉ）はＢ．ブルグドルフェリと非常に近縁である
が異なったヒト疾患（回帰熱）に関連している。Ｂ．ヘ
ルムシーはＤＮＡハイブリダイゼーションによりＢ．パ
ルヘリ（ｐａｒｈｅｒｉ）およびＢ．トゥリカテ（ｔｕ
ｒｉｃａｔａｅ）と同一の種に属していると特性付けら
れているが、各々は特定の節足動物ベクターに特異的で
ある（Ｂａｒｂｅｒｉ＆ Ｈａｙｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５０：３９１−４００，１９８
６）。二つの他のボレリア種Ｂ．アンセリナ（ａｎｓｅ
ｒｉｎａ）およびＢ．コリアセエ（ｃｏｒｉａｃｅａ
ｅ）はＢ．ブルグドルフェリと非常に近縁であるが、ヒ
トに対して感染性ではない。
ｍｓｉｉ）はＢ．ブルグドルフェリと非常に近縁である
が異なったヒト疾患（回帰熱）に関連している。Ｂ．ヘ
ルムシーはＤＮＡハイブリダイゼーションによりＢ．パ
ルヘリ（ｐａｒｈｅｒｉ）およびＢ．トゥリカテ（ｔｕ
ｒｉｃａｔａｅ）と同一の種に属していると特性付けら
れているが、各々は特定の節足動物ベクターに特異的で
ある（Ｂａｒｂｅｒｉ＆ Ｈａｙｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５０：３９１−４００，１９８
６）。二つの他のボレリア種Ｂ．アンセリナ（ａｎｓｅ
ｒｉｎａ）およびＢ．コリアセエ（ｃｏｒｉａｃｅａ
ｅ）はＢ．ブルグドルフェリと非常に近縁であるが、ヒ
トに対して感染性ではない。
【００１０】ボレリア生物体は他のスピロヘータのよう
に波打った形および鞭毛を持っている。Ａ．Ｇ．Ｂａｒ
ｂｏｕｒ ＆ Ｓ．Ｆ．Ｈａｙｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｒｅｖ．，５０：３８１−４００（１９８６）。こ
れらの生物体はまた、染色体および環状というよりむし
ろ線状のいくつかの染色体外要素も持っている。Ａ．
Ｇ．Ｂａｒｂｏｕｒ ＆ Ｃ．Ｆ．Ｇａｒｏｎ，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３７：４０９（１９８７）。いくつかの表
面露出リポ蛋白質、ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢが同定され
ており、血清学的実験室試験において抗原マーカーとし
て使用された。
に波打った形および鞭毛を持っている。Ａ．Ｇ．Ｂａｒ
ｂｏｕｒ ＆ Ｓ．Ｆ．Ｈａｙｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｒｅｖ．，５０：３８１−４００（１９８６）。こ
れらの生物体はまた、染色体および環状というよりむし
ろ線状のいくつかの染色体外要素も持っている。Ａ．
Ｇ．Ｂａｒｂｏｕｒ ＆ Ｃ．Ｆ．Ｇａｒｏｎ，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２３７：４０９（１９８７）。いくつかの表
面露出リポ蛋白質、ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢが同定され
ており、血清学的実験室試験において抗原マーカーとし
て使用された。
【００１１】体液からのボレリア生物体の培養は困難で
あり、培養によるライムボレリア病の微生物学的診断を
不十分なものにしている。Ｂ．ブルグドルフェリを検出
するための血清学的試験が開発されており、酵素結合免
疫吸着アッセイ［ＥＬＩＳＡ］、間接免疫蛍光アッセイ
（ＩＦＡ）およびウェスタンブロッティングが挙げられ
ている。Ｍ．Ｇ．Ｇｏｌｉｇｈｔｌｙ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，９９：１６８−７４（１９９
３）を参照されたい。しかしながら、これらの血清学的
試験では標準化が難しく、偽りの陽性および偽りの陰性
結果を与えるのでその有効性は制限されている。Ｂａｒ
ｂｏｕｒ，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１１０：
５０４（１９８９）を参照されたい。
あり、培養によるライムボレリア病の微生物学的診断を
不十分なものにしている。Ｂ．ブルグドルフェリを検出
するための血清学的試験が開発されており、酵素結合免
疫吸着アッセイ［ＥＬＩＳＡ］、間接免疫蛍光アッセイ
（ＩＦＡ）およびウェスタンブロッティングが挙げられ
ている。Ｍ．Ｇ．Ｇｏｌｉｇｈｔｌｙ，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，９９：１６８−７４（１９９
３）を参照されたい。しかしながら、これらの血清学的
試験では標準化が難しく、偽りの陽性および偽りの陰性
結果を与えるのでその有効性は制限されている。Ｂａｒ
ｂｏｕｒ，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１１０：
５０４（１９８９）を参照されたい。
【００１２】感染初期（Ｉ期）またはＩＩ期の患者では
抗体が検出可能なレベルには達していず、トレポネマ
（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）またはライム病と関連しない他
のボレリアとの交差反応が起こるであろう。抗生物質に
よる処置はライムボレリア病患者における検出可能な抗
体の発生を妨げまたは遅延させるであろう。これらの欠
陥は、ライムボレリア病の診断および処置における血清
学的試験の有用性および信頼性を制限する。
抗体が検出可能なレベルには達していず、トレポネマ
（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）またはライム病と関連しない他
のボレリアとの交差反応が起こるであろう。抗生物質に
よる処置はライムボレリア病患者における検出可能な抗
体の発生を妨げまたは遅延させるであろう。これらの欠
陥は、ライムボレリア病の診断および処置における血清
学的試験の有用性および信頼性を制限する。
【００１３】感染作因の認識のためのプローブとして特
異的ヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドの使用
は問題のある免疫学的検出アッセイの代替物になってき
ている。ボレリアのゲノムおよびプラスミドＤＮＡ配列
の両方の少なくとも一部が得られている。Ｓｃｈｗａｎ
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７：１７
３４（１９８９）；Ｓｃｈｗａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５３９：４１９（１９８８）を参
照されたい。Ｂ．ブルグドルフェリの直線状プラスミド
から誘導された核酸ハイブリダイゼーションプローブが
製造され、多数のボレリア種からのＢ．ブルグドルフェ
リの同定に使用された。しかしながら、これらのプロー
ブはそのヌクレオチド配列が時間が経つと不安定にな
り、または病原性ボレリア単離物には存在しないかもし
れないプラスミドから誘導されているので生来的に制限
されている。特異的ボレリア遺伝子を標的とする他の核
酸ハイブリダイゼーションプローブもまた、標的とされ
た遺伝子の進化的安定性の程度に依存して生来的に制限
されている。例えば、Ｍａｌｌｏｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：１０８９（１９９０）；
Ｌｅｂａｃｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，２９：７３１−７３７；およびＧｏｏｄｍａｎ
ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：２６９−２７
８（１９９１）を参照されたい。
異的ヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドの使用
は問題のある免疫学的検出アッセイの代替物になってき
ている。ボレリアのゲノムおよびプラスミドＤＮＡ配列
の両方の少なくとも一部が得られている。Ｓｃｈｗａｎ
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７：１７
３４（１９８９）；Ｓｃｈｗａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５３９：４１９（１９８８）を参
照されたい。Ｂ．ブルグドルフェリの直線状プラスミド
から誘導された核酸ハイブリダイゼーションプローブが
製造され、多数のボレリア種からのＢ．ブルグドルフェ
リの同定に使用された。しかしながら、これらのプロー
ブはそのヌクレオチド配列が時間が経つと不安定にな
り、または病原性ボレリア単離物には存在しないかもし
れないプラスミドから誘導されているので生来的に制限
されている。特異的ボレリア遺伝子を標的とする他の核
酸ハイブリダイゼーションプローブもまた、標的とされ
た遺伝子の進化的安定性の程度に依存して生来的に制限
されている。例えば、Ｍａｌｌｏｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：１０８９（１９９０）；
Ｌｅｂａｃｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，２９：７３１−７３７；およびＧｏｏｄｍａｎ
ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５９：２６９−２７
８（１９９１）を参照されたい。
【００１４】無作為にクローン化したＢ．ブルグドルフ
ェリＤＮＡ配列が核酸プライマーを構築するのに使用さ
れ、これらのプライマーがＢ．ブルグドルフェリの標的
ＤＮＡ配列の増幅に使用された。Ｒｏｓａら、Ｊ．Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６０：１０１８（１９８９）を
参照されたい。しかしながら、Ｂ．ブルグドルフェリ単
離物の全ては検出されず、ライム病を起こす全てのＢ．
ブルグドルフェリを検出するためには不十分な核酸プラ
イマーであった。
ェリＤＮＡ配列が核酸プライマーを構築するのに使用さ
れ、これらのプライマーがＢ．ブルグドルフェリの標的
ＤＮＡ配列の増幅に使用された。Ｒｏｓａら、Ｊ．Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６０：１０１８（１９８９）を
参照されたい。しかしながら、Ｂ．ブルグドルフェリ単
離物の全ては検出されず、ライム病を起こす全てのＢ．
ブルグドルフェリを検出するためには不十分な核酸プラ
イマーであった。
【００１５】ＦｕｋｕｎａｇａおよびＳｏｈｎａｋａ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１８３：９５２
−５７（１９９２）；およびＰｏｓｔｉｃら、Ｒｅｓ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４１：４６５−４７５（１９
９０）によりＢ．ブルグドルフェリのリボソームＲＮＡ
（ｒＲＮＡ）遺伝子の地図が作製され、クローン化され
た。Ｂ．ブルグドルフェリは染色体当たり２３Ｓ ＲＮ
Ａ遺伝子の二つのコピーおよび１６Ｓ ｒＲＮＡをコー
ドしているたった一つのコピーのみを含んでいるようで
ある点において通常と異なっている。（Ｆｕｋｕｎａｇ
ａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３８：８
７１−８７７，１９９２）。ボレリア１６Ｓ ＲＮＡの
配列が培養Ｂ．ブルグドルフェリ生物体を検出できたハ
イブリダイゼーションプローブの設計に使用された。Ｍ
ａｒｃｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，３０：６２８−３２（１９９２）を参照された
い。生物体を培養せずに臨床試料中のＢ．ブルグドルフ
ェリを検出することに対するこのプローブの有用性は証
明されていない。
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１８３：９５２
−５７（１９９２）；およびＰｏｓｔｉｃら、Ｒｅｓ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４１：４６５−４７５（１９
９０）によりＢ．ブルグドルフェリのリボソームＲＮＡ
（ｒＲＮＡ）遺伝子の地図が作製され、クローン化され
た。Ｂ．ブルグドルフェリは染色体当たり２３Ｓ ＲＮ
Ａ遺伝子の二つのコピーおよび１６Ｓ ｒＲＮＡをコー
ドしているたった一つのコピーのみを含んでいるようで
ある点において通常と異なっている。（Ｆｕｋｕｎａｇ
ａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３８：８
７１−８７７，１９９２）。ボレリア１６Ｓ ＲＮＡの
配列が培養Ｂ．ブルグドルフェリ生物体を検出できたハ
イブリダイゼーションプローブの設計に使用された。Ｍ
ａｒｃｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，３０：６２８−３２（１９９２）を参照された
い。生物体を培養せずに臨床試料中のＢ．ブルグドルフ
ェリを検出することに対するこのプローブの有用性は証
明されていない。
【００１６】これらの制限を克服するため、ボレリア１
６Ｓ ｒＤＮＡを増幅するための広範囲の特異性を持つ
プライマー対を用いたリボソームＲＮＡ配列の核酸増幅
が記載されている。Ｍａｌｌｏｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：１０８９−９３（１９９
０）を参照されたい。しかしながら、使用された核酸プ
ライマーはＳ．オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）およびＰ．
アエルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）をもまた増幅
し、従ってボレリア ブルグドルフェリに特異的ではな
かった。
６Ｓ ｒＤＮＡを増幅するための広範囲の特異性を持つ
プライマー対を用いたリボソームＲＮＡ配列の核酸増幅
が記載されている。Ｍａｌｌｏｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：１０８９−９３（１９９
０）を参照されたい。しかしながら、使用された核酸プ
ライマーはＳ．オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）およびＰ．
アエルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）をもまた増幅
し、従ってボレリア ブルグドルフェリに特異的ではな
かった。
【００１７】１６Ｓ ｒＲＮＡ配列由来の四つの組のプ
ライマーが三つの異なったボレリアゲノム群のＤＮＡを
増幅するのに使用された。Ｒ．Ｔ．Ｍａｒｃｏｎｉおよ
びＣ．Ｆ．Ｂａｒｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．，３０：２８３０−３４（１９９２）を参照され
たい。ボレリア１６Ｓ ｒＲＮＡの８１９−８４２およ
び１１５３−１１７３位由来のたただ一つのプライマー
の組のみが試験された種々の培養ライム病単離物中に存
在するすべてのボレリア生物体を検出した。他のプライ
マーの組はライム病ボレリアの三つすべてを認識しなか
ったかまたはライム病に関係しないボレリアをも認識し
た。その他のプライマーの組は臨床単離物から培養され
た種々のボレリア生物体のすべてを増幅しなかった。１
６Ｓ ｒＲＮＡ配列および１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ
４領域が変化したボレリア ブルグドルフェリのサブタ
イプの増幅はＡｄａｍら、Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，
５９：２５７９−８５、により記載されている。ＰＣＲ
プライマーがＢ．ブルグドルフェリの２３Ｓ ｒＲＮＡ
の特異的領域を増幅するためおよびボレリアの他の種か
らそれを区別するために使用された。Ｓｃｈｗａｒｔｚ
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，３０：３０８２（１
９９２）を参照されたい。
ライマーが三つの異なったボレリアゲノム群のＤＮＡを
増幅するのに使用された。Ｒ．Ｔ．Ｍａｒｃｏｎｉおよ
びＣ．Ｆ．Ｂａｒｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．，３０：２８３０−３４（１９９２）を参照され
たい。ボレリア１６Ｓ ｒＲＮＡの８１９−８４２およ
び１１５３−１１７３位由来のたただ一つのプライマー
の組のみが試験された種々の培養ライム病単離物中に存
在するすべてのボレリア生物体を検出した。他のプライ
マーの組はライム病ボレリアの三つすべてを認識しなか
ったかまたはライム病に関係しないボレリアをも認識し
た。その他のプライマーの組は臨床単離物から培養され
た種々のボレリア生物体のすべてを増幅しなかった。１
６Ｓ ｒＲＮＡ配列および１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ
４領域が変化したボレリア ブルグドルフェリのサブタ
イプの増幅はＡｄａｍら、Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，
５９：２５７９−８５、により記載されている。ＰＣＲ
プライマーがＢ．ブルグドルフェリの２３Ｓ ｒＲＮＡ
の特異的領域を増幅するためおよびボレリアの他の種か
らそれを区別するために使用された。Ｓｃｈｗａｒｔｚ
ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，３０：３０８２（１
９９２）を参照されたい。
【００１８】ボレリア１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に相補的な
他のプローブがＷｅｉｓｂｕｒｇ、ＥＰＯ公開番号ＥＰ
Ｏ ０４２１ ７２５Ａ号、出願番号第９０３１０７６
６．２号、により記載されている。ＷｈｉｔｅおよびＤ
ｏｄｇｅ、ＰＣＴ ＵＳ９１／０１５７４号、はＢ．ブ
ルグドルフェリおよびＢ．ヘルムシーの１６Ｓ ｒＲＮ
Ａ遺伝子由来のプライマーおよびプローブを開示してい
る。
他のプローブがＷｅｉｓｂｕｒｇ、ＥＰＯ公開番号ＥＰ
Ｏ ０４２１ ７２５Ａ号、出願番号第９０３１０７６
６．２号、により記載されている。ＷｈｉｔｅおよびＤ
ｏｄｇｅ、ＰＣＴ ＵＳ９１／０１５７４号、はＢ．ブ
ルグドルフェリおよびＢ．ヘルムシーの１６Ｓ ｒＲＮ
Ａ遺伝子由来のプライマーおよびプローブを開示してい
る。
【００１９】ライム病の血清学的検出および同定におい
て現在は制限があるため、ライム病に関連するボレリア
のすべての地理的単離物を検出するための感度のよい方
法に対する要望が存在する。
て現在は制限があるため、ライム病に関連するボレリア
のすべての地理的単離物を検出するための感度のよい方
法に対する要望が存在する。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】本発明はボレリアのｒ
ＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）またはｒＤＮＡ（リボソー
ムＤＮＡ）ヌクレオチド配列の特定の領域に相補的であ
るように設計された新規かつ有用な増幅オリゴヌクレオ
チド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ、また
はボレリアｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列ま
たはその相補体の特定の部分に実質的に対応する核酸配
列を持つオリゴヌクレオチドを開示し、特許請求してい
る。これらの増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴ
ヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブは病原性ボレリアの１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮ
Ａ由来であるので、これらのｒＲＮＡ遺伝子から発現さ
れたＲＮＡのレベルがより高くなり、核酸配列の変化の
速度が遅く、および生物体間でのｒＲＮＡ配列の側方伝
達がなくなるためより優れた検出アッセイが得られる。
ＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）またはｒＤＮＡ（リボソー
ムＤＮＡ）ヌクレオチド配列の特定の領域に相補的であ
るように設計された新規かつ有用な増幅オリゴヌクレオ
チド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ、また
はボレリアｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列ま
たはその相補体の特定の部分に実質的に対応する核酸配
列を持つオリゴヌクレオチドを開示し、特許請求してい
る。これらの増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴ
ヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブは病原性ボレリアの１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮ
Ａ由来であるので、これらのｒＲＮＡ遺伝子から発現さ
れたＲＮＡのレベルがより高くなり、核酸配列の変化の
速度が遅く、および生物体間でのｒＲＮＡ配列の側方伝
達がなくなるためより優れた検出アッセイが得られる。
【００２１】増幅オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブはス
トリンジェントハイブリダイゼーションアッセイ条件
下、標的ボレリア１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡおよび
／またはｒＤＮＡ遺伝子配列にハイブリダイズすること
により機能する。好適な態様において、本明細書に記載
したプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドはボレリア
ブルグドルフェリ、ボレリア ガルニーおよびＶＳ４
６１群のボレリアを含むライム病関連ボレリアを、血液
または組織のような臨床試料中に観察される他の微生物
および他のボレリア種から区別できる。従って、本増幅
オリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッ
セイプローブはライム病関連ボレリアを特異的に検出お
よび／または定量するためのアッセイに使用されるであ
ろう。好適な態様において、本明細書に記載したハイブ
リダイゼーションアッセイプローブはストリンジェント
ハイブリダイゼーション条件下、ライム病関連ボレリア
からの核酸に選択的にハイブリダイズすることができ、
ボレリア ヘルムシーからの核酸にはハイブリダイズし
ない。本発明のいくつかの態様において、ハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブは標的配列へのプローブの
ハイブリダイゼーションの同定を助けるため、アクリジ
ニウムエステルまたは放射性同位元素のようなレポータ
ー基を含むオリゴヌクレオチドから成っている。本発明
のいくつかの態様において、増幅オリゴヌクレオチドは
随意にＲＮＡポリメラーゼにより認識されるか、または
ＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する核
酸配列を持っているものである。
レオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブはス
トリンジェントハイブリダイゼーションアッセイ条件
下、標的ボレリア１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡおよび
／またはｒＤＮＡ遺伝子配列にハイブリダイズすること
により機能する。好適な態様において、本明細書に記載
したプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドはボレリア
ブルグドルフェリ、ボレリア ガルニーおよびＶＳ４
６１群のボレリアを含むライム病関連ボレリアを、血液
または組織のような臨床試料中に観察される他の微生物
および他のボレリア種から区別できる。従って、本増幅
オリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッ
セイプローブはライム病関連ボレリアを特異的に検出お
よび／または定量するためのアッセイに使用されるであ
ろう。好適な態様において、本明細書に記載したハイブ
リダイゼーションアッセイプローブはストリンジェント
ハイブリダイゼーション条件下、ライム病関連ボレリア
からの核酸に選択的にハイブリダイズすることができ、
ボレリア ヘルムシーからの核酸にはハイブリダイズし
ない。本発明のいくつかの態様において、ハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブは標的配列へのプローブの
ハイブリダイゼーションの同定を助けるため、アクリジ
ニウムエステルまたは放射性同位元素のようなレポータ
ー基を含むオリゴヌクレオチドから成っている。本発明
のいくつかの態様において、増幅オリゴヌクレオチドは
随意にＲＮＡポリメラーゼにより認識されるか、または
ＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する核
酸配列を持っているものである。
【００２２】本発明はライム病関連ボレリアおよびボレ
リア ヘルムシーからの核酸の存在を検出するのに有用
なハイブリダイゼーションアッセイプローブを特色とす
る。好適には、ハイブリダイゼーションアッセイプロー
ブは以下のヌクレオチド配列から選択される： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
リア ヘルムシーからの核酸の存在を検出するのに有用
なハイブリダイゼーションアッセイプローブを特色とす
る。好適には、ハイブリダイゼーションアッセイプロー
ブは以下のヌクレオチド配列から選択される： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
【００２３】本発明はライム病関連ボレリアからの核酸
の存在を検出するのに有用なハイブリダイゼーションア
ッセイプローブを特色とする。これらのハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブは、好適には以下のヌクレオ
チド配列から選択される： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC。
の存在を検出するのに有用なハイブリダイゼーションア
ッセイプローブを特色とする。これらのハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブは、好適には以下のヌクレオ
チド配列から選択される： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC。
【００２４】本発明はまたボレリア ヘルムシー核酸を
検出するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブも特色とする。好適には、これらのハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配列
の一つから選択されるヌクレオチド配列を持っている： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
検出するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブも特色とする。好適には、これらのハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配列
の一つから選択されるヌクレオチド配列を持っている： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
【００２５】本発明の別の態様は本発明のハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブと一緒にヘルパーオリゴヌ
クレオチド（プローブ）を含むプローブ混合物である。
好適には、ヘルパーオリゴヌクレオチドは標的核酸への
アッセイプローブの特異的ハイブリダイゼーションを容
易にするために使用される；ヘルパーオリゴヌクレオチ
ドは本明細書において援用され、本発明と共通の所有権
を享有するＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎの米国特
許第５，０３０，５５７号に記載されている。本発明に
おいてヘルパープローブとして使用されるオリゴヌクレ
オチドには以下の配列が含まれる： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
ゼーションアッセイプローブと一緒にヘルパーオリゴヌ
クレオチド（プローブ）を含むプローブ混合物である。
好適には、ヘルパーオリゴヌクレオチドは標的核酸への
アッセイプローブの特異的ハイブリダイゼーションを容
易にするために使用される；ヘルパーオリゴヌクレオチ
ドは本明細書において援用され、本発明と共通の所有権
を享有するＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎの米国特
許第５，０３０，５５７号に記載されている。本発明に
おいてヘルパープローブとして使用されるオリゴヌクレ
オチドには以下の配列が含まれる： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
【００２６】本発明の別の態様はライム病関連ボレリア
を検出するための組成物であり、それは本発明のオリゴ
ヌクレオチドとライム病関連ボレリアからのヌクレオチ
ドポリマーの特定の領域との間で形成された核酸ハイブ
リッドである。一般的に、ヌクレオチドポリマーは本発
明のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体に実質的
に対応する核酸配列を含んでおり、ボレリアのリボソー
ムＲＮＡをコードしているｒＲＮＡまたはｒＤＮＡから
誘導される。これらの組成物に存在するオリゴヌクレオ
チドは増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレ
オチド、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ま
たはそれらの混合物であろう。従って、本発明の組成物
は一つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、一つ
またはそれ以上のヘルパーオリゴヌクレオチドおよび一
つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブを含んでいるであろう。
を検出するための組成物であり、それは本発明のオリゴ
ヌクレオチドとライム病関連ボレリアからのヌクレオチ
ドポリマーの特定の領域との間で形成された核酸ハイブ
リッドである。一般的に、ヌクレオチドポリマーは本発
明のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体に実質的
に対応する核酸配列を含んでおり、ボレリアのリボソー
ムＲＮＡをコードしているｒＲＮＡまたはｒＤＮＡから
誘導される。これらの組成物に存在するオリゴヌクレオ
チドは増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレ
オチド、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ま
たはそれらの混合物であろう。従って、本発明の組成物
は一つまたはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド、一つ
またはそれ以上のヘルパーオリゴヌクレオチドおよび一
つまたはそれ以上のハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブを含んでいるであろう。
【００２７】その標的配列へハイブリダイズしたプロー
ブを含んでいる本発明の組成物は核酸配列の存在を検出
するために有用である。その標的核酸配列へハイブリダ
イズしたヘルパーオリゴヌクレオチドを含んでいる本発
明の組成物はハイブリダイゼーションに利用可能な標的
核酸配列の特定の部分を作るために有用である。その標
的配列へハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライ
マーを含んでいる本発明の組成物はプライマーの３’末
端にポリメラーゼのための開始部位を作り出すために有
用である。
ブを含んでいる本発明の組成物は核酸配列の存在を検出
するために有用である。その標的核酸配列へハイブリダ
イズしたヘルパーオリゴヌクレオチドを含んでいる本発
明の組成物はハイブリダイゼーションに利用可能な標的
核酸配列の特定の部分を作るために有用である。その標
的配列へハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライ
マーを含んでいる本発明の組成物はプライマーの３’末
端にポリメラーゼのための開始部位を作り出すために有
用である。
【００２８】本発明はライム病に関連したボレリアの存
在を検出するための方法もまた企図しており、核酸ハイ
ブリダイゼーションアッセイプローブがボレリア ブル
グドルフェリ標的核酸配列へハイブリダイズできるがボ
レリア ヘルムシーからの核酸配列とはハイブリダイズ
しないストリンジェントハイブリダイゼーションアッセ
イ条件下、試験試料を核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイプローブと接触させる。本発明はまたこれらの方法
で使用されるオリゴヌクレオチドおよびその均等物も企
図しており、それらは標的配列へのプローブのハイブリ
ダイゼーションの同定の助けとなるレポーター分子を随
意に含んでいる。本発明は血液、血液由来試料、組織、
組織由来試料、他の体液および身体試料のようなヒトか
らの試験試料におけるボレリア核酸の存在を検出するの
に有用である。
在を検出するための方法もまた企図しており、核酸ハイ
ブリダイゼーションアッセイプローブがボレリア ブル
グドルフェリ標的核酸配列へハイブリダイズできるがボ
レリア ヘルムシーからの核酸配列とはハイブリダイズ
しないストリンジェントハイブリダイゼーションアッセ
イ条件下、試験試料を核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイプローブと接触させる。本発明はまたこれらの方法
で使用されるオリゴヌクレオチドおよびその均等物も企
図しており、それらは標的配列へのプローブのハイブリ
ダイゼーションの同定の助けとなるレポーター分子を随
意に含んでいる。本発明は血液、血液由来試料、組織、
組織由来試料、他の体液および身体試料のようなヒトか
らの試験試料におけるボレリア核酸の存在を検出するの
に有用である。
【００２９】核酸が少なくとも一つの本発明の増幅オリ
ゴヌクレオチドを用いて増幅される、ライム病関連ボレ
リアの存在を検出するための方法も本発明はまた企図し
ている。好適な態様において、そのような増幅後に検出
工程が続いており、そこでは本発明のオリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて増
幅された核酸が検出される。本発明の方法はまた、ＲＮ
Ａプロモーターのためのヌクレオチド配列を含む増幅オ
リゴヌクレオチドの使用も企図している。
ゴヌクレオチドを用いて増幅される、ライム病関連ボレ
リアの存在を検出するための方法も本発明はまた企図し
ている。好適な態様において、そのような増幅後に検出
工程が続いており、そこでは本発明のオリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて増
幅された核酸が検出される。本発明の方法はまた、ＲＮ
Ａプロモーターのためのヌクレオチド配列を含む増幅オ
リゴヌクレオチドの使用も企図している。
【００３０】別の態様において、本発明は増幅アッセイ
における、ボレリア ブルグドルフェリを含むライム病
関連スピロヘータの検出に有用な増幅オリゴヌクレオチ
ドを特色としている。そのようなオリゴマーは好適には
以下の配列の一つに実質的に対応している： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。 ここで、オリゴマーは修飾されていなくてもよいし、ま
たはＲＮＡポリメラーゼにより認識される５’末端への
特異的核酸配列（Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ ＲＮＡポリ
メラーゼのためのプロモーター配列が挙げられるが、こ
れらに制限されるわけではない）、および／またはＲＮ
ＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写の開始または伸長を促
進する配列の付加のような修飾を含んでいてもよい。プ
ロモーター配列の一つの例としては、配列ＩＤ番号：４
３、5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'が挙げられ
る。有用なプロモーター配列の別の例には、例えば、Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ
からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲベクターまたはＰｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ．からのｐＧＥＭＴＭベクター
を含む種々の市販品として入手可能なベクターが含まれ
る。
における、ボレリア ブルグドルフェリを含むライム病
関連スピロヘータの検出に有用な増幅オリゴヌクレオチ
ドを特色としている。そのようなオリゴマーは好適には
以下の配列の一つに実質的に対応している： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。 ここで、オリゴマーは修飾されていなくてもよいし、ま
たはＲＮＡポリメラーゼにより認識される５’末端への
特異的核酸配列（Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ ＲＮＡポリ
メラーゼのためのプロモーター配列が挙げられるが、こ
れらに制限されるわけではない）、および／またはＲＮ
ＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写の開始または伸長を促
進する配列の付加のような修飾を含んでいてもよい。プ
ロモーター配列の一つの例としては、配列ＩＤ番号：４
３、5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'が挙げられ
る。有用なプロモーター配列の別の例には、例えば、Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ
からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲベクターまたはＰｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ．からのｐＧＥＭＴＭベクター
を含む種々の市販品として入手可能なベクターが含まれ
る。
【００３１】本発明の別の態様において、増幅オリゴヌ
クレオチドは以下の配列に実質的に対応する配列を介し
て結合するかまたは配列の伸長を起こす： 配列ＩＤ番号３６：ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号３７：TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATA
GAGGAAG 配列ＩＤ番号３８：TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGG
GTGG 配列ＩＤ番号３９：ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号４０：CCCGTTTCCCATCGACTACACTTTTCAG 配列ＩＤ番号４１：GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC 配列ＩＤ番号４２：CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号５１：ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU 配列ＩＤ番号５２：UAUGUUGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUA
GAGGAAG 配列ＩＤ番号５３：UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGG
GUGG 配列ＩＤ番号５４：ACGCUCGCCCCUUACGUAUUACCGCGGCU 配列ＩＤ番号５５：CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG 配列ＩＤ番号５６：GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG および 配列ＩＤ番号５７：CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG。
クレオチドは以下の配列に実質的に対応する配列を介し
て結合するかまたは配列の伸長を起こす： 配列ＩＤ番号３６：ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号３７：TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATA
GAGGAAG 配列ＩＤ番号３８：TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGG
GTGG 配列ＩＤ番号３９：ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号４０：CCCGTTTCCCATCGACTACACTTTTCAG 配列ＩＤ番号４１：GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC 配列ＩＤ番号４２：CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号５１：ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU 配列ＩＤ番号５２：UAUGUUGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUA
GAGGAAG 配列ＩＤ番号５３：UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGG
GUGG 配列ＩＤ番号５４：ACGCUCGCCCCUUACGUAUUACCGCGGCU 配列ＩＤ番号５５：CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG 配列ＩＤ番号５６：GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG および 配列ＩＤ番号５７：CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG。
【００３２】本発明の別の態様は、増幅オリゴヌクレオ
チド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブを含む一つまたはそれ以上
の本発明のオリゴヌクレオチドを含むキットを含んでい
る。好適な態様において、本発明のキットは少なくとも
一つの増幅オリゴヌクレオチド、および他の微生物およ
び他のボレリア種からライム病関連ボレリアを区別でき
る一つのハイブリダイゼーションアッセイプローブを含
んでいる。
チド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブを含む一つまたはそれ以上
の本発明のオリゴヌクレオチドを含むキットを含んでい
る。好適な態様において、本発明のキットは少なくとも
一つの増幅オリゴヌクレオチド、および他の微生物およ
び他のボレリア種からライム病関連ボレリアを区別でき
る一つのハイブリダイゼーションアッセイプローブを含
んでいる。
【００３３】特定の核酸配列を検出するための核酸ハイ
ブリダイゼーションの使用の基礎的な記述は、Ｋｏｈｎ
ｅ（１９８９年７月２５日に公開された米国特許第４，
８５１，３３０号）およびＨｏｇａｎら（”非ウイルス
生物体の検出および／または定量のための核酸プロー
ブ”と題された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／０
３００９）により与えられている（両方の参照文献とも
本明細書において援用される）。Ｈｏｇａｎらは（上記
文献）試料（例えば、痰、尿、血液および組織切片、食
品、土壌および水）中の非ウイルス生物体または非ウイ
ルス生物体の群の存在を決定するための方法を記載して
いる。
ブリダイゼーションの使用の基礎的な記述は、Ｋｏｈｎ
ｅ（１９８９年７月２５日に公開された米国特許第４，
８５１，３３０号）およびＨｏｇａｎら（”非ウイルス
生物体の検出および／または定量のための核酸プロー
ブ”と題された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／０
３００９）により与えられている（両方の参照文献とも
本明細書において援用される）。Ｈｏｇａｎらは（上記
文献）試料（例えば、痰、尿、血液および組織切片、食
品、土壌および水）中の非ウイルス生物体または非ウイ
ルス生物体の群の存在を決定するための方法を記載して
いる。
【００３４】
【課題を解決するための手段】Ａ．定義 以下の用語は特別に異なった意味を持つように指示しな
い限り、本明細書においては指示された意味を持ってい
る。
い限り、本明細書においては指示された意味を持ってい
る。
【００３５】”標的核酸”とは標的ヌクレオチド配列を
持っている核酸を意味している。”オリゴヌクレオチ
ド”とはお互いに共有結合で結合された二つ以上のヌク
レオチドサブユニットから作製された一本鎖ヌクレオチ
ドポリマーを意味している。好適には、１０から１００
の間のヌクレオチドユニットが存在し、より好適には１
２から５０の間のヌクレオチドサブユニットがお互いに
結合されている。ヌクレオチドサブユニットの糖部分は
リボースでも、デオキシリボースでも、または０−メチ
ルリボースのようなそれらの修飾誘導体でもよい。オリ
ゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットはホスホジ
エステル結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホ
ネート結合またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ
ーションを妨害しない他の希なまたは天然に存在しない
結合により結合されているであろう。さらに、オリゴヌ
クレオチドは普通には存在しないヌクレオチドまたは非
ヌクレオチド残基を持っていてもよい。本明細書で定義
されるように、オリゴヌクレオチドは核酸であるが（好
適にはＤＮＡ）、ＲＮＡまたは共有結合で結合されたリ
ボ−およびデオキシリボヌクレオチドの組み合わせでも
よい。決められた配列のオリゴヌクレオチドプローブお
よび増幅オリゴヌクレオチドは、化学的または生化学的
合成および例えば、細菌またはレトロウイルスベクター
のような組換え核酸分子からのインビトロまたはインビ
ボ発現によるような当業者には既知の技術により製造さ
れる。本開示により意図されるように、オリゴヌクレオ
チドは野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写生成
物からは成っていない。プローブの一つの使用はハイブ
リダイゼーションアッセイプローブとしてであり；プロ
ーブは病気にかかった、感染したまたは病原性の細胞に
おいての遺伝子転写または翻訳を阻止または阻害するた
めのインビボまたはインビトロ治療増幅オリゴマーまた
はアンチセンス剤としても使用されるであろう。
持っている核酸を意味している。”オリゴヌクレオチ
ド”とはお互いに共有結合で結合された二つ以上のヌク
レオチドサブユニットから作製された一本鎖ヌクレオチ
ドポリマーを意味している。好適には、１０から１００
の間のヌクレオチドユニットが存在し、より好適には１
２から５０の間のヌクレオチドサブユニットがお互いに
結合されている。ヌクレオチドサブユニットの糖部分は
リボースでも、デオキシリボースでも、または０−メチ
ルリボースのようなそれらの修飾誘導体でもよい。オリ
ゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットはホスホジ
エステル結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホ
ネート結合またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ
ーションを妨害しない他の希なまたは天然に存在しない
結合により結合されているであろう。さらに、オリゴヌ
クレオチドは普通には存在しないヌクレオチドまたは非
ヌクレオチド残基を持っていてもよい。本明細書で定義
されるように、オリゴヌクレオチドは核酸であるが（好
適にはＤＮＡ）、ＲＮＡまたは共有結合で結合されたリ
ボ−およびデオキシリボヌクレオチドの組み合わせでも
よい。決められた配列のオリゴヌクレオチドプローブお
よび増幅オリゴヌクレオチドは、化学的または生化学的
合成および例えば、細菌またはレトロウイルスベクター
のような組換え核酸分子からのインビトロまたはインビ
ボ発現によるような当業者には既知の技術により製造さ
れる。本開示により意図されるように、オリゴヌクレオ
チドは野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写生成
物からは成っていない。プローブの一つの使用はハイブ
リダイゼーションアッセイプローブとしてであり；プロ
ーブは病気にかかった、感染したまたは病原性の細胞に
おいての遺伝子転写または翻訳を阻止または阻害するた
めのインビボまたはインビトロ治療増幅オリゴマーまた
はアンチセンス剤としても使用されるであろう。
【００３６】”標的核酸配列”、”標的ヌクレオチド配
列”または”標的配列”とは一本鎖核酸分子の全部また
は一部のヌクレオチド配列およびそれらに相補的なデオ
キシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列から
なる特異的デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレ
オチド配列を意味している。
列”または”標的配列”とは一本鎖核酸分子の全部また
は一部のヌクレオチド配列およびそれらに相補的なデオ
キシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列から
なる特異的デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレ
オチド配列を意味している。
【００３７】核酸ハイブリダイゼーションとは、完全に
または一部が相補的であるヌクレオチド配列を持つ二つ
の核酸鎖が前もって決定された反応条件下でお互いに一
緒になって特異的水素結合を持つ安定な二本鎖ハイブリ
ッドを形成する過程である。
または一部が相補的であるヌクレオチド配列を持つ二つ
の核酸鎖が前もって決定された反応条件下でお互いに一
緒になって特異的水素結合を持つ安定な二本鎖ハイブリ
ッドを形成する過程である。
【００３８】どちらの核酸鎖もデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）かまたはリボ核酸（ＲＮＡ）であり；従ってハイブ
リダイゼーションによりＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、
ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＤＮＡハイ
ブリッドが生成する。
Ａ）かまたはリボ核酸（ＲＮＡ）であり；従ってハイブ
リダイゼーションによりＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、
ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＤＮＡハイ
ブリッドが生成する。
【００３９】本明細書で使用する場合の用語”ハイブリ
ダイゼーション”とは二つの相補的または部分的に相補
的な一本鎖核酸が逆平行配位で一緒になって二本鎖領域
を持つ安定な構造を形成する能力を指している。この二
本鎖構造（しばしばハイブリッドと呼ばれる）の構成鎖
は水素結合によりお互いに保たれている。これらの水素
結合は一本鎖核酸上に塩基アデニンおよびチミンまたは
ウラシル（ＡおよびＴまたはＵ）またはシトシンおよび
グアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間で最も普
通に形成されるが、これらの”規範的”対の構成要素で
はない塩基間でも塩基対形成は形成できる。非規範的塩
基対形成は本分野ではよく知られている。例えば、Ｔｈ
ｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（Ａｄａｍｓら、編、１９９２）を
参照されたい。
ダイゼーション”とは二つの相補的または部分的に相補
的な一本鎖核酸が逆平行配位で一緒になって二本鎖領域
を持つ安定な構造を形成する能力を指している。この二
本鎖構造（しばしばハイブリッドと呼ばれる）の構成鎖
は水素結合によりお互いに保たれている。これらの水素
結合は一本鎖核酸上に塩基アデニンおよびチミンまたは
ウラシル（ＡおよびＴまたはＵ）またはシトシンおよび
グアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間で最も普
通に形成されるが、これらの”規範的”対の構成要素で
はない塩基間でも塩基対形成は形成できる。非規範的塩
基対形成は本分野ではよく知られている。例えば、Ｔｈ
ｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（Ａｄａｍｓら、編、１９９２）を
参照されたい。
【００４０】”ストリンジェント”ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ条件とは、特異的ハイブリダイゼーション
アッセイプローブが他の微生物（例えば、ボレリア ヘ
ルムシー）またはヒトに由来する試験試料中に存在する
他の核酸の中で標的核酸（好適にはライム病関連ボレリ
アのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）とハイブリダイズできる
条件を意味している。これらの条件は、ＧＣ含量および
プローブの長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブ
リダイゼーション試薬または溶液の組成、および考えら
れたハイブリダイゼーション特異性の程度を含む因子に
依存して変化するであろうことが理解されるであろう。
特異的ストリンジェント条件は以下の開示で提供され
る。
ョンアッセイ条件とは、特異的ハイブリダイゼーション
アッセイプローブが他の微生物（例えば、ボレリア ヘ
ルムシー）またはヒトに由来する試験試料中に存在する
他の核酸の中で標的核酸（好適にはライム病関連ボレリ
アのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）とハイブリダイズできる
条件を意味している。これらの条件は、ＧＣ含量および
プローブの長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブ
リダイゼーション試薬または溶液の組成、および考えら
れたハイブリダイゼーション特異性の程度を含む因子に
依存して変化するであろうことが理解されるであろう。
特異的ストリンジェント条件は以下の開示で提供され
る。
【００４１】”プローブ”とは検出されるべきと考えら
れた核酸配列にストリンジェントハイブリダイゼーショ
ン条件下でハイブリダイズするようにその配列と部分的
または完全に相補的である配列を持つ一本鎖オリゴヌク
レオチドを意味している。用語”プローブ”では天然に
存在する核酸は除かれる。精製されたオリゴヌクレオチ
ドプローブは化学合成および組換え核酸分子（例えば、
レトロウイルスベクター）からのインビトロおよびイン
ビボ発現のような本分野で知られている技術により製造
される。好適には、プローブは１０から１００ヌクレオ
チドの長さである。プローブは、ストリンジェントハイ
ブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションに
実質的に影響を与えない限り、標的配列に相補的でない
領域を持っていてもよい。もしそのような領域が存在す
るならば、それらはＲＮＡ転写のための５’プロモータ
ー配列および／または結合部位、制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位を含むか、またはプローブまたは標的核酸上
に、またはその両方に触媒活性部位またはヘアピン構造
のような所望の二次または三次構造を与えるであろう配
列を含んでいるであろう。プローブが標的配列へハイブ
リダイズしたことを検出または確認するために使用でき
る放射性同位元素、蛍光または化学発光残基のようなレ
ポーター基残基、酵素または他のリガンドで修飾されて
いるであろう。
れた核酸配列にストリンジェントハイブリダイゼーショ
ン条件下でハイブリダイズするようにその配列と部分的
または完全に相補的である配列を持つ一本鎖オリゴヌク
レオチドを意味している。用語”プローブ”では天然に
存在する核酸は除かれる。精製されたオリゴヌクレオチ
ドプローブは化学合成および組換え核酸分子（例えば、
レトロウイルスベクター）からのインビトロおよびイン
ビボ発現のような本分野で知られている技術により製造
される。好適には、プローブは１０から１００ヌクレオ
チドの長さである。プローブは、ストリンジェントハイ
ブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションに
実質的に影響を与えない限り、標的配列に相補的でない
領域を持っていてもよい。もしそのような領域が存在す
るならば、それらはＲＮＡ転写のための５’プロモータ
ー配列および／または結合部位、制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位を含むか、またはプローブまたは標的核酸上
に、またはその両方に触媒活性部位またはヘアピン構造
のような所望の二次または三次構造を与えるであろう配
列を含んでいるであろう。プローブが標的配列へハイブ
リダイズしたことを検出または確認するために使用でき
る放射性同位元素、蛍光または化学発光残基のようなレ
ポーター基残基、酵素または他のリガンドで修飾されて
いるであろう。
【００４２】本開示において使用される特異的配列の
群”より選択される配列から本質的に成る核酸配列を持
つプローブ（またはオリゴヌクレオチド）”という句
は、そのプローブが（基本的はおよび新規で特徴的なも
のとして）ストリンジェントハイブリダイゼーション条
件下、掲げた核酸配列の群の一つの配列の正確な相補体
を持つ核酸へ安定にハイブリダイズできることを意味し
ている。正確な相補体には対応するＤＮＡまたはＲＮＡ
配列が含まれる。
群”より選択される配列から本質的に成る核酸配列を持
つプローブ（またはオリゴヌクレオチド）”という句
は、そのプローブが（基本的はおよび新規で特徴的なも
のとして）ストリンジェントハイブリダイゼーション条
件下、掲げた核酸配列の群の一つの配列の正確な相補体
を持つ核酸へ安定にハイブリダイズできることを意味し
ている。正確な相補体には対応するＤＮＡまたはＲＮＡ
配列が含まれる。
【００４３】句”核酸配列に実質的に対応している”と
は引き合いに出された核酸は十分に核酸配列と類似して
おり、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件
下、同一の標的核酸配列とハイブリダイズするであろう
という点で引き合いに出された核酸は核酸配列と類似の
ハイブリダイゼーション特性を持っている。
は引き合いに出された核酸は十分に核酸配列と類似して
おり、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件
下、同一の標的核酸配列とハイブリダイズするであろう
という点で引き合いに出された核酸は核酸配列と類似の
ハイブリダイゼーション特性を持っている。
【００４４】本発明の実質的に対応するプローブおよび
プライマーは引き合いに出された配列と変わっていても
よいが、依然として同一の標的核酸配列にハイブリダイ
ズすることを当業者は理解するであろう。当業者はま
た、この変異はプローブまたはプライマー中の同一でな
い塩基の数、または標的核酸配列の対応する塩基へハイ
ブリダイズしないプローブの不適正塩基の数として表現
できることも理解するであろう。本発明のプローブまた
はプライマーは、もしこれらのパーセントが１００％か
ら８０％であるか、または１０ヌクレオチド標的配列中
の不適正が０塩基から１０ヌクレオチド標的配列中の不
適正が２塩基であるならば実質的に対応している。
プライマーは引き合いに出された配列と変わっていても
よいが、依然として同一の標的核酸配列にハイブリダイ
ズすることを当業者は理解するであろう。当業者はま
た、この変異はプローブまたはプライマー中の同一でな
い塩基の数、または標的核酸配列の対応する塩基へハイ
ブリダイズしないプローブの不適正塩基の数として表現
できることも理解するであろう。本発明のプローブまた
はプライマーは、もしこれらのパーセントが１００％か
ら８０％であるか、または１０ヌクレオチド標的配列中
の不適正が０塩基から１０ヌクレオチド標的配列中の不
適正が２塩基であるならば実質的に対応している。
【００４５】好適な態様において、このパーセントは１
００％から８５％である。より好適な態様において、こ
のパーセントは９０％から１００％であり；別の好適な
態様において、このパーセントは９５％から１００％で
ある。当業者は受容不可能なレベルの非特異的ハイブリ
ダイゼーションを起こすことなく、特異的標的配列への
ハイブリダイゼーションを可能にする相補性の種々のパ
ーセントで必要とされるであろうハイブリダイゼーショ
ン条件の種々の変更を理解するであろう。
００％から８５％である。より好適な態様において、こ
のパーセントは９０％から１００％であり；別の好適な
態様において、このパーセントは９５％から１００％で
ある。当業者は受容不可能なレベルの非特異的ハイブリ
ダイゼーションを起こすことなく、特異的標的配列への
ハイブリダイゼーションを可能にする相補性の種々のパ
ーセントで必要とされるであろうハイブリダイゼーショ
ン条件の種々の変更を理解するであろう。
【００４６】”核酸ハイブリッド”または”ハイブリッ
ド”とは二本鎖、水素結合領域（好適には１０から１０
０ヌクレオチドの間の長さで、最も好適には約１２から
５０ヌクレオチドの間の長さで）を含む核酸構造を意味
しており、ここで各々の鎖は相手と相補的であり、およ
びこの領域は化学発光または蛍光光検出、オートラジオ
グラフィーまたはゲル電気泳動を含む（これらに制限さ
れるわけではない）方法により検出されるようにストリ
ンジェントハイブリダイゼーション条件下で十分に安定
である。そのようなハイブリッドはＲＮＡ：ＲＮＡ、Ｒ
ＮＡ：ＤＮＡまたはＤＮＡ：ＤＮＡデュープレックス分
子から成っている。
ド”とは二本鎖、水素結合領域（好適には１０から１０
０ヌクレオチドの間の長さで、最も好適には約１２から
５０ヌクレオチドの間の長さで）を含む核酸構造を意味
しており、ここで各々の鎖は相手と相補的であり、およ
びこの領域は化学発光または蛍光光検出、オートラジオ
グラフィーまたはゲル電気泳動を含む（これらに制限さ
れるわけではない）方法により検出されるようにストリ
ンジェントハイブリダイゼーション条件下で十分に安定
である。そのようなハイブリッドはＲＮＡ：ＲＮＡ、Ｒ
ＮＡ：ＤＮＡまたはＤＮＡ：ＤＮＡデュープレックス分
子から成っている。
【００４７】”相補的”とは二つの一本鎖核酸の類似の
領域または同一の一本鎖核酸の異なった領域のヌクレオ
チド配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条
件下、一本鎖が一緒になって安定な二本鎖水素結合領域
にハイブリダイズすることを可能にするヌクレオチド塩
基組成を持っていることを意味している。一つの一本鎖
領域のヌクレオチドの隣接する配列が他の一本鎖領域の
ヌクレオチドの類似の配列と一連の”規範的”水素結合
塩基対（ＡはＵまたはＴと対合し、ＣがＧと対合するよ
うな）を形成できるとき、ヌクレオチド配列は”完全
に”相補的である。
領域または同一の一本鎖核酸の異なった領域のヌクレオ
チド配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条
件下、一本鎖が一緒になって安定な二本鎖水素結合領域
にハイブリダイズすることを可能にするヌクレオチド塩
基組成を持っていることを意味している。一つの一本鎖
領域のヌクレオチドの隣接する配列が他の一本鎖領域の
ヌクレオチドの類似の配列と一連の”規範的”水素結合
塩基対（ＡはＵまたはＴと対合し、ＣがＧと対合するよ
うな）を形成できるとき、ヌクレオチド配列は”完全
に”相補的である。
【００４８】”保存的に修飾された変異体”とは別の核
酸の核酸領域と相補的であるヌクレオチド配列を持って
いる核酸またはオリゴヌクレオチドを意味しており、そ
のような領域は順番に参照核酸と完全に相補的である。
そのような保存的に修飾された変異体はストリンジェン
トハイブリダイゼーション条件下、ボレリアヌクレオチ
ド配列を持つ標的核酸領域と安定にハイブリダイズでき
る。
酸の核酸領域と相補的であるヌクレオチド配列を持って
いる核酸またはオリゴヌクレオチドを意味しており、そ
のような領域は順番に参照核酸と完全に相補的である。
そのような保存的に修飾された変異体はストリンジェン
トハイブリダイゼーション条件下、ボレリアヌクレオチ
ド配列を持つ標的核酸領域と安定にハイブリダイズでき
る。
【００４９】”増幅オリゴヌクレオチド”とは標的核酸
配列とハイブリダイズでき、および核酸合成のためのプ
ライマーまたは核酸合成開始のためのプロモーター鋳型
（例えば、相補鎖合成のための、それにより機能性プロ
モーター配列が形成される）またはその両方として働く
ことができるオリゴヌクレオチドを意味している。もし
増幅オリゴヌクレオチドがＲＮＡ合成を開始させるよう
に設計されているとしたら、オリゴヌクレオチドは標的
配列とは相補的ではないが、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ
７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような）
により認識されるヌクレオチド配列を含んでいるであろ
う。増幅ヌクレオチドはプライマー伸長を阻害するまた
はその量を少なくするように修飾された３’末端を持っ
ていてもよいし、持っていなくてもよい。本明細書で定
義されたように、増幅ヌクレオチドは好適には１０から
１００ヌクレオチドの間の長さであろう；最も好適であ
るのは約１２から５０ヌクレオチドの間の長さであろ
う。本発明の増幅オリゴヌクレオチドは化学的に合成さ
れるかまたはベクターから誘導されるが、そのようなオ
リゴヌクレオチドは天然に存在する核酸ではない。
配列とハイブリダイズでき、および核酸合成のためのプ
ライマーまたは核酸合成開始のためのプロモーター鋳型
（例えば、相補鎖合成のための、それにより機能性プロ
モーター配列が形成される）またはその両方として働く
ことができるオリゴヌクレオチドを意味している。もし
増幅オリゴヌクレオチドがＲＮＡ合成を開始させるよう
に設計されているとしたら、オリゴヌクレオチドは標的
配列とは相補的ではないが、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ
７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような）
により認識されるヌクレオチド配列を含んでいるであろ
う。増幅ヌクレオチドはプライマー伸長を阻害するまた
はその量を少なくするように修飾された３’末端を持っ
ていてもよいし、持っていなくてもよい。本明細書で定
義されたように、増幅ヌクレオチドは好適には１０から
１００ヌクレオチドの間の長さであろう；最も好適であ
るのは約１２から５０ヌクレオチドの間の長さであろ
う。本発明の増幅オリゴヌクレオチドは化学的に合成さ
れるかまたはベクターから誘導されるが、そのようなオ
リゴヌクレオチドは天然に存在する核酸ではない。
【００５０】”核酸増幅”または”標的増幅”とは少な
くとも一つの標的核酸配列を持つ核酸分子の数を増加さ
せることを意味している。”アンチセンス”または”負
のセンス”とは参照核酸配列と相補的な核酸配列を持っ
ていることを意味している。
くとも一つの標的核酸配列を持つ核酸分子の数を増加さ
せることを意味している。”アンチセンス”または”負
のセンス”とは参照核酸配列と相補的な核酸配列を持っ
ていることを意味している。
【００５１】”センス”、”同一センス”または”正の
センス”とは参照核酸配列と類似の核酸配列を持ってい
ることを意味している。”ヘルパーオリゴヌクレオチ
ド”とは標識プローブと異なった場所で標的核酸とハイ
ブリダイズするように設計された核酸プローブを意味し
ており、それにより標識プローブのハイブリダイゼーシ
ョン速度を増加させ、または標的：標識プローブハイブ
リッドの融解温度（Ｔｍ）を高め、またはその両方を行
う。
センス”とは参照核酸配列と類似の核酸配列を持ってい
ることを意味している。”ヘルパーオリゴヌクレオチ
ド”とは標識プローブと異なった場所で標的核酸とハイ
ブリダイズするように設計された核酸プローブを意味し
ており、それにより標識プローブのハイブリダイゼーシ
ョン速度を増加させ、または標的：標識プローブハイブ
リッドの融解温度（Ｔｍ）を高め、またはその両方を行
う。
【００５２】”ライム病関連ボレリア”とはライム病を
起こすボレリア種であり、亞種ボレリア ブルグドルフ
ェリ、ボレリア ガルニーおよびボレリアＶＳ４６１が
含まれる。典型的には、ライム病関連ボレリアはライム
病に罹患した哺乳類から単離できる。
起こすボレリア種であり、亞種ボレリア ブルグドルフ
ェリ、ボレリア ガルニーおよびボレリアＶＳ４６１が
含まれる。典型的には、ライム病関連ボレリアはライム
病に罹患した哺乳類から単離できる。
【００５３】”系統発生的に密接に関係した”とは生物
体が進化的意味においてお互いに密接に関係しており、
従ってより遠い関係の生物体より形態学における著しい
類似性およびより高い全核酸配列相同性を持っているで
あろう。系統発生樹上で隣りおよび隣の次の位置を占め
る生物体は密接に関係している。系統発生樹上で隣りお
よび隣の次よりさらに離れた位置を占める生物体は、も
しそれらが著しい全核酸配列相同性を持っているならば
密接に関係しているであろう。
体が進化的意味においてお互いに密接に関係しており、
従ってより遠い関係の生物体より形態学における著しい
類似性およびより高い全核酸配列相同性を持っているで
あろう。系統発生樹上で隣りおよび隣の次の位置を占め
る生物体は密接に関係している。系統発生樹上で隣りお
よび隣の次よりさらに離れた位置を占める生物体は、も
しそれらが著しい全核酸配列相同性を持っているならば
密接に関係しているであろう。
【００５４】Ｂ．ハイブリダイゼーション条件およびプ
ローブ／プライマー設計 ハイブリダイゼーション反応条件（ハイブリダイゼーシ
ョンの温度およびハイブリダイゼーション溶液中の塩濃
度が最も重要）は本発明の増幅オリゴヌクレオチドまた
はハイブリダイゼーションプローブが標的ボレリアヌク
レオチド配列を持つ核酸と優先的にハイブリダイズ可能
にし、試験試料中に存在していると疑われる他の選ばれ
ていない核酸とはハイブリダイズしないように選択でき
る。塩濃度が減少および／または温度が上昇（ストリン
ジェンシーの増加と呼ばれる）すると、二本鎖ハイブリ
ッド分子において対合したヌクレオチド塩基間の水素結
合が破壊されるので核酸ハイブリダイゼーションの程度
が減少する；この過程は”融解”と呼ばれている。
ローブ／プライマー設計 ハイブリダイゼーション反応条件（ハイブリダイゼーシ
ョンの温度およびハイブリダイゼーション溶液中の塩濃
度が最も重要）は本発明の増幅オリゴヌクレオチドまた
はハイブリダイゼーションプローブが標的ボレリアヌク
レオチド配列を持つ核酸と優先的にハイブリダイズ可能
にし、試験試料中に存在していると疑われる他の選ばれ
ていない核酸とはハイブリダイズしないように選択でき
る。塩濃度が減少および／または温度が上昇（ストリン
ジェンシーの増加と呼ばれる）すると、二本鎖ハイブリ
ッド分子において対合したヌクレオチド塩基間の水素結
合が破壊されるので核酸ハイブリダイゼーションの程度
が減少する；この過程は”融解”と呼ばれている。
【００５５】一般的に言って、最も安定なハイブリッド
は最も多くの隣接する完全に一致した（即ち、水素結合
された）ヌクレオチド塩基対を持つものである。従っ
て、そのようなハイブリッドは通常ハイブリダイゼーシ
ョン条件のストリンジェンシーを増加させた場合最も遅
く融解することが期待されるであろう。しかしながら、
一つまたはそれ以上の不適正な（”非規範的”）または
不完全な塩基対（核酸のヌクレオチド配列のその位置で
より弱い塩基対合を生じるかまたは塩基対合が存在しな
い結果を生む）を含む二本鎖核酸領域は、それでも試験
試料中に存在する他の選ばれていない核酸と交差反応す
ることなくハイブリダイゼーションアッセイで検出され
るべき核酸ハイブリッドを与える比較的高いストリンジ
ェンシー条件下で十分に安定である。
は最も多くの隣接する完全に一致した（即ち、水素結合
された）ヌクレオチド塩基対を持つものである。従っ
て、そのようなハイブリッドは通常ハイブリダイゼーシ
ョン条件のストリンジェンシーを増加させた場合最も遅
く融解することが期待されるであろう。しかしながら、
一つまたはそれ以上の不適正な（”非規範的”）または
不完全な塩基対（核酸のヌクレオチド配列のその位置で
より弱い塩基対合を生じるかまたは塩基対合が存在しな
い結果を生む）を含む二本鎖核酸領域は、それでも試験
試料中に存在する他の選ばれていない核酸と交差反応す
ることなくハイブリダイゼーションアッセイで検出され
るべき核酸ハイブリッドを与える比較的高いストリンジ
ェンシー条件下で十分に安定である。
【００５６】これ故、標的核酸のヌクレオチド配列およ
び系統発生的に別個のものに属するが一方密接に関係し
た非標的核酸のヌクレオチド配列間の類似性の程度、お
よび特定の増幅オリゴヌクレオチドまたはハイブリダイ
ゼーションプローブのヌクレオチド配列および他の標的
および非標的核酸のヌクレオチド配列間の相補性の程度
に依存して、一つまたはそれ以上の不適正は標的核酸へ
ハイブリダイズし、非標的核酸へハイブリダイズしない
オリゴヌクレオチドの能力を必ずしもくじくわけではな
いであろう。
び系統発生的に別個のものに属するが一方密接に関係し
た非標的核酸のヌクレオチド配列間の類似性の程度、お
よび特定の増幅オリゴヌクレオチドまたはハイブリダイ
ゼーションプローブのヌクレオチド配列および他の標的
および非標的核酸のヌクレオチド配列間の相補性の程度
に依存して、一つまたはそれ以上の不適正は標的核酸へ
ハイブリダイズし、非標的核酸へハイブリダイズしない
オリゴヌクレオチドの能力を必ずしもくじくわけではな
いであろう。
【００５７】本発明のハイブリダイゼーションアッセイ
プローブはプローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔ
ｍ、与えられた反応混合物中の潜在的二本鎖分子の半分
が一本鎖の変性された状態にある温度として定義され
る）およびプローブと試験試料中に存在すると予想され
る系統発生的に最も密接に関係した生物体のｒＲＮＡま
たはｒＤＮＡ（検出されるべきとは求められていない）
のＴｍ間の相違が最大になるように選択、抜粋および／
または設計された。非標識増幅オリゴヌクレオチドおよ
びヘルパーオリゴヌクレオチドは本発明で有用な標識ハ
イブリダイゼーションアッセイプローブのように非常に
高程度の特異性を持つ必要はないので、それらは他の核
酸を制して一つまたはそれ以上の標的核酸へ優先的にハ
イブリダイズするための同様の方法で設計された。
プローブはプローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔ
ｍ、与えられた反応混合物中の潜在的二本鎖分子の半分
が一本鎖の変性された状態にある温度として定義され
る）およびプローブと試験試料中に存在すると予想され
る系統発生的に最も密接に関係した生物体のｒＲＮＡま
たはｒＤＮＡ（検出されるべきとは求められていない）
のＴｍ間の相違が最大になるように選択、抜粋および／
または設計された。非標識増幅オリゴヌクレオチドおよ
びヘルパーオリゴヌクレオチドは本発明で有用な標識ハ
イブリダイゼーションアッセイプローブのように非常に
高程度の特異性を持つ必要はないので、それらは他の核
酸を制して一つまたはそれ以上の標的核酸へ優先的にハ
イブリダイズするための同様の方法で設計された。
【００５８】原核生物のヌクレオチド配列は５Ｓ、１６
Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡをコードしているｒＲＮＡ遺
伝子を含んでいる。レプトスピラ、レプトネマ、セルピ
ュラ、スピロヘータおよびトレポネマ１６Ｓ核酸配列の
リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）のボレリア核酸配
列もまた比較のために使用された。ボレリア核酸配列情
報は実験室での研究および発表された論文（Ｍａｒｃｏ
ｎｉおよびＧａｒｏｎ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．１３８：５３３−５３６（１９９２）；Ｐａｓｔｅ
ｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：８１８１−６
１０９（１９９１）；ＭａｒｃｏｎｉおよびＧａｒｏ
ｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：２４１−２４４
（１９９２）；Ｍａｒｃｏｎｉ ＆ Ｇａｒｏｎ、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：２８３０−３４
（１９９２）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１７４：３７７６−７４（１９９２））から得
られた。
Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡをコードしているｒＲＮＡ遺
伝子を含んでいる。レプトスピラ、レプトネマ、セルピ
ュラ、スピロヘータおよびトレポネマ１６Ｓ核酸配列の
リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）のボレリア核酸配
列もまた比較のために使用された。ボレリア核酸配列情
報は実験室での研究および発表された論文（Ｍａｒｃｏ
ｎｉおよびＧａｒｏｎ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．１３８：５３３−５３６（１９９２）；Ｐａｓｔｅ
ｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：８１８１−６
１０９（１９９１）；ＭａｒｃｏｎｉおよびＧａｒｏ
ｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：２４１−２４４
（１９９２）；Ｍａｒｃｏｎｉ ＆ Ｇａｒｏｎ、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：２８３０−３４
（１９９２）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１７４：３７７６−７４（１９９２））から得
られた。
【００５９】プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドと
して使用されるべき核酸配列の同定を容易にするため、
生物体の異なった種からのヌクレオチド配列を最初に整
列させて相同性を最大限に活用した。ｒＲＮＡ分子内で
は、全体にわたる構造および機能間に緊密な関係が存在
する。このことは一次配列の進化的変化に制限を賦課
し、そのため二次構造が維持されている。例えば、もし
ヘリックスの一つの側で塩基が変化していると、相補性
を保存するために他の側に補償する変化がなされている
（このことは共変異と呼ばれている）。このことは保存
された一次配列におよび保存された二次構造要素に基づ
いて整列されるべき二つの非常に異なった配列を可能に
する。ハイブリダイゼーションプローブのための可能性
のある標的配列は整列させた配列の相同性の変異に注目
して同定された。
して使用されるべき核酸配列の同定を容易にするため、
生物体の異なった種からのヌクレオチド配列を最初に整
列させて相同性を最大限に活用した。ｒＲＮＡ分子内で
は、全体にわたる構造および機能間に緊密な関係が存在
する。このことは一次配列の進化的変化に制限を賦課
し、そのため二次構造が維持されている。例えば、もし
ヘリックスの一つの側で塩基が変化していると、相補性
を保存するために他の側に補償する変化がなされている
（このことは共変異と呼ばれている）。このことは保存
された一次配列におよび保存された二次構造要素に基づ
いて整列されるべき二つの非常に異なった配列を可能に
する。ハイブリダイゼーションプローブのための可能性
のある標的配列は整列させた配列の相同性の変異に注目
して同定された。
【００６０】変異領域の各々での配列進化はほとんど分
岐的である。分岐のため、ライム病関連ボレリアのより
遠い系統発生的関係種は系統学的により近い関係種より
も変異領域により大きな変異性を示す。ライム病関連ボ
レリアおよび同一の試料中に観察されるであろう他のボ
レリア種の間に、好適な標的部位を同定および有用なプ
ローブを設計するための十分な変異が観察された。
岐的である。分岐のため、ライム病関連ボレリアのより
遠い系統発生的関係種は系統学的により近い関係種より
も変異領域により大きな変異性を示す。ライム病関連ボ
レリアおよび同一の試料中に観察されるであろう他のボ
レリア種の間に、好適な標的部位を同定および有用なプ
ローブを設計するための十分な変異が観察された。
【００６１】ライム病に関連するボレリア種と、文献で
発表されているまたは実験室で決定されたｒＲＮＡ配列
の比較分析による他のボレリア種との間で変化している
配列が同定された。本明細書で開示されている目的のた
めに使用されるまたは適用されるであろうコンピュータ
ーおよびコンピュータープログラムは市販品として入手
可能である。本プローブを設計するため、標的生物体お
よび同一の試料中に観察されるであろう最も近い系統発
生的関係種間に十分な変異が観察された。
発表されているまたは実験室で決定されたｒＲＮＡ配列
の比較分析による他のボレリア種との間で変化している
配列が同定された。本明細書で開示されている目的のた
めに使用されるまたは適用されるであろうコンピュータ
ーおよびコンピュータープログラムは市販品として入手
可能である。本プローブを設計するため、標的生物体お
よび同一の試料中に観察されるであろう最も近い系統発
生的関係種間に十分な変異が観察された。
【００６２】推定の独特で可能性のある標的ヌクレオチ
ド配列を単に同定するだけでは、その配列を含むボレリ
アｒＲＮＡまたはｒＤＮＡへハイブリダイズする機能的
な種特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブが
製作できることを保証してはいない。種々の他の因子が
種特異的プローブのための標的部位としての核酸座の適
性を決定するであろう。本明細書に記載したようなハイ
ブリダイゼーション反応の程度および特異性は多くの因
子により影響されるため、一つまたはそれ以上のこれら
の因子の操作が特定のオリゴヌクレオチド（その標的に
完全に相補的であるにしろまたはないにしろ）の正確な
感受性および特異性を決定するであろう。種々のアッセ
イ条件の重要性および影響はＨｏｇａｎら（本出願と同
一の譲受人および本明細書において援用される）および
ＨｏｇａｎおよびＨａｍｍｏｎｄ、米国特許第５，２１
６，１４３号（国際特許番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３０
０９号に譲渡されている）、Ｋｏｈｎｅ、米国特許第
４，８５１，３３０号により記載されているように当業
者には知られている。
ド配列を単に同定するだけでは、その配列を含むボレリ
アｒＲＮＡまたはｒＤＮＡへハイブリダイズする機能的
な種特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブが
製作できることを保証してはいない。種々の他の因子が
種特異的プローブのための標的部位としての核酸座の適
性を決定するであろう。本明細書に記載したようなハイ
ブリダイゼーション反応の程度および特異性は多くの因
子により影響されるため、一つまたはそれ以上のこれら
の因子の操作が特定のオリゴヌクレオチド（その標的に
完全に相補的であるにしろまたはないにしろ）の正確な
感受性および特異性を決定するであろう。種々のアッセ
イ条件の重要性および影響はＨｏｇａｎら（本出願と同
一の譲受人および本明細書において援用される）および
ＨｏｇａｎおよびＨａｍｍｏｎｄ、米国特許第５，２１
６，１４３号（国際特許番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３０
０９号に譲渡されている）、Ｋｏｈｎｅ、米国特許第
４，８５１，３３０号により記載されているように当業
者には知られている。
【００６３】例としては：可能な標的ヌクレオチド配列
の（および従って二本鎖プローブ：標的ハイブリッド
の）ＧＣ含量がより高いと一般的に安定性および従って
ハイブリッドのＴｍが上昇する。一つまたはそれ以上
の”選ばれなかった”生物体と同一である配列内のヌク
レオチドの数もまた安定性、従って、ボレリアｒＲＮＡ
と完全に相補的であるプローブと選ばれなかった生物体
（類）のｒＲＮＡヌクレオチド配列を持っている核酸の
間の部分的に不適正なハイブリッドのＴｍ’に影響す
る。
の（および従って二本鎖プローブ：標的ハイブリッド
の）ＧＣ含量がより高いと一般的に安定性および従って
ハイブリッドのＴｍが上昇する。一つまたはそれ以上
の”選ばれなかった”生物体と同一である配列内のヌク
レオチドの数もまた安定性、従って、ボレリアｒＲＮＡ
と完全に相補的であるプローブと選ばれなかった生物体
（類）のｒＲＮＡヌクレオチド配列を持っている核酸の
間の部分的に不適正なハイブリッドのＴｍ’に影響す
る。
【００６４】ハイブリダイゼーションの望まれる温度お
よびハイブリダイゼーション溶液組成（濃度、界面活性
剤および他の溶質のような）もまた二本鎖ハイブリッド
の安定性に大きな影響を与える。イオン強度およびプロ
ーブが標的にハイブリダイズされるであろう温度のよう
な条件は、群−または種−特異的プローブの構築に考え
に入れなければならない。ハイブリッド核酸の熱安定性
は一般に反応混合物のイオン強度の増加とともに増加す
る。一方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド
およびアルコールのような水素結合を破壊する化学試薬
はハイブリッドの熱安定性を非常に減少させることがで
きる。
よびハイブリダイゼーション溶液組成（濃度、界面活性
剤および他の溶質のような）もまた二本鎖ハイブリッド
の安定性に大きな影響を与える。イオン強度およびプロ
ーブが標的にハイブリダイズされるであろう温度のよう
な条件は、群−または種−特異的プローブの構築に考え
に入れなければならない。ハイブリッド核酸の熱安定性
は一般に反応混合物のイオン強度の増加とともに増加す
る。一方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド
およびアルコールのような水素結合を破壊する化学試薬
はハイブリッドの熱安定性を非常に減少させることがで
きる。
【００６５】標的に対するプローブの特異性を最大限に
活用するため、本発明の目的プローブは高いストリンジ
ェンシーの条件下で標的とハイブリダイズするように設
計された。そのような条件下では程度の高い相補性を持
つ核酸一本鎖のみがお互いにハイブリダイズするであろ
う；そのような程度の高い相補性を持たない核酸一本鎖
はハイブリッドを形成しないであろう。従って、アッセ
イ条件のストリンジェンシーはハイブリッドを形成する
ために二つの核酸鎖間に存在しなければならない相補性
の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブと標
的核酸の間で形成されるハイブリッドおよびプローブと
存在する任意の非標的核酸の間で形成される可能性のあ
るハイブリッドの安定性の相違を最大限に活用するよう
に選択される。
活用するため、本発明の目的プローブは高いストリンジ
ェンシーの条件下で標的とハイブリダイズするように設
計された。そのような条件下では程度の高い相補性を持
つ核酸一本鎖のみがお互いにハイブリダイズするであろ
う；そのような程度の高い相補性を持たない核酸一本鎖
はハイブリッドを形成しないであろう。従って、アッセ
イ条件のストリンジェンシーはハイブリッドを形成する
ために二つの核酸鎖間に存在しなければならない相補性
の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブと標
的核酸の間で形成されるハイブリッドおよびプローブと
存在する任意の非標的核酸の間で形成される可能性のあ
るハイブリッドの安定性の相違を最大限に活用するよう
に選択される。
【００６６】適切な特異性は、非標的生物体の配列に対
する完全な相補性を持つプローブの長さを最少にするこ
とにより、非標的配列に対する相同性のＧおよびＣが豊
富な領域を避けることにより、および可能な限り非標的
配列に対する多くの不安定化不適正を含むようにプロー
ブを構築することにより達成される。プローブ配列が生
物体の特定の型のみを検出するのに有効かどうかは、プ
ローブ：標的ハイブリッド対潜在的プローブ：非標的ハ
イブリッド間の熱安定性の相違に大きく依存している。
プローブの設計において、これらのハイブリッド間のＴ
ｍ値の相違は可能な限り大きくしなければならない（好
適には約５℃またはそれ以上）。Ｔｍの操作はプローブ
長およびプローブ組成（ＧＣ含量に対するＡＴ含量）を
変化させることにより達成できる。
する完全な相補性を持つプローブの長さを最少にするこ
とにより、非標的配列に対する相同性のＧおよびＣが豊
富な領域を避けることにより、および可能な限り非標的
配列に対する多くの不安定化不適正を含むようにプロー
ブを構築することにより達成される。プローブ配列が生
物体の特定の型のみを検出するのに有効かどうかは、プ
ローブ：標的ハイブリッド対潜在的プローブ：非標的ハ
イブリッド間の熱安定性の相違に大きく依存している。
プローブの設計において、これらのハイブリッド間のＴ
ｍ値の相違は可能な限り大きくしなければならない（好
適には約５℃またはそれ以上）。Ｔｍの操作はプローブ
長およびプローブ組成（ＧＣ含量に対するＡＴ含量）を
変化させることにより達成できる。
【００６７】一般に、約１０−５０ヌクレオチド長のオ
リゴヌクレオチドプローブに対する至適ハイブリダイゼ
ーション温度は、与えられたデュープレックスに対する
融解温度の約５℃下である。至適温度以下の温度でのイ
ンキュベーションは不適正塩基配列のハイブリダイズを
可能にし、従って特異性を減少できる。プローブをより
長くすると（塩基対間の水素結合が多くなる）、一般に
Ｔｍが高くなる。また、ＧおよびＣのパーセントを多く
すると、Ｇ−Ｃ塩基対は追加の水素結合を示してＡ−Ｔ
塩基対よりも熱安定性が大きくなるのでＴｍは高くな
る。
リゴヌクレオチドプローブに対する至適ハイブリダイゼ
ーション温度は、与えられたデュープレックスに対する
融解温度の約５℃下である。至適温度以下の温度でのイ
ンキュベーションは不適正塩基配列のハイブリダイズを
可能にし、従って特異性を減少できる。プローブをより
長くすると（塩基対間の水素結合が多くなる）、一般に
Ｔｍが高くなる。また、ＧおよびＣのパーセントを多く
すると、Ｇ−Ｃ塩基対は追加の水素結合を示してＡ−Ｔ
塩基対よりも熱安定性が大きくなるのでＴｍは高くな
る。
【００６８】Ｔｍを決定するための好適な方法では、”
均一保護アッセイ”と題したＡｒｎｏｌｄら（上記文
献）によるハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰ
Ａ）を用いてハイブリダイゼーションが測定される。Ｔ
ｍは以下の方法によりＨＰＡを用いて測定できる。プロ
ーブ：標的ハイブリッドはコハク酸リチウム緩衝化溶液
（０．１Ｍコハク酸リチウム緩衝液、ｐＨ５．０、２ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭエチレ
ン グリコール−ビス（β−アミノ−エチルエーテル）
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１０％（ｗ
／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）中、過剰量の標的を用い
て形成させる。ハイブリッドの一部は次にクエン酸リチ
ウム緩衝化溶液で希釈し、予期されるＴｍ（典型的には
５５℃）より下の温度から始め、２−５℃づつ高くした
種々の温度で５分間インキュベートする。この溶液は続
いて温和なアルカリ性ホウ酸緩衝液（０．１５Ｍ四ホウ
酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯ
ＮＲ Ｘ−１００）で希釈してより低い温度（例えば、
５０℃）で１０分間インキュベートする。これらの条件
下、一本鎖プローブに結合されているアクリジニウムエ
ステルは加水分解されるが、一方ハイブリダイズされた
プローブに結合されているアクリジニウムエステルは加
水分解から比較的保護されている。従って、残存するア
クリジニウムエステルはハイブリッドの量に比例し、過
酸化水素続いてのアルカリの添加によりアクリジニウム
エステルから発生される化学発光により測定できる。化
学発光はルミノメーター（例えば、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ
ＬＥＡＤＥＲＲＩまたはＬＥＡＤＥＲＲ５０）により
測定できる。得られたデータは温度に対して最大信号
（通常最も低い温度）のパーセントとしてプロットす
る。Ｔｍは残存する最大信号の５０％を示す温度として
定義される。上記の方法に加え、当業者にはよく知られ
ている同位元素法（例えば、Ｈｏｇａｎら、上記文献）
によってもＴｍが決定されるであろう。
均一保護アッセイ”と題したＡｒｎｏｌｄら（上記文
献）によるハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰ
Ａ）を用いてハイブリダイゼーションが測定される。Ｔ
ｍは以下の方法によりＨＰＡを用いて測定できる。プロ
ーブ：標的ハイブリッドはコハク酸リチウム緩衝化溶液
（０．１Ｍコハク酸リチウム緩衝液、ｐＨ５．０、２ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２ｍＭエチレ
ン グリコール−ビス（β−アミノ−エチルエーテル）
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１０％（ｗ
／ｖ）ラウリル硫酸リチウム）中、過剰量の標的を用い
て形成させる。ハイブリッドの一部は次にクエン酸リチ
ウム緩衝化溶液で希釈し、予期されるＴｍ（典型的には
５５℃）より下の温度から始め、２−５℃づつ高くした
種々の温度で５分間インキュベートする。この溶液は続
いて温和なアルカリ性ホウ酸緩衝液（０．１５Ｍ四ホウ
酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯ
ＮＲ Ｘ−１００）で希釈してより低い温度（例えば、
５０℃）で１０分間インキュベートする。これらの条件
下、一本鎖プローブに結合されているアクリジニウムエ
ステルは加水分解されるが、一方ハイブリダイズされた
プローブに結合されているアクリジニウムエステルは加
水分解から比較的保護されている。従って、残存するア
クリジニウムエステルはハイブリッドの量に比例し、過
酸化水素続いてのアルカリの添加によりアクリジニウム
エステルから発生される化学発光により測定できる。化
学発光はルミノメーター（例えば、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ
ＬＥＡＤＥＲＲＩまたはＬＥＡＤＥＲＲ５０）により
測定できる。得られたデータは温度に対して最大信号
（通常最も低い温度）のパーセントとしてプロットす
る。Ｔｍは残存する最大信号の５０％を示す温度として
定義される。上記の方法に加え、当業者にはよく知られ
ている同位元素法（例えば、Ｈｏｇａｎら、上記文献）
によってもＴｍが決定されるであろう。
【００６９】与えられたハイブリッドのＴｍは使用され
たハイブリダイゼーション溶液に依存して変化すること
に注意しなければならない。塩濃度、界面活性剤および
他の溶質のような因子は熱変性の間のハイブリッド安定
性に影響を及ぼすことができる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１１章（第
ニ版、１９８９））。プローブの標的へのハイブリダイ
ズに使用されるであろうイオン強度およびインキュベー
ション温度のような条件はプローブの構築の際に考えに
入れなければならない。一方、ホルムアミド、尿素、ジ
メチルスルホキスドおよびアルコールのような水素結合
を破壊する化学試薬はハイブリッドの熱安定性を大きく
減少させることができる。
たハイブリダイゼーション溶液に依存して変化すること
に注意しなければならない。塩濃度、界面活性剤および
他の溶質のような因子は熱変性の間のハイブリッド安定
性に影響を及ぼすことができる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１１章（第
ニ版、１９８９））。プローブの標的へのハイブリダイ
ズに使用されるであろうイオン強度およびインキュベー
ション温度のような条件はプローブの構築の際に考えに
入れなければならない。一方、ホルムアミド、尿素、ジ
メチルスルホキスドおよびアルコールのような水素結合
を破壊する化学試薬はハイブリッドの熱安定性を大きく
減少させることができる。
【００７０】プローブがその標的に特異的であることを
確かにするため、高いストリンジェンシーの条件下での
みハイブリダイズするプローブを持つことが望まれる。
高ストリンジェンシー条件下では高度に相補的である核
酸ハイブリッドのみが形成される；十分な程度の相補性
のないハイブリッドは形成されないであろう。従って、
アッセイ条件のストリンジェンシーがハイブリッドを形
成するための二つの核酸鎖間に必要とされる相補性の量
を決定する。ストリンジェンシーは標的および他の核酸
配列で形成されるハイブリッド間の安定性の相違を最大
にするように選ばれる。
確かにするため、高いストリンジェンシーの条件下での
みハイブリダイズするプローブを持つことが望まれる。
高ストリンジェンシー条件下では高度に相補的である核
酸ハイブリッドのみが形成される；十分な程度の相補性
のないハイブリッドは形成されないであろう。従って、
アッセイ条件のストリンジェンシーがハイブリッドを形
成するための二つの核酸鎖間に必要とされる相補性の量
を決定する。ストリンジェンシーは標的および他の核酸
配列で形成されるハイブリッド間の安定性の相違を最大
にするように選ばれる。
【００７１】適切な特異性は、非標的核酸に対して完全
な相補性の長さを最少にすることにより、非標的配列に
対する相同性のＧおよびＣが豊富な領域を避けることに
より、および可能な限り非標的配列に対する多くの不安
定化不適正を含むようにすることにより達成される。プ
ローブ配列が生物体の特定の型のみを検出するのに有効
かどうかは、プローブ：標的ハイブリッドおよびプロー
ブ：非標的ハイブリッド間の熱安定性の相違に大きく依
存している。プローブの設計において、これらのＴｍ値
間の相違は可能な限り大きくしなければならない（好適
には約５℃またはそれ以上）。
な相補性の長さを最少にすることにより、非標的配列に
対する相同性のＧおよびＣが豊富な領域を避けることに
より、および可能な限り非標的配列に対する多くの不安
定化不適正を含むようにすることにより達成される。プ
ローブ配列が生物体の特定の型のみを検出するのに有効
かどうかは、プローブ：標的ハイブリッドおよびプロー
ブ：非標的ハイブリッド間の熱安定性の相違に大きく依
存している。プローブの設計において、これらのＴｍ値
間の相違は可能な限り大きくしなければならない（好適
には約５℃またはそれ以上）。
【００７２】標的核酸配列の長さ、および、従ってプロ
ーブ配列の長さもまた重要である。ある場合には、特定
の領域、例えば、位置および長さが変化している変異領
域からのいくつかの配列が存在し、それらから所望のハ
イブリダイゼーション特性を持つプローブが得られる。
別の場合には、あるプローブが単一の塩基が異なってい
るヌクレオチド配列を持つプローブよりも著しく良好で
あろう。核酸はハイブリダイズするために完全に相同的
ではなくてもよく、完全に相同的な塩基配列の最も長い
広がりが一般的にハイブリッド安定性を決定し、塩基対
の組成もまたそれに対して役割を果たしている。標的核
酸配列の長さ、および、従ってプローブ配列の長さもま
た重要である。ある場合には、特定の”変異”領域（位
置および長さが変化している）からのいくつかの配列が
存在し、それらは所望のハイブリダイゼーション特性を
持つプローブの設計に使用される。
ーブ配列の長さもまた重要である。ある場合には、特定
の領域、例えば、位置および長さが変化している変異領
域からのいくつかの配列が存在し、それらから所望のハ
イブリダイゼーション特性を持つプローブが得られる。
別の場合には、あるプローブが単一の塩基が異なってい
るヌクレオチド配列を持つプローブよりも著しく良好で
あろう。核酸はハイブリダイズするために完全に相同的
ではなくてもよく、完全に相同的な塩基配列の最も長い
広がりが一般的にハイブリッド安定性を決定し、塩基対
の組成もまたそれに対して役割を果たしている。標的核
酸配列の長さ、および、従ってプローブ配列の長さもま
た重要である。ある場合には、特定の”変異”領域（位
置および長さが変化している）からのいくつかの配列が
存在し、それらは所望のハイブリダイゼーション特性を
持つプローブの設計に使用される。
【００７３】本発明においてプローブとして使用される
オリゴヌクレオチドは種々の長さである。好適なプロー
ブは１０から１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレ
オチドである。
オリゴヌクレオチドは種々の長さである。好適なプロー
ブは１０から１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレ
オチドである。
【００７４】ハイブリダイゼーションの阻害となる強い
内部構造を形成するｒＲＮＡ領域は、少なくともヘルパ
ープローブが使用されないアッセイではより好ましくな
い標的領域である。同様に、強い自己相補性を生じるプ
ローブ設計も避けるべきである。前に説明したように、
ハイブリダイゼーションとは相補的核酸の二つの一本鎖
が会合して水素結合で結合されたニ本鎖ハイブリッドを
形成することである。従って、二つの鎖の一つが完全に
または部分的に分子内または分子間ハイブリッドに含ま
れているとしたら、新しい分子間プローブ：標的ハイブ
リッドの形成に関与しにくいであろう。リボソームＲＮ
Ａ分子は水素結合により非常に安定な分子内ヘリックス
および二次構造を形成することが知られている。標的化
された配列の実質的な部分がプローブとのハイブリダイ
ゼーションまで一本鎖状態で残っているようにハイブリ
ダイゼーションアッセイを設計することにより、プロー
ブおよび標的間のハイブリダイゼーションの速度および
程度が著しく増加するであろう。このことの一つの方法
は、標的ヌクレオチド配列として分子内水素結合に含ま
れていない配列を選ぶことにより達成されるであろう。
もしくはまたはさらに、標的部位をハイブリダイゼーシ
ョンのためにハイブリダイゼーションアッセイプローブ
により近づき易くするようにできるヘルパーオリゴヌク
レオチドとのプローブ混合物としてハイブリダイゼーシ
ョンアッセイプローブが使用される。
内部構造を形成するｒＲＮＡ領域は、少なくともヘルパ
ープローブが使用されないアッセイではより好ましくな
い標的領域である。同様に、強い自己相補性を生じるプ
ローブ設計も避けるべきである。前に説明したように、
ハイブリダイゼーションとは相補的核酸の二つの一本鎖
が会合して水素結合で結合されたニ本鎖ハイブリッドを
形成することである。従って、二つの鎖の一つが完全に
または部分的に分子内または分子間ハイブリッドに含ま
れているとしたら、新しい分子間プローブ：標的ハイブ
リッドの形成に関与しにくいであろう。リボソームＲＮ
Ａ分子は水素結合により非常に安定な分子内ヘリックス
および二次構造を形成することが知られている。標的化
された配列の実質的な部分がプローブとのハイブリダイ
ゼーションまで一本鎖状態で残っているようにハイブリ
ダイゼーションアッセイを設計することにより、プロー
ブおよび標的間のハイブリダイゼーションの速度および
程度が著しく増加するであろう。このことの一つの方法
は、標的ヌクレオチド配列として分子内水素結合に含ま
れていない配列を選ぶことにより達成されるであろう。
もしくはまたはさらに、標的部位をハイブリダイゼーシ
ョンのためにハイブリダイゼーションアッセイプローブ
により近づき易くするようにできるヘルパーオリゴヌク
レオチドとのプローブ混合物としてハイブリダイゼーシ
ョンアッセイプローブが使用される。
【００７５】ＤＮＡ標的は自然にはポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）の生成物のようにニ本鎖の形で存在する。
これらのニ本鎖標的は自然にはプローブとのハイブリダ
イゼーションには阻害的であり、ハイブリダイゼーショ
ンに先立って変性を必要とする。適した変性およびハイ
ブリダイゼーション条件は本分野では既知である（例え
ば、Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．９８：５０３（１９７５））。
応（ＰＣＲ）の生成物のようにニ本鎖の形で存在する。
これらのニ本鎖標的は自然にはプローブとのハイブリダ
イゼーションには阻害的であり、ハイブリダイゼーショ
ンに先立って変性を必要とする。適した変性およびハイ
ブリダイゼーション条件は本分野では既知である（例え
ば、Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．９８：５０３（１９７５））。
【００７６】その標的核酸へ完全に一致したオリゴヌク
レオチドのために融解温度の推定値を提供するであろう
多くの式が利用可能である。そのような式の一つ、Ｔｍ
＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．
４１（分画Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎ＝ヌク
レオチドの数でのオリゴヌクレオチドの長さ）は１４か
ら６０または７０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオ
チドに対して良好な推定値を提供する。そのような計算
から、続いての経験的確認またはＴｍの”微細な調整”
が本分野ではよく知られているスクリーニング技術を用
いて行われる。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌ
クレオチドプローブに関するさらなる情報は、例えば、
本明細書において援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８
９）を参照されたい（１１章）。この参照文献は特に本
分野でよく知られており、ハイブリッドのＴｍに対する
不適正の影響の推定値も提供している。従って、二つま
たはそれ以上の生物体のリボソームＲＮＡ（またはｒＤ
ＮＡ）の与えられた既知のヌクレオチド配列から、これ
らの生物体をお互いに区別するであろうオリゴヌクレオ
チドが設計される。
レオチドのために融解温度の推定値を提供するであろう
多くの式が利用可能である。そのような式の一つ、Ｔｍ
＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．
４１（分画Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎ＝ヌク
レオチドの数でのオリゴヌクレオチドの長さ）は１４か
ら６０または７０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオ
チドに対して良好な推定値を提供する。そのような計算
から、続いての経験的確認またはＴｍの”微細な調整”
が本分野ではよく知られているスクリーニング技術を用
いて行われる。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌ
クレオチドプローブに関するさらなる情報は、例えば、
本明細書において援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８
９）を参照されたい（１１章）。この参照文献は特に本
分野でよく知られており、ハイブリッドのＴｍに対する
不適正の影響の推定値も提供している。従って、二つま
たはそれ以上の生物体のリボソームＲＮＡ（またはｒＤ
ＮＡ）の与えられた既知のヌクレオチド配列から、これ
らの生物体をお互いに区別するであろうオリゴヌクレオ
チドが設計される。
【００７７】Ｃ．核酸増幅 好適には、本発明の増幅オリゴヌクレオチドはオリゴデ
オキシヌクレオチドであり、核酸ポリメラーゼによる伸
長生成物合成のための基質として使用するのに十分な長
さである。至適プライマー長は反応温度、構造およびプ
ライマーの塩基組成およびいかにプライマーが使用され
るべきかなどのいくつかの因子を考えに入れなければな
らない。例えば、至適特異性のためにはオリゴヌクレオ
チドプライマーは一般的には標的核酸配列の複雑さに依
存して少なくとも約１２のヌクレオチドを含んでいなけ
ればならない。もしそのような特異性が必須ではないな
ら、より短いプライマーが使用されるであろう；そのよ
うな場合、鋳型核酸との安定なハイブリッド複合体を形
成させるためにより冷たい温度で反応を実施することが
望ましいであろう。
オキシヌクレオチドであり、核酸ポリメラーゼによる伸
長生成物合成のための基質として使用するのに十分な長
さである。至適プライマー長は反応温度、構造およびプ
ライマーの塩基組成およびいかにプライマーが使用され
るべきかなどのいくつかの因子を考えに入れなければな
らない。例えば、至適特異性のためにはオリゴヌクレオ
チドプライマーは一般的には標的核酸配列の複雑さに依
存して少なくとも約１２のヌクレオチドを含んでいなけ
ればならない。もしそのような特異性が必須ではないな
ら、より短いプライマーが使用されるであろう；そのよ
うな場合、鋳型核酸との安定なハイブリッド複合体を形
成させるためにより冷たい温度で反応を実施することが
望ましいであろう。
【００７８】所望の特性を持つ増幅オリゴヌクレオチド
およびプローブのための有用なガイドラインが本明細書
に記載されている。我々の最良の様式設計部位は、単一
核酸分子の約１５塩基より大きく約３５０塩基以内の、
およびより好適には１５０保存ヌクレオチド以内のライ
ム病関連ボレリア核酸の二つおよび好適には三つの保存
領域を含んでいる。
およびプローブのための有用なガイドラインが本明細書
に記載されている。我々の最良の様式設計部位は、単一
核酸分子の約１５塩基より大きく約３５０塩基以内の、
およびより好適には１５０保存ヌクレオチド以内のライ
ム病関連ボレリア核酸の二つおよび好適には三つの保存
領域を含んでいる。
【００７９】プライマーまたはプロモータープライマー
の組で観察される増幅の程度は、その相補的配列へハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力および酵素的
に伸長またはコピーされるそれらの能力を含むいくつか
の因子に依存している。異なった長さおよび塩基組成の
オリゴヌクレオチドが使用できるが、本発明で好適なオ
リゴヌクレオチドは１８−４０塩基の標的結合領域を持
ち、約６５℃の標的との予想Ｔｍを持っている。
の組で観察される増幅の程度は、その相補的配列へハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力および酵素的
に伸長またはコピーされるそれらの能力を含むいくつか
の因子に依存している。異なった長さおよび塩基組成の
オリゴヌクレオチドが使用できるが、本発明で好適なオ
リゴヌクレオチドは１８−４０塩基の標的結合領域を持
ち、約６５℃の標的との予想Ｔｍを持っている。
【００８０】Ｔｍのようなプローブのハイブリダイゼー
ションに影響するパラメーター、相補性および標的配列
の二次構造もまたプライマーハイブリダイゼーションお
よびその結果としての性能に影響する。非特異的伸長
（プライマー−ダイマーまたは補標的のコピー）の程度
もまた増幅効率に影響し、従ってプライマーは低自己−
または交差−相補性を持つように選択される（特に配列
の３’末端で）。長いホモポリマー領域および高ＧＣ含
量は見せかけのプライマー伸長を減少させるために避け
られる。設計のこの局面を助けるためにコンピューター
プログラムが利用可能である。
ションに影響するパラメーター、相補性および標的配列
の二次構造もまたプライマーハイブリダイゼーションお
よびその結果としての性能に影響する。非特異的伸長
（プライマー−ダイマーまたは補標的のコピー）の程度
もまた増幅効率に影響し、従ってプライマーは低自己−
または交差−相補性を持つように選択される（特に配列
の３’末端で）。長いホモポリマー領域および高ＧＣ含
量は見せかけのプライマー伸長を減少させるために避け
られる。設計のこの局面を助けるためにコンピューター
プログラムが利用可能である。
【００８１】本発明の増幅オリゴヌクレオチドに関連し
て使用される核酸ポリメラーゼは化学的、物理的または
生物学的作用剤を意味し、それは鋳型依存的様式で核酸
ポリマーまたは鎖内へリボ−またはデオキシリボヌクレ
オチドまたはその両方を取り込む。核酸ポリメラーゼの
例としては、ＤＮＡ−指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ
−指向ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ−指向ＲＮＡポ
リメラーゼが含まれる。ＤＮＡポリメラーゼは鋳型依存
的様式でおよび５’から３’方向への核酸合成を引起こ
す。ニ本鎖核酸中の二つの鎖は逆平行配向のため、この
方向は鋳型の３’領域から鋳型の５’領域である。ＤＮ
Ａ−指向ＤＮＡポリメラーゼの例には大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩ、テルムス アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）からの熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼおよびバシルスステアロテルモフィルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）（Ｂｓｔ）からのＤＮＡポリメラーゼＩのラー
ジフラグメントが含まれる。ＲＮＡ−指向ＤＮＡポリメ
ラーゼの例にはモロニーマウス白血球ウイルス（ＭＭＬ
Ｖ）逆転写酵素またはトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭ
Ｖ）逆転写酵素のような種々のレトロウイルス逆転写酵
素が含まれる。
て使用される核酸ポリメラーゼは化学的、物理的または
生物学的作用剤を意味し、それは鋳型依存的様式で核酸
ポリマーまたは鎖内へリボ−またはデオキシリボヌクレ
オチドまたはその両方を取り込む。核酸ポリメラーゼの
例としては、ＤＮＡ−指向ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ
−指向ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ−指向ＲＮＡポ
リメラーゼが含まれる。ＤＮＡポリメラーゼは鋳型依存
的様式でおよび５’から３’方向への核酸合成を引起こ
す。ニ本鎖核酸中の二つの鎖は逆平行配向のため、この
方向は鋳型の３’領域から鋳型の５’領域である。ＤＮ
Ａ−指向ＤＮＡポリメラーゼの例には大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩ、テルムス アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）からの熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼおよびバシルスステアロテルモフィルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）（Ｂｓｔ）からのＤＮＡポリメラーゼＩのラー
ジフラグメントが含まれる。ＲＮＡ−指向ＤＮＡポリメ
ラーゼの例にはモロニーマウス白血球ウイルス（ＭＭＬ
Ｖ）逆転写酵素またはトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭ
Ｖ）逆転写酵素のような種々のレトロウイルス逆転写酵
素が含まれる。
【００８２】ほとんどの核酸増幅反応の間に、核酸ポリ
メラーゼは鋳型として標的核酸を用いてプライマーの
３’末端にヌクレオチド残基を付加するので、標的核酸
領域に部分的にまたは完全に相補的である核酸配列を持
つ第二の核酸鎖を合成する。多くの核酸増幅反応におい
て、生じたニ本鎖構造を含む二つの鎖は、増幅反応の進
行を可能にするために化学的または物理的手段により分
離されなければならない。もしくは、新しく合成された
鋳型鎖は、鎖置換または本来の標的鎖の一部または全部
を消化する核酸分解性酵素の使用により第二のプライマ
ーまたはプロモーター−プライマーによるハイブリダイ
ゼーションに利用可能なようにされるであろう。このよ
うに、本過程を多くのサイクル繰り返され、標的ヌクレ
オチド配列を持つ核酸分子の数が多量に増加する。
メラーゼは鋳型として標的核酸を用いてプライマーの
３’末端にヌクレオチド残基を付加するので、標的核酸
領域に部分的にまたは完全に相補的である核酸配列を持
つ第二の核酸鎖を合成する。多くの核酸増幅反応におい
て、生じたニ本鎖構造を含む二つの鎖は、増幅反応の進
行を可能にするために化学的または物理的手段により分
離されなければならない。もしくは、新しく合成された
鋳型鎖は、鎖置換または本来の標的鎖の一部または全部
を消化する核酸分解性酵素の使用により第二のプライマ
ーまたはプロモーター−プライマーによるハイブリダイ
ゼーションに利用可能なようにされるであろう。このよ
うに、本過程を多くのサイクル繰り返され、標的ヌクレ
オチド配列を持つ核酸分子の数が多量に増加する。
【００８３】第一または第二の増幅オリゴヌクレオチド
またはその両方がプロモーター−プライマーであろう。
そのようなプロモーター−プライマーは通常標的核酸分
子またはプライマー伸長生成物のヌクレオチド配列と相
補的ではないヌクレオチド配列を含んでいる。これらの
非相補的配列は増幅オリゴヌクレオチドの相補的配列の
５’に位置しており、核酸ポリメラーゼの作用によりニ
本鎖が作製された場合、ＲＮＡ合成開始のための座を提
供するであろう。このように提供されたプロモーターは
標的核酸配列の複数のＲＮＡコピーのインビトロ転写を
可能にするであろう。本明細書のプライマーに言及する
場合、言及の文脈において明白に他のものを示していな
い限り、そのような言及はプロモーター−プライマーの
プライマー的見地を含んでいるつもりである。
またはその両方がプロモーター−プライマーであろう。
そのようなプロモーター−プライマーは通常標的核酸分
子またはプライマー伸長生成物のヌクレオチド配列と相
補的ではないヌクレオチド配列を含んでいる。これらの
非相補的配列は増幅オリゴヌクレオチドの相補的配列の
５’に位置しており、核酸ポリメラーゼの作用によりニ
本鎖が作製された場合、ＲＮＡ合成開始のための座を提
供するであろう。このように提供されたプロモーターは
標的核酸配列の複数のＲＮＡコピーのインビトロ転写を
可能にするであろう。本明細書のプライマーに言及する
場合、言及の文脈において明白に他のものを示していな
い限り、そのような言及はプロモーター−プライマーの
プライマー的見地を含んでいるつもりである。
【００８４】いくつかの増幅系において（例えば、Ｄａ
ｔｔａｇｕｐｔａら、上記文献、の増幅法）、増幅オリ
ゴヌクレオチドは鎖置換を助ける５’非相補的ヌクレオ
チドを含んでいるであろう。さらに、５’エキソヌクレ
アーゼ活性を持つ核酸ポリメラーゼと関連して使用され
た場合、増幅オリゴヌクレオチドは酵素的消化を防止す
るためにそれらの５’末端が修飾されているであろう。
もしくは、核酸ポリメラーゼは５’エキソヌクレアーゼ
を除去するように修飾（そのようなヌクレアーゼを持た
ない活性なポリメラーゼ断片を発生するプロテアーゼで
の処理によるような）されているであろう。そのような
場合、オリゴヌクレオチドはその５’末端が修飾される
必要はない。
ｔｔａｇｕｐｔａら、上記文献、の増幅法）、増幅オリ
ゴヌクレオチドは鎖置換を助ける５’非相補的ヌクレオ
チドを含んでいるであろう。さらに、５’エキソヌクレ
アーゼ活性を持つ核酸ポリメラーゼと関連して使用され
た場合、増幅オリゴヌクレオチドは酵素的消化を防止す
るためにそれらの５’末端が修飾されているであろう。
もしくは、核酸ポリメラーゼは５’エキソヌクレアーゼ
を除去するように修飾（そのようなヌクレアーゼを持た
ない活性なポリメラーゼ断片を発生するプロテアーゼで
の処理によるような）されているであろう。そのような
場合、オリゴヌクレオチドはその５’末端が修飾される
必要はない。
【００８５】１．オリゴヌクレオチドの製造 オリゴヌクレオチドはお互いに共有結合で連結されたヌ
クレオチドサブユニットから作られている。ヌクレオチ
ドサブユニットの糖基はリボース、デオキシリボースま
たはＯ−メチルリボースのようなそれらの修飾された誘
導体である。ヌクレオチドサブユニットはホスホジエス
テル結合、修飾結合またはオリゴヌクレオチドのハイブ
リダイゼーションを阻害しない非ヌクレオチド残基のよ
うな結合で連結されている。修飾結合には標準ホスホジ
エステル結合がホスホロチオエート結合またはメチルホ
スホネート結合のような異なった結合で置き換えられて
いる結合が含まれる。前記のように、ハイブリダイゼー
ションアッセイプローブとして使用された場合、オリゴ
ヌクレオチドは好適には、標的配列へのプローブのハイ
ブリダイゼーションの同定を助けるためアクリジニウム
エステルまたは放射性同位元素のようなレポーター基を
含んでいる。
クレオチドサブユニットから作られている。ヌクレオチ
ドサブユニットの糖基はリボース、デオキシリボースま
たはＯ−メチルリボースのようなそれらの修飾された誘
導体である。ヌクレオチドサブユニットはホスホジエス
テル結合、修飾結合またはオリゴヌクレオチドのハイブ
リダイゼーションを阻害しない非ヌクレオチド残基のよ
うな結合で連結されている。修飾結合には標準ホスホジ
エステル結合がホスホロチオエート結合またはメチルホ
スホネート結合のような異なった結合で置き換えられて
いる結合が含まれる。前記のように、ハイブリダイゼー
ションアッセイプローブとして使用された場合、オリゴ
ヌクレオチドは好適には、標的配列へのプローブのハイ
ブリダイゼーションの同定を助けるためアクリジニウム
エステルまたは放射性同位元素のようなレポーター基を
含んでいる。
【００８６】本発明のすべての増幅オリゴヌクレオチド
は本分野では既知の方法により容易に製造できる。好適
には、プライマーは固相法を用いて合成された。例え
ば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓらはホスホジエステル結合に
よりヌクレオチドを連結するために標準ホスホロアミダ
イト固相化学の使用を記載している。シアノエチルホス
ホロアミダイト前駆体を用いる自動化固相化学合成がＢ
ａｒｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，１２：４０５（１９８４）、により記載され
ている。（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，１４３巻、２８７ページ（１９８７））。同様に、
Ｂｈａｔｔはホスホロチオエート結合を含むオリゴヌク
レオチド合成のための方法を記載している。（本発明と
共通の所有権を享有する”有機リン化合物の硫化のため
の方法および試薬”と題した米国特許出願第０７／３１
９，５７０号）。また、Ｋｌｅｍら（”オリゴマー合成
の改良法”と題したＰＣＴ ＷＯ９２／０７８６４）
は、メチルホスホネート結合を含む異なった結合を持つ
オリゴヌクレオチドの合成を記載している。後の三つの
参照文献は本発明において援用される。さらに、オリゴ
ヌクレオチドの有機合成のための方法は当業者には既知
であり，Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより記載されている（上
記文献、前に本明細書において援用されている）。
は本分野では既知の方法により容易に製造できる。好適
には、プライマーは固相法を用いて合成された。例え
ば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓらはホスホジエステル結合に
よりヌクレオチドを連結するために標準ホスホロアミダ
イト固相化学の使用を記載している。シアノエチルホス
ホロアミダイト前駆体を用いる自動化固相化学合成がＢ
ａｒｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，１２：４０５（１９８４）、により記載され
ている。（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，１４３巻、２８７ページ（１９８７））。同様に、
Ｂｈａｔｔはホスホロチオエート結合を含むオリゴヌク
レオチド合成のための方法を記載している。（本発明と
共通の所有権を享有する”有機リン化合物の硫化のため
の方法および試薬”と題した米国特許出願第０７／３１
９，５７０号）。また、Ｋｌｅｍら（”オリゴマー合成
の改良法”と題したＰＣＴ ＷＯ９２／０７８６４）
は、メチルホスホネート結合を含む異なった結合を持つ
オリゴヌクレオチドの合成を記載している。後の三つの
参照文献は本発明において援用される。さらに、オリゴ
ヌクレオチドの有機合成のための方法は当業者には既知
であり，Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより記載されている（上
記文献、前に本明細書において援用されている）。
【００８７】特定のオリゴヌクレオチドの合成および精
製に続いて、いくつかの異なった方法が大きさおよび純
度の点でのプローブまたはプライマーの受容可能性を決
定するために利用される。適した方法にはポリアクリル
アミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー
が含まれる。これらの方法は両方とも当業者にはよく知
られている。
製に続いて、いくつかの異なった方法が大きさおよび純
度の点でのプローブまたはプライマーの受容可能性を決
定するために利用される。適した方法にはポリアクリル
アミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー
が含まれる。これらの方法は両方とも当業者にはよく知
られている。
【００８８】本発明のすべてのオリゴヌクレオチドは、
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅オリゴ
ヌクレオチドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドにせ
よ、それらの性能を高めるためまたは増幅精製物の特性
決定を容易にするために化学基で修飾される。例えば、
オリゴヌクレオチドをある種のポリメラーゼの核酸分解
活性耐性にするホスホロチオエートまたはメチルホスホ
ネート基を持つオリゴヌクレオチドのような主鎖修飾オ
リゴヌクレオチドは増幅または他の反応でのそのような
酵素の使用を可能にする。修飾の別の例にはハイブリダ
イゼーションまたはプライマーの伸長を妨害しない、核
酸鎖中のヌクレオチド間に取り込まれたヌクレオチドリ
ンカー（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、”ヌクレオチドプロ
ーブのための非ヌクレオチド結合剤”欧州特許出願第８
８３０８７６６−０号）の使用が含まれる。増幅オリゴ
ヌクレオチドはまた所望の修飾および天然のヌクレオチ
ドの混合物も含んでいる。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅オリゴ
ヌクレオチドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドにせ
よ、それらの性能を高めるためまたは増幅精製物の特性
決定を容易にするために化学基で修飾される。例えば、
オリゴヌクレオチドをある種のポリメラーゼの核酸分解
活性耐性にするホスホロチオエートまたはメチルホスホ
ネート基を持つオリゴヌクレオチドのような主鎖修飾オ
リゴヌクレオチドは増幅または他の反応でのそのような
酵素の使用を可能にする。修飾の別の例にはハイブリダ
イゼーションまたはプライマーの伸長を妨害しない、核
酸鎖中のヌクレオチド間に取り込まれたヌクレオチドリ
ンカー（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、”ヌクレオチドプロ
ーブのための非ヌクレオチド結合剤”欧州特許出願第８
８３０８７６６−０号）の使用が含まれる。増幅オリゴ
ヌクレオチドはまた所望の修飾および天然のヌクレオチ
ドの混合物も含んでいる。
【００８９】増幅オリゴヌクレオチドの３’末端はま
た、”核酸配列増幅”と題された米国特許出願第０７／
９２５，４０５号（本発明と共通の所有権を享有し、本
明細書において援用される）にＭａＤｏｎｏｕｇｈによ
り記載されているようにＤＮＡ合成の開始を防止するた
めに保護されている。異なった３’保護増幅オリゴヌク
レオチドはここに記載されているように核酸増幅の効率
を増加させる。
た、”核酸配列増幅”と題された米国特許出願第０７／
９２５，４０５号（本発明と共通の所有権を享有し、本
明細書において援用される）にＭａＤｏｎｏｕｇｈによ
り記載されているようにＤＮＡ合成の開始を防止するた
めに保護されている。異なった３’保護増幅オリゴヌク
レオチドはここに記載されているように核酸増幅の効率
を増加させる。
【００９０】前記のように、オリゴヌクレオチドの５’
末端はいくつかの核酸ポリメラーゼに存在する５’−エ
キソヌクレアーゼ活性に耐性となるように修飾されてい
る。そのような修飾は、前に本明細書において援用され
た”ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合
剤”と題してＡｒｎｏｌｄらにより記載されているよう
な技術を用いてプライマーの末端５’ヌクレオチドへ非
ヌクレオチド基を付加させることにより実施できる。
末端はいくつかの核酸ポリメラーゼに存在する５’−エ
キソヌクレアーゼ活性に耐性となるように修飾されてい
る。そのような修飾は、前に本明細書において援用され
た”ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合
剤”と題してＡｒｎｏｌｄらにより記載されているよう
な技術を用いてプライマーの末端５’ヌクレオチドへ非
ヌクレオチド基を付加させることにより実施できる。
【００９１】一度合成されたら、選択されたオリゴヌク
レオチドプローブはいくつかの既知の方法により標識さ
れる（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記文献）。有
用な標識には放射性同位元素ならびに非放射活性レポー
ト基が含まれる。同位元素標識には3Ｈ、35Ｓ、32Ｐ、
125Ｉ、57Ｃｏおよび14Ｃが含まれる。同位元素標識
は、ニックトランスレーション、末端標識、第二鎖合
成、逆転写の使用および化学的方法のような本分野では
既知の技術によりオリゴヌクレオチド内へ導入できる。
放射性標識プローブを使用した場合、ハイブリダイゼー
ションはオートラジオグラフィー、シンチレーション計
数またはガンマ計数により検出できる。選択される検出
法は標識に使用された特定の放射性同位元素に依存する
であろう。
レオチドプローブはいくつかの既知の方法により標識さ
れる（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記文献）。有
用な標識には放射性同位元素ならびに非放射活性レポー
ト基が含まれる。同位元素標識には3Ｈ、35Ｓ、32Ｐ、
125Ｉ、57Ｃｏおよび14Ｃが含まれる。同位元素標識
は、ニックトランスレーション、末端標識、第二鎖合
成、逆転写の使用および化学的方法のような本分野では
既知の技術によりオリゴヌクレオチド内へ導入できる。
放射性標識プローブを使用した場合、ハイブリダイゼー
ションはオートラジオグラフィー、シンチレーション計
数またはガンマ計数により検出できる。選択される検出
法は標識に使用された特定の放射性同位元素に依存する
であろう。
【００９２】非同位元素物質もまた標識に使用でき、核
酸配列の内部にまたは核酸配列の末端に導入される。修
飾ヌクレオチドは酵素的にまたは化学的に取り込まれ
る。プローブの化学修飾は、例えば、Ａｒｎｏｌｄ
ら（”ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結
合剤”と題したＥＰＯ出願番号第８８３０８７６６−０
号、公開番号第３１３２１９号、本明細書において援用
される）により記載されたような非ヌクレオチドリンカ
ー基の使用により、プローブ合成の間または後で実行さ
れる。非同位元素標識には蛍光分子、化学発光分子、酵
素、補因子、酵素基質、ハプテンまたはその他のリガン
ドが含まれる。
酸配列の内部にまたは核酸配列の末端に導入される。修
飾ヌクレオチドは酵素的にまたは化学的に取り込まれ
る。プローブの化学修飾は、例えば、Ａｒｎｏｌｄ
ら（”ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結
合剤”と題したＥＰＯ出願番号第８８３０８７６６−０
号、公開番号第３１３２１９号、本明細書において援用
される）により記載されたような非ヌクレオチドリンカ
ー基の使用により、プローブ合成の間または後で実行さ
れる。非同位元素標識には蛍光分子、化学発光分子、酵
素、補因子、酵素基質、ハプテンまたはその他のリガン
ドが含まれる。
【００９３】好適には、プローブはアクリジニウムエス
テルで標識される。アクリジニウムエステル標識はＡｒ
ｎｏｌｄら（”アクリジニウムエステル標識およびヌク
レオチドプローブの精製”と題して１９９３年２月９日
に公開された米国特許第５，１８５，４３９号、本明細
書において援用される）により記載されたように実施さ
れる。
テルで標識される。アクリジニウムエステル標識はＡｒ
ｎｏｌｄら（”アクリジニウムエステル標識およびヌク
レオチドプローブの精製”と題して１９９３年２月９日
に公開された米国特許第５，１８５，４３９号、本明細
書において援用される）により記載されたように実施さ
れる。
【００９４】２．ボレリアｒＲＮＡおよびｒＤＮＡの増
幅 本発明の増幅オリゴヌクレオチドは特定のボレリア１６
Ｓまたは２３Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列またはそれ
らのｒＤＮＡ対応物に方向付けられている。これらの増
幅オリゴヌクレオチドは、核酸増幅アッセイにおいてボ
レリアの存在を検出するためのハイブリダイゼーション
アッセイプローブとして使用された少なくとも一つの標
的ヌクレオチド配列内に隣接または含まれている。本明
細書において記載され特許請求された増幅オリゴヌクレ
オチドは二つの組の増幅オリゴヌクレオチドを含んでい
る。増幅オリゴヌクレオチドの組の構成物は以下のヌク
レオチド配列の一つを持つかまたは実質的に対応してい
る核酸とハイブリダイズできる： 配列ＩＤ番号３６：ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号３７：TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATA
GAGGAAG 配列ＩＤ番号３８：TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGG
GTGG 配列ＩＤ番号３９：ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号４０：CCCGTTTCCCATCGACTACACTTTTCAG 配列ＩＤ番号４１：GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC 配列ＩＤ番号４２：CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG 配列ＩＤ番号５１：ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU 配列ＩＤ番号５２：UAUGUUGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUA
GAGGAAG 配列ＩＤ番号５３：UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGG
GUGG 配列ＩＤ番号５４：ACGCUCGCCCCUUACGUAUUACCGCGGCU 配列ＩＤ番号５５：CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG 配列ＩＤ番号５６：GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号５７：CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
幅 本発明の増幅オリゴヌクレオチドは特定のボレリア１６
Ｓまたは２３Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列またはそれ
らのｒＤＮＡ対応物に方向付けられている。これらの増
幅オリゴヌクレオチドは、核酸増幅アッセイにおいてボ
レリアの存在を検出するためのハイブリダイゼーション
アッセイプローブとして使用された少なくとも一つの標
的ヌクレオチド配列内に隣接または含まれている。本明
細書において記載され特許請求された増幅オリゴヌクレ
オチドは二つの組の増幅オリゴヌクレオチドを含んでい
る。増幅オリゴヌクレオチドの組の構成物は以下のヌク
レオチド配列の一つを持つかまたは実質的に対応してい
る核酸とハイブリダイズできる： 配列ＩＤ番号３６：ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号３７：TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATA
GAGGAAG 配列ＩＤ番号３８：TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGG
GTGG 配列ＩＤ番号３９：ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号４０：CCCGTTTCCCATCGACTACACTTTTCAG 配列ＩＤ番号４１：GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC 配列ＩＤ番号４２：CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG 配列ＩＤ番号５１：ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU 配列ＩＤ番号５２：UAUGUUGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUA
GAGGAAG 配列ＩＤ番号５３：UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGG
GUGG 配列ＩＤ番号５４：ACGCUCGCCCCUUACGUAUUACCGCGGCU 配列ＩＤ番号５５：CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG 配列ＩＤ番号５６：GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号５７：CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
【００９５】好適な態様において、これらの増幅オリゴ
ヌクレオチドは以下の配列を持つかまたは実質的に対応
している： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA。 これらのオリゴヌクレオチドはまた、その５’末端にＲ
ＮＡポリメラーゼを結合でき、鋳型として標的核酸を用
いるＲＮＡ転写を指図するプロモーター配列を含む追加
の非相補的塩基も持っている。
ヌクレオチドは以下の配列を持つかまたは実質的に対応
している： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA。 これらのオリゴヌクレオチドはまた、その５’末端にＲ
ＮＡポリメラーゼを結合でき、鋳型として標的核酸を用
いるＲＮＡ転写を指図するプロモーター配列を含む追加
の非相補的塩基も持っている。
【００９６】ボレリアの１６Ｓ ｒＲＮＡへ方向付けら
れた好適な増幅プライマーは以下の配列を持つかまたは
実質的に対応している： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA および 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU。
れた好適な増幅プライマーは以下の配列を持つかまたは
実質的に対応している： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA および 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU。
【００９７】これらの１６Ｓ ｒＲＮＡ増幅オリゴヌク
レオチドは特定のボレリア１６ＳｒＲＮＡ核酸配列、ｒ
ＤＮＡ対応物に方向付けることができ、部分的または完
全にこれらの配列と重複している。
レオチドは特定のボレリア１６ＳｒＲＮＡ核酸配列、ｒ
ＤＮＡ対応物に方向付けることができ、部分的または完
全にこれらの配列と重複している。
【００９８】好適であるのはヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA に実質的に対応するヌクレオチド配列を持つ１６Ｓ増幅
オリゴヌクレオチドである。
ACATA に実質的に対応するヌクレオチド配列を持つ１６Ｓ増幅
オリゴヌクレオチドである。
【００９９】最も好適であるのはヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA （式中、１９の最も３’のヌクレオチドが示された通り
厳密であるである）に実質的に対応するヌクレオチド配
列を持つ１６Ｓ増幅オリゴヌクレオチドである。
ACATA （式中、１９の最も３’のヌクレオチドが示された通り
厳密であるである）に実質的に対応するヌクレオチド配
列を持つ１６Ｓ増幅オリゴヌクレオチドである。
【０１００】ボレリアの２３６Ｓ ｒＲＮＡへ方向付け
られた好適な増幅プライマーは以下の配列を持つかまた
は実質的に対応している： 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。
られた好適な増幅プライマーは以下の配列を持つかまた
は実質的に対応している： 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。
【０１０１】これらの２３Ｓ ｒＲＮＡ増幅オリゴヌク
レオチドは特定のボレリア２３ＳｒＲＮＡ核酸配列、ｒ
ＤＮＡ対応物に方向付けることができ、部分的または完
全にこれらの配列と重複している。
レオチドは特定のボレリア２３ＳｒＲＮＡ核酸配列、ｒ
ＤＮＡ対応物に方向付けることができ、部分的または完
全にこれらの配列と重複している。
【０１０２】本発明のすべての増幅オリゴヌクレオチド
はこれらの配列への修飾または付加を含まない配列を持
っている。増幅オリゴヌクレオチドはまた、またはもし
くは、保護された３’および／または５’末端またはＲ
ＮＡポリメラーゼにより認識される特異的ヌクレオチド
配列（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ ＲＮＡポリメ
ラーゼのためのプロモーター配列）の付加、ＲＮＡポリ
メラーゼによるＲＮＡ転写の開始または延長を促進する
配列の付加、または分子内塩基対合を提供し、二次また
は三次核酸構造の形成を助長する配列の付加を含む（こ
れらに制限されるわけではない）付加のような修飾を持
っていてもよい。
はこれらの配列への修飾または付加を含まない配列を持
っている。増幅オリゴヌクレオチドはまた、またはもし
くは、保護された３’および／または５’末端またはＲ
ＮＡポリメラーゼにより認識される特異的ヌクレオチド
配列（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ ＲＮＡポリメ
ラーゼのためのプロモーター配列）の付加、ＲＮＡポリ
メラーゼによるＲＮＡ転写の開始または延長を促進する
配列の付加、または分子内塩基対合を提供し、二次また
は三次核酸構造の形成を助長する配列の付加を含む（こ
れらに制限されるわけではない）付加のような修飾を持
っていてもよい。
【０１０３】ポリメラーゼ連鎖反応またはＫａｃｉａｎ
およびＦＵｌｔｚ、上記文献，Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ
ら、上記文献、およびＳｎｉｎｓｋｙら、米国特許第
５，０７９，３５１号（どちらも本明細書において援用
され、最初の二つは本発明と共通の所有権を享有してい
る）により記載されたようなＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮ
ＡポリメラーゼおよびＲＮＡｓｅ Ｈまたはその均等物
を用いる増幅反応のような核酸増幅反応で増幅オリゴヌ
クレオチドが使用される。
およびＦＵｌｔｚ、上記文献，Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ
ら、上記文献、およびＳｎｉｎｓｋｙら、米国特許第
５，０７９，３５１号（どちらも本明細書において援用
され、最初の二つは本発明と共通の所有権を享有してい
る）により記載されたようなＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮ
ＡポリメラーゼおよびＲＮＡｓｅ Ｈまたはその均等物
を用いる増幅反応のような核酸増幅反応で増幅オリゴヌ
クレオチドが使用される。
【０１０４】増幅された標的配列の検出に広範囲の方法
が利用できる。例えば、ヌクレオチド基質またはプライ
マーは新たに合成されるＤＮＡ内へ取り込まれる検出可
能な標識を含むことができる。生じた標識増幅生成物は
次に、未使用の標識ヌクレオチドまたはプライマーから
分離され、標識は分離された生成物分画で検出される。
が利用できる。例えば、ヌクレオチド基質またはプライ
マーは新たに合成されるＤＮＡ内へ取り込まれる検出可
能な標識を含むことができる。生じた標識増幅生成物は
次に、未使用の標識ヌクレオチドまたはプライマーから
分離され、標識は分離された生成物分画で検出される。
【０１０５】有用な検出可能標識として働くことができ
る物質は本分野ではよく知られており、放射性同位元
素、蛍光化合物、化学発光化合物、発色団、ならびにビ
オチンおよびハプテンのようなリガンド（こられは直接
的には検出可能ではないが、例えば、各々アビジンおよ
び抗体のようなそれらの特異的結合相手の標識形との反
応により容易に検出できる）が含まれる。
る物質は本分野ではよく知られており、放射性同位元
素、蛍光化合物、化学発光化合物、発色団、ならびにビ
オチンおよびハプテンのようなリガンド（こられは直接
的には検出可能ではないが、例えば、各々アビジンおよ
び抗体のようなそれらの特異的結合相手の標識形との反
応により容易に検出できる）が含まれる。
【０１０６】増幅生成物を検出する別の方法は、検出可
能なように標識した核酸プローブとハイブリダイゼーシ
ョンさせ、生じたハイブリッドを通常の様式で測定する
方法である。特に、生成物は標的配列へ化学発光アクリ
ジニウムエステル標識核酸プローブをハイブリダイズさ
せ、ハイブリダイズしていないプローブ上に存在するア
クリジニウムエステルを選択的に加水分解し、ルミノメ
ーターで残存するアクリジニウムエステルから発生する
化学発光を測定することによりアッセイできる。（例え
ば、Ａｒｎｏｌｄら、上記文献、ＰＣＴ出願番号ＵＳ８
８／０２７４６、およびＮｅｌｓｏｎら、”Ｎｏｎ−Ｉ
ｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ ＰｒｏｂｅＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｅｓｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ（Ｋｒｉｃｋａ編、１９９２年）、両方の
参照文献ともに本明細書において援用される、を参照さ
れたい。） Ｄ．ボレリアｒＲＮＡおよびｒＤＮＡに対するオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ 本明細書において開示および請求されているオリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは系
統発生学的に密接に関連した細菌種の核酸を制して、ラ
イム病関連ボレリアｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチ
ド配列を含む標的核酸へ優先的にハイブリダイズでき
る。これらのハイブリダイゼーションプローブは、ライ
ム病関連ボレリアおよび該系統発生学的に密接に関連し
た種のヌクレオチド配列の比較に基づいて設計され、選
択されおよび／または決められた。好適な態様におい
て、これらのプローブはボレリア ヘルムシーの核酸を
制してライム病関連ボレリアの核酸に選択的にハイブリ
ダイズする。
能なように標識した核酸プローブとハイブリダイゼーシ
ョンさせ、生じたハイブリッドを通常の様式で測定する
方法である。特に、生成物は標的配列へ化学発光アクリ
ジニウムエステル標識核酸プローブをハイブリダイズさ
せ、ハイブリダイズしていないプローブ上に存在するア
クリジニウムエステルを選択的に加水分解し、ルミノメ
ーターで残存するアクリジニウムエステルから発生する
化学発光を測定することによりアッセイできる。（例え
ば、Ａｒｎｏｌｄら、上記文献、ＰＣＴ出願番号ＵＳ８
８／０２７４６、およびＮｅｌｓｏｎら、”Ｎｏｎ−Ｉ
ｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ ＰｒｏｂｅＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｅｓｓ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ（Ｋｒｉｃｋａ編、１９９２年）、両方の
参照文献ともに本明細書において援用される、を参照さ
れたい。） Ｄ．ボレリアｒＲＮＡおよびｒＤＮＡに対するオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ 本明細書において開示および請求されているオリゴヌク
レオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは系
統発生学的に密接に関連した細菌種の核酸を制して、ラ
イム病関連ボレリアｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチ
ド配列を含む標的核酸へ優先的にハイブリダイズでき
る。これらのハイブリダイゼーションプローブは、ライ
ム病関連ボレリアおよび該系統発生学的に密接に関連し
た種のヌクレオチド配列の比較に基づいて設計され、選
択されおよび／または決められた。好適な態様におい
て、これらのプローブはボレリア ヘルムシーの核酸を
制してライム病関連ボレリアの核酸に選択的にハイブリ
ダイズする。
【０１０７】本発明はライム病関連ボレリアまたはボレ
リア ヘルムシーを含むボレリア種の核酸に選択的にハ
イブリダイズするが密接に関連した微生物の核酸とはハ
イブリダイズしないオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーションプローブを企図しており、以下の核酸配列を持
つまたは実質的に対応する核酸配列が含まれる： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
リア ヘルムシーを含むボレリア種の核酸に選択的にハ
イブリダイズするが密接に関連した微生物の核酸とはハ
イブリダイズしないオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーションプローブを企図しており、以下の核酸配列を持
つまたは実質的に対応する核酸配列が含まれる： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
【０１０８】ライム病関連ボレリアの核酸に選択的にハ
イブリダイズする本発明のハイブリダイゼーションアッ
セイプローブは以下の核酸配列を持つまたは実質的に対
応する： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC。
イブリダイズする本発明のハイブリダイゼーションアッ
セイプローブは以下の核酸配列を持つまたは実質的に対
応する： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC。
【０１０９】現在の所、ライム病関連ボレリアの１６Ｓ
ｒＲＮＡに方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好適な態
様は以下のヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応
する： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC および 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC。
ｒＲＮＡに方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチ
ドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好適な態
様は以下のヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応
する： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC および 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC。
【０１１０】ライム病関連ボレリアの２３Ｓ ｒＲＮＡ
に方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチドハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下の
ヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC。
に方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチドハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下の
ヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC。
【０１１１】本発明の多くのオリゴヌクレオチドハイブ
リダイゼーションアッセイプローブは他の系統発生学的
に密接に関連した細菌種の核酸を制して、ボレリア ヘ
ルムシーｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列を含
む標的核酸へ好適にハイブリダイズする。好適な態様に
おいて、これらのハイブリダイゼーションアッセイプロ
ーブは他のボレリア核酸からボレリア ヘルムシー核酸
を区別できる。
リダイゼーションアッセイプローブは他の系統発生学的
に密接に関連した細菌種の核酸を制して、ボレリア ヘ
ルムシーｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列を含
む標的核酸へ好適にハイブリダイズする。好適な態様に
おいて、これらのハイブリダイゼーションアッセイプロ
ーブは他のボレリア核酸からボレリア ヘルムシー核酸
を区別できる。
【０１１２】ボレリア ヘルムシーに由来する核酸に選
択的にハイブリダイズする本発明のハイブリダイゼーシ
ョンプローブは以下のヌクレオチド配列を持つまたは実
質的に対応する： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
択的にハイブリダイズする本発明のハイブリダイゼーシ
ョンプローブは以下のヌクレオチド配列を持つまたは実
質的に対応する： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
【０１１３】ボレリア ヘルムシーの１６Ｓ ｒＲＮＡ
に方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチドハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下の
ヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC および 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC。
に方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチドハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下の
ヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC および 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC。
【０１１４】ボレリア ヘルムシーの２３Ｓ ｒＲＮＡ
に方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチドハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下の
ヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する： 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
に方向付けられたこれらのオリゴヌクレオチドハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブの好適な態様は以下の
ヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応する： 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC。
【０１１５】本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブは、標的配列へプローブが
ハイブリダイズしたことを検出または確認するために使
用できる放射性同位元素、蛍光性または化学発光性残
基、酵素またはその他のリガンドのようなレポーター基
残基で好適に標識される。標識として化学発光性アクリ
ジニウムエステルの使用が最も好ましい。本出願と共通
の所有権を享有し、本明細書において援用されるＡｒｎ
ｏｌｄらによる米国特許第５，１８５，４３９号を参照
されたい。アッセイプローブは、相補性領域中での水素
結合形成により二つの鎖のアニーリングを可能にするた
めに適したハイブリダイゼーション条件下、標的配列を
持っている核酸を含むと疑われる試料と混合する。プロ
ーブは標的ボレリアヌクレオチド配列を持っている核酸
との結合を容易にするため、一つまたはそれ以上の非標
識ヘルパーオリゴヌクレオチドとも結合されているであ
ろう。プローブは試料中に存在する標的核酸へハイブリ
ダイズする；生じたハイブリッドデュープレックスは分
離され、ヒドロキシアパタイト吸着および放射活性モニ
タリングのような本分野ではよく知られている種々の技
術により検出される。本出願と共通の所有権を享有し、
本明細書において援用されるＡｒｎｏｌｄらによる米国
特許第５，２８３，１７４号に開示されているような、
ハイブリダイズしていないプローブ上に存在する標識を
選択的に分解し、続いて残存するハイブリダイズしたプ
ローブに付随する標識の量を測定することを含む技術も
これらの技術の中に含まれている。この後者の技術が現
在のところ好ましい。
ゼーションアッセイプローブは、標的配列へプローブが
ハイブリダイズしたことを検出または確認するために使
用できる放射性同位元素、蛍光性または化学発光性残
基、酵素またはその他のリガンドのようなレポーター基
残基で好適に標識される。標識として化学発光性アクリ
ジニウムエステルの使用が最も好ましい。本出願と共通
の所有権を享有し、本明細書において援用されるＡｒｎ
ｏｌｄらによる米国特許第５，１８５，４３９号を参照
されたい。アッセイプローブは、相補性領域中での水素
結合形成により二つの鎖のアニーリングを可能にするた
めに適したハイブリダイゼーション条件下、標的配列を
持っている核酸を含むと疑われる試料と混合する。プロ
ーブは標的ボレリアヌクレオチド配列を持っている核酸
との結合を容易にするため、一つまたはそれ以上の非標
識ヘルパーオリゴヌクレオチドとも結合されているであ
ろう。プローブは試料中に存在する標的核酸へハイブリ
ダイズする；生じたハイブリッドデュープレックスは分
離され、ヒドロキシアパタイト吸着および放射活性モニ
タリングのような本分野ではよく知られている種々の技
術により検出される。本出願と共通の所有権を享有し、
本明細書において援用されるＡｒｎｏｌｄらによる米国
特許第５，２８３，１７４号に開示されているような、
ハイブリダイズしていないプローブ上に存在する標識を
選択的に分解し、続いて残存するハイブリダイズしたプ
ローブに付随する標識の量を測定することを含む技術も
これらの技術の中に含まれている。この後者の技術が現
在のところ好ましい。
【０１１６】Ｅ．ボレリアの検出に使用されるヘルパー
オリゴヌクレオチド 特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドが標的核酸へのハイ
ブリダイゼーションアッセイプローブのハイブリダイゼ
ーションを容易にするために使用された。ヘルパーオリ
ゴヌクレオチドは、本出願と共通の所有権を享有し、本
明細書において援用される”核酸ハイブリダイゼーショ
ンを促進するための手段および方法”と題されたＨｏｇ
ａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎによる米国特許第５，０３
０，５５７号に開示されている。
オリゴヌクレオチド 特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドが標的核酸へのハイ
ブリダイゼーションアッセイプローブのハイブリダイゼ
ーションを容易にするために使用された。ヘルパーオリ
ゴヌクレオチドは、本出願と共通の所有権を享有し、本
明細書において援用される”核酸ハイブリダイゼーショ
ンを促進するための手段および方法”と題されたＨｏｇ
ａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎによる米国特許第５，０３
０，５５７号に開示されている。
【０１１７】ヘルパープローブはハイブリダイゼーショ
ンアッセイプローブにより標的化された領域近くに位置
する核酸配列へハイブリダイズするように選択される。
ヘルパープローブのハイブリダイゼーションは標的核酸
の二次および三次構造を変化させ、標的核酸へのプロー
ブのハイブリダイゼーションを容易にする。
ンアッセイプローブにより標的化された領域近くに位置
する核酸配列へハイブリダイズするように選択される。
ヘルパープローブのハイブリダイゼーションは標的核酸
の二次および三次構造を変化させ、標的核酸へのプロー
ブのハイブリダイゼーションを容易にする。
【０１１８】ボレリア核酸の特異的検出を容易にするた
めの特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドはこれらのヌク
レオチド配列の一つを持っているかまたは実質的に対応
している： 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA。
めの特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドはこれらのヌク
レオチド配列の一つを持っているかまたは実質的に対応
している： 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA。
【０１１９】別の態様において、ボレリア核酸の特異的
検出を容易にするための特異的ヘルパーオリゴヌクレオ
チドは以下のヌクレオチド配列の一つを持っているかま
たは実質的に対応している： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
検出を容易にするための特異的ヘルパーオリゴヌクレオ
チドは以下のヌクレオチド配列の一つを持っているかま
たは実質的に対応している： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
【０１２０】好適な態様において、ヘルパーオリゴヌク
レオチドと一緒にプローブ混合物で使用されるライム病
関連ボレリアの１６Ｓリボソーム核酸に方向付けられた
ハイブリダイゼーションアッセイプローブは以下のヌク
レオチド配列を持っているかまたは実質的に対応してい
る： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG。
レオチドと一緒にプローブ混合物で使用されるライム病
関連ボレリアの１６Ｓリボソーム核酸に方向付けられた
ハイブリダイゼーションアッセイプローブは以下のヌク
レオチド配列を持っているかまたは実質的に対応してい
る： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG。
【０１２１】最も好適な態様において、実質的に 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC に対応するライム病関連ボレリア１６Ｓリボソーム核酸
に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以
下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以
下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【０１２２】最も好適な態様において、実質的に 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC に対応するライム病関連ボレリア１６Ｓリボソーム核酸
に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以
下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG および 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以
下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG および 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【０１２３】好適な態様において、ヘルパーオリゴヌク
レオチドと一緒にプローブ混合物で使用されるライム病
関連ボレリアの２３Ｓ核酸に方向付けられたハイブリダ
イゼーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配
列を持っているかまたは実質的に対応している： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
レオチドと一緒にプローブ混合物で使用されるライム病
関連ボレリアの２３Ｓ核酸に方向付けられたハイブリダ
イゼーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配
列を持っているかまたは実質的に対応している： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
【０１２４】最も好適な態様において、実質的に 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG に対応するライム病関連ボレリア２３Ｓリボソーム核酸
に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以
下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以
下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【０１２５】好適な態様において、実質的に配列ＩＤ番
号１０または配列ＩＤ番号３３に対応するボレリア ヘ
ルムシー１６Ｓリボソーム核酸に方向付けられたハイブ
リダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
号１０または配列ＩＤ番号３３に対応するボレリア ヘ
ルムシー１６Ｓリボソーム核酸に方向付けられたハイブ
リダイゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【０１２６】好適な態様において、実質的に 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC に対応するボレリア ヘルムシー１６Ｓリボソーム核酸
に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以
下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以
下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【０１２７】好適な態様において、ボレリア ヘルムシ
ー２３Ｓリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダイ
ゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
ー２３Ｓリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダイ
ゼーションプローブは以下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【０１２８】好適な態様において、実質的に 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG に対応するボレリア ヘルムシー２３Ｓリボソーム核酸
に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以
下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
に方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以
下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。
【０１２９】ヘルパーオリゴヌクレオチドは一般的には
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で使用
されるが、特異性においては種特異的である必要はな
い；すなわち、ヘルパーオリゴヌクレオチドのための標
的ヌクレオチド配列は種ボレリアに独特である必要はな
い。
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で使用
されるが、特異性においては種特異的である必要はな
い；すなわち、ヘルパーオリゴヌクレオチドのための標
的ヌクレオチド配列は種ボレリアに独特である必要はな
い。
【０１３０】Ｆ．核酸組成物 別の関連する態様において、本発明はハイブリダイゼー
ションアッセイプローブおよびそれに対して実質的に相
補的である核酸配列間の核酸ハイブリッド（プローブ：
標的）を含む組成物を特色としている。プローブおよび
標的間で形成されたハイブリッドの一つの使用は標的配
列の存在を検出することである。例えば、ハイブリッド
に存在するアクリジニウムエステル（”ＡＥ”）はアル
カリ溶液での加水分解に抵抗するが、一方一本鎖核酸に
存在するＡＥはアルカリ溶液で加水分解される（Ａｒｎ
ｏｌｄら、”同質保護アッセイ”と題されたＥＰＯ出願
番号第８８３０８７６７．８号、公開番号第３０９２３
０号、および米国特許番号第５，２３８，１７４号、本
明細書において援用される）。従って、非結合ＡＥ−標
識プローブの加水分解後、核酸ハイブリッドに付随する
残存アクリジニウムエステルの化学発光を測定すること
により標的核酸の存在が検出できる。
ションアッセイプローブおよびそれに対して実質的に相
補的である核酸配列間の核酸ハイブリッド（プローブ：
標的）を含む組成物を特色としている。プローブおよび
標的間で形成されたハイブリッドの一つの使用は標的配
列の存在を検出することである。例えば、ハイブリッド
に存在するアクリジニウムエステル（”ＡＥ”）はアル
カリ溶液での加水分解に抵抗するが、一方一本鎖核酸に
存在するＡＥはアルカリ溶液で加水分解される（Ａｒｎ
ｏｌｄら、”同質保護アッセイ”と題されたＥＰＯ出願
番号第８８３０８７６７．８号、公開番号第３０９２３
０号、および米国特許番号第５，２３８，１７４号、本
明細書において援用される）。従って、非結合ＡＥ−標
識プローブの加水分解後、核酸ハイブリッドに付随する
残存アクリジニウムエステルの化学発光を測定すること
により標的核酸の存在が検出できる。
【０１３１】本発明はまた増幅オリゴヌクレオチドおよ
びそれに対して実質的に相補的な核酸配列間の核酸ハイ
ブリッド（プライマー：標的）を含む組成物も企図して
いる。プライマーおよび標的間で形成された核酸ハイブ
リッドの一つの使用は増幅オリゴヌクレオチドの３’末
端にポリメラーゼのための開始部位を提供することであ
る。例えば、ハイブリッドは逆転写酵素、Ｔａｑポリメ
ラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ポリメラ
ーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼおよびＴ３ポリメラーゼなど
のようなＤＮＡポリメラーゼのための開始部位を形成す
るであろう。
びそれに対して実質的に相補的な核酸配列間の核酸ハイ
ブリッド（プライマー：標的）を含む組成物も企図して
いる。プライマーおよび標的間で形成された核酸ハイブ
リッドの一つの使用は増幅オリゴヌクレオチドの３’末
端にポリメラーゼのための開始部位を提供することであ
る。例えば、ハイブリッドは逆転写酵素、Ｔａｑポリメ
ラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ポリメラ
ーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼおよびＴ３ポリメラーゼなど
のようなＤＮＡポリメラーゼのための開始部位を形成す
るであろう。
【０１３２】本発明はまた、ヘルパーオリゴヌクレオチ
ドおよびそれに対して実質的に相補的である核酸配列間
の核酸ハイブリッド（ヘルパーオリゴヌクレオチド：標
的）を含む組成物を特色とする。ヘルパーオリゴヌクレ
オチドおよび標的間のハイブリッドの一つの使用は特別
の核酸配列をハイブリダイゼーションに利用できること
にすることである。例えば、ヘルパーオリゴヌクレオチ
ドおよびその標的間のハイブリッドは核酸配列をハイブ
リダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーション
に利用可能な標的配列へハイブリダイズできるようにす
るであろう。ヘルパーオリゴヌクレオチド使用の完全な
記述はＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎによる米国特
許第５，０３０，５５７号に提供されている。
ドおよびそれに対して実質的に相補的である核酸配列間
の核酸ハイブリッド（ヘルパーオリゴヌクレオチド：標
的）を含む組成物を特色とする。ヘルパーオリゴヌクレ
オチドおよび標的間のハイブリッドの一つの使用は特別
の核酸配列をハイブリダイゼーションに利用できること
にすることである。例えば、ヘルパーオリゴヌクレオチ
ドおよびその標的間のハイブリッドは核酸配列をハイブ
リダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーション
に利用可能な標的配列へハイブリダイズできるようにす
るであろう。ヘルパーオリゴヌクレオチド使用の完全な
記述はＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍａｎによる米国特
許第５，０３０，５５７号に提供されている。
【０１３３】本発明の組成物にはボレリア核酸および下
記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸
配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイ
ブリッドを含むボレリア核酸を検出するための組成物が
含まれる： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。
記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸
配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイ
ブリッドを含むボレリア核酸を検出するための組成物が
含まれる： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。
【０１３４】本発明の好適な組成物にはボレリア核酸お
よび下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応す
る核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核
酸ハイブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出する
ための組成物が含まれる： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。
よび下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応す
る核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核
酸ハイブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出する
ための組成物が含まれる： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG。
【０１３５】本発明の好適な組成物にはボレリア核酸お
よび下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応す
る核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核
酸ハイブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出する
ための組成物が含まれる： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC および 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG。
よび下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応す
る核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された核
酸ハイブリッドを含むライム病関連ボレリアを検出する
ための組成物が含まれる： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC および 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG。
【０１３６】本発明はまた、ボレリア核酸および 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号８：おCTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTC
CAACATA および 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むライム
病関連ボレリアを検出するための組成物も企図してい
る。
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号８：おCTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTC
CAACATA および 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むライム
病関連ボレリアを検出するための組成物も企図してい
る。
【０１３７】本発明はまた、ボレリア核酸および 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA および 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むライム
病関連ボレリアを検出するための組成物も企図してい
る。
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA および 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むライム
病関連ボレリアを検出するための組成物も企図してい
る。
【０１３８】本発明の好適な組成物にはボレリア ヘル
ムシー核酸および下記の核酸配列の少なくとも一つに実
質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で
形成された核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシ
ーを検出するための組成物が含まれる： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG および 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC。
ムシー核酸および下記の核酸配列の少なくとも一つに実
質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で
形成された核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシ
ーを検出するための組成物が含まれる： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG および 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC。
【０１３９】本発明のより好適な組成物にはボレリア
ヘルムシー核酸および下記の核酸配列の少なくとも一つ
に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成された核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘル
ムシーを検出するための組成物が含まれる： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG および 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC。
ヘルムシー核酸および下記の核酸配列の少なくとも一つ
に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成された核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘル
ムシーを検出するための組成物が含まれる： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG および 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC。
【０１４０】本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸
および 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT および 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むボレリ
ア ヘルムシーを検出するための組成物も企図してい
る。
および 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT および 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むボレリ
ア ヘルムシーを検出するための組成物も企図してい
る。
【０１４１】本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸
および 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU および 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU の少なくとも一つと実質的に対応した核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むボレリ
ア ヘルムシーを検出するための組成物も企図してい
る。
および 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU および 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU の少なくとも一つと実質的に対応した核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むボレリ
ア ヘルムシーを検出するための組成物も企図してい
る。
【０１４２】本発明はまた本発明のプローブおよび下記
の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配
列を持つ少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチド
を含む核酸ハイブリッドを企図している： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配
列を持つ少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチド
を含む核酸ハイブリッドを企図している： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG。
【０１４３】本発明はまた、ボレリア核酸および 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT および 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA および 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG および 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図
している。
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA および 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG および 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図
している。
【０１４４】本発明はまた、ボレリア核酸および 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG および 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図
している。
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図
している。
【０１４５】本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸
および 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA および 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT および 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図
している。
および 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA および 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT および 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図
している。
【０１４６】本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸
および 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG および 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図
している。
および 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG および 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図
している。
【０１４７】好適な態様において、本発明はまた本発明
のプローブおよび下記の核酸配列の少なくとも一つに実
質的に対応する核酸配列を持つ少なくとも一つのヘルパ
ーオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドを企図し
ている： 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA。
のプローブおよび下記の核酸配列の少なくとも一つに実
質的に対応する核酸配列を持つ少なくとも一つのヘルパ
ーオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドを企図し
ている： 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA。
【０１４８】本発明はまた、ボレリア核酸および 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA または 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA （ここで１９の最も３’のヌクレオチドは示されたよう
に厳密である）に実質的に対応した核酸配列を持つオリ
ゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッドを含む
ライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図し
ている。
ACATA または 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA （ここで１９の最も３’のヌクレオチドは示されたよう
に厳密である）に実質的に対応した核酸配列を持つオリ
ゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッドを含む
ライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図し
ている。
【０１４９】Ｇ．アッセイ法 本発明は試料内のボレリア核酸の存在をアッセイするた
めの種々の方法を企図している。使用される厳密なアッ
セイ条件、プローブまたはプライマーは、使用される特
定のアッセイ型および試料源に依存して変化するであろ
うことが当業者には理解されるであろう。
めの種々の方法を企図している。使用される厳密なアッ
セイ条件、プローブまたはプライマーは、使用される特
定のアッセイ型および試料源に依存して変化するであろ
うことが当業者には理解されるであろう。
【０１５０】一般に、本発明はストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェント
ハイブリダイゼーション条件下でボレリア標的核酸とハ
イブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核
酸とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイプローブと接触させることによりボレリア
微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核
酸は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸
配列を持っている。
リダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェント
ハイブリダイゼーション条件下でボレリア標的核酸とハ
イブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核
酸とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイプローブと接触させることによりボレリア
微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標的核
酸は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸
配列を持っている。
【０１５１】ライム病関連ボレリアの存在を検出するた
めの好適な方法は、ストリンジェントハイブリダイゼー
ション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダ
イゼーション条件下でライム病関連ボレリア標的核酸と
ハイブリダイズできるが、ボレリア ヘルムシーのよう
な密接に関連した細菌の核酸配列とはハイブリダイズで
きない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと
接触させる工程を含み、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC から成るより選択される配列に実質的に対応する。
めの好適な方法は、ストリンジェントハイブリダイゼー
ション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダ
イゼーション条件下でライム病関連ボレリア標的核酸と
ハイブリダイズできるが、ボレリア ヘルムシーのよう
な密接に関連した細菌の核酸配列とはハイブリダイズで
きない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと
接触させる工程を含み、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC から成るより選択される配列に実質的に対応する。
【０１５２】ライム病関連ボレリアの存在を検出するた
めのより好適な方法は、ストリンジェントハイブリダイ
ゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア標的核
酸とハイブリダイズできるが、ボレリア ヘルムシーの
ような密接に関連した細菌の核酸配列とはハイブリダイ
ズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプロー
ブと接触させる工程を含み、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG および 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC から成るより選択される配列に実質的に対応する。
めのより好適な方法は、ストリンジェントハイブリダイ
ゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア標的核
酸とハイブリダイズできるが、ボレリア ヘルムシーの
ような密接に関連した細菌の核酸配列とはハイブリダイ
ズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプロー
ブと接触させる工程を含み、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG および 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC から成るより選択される配列に実質的に対応する。
【０１５３】本発明はまた、ストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハ
イブリダイゼーション条件下でボレリア１６Ｓリボソー
ム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した
微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸
ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる
ことによりボレリア微生物の存在を検出する方法を企図
しており、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC および 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。
ダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハ
イブリダイゼーション条件下でボレリア１６Ｓリボソー
ム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した
微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸
ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる
ことによりボレリア微生物の存在を検出する方法を企図
しており、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC および 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。
【０１５４】一般に、本発明はストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェント
ハイブリダイゼーション条件下でボレリア２３Ｓリボソ
ーム核酸とハイブリダイズできるが、密接に関連した微
生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイプローブと接触させるこ
とによりボレリア微生物の存在を検出する方法を企図し
ており、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。
リダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェント
ハイブリダイゼーション条件下でボレリア２３Ｓリボソ
ーム核酸とハイブリダイズできるが、密接に関連した微
生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイプローブと接触させるこ
とによりボレリア微生物の存在を検出する方法を企図し
ており、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。
【０１５５】本発明はストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でボレリア１６Ｓリボソーム核酸
配列とハイブリダイズできるが、ボレリア ブルグドル
フェリおよび他のライム病関連ボレリアのような密接に
関連した微生物からの核酸とはハイブリダイズできない
核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触さ
せることによりボレリア ヘルムシー微生物の存在を検
出する方法を企図しており、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC および 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC から成る群より選択される配列に実質的に対応するヌク
レオチド配列を持っている。
ーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でボレリア１６Ｓリボソーム核酸
配列とハイブリダイズできるが、ボレリア ブルグドル
フェリおよび他のライム病関連ボレリアのような密接に
関連した微生物からの核酸とはハイブリダイズできない
核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触さ
せることによりボレリア ヘルムシー微生物の存在を検
出する方法を企図しており、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC および 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC から成る群より選択される配列に実質的に対応するヌク
レオチド配列を持っている。
【０１５６】本発明はストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でボレリア２３Ｓリボソーム核酸
配列とハイブリダイズできるが、ボレリア ブルグドル
フェリおよび他のライム病関連ボレリアのような密接に
関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズでき
ない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接
触させることによりボレリア ヘルムシー微生物の存在
を検出する方法を企図しており、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される配列に実質的に対応する。
ーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でボレリア２３Ｓリボソーム核酸
配列とハイブリダイズできるが、ボレリア ブルグドル
フェリおよび他のライム病関連ボレリアのような密接に
関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズでき
ない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接
触させることによりボレリア ヘルムシー微生物の存在
を検出する方法を企図しており、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される配列に実質的に対応する。
【０１５７】本発明はまた、ストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハ
イブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア１
６Ｓリボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密
接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズ
できない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ
と接触させることによりライム病関連ボレリア微生物の
存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸配列
は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC および 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。
ダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェントハ
イブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア１
６Ｓリボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密
接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズ
できない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ
と接触させることによりライム病関連ボレリア微生物の
存在を検出する方法を企図しており、該標的核酸配列
は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC および 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。
【０１５８】最も好適であるのはストリンジェントハイ
ブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェン
トハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリ
ア１６Ｓリボソーム核酸配列とハイブリダイズできる
が、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリ
ダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブと接触させることによりライム病関連ボレリア微
生物の存在を検出する方法であり、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。
ブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェン
トハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリ
ア１６Ｓリボソーム核酸配列とハイブリダイズできる
が、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリ
ダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブと接触させることによりライム病関連ボレリア微
生物の存在を検出する方法であり、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。
【０１５９】本発明はストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア２３Ｓリ
ボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関
連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできな
い核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触
させることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を
検出する方法を企図しており、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。
ーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア２３Ｓリ
ボソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関
連した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできな
い核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触
させることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を
検出する方法を企図しており、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。
【０１６０】最も好適であるのはストリンジェントハイ
ブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェン
トハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリ
ア２３Ｓリボソーム核酸配列とハイブリダイズできる
が、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリ
ダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブと接触させることによりライム病関連ボレリア微
生物の存在を検出する方法であり、該標的核酸配列はヌ
クレオチド配列： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG に実質的に対応している。
ブリダイゼーション条件下、試験試料をストリンジェン
トハイブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリ
ア２３Ｓリボソーム核酸配列とハイブリダイズできる
が、密接に関連した微生物からの核酸配列とはハイブリ
ダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブと接触させることによりライム病関連ボレリア微
生物の存在を検出する方法であり、該標的核酸配列はヌ
クレオチド配列： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG に実質的に対応している。
【０１６１】本発明はまた、最初にボレリア核酸の一部
を増幅し、次に随意に本発明のハイブリダイゼーション
アッセイプローブを用いて本発明のプライマーにより増
幅された特異的ボレリア核酸をアッセイすることによる
ボレリア微生物の検出法も企図している。増幅された核
酸はゲル電気泳動を含む多くの方法で検出できる。
を増幅し、次に随意に本発明のハイブリダイゼーション
アッセイプローブを用いて本発明のプライマーにより増
幅された特異的ボレリア核酸をアッセイすることによる
ボレリア微生物の検出法も企図している。増幅された核
酸はゲル電気泳動を含む多くの方法で検出できる。
【０１６２】好適な態様において、本発明は最初に以下
の配列： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC および 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG の一つまたはそれ以上へ結合するまたは延長を起こすで
あろう少なくとも一つの増幅オリゴヌクレオチドで該核
酸を増幅するボレリア核酸の検出法を企図しており、こ
こで該増幅オリゴヌクレオチドは随意にＲＮＡポリメラ
ーゼにより認識されるまたはＲＮＡポリメラーゼによる
延長の開始を促進する核酸配列を持っている。
の配列： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC および 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG の一つまたはそれ以上へ結合するまたは延長を起こすで
あろう少なくとも一つの増幅オリゴヌクレオチドで該核
酸を増幅するボレリア核酸の検出法を企図しており、こ
こで該増幅オリゴヌクレオチドは随意にＲＮＡポリメラ
ーゼにより認識されるまたはＲＮＡポリメラーゼによる
延長の開始を促進する核酸配列を持っている。
【０１６３】この最初の方法工程に続いて、増幅工程で
産生された増幅核酸をストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下、ボレリア核酸に特異的にハイブリダイ
ズできるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションア
ッセイプローブで検出する。
産生された増幅核酸をストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下、ボレリア核酸に特異的にハイブリダイ
ズできるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションア
ッセイプローブで検出する。
【０１６４】本発明の方法で使用される増幅オリゴヌク
レオチドは随意にＲＮＡポリメラーゼにより認識される
またはＲＮＡポリメラーゼによる延長の開始を促進する
核酸配列を持っている。
レオチドは随意にＲＮＡポリメラーゼにより認識される
またはＲＮＡポリメラーゼによる延長の開始を促進する
核酸配列を持っている。
【０１６５】Ｈ．診断システム 本発明はまたキットの形での診断システムも企図してい
る。本発明の診断システムには、少なくとも１回のアッ
セイに十分な量の増幅プライマーおよび／または本発明
のハイブリダイゼーションアッセイプローブを包装素材
内に包含するキットを含まれる。典型的には、キットに
はまた包装されたプライマーおよび／またはプローブを
使用するための説明書も含まれているであろう。
る。本発明の診断システムには、少なくとも１回のアッ
セイに十分な量の増幅プライマーおよび／または本発明
のハイブリダイゼーションアッセイプローブを包装素材
内に包含するキットを含まれる。典型的には、キットに
はまた包装されたプライマーおよび／またはプローブを
使用するための説明書も含まれているであろう。
【０１６６】診断システムのさまざまな構成要素は種々
の形で提供される。例えば、必要とされる酵素、ヌクレ
オチド三リン酸、プライマーおよびプローブは凍結乾燥
された試薬として提供される。これらの凍結乾燥された
試薬は再構成された場合、各々の成分の適正な比を持ち
アッセイに即座に使用できる完全な混合物を形成させる
ために凍結乾燥に先立って混合されているであろう。さ
らに、本発明の診断システムはキットの凍結乾燥試薬再
構築のための再構築試薬を含んでいるであろう。好適な
キットにおいて、酵素、ヌクレオチド三リン酸および酵
素に必要とされる補助因子は単独の凍結乾燥試薬として
提供され、再構築された場合に本方法で使用する適切な
試薬を形成する。これらの好適なキットにおいて、凍結
乾燥プライマー試薬もまた提供される。別の好適なキッ
トにおいては凍結乾燥プローブ試薬が提供される。
の形で提供される。例えば、必要とされる酵素、ヌクレ
オチド三リン酸、プライマーおよびプローブは凍結乾燥
された試薬として提供される。これらの凍結乾燥された
試薬は再構成された場合、各々の成分の適正な比を持ち
アッセイに即座に使用できる完全な混合物を形成させる
ために凍結乾燥に先立って混合されているであろう。さ
らに、本発明の診断システムはキットの凍結乾燥試薬再
構築のための再構築試薬を含んでいるであろう。好適な
キットにおいて、酵素、ヌクレオチド三リン酸および酵
素に必要とされる補助因子は単独の凍結乾燥試薬として
提供され、再構築された場合に本方法で使用する適切な
試薬を形成する。これらの好適なキットにおいて、凍結
乾燥プライマー試薬もまた提供される。別の好適なキッ
トにおいては凍結乾燥プローブ試薬が提供される。
【０１６７】典型的な包装素材には本発明のハイブリダ
イゼーションアッセイプローブまたは増幅プライマーを
固定した範囲内に保つことができるガラス、プラスチッ
ク、紙、およびホイルのような固体マトリックスが含ま
れるであろう。従って、例えば、包装素材から作製され
た包装とは企図されたプライマーまたはハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブのマイクログラムからミリグ
ラム量を包含させるためのガラスバイアルであろうし、
または本発明のプローブおよび／またはプライマーが作
動可能なように付着されている（すなわち、本発明の検
出法に関与できるように結合されている）マイクロタイ
タープレートであろう。
イゼーションアッセイプローブまたは増幅プライマーを
固定した範囲内に保つことができるガラス、プラスチッ
ク、紙、およびホイルのような固体マトリックスが含ま
れるであろう。従って、例えば、包装素材から作製され
た包装とは企図されたプライマーまたはハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブのマイクログラムからミリグ
ラム量を包含させるためのガラスバイアルであろうし、
または本発明のプローブおよび／またはプライマーが作
動可能なように付着されている（すなわち、本発明の検
出法に関与できるように結合されている）マイクロタイ
タープレートであろう。
【０１６８】使用説明書は典型的には種々の試薬および
／または試薬の濃度を記載している明確な表現、および
少なくとも一つのアッセイ法パラメーター（例えば、試
料量当たりの試薬の相対量であろう）を含んでいる。さ
らに、メンテナンス、時間、温度および緩衝液条件のよ
うな明細書も含まれているであろう。
／または試薬の濃度を記載している明確な表現、および
少なくとも一つのアッセイ法パラメーター（例えば、試
料量当たりの試薬の相対量であろう）を含んでいる。さ
らに、メンテナンス、時間、温度および緩衝液条件のよ
うな明細書も含まれているであろう。
【０１６９】本発明は本発明の組成物のオリゴヌクレオ
チドを含む診断システムまたはキットを企図している。
本発明はまた、本発明の方法を実施するのに必要なオリ
ゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図
している。
チドを含む診断システムまたはキットを企図している。
本発明はまた、本発明の方法を実施するのに必要なオリ
ゴヌクレオチドを含む診断システムまたはキットを企図
している。
【０１７０】本発明は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC から成る群より選択される核酸配列に実質的に対応して
いる核酸を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを
含む診断システムまたはキットを企図している。
いる核酸を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを
含む診断システムまたはキットを企図している。
【０１７１】本発明は：該オリゴヌクレオチドが 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC または 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC である場合： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU；または該オリゴヌクレオチドが 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC または 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC である場合： 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG； または、該オリゴヌクレオチドが 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG である場合： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸
配列を持つ少なくとも一つのヘルパープローブを随意に
持つ診断システムまたはキットを企図している。
AT 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU；または該オリゴヌクレオチドが 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC または 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC である場合： 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG； または、該オリゴヌクレオチドが 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG である場合： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸
配列を持つ少なくとも一つのヘルパープローブを随意に
持つ診断システムまたはキットを企図している。
【０１７２】本発明は、随意にＲＮＡポリメラーゼによ
り認識される、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始ま
たは延長を促進する５’配列を持つ： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC および 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG から成る群より選択される核酸配列に実質的に対応して
いる核酸を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを
含む診断システムまたはキットを企図している。
り認識される、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始ま
たは延長を促進する５’配列を持つ： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC および 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG から成る群より選択される核酸配列に実質的に対応して
いる核酸を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを
含む診断システムまたはキットを企図している。
【０１７３】本発明は：該二つのオリゴヌクレオチド
が： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA および 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT から選択される場合は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC および 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC； または、該オリゴヌクレオチドが 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC および 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG から選択される場合は： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG および 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG から選択される核酸配列に実質的に対応する核酸配列を
持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを随意に持つ
診断システムまたはキットを企図している。
が： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA および 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT から選択される場合は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC および 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC； または、該オリゴヌクレオチドが 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC および 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG から選択される場合は： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG および 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG から選択される核酸配列に実質的に対応する核酸配列を
持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを随意に持つ
診断システムまたはキットを企図している。
【０１７４】本発明は以下の配列： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA および 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC または 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。
ACATA および 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC または 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。
【０１７５】本発明は以下の配列： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA および 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC または 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。
CA および 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC または 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。
【０１７６】本発明は以下の配列： 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA および 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC または 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。
ACATA および 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC または 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。
【０１７７】本発明は以下の配列： 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG または 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。
を含む診断システムまたはキットを企図している。
【０１７８】本発明は以下の配列： 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG または 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。
を含む診断システムまたはキットを企図している。
【０１７９】
【実施例】実施例：本発明の異なった特色および態様を
例示するために以下に実施例が提供される。これらの実
施例は開示された発明を制限することを意図しているも
のではない。
例示するために以下に実施例が提供される。これらの実
施例は開示された発明を制限することを意図しているも
のではない。
【０１８０】ボレリア ブルグドルフェリを含むライム
病関連ボレリアに対して特異的なプローブは報告および
決定されている１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ配列から
同定された。系統発生的に近い近縁種Ｂ．ヘルムシー、
Ｂ．トゥリカテ、Ｂ．アンセリナおよびＢ．コリアセエ
からの核酸配列は変異領域を同定するためにＢ．ブルグ
ドルフェリの核酸配列との比較に使用された。
病関連ボレリアに対して特異的なプローブは報告および
決定されている１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ配列から
同定された。系統発生的に近い近縁種Ｂ．ヘルムシー、
Ｂ．トゥリカテ、Ｂ．アンセリナおよびＢ．コリアセエ
からの核酸配列は変異領域を同定するためにＢ．ブルグ
ドルフェリの核酸配列との比較に使用された。
【０１８１】以下のハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブ配列は以下の実施例に特徴が示されている：配列
ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：
２１はＢ．ブルグドルフェリに方向付けられており、お
よび配列ＩＤ番号：１０および２２はＢ．ヘルムシーに
方向付けられている。
ローブ配列は以下の実施例に特徴が示されている：配列
ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：
２１はＢ．ブルグドルフェリに方向付けられており、お
よび配列ＩＤ番号：１０および２２はＢ．ヘルムシーに
方向付けられている。
【０１８２】プローブはＡｒｎｏｌｄら（上記文献、”
ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合
剤”）により記載されているように非ヌクレオチドリン
カーで合成され、次にＡｒｎｏｌｄら（上記文献、米国
特許第５，１８５，４３９号）により記載されているよ
うに化学発光性アクリジニウムエステルで標識された。
ライム病関連ボレリアに対する反応性および特異性はＡ
ｒｎｏｌｄら（上記文献、”均質保護アッセイ”）およ
びＡｒｎｏｌｄら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１５８
８（１９８９）、本明細書において援用される）により
記載されているような均質アッセイフォーマットを用い
て示された。結果はルミノメーターにより検出された光
子計測の相対的光ユニット（ＲＬＵ）として与えられ
た。プローブは細胞溶解物の核酸または標的増幅反応の
生成物とハイブリダイズされた。以下の実施例はボレリ
ア ブルグドルフェリを含むライム病関連ボレリアを標
的とするハイブリダイゼーションアッセイプローブおよ
び増幅オリゴヌクレオチド、およびハイブリダイゼーシ
ョンおよび増幅／ハイブリダイゼーションアッセイにお
けるそれらの使用を記載している。実施例１． １６Ｓ
ｒＲＮＡを標的とするプローブを用いたライム病関連
ボレリアの検出 この実施例はＢ．ブルグドルフェリからのライム病関連
ボレリア核酸を直接検出するために（しかしＢ．ヘルム
シーは検出しない）ライム病関連ボレリア１６Ｓ ｒＲ
ＮＡを標的としたプローブの能力を例示している。プロ
ーブ溶液は配列、配列ＩＤ番号：１で合成されたアクリ
ジニウムエステル標識プローブおよび配列ＩＤ番号：３
および配列ＩＤ番号：５を持つ対応する非標識ヘルパー
オリゴヌクレオチドを含んでいる。配列ＩＤ番号：１か
らなるプローブの標的配列はライム病関連ボレリア群を
示す株で同一になるように選択され、従ってこのプロー
ブはライム病に関連する三つすべての亜種または種（Ｖ
Ｓ４６１、Ｂ．ブルグドルフェリ センス ストリクチ
ュおよびＢ．ガリニー）を検出することが期待される。
ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合
剤”）により記載されているように非ヌクレオチドリン
カーで合成され、次にＡｒｎｏｌｄら（上記文献、米国
特許第５，１８５，４３９号）により記載されているよ
うに化学発光性アクリジニウムエステルで標識された。
ライム病関連ボレリアに対する反応性および特異性はＡ
ｒｎｏｌｄら（上記文献、”均質保護アッセイ”）およ
びＡｒｎｏｌｄら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１５８
８（１９８９）、本明細書において援用される）により
記載されているような均質アッセイフォーマットを用い
て示された。結果はルミノメーターにより検出された光
子計測の相対的光ユニット（ＲＬＵ）として与えられ
た。プローブは細胞溶解物の核酸または標的増幅反応の
生成物とハイブリダイズされた。以下の実施例はボレリ
ア ブルグドルフェリを含むライム病関連ボレリアを標
的とするハイブリダイゼーションアッセイプローブおよ
び増幅オリゴヌクレオチド、およびハイブリダイゼーシ
ョンおよび増幅／ハイブリダイゼーションアッセイにお
けるそれらの使用を記載している。実施例１． １６Ｓ
ｒＲＮＡを標的とするプローブを用いたライム病関連
ボレリアの検出 この実施例はＢ．ブルグドルフェリからのライム病関連
ボレリア核酸を直接検出するために（しかしＢ．ヘルム
シーは検出しない）ライム病関連ボレリア１６Ｓ ｒＲ
ＮＡを標的としたプローブの能力を例示している。プロ
ーブ溶液は配列、配列ＩＤ番号：１で合成されたアクリ
ジニウムエステル標識プローブおよび配列ＩＤ番号：３
および配列ＩＤ番号：５を持つ対応する非標識ヘルパー
オリゴヌクレオチドを含んでいる。配列ＩＤ番号：１か
らなるプローブの標的配列はライム病関連ボレリア群を
示す株で同一になるように選択され、従ってこのプロー
ブはライム病に関連する三つすべての亜種または種（Ｖ
Ｓ４６１、Ｂ．ブルグドルフェリ センス ストリクチ
ュおよびＢ．ガリニー）を検出することが期待される。
【０１８３】Ｂ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ヘルムシーお
よび大腸菌１６Ｓの領域を整列させたものが以下に示さ
れており、点は配列における類似点を示している：
よび大腸菌１６Ｓの領域を整列させたものが以下に示さ
れており、点は配列における類似点を示している：
【０１８４】
【化１】大腸菌１６Ｓ 5'- GGCGGUUUGUUAAGUCUG-AU-3' ..... . ....... Bbu GGCGGAUAUAUAAGUCUUACG-3' Bhe .........GC...... .... 以下の実験において、細胞溶解物から放出された核酸が
直接アッセイされた。溶解物を調製するための方法の例
はＭｕｒｐｈｙら（ＥＰＯ公開番号第２８８６１８号、
本明細書において援用される）により提供されている。
各々の細胞の５０μｌおよび１００ｍＭコハク酸リチウ
ム ｐＨ５、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、
１．２Ｍ塩化リチウム、２０ｍＭエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）、およびエチレングリコールビス（ベー
タ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸
（ＥＧＴＡ）を含む５０μｌのプローブ溶液を混合し、
６０℃で２０分インキュベートし、続いて０．３ｍｌの
０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％トリト
ンＸ−１００を加え、６０℃で１５分間インキュベート
した。反応液を冷却し、０．１％過酸化水素を含む１ｍ
Ｍ硝酸の自動注入、続いての１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
の注入後、ハイブリダイズしたアクリジニウムエステル
標識プローブからの残存する化学発光をルミノメーター
で測定した。結果は相対的光ユニットまたはＲＬＵで与
えられた。配列ＩＤ番号：５８−６３を含むヘルパーオ
リゴヌクレオチドとともに全細菌／酵母プローブ混合物
が細菌核酸の存在を示すために対照として使用された。
Ｈｏｇａｎら（上記文献、”非ウイルス生物体の検出お
よび／または定量のための核酸プローブ”と題された）
は適した全細菌／酵母プローブ混合物の例を与えてい
る。データは、プローブはライム病関連ボレリア種ボレ
リア ブルグドルフェリとハイブリダイズし、それをそ
の密接な系統発生学的近縁種ボレリア ヘルムシーと区
別していることを示している。
直接アッセイされた。溶解物を調製するための方法の例
はＭｕｒｐｈｙら（ＥＰＯ公開番号第２８８６１８号、
本明細書において援用される）により提供されている。
各々の細胞の５０μｌおよび１００ｍＭコハク酸リチウ
ム ｐＨ５、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、
１．２Ｍ塩化リチウム、２０ｍＭエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）、およびエチレングリコールビス（ベー
タ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸
（ＥＧＴＡ）を含む５０μｌのプローブ溶液を混合し、
６０℃で２０分インキュベートし、続いて０．３ｍｌの
０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％トリト
ンＸ−１００を加え、６０℃で１５分間インキュベート
した。反応液を冷却し、０．１％過酸化水素を含む１ｍ
Ｍ硝酸の自動注入、続いての１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
の注入後、ハイブリダイズしたアクリジニウムエステル
標識プローブからの残存する化学発光をルミノメーター
で測定した。結果は相対的光ユニットまたはＲＬＵで与
えられた。配列ＩＤ番号：５８−６３を含むヘルパーオ
リゴヌクレオチドとともに全細菌／酵母プローブ混合物
が細菌核酸の存在を示すために対照として使用された。
Ｈｏｇａｎら（上記文献、”非ウイルス生物体の検出お
よび／または定量のための核酸プローブ”と題された）
は適した全細菌／酵母プローブ混合物の例を与えてい
る。データは、プローブはライム病関連ボレリア種ボレ
リア ブルグドルフェリとハイブリダイズし、それをそ
の密接な系統発生学的近縁種ボレリア ヘルムシーと区
別していることを示している。
【０１８５】
【表１】表１ ． ボレリア ブルグドルフェリおよびボレリア ヘルムシーのｒＲＮＡへ のプローブ配列番号：１のハイブリダイゼーション ＲＬＵ プローブ 配列番号：１ 全細菌 生物体Ｂ．ブルグドルフェリ ８１１，７１２ １，１８７，３４５ ７９５，８１８ １，１８３，４３４ Ｂ．ヘルムシー １，０３３ ２，０６７，７８２ ９５９ ２，０８５，８８１ 標的なし ９０７ ２，０７４ ９０２ ２，０７１実施例２ ． 増幅に続いてのオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いるボレリア生物体の検出 少数のボレリア生物体の検出はハイブリダイゼーション
によるアッセイに先だってのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの
増幅により促進できる。この実験において、約３０，０
００生物体からの精製Ｂ．ブルグドルフェリＤＮＡが
Ｂ．ブルグドルフェリｒＲＮＡ配列と相補的または相同
なオリゴヌクレオチドで増幅された。一つの増幅オリゴ
ヌクレオチドは３’末端の配列ＩＤ番号：７および５’
末端のＴ７プロモーター配列配列ＩＤ番号：４３から合
成されたプロモーター−プライマーから成り（以後プロ
モーター−プライマーはその標的結合領域の配列ＩＤ番
号で同定されるであろう）、および第二のオリゴヌクレ
オチドは配列、配列ＩＤ番号：８または９のプライマー
から成っている。増幅混合物は５０ｍＭトリスＨＣｌ、
ｐＨ８．５、４０ｍＭ酢酸カリウム、６ｍＭ ＧＴＰ、
６ｍＭ ＡＴＰ，２．５ｍＭ ＵＴＰ、２．５ｍＭ Ｃ
ＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、１７．
５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ジチオスレイトール、
１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２ｍＭスペルミジン、
３０ピコモルのプロモーター−プライマー配列ＩＤ番
号：７および３０ピコモルのプロモーター−プライマー
配列ＩＤ番号：８または９を１００μｌの最終容量に含
んでいた。混合物は９５℃で８分加熱し、４２℃まで冷
却して９００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）および
４００単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを添加した。４
２℃で２時間インキュベーション後、増幅反応液の２０
μｌが非標識ヘルパー配列ＩＤ番号：３および５を持つ
配列ＩＤ番号：１のアクリジニウムエステル標識プロー
ブとのハイブリダイゼーションによりアッセイされた。
二回の反応の結果が報告されている。
ブを用いるボレリア生物体の検出 少数のボレリア生物体の検出はハイブリダイゼーション
によるアッセイに先だってのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの
増幅により促進できる。この実験において、約３０，０
００生物体からの精製Ｂ．ブルグドルフェリＤＮＡが
Ｂ．ブルグドルフェリｒＲＮＡ配列と相補的または相同
なオリゴヌクレオチドで増幅された。一つの増幅オリゴ
ヌクレオチドは３’末端の配列ＩＤ番号：７および５’
末端のＴ７プロモーター配列配列ＩＤ番号：４３から合
成されたプロモーター−プライマーから成り（以後プロ
モーター−プライマーはその標的結合領域の配列ＩＤ番
号で同定されるであろう）、および第二のオリゴヌクレ
オチドは配列、配列ＩＤ番号：８または９のプライマー
から成っている。増幅混合物は５０ｍＭトリスＨＣｌ、
ｐＨ８．５、４０ｍＭ酢酸カリウム、６ｍＭ ＧＴＰ、
６ｍＭ ＡＴＰ，２．５ｍＭ ＵＴＰ、２．５ｍＭ Ｃ
ＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、１７．
５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ジチオスレイトール、
１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２ｍＭスペルミジン、
３０ピコモルのプロモーター−プライマー配列ＩＤ番
号：７および３０ピコモルのプロモーター−プライマー
配列ＩＤ番号：８または９を１００μｌの最終容量に含
んでいた。混合物は９５℃で８分加熱し、４２℃まで冷
却して９００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）および
４００単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを添加した。４
２℃で２時間インキュベーション後、増幅反応液の２０
μｌが非標識ヘルパー配列ＩＤ番号：３および５を持つ
配列ＩＤ番号：１のアクリジニウムエステル標識プロー
ブとのハイブリダイゼーションによりアッセイされた。
二回の反応の結果が報告されている。
【０１８６】
【表２】表２ ボレリア ブルグドルフェリｒＤＮＡの増幅とプローブ配列番号：１によ る選択 プライマー配列番号： ７／８ ７／９ ＲＬＵ １２８，１４０ ８８８，５７９ ７２，３９７ ３８８，５１５ これらのデータは、ボレリアＲＮＡに相補的な配列ＩＤ
番号：１のプローブはｒＲＮＡ配列の直接的検出または
増幅生成物の検出に使用してもよいことを示している。
これらの結果は、配列ＩＤ番号：７（５’末端に配列Ｉ
Ｄ番号：４３を加えて）および配列ＩＤ番号：８かまた
は９を持つプライマーの組はＢ．ブルグドルフェリ核酸
を増幅できることを示している。配列ＩＤ番号：９がよ
り有効な負のセンスプライマーであることも明かであ
る。実施例３ １６Ｓ ｒＲＮＡ配列へハイブリダイズする
プライマーを用いるボレリア核酸の増幅 この実施例において、ボレリアからの核酸が１６Ｓリボ
ソームＲＮＡ配列に相補的または相同的なプライマーで
増幅された。Ｂ．ブルグドルフェリまたはＢ．ヘルムシ
ー細胞からの溶解物がＲＮＡの保存領域へ方向付けられ
たプローブによるハイブリダイゼーションにより定量さ
れた。ＲＮＡは希釈され、３０ピコモルの５’末端に配
列、配列ＩＤ番号：４３を持つ配列ＩＤ番号：８のプロ
モーター−プライマーおよび３０ピコモルのプライマー
配列ＩＤ番号：７を含む反応混合物へ加えられた。最終
反応条件は、１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、３
５ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴ
Ｐ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡ
ＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍ
Ｍ ジチオスレイトール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロー
ル、２ｍＭスペルミジンであった。混合物は９５℃で５
分加熱し、４２℃まで冷却して８００単位のＭＭＬＶ
ＲＴおよび４００単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを添
加した。４２℃で２時間インキュベーション後、反応液
の２０μｌが、１５ｍＭのアルドリチオール存在下、配
列、配列ＩＤ番号：２で合成されたプローブ、および配
列ＩＤ番号：４および６の非標識ヘルパープローブを用
いて実施例１に記載したようにハイブリダイゼーション
によりアッセイされた。結果はプライマーでのボレリア
ブルグドルフェリ核酸の増幅は成功し、少量のボレリ
アｒＲＮＡの検出を可能にした。大過剰のＢ．ヘルムシ
ー核酸存在下でさえも有意な交差反応は観察されなかっ
た。３回の反応の結果が報告されている。
番号：１のプローブはｒＲＮＡ配列の直接的検出または
増幅生成物の検出に使用してもよいことを示している。
これらの結果は、配列ＩＤ番号：７（５’末端に配列Ｉ
Ｄ番号：４３を加えて）および配列ＩＤ番号：８かまた
は９を持つプライマーの組はＢ．ブルグドルフェリ核酸
を増幅できることを示している。配列ＩＤ番号：９がよ
り有効な負のセンスプライマーであることも明かであ
る。実施例３ １６Ｓ ｒＲＮＡ配列へハイブリダイズする
プライマーを用いるボレリア核酸の増幅 この実施例において、ボレリアからの核酸が１６Ｓリボ
ソームＲＮＡ配列に相補的または相同的なプライマーで
増幅された。Ｂ．ブルグドルフェリまたはＢ．ヘルムシ
ー細胞からの溶解物がＲＮＡの保存領域へ方向付けられ
たプローブによるハイブリダイゼーションにより定量さ
れた。ＲＮＡは希釈され、３０ピコモルの５’末端に配
列、配列ＩＤ番号：４３を持つ配列ＩＤ番号：８のプロ
モーター−プライマーおよび３０ピコモルのプライマー
配列ＩＤ番号：７を含む反応混合物へ加えられた。最終
反応条件は、１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、３
５ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴ
Ｐ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡ
ＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、
０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍ
Ｍ ジチオスレイトール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロー
ル、２ｍＭスペルミジンであった。混合物は９５℃で５
分加熱し、４２℃まで冷却して８００単位のＭＭＬＶ
ＲＴおよび４００単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを添
加した。４２℃で２時間インキュベーション後、反応液
の２０μｌが、１５ｍＭのアルドリチオール存在下、配
列、配列ＩＤ番号：２で合成されたプローブ、および配
列ＩＤ番号：４および６の非標識ヘルパープローブを用
いて実施例１に記載したようにハイブリダイゼーション
によりアッセイされた。結果はプライマーでのボレリア
ブルグドルフェリ核酸の増幅は成功し、少量のボレリ
アｒＲＮＡの検出を可能にした。大過剰のＢ．ヘルムシ
ー核酸存在下でさえも有意な交差反応は観察されなかっ
た。３回の反応の結果が報告されている。
【０１８７】
【表３】表３ 配列番号：７／８プライマーによるボレリア ブルグドルフェリおよびボ レリア ヘルムシー 核酸の増幅およびプローブ配列番号：２による検出。 Ｂ．ブルグドルフェリｒＲＮＡ Ｂ．ヘルムシーｒＲＮＡ （０モル） （２ｘ１０-21モル） （３ｘ１０-9モル） ＲＬＵ １９４，４３４ ５４８ ５１４ ２１７，８２８ ６２６ ６１０ ３１９，６６２ ６４６実施例４ ハイブリダイゼーションアッセイプローブ番
号２および１０を用いるボレリアの増幅および検出 この実施例においては、増幅は実施例３のように実行さ
れるが、ただし配列ＩＤ番号：８のプロモーター−プラ
イマー（配列ＩＤ番号：４３の５’プロモーター配列を
持つ）および配列ＩＤ番号：１１のプライマーが使用さ
れ、および配列ＩＤ番号：１０のプローブが使用され
た。この実施例で使用されたアクリジニウムエステル標
識プローブおよび非標識ヘルパープローブは表に示され
ている。これらのデータは、これらのプライマーがＢ．
ブルグドルフェリおよびＢ．ヘルムシーｒＲＮＡ配列の
両方を増幅でき、プローブは開示されたアッセイシステ
ムで二つの生物体間を区別したことを示している。
号２および１０を用いるボレリアの増幅および検出 この実施例においては、増幅は実施例３のように実行さ
れるが、ただし配列ＩＤ番号：８のプロモーター−プラ
イマー（配列ＩＤ番号：４３の５’プロモーター配列を
持つ）および配列ＩＤ番号：１１のプライマーが使用さ
れ、および配列ＩＤ番号：１０のプローブが使用され
た。この実施例で使用されたアクリジニウムエステル標
識プローブおよび非標識ヘルパープローブは表に示され
ている。これらのデータは、これらのプライマーがＢ．
ブルグドルフェリおよびＢ．ヘルムシーｒＲＮＡ配列の
両方を増幅でき、プローブは開示されたアッセイシステ
ムで二つの生物体間を区別したことを示している。
【０１８８】
【表４】表４ ボレリア ブルグドルフェリおよびボレリア ヘルムシー核酸の増幅およ びプローブ配列番号：２および１０による検出。 プローブ 配列番号：２（ＲＬＵ） 配列番号：１０（ＲＬＵ）ヘルパー 配列番号：４および６ 配列番号：６ ２ｘ１０-20モル ８９９，５２１ １，９６３ Ｂ．ブルグドルフェリ ９１２，７０６ １，８００ ｒＲＮＡ ９１９，６８１ １，８０９ ３ｘ１０-18モル ２，７８３ １，３３５，１８３ Ｂ．ヘルムシー ２，３２２ １，３２８，２９０ ｒＲＮＡ ２，１２５ １，３６８，５８１ ０モルｒＲＮＡ １，６１９ １，１３７ １，５９６ １，３４７ １，３７３ １，１７４実施例５ ２３ＳリボソームＲＮＡへ方向付けられたプ
ローブを用いるボレリアの検出 Ｂ．ブルグドルフェリ の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列は報告さ
れている、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：
３０８２（１９９２）およびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１７４：３７６６−３７７４（１９９２）。ボレリア２
３Ｓ ｒＲＮＡ配列へ方向付けられた特異的プライマー
およびプローブを設計するため、密接に関連した生物体
の配列が必要とされた。ボレリア ヘルムシー、ボレリ
ア コリアセエおよび ボレリア トゥリカテをＢＳＫ
Ｈブロス（Ｓｉｇｍａ）中で数日増殖させ、ペレット
化し、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０に再懸濁し
た。ＤＮＡは溶解に続いてトリスＨＣｌ［ｐＨ８．０］
で平衡化したフェノール中に調製された。最終生成物は
エタノール沈澱により単離した。２３Ｓ ｒＤＮＡ配列
の５’および３’部分をポリメラーゼ連鎖反応およびＡ
ｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ）を用いて、ボレリア種の保存領域またはＢ．ブルグ
ドルフェリ特異的配列に方向付けられたプライマーで増
幅した。精製アンプリコンは35Ｓ−ｄＮＴＰ取り込みを
用い、Ｐｒｏｍｅｇａ（ｆｍｏｌキット）またはＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（サーカムベントキ
ット）からの市販品として入手可能なキットを使用して
配列決定した。得られた配列は報告されているボレリア
ブルグドルフェリ配列（Ｇｅｎ−Ｂａｎｋ寄託番号Ｍ
８８３３０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３
０：３０８２（１９９２）およびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１７４：３７６６−３７７４（１９９２））と比較
した。Ｂ．ブルグドルフェリがＢ．ヘルムシーおよび
Ｂ．トゥリカテから変異している特異的配列が２３Ｓプ
ローブ設計のために選ばれた。この領域は大腸菌の塩基
１４７８−１５００に対応し、Ｂ．ヘルムシーおよび
Ｂ．トゥリカテはこの領域に同一のヌクレオチド配列を
持っていたが、Ｂ．ブルグドルフェリでは４塩基変化し
ていた。一つのプローブがＢ．ブルグドルフェリに設計
され、第二のプローブはＢ．ヘルムシーおよびＢ．トゥ
リカテに設計された（配列ＩＤ番号：２２）。ｒＲＮＡ
配列は以下に示されている：
ローブを用いるボレリアの検出 Ｂ．ブルグドルフェリ の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列は報告さ
れている、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：
３０８２（１９９２）およびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１７４：３７６６−３７７４（１９９２）。ボレリア２
３Ｓ ｒＲＮＡ配列へ方向付けられた特異的プライマー
およびプローブを設計するため、密接に関連した生物体
の配列が必要とされた。ボレリア ヘルムシー、ボレリ
ア コリアセエおよび ボレリア トゥリカテをＢＳＫ
Ｈブロス（Ｓｉｇｍａ）中で数日増殖させ、ペレット
化し、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０に再懸濁し
た。ＤＮＡは溶解に続いてトリスＨＣｌ［ｐＨ８．０］
で平衡化したフェノール中に調製された。最終生成物は
エタノール沈澱により単離した。２３Ｓ ｒＤＮＡ配列
の５’および３’部分をポリメラーゼ連鎖反応およびＡ
ｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ）を用いて、ボレリア種の保存領域またはＢ．ブルグ
ドルフェリ特異的配列に方向付けられたプライマーで増
幅した。精製アンプリコンは35Ｓ−ｄＮＴＰ取り込みを
用い、Ｐｒｏｍｅｇａ（ｆｍｏｌキット）またはＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（サーカムベントキ
ット）からの市販品として入手可能なキットを使用して
配列決定した。得られた配列は報告されているボレリア
ブルグドルフェリ配列（Ｇｅｎ−Ｂａｎｋ寄託番号Ｍ
８８３３０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３
０：３０８２（１９９２）およびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１７４：３７６６−３７７４（１９９２））と比較
した。Ｂ．ブルグドルフェリがＢ．ヘルムシーおよび
Ｂ．トゥリカテから変異している特異的配列が２３Ｓプ
ローブ設計のために選ばれた。この領域は大腸菌の塩基
１４７８−１５００に対応し、Ｂ．ヘルムシーおよび
Ｂ．トゥリカテはこの領域に同一のヌクレオチド配列を
持っていたが、Ｂ．ブルグドルフェリでは４塩基変化し
ていた。一つのプローブがＢ．ブルグドルフェリに設計
され、第二のプローブはＢ．ヘルムシーおよびＢ．トゥ
リカテに設計された（配列ＩＤ番号：２２）。ｒＲＮＡ
配列は以下に示されている：
【０１８９】
【化２】 大腸菌 GGC---UGGUUUUCCAGGCAAAUCCG .. .. ... ....... Ｂｂｕ GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG （配列番号：２５） .... .... .. ............ ｂＨＥ GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG （配列番号：３１） 増幅効率およびプローブ特異性を示すため、以下の実験
が実施された。７ｍｌの培養物を０．７５ｍｌの１０ｍ
Ｍ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、２ｍＭＥＤＴＡ、
４０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８を含む０．７５ｍｌの溶
液を再懸濁し、６０℃で５分間加熱することにより細胞
溶解物をＢ．ブルグドルフェリ株Ｎ４０およびＢ．トゥ
リカテの培養物から調製した。各々の試料中の核酸の量
を定量するため、実施例１に記載したように異なった量
の試料およびボレリア２３ＳｒＲＮＡの保存領域に方向
付けられたプローブとハイブリダイゼーションを実施し
た。得られた値は既知の標品の結果と比較した。
が実施された。７ｍｌの培養物を０．７５ｍｌの１０ｍ
Ｍ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、２ｍＭＥＤＴＡ、
４０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８を含む０．７５ｍｌの溶
液を再懸濁し、６０℃で５分間加熱することにより細胞
溶解物をＢ．ブルグドルフェリ株Ｎ４０およびＢ．トゥ
リカテの培養物から調製した。各々の試料中の核酸の量
を定量するため、実施例１に記載したように異なった量
の試料およびボレリア２３ＳｒＲＮＡの保存領域に方向
付けられたプローブとハイブリダイゼーションを実施し
た。得られた値は既知の標品の結果と比較した。
【０１９０】Ｂ．ブルグドルフェリまたはＢ．トゥリカ
テ溶解物中の既知量の核酸を、３０ピコモルの５’プロ
モーター配列（配列ＩＤ番号：４３）および配列ＩＤ番
号：１９かまたは配列ＩＤ番号：２０の３’標的ハイブ
リダイゼーション領域で合成したプロモーター−プライ
マーおよび配列ＩＤ番号：１８を持つプライマーを含む
１００μｌの反応液で増幅した。溶解物は適当な濃度に
水で希釈し、プライマーおよびプロモーター−プライマ
ーを含む溶液に加え、９５℃で１５分加熱した。モロニ
ーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）
９００単位および４００単位のＴ７ ＲＮＡポリメラー
ゼを加えた。最終増幅混合物は５０ｍＭトリスＨＣｌ、
ｐＨ８．５、３５ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、
４ｍＭＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍ
Ｍ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１．２ｍＭ ｄＣＴ
Ｐ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍ
Ｍ Ｎ−アセチルーＬ−システイン、５％グリセロール
を含んでいる。４２℃で２時間インキュベーション後、
全１００μｌの増幅反応液を配列ＩＤ番号：２１のアク
リジニウムエステル標識プローブによるハイブリダイゼ
ーションでアッセイした。 ハイブリダイゼーションは
０．０５Ｍコハク酸リチウム ｐＨ５、０．６Ｍ Ｌｉ
Ｃｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ ＥＧＴＡを含む２００μ
ｌの溶液中、６０℃で１０分間で実施し、続いて３００
μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％
トリトンRＸ−１００を加えた。この混合物は６０℃で
１５分間インキュベートし、室温まで冷却した。各々の
チューブの残存化学発光を、１ｍＭ硝酸および０．１％
過酸化水素の自動注入、続いて１Ｎの水酸化ナトリウム
を注入装置を備えた続いてＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡ
ＤＥＲＲ Ｉルミノメータでアッセイした。結果はＲＬ
Ｕで示されている。
テ溶解物中の既知量の核酸を、３０ピコモルの５’プロ
モーター配列（配列ＩＤ番号：４３）および配列ＩＤ番
号：１９かまたは配列ＩＤ番号：２０の３’標的ハイブ
リダイゼーション領域で合成したプロモーター−プライ
マーおよび配列ＩＤ番号：１８を持つプライマーを含む
１００μｌの反応液で増幅した。溶解物は適当な濃度に
水で希釈し、プライマーおよびプロモーター−プライマ
ーを含む溶液に加え、９５℃で１５分加熱した。モロニ
ーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）
９００単位および４００単位のＴ７ ＲＮＡポリメラー
ゼを加えた。最終増幅混合物は５０ｍＭトリスＨＣｌ、
ｐＨ８．５、３５ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、
４ｍＭＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍ
Ｍ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１．２ｍＭ ｄＣＴ
Ｐ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍ
Ｍ Ｎ−アセチルーＬ−システイン、５％グリセロール
を含んでいる。４２℃で２時間インキュベーション後、
全１００μｌの増幅反応液を配列ＩＤ番号：２１のアク
リジニウムエステル標識プローブによるハイブリダイゼ
ーションでアッセイした。 ハイブリダイゼーションは
０．０５Ｍコハク酸リチウム ｐＨ５、０．６Ｍ Ｌｉ
Ｃｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ ＥＧＴＡを含む２００μ
ｌの溶液中、６０℃で１０分間で実施し、続いて３００
μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％
トリトンRＸ−１００を加えた。この混合物は６０℃で
１５分間インキュベートし、室温まで冷却した。各々の
チューブの残存化学発光を、１ｍＭ硝酸および０．１％
過酸化水素の自動注入、続いて１Ｎの水酸化ナトリウム
を注入装置を備えた続いてＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡ
ＤＥＲＲ Ｉルミノメータでアッセイした。結果はＲＬ
Ｕで示されている。
【０１９１】
【表５】表５ 配列ＩＤ番号：１９および１８または２０および１８を含む増幅オリゴヌ クレオチドによるボレリア ブルグドルフェリの増幅および続いての配列番号： ２１を含むプローブによる検出 標的 プライマー プライマー 配列番号： 配列番号： １８／１９ １８／２０ ３ｘ１０-20モル ３３，３６６ ２１１，８６７ B.ブルグドルフェリrRNA ６ｘ１０-21モル １５，１１５ ５７，０２９ B.ブルグドルフェリrRNA ３ｘ１０-20モル ３，６７６ ２，２６０ B.トゥリカテrRNA ３ｘ１０-21モル ２，２１５ ２，２９７ B.トゥリカテrRNA ０モル rRNA ２，４０８ ２，３２４ 別の実験において、配列、配列ＩＤ番号：１９を持つオ
リゴヌクレオチドがプライマーとして使用された。配列
ＩＤ番号：１８および１９および配列ＩＤ番号：２３お
よび１９を持つプライマーはＢ．ブルグドルフェリ株Ｂ
２１およびＢＮ４０両方のｒＲＮＡ配列を増幅すること
が示された（データは示されていない）。実施例６ ２３Ｓ ｒＲＮＡへ方向付けられたハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブを用いるボレリア ヘ
ルムシーの特異的検出 この実施例においては、Ｂ．ヘルムシーに対するプロー
ブの特異性が示される。Ｂ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ヘ
ルムシーおよびＢ．トゥリカテは２３Ｓ ｒＲＮＡ核酸
配列レベルで非常に密接に関係している。Ｂ．ブルグド
ルフェリ２３ＳｒＲＮＡプローブのように、２３Ｓ ｒ
ＲＮＡの同一の領域でＢ．ヘルムシーおよびＢ．トゥリ
カテの両方を検出するようにプローブが設計された。
Ｂ．ブルグドルフェリまたはＢ．ヘルムシー／Ｂ．トゥ
リカテ配列の両方を含む二つの合成標的が合成され、各
々の標的がハイブリダイゼーションが５５℃で１５分実
施されることを除いて前記の条件下で配列ＩＤ番号：２
２のプローブとハイブリダイズさせた。０．１５Ｍ四ホ
ウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％トリトンＲＸ−１００
を含む３００μｌの溶液を加えた後、反応液は５５℃で
５分インキュベートされた。試料は上記のようにルミノ
メーターで読みとられた。結果は、本プローブはＢ．ブ
ルグドルフェリ配列からＢ．ヘルムシー配列を区別でき
ることを示している。
リゴヌクレオチドがプライマーとして使用された。配列
ＩＤ番号：１８および１９および配列ＩＤ番号：２３お
よび１９を持つプライマーはＢ．ブルグドルフェリ株Ｂ
２１およびＢＮ４０両方のｒＲＮＡ配列を増幅すること
が示された（データは示されていない）。実施例６ ２３Ｓ ｒＲＮＡへ方向付けられたハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブを用いるボレリア ヘ
ルムシーの特異的検出 この実施例においては、Ｂ．ヘルムシーに対するプロー
ブの特異性が示される。Ｂ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ヘ
ルムシーおよびＢ．トゥリカテは２３Ｓ ｒＲＮＡ核酸
配列レベルで非常に密接に関係している。Ｂ．ブルグド
ルフェリ２３ＳｒＲＮＡプローブのように、２３Ｓ ｒ
ＲＮＡの同一の領域でＢ．ヘルムシーおよびＢ．トゥリ
カテの両方を検出するようにプローブが設計された。
Ｂ．ブルグドルフェリまたはＢ．ヘルムシー／Ｂ．トゥ
リカテ配列の両方を含む二つの合成標的が合成され、各
々の標的がハイブリダイゼーションが５５℃で１５分実
施されることを除いて前記の条件下で配列ＩＤ番号：２
２のプローブとハイブリダイズさせた。０．１５Ｍ四ホ
ウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％トリトンＲＸ−１００
を含む３００μｌの溶液を加えた後、反応液は５５℃で
５分インキュベートされた。試料は上記のようにルミノ
メーターで読みとられた。結果は、本プローブはＢ．ブ
ルグドルフェリ配列からＢ．ヘルムシー配列を区別でき
ることを示している。
【０１９２】
【表６】表６ Ｂ．ヘルムシー／Ｂ．トゥリカテプローブとＢ．ヘルムシーおよびＢ．ブ ルグドルフェリ 合成ＤＮＡ標的のハイブリダイゼーション 標的配列 合成ＤＮＡ標的の量 プローブ配列番号： ２２でのＲＬＵ Ｂ．ヘルムシー １０-11モル ８９０，６０９ Ｂ．ヘルムシー １０-12モル ８５２，４１９ Ｂ．ヘルムシー １０-13モル ８８５，９７９ Ｂ．ヘルムシー １０-14モル ５１１，４１９ Ｂ．ブルグドルフェリ １０-11モル ２，６８４ Ｂ．ブルグドルフェリ １０-12モル １．９１１ Ｂ．ブルグドルフェリ １０-13モル ８０８実施例７ ２３Ｓ ｒＲＮＡハイブリダイゼーションア
ッセイプローブを用いるボレリアの増幅および検出 次に、Ｂ．トゥリカテ核酸の増幅および検出が示され
る。Ｂ．トゥリカテ細胞溶解物は３０ピコモルの配列、
配列ＩＤ番号：１８から合成されたプライマーおよび３
０ピコモルの５’配列、配列ＩＤ番号：４３および３’
標的ハイブリダイゼーション領域配列ＩＤ番号：１９を
持つプロモーター−プライマーで増幅された。全増幅反
応液は２．５ピコモルの非標識ヘルパープローブ配列Ｉ
Ｄ番号：２３の存在下、配列ＩＤ番号：２２のプローブ
を用い、５５℃で１５分ハイブリダイズされ、０．１５
Ｍ四ホウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％トリトンＲＸ−
１００を加え、ルミノメーターで読みとられた。Ｂ．ヘ
ルムシーと同一の信号が予期され、なぜなら、２３Ｓ
ｒＲＮＡのこの領域は二つの生物体の配列が同一である
からである。
ッセイプローブを用いるボレリアの増幅および検出 次に、Ｂ．トゥリカテ核酸の増幅および検出が示され
る。Ｂ．トゥリカテ細胞溶解物は３０ピコモルの配列、
配列ＩＤ番号：１８から合成されたプライマーおよび３
０ピコモルの５’配列、配列ＩＤ番号：４３および３’
標的ハイブリダイゼーション領域配列ＩＤ番号：１９を
持つプロモーター−プライマーで増幅された。全増幅反
応液は２．５ピコモルの非標識ヘルパープローブ配列Ｉ
Ｄ番号：２３の存在下、配列ＩＤ番号：２２のプローブ
を用い、５５℃で１５分ハイブリダイズされ、０．１５
Ｍ四ホウ酸ナトリウムｐＨ８．５、１％トリトンＲＸ−
１００を加え、ルミノメーターで読みとられた。Ｂ．ヘ
ルムシーと同一の信号が予期され、なぜなら、２３Ｓ
ｒＲＮＡのこの領域は二つの生物体の配列が同一である
からである。
【０１９３】
【表７】表７ Ｂ．トゥリカテｒＲＮＡ配列の増幅 標的 ｒＲＮＡ標的量 プローブ配列ＩＤ番号： ２２でのＲＬＵ Ｂ．トゥリカテ １．２ｘ１０-19モル ２４０，６０７ Ｂ．トゥリカテ ６ｘ１０-20モル １３３、８１２ Ｂ．トゥリカテ ３ｘ１０-20モル ２０、３４５ Ｂ．トゥリカテ ６ｘ１０-21モル １４，９６８ 標的なし ０モル ７５１実施例８ 血液中に観察される微生物存在下でのボレリ
アの特異的増幅および特異的検出 プライマー配列ＩＤ番号：１８および３’末端に配列Ｉ
Ｄ番号：２０を持つプロモーター−プライマーが血液単
離物に観察されることが予期される一団の生物体から調
製される細胞溶解物の増幅に使用された。各々の細胞溶
解物から少なくとも３ｘ１０−１９モルのｒＲＮＡがヌ
クレオチド配列配列ＩＤ番号：２１（表８）または配列
ＩＤ番号：２２（データは示されていない）で合成され
たプローブで試験された。両方のプローブとも非ボレリ
ア種との交差反応は観察されなかった。配列ＩＤ番号：
２２のプローブはＢ．トゥリカテ培養物で強い信号を与
え（＞２，０００，０００ＲＬＵ）、Ｂ．トゥリカテ細
胞の存在が確認された。配列ＩＤ番号：２１による検出
の結果は下記の表に示されている。
アの特異的増幅および特異的検出 プライマー配列ＩＤ番号：１８および３’末端に配列Ｉ
Ｄ番号：２０を持つプロモーター−プライマーが血液単
離物に観察されることが予期される一団の生物体から調
製される細胞溶解物の増幅に使用された。各々の細胞溶
解物から少なくとも３ｘ１０−１９モルのｒＲＮＡがヌ
クレオチド配列配列ＩＤ番号：２１（表８）または配列
ＩＤ番号：２２（データは示されていない）で合成され
たプローブで試験された。両方のプローブとも非ボレリ
ア種との交差反応は観察されなかった。配列ＩＤ番号：
２２のプローブはＢ．トゥリカテ培養物で強い信号を与
え（＞２，０００，０００ＲＬＵ）、Ｂ．トゥリカテ細
胞の存在が確認された。配列ＩＤ番号：２１による検出
の結果は下記の表に示されている。
【０１９４】
【表８】表８ 血液標本に単離される一連の微生物の増幅 ＲＬＵ プローブ 配列ＩＤ番号：２１ 生物体 ＡＴＣＣ番号 バクテロイデス フラギリス ２３７４５ ３，４０６ ３，５２５Ｂ．ブルグドルフェリ １，５２９，０４０ １，３３５，８９７Ｂ．トゥリカテ ３５２０９ ３，５７３ ３，５２４Ｂ．コリアセエ ４３３８１ ３，４５７ ４，１００ 大腸菌 ２５９２２ ５，０９１ ４，５０４ヘモフィラス インフルエンザエ １９４１８ ４，７３７ ３，５３１クレブシエラ ニューモニエ ２３３５７ ４，５１０ ３，８５３プロテウス ミラビリス ２５９３３ ３，８９３ ４，１７０シュードモナス アエルギノサ ２５３３０ ４，２８１ ４，３３５スタフィロコッカス オーレウス ２５９２３ ３，０８８ ３，６４６スタフィロコッカス エピデルミス １２２２８ ４，７２２ ３，１４１ストレプトミセス ミチス ９８１１ ３，０５９ ３，１７１ストレプトコッカス ニューモニ エ ６３０６ ３，０８１ ３，０３８ 上記のデータは本明細書で開示および請求された新規増
幅オリゴヌクレオチドおよびプローブはボレリアｒＲＮ
Ａ配列を増幅できおよびライム病関連ボレリア（ボレリ
ア ブルグドルフェリ）を他の細菌およびボレリア属の
他の構成菌から区別できることが確認された。実施例９ １６Ｓリボソームプローブを用いるボレリア
の増幅および特異的検出 １６Ｓリボソーム核酸に特異的なハイブリダイゼーショ
ンアッセイプローブ配列ＩＤ番号：１がボレリア存在を
検出するため、およびこのハイブリダイゼーションアッ
セイプローブが血液中に普通に観察される他の生物体と
交差反応しないことを決定するために使用された。ハイ
ブリダイゼーションプローブは細胞溶解物中で、ヘルパ
ーオリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：３および５の存在
下、ボレリア核酸にハイブリダイズされた。アッセイは
上記実施例１に記載されたように直接ハイブリダイゼー
ションフォーマットを用いて実施された。各々の試料中
のリボソームｒＲＮＡの存在は試料を全細菌プローブお
よびヘルパーオリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：５８、
５９、６０および６１、または真菌プローブおよびヘル
パープローブ配列ＩＤ番号：６２および６３とハイブリ
ダイズすることにより確認された。このアッセイでは、
３０，０００相対的光ユニット（ＲＬＵ）より大きな値
は陽性と考えられる。このアッセイの結果は下記表９に
示されている。
幅オリゴヌクレオチドおよびプローブはボレリアｒＲＮ
Ａ配列を増幅できおよびライム病関連ボレリア（ボレリ
ア ブルグドルフェリ）を他の細菌およびボレリア属の
他の構成菌から区別できることが確認された。実施例９ １６Ｓリボソームプローブを用いるボレリア
の増幅および特異的検出 １６Ｓリボソーム核酸に特異的なハイブリダイゼーショ
ンアッセイプローブ配列ＩＤ番号：１がボレリア存在を
検出するため、およびこのハイブリダイゼーションアッ
セイプローブが血液中に普通に観察される他の生物体と
交差反応しないことを決定するために使用された。ハイ
ブリダイゼーションプローブは細胞溶解物中で、ヘルパ
ーオリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：３および５の存在
下、ボレリア核酸にハイブリダイズされた。アッセイは
上記実施例１に記載されたように直接ハイブリダイゼー
ションフォーマットを用いて実施された。各々の試料中
のリボソームｒＲＮＡの存在は試料を全細菌プローブお
よびヘルパーオリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：５８、
５９、６０および６１、または真菌プローブおよびヘル
パープローブ配列ＩＤ番号：６２および６３とハイブリ
ダイズすることにより確認された。このアッセイでは、
３０，０００相対的光ユニット（ＲＬＵ）より大きな値
は陽性と考えられる。このアッセイの結果は下記表９に
示されている。
【０１９５】
【表９】
【０１９６】実施例１０ 三つの異なった系統発生学的
群からのライム病関連ボレリアの増幅および検出 報告されている配列は異なったライム病関連ボレリア間
のプローブ配列ＩＤ番号：２により標的とされる部位に
ｒＲＮＡ配列の保存が示されている。以下のデータは本
発明のプライマーおよびプローブが、ライム病に関連し
たボレリアの三つの系統発生学的グループ化を示す一つ
以上の地理的場所からの単離物の増幅および検出に有用
であることを示している。溶解物はＢ．ブルグドルフェ
リ株Ｎ４０（グループＩ）、Ｂ．ガリニー株ＩＰ−９０
（ロシア単離物）および株０１４Ａ（ＮＢＳ１６）（グ
ループＩＩ）およびＢ．アフゼリー株ＩＰ−３（ロシア
単離物）および株０９Ａ（ＡＣＡ１、スエーデン単離
物）からの培養物から、約１５ｍｌの培養液からの細胞
を３０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１ｍＭＥＤ
ＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび３％（ｗ／ｖ）ラウリル
硫酸リチウムを含む０．１ｍｌの溶液に再懸濁すること
により調製される。各々の溶解物中の核酸量を定量する
ため、異なった量の溶解物および２３Ｓ ｒＲＮＡ保存
領域に方向付けられたプローブでハイブリダイゼーショ
ンを実施した。得られた値は既知の標品の結果と比較さ
れた。既知の量のＢ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニー
およびＢ．アフゼリー溶解物（約＝３ｘ１０−１９モル
のＲＮＡ）は、配列ＩＤ番号：８の３’標的ハイブリダ
イズ領域（Ｂ．ブルグドルフェリ１６Ｓ ｒＲＮＡと相
補的）の５０ピコモルのプライマー、および配列ＩＤ番
号：１１のｒＲＮＡとして同じセンスのプライマー、お
よび５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８、２５ｍＭＫＣｌ，
２ｍＭ ＭｇＣｌ２，２．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑポリ
メラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含むポリメラ
ーゼ連鎖反応により増幅された。反応液は９５℃で２分
間加熱し、次に５５℃１分、７２℃１分、９５℃０．５
分のサイクルを３５回行い、続いてアッセイまでに４℃
に冷却する。アガロースゲル電気泳動は、三つすべての
系統発生学的群からの核酸はエチジウムブロミド染色に
より検出可能な１７５塩基対断片を産生した。Ｂ．アフ
ゼリー株０９Ａ核酸を含む試料の配列ＩＤ番号：２アク
リジニウムエステル標識プローブへの５６℃でのハイブ
リダイゼーションはこのプローブでの陽性信号を明らか
にした（バックグラウンドの少なくとも１９倍）。Ｂ．
ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニー株ＩＰ−９０または株
０１４ＡまたはＢ．アフゼリー株ＩＰ−３核酸は６０℃
でハイブリダイズさせた場合、少なくともバックグラウ
ンドの１７８倍の信号を与えた。Ｂ．アフゼリー０９８
株は他の単離物よりも低いハイブリダイゼーション信号
を与えたが、しかし、バックグラウンドを制して明らか
に検出された。実施例１１ ５６℃でのライム病関連ボレリアの特異的
増幅および検出 この実施例では、配列、配列ＩＤ番号：８から合成され
た３０ピコモルのプロモーター−プライマーおよび配列
ＩＤ番号：１１のプライマーを含む１００μｌの反応液
が使用された。溶解物は水で適した濃度に希釈され、プ
ロモータープライマーを含む溶液に加えられ、９５℃で
１５分加熱し、５分で４２℃まで冷却した。モロニーマ
ウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）９０
０単位、および４００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを
加えた。最終増幅混合物は５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ
８．５、３５ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍ
ＭＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ
ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１．２ｍＭ ｄＣＴＰ、
１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ
Ｎ−アセチルーＬ−システイン、５％グリセロールを含
んでいる。４２℃で２時間インキュベーション後、全１
００μｌの増幅反応液を配列ＩＤ番号：２のアクリジニ
ウムエステル標識プローブおよび非標識ヘルパープロー
ブ配列ＩＤ番号：４および６または配列ＩＤ番号：１０
と非標識ヘルパー配列ＩＤ番号：４および６によるハイ
ブリダイゼーションでアッセイした。 ハイブリダイゼ
ーションは０．０５Ｍコハク酸リチウム ｐＨ５、０．
６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウ
ム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ ＥＧＴＡを
含む２００μｌの溶液中、５６℃で１５分間で実施し、
続いて３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウムｐＨ
８．５、１％トリトンＲＸ−１００を加えた。この混合
物は５６℃で１５分間インキュベートし、室温まで冷却
した。各々のチューブの残存化学発光を、１ｍＭ硝酸お
よび０．１％過酸化水素の自動注入、続いて１Ｎの水酸
化ナトリウムを注入装置を備えた続いてＧｅｎ−Ｐｒｏ
ｂｅ ＬＥＡＤＥＲＲ Ｉルミノメータでアッセイし
た。結果はＲＬＵで示されている。
群からのライム病関連ボレリアの増幅および検出 報告されている配列は異なったライム病関連ボレリア間
のプローブ配列ＩＤ番号：２により標的とされる部位に
ｒＲＮＡ配列の保存が示されている。以下のデータは本
発明のプライマーおよびプローブが、ライム病に関連し
たボレリアの三つの系統発生学的グループ化を示す一つ
以上の地理的場所からの単離物の増幅および検出に有用
であることを示している。溶解物はＢ．ブルグドルフェ
リ株Ｎ４０（グループＩ）、Ｂ．ガリニー株ＩＰ−９０
（ロシア単離物）および株０１４Ａ（ＮＢＳ１６）（グ
ループＩＩ）およびＢ．アフゼリー株ＩＰ−３（ロシア
単離物）および株０９Ａ（ＡＣＡ１、スエーデン単離
物）からの培養物から、約１５ｍｌの培養液からの細胞
を３０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１ｍＭＥＤ
ＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび３％（ｗ／ｖ）ラウリル
硫酸リチウムを含む０．１ｍｌの溶液に再懸濁すること
により調製される。各々の溶解物中の核酸量を定量する
ため、異なった量の溶解物および２３Ｓ ｒＲＮＡ保存
領域に方向付けられたプローブでハイブリダイゼーショ
ンを実施した。得られた値は既知の標品の結果と比較さ
れた。既知の量のＢ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニー
およびＢ．アフゼリー溶解物（約＝３ｘ１０−１９モル
のＲＮＡ）は、配列ＩＤ番号：８の３’標的ハイブリダ
イズ領域（Ｂ．ブルグドルフェリ１６Ｓ ｒＲＮＡと相
補的）の５０ピコモルのプライマー、および配列ＩＤ番
号：１１のｒＲＮＡとして同じセンスのプライマー、お
よび５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８、２５ｍＭＫＣｌ，
２ｍＭ ＭｇＣｌ２，２．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑポリ
メラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含むポリメラ
ーゼ連鎖反応により増幅された。反応液は９５℃で２分
間加熱し、次に５５℃１分、７２℃１分、９５℃０．５
分のサイクルを３５回行い、続いてアッセイまでに４℃
に冷却する。アガロースゲル電気泳動は、三つすべての
系統発生学的群からの核酸はエチジウムブロミド染色に
より検出可能な１７５塩基対断片を産生した。Ｂ．アフ
ゼリー株０９Ａ核酸を含む試料の配列ＩＤ番号：２アク
リジニウムエステル標識プローブへの５６℃でのハイブ
リダイゼーションはこのプローブでの陽性信号を明らか
にした（バックグラウンドの少なくとも１９倍）。Ｂ．
ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニー株ＩＰ−９０または株
０１４ＡまたはＢ．アフゼリー株ＩＰ−３核酸は６０℃
でハイブリダイズさせた場合、少なくともバックグラウ
ンドの１７８倍の信号を与えた。Ｂ．アフゼリー０９８
株は他の単離物よりも低いハイブリダイゼーション信号
を与えたが、しかし、バックグラウンドを制して明らか
に検出された。実施例１１ ５６℃でのライム病関連ボレリアの特異的
増幅および検出 この実施例では、配列、配列ＩＤ番号：８から合成され
た３０ピコモルのプロモーター−プライマーおよび配列
ＩＤ番号：１１のプライマーを含む１００μｌの反応液
が使用された。溶解物は水で適した濃度に希釈され、プ
ロモータープライマーを含む溶液に加えられ、９５℃で
１５分加熱し、５分で４２℃まで冷却した。モロニーマ
ウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴ）９０
０単位、および４００単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを
加えた。最終増幅混合物は５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ
８．５、３５ｍＭ塩化カリウム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍ
ＭＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ
ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１．２ｍＭ ｄＣＴＰ、
１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ
Ｎ−アセチルーＬ−システイン、５％グリセロールを含
んでいる。４２℃で２時間インキュベーション後、全１
００μｌの増幅反応液を配列ＩＤ番号：２のアクリジニ
ウムエステル標識プローブおよび非標識ヘルパープロー
ブ配列ＩＤ番号：４および６または配列ＩＤ番号：１０
と非標識ヘルパー配列ＩＤ番号：４および６によるハイ
ブリダイゼーションでアッセイした。 ハイブリダイゼ
ーションは０．０５Ｍコハク酸リチウム ｐＨ５、０．
６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウ
ム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ ＥＧＴＡを
含む２００μｌの溶液中、５６℃で１５分間で実施し、
続いて３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナトリウムｐＨ
８．５、１％トリトンＲＸ−１００を加えた。この混合
物は５６℃で１５分間インキュベートし、室温まで冷却
した。各々のチューブの残存化学発光を、１ｍＭ硝酸お
よび０．１％過酸化水素の自動注入、続いて１Ｎの水酸
化ナトリウムを注入装置を備えた続いてＧｅｎ−Ｐｒｏ
ｂｅ ＬＥＡＤＥＲＲ Ｉルミノメータでアッセイし
た。結果はＲＬＵで示されている。
【０１９７】これらのデータは温度５６℃でのプローブ
配列ＩＤ番号：２のハイブリダイゼーションでもＢ．ブ
ルグドルフェリおよびＢ．ヘルムシー間の明瞭な区別が
可能であることを示している。
配列ＩＤ番号：２のハイブリダイゼーションでもＢ．ブ
ルグドルフェリおよびＢ．ヘルムシー間の明瞭な区別が
可能であることを示している。
【０１９８】
【表１０】
【０１９９】実施例１２ プロモーター配列を含む増幅
プライマーを用いるボレリア核酸の増幅 プライマーなしでプロモーター−プライマーのみを用い
る方式で増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブを使用
してもよい。この方式はＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２２
４６１号に記載されている。二つのプロモータープライ
マーが合成され、各々が５’末端で標的相補的配列（配
列ＩＤ番号：８）の３’末端に共有結合で結合されたＴ
７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、配列ＩＤ番
号：４３、５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’を含んでいる。一つのプロ
モータープライマーは遊離の３’ＯＨ基を持つように合
成され、１００μｌ反応液当たり４ピコモルで使用され
た。第二のプロモータープライマーは３’末端にアルカ
ンジオールを持つように合成され、１００μｌ反応液当
たり２６ピコモルで使用された。ボレリア溶解物は水で
適した濃度に希釈され、プロモータープライマーを含む
溶液に加えられ、９５℃で５分加熱し、１５分で４２℃
まで冷却した。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵
素（ＭＭＬＶＲＴ）９００単位、および４００単位のＴ
７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。最終増幅混合物は５０
ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、３５ｍＭ塩化カリウ
ム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴ
Ｐ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴ
ＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ
ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ
ｄＴＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０
ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｎ−アセチルーＬ−シス
テイン、５％グリセロールを含んでいる。４２℃で３．
５時間インキュベーション後、３０μｌの増幅反応液を
配列ＩＤ番号：２のアクリジニウムエステル標識プロー
ブおよび非標識ヘルパープローブ配列ＩＤ番号：４およ
び６によるハイブリダイゼーションでアッセイした。
ハイブリダイゼーションは０．０５Ｍコハク酸リチウム
ｐＨ５、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリ
ル硫酸リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ
ＥＧＴＡを含む２００μｌの溶液中、６０℃で１５分
間で実施し、続いて３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナ
トリウムｐＨ８．５、１％トリトンＲＸ−１００を加え
た。この混合物は６０℃で１５分間インキュベートし、
室温まで冷却した。各々のチューブの残存化学発光を、
Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲＲ Ｉルミノメータ
でアッセイした。表には同一条件下、同一のプロモータ
ー配列、配列ＩＤ番号：４３、５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴ
ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’および
３’標的相補的領域配列ＩＤ番号：９を含んでいるプロ
モーター−プライマー対を用いて得られたデータも示さ
れている。１００μｌ当たり遊離３’ＯＨを持つ４ピコ
モルのプロモーター−プライマーおよび３’アルカンジ
オール基を持つように合成された２６ピコモルの同じプ
ロモータープライマーが使用された。
プライマーを用いるボレリア核酸の増幅 プライマーなしでプロモーター−プライマーのみを用い
る方式で増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブを使用
してもよい。この方式はＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２２
４６１号に記載されている。二つのプロモータープライ
マーが合成され、各々が５’末端で標的相補的配列（配
列ＩＤ番号：８）の３’末端に共有結合で結合されたＴ
７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、配列ＩＤ番
号：４３、５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’を含んでいる。一つのプロ
モータープライマーは遊離の３’ＯＨ基を持つように合
成され、１００μｌ反応液当たり４ピコモルで使用され
た。第二のプロモータープライマーは３’末端にアルカ
ンジオールを持つように合成され、１００μｌ反応液当
たり２６ピコモルで使用された。ボレリア溶解物は水で
適した濃度に希釈され、プロモータープライマーを含む
溶液に加えられ、９５℃で５分加熱し、１５分で４２℃
まで冷却した。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵
素（ＭＭＬＶＲＴ）９００単位、および４００単位のＴ
７ＲＮＡポリメラーゼを加えた。最終増幅混合物は５０
ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、３５ｍＭ塩化カリウ
ム、４ｍＭ ＧＴＰ、４ｍＭ ＡＴＰ、４ｍＭ ＵＴ
Ｐ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴ
ＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０ｍＭ
ＵＴＰ、４ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ
ｄＴＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＧＴＰ、２０
ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｎ−アセチルーＬ−シス
テイン、５％グリセロールを含んでいる。４２℃で３．
５時間インキュベーション後、３０μｌの増幅反応液を
配列ＩＤ番号：２のアクリジニウムエステル標識プロー
ブおよび非標識ヘルパープローブ配列ＩＤ番号：４およ
び６によるハイブリダイゼーションでアッセイした。
ハイブリダイゼーションは０．０５Ｍコハク酸リチウム
ｐＨ５、０．６Ｍ ＬｉＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ラウリ
ル硫酸リチウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ
ＥＧＴＡを含む２００μｌの溶液中、６０℃で１５分
間で実施し、続いて３００μｌの０．１５Ｍ四ホウ酸ナ
トリウムｐＨ８．５、１％トリトンＲＸ−１００を加え
た。この混合物は６０℃で１５分間インキュベートし、
室温まで冷却した。各々のチューブの残存化学発光を、
Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲＲ Ｉルミノメータ
でアッセイした。表には同一条件下、同一のプロモータ
ー配列、配列ＩＤ番号：４３、５’−ＡＡＴＴＴＡＡＴ
ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’および
３’標的相補的領域配列ＩＤ番号：９を含んでいるプロ
モーター−プライマー対を用いて得られたデータも示さ
れている。１００μｌ当たり遊離３’ＯＨを持つ４ピコ
モルのプロモーター−プライマーおよび３’アルカンジ
オール基を持つように合成された２６ピコモルの同じプ
ロモータープライマーが使用された。
【０２００】
【表１１】
【０２０１】他の態様は以下の請求の範囲内に存在す
る。
る。
【０２０２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING 配列番号： 1: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 1: GCATAGACTT ATATATCCGC C 21 配列番号： 2: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 2: GGCGGATATA TAAGTCTATG C 21 配列番号： 3: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 3: TACTCACCCT TTACGCCCAA TAATCCCG 28 配列番号： 4: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 4: CGGGATTATT GGGCGTAAAG GGTGAGTA 28 配列番号： 5: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 5: CCAACATAGG TCCACAGTTG AGCTGTGGTA TTTTAT 36 配列番号： 6: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 6: ATAAAATACC ACAGCTCAAC TGTGGACCTA TGTTGG 36 配列番号： 7: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 7: AGCCGCGGTA ATACGTAAGG GTTTAGCGT 29 配列番号： 8: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 39 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 8: CTTCCTCTAT CAGACTCTAG ACATATAGTT TCCAACATA 39 配列番号： 9: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 9: CCACCCTTAC ACCAGAAATT CTAACTTCCT CTATCA 36 配列番号： 10: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 10: GGCGGATATG CAAGTCTATG C 21 配列番号： 11: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 11: AGCCGCGGTA ATACGTAAGG GGCGAGCGT 29 配列番号： 12: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 12: GCAUAGACUU AUAUAUCCGC C 21 配列番号： 13: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 13: GGCGGAUAUA UAAGUCUAUG C 21 配列番号： 14: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 14: UACUCACCCU UUACGCCCAA UAAUCCCG 28 配列番号： 15: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 15: CGGGAUUAUU GGGCGUAAAG GGUGAGUA 28 配列番号： 16: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 16: CCAACAUAGG UCCACAGUUG AGCUGUGGUA UUUUAU 36 配列番号： 17: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 17: AUAAAAUACC ACAGCUCAAC UGUGGACCUA UGUUGG 36 配列番号： 18: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 18: CTGAAAAGTG TAGTCGATGG GAAACGGG 28 配列番号： 19: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 19: GCACTCATCA TCACATCTTA GCTC 24 配列番号： 20: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 20: CGTATTTTGC AGAGTTCCTT AACG 24 配列番号： 21: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 26 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 21: GGTGATGATC TTGATAGGAA AATCCG 26 配列番号： 22: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 26 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 22: GGTGTTGATT TTAGTAGGAA AATCCG 26 配列番号： 23: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 23: CGATGGTTGT CCTAGTTTAA GCATTAA 27 配列番号： 24: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 26 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 24: CGGATTTTCC TATCAAGATC ATCACC 26 配列番号： 25: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 26 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 25: GGUGAUGAUC UUGAUAGGAA AAUCCG 26 配列番号： 26: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 26 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 26: CGGAUUUUCC UAUCAAGAUC AUCACC 26 配列番号： 27: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 27: TTAATGCTTA AACTAGGACA ACCATCG 27 配列番号： 28: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 28: CGAUGGUUGU CCUAGUUUAA GCAUUAA 27 配列番号： 29: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 29: UUAAUGCUUA AACUAGGACA ACCAUCG 27 配列番号： 30: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 26 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 30: CGGATTTTCC TACTAAAATC AACACC 26 配列番号： 31: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 26 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 31: GGUGUUGAUU UUAGUAGGAA AAUCCG 26 配列番号： 32: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 26 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 32: CGGAUUUUCC UACUAAAAUC AACACC 26 配列番号： 33: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 33: GCATAGACTT GCATATCCGC C 21 配列番号： 34: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 34: GGCGGAUAUG CAAGUCUAUG C 21 配列番号： 35: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 35: GCAUAGACUU GCAUAUCCGC C 21 配列番号： 36: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 36: ACGCTAAACC CTTACGTATT ACCGCGGCT 29 配列番号： 37: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 39 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 37: TATGTTGGAA ACTATATGTC TAGAGTCTGA TAGAGGAAG 39 配列番号： 38: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 38: TGATAGAGGA AGTTAGAATT TCTGGTGTAA GGGTGG 36 配列番号： 39: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 39: ACGCTCGCCC CTTACGTATT ACCGCGGCT 29 配列番号： 40: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 40: CCCGTTTCCC ATCGACTACA CTTTTCAG 28 配列番号： 41: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 41: GAGCTAAGAT GTGATGATGA GTGC 24 配列番号： 42: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 42: CGTTAAGGAA CTCTGCAAAA TACG 24 配列番号： 43: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 43: AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGA 27 配列番号： 44: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 44: AGCCGCGGUA AUACGUAAGG GUUUAGCGU 29 配列番号： 45: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 39 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 45: CUUCCUCUAU CAGACUCUAG ACAUAUAGUU UCCAACAUA 39 配列番号： 46: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 46: CCACCCUUAC ACCAGAAAUU CUAACUUCCU CUAUCA 36 配列番号： 47: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 47: AGCCGCGGUA AUACGUAAGG GGCGAGCGU 29 配列番号： 48: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 48: CUGAAAAGUG UAGUCGAUGG GAAACGGG 28 配列番号： 49: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 49: GCACUCAUCA UCACAUCUUA GCUC 24 配列番号： 50: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 50: CGUAUUUUGC AGAGUUCCUU AACG 24 配列番号： 51: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 51: ACGCUAAACC CUUACGUAUU ACCGCGGCU 29 配列番号： 52: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 39 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 52: UAUGUUGGAA ACUAUAUGUC UAGAGUCUGA UAGAGGAAG 39 配列番号： 53: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 53: UGAUAGAGGA AGUUAGAAUU UCUGGUGUAA GGGUGG 36 配列番号： 54: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 54: ACGCUCGCCC CUUACGUAUU ACCGCGGCU 29 配列番号： 55: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 55: CCCGUUUCCC AUCGACUACA CUUUUCAG 28 配列番号： 56: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 56: GAGCUAAGAU GUGAUGAUGA GUGC 24 配列番号： 57: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 57: CGUUAAGGAA CUCUGCAAAA UACG 24 配列番号： 58: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 35 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 58: GGAACTTACC CGACAAGGAA TTTCGCTACC TTAGG 35 配列番号： 59: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 59: ACCGTTATAG TTACGGCCGC CGTTTACTGG GGCTTC 36 配列番号： 60: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 32 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 60: GCCTGGCCAT CGTTACGCCA TTCGTGCAGG TC 32 配列番号： 61: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 61: GCCCAAATCG TTACGCCTTT CGTGCGGGTC 30 配列番号： 62: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 62: CCCGACCGTC CCTATTAATC ATTACGATGG 30 配列番号： 63: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 46 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: DNA (genomic) (xi) 配列: SEQ ID NO: 63: CTACGACGGT ATCTGATCAT CTTCGATCCC CTAACTTTCG TTCTTG 46
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ヤン，イージィン アメリカ合衆国カリフォルニア州92130, サン・ディエゴ，グレンクリフ・ウェイ 13569 (72)発明者 カーター，ニック アメリカ合衆国カリフォルニア州92116, サン・ディエゴ，ノース・アベニュー 4620，アパートメント ナンバー10
Claims (60)
- 【請求項１】ボレリア属のメンバーを検出するためのハ
イブリダイゼーションアッセイプローブであって、スト
リンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア
核酸配列の少なくとも一部にハイブリダイズする１０か
ら１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、該ボレリア核酸配列は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
を特徴とするプローブ。 - 【請求項２】該プローブが、該ストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件下、ボレリア核酸配列とは優先的
にハイブリダイズするが、系統発生学的に密接に関連し
た微生物の核酸とはハイブリダイズしない、請求項第１
項に記載の核酸ハイブリダイゼーションアッセイプロー
ブ。 - 【請求項３】 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG および 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC から成る群より選択される核酸配列を持つオリゴヌクレ
オチドプローブと実質的に対応し、ストリンジェントハ
イブリダイゼーション条件下でボレリア属のメンバーを
検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブ。 - 【請求項４】請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチド
および少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチドを
含むプローブ混合物。 - 【請求項５】該ヘルパーオリゴヌクレオチドが１０−１
００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、スト
リンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア
核酸配列にハイブリダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレ
オチドは： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸
配列を持つ、請求項第４項に記載のプローブ混合物。 - 【請求項６】該オリゴヌクレオチドが： 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC と実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘ
ルパーオリゴヌクレオチドが： 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA および 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである、請求項第４
項に記載のプローブ混合物。 - 【請求項７】該オリゴヌクレオチドが： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC と実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘ
ルパーオリゴヌクレオチドが： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG および 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
核酸配列を持つオリゴヌクレオチドである、請求項第４
項に記載のプローブ混合物。 - 【請求項８】該オリゴヌクレオチドが： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC と実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘ
ルパーオリゴヌクレオチドが核酸配列： 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
である、請求項第４項に記載のプローブ混合物。 - 【請求項９】該オリゴヌクレオチドが： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG または 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG と実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘ
ルパーオリゴヌクレオチドが核酸配列： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
である、請求項第４項に記載のプローブ混合物。 - 【請求項１０】ライム病関連ボレリアを検出するための
ハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、ス
トリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ライム
病関連ボレリア核酸配列に優先的にハイブリダイズする
が、ボレリア ヘルムシーに存在する核酸配列とはハイ
ブリダイズしない１０から１００ヌクレオチド長のオリ
ゴヌクレオチドプローブをみ、該ボレリア核酸配列は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC および 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
を特徴とするプローブ。 - 【請求項１１】 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC および 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC から成る群より選択される核酸配列を持つオリゴヌクレ
オチドプローブと実質的に対応し、ストリンジェントハ
イブリダイゼーション条件下でライム病関連ボレリアを
検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブ。 - 【請求項１２】請求項第１０項に記載のオリゴヌクレオ
チドおよび少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチ
ドを含むプローブ混合物。 - 【請求項１３】該プローブが： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC または 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC と実質的に対応する核酸配列を持ち、該ヘルパーオリゴ
ヌクレオチドは１０−１００ヌクレオチド長のオリゴヌ
クレオチドであり、およびストリンジェントハイブリダ
イゼーション条件下でライム病関連ボレリア核酸配列に
ハイブリダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG および 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAU から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸
配列を持つ、請求項第１２項に記載のプローブ混合物。 - 【請求項１４】該プローブが： 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC または 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC と実質的に対応する核酸配列を持ち、該ヘルパーオリゴ
ヌクレオチドは１０−１００ヌクレオチド長のオリゴヌ
クレオチドであり、およびストリンジェントハイブリダ
イゼーション条件下でライム病関連ボレリア核酸配列に
ハイブリダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸
配列を持つ、請求項第１２項に記載のプローブ混合物。 - 【請求項１５】ライム病関連ボレリアを検出するための
ハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、ス
トリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ライム
病関連ボレリア核酸配列に優先的にハイブリダイズする
が、ボレリア ヘルムシーに存在する核酸配列とはハイ
ブリダイズしない１０から１００ヌクレオチド長のオリ
ゴヌクレオチドプローブを含み、該核酸配列は： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
を特徴とするプローブ。 - 【請求項１６】請求項第１５項に記載のオリゴヌクレオ
チドおよび少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチ
ドを含むプローブ混合物。 - 【請求項１７】該プローブが： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG または 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG と実質的に対応する核酸配列を持ち、該ヘルパーオリゴ
ヌクレオチドは１０−１００ヌクレオチド長のオリゴヌ
クレオチドであり、およびストリンジェントハイブリダ
イゼーション条件下でライム病関連ボレリア核酸配列に
ハイブリダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸
配列を持つ、請求項第１６項に記載のプローブ混合物。 - 【請求項１８】ボレリア核酸と、 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
核酸配列を持つオリゴヌクレオチドとの間で形成される
核酸ハイブリッドを含む、ボレリア属のメンバーを検出
するための組成物。 - 【請求項１９】ボレリア核酸と、 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
核酸配列を持つオリゴヌクレオチドとの間で形成される
核酸ハイブリッドを含む、ボレリア核酸を増幅するため
の組成物。 - 【請求項２０】ボレリア核酸と、核酸配列： 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
との間で形成される核酸ハイブリッドを含み、およびさ
らに： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT および 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含む組成物。 - 【請求項２１】さらにヘルパーオリゴヌクレオチドを含
む、請求項第１８項に記載の組成物。 - 【請求項２２】ボレリア核酸と、 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
核酸配列を持つオリゴヌクレオチドとの間で形成される
核酸ハイブリッドを含む、ライム病関連ボレリアを検出
するための組成物。 - 【請求項２３】ライム病関連ボレリアの存在を検出する
ための方法であって、ストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下、試験試料とストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア１６Ｓ標
的核酸配列とはハイブリダイズできるが、ボレリア ヘ
ルムシーからの核酸配列とはハイブリダイズできない核
酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブを接触させ
る工程を含み、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC および 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
を特徴とする方法。 - 【請求項２４】ライム病関連ボレリアの存在を検出する
ための方法であって、ストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下、試験試料とストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア標的２３
Ｓ核酸配列とはハイブリダイズできるが、ボレリア ヘ
ルムシーからの核酸配列とはハイブリダイズできない核
酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブを接触させ
る工程を含み、該標的核酸配列は： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
を特徴とする方法。 - 【請求項２５】試験試料中のボレリア核酸の数を増加さ
せるための方法であって、 ａ）以下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号３６：ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号３８：TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGG
GTGG 配列ＩＤ番号３９：ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号４０：CCCGTTTCCCATCGACTACACTTTTCAG 配列ＩＤ番号４１：GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC 配列ＩＤ番号４２：CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG 配列ＩＤ番号２７：TTAATGCTTAAACTAGGACAACCATCG 配列ＩＤ番号５１：ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU 配列ＩＤ番号５３：UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGG
GUGG 配列ＩＤ番号５４：ACGCUCGCCCCUUACGUAUUACCGCGGCU 配列ＩＤ番号５５：CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG 配列ＩＤ番号５６：GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC 配列ＩＤ番号５７：CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG および 配列ＩＤ番号２９：UUAAUGCUUAAACUAGGACAACCAUCG の一つまたはそれ以上に実質的に対応する核酸配列に結
合するかまたはそれを通した延長を起こす一つまたはそ
れ以上の増幅オリゴヌクレオチドで該核酸を増幅するこ
とを含み、ここで該増幅オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ
ポリメラーゼにより認識されまたはＲＮＡポリメラーゼ
による開始または延長を促進する核酸配列を随意に持つ
ことを特徴とする方法。 - 【請求項２６】ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼー
ション条件下、ボレリア核酸に特異的にハイブリダイズ
できるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ
セイプローブで増幅された核酸を検出する工程をさらに
含む、請求項第２５項に記載の方法。 - 【請求項２７】試験試料中のボレリア核酸を増幅する方
法であって、該核酸を、以下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号３６：ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号５１：ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU と実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれを
通しての延長を起こすであろう一つまたはそれ以上の増
幅オリゴヌクレオチド、および以下のヌクレオチド配
列： 配列ＩＤ番号３７：TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATA
GAGGAAG 配列ＩＤ番号５２：UAUGUUGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUA
GAGGAAG 配列ＩＤ番号３８：TGATAGAGGAAGTTAGAATTTCTGGTGTAAGG
GTGG および 配列ＩＤ番号５３：UGAUAGAGGAAGUUAGAAUUUCUGGUGUAAGG
GUGG と実質的に対応する核酸配列に結合するであろう、また
はそれを通しての延長を起こすであろう第二の増幅オリ
ゴヌクレオチドで増幅することを含み、ここで該増幅オ
リゴヌクレオチドの一つはＲＮＡポリメラーゼにより認
識されまたはＲＮＡポリメラーゼによる開始または延長
を促進する核酸配列を随意に持つことを特徴とする方
法。 - 【請求項２８】ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼー
ション条件下、ボレリア核酸に特異的にハイブリダイズ
できるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ
セイプローブで増幅された核酸を検出する工程をさらに
含む、請求項第２７項に記載の方法。 - 【請求項２９】試験試料中のボレリア核酸を増幅する方
法であって、該核酸を、以下のヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号３６：ACGCTAAACCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号５１：ACGCUAAACCCUUACGUAUUACCGCGGCU 配列ＩＤ番号３９：ACGCTCGCCCCTTACGTATTACCGCGGCT 配列ＩＤ番号５４：ACGCUCGCCCCUUACGUAUUACCGCGGCU の一つと実質的に対応する核酸配列に結合するかまたは
それを通しての延長を起こすであろう一つまたはそれ以
上の増幅オリゴヌクレオチド、および以下の配列： 配列ＩＤ番号３７：TATGTTGGAAACTATATGTCTAGAGTCTGATA
GAGGAAG 配列ＩＤ番号５２：UAUGUUGGAAACUAUAUGUCUAGAGUCUGAUA
GAGGAAG と実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれを
通しての延長を起こすであろう第二の増幅オリゴヌクレ
オチドで増幅することを含み、ここで該増幅オリゴヌク
レオチドの一つは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識され
またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または延長を促進
する核酸配列を随意に持つことを特徴とする方法。 - 【請求項３０】ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼー
ション条件下、ボレリア核酸に特異的にハイブリダイズ
できるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ
セイプローブで増幅された核酸を検出する工程をさらに
含む、請求項第２９項に記載の方法。 - 【請求項３１】試験試料中のボレリア核酸配列の数を増
加させる方法であって、該核酸を以下のヌクレオチド配
列： 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号５５：CCCGUUUCCCAUCGACUACACUUUUCAG と実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれを
通しての延長を起こすであろう一つまたはそれ以上の増
幅オリゴヌクレオチド、および以下の配列： 配列ＩＤ番号４１：GAGCTAAGATGTGATGATGAGTGC 配列ＩＤ番号５６：GAGCUAAGAUGUGAUGAUGAGUGC 配列ＩＤ番号４２：CGTTAAGGAACTCTGCAAAATACG および 配列ＩＤ番号５７：CGUUAAGGAACUCUGCAAAAUACG と実質的に対応する核酸配列に結合するかまたはそれを
通しての延長を起こすであろう第二の増幅オリゴヌクレ
オチドで増幅することを含み、ここで該増幅オリゴヌク
レオチドの一つは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識され
またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または延長を促進
する核酸配列を随意に持つことを特徴とする方法。 - 【請求項３２】ｂ）ストリンジェントハイブリダイゼー
ション条件下、ボレリア核酸に特異的にハイブリダイズ
できるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ
セイプローブで増幅された核酸を検出する工程をさらに
含む、請求項第３１項に記載の方法。 - 【請求項３３】該ボレリア核酸がライム病関連ボレリ
ア、またはボレリア ヘルムシー核酸である、請求項第
３１項に記載の方法。 - 【請求項３４】該オリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ションアッセイプローブが： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸
配列を持つ、請求項第３１項に記載の方法。 - 【請求項３５】 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU 配列ＩＤ番号４６：CCACCCUUACACCAGAAAUUCUAACUUCCUCU
AUCA 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC および 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG から成る群より選択される配列と実質的に対応する配列
を持つ増幅オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３６】ヌクレオチド配列： 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA または 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA （ここで最も３’の１９ヌクレオチドは厳密に示されて
いるとおりである）と実質的に対応するヌクレオチド配
列を持つ増幅オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３７】ＲＮＡポリメラーゼにより認識されまた
はＲＮＡポリメラーゼによる開始または延長を促進する
５’配列をさらに含む、請求項第３５または３６項に記
載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３８】ボレリア核酸と、請求項第３６または３
７項に記載の核酸配列を持つオリゴヌクレオチドとの間
で形成される核酸ハイブリッドを含む、ボレリア核酸増
幅のための組成物。 - 【請求項３９】 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号２６：CGGAUUUUCCUAUCAAGAUCAUCACC から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
核酸配列を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを
含むキット。 - 【請求項４０】該オリゴヌクレオチドが 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC または 配列ＩＤ番号１２：GCAUAGACUUAUAUAUCCGCC である場合： 配列ＩＤ番号３：TACTCACCCTTTACGCCCAATAATCCCG 配列ＩＤ番号５：CCAACATAGGTCCACAGTTGAGCTGTGGTATTTT
AT 配列ＩＤ番号１４：UACUCACCCUUUACGCCCAAUAAUCCCG および 配列ＩＤ番号１６：CCAACAUAGGUCCACAGUUGAGCUGUGGUAUU
UUAUから成る群より選択され；または 該オリゴヌクレオチドが 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC または 配列ＩＤ番号１３：GGCGGAUAUAUAAGUCUAUGC である場合： 配列ＩＤ番号４：CGGGATTATTGGGCGTAAAGGGTGAGTA 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG 配列ＩＤ番号１５：CGGGAUUAUUGGGCGUAAAGGGUGAGUA および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGGから成る群より選択され；または該オリゴヌクレオ
チドが 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG および 配列ＩＤ番号２５：GGUGAUGAUCUUGAUAGGAAAAUCCG である場合： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸
配列を持つ少なくとも一つのヘルパープローブを持つ、
請求項第３９項に記載のキット。 - 【請求項４１】 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC および 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
核酸配列を持ち、ＲＮＡポリメラーゼにより認識される
またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または延長を促進
する５’配列を随意に持つ二つのオリゴヌクレオチドを
含むキット。 - 【請求項４２】該二つのオリゴヌクレオチドが 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT の群から選択される場合： 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC および 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGCから成る群
より選択され；または該オリゴヌクレオチドが 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC および 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG から選択される場合： 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG および 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
核酸配列を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを
さらに含む、請求項第４１項に記載のキット。 - 【請求項４３】以下の配列： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA および 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC または 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含むキット。 - 【請求項４４】以下の配列： 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT 配列ＩＤ番号９：CCACCCTTACACCAGAAATTCTAACTTCCTCTAT
CA および 配列ＩＤ番号１：GCATAGACTTATATATCCGCC または 配列ＩＤ番号２：GGCGGATATATAAGTCTATGC と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含むキット。 - 【請求項４５】以下の配列： 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA および 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA （ここで最も３’の１９ヌクレオチドは厳密に示されて
いるとおりである）と実質的に対応する）と実質的に対
応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを含むキッ
ト。 - 【請求項４６】以下の配列： 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA；および 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC または 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含むキット。 - 【請求項４７】以下の配列： 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC；および 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG または 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC；また
は 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG または 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含むキット。 - 【請求項４８】以下の配列： 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG；および 配列ＩＤ番号２１：GGTGATGATCTTGATAGGAAAATCCG または 配列ＩＤ番号２４：CGGATTTTCCTATCAAGATCATCACC；また
は 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG または 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含むキット。 - 【請求項４９】ボレリア ヘルムシーを検出するための
ハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、ス
トリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリ
ア ヘルムシー核酸配列とは優先的にハイブリダイズす
るが、ボレリア ブルグドルフェリに存在する核酸配列
とはハイブリダイズしない、１０から１００ヌクレオチ
ド長のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該ボレリア
ヘルムシー核酸配列は： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC および 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
を特徴とするプローブ。 - 【請求項５０】請求項第４９項に記載のハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブおよび少なくとも一つのヘル
パーオリゴヌクレオチドを含むプローブ混合物。 - 【請求項５１】該プローブが： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC または 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC に実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘ
ルパーオリゴヌクレオチドが１０から１００ヌクレオチ
ド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントハ
イブリダイゼーション条件下でボレリア ヘルムシー核
酸配列とハイブリダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレオ
チドが： 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸
配列を持つ、請求項第５０項に記載のプローブ混合物。 - 【請求項５２】ボレリア ヘルムシーを検出するための
ハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、ス
トリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリ
ア ヘルムシー核酸配列とは優先的にハイブリダイズす
るが、ボレリア ブルグドルフェリに存在する核酸配列
とはハイブリダイズしない、１０から１００ヌクレオチ
ド長のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該ボレリア
ヘルムシー核酸配列は： 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
を特徴とするプローブ。 - 【請求項５３】請求項第５２項に記載のオリゴヌクレオ
チドおよび少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチ
ドを含むプローブ混合物。 - 【請求項５４】オリゴヌクレオチドが： 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG または 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG に実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘ
ルパーオリゴヌクレオチドが１０から１００ヌクレオチ
ド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントハ
イブリダイゼーション条件下でボレリア ヘルムシー核
酸配列とハイブリダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレオ
チドが： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸
配列を持つ、請求項第５３項に記載のプローブ混合物。 - 【請求項５５】ボレリア ヘルムシーの存在を検出する
ための方法であって、ストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下、試験試料とストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でボレリア ヘルムシー標的核酸
配列とはハイブリダイズするであろうが、ボレリア ブ
ルグドルフェリからの核酸配列とはハイブリダイズしな
いであろう核酸ハイブリダイゼーションアッセイプロー
ブを接触させる工程を含み、該ボレリア ヘルムシー標
的核酸配列は： 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC および 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
を特徴とする方法。 - 【請求項５６】ボレリア ヘルムシーの存在を検出する
ための方法であって、ストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下、試験試料とストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でボレリア ヘルムシー標的核酸
配列とはハイブリダイズするであろうが、ボレリア ブ
ルグドルフェリからの核酸配列とはハイブリダイズしな
いであろう核酸ハイブリダイゼーションアッセイプロー
ブを接触させる工程を含み、該ボレリア ヘルムシー標
的核酸配列は： 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
を特徴とする方法。 - 【請求項５７】ボレリア ヘルムシー核酸と、 配列ＩＤ番号１０：GGCGGATATGCAAGTCTATGC 配列ＩＤ番号３３：GCATAGACTTGCATATCCGCC 配列ＩＤ番号３４：GGCGGAUAUGCAAGUCUAUGC 配列ＩＤ番号３５：GCAUAGACUUGCAUAUCCGCC 配列ＩＤ番号２２：GGTGTTGATTTTAGTAGGAAAATCCG 配列ＩＤ番号３０：CGGATTTTCCTACTAAAATCAACACC 配列ＩＤ番号３１：GGUGUUGAUUUUAGUAGGAAAAUCCG および 配列ＩＤ番号３２：CGGAUUUUCCUACUAAAAUCAACACC から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
核酸配列を持つオリゴヌクレオチドとの間で形成される
核酸ハイブリッドを含む組成物。 - 【請求項５８】少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレ
オチドをさらに含む、請求項第５７項に記載の組成物。 - 【請求項５９】 配列ＩＤ番号７：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGTTTAGCGT または 配列ＩＤ番号４４：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGUUUAGCGU および 配列ＩＤ番号８：CTTCCTCTATCAGACTCTAGACATATAGTTTCCA
ACATA または 配列ＩＤ番号４５：CUUCCUCUAUCAGACUCUAGACAUAUAGUUUC
CAACAUA および 配列ＩＤ番号１１：AGCCGCGGTAATACGTAAGGGGCGAGCGT または 配列ＩＤ番号４７：AGCCGCGGUAAUACGUAAGGGGCGAGCGU から成る群より選択される配列と実質的に対応するヌク
レオチド配列を持つ第二のオリゴヌクレオチドをさらに
含み、ここで該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： 配列ＩＤ番号６：ATAAAATACCACAGCTCAACTGTGGACCTATGTT
GG および 配列ＩＤ番号１７：AUAAAAUACCACAGCUCAACUGUGGACCUAUG
UUGG から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
オリゴヌクレオチドである、請求項第５８項に記載の組
成物。 - 【請求項６０】 配列ＩＤ番号１８：CTGAAAAGTGTAGTCGATGGGAAACGGG または 配列ＩＤ番号４８：CUGAAAAGUGUAGUCGAUGGGAAACGGG；お
よび 配列ＩＤ番号１９：GCACTCATCATCACATCTTAGCTC または 配列ＩＤ番号４９：GCACUCAUCAUCACAUCUUAGCUC；および 配列ＩＤ番号２０：CGTATTTTGCAGAGTTCCTTAACG または 配列ＩＤ番号５０：CGUAUUUUGCAGAGUUCCUUAACG から成る群より選択される配列と実質的に対応するヌク
レオチド配列を持つ第二のオリゴヌクレオチドをさらに
含み、ここで該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： 配列ＩＤ番号２３：CGATGGTTGTCCTAGTTTAAGCATTAA および 配列ＩＤ番号２８：CGAUGGUUGUCCUAGUUUAAGCAUUAA から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
オリゴヌクレオチドである、請求項第５８項に記載の組
成物。
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