JP2001029089A

JP2001029089A - ケモカイン受容体８８−２ｂ［ｃｋｒ−３］及び８８ｃならびにそれらの抗体

Info

Publication number: JP2001029089A
Application number: JP2000143832A
Authority: JP
Inventors: Patrick W Gray; パトリック，ダブリュ．ギャリー，; Vicki L Schweickart; ヴィッキー，エル．シュウェイッカート，; Carol J Raport; キャロル，ジェイ．レイポート，
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 2000-05-16
Publication date: 2001-02-06
Also published as: ATE309349T1; AU730463B2; DE69638128D1; CA2213331C; HUP9801127A2; US6265184B1; AU1689297A; NO20052202D0; US20040230037A1; WO1997022698A2; DE69635406T3; US6268477B1; JP2001264324A; JP3288384B2; CN1183805A; EP1642975A3; MX9706316A; US20050260565A1; NO973800D0; EP1642975A2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】ケモカイン受容体８８−２Ｂ［ＣＫＲ−３］及
び８８Ｃ並びにそれらの抗体及びそれらの製造方法の提
供。【解決手段】ケモカイン受容体88-2Ｂ又は88Ｃをコード
するポリヌクレオチド並びにこれら２つのケモカイン受
容体の組換え生産のための材料及び方法を提供する。更
に、ケモカイン受容体のリガンド及びモジュレーターの
同定を容易ならしめる、ポリヌクレオチドを利用したア
ッセイも提供される。受容体断片、リガンド、モジュレ
ーター、及び抗体は、アテローム性動脈硬化症、慢性関
節リウマチ、腫瘍生長抑制、喘息、ウイルス感染、ＡＩ
ＤＳ、及び他の炎症状態等の、ケモカイン受容体に関わ
る病態の検出及び処置において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、一般に、シグナルトランスダク
ション経路に関する。さらに詳細には、本発明は、ケモ
カイン受容体、ケモカイン受容体をコードする核酸、ケ
モカイン受容体リガンド、ケモカイン受容体活性のモジ
ュレーター、ケモカイン及びケモカイン受容体を認識す
る抗体、ケモカイン受容体リガンド及びモジュレーター
を同定するための方法、ケモカイン受容体を製造するた
めの方法、ならびにケモカイン受容体を認識する抗体を
製造するための方法に関する。

【０００２】

【背景技術】本出願は、1996年６月７日に出願せる米国
特許出願第08/661,393号の一部継続出願であり、当該出
願は、1995年12月20日に出願せる米国特許出願第08/57
5,967号の一部継続出願である。

【０００３】分子生物学の近年の進歩によって、生物学
的プロセスにおけるシグナルトランスダクション経路の
中心的な役割の正当な認識がなされるようになってい
る。これらの経路は、多細胞生物の個々の細胞が交信
し、それによって生物学的プロセスの整合を行う、中心
的な手段を含むものである。１つのモデルとして、Spri
nger、Cell 76巻、301〜314頁(1994)の表Ｉを参照され
たい。シグナルトランスダクション経路の１つの分岐点
は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇ−タンパ
ク質）の細胞内での関与によって規定されており、これ
が広範囲にわたる生物学的プロセスに影響を及ぼすもの
である。

【０００４】Lewin、GENES V 319〜348頁(1994)は、最
小限で以下の成分すなわち、細胞外シグナル（例えば、
神経伝達物質、ペプチドホルモン、有機分子、光、また
は臭気物質）、シグナルを認識する受容体（Probstら、
DNA and Cell Biology 11巻、1〜20頁[1992]において概
説されており、ＧＰＲまたはＧＰＣＲとして知られてい
る、Ｇ−タンパク質にカップリングする受容体）、なら
びに細胞内、ヘテロトリマー性ＧＴＰ−結合タンパク
質、またはＧタンパク質を包含する、Ｇ−タンパク質シ
グナルトランスダクション経路について一般的に論じて
いる。特に、これらの経路は、白血球細胞すなわちロイ
コサイトのトラフィッキング（trafficking）を調節す
る上での役割のゆえに、注目に値する興味を集めるもの
である。

【０００５】白血球は、顆粒球（すなわち、好中球、好
塩基球及び好酸球）、リンパ球、及び単球を包含する可
動性の細胞型の一群を含んでなる。可動化され活性化さ
れると、これらの細胞は第一に外来物質に対する生体防
御に関与する。この任務は、白血球が関与する多岐にわ
たる正常及び病理学的プロセスによって複雑なものにな
っている。例えば、感染に対する正常の免疫応答におい
て白血球は機能する。白血球はまた、様々な病理学的炎
症にも関わっている。要約として、Schallら、Curr.Opi
n.Immun-ol. 6巻、865〜873頁(1994)を参照されたい。
さらに、これらプロセスの各々は、白血球細胞型の各々
に由来する等級（degree）、種類、及び期間において独
特な寄与形態に関わることができるのである。

【０００６】これらの免疫反応を研究する上で、研究者
は先ず、白血球に対して作用しているシグナルを集中的
に調べた。これは、シグナルがあらゆる型の応答を引き
出すために必要であると考えられるからである。Murph
y、Ann.Rev.Immunol. 12巻、593〜633頁(1994)は、白血
球シグナルの重量な一群のメンバーであるペプチドシグ
ナルを概説している。ペプチドシグナルの一つの型は、
ケモカイン（化学（ケモ）誘引（attractant）サイトカ
イン）を含むペプチドシグナルであり、Oppenheimら、A
nn.Rev.Immunol. 9巻、617〜648頁(1991)においてイン
タークライン（intercline）と命名されている。Oppenh
eimらに加えて、Baggioliniら、Advences in Immunol.
55巻、97〜179頁(1994)は、同定され、遺伝的及び生化
学的分析に供されつつある、ケモカインを詳報してお
り、これらの数は増加傾向を辿っている。

【０００７】既知のケモカインのアミノ酸配列の比較に
よって、ケモカインを２群に分かつ分類大系が導き出さ
れており、かかる２群とは、最初の２つのシステインを
分離している単一のアミノ酸によって特徴付けられるα
群（ＣＸＣ、Ｎ−末端指示対照）、及びこれらのシステ
インが隣接しているβ群（ＣＣ）である。ケモカイン
と、それらのシグナルに対応する特定の白血球細胞型と
の間の相関性が、見出されている。Schallら、前出は、
ＣＸＣケモカインは一般に好中球に影響を及ぼし、そし
てＣＣケモカインは単球、リンパ球、好塩基球、及び好
酸球に影響を及ぼす傾向があることを報告している。例
えば、Baggioliniら、前出は、ＣＣケモカインであるＲ
ＡＮＴＥＳが、単球、リンパ球（すなわち、記憶Ｔ細
胞）、好塩基球、及び好酸球に対して化学誘引物質とし
て機能するが、好中球に対しては機能せず、一方、好塩
基球からのヒスタミン遊離を誘導することを述べてい
る。

【０００８】ケモカインは、ＨＩＶ増殖のサプレッサー
であることが、Cocchiら、Science、270巻、1811〜1815
頁(1995)によって最近示された。Cocchiらは、ＲＡＮＴ
ＥＳ、ＭＩＰ−1α、及びＭＩＰ−1βが、ＰＭ１と称さ
れるＣＤ⁴⁺細胞系及びヒト末梢血初代単核細胞系のＨＩ
Ｖ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶによる感染を抑制ことを
立証した。

【０００９】しかしながら、近年、細胞外ケモカインが
無差別に細胞に接触し、従って、個々の白血球細胞型を
調節するのに必要な特異性を欠くようであるために、ケ
モカインが結合する受容体へと注目の対象が移行してき
ている。

【００１０】Murphyら、前出は、受容体のＧＰＣＲスー
パーファミリーが、ケモカイン受容体ファミリーを含ん
でいることを報告した。典型的なケモカイン受容体構造
は、Ｎ−末端近傍に位置する細胞外ケモカイン結合ドメ
インと、それに続く、膜貫通α−ヘリックスを形成する
ことができる主として疎水性の、７つの間隔をあけた領
域を包含している。α−ヘリックスドメインの各々の間
に疎水性ドメインが、交互に、細胞内及び細胞外空間に
位置している。これらの特徴によって、膜に埋没したケ
モカイン受容体に蛇行状のコンフォメーションが付与さ
れる。第３の細胞内ループは、典型的にＧ−タンパク質
と相互作用する。加えて、Murphy、前出は、細胞内カル
ボキシル末端もＧ−タンパク質と相互作用できることを
認めている。

【００１１】分子クローニング技術によって分析すべき
第１のケモカイン受容体は、ＣＸＣケモカインであるヒ
トＩＬ８に対する２つの好中球受容体であった。Holmes
ら、Science、253巻、178〜1280頁(1991) 及びMurphy
ら、Science、253巻、1280〜1283頁(1991)は、ＩＬ８に
対する２つの受容体のクローニングを報告した。Lee
ら、J.Biol.Chem. 267巻、16823〜16287頁(1992)は、こ
れらの受容体をコードするｃＤＮＡを分析し、かかるコ
ードされた受容体が各受容体と77％のアミノ酸一致度を
有し、Ｇ−タンパク質にカップリングする受容体ファミ
リーの特徴を呈することを見出した。これら受容体の１
つは、ＩＬ−8に対して特異的であるが、一方、他の受
容体は、ＩＬ−8、gro/ＭＧＳＡ、及びＮＡＰ−２に結
合し、それに応答してシグナル伝達を行う。ＩＬ−8受
容体をコードする遺伝子の遺伝的操作が、これらの受容
体が携わる生物学的な役割の理解に貢献してきている。
例えば、Cacalanoら、Science、265巻、682〜684頁(199
4)は、マウスにおけるＩＬ−8受容体相同体の削除の結
果、リンパ節障害及び脾腫を包含する多面発現性の表現
型が生じることを報告した。加うるに、Leongら、J.Bio
l.Chem. 269巻、19343〜19348頁(1994)に記載されたミ
スセンス変異によって、ＩＬ−8結合について重要なＩ
Ｌ−8受容体の酸性アミノ酸が明らかになった。Murph
y、前出において論じられたドメイン交換実験では、結
合特異性の決定因子として、アミノ末端細胞外ドメイン
が含意された。

【００１２】ＣＣケモカインに対する様々な受容体もま
た、同定及びクローニングされた。ＣＣＣＫＲ1は、Ｍ
ＩＰ−1α及びＲＡＮＴＥＳの双方に結合し、そして双
方のリガンドに応答して細胞内カルシウムイオンの流出
が惹起こされる。Charoら、Proc.Natl.Acad.Sci. (USA)
91巻、2752〜2756頁(1994)は、他のＣＣケモカイン受
容体であるＭＣＰ−Ｒ1（ＣＣＣＫＲ2）が、単一の遺伝
子によってコードされ、カルボキシ末端が異なる２つの
スプライシング変異体を産生することを報告した。この
受容体は、ＭＣＰ−1に加えてＭＣＰ−3に結合及び応答
する。

【００１３】ＣＸＣ及びＣＣケモカインの双方に結合す
る特異性の低い受容体も同定されている。この受容体
は、元々は赤血球細胞にて同定されたのであり、Horuk
ら、Science、261巻、1182〜1184頁(1993)は、ＩＬ−
8、ＮＡＰ−2、ＧＲＯα、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−1
に結合することを報告している。赤血球のケモカイン受
容体は、他のケモカイン受容体と約25％の一致度を共有
しており、循環系でのケモカインレベルの調節を助けた
り、標的へのケモカインの呈示を補助したりするのかも
しれない。ケモカインの結合に加えて、赤血球ケモカイ
ン受容体はマラリアの主原因である三日熱(マラリア)プ
ラスモジウムに対する受容体であることも示されている
（同上）。ケモカイン受容体に密接に関係する他のＧ−
タンパク質にカップリングする受容体である、血小板活
性化因子受容体も、ヒトの病原たる細菌である肺炎レン
サ球菌に対する受容体であることが示されている（Cund
ellら、Nature、377巻、435〜438頁(1995)）。

【００１４】哺乳類のケモカイン受容体に加えて、２種
のウイルスケモカイン相同体も同定されている。Ahuja
ら、J.Biol.Chem. 268巻、20691〜20694頁(1993)は、Ｉ
Ｌ−8受容体と約30％の一致度を共有し、ＣＸＣケモカ
インに結合するHerpesvirus saimiri由来の遺伝子産物
を記載している。Neoteら、Cell、72巻、415〜425頁(19
93)は、ヒトサイトメガロウイルスが、ＭＩＰ−1α、Ｍ
ＩＰ−1β、ＭＣＰ−1、及びＲＡＮＴＥＳに結合するＣ
Ｃケモカイン受容体と約30％の一致度を共有する受容体
をコードする遺伝子を含んでいることを報告している。
これらウイルスの受容体は、ケモカインの通常の役割に
影響を及ぼし、ウイルスに対する選択的な病理学上の利
点を供給するかもしれない。

【００１５】ケモカイン及びその活性の広範なる多様性
のゆえに、ケモカインに対して数多くの受容体が存在す
る。その特徴が明らかにされている受容体は、ケモカイ
ン受容体の全体的な補集合の一画分のみを表しているに
すぎない。かくして、当該技術分野においてさらなるケ
モカイン受容体の同定が希求され続けている。これら新
規受容体の有用性により、ケモカインまたはケモカイン
受容体機能の治療用モジュレーターの開発のための手段
が提供されよう。アテローム性動脈硬化症、慢性関節リ
ウマチ、腫瘍生長抑制、喘息、ウイルス感染、及び他の
炎症性病態の処置のための療法における、かかるモジュ
レーターの有用性が本発明によって企図される。あるい
は、ケモカイン受容体の断片もしくは変異体、またはそ
れら受容体を認識する抗体が、前記療法に関わるものと
して企図される。

【００１６】

【発明の開示】本発明は、白血球のトラフィッキングに
関与するケモカイン受容体をコードする、精製及び単離
された核酸を提供する。本発明のポリヌクレオチド（セ
ンス鎖及びそのアンチセンス鎖の双方）には、ゲノミッ
クＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＲＮＡが包含され、さらに完
全にまたは部分的に合成された核酸も含まれる。本発明
の好ましいポリヌクレオチドには、配列番号：３に示さ
れるケモカイン受容体88-2ＢをコードするＤＮＡ、配列
番号：１に示されるケモカイン受容体88Ｃをコードする
ＤＮＡ、及び標準的なストリンジェンシーのハイブリダ
イゼーション条件下でそれらのＤＮＡとハイブリダイズ
する、または遺伝コードの重複なしにハイブリダイズす
ると思われるＤＮＡが包含される。ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件の例は、以下の通りであ
る。すなわち、42℃にて、50％ホルムアミド、5X SSC、
20 mMリン酸ナトリウム、pH 6.8でハイブリダイゼーシ
ョンを行い、そして55℃にて、0.2X SSCで洗浄する。当
業者には、ハイブリダイズされるべき配列の長さ及びＧ
Ｃヌクレオチド含量に基づいてこれらの条件を変更する
ことが想起されることは理解される。当該技術分野にお
ける標準の常則が、正確なハイブリダイゼーション条件
を決定するためには適切である。Sambrookら、Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual、ColdSpring Harbor
Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク
(1989)の、§§9.47〜9.51を参照のこと。さらにまた本
発明によって企図されるのは、88-2Ｂまたは88Ｃのドメ
インをコードするポリヌクレオチドであり、例えば、い
ずれかのタンパク質の１以上の細胞外ドメインまたはそ
の、生物学的活性を有する他の断片をコードするポリヌ
クレオチドである。88-2Ｂ細胞外ドメインは、配列番
号：３及び配列番号：４で、アミノ酸残基1〜36、93〜1
07、171〜196、及び263〜284に対応する。88-2Ｂの細胞
外ドメインは、配列番号：３で、ヌクレオチド362〜46
9、638〜682、872〜949、及び1148〜1213に対応するポ
リヌクレオチド配列によってコードされている。88Ｃの
細胞外ドメインは、配列番号：１及び配列番号：２で、
アミノ酸残基1〜32、89〜112、166〜191、及び259〜280
に対応する。88Ｃの細胞外ドメインは、配列番号：１
で、ヌクレオチド55〜150、319〜390、550〜627、及び8
29〜894に対応するポリヌクレオチド配列によってコー
ドされている。本発明はまた、これらケモカイン受容体
の細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドも企図
している。88-2Ｂの細胞内ドメインには、配列番号：３
及び配列番号：４のアミノ酸60〜71、131〜151、219〜2
40、及び306〜355が包含される。それらのドメインは、
配列番号：３で、ヌクレオチド539〜574、752〜814、10
16〜1081、及び1277〜1426にそれぞれ対応するポリヌク
レオチド配列によってコードされている。88Ｃの細胞内
ドメインには、配列番号：１及び配列番号：２のアミノ
酸残基56〜67、125〜145、213〜235、及び301〜352が包
含される。88Ｃの細胞内ドメインは、配列番号：１で、
ヌクレオチド220〜255、427〜489、691〜759、及び955
〜1110に対応するポリヌクレオチド配列によってコード
されている。細胞外もしくは細胞内ドメインの１つ以上
に対応するペプチド、またはそれらペプチドに対して作
製された抗体が、受容体活性、特に受容体のリガンド及
びＧタンパク質結合活性のモジュレーターとして企図さ
れる。

【００１７】本発明のヌクレオチド配列は、ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下で88-2Ｂまたは
88ＣをコードするゲノミックＤＮＡを単離するために標
識付けしたプローブとして用いる（すなわち、サザン分
析及びポリメラーゼ連鎖反応方法論による）ための、オ
リゴヌクレオチドを設計するために使用してもよい。さ
らに、これらのオリゴヌクレオチドプローブは、88-2Ｂ
または88Ｃをコードする遺伝子の、特定の対立遺伝子を
検出するために使用することができ、それによって、か
かる対立遺伝子に関わる病態の診断及び遺伝子療法によ
る処置が容易ならしめられる。加えて、これらのオリゴ
ヌクレオチドは、ケモカイン受容体のモジュレーターの
同定を容易にすべく、ケモカイン受容体の遺伝的性質を
改変するのにも使用することができる。さらに、そのヌ
クレオチド配列は、88-2Ｂまたは88Ｃの遺伝的性質及び
発現を探索または改変する上で使用するアンチセンス遺
伝要素を設計するためにも使用できる。本発明は、ま
た、本発明のＤＮＡの生物学的複製物（すなわち、in v
ivo または in vitro でつくられ、単離されたＤＮＡの
コピー）も企図するものである。効率的に88-2Ｂまたは
88Ｃポリヌクレオチドを組み込んでいる、プラスミド、
ウイルス、及び染色体（例えば、ＹＡＣ）核酸ベクター
などの自己複製する組換え構築体、ならびに、特に88-2
Ｂまたは88Ｃを有効にコードするＤＮＡが１以上の内在
性または異種由来の発現制御配列に作動可能に連結され
たベクターも提供される。

【００１８】88-2Ｂ及び88Ｃ受容体は、天然に、組換え
によって、または合成によって製造してもよい。標準法
によって本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換ま
たはトランスフェクトした宿主細胞（原核細胞性または
真核細胞性）もまた、88-2Ｂ及び88Ｃケモカイン受容体
を発現するために使用することができる。本来のままの
88-2Ｂまたは88Ｃ遺伝子産物以上に、88-2Ｂまたは88Ｃ
の生物学的に活性を有する断片、88-2Ｂまたは88Ｃの類
似体、及び配列番号：４に示される88-2Ｂ、または配列
番号：２に示される88Ｃのアミノ酸配列由来の合成ペプ
チドが、本発明により企図される。さらに、真核細胞に
て製造する場合、88-2Ｂもしくは88Ｃ遺伝子産物、また
はいずれかの遺伝子産物の生物学的に活性を有する断片
は、転写後に修飾（例えば、ジスルフィド結合の形成、
グリコシル化、リン酸化、ミリストイル化、パルミトイ
ル化、アセチル化等による）してもよい。本発明はさら
に、88-2Ｂ及び88Ｃ遺伝子産物、または生物学的に活性
を有するそれらの断片の、モノマー、ホモマルチマー、
またはヘテロマルチマーの形態のものを企図する。

【００１９】特に、本発明の１つの特徴は、88-2Ｂまた
は88Ｃケモカイン受容体に特異的に結合することができ
る抗体産物に関わるものである。抗体産物は、組換え88
-2Ｂもしくは88Ｃ受容体、88-2Ｂもしくは88Ｃ受容体の
合成ペプチドもしくはペプチド断片、表面に88-2Ｂもし
くは88Ｃを発現している宿主細胞、または天然の供給源
から精製した88-2Ｂもしくは88Ｃ受容体を免疫原として
使用して、当該技術分野における標準方法により作製さ
れる。抗体産物には、モノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体が包含され、いかなる供給源のものでも、
いかなるサブタイプのものでもかまわない。さらには、
モノマー、ホモマルチマー、及びヘテロマルチマー抗
体、ならびにそれらの断片が、本発明によって企図され
る。さらに本発明は、ＣＤＲ−組織移植抗体、「ヒト
化」抗体、及びケモカイン受容体に特異的に結合する能
力を保持する他の修飾された抗体産物を企図する。

【００２０】本発明はさらに、88-2Ｂもしくは88Ｃ遺伝
子産物、それらの類似体、またはそれらの生物学的に活
性を有する断片を検出するための、抗体産物の使用も企
図するものである。例えば、抗体産物は、88-2Ｂまたは
88Ｃの発現と、様々な正常または病理学的状態との間の
相関を明らかにするために計画される診断方法において
使用してもよい。加えて、抗体産物は、88-2Ｂもしくは
88Ｃ、それらの類似体、またはそれらの生物学的に活性
を有する断片の発現における、組織特異的な変動を診断
するために使用することができる。88-2Ｂ及び88Ｃケモ
カイン受容体に対して特異的な抗体産物は、受容体活性
のモジュレーターとしても作用するかもしれない。他の
特徴として、88-2Ｂまたは88Ｃ受容体に対する抗体は、
治療上の目的のために有用である。

【００２１】本発明のケモカイン受容体と相互作用する
ことができるリガンドのためアッセイも提供される。こ
れらのアッセイは、例えば、標識付けしたリガンドへの
受容体の結合をモニターすることによるなどといった、
ケモカイン受容体活性の直接的な検出を包含しうる。加
えて、これらのアッセイは、ケモカイン受容体とのリガ
ンドの相互作用を間接的に評価するために使用しうる。
本明細書中において、「リガンド」なる語は、88-2Ｂま
たは88Ｃのアゴニスト及びアンタゴニストである分子、
ならびに受容体に結合する他の分子を含むものである。

【００２２】ケモカイン受容体へのリガンド結合の直接
的な検出は、以下のアッセイを使用して成し遂げられう
る。供試化合物（すなわち、リガンドと推定される物
質）は、検出可能となるように標識付け（例えば、放射
性同位体ヨウ素付加）される。検出可能に標識付けされ
た供試化合物は、次いで、本発明のケモカイン受容体を
含む膜調製物と接触させられる。好ましくは、かかる膜
は、組換えベクターから本発明のケモカイン受容体を発
現している宿主細胞より調製される。膜に埋込まれたケ
モカイン受容体と、検出可能に標識付けされた供試化合
物との間の接触を促すインキュベーション期間に続き、
減圧濾過を使用してフィルター上に膜物質が採集され
る。次いで、フィルターに会合した検出可能な標識を定
量する。例えば、液体シンチレーションスペクトル光学
測定法を使用して、放射性同位体の標識を定量する。こ
の技術を使用して、ケモカイン受容体へのリガンド結合
を同定する。リガンドの同定を確証するために、標識付
けされていない状態にある供試化合物の量を増加して存
在させた下で、検出可能に標識付けされた供試化合物
を、ケモカイン受容体を呈示する膜調製物に曝す。標識
付けしていない供試化合物の添加量を増加するに従っ
て、フィルターに会合している標識のレベルが漸減すれ
ば、リガンドの同定が確証される。

【００２３】アゴニストは受容体に結合するリガンドで
あり、細胞内シグナルトランスダクションを導き出し、
そしてアンタゴニストは、受容体に結合するリガンドで
あるが、細胞内シグナルトランスフェクトを導き出すこ
とはない。特定のリガンドがアゴニストであるかまたは
アンタゴニストであるかどうかは、例えば、Ｇタンパク
質に関わるシグナルトランスダクション経路をアッセイ
することによって定量することができる。これらの経路
の活性化は、他のアッセイに加えて、細胞内Ｃａ⁺⁺流
出、ホスフォリパーゼＣ活性またはアデニル酸シクラー
ゼ活性を測定することによって定量することができる
（実施例５及び６を参照されたい）。

【００２４】本明細書における実施例において詳説して
いるように、88Ｃ受容体に結合するケモカインには、Ｒ
ＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−1α、及びＭＩＰ−1βが包含さ
れ、そして88-2Ｂ受容体に結合するケモカインには、Ｒ
ＡＮＴＥＳが包含される。

【００２５】他の特徴において、88Ｃ及び88-2Ｂ受容体
とそれらのリガンドとの間の相互作用のモジュレーター
が、本発明によって特に企図される。ケモカイン受容体
機能のモジュレーターは、リガンドを同定するために使
用されたものと類似のアッセイを使用して同定しうる。
ケモカイン受容体を呈示している膜調製物が、一定且つ
既知量の検出可能に標識付けされた機能性リガンドに曝
される。加えて、膜に結合したケモカイン受容体は、そ
のケモカイン受容体の活性をモジュレートすることが推
測される供試化合物にその量を増加させて曝される。フ
ィルターに会合した標識のレベルが供試化合物の量に呼
応するならば、その供試化合物は、ケモカイン受容体の
活性のモジュレーターである。フィルターに会合した標
識のレベルが、供試化合物の増加量に伴って増加すれ
ば、活性化物質が同定される。反対に、フィルターに会
合した標識のレベルが、供試化合物の量と逆に変化する
のであれば、ケモカイン受容体活性の阻害物質が同定さ
れる。このようにして受容体結合のモジュレーターを試
験することによって、同じ反応で同時に多くのモジュレ
ーターの可能性がある物質を含有するプールを試験する
ことができるので、多くのモジュレーターと推定される
物質を迅速にスクリーニングすることが可能となる。

【００２６】受容体結合のための間接的なアッセイに
は、関連するシグナルトランスダクション経路に見出さ
れる成分のうちのいずれかの活性の濃度またはレベルの
測定が包含される。ケモカイン受容体の活性化は、細胞
内Ｃａ⁺⁺流出に関係していることがある。ケモカイン受
容体を発現している細胞に、カルシウム感受性の染料を
付してもよい。発現された受容体の活性化に伴って、Ｃ
ａ⁺⁺流出が染料によりスペクトル光学測定で検出可能に
なるであろう。あるいは、かかるＣａ⁺⁺流出を顕微鏡で
検出することができる。いずれかの技術を用いて、リガ
ンドと推定される物質の存在下及び非存在下に平行した
アッセイを実施してもよい。例えば、Ｃａ ⁺⁺流出につい
ての顕微鏡でのアッセイを使用して、ＣＣケモカインで
あるＲＡＮＴＥＳが、88-2Ｂケモカイン受容体のリガン
ドとして同定された。当業者であれば、それらのアッセ
イが受容体活性のモジュレーターの精製を同定及びモニ
ターするためにも有用であることを認めるであろう。受
容体活性化物質及び阻害物質は、これらのアッセイにお
いて受容体とそのリガンドとの相互作用を、それぞれ活
性化または阻害するであろう。

【００２７】あるいは、ケモカイン受容体とＧタンパク
質との会合によって、Ｇタンパク質活性をモニターする
ことによる受容体活性を評価する機会が与えられる。Ｇ
タンパク質の特徴的な活性であるＧＴＰ加水分解を、例
えば、³²Ｐ−標識付けＧＴＰを使用してモニターしても
よい。

【００２８】Ｇタンパク質は、シグナルトランスダクシ
ョン経路における関与を通じて、様々な他の分子にも影
響を及ぼしている。Ｇタンパク質エフェクター分子に
は、アデニル酸シクラーゼ、ホスフォリパーゼＣ、イオ
ンチャンネル、及びホスフォジエステラーゼが包含され
る。これらのエフェクターのいずれかに焦点をおくアッ
セイを使用して、興味の対照であるケモカイン受容体を
発現しており、且つ適切なリガンドに接触せしめられて
いる宿主細胞にて、リガンド結合によって誘導されるケ
モカイン受容体活性をモニターしてもよい。例えば、ケ
モカイン受容体の活性を検出しうる一つの方法として、
ホスフォリパーゼＣ活性の測定が挙げられる。このアッ
セイにおいて、アゴニストの存在下で、ケモカイン受容
体を発現している宿主細胞による、放射性同位体で標識
付けしたイノシトールホスフェートの生産が検出され
る。ホスフォリパーゼ活性の検出は、外来性のＧタンパ
ク質をコードするＤＮＡと共にトランスフェクション
（コトランスフェクション）することを必要とするかも
しれない。コトランスフェクションが必要である場合に
は、このアッセイは、キメラＧタンパク質ＤＮＡ、例え
ば、Ｇqi5（Conklinら、Nature、363巻、274〜276頁(19
93)）を、88-2Ｂまたは88ＣのＤＮＡとコトランスフェ
クトし、そのコトランスフェクトされた細胞が88-2Ｂま
たは88Ｃ受容体のアゴニストに曝された際のホスフォイ
ノシトール生産を検出することによって行うことができ
る。当業者であれば、Ｇタンパク質エフェクター分子に
焦点をおいたアッセイもまた、受容体活性の精製を同定
及びモニターするために有用であることを認めるであろ
う。受容体の活性化物質及び阻害物質は、これらのアッ
セイにおいて、受容体とそれらのリガンドの相互作用を
それぞれ、活性化または阻害するであろう。

【００２９】ケモカインは、乾癬、関節炎、肺線維症及
びアテローム性動脈硬化症などの多くの炎症性疾患に関
わっている。Baggioliniら、前出を参照されたい。ケモ
カイン作用の阻害物質は、これらの病態を処置する上で
も有用かもしれない。一例として、Broaddusら、J. of
Immunol.、152巻、2960〜2967頁(1994)は、ウサギ肺に
おける急性炎症のモデルである、内毒素誘導性の胸膜炎
での好中球補充（recruitment）を阻害できるＩＬ−8に
対する抗体を記載している。88Ｃ受容体に結合する、ま
たはこれを活性化するリガンドまたはモジュレーター
が、ＨＩＶ感染及びＨＩＶ関連病態の処置に有用である
かもしれないことも、本発明において企図するところで
ある。本発明にて企図される特異的受容体へのケモカイ
ンの結合のモジュレーターは、ケモカインもしくは受容
体に対して作製された抗体、生物学的もしくは化学的小
分子、またはケモカインもしくは受容体の断片に対応す
る合成ペプチドが包含されうる。

【００３０】正常または病理学的免疫反応ならびに、Ｈ
ＩＶ−1、ＨＩＶ−2及びＳＩＶなどのレトロウイルスに
よる感染を包含するウイルス感染をモニターまたは治療
改善することを目的として、哺乳類被験者に88-2Ｂまた
は88Ｃモジュレーターを含有する組成物を投与すること
が、本発明によって企図される。特に、本発明は、製薬
的に容認しうる量の88-2Ｂまたは88Ｃケモカイン受容体
モジュレーターを輸送することによる、炎症性応答、異
常な造血プロセス、及びウイルス感染の鎮静を企図して
いる。本発明はさらに、担体、希釈剤、または薬物を含
んでなる製薬上容認しうる組成物にて、これらの活性物
質を輸送することを企図する。本発明はまた、様々な投
与経路も企図している。例えば、活性物質は、以下の経
路、すなわち、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、経口、
肛門（すなわち、座剤に調剤して）、または経肺（すな
わち、吸入、アトマイザー、ネブライザー等）によって
投与しうる。

【００３１】他の特徴において、本発明により提供され
るＤＮＡ配列の情報によって、相同組換えまたは「ノッ
クアウト」戦略［例えば、Kapecchiら、Science、244
巻、1288〜1292頁(1989)を参照されたい］による、機能
を有する88Ｃもしくは88-2Ｂケモカイン受容体を発現し
ない齧歯類、または受容体の変異体を発現する齧歯類の
開発が可能となる。あるいはクローン化された88-2Ｂま
たは88Ｃ受容体を発現するトランスジェニックマウス
を、周知の実験技術（マウス胚の操作（Manipulating t
he Mouse Embryo）、A Laboratory Manual、Brigid Hoh
an、Frank Costantini及びElizabeth Lacy編(1986) Col
d Spring Harbor Laboratory ISBN 0-87969-175-I）に
よって調製することができる。かかる齧歯類は、88Ｃま
たは88-2Ｂのin vivoの活性を研究するためのモデルと
して有用である。

【００３２】本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施
例を考慮すれば、当業者に明らかになるであろう。

【００３３】

【発明を実施するための最良の形態】以下の実施例が、
本発明を例証するものである。実施例１には、88-2Ｂ及
び88Ｃケモカイン受容体をコードするゲノミックＤＮＡ
の単離を記載する。実施例２には、ヒト88-2Ｂ及び88Ｃ
ならびにマカーク88ＣをコードするｃＤＮＡの単離及び
配列決定を表す。実施例３では、様々な組織における88
-2Ｂ及び88Ｃ受容体の発現パターンを明らかにするノザ
ン分析を記載する。実施例４では、88-2Ｂ及び88Ｃ受容
体の組換え発現を詳説する。実施例５には、Ｃａ⁺⁺流出
アッセイ、ホスフォイノシトール加水分解アッセイ、な
らびに様々なリガンドである可能性を有する物質に応答
した88-2Ｂ及び88Ｃ受容体活性についての結合アッセイ
を記載する。ＨＩＶに対する共受容体としての88Ｃ及び
88-2Ｂの役割を記載する実験を、実施例６及び７に記載
する。88Ｃと免疫反応性を有するモノクローナル及びポ
リクローナル抗体の調製及び特徴付けを、実施例８に記
載する。実施例９には、88-2Ｂまたは88Ｃリガンドまた
はモジュレーターを同定するために計画したさらなるア
ッセイを記載する。

【００３４】［実施例１］本発明の新規ケモカイン受容
体遺伝子をコードする部分的なゲノミッククローンを、
以前に同定された遺伝子に見出される保存配列に基づ
き、且つヒトゲノム内でのこれらケモカイン受容体遺伝
子のクラスター形成（clustering）に基づいて、ＰＣＲ
によって単離した。縮重オリゴヌクレオチドプライマー
を使用して、標準ＰＣＲ法によってゲノミックＤＮＡを
増幅した。

【００３５】ＰＣＲ増幅のための鋳型は、酵母人工染色
体（Yeast Arti-ficial Chromosomes、すなわち、ＹＡ
Ｃ）（Research Gene-tics, Inc.、Huntsville、アラバ
マ、ＹＡＣ Library Pools、カタログ番号第95011 Ｂ）
にクローニングした組換えヒトゲノミックＤＮＡの市販
されている供給源の一つであった。ＹＡＣベクターは、
500〜1000 kbpのインサートに適応できるものである。
最初に、ＹＡＣクローンＤＮＡのプールを、ＣＣＣＫＲ
1をコードする遺伝子に対して特異的なプライマーを使
用したＰＣＲによってスクリーニングした。詳細には、
センス鎖プライマー（ＣＣＣＫＲ1のセンス鎖に対応す
る）である、ＣＣＣＫＲ(2)-5'は配列番号：１５に示さ
れる。プライマーＣＣＣＫＲ(2)-5'は、5'-CGTAAGCTTAG
AGAAGCCGGGATGGGAA-3'の配列からなり、配列で下線を付
したヌクレオチドは、ＣＣＣＫＲ1に対する翻訳開始コ
ドンである。アンチセンス鎖プライマーは、ＣＣＣＫＲ
-3'（ＣＣＣＫＲ1のアンチセンス鎖に対応する）であ
り、その配列は、配列番号：１６に示される。ＣＣＣＫ
Ｒ-3'の配列である5'-GCCTCTAGAGTCAGAGACCAGCAGA-3'
は、ＣＣＣＫＲ1翻訳終止コドン（下線を付した）の逆
相補的配列を含んでいる。検出可能なＰＣＲ産物（すな
わち、ゲル電気泳動でのＤＮＡのバンド）を生じるＹＡ
ＣクローンＤＮＡのプールで、商標権を有する同定スキ
ーム（Research Genetics, Inc.、Huntsville、アラバ
マ）に基づいてＹＡＣクローンの適切なサブプールを同
定した。ＰＣＲ反応は、94℃にて４分間のインキュベー
ションを行うことをもって開始した。配列の増幅は、94
℃にて１分間の変性、55℃にて１分間のアニーリング、
そして72℃にて２分間の伸長の３３サイクルを使用して
成し遂げた。

【００３６】ＹＡＣクローンＤＮＡのサブプールは、次
いで第１回のＰＣＲにおいて使用した条件及びプライマ
ーを使用して、第２回のＰＣＲ反応に供した。サブプー
ルのスクリーニングの結果によって、ＣＣＣＫＲに特異
的なプライマーでのＰＣＲ反応を支持することができる
個々のクローンが同定された。１つのクローンである88
1Ｆ10は、ＰＣＲ及びハイブリダイゼーションによって
調べると、ＣＣＣＫＲ1及びＣＣＣＫＲ2に対する遺伝子
を含む染色体3p21由来のヒトゲノミックＤＮＡの640 kb
を含んでいた。重複するＹＡＣクローンである941Ａ7
は、ヒトゲノミックＤＮＡの700 kbを含んでおり、やは
りＣＣＣＫＲ1及びＣＣＣＫＲ2に対する遺伝子を含んで
いた。それゆえに、これら２つのＹＡＣクローンを使用
して、さらなるマッピング実験を行った。サザン分析に
より、ＣＣＣＫＲ1とＣＣＣＫＲ2とは互いにおよそ100
kb以内に位置していることが明らかになった。

【００３７】ＣＣＣＫＲ1とＣＣＣＫＲ2との遺伝子が極
めて近接していることにより、新規の関連遺伝子がＣＣ
ＣＫＲ1及びＣＣＣＫＲ2に連接しているかもしれないこ
とが示唆された。ＹＡＣクローンの881Ｆ10及び941Ａ7
を含む酵母由来のＤＮＡを鋳型として使用して、何らか
の関連受容体遺伝子を増幅するためにＰＣＲ反応を実施
した。ＰＣＲプライマーとして、縮重オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチ
ドは、ＣＣＣＫＲ1、ＣＣＣＫＲ2、及びＶ28のアライン
メントでの配列比較から推定して、ＣＣケモカイン受容
体の第２の細胞内ループ及び第６の膜貫通ドメインをコ
ードする領域に対応するものであった。Ｖ28は、ケモカ
イン受容体の特徴を呈示するオーファン受容体であるの
で使用した。Ｖ28もまた、ヒト第３染色体にマッピング
されている。Raportら、Gene、163巻、295〜299頁(199
5)。さらに注目すべきは、ＣＣＣＫＲ2の２つのスプラ
イシング変異体であるＣＣＣＫＲ2Ａ及びＣＣＣＫＲ2Ｂ
は、分析に使用した第２の細胞内ループ及び第６の膜貫
通ドメイン領域にて同じであることである。Ｖ28degf2
と称される5'プライマーは、内部BamHI制限部位（下記
参照）を含み、その配列は配列番号：５に示す。プライ
マーＶ28degf2の配列は、規範的な受容体構造の第２の
細胞内ループ領域をコードするＤＮＡに対応している。
Probstら、前出を参照されたい。3'プライマーであるＶ
28degr2は、内部HindIII制限部位（下記参照）を含み、
その配列は配列番号：６に示す。プライマーＶ28degr2
の配列は、規範的な受容体構造の第６の膜貫通ドメイン
をコードするＤＮＡに対応している。

【００３８】増幅されたＰＣＲＤＮＡを、次に、BamHI
及びHindIIIで消化し、規範配列を調べた結果から予測
される断片のサイズに一致するおよそ390 bpの断片を作
製した。エンドヌクレアーゼで消化した後、これらＰＣ
Ｒ断片をpBluescript（Staragene Inc.、La Jolla、カ
リフォルニア）へとクローニングした。合計で５４のク
ローニングされた断片を、自動ヌクレオチド配列分析に
供した。ＣＣＣＫＲ1及びＣＣＣＫＲ2由来の配列に加え
て、本発明の２つの新規ケモカイン受容体遺伝子由来の
配列が同定された。これらの２つの新規ケモカイン受容
体遺伝子を、88-2Ｂ及び88Ｃと命名した。

【００３９】制限エンドヌクレアーゼマッピング及びハ
イブリダイゼーションを利用して、受容体88Ｃ、88-2
Ｂ、ＣＣＣＫＲ1、及びＣＣＣＫＲ2をコードする遺伝子
の相対的な位置をマッピングした。88Ｃに対する遺伝子
は、ヒト染色体3p21でＣＣＣＫＲ2遺伝子からおよそ18
KBPに位置するので、これら４つの遺伝子は近くに連接
している。

【００４０】［実施例２］以下の方法によって、マクロ
ファージｃＤＮＡライブラリーから全長の88-2Ｂ及び88
ＣｃＤＮＡを単離した。先ず、Tjoelkerら、Nature、3
74巻、549〜553頁(1995)に記載されるｃＤＮＡライブラ
リーを、ヒトマクロファージｍＲＮＡからのpMcＲＣＭ
Ｖ（Invitrogen Corp.、San Diego、カリフォルニア）
にて構築した。当該ｃＤＮＡを、88-2Ｂまたは88Ｃに対
応する独特なプライマー対を使用したＰＣＲによって、
88-2Ｂ及び88ＣｃＤＮＡクローンの存在についてスクリ
ーニングした。ＰＣＲのプロトコルは、94℃にて４分
間、最初に変性を行う工程を含むものであった。次い
で、以下の条件の下でＰＣＲを３３サイクル行なってポ
リヌクレオチドを増幅した：94℃にて１分間変性、55℃
にて１分間アニーリング、そして72℃にて２分間伸長。
88-2Ｂに対して特異的な第１のプライマーは、プライマ
ー88-2Ｂ-f1であり、配列番号：１１に示される。これ
は、配列番号：３のヌクレオチド844〜863のセンス鎖に
対応する。88-2Ｂをコードする遺伝子に対して特異的な
第２のＰＣＲプライマーは、プライマー88-2Ｂ-r1であ
り、配列番号：１２に示され、この88-2Ｂ-r1配列は配
列番号：３のヌクレオチド1023〜1042のアンチセンス鎖
に対応する。同様に、88Ｃをコードする遺伝子に対して
特異的な第１のプライマーであるプライマー88Ｃ-f1の
配列は、配列番号：１３に示され、配列番号：１のヌク
レオチド453〜471のセンス鎖に対応する。88Ｃをコード
する遺伝子に対して特異的な第２のプライマーは、プラ
イマー88Ｃ-r3であり、配列番号：１４に示されてお
り、88Ｃ-r3の配列は、配列番号：１のヌクレオチド744
〜763のアンチセンス鎖に対応する。

【００４１】スクリーニングによって、88-2ＢのｃＤＮ
Ａクローンであるクローン777を同定した。クローン777
は、以下の特徴によって判定したところ88-2Ｂの全長の
コード配列を包含する1915 bpのＤＮＡインサートを含
んでいた：当該クローンは、ＡＴＧコドンで開始する長
い読み取り枠を含み、Kozak配列を呈し、そして枠内の
上流終止コドンを有していた。クローン777のＤＮＡ及
びインサートの導き出されたアミノ酸配列を、配列番
号：３及び配列番号：４にそれぞれ表す。88-2Ｂの転写
物は、マクロファージのｃＤＮＡライブラリー中には、
比較的稀少であった。ライブラリーのスクリーニングに
際し、合計３００万と見積もられるクローンからわずか
３つの88-2Ｂクローンのみが同定された。

【００４２】88Ｃケモカイン受容体をコードするｃＤＮ
Ａクローンに対するスクリーニングによって、開始コド
ンと推定されるコドンを包含する、88Ｃの全コード領域
を含むと考えられるクローン101及び134が同定された。
しかしながら、これらのクローンは、開始コドンの実体
を確証するのに必要なさらなる5'配列を欠いていた。88
Ｃの転写物は、マクロファージｃＤＮＡライブラリーに
おいて比較的豊富に存在していた。ライブラリーのスク
リーニングに際して、３０００の転写物当たり１つ（ラ
イブラリー中、合計でおよそ３００万のクローンのう
ち）の88Ｃが存在すると見積もられた。

【００４３】手元にある88Ｃクローン配列を伸長するた
めにＲＡＣＥＰＣＲ（ｃＤＮＡ端部の迅速増幅(Rapid
Amplification of cDNA Ends)）を実施し、それによっ
て88ＣｃＤＮＡの5'端の正確な特徴付けをすすめた。
ヒト脾臓5'-ＲＡＣＥ-readyｃＤＮＡは、Clontech Labo
ratories, Inc.、Palo Alto、カリフォルニアより購入
し、製造業者の推奨事項に従って使用した。ｃＤＮＡ
は、ｃＤＮＡ断片の5'端にアンカー配列を連結すること
によって「5'-ＲＡＣＥ-ready」とした。アンカー配列
は、Clontech Laboratories, Inc.、Palo Alto、カリフ
ォルニアにより供給されたアンカープライマーに相補的
なものである。アンカー配列とアンカープライマーの二
重のポリヌクレオチドには、EcoRI制限部位が含まれて
いる。ヒト脾臓ｃＤＮＡを、鋳型ＤＮＡとして選択し
た。これは、この組織に88Ｃが発現されていることがノ
ザンブロットによって明らかになっていたためである。
ＰＣＲ反応は、94℃にて４分間、試料を変性させること
をもって開始した。次いで、94℃にて１分間変性、60℃
にて４５秒間アニーリング、そして72℃にて２分間伸長
する工程を含む３５サイクルを用いて配列を増幅した。
ＰＣＲの第１回目は、50μlの総反応液容量に2μlの5'-
ＲＡＣＥ-ready脾臓ｃＤＮＡ、1μlのアンカープライマ
ー、及び1μlのプライマー88c-r4（100 ng/μl）を含有
する反応混合液にて実施した。88Ｃに特異的なプライマ
ーである88c-r4（5'-GATAAGCCTCACAGCCCTGTG-3'）は、
配列番号：７に示されている。プライマー88c-r4の配列
は、配列番号：１のヌクレオチド745〜765のアンチセン
ス鎖に対応する。第２回のＰＣＲは、1μlのアンカープ
ライマー及び、以下の配列（5'-GCTAAGCTTGATGACTATCTT
TAATGTC-3'）（配列番号：８に示される）を含むプライ
マー88Ｃ-rlb（100 ng/μl）の1μlと共に1μlの第１Ｐ
ＣＲ反応液を含む反応混合液について実施した。プライ
マー88Ｃ-rlbの配列は、内部HindIIIクローニング部位
（下線部）を含んでいる。そのHindIII部位の3'側の配
列は、配列番号：１のヌクレオチド636〜654のアンチセ
ンス鎖に対応している。このようにして得られたＰＣＲ
産物は、EcoRI及びHindIIIを用いて消化し、1％アガロ
ースゲルにて分画した。およそ700 bpの断片が単離さ
れ、pBluescriptにクローニングされた。最も大きなイ
ンサートを有するクローンを配列決定に供した。あるい
は、市販のＴＡクローニングキット（Invitrogen Cor
p.、San Diego、カリフォルニア）を使用して、その後
のヌクレオチド配列決定用に、ＰＣＲ産物をそのままｐ
ＣＲベクターに連結した。

【００４４】88-2Ｂ及び88ＣｃＤＮＡは、ＰＲＩＳＭ
（登録商標）ReadyReaction DyeDeoxy（登録商標）Term
inator Cycle SequencingKit（Perkin Elmer Corp.、Fo
sterCity、カリフォルニア）及びApplied Biosystems 3
73A ＤＮＡ Sequencerを使用して配列決定した。88-2Ｂ
cＤＮＡ配列を決定するために使用される、配列決定反
応用の二本鎖の鋳型が、クローン777のインサートより
提供された。クローン777のインサートの全配列を決定
し、そして88-2Ｂ cＤＮＡ配列及びアミノ酸配列として
配列番号：３に示している。その配列は1915 bpの長さ
であり、5'非翻訳ＤＮＡの361 bp（配列番号：３のヌク
レオチド1〜361に対応する）、1065 bpのコード領域
（配列番号：３のヌクレオチド362〜1426に対応す
る）、及び3'非翻訳ＤＮＡの489 bp（配列番号：３のヌ
クレオチド1427〜1915に対応する）を含む。前記実施例
１にて述べた88-2ＢのゲノミックＤＮＡは、配列番号：
３のヌクレオチド746〜1128に対応する。88ＣｃＤＮＡ
配列、及び導き出されたアミノ酸配列は、配列番号：１
に示される。88Ｃ cＤＮＡ配列は、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ
ｃＤＮＡのクローン134、及びクローン101から得られた
配列を合わせたものである。ＲＡＣＥ−ＰＣＲｃＤＮ
Ａを、配列番号：１のヌクレオチド1〜654を決定するた
めの配列決定用鋳型として使用したが、それには、配列
番号：１のヌクレオチド1〜9における9 bpの5'非翻訳ｃ
ＤＮＡ配列が独自に同定されていた。ＲＡＣＥＰＣＲ c
ＤＮＡから得られた配列によって、配列番号：１のヌク
レオチド55〜57に最初のメチオニンコドンが位置するこ
とが確認され、しかして、クローン134及びクローン101
が88Ｃコード領域の全長のコピーを含んでいるという結
論が支持された。クローン134は、5'非翻訳ｃＤＮＡの4
5 bp（配列番号：１のヌクレオチド10〜54に対応す
る）、1056 bpの88Ｃコード領域（配列番号：１のヌク
レオチド55〜1110に対応する）、及び3'非翻訳ｃＤＮＡ
の492 bp（配列番号：１のヌクレオチド1111〜1602に対
応する）を含んでいた。クローン101は、5'非翻訳ｃＤ
ＮＡの25 bp（配列番号：１のヌクレオチド30〜54に対
応する）、1056 bpの88Ｃコード領域（配列番号：１の
ヌクレオチド55〜1110に対応する）、及び3'非翻訳ｃＤ
ＮＡの2273 bp（配列番号：１のヌクレオチド1111〜338
3に対応する）を含んでいた。前記実施例１にて述べた8
8ＣのゲノミックＤＮＡは、配列番号：１のヌクレオチ
ド424〜809に対応する。

【００４５】88-2Ｂ及び88Ｃの導き出されたアミノ酸配
列によって、ＧＰＣＲ膜貫通ドメインに対応する７つの
疎水性ドメインを含む、ＧＰＣＲに特異的な疎水性につ
いての概観が明らかになった。他のＧＰＣＲとの配列の
比較によって、一致度の程度も明らかになった。意義深
いことに、88-2Ｂ及び88Ｃの双方の導き出されたアミノ
酸配列は、ケモカイン受容体の配列と最も高い一致度を
有していた。表１に、これらのアミノ酸配列の比較の結
果を表す。

【００４６】

【表１】

【００４７】表１により、88-2ＢはＣＣＣＫＲ1に最も
類似しており（アミノ酸レベルで62％一致）、そして88
Ｃは、ＣＣＣＫＲ2に最も類似している（アミノ酸レベ
ルで72％一致）ことが示される。

【００４８】88-2Ｂ及び88Ｃの導き出されたアミノ酸配
列によって、ＧＰＣＲに特異的な細胞内及び細胞外ドメ
インも明らかになっている。88-2Ｂの細胞外ドメイン
は、配列番号：３及び配列番号：４にて提供されるアミ
ノ酸配列のアミノ酸残基1〜36、93〜107、171〜196、及
び263〜284に対応する。88-2Ｂの細胞外ドメインは、配
列番号：３で、ヌクレオチド362〜469、638〜682、872
〜949、及び1148〜1213に対応するポリヌクレオチド配
列によってコードされている。88Ｃの細胞外ドメイン
は、配列番号：１及び配列番号：２における、アミノ酸
残基1〜32、89〜112、166〜191、及び259〜280を包含す
る。88Ｃの細胞外ドメインは、配列番号：１で、ヌクレ
オチド55〜150、319〜390、550〜627、及び829〜894に
対応するポリヌクレオチド配列によってコードされてい
る。88-2Ｂの細胞内ドメインには、配列番号：３及び配
列番号：４のアミノ酸60〜71、131〜151、219〜240、及
び306〜355が包含される。それらのドメインは、配列番
号：３で、ヌクレオチド539〜574、752〜814、1016〜10
81、及び1277〜1426にそれぞれ対応するポリヌクレオチ
ド配列によってコードされている。88Ｃの細胞内ドメイ
ンには、配列番号：１及び配列番号：２のアミノ酸残基
56〜67、125〜145、213〜235、及び301〜352が包含され
る。88Ｃの細胞内ドメインは、配列番号：１で、ヌクレ
オチド220〜255、427〜489、691〜759、及び955〜1110
に対応するポリヌクレオチド配列によってコードされて
いる。

【００４９】加えて、ヒト88ＣｃＤＮＡの5'及び3'フ
ランキング領域に対応するプライマーを使用して、マカ
ークのゲノミックＤＮＡからＰＣＲによってマカーク88
ＣＤＮＡを増幅した。5'プライマーは、開始のMetコド
ンを含み、そのコドンの直ぐ上流の領域に対応してい
た。3'プライマーは、終止コドンの直ぐ下流の領域に相
補的なものであった。プライマーは、発現ベクターへの
クローニング用の制限酵素部位を含んでいた。5'プライ
マーの配列は、GACAAGCTTCACAGGGTGGAACAAGATG（HindII
I制限部位に下線を付した）（配列番号：１７）であ
り、3'プライマーの配列は、GTCTCTAGACCACTTGAGTCCGTG
TCA（XbaI制限部位に下線を付した）（配列番号：１
８）であった。ＰＣＲ増幅の条件は、94℃にて８分間、
続いて、94℃にて１分間、55℃にて４５秒間、そして72
℃にて１分間の４０サイクルであった。増幅産物は、pc
ＤＮＡ3のHindIII及びXbaI制限部位へとクローニング
し、そしてクローンを得て配列決定した。マカークの全
長のｃＤＮＡ及び導き出されたアミノ酸配列を、それぞ
れ配列番号：１９及び２０に表す。マカークの88Ｃのヌ
クレオチド配列は、ヒト88Ｃ配列と98％の一致度を有し
ている。導き出されたアミノ酸配列は、97％の一致度を
有するものである。

【００５０】［実施例３］88-2Ｂ及び88ＣのｍＲＮＡ発
現パターンをノザンブロット分析によって調べた。

【００５１】様々なヒト組織からのポリＡ⁺ＲＮＡを固
定化した状態で含むノザンブロットは、Clontech Labor
atories, Inc.、Palo Alto、カリフォルニアより購入し
た。詳細には、以下の組織すなわち、心臓、脳、胎盤、
肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、
精巣、卵巣、小腸、結腸及び末梢血白血球を試験に供し
た。

【００５２】88-2Ｂヌクレオチド配列に対して特異的な
プローブを、ｃＤＮＡクローン478から作製した。クロ
ーン478のｃＤＮＡインサートは、配列番号：３のヌク
レオチド641〜1915に対応する配列を含んでいる。プロ
ーブを作製するために、クローン478を消化し、そのイ
ンサートＤＮＡ断片をゲル電気泳動によって単離した。
単離されたインサート断片は、次いで当該技術分野にお
いて知られている技術を使用して、³²Ｐで標識付けした
ヌクレオチドで、放射性同位体による標識付けを行っ
た。

【００５３】88Ｃヌクレオチド配列に対して特異的なプ
ローブを、クローン493に認められるインサートＤＮＡ
断片を単離し、そして放射性同位体による標識付けを行
うことによって作製した。クローン493由来のインサー
ト断片は、配列番号：１のヌクレオチド421〜1359に対
応する配列を含んでいる。再度、³²Ｐで標識付けしたヌ
クレオチドに関わる旧来の技術を使用して、プローブを
作製した。

【００５４】88-2Ｂをプローブとして用いて行ったノザ
ンブロットには、およそ1.8 kbのｍＲＮＡが末梢血白血
球に現れた。88Ｃのノザン分析では、様々なヒト組織に
およそ4 kbのｍＲＮＡが示され、それらのうち、脾臓ま
たは胸腺組織をプローブで探索したものは強いシグナル
が認められ、そして末梢血白血球及び小腸からのｍＲＮ
Ａを分析した場合には、もっと強度の低いシグナルが認
められた。肺組織及び卵巣組織では、88Ｃに対するシグ
ナルは比較的弱かった。

【００５５】ヒトＴ細胞及び造血細胞系における88Ｃの
発現も、ノザンブロット分析によって調べた。ＣＤ4⁺及
びＣＤ8⁺ Ｔ細胞における88Ｃのレベルは非常に高かっ
た。転写物は、骨髄細胞系のＴＨＰ1及びＨＬ−60に比
較的高レベルに存在しており、そしてＢ細胞系のJijoye
にも認められた。加えて、このｃＤＮＡは、ライブラリ
ーサブ画分のＰＣＲ増幅に基づくと、ヒトマクロファー
ジｃＤＮＡライブラリーにて比較的多く転写されてい
た。

【００５６】［実施例４］88-2Ｂ及び88ＣｃＤＮＡ
を、組換え法によって哺乳動物細胞にて発現させた。

【００５７】一過性のトランスフェクション実験のため
には、88Ｃを哺乳動物細胞発現ベクターpＢＪ1へとサブ
クローニングした（Ishi, K.ら、J.Biol.Chem.、270
巻、16435〜16440頁(1995)）。構築体には、効率的な細
胞表面発現のためのプロラクチンシグナル配列、及び発
現されたタンパク質の検出を容易にするために88Ｃのア
ミノ末端にＦＬＡＧエピトープをコードする配列が含ま
れていた。ＦＬＡＧエピトープは、「DYKDDDD」の配列
からなるものである。ＣＯＳ−7細胞を、Lipofectamine
（Life Technology, Inc.、Grand Island、ニューヨー
ク）を使用して製造業者のプロトコルに従って、88Ｃ発
現プラスミドでトランスフェクトした。手短に説明する
と、細胞は、24ウェルのプレートに、ウェル当たり4 x
10⁴ 細胞の密度で播種し、終夜生育した。次いで細胞を
ＰＢＳで洗浄し、各ウェルに1.5μlのリポフェクタミン
に混合した0.3 mgのＤＮＡを含むOpti−ＭＥＭ 0.25 ml
を添加した。37℃にて５時間経過した後、培地を10％Ｆ
ＣＳを含有する培地に交換した。ＦＬＡＧエピトープに
対して特異的なＭ1抗体（Eastman Co.、New Haven、コ
ネチカット）を使用して定量的ＥＬＩＳＡ法によって、
一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ−細胞におい
て、その細胞表面に88Ｃが発現されていることが確認さ
れた。

【００５８】ＦＬＡＧでタグ付けした88Ｃ受容体は、さ
らにトランスフェクション用試薬ＤＯＴＡＰ（N-[1-
[(2,3-ジオレオイロキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル
アンモニウムメチルサルフェート、Boehringer-Mannhei
m, Inc.、Indianapolis、インディアナ）を製造業者の
推奨事項に従って使用して、ヒト胎児腎臓細胞系である
ＨＥＫ−293にも安定にトランスフェクトした。薬剤Ｇ4
18の存在下で、安定な系を選択した。トランスフェクト
されたＨＥＫ−293細胞を、ＦＬＡＧエピトープに対す
るＭ1抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって細胞表面で
の88Ｃの発現について評価した。ＥＬＩＳＡにより、安
定に形質転換されたＨＥＫ−293細胞の細胞表面に、Ｆ
ＬＡＧエピトープを有するタグ付けした88Ｃが発現して
いることが示された。

【００５９】88-2Ｂ及び88ＣｃＤＮＡを、安定なＨＥ
Ｋ−293トランスフェクト体をつくるために使用した。8
8-2Ｂ受容体ｃＤＮＡは、ＰＣＲに基づく戦略を使用し
て、pＲc/ＣＭＶ（Invitrogen Corp.、San Diego、カリ
フォルニア）にてサイトメガロウイルスプロモーターの
後にクローニングした。ＰＣＲ反応のための鋳型は、ク
ローン777中のｃＤＮＡインサートであった。ＰＣＲプ
ライマーは、88-2Ｂ-3（内部XbaI制限部位を含む）及び
88-2Ｂ-5（内部HindIII制限部位を含む）であった。プ
ライマー88-2Ｂ-3のヌクレオチド配列は、配列番号：９
に示され、プライマー88-2Ｂ-5のヌクレオチド配列は、
配列番号：１０に示される。ｃＤＮＡの1104 bpの領域
を増幅した。増幅の後、ＤＮＡをXbaI及びHindIIIを用
いて消化し、そして同様に消化されたpＲc/ＣＭＶへと
クローニングした。この結果得られたプラスミドは、77
7ＸＰ2と名付けられ、これは18 bpの5'非翻訳配列、88-
2Ｂの全コード領域、及び3 bpの3'非翻訳配列を含んで
いる。88Ｃの配列については、ＨＥＫ−293細胞にトラ
ンスフェクトするに先駆けてクローン134における全長
のｃＤＮＡインサートにさらに修飾を施すことはしなか
った。

【００６０】安定に形質転換された細胞系を作出するた
めに、pＲc/ＣＭＶ組換えクローンを、トランスフェク
ション用試薬ＤＯＴＡＰ（N-[1-[(2,3-ジオレオイロキ
シ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルサ
ルフェート、Boehringer-Mannheim, Inc.、Indianapoli
s、インディアナ）を製造業者の推奨事項に従って使用
して、ヒト胎児腎臓細胞系であるＨＥＫ−293にトラン
スフェクトした。薬剤Ｇ418の存在下で、安定な系を選
択した。88-2Ｂ及び88ＣｍＲＮＡを最高のレベルで発
現している安定な細胞系を同定するために、標準的なス
クリーニング方法（すなわち、ノザンブロット分析）を
実施した。

【００６１】［実施例５］Ａ．Ｃａ⁺⁺流出アッセイポリペプチドの発現を分析するために、ケモカイン受容
体活性についての機能性アッセイを用いた。既知のケモ
カイン受容体を通じたシグナル伝達の一般的な特徴は、
シグナルトランスダクションが細胞内カルシウム陽イオ
ンの遊離に関わっていることである。従って、トランス
フェクトされたＨＥＫ−293細胞での細胞内Ｃａ⁺⁺濃度
をアッセイし、88-2Ｂまたは88Ｃ受容体が既知のケモカ
インのいずれかのものに応答するか否かを調べた。

【００６２】88-2Ｂ、88Ｃ（ＦＬＡＧエピトープ配列は
含まない）、または対照のコード領域（ＩＬ８Ｒまたは
ＣＣＣＫＲ2をコードするもの、下記参照のこと）で前
記のごとくに安定に形質転換されたＨＥＫ−293細胞
を、ＭＥＭ＋10％血清中でおよそ90％の周密度までＴ75
フラスコにて生育した。次いで細胞を洗浄し、バーセン
（versene）（0.6 mM ＥＤＴＡ、10 mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄、
0.14 M ＮａＣｌ、3 mMＫＣｌ、及び1 mM グルコー
ス）を用いて回収し、そしてＭＥＭ＋10％血清＋1μM F
ura-2 ＡＭ（Molecular Probes,Inc.、Eugene、オレゴ
ン）中で、室温にて３０分間インキュベートした。Fura
-2 ＡＭは、Ｃａ⁺⁺に感受性を有する染料である。細胞
は、0.9 mM ＣａＣｌ₂及び0.5 mM ＭｇＣｌ₂を含有する
ダルベッコのリン酸緩衝性生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）に
およそ10⁷細胞/mlの濃度で再度懸濁し、蛍光分光光度計
（Hitachi Model Ｆ-4010）を用いて蛍光の変化をモニ
ターした。およそ10⁶の細胞を、キュベット中で1.8 ml
のＤ−ＰＢＳに懸濁し、37℃に維持した。励起波長を４
秒間隔で340から380 nmの間で変化させ、検出波長は510
nmとした。供試化合物は、投入口を介してキュベットに
加え、イオノマイシン添加に伴うＣａ⁺⁺流出の最高値を
測定した。

【００６３】ＩＬ−8ＲＡを発現している細胞でＩＬ−8
を用いて刺激した際に、及びＭＣＰ−1またはＭＣＰ−3
を用いてＣＣＣＫＲ2を刺激した際には、陽性の応答が
観察された。しかしながら、88-2Ｂまたは88Ｃのいずれ
かを発現しているＨＥＫ−293細胞は、以下のケモカイ
ン：ＭＣＰ−1、ＭＣＰ−2、ＭＣＰ−3、ＭＩＰ−1α、
ＭＩＰ−1β、ＩＬ８、ＮＡＰ−2、gro/ＭＧＳＡ、ＩＰ
−10、ＥＮＡ−78、またはＰＦ−4のいずれに曝された
場合においても細胞内Ｃａ⁺⁺濃度の流出が示されること
はなかった。（Peprotech, Inc.、Rocky Hill、ニュー
ジャージー）。

【００６４】さらに感度の高いアッセイを使用して、Ｒ
ＡＮＴＥＳに対するＣａ⁺⁺流出の応答を、88-2Ｂを発現
している、Fura-2 ＡＭを付した細胞で顕微鏡によって
観察した。アッセイには、前記の通りに調製した細胞及
び試薬が包含されていた。ＲＡＮＴＥＳ（活性化調節、
正常Ｔ発現及び分泌（Regulated on Activati-on, Norm
al T Expressed and Secreted））は、好酸球の化学誘
引物質及び活性化物質として同定されているケモカイン
である。Neoteら、前出を参照されたい。このケモカイ
ンは、好塩基球によるヒスタミンの遊離も媒介し、in v
itroで記憶Ｔ細胞に対する化学誘引物質として機能する
ことも示されている。88-2Ｂ受容体活性のモジュレーシ
ョンは、従って、白血球活性化をモジュレートする上で
有用であることが含意される。

【００６５】ＦＬＡＧでタグを付けた88Ｃ受容体をＨＥ
Ｋ−293細胞において発現させ、そしてＣａ⁺⁺流出アッ
セイにて、ケモカイン相互作用について試験した。88Ｃ
の細胞表面での発現は、Ｍ1抗体を使用して、ＥＬＩＳ
Ａによって、及びＦＡＣＳcan分析によって確認した。
ケモカインであるＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−1α、及びＭ
ＩＰ−1βがすべて100 nMの濃度で添加された場合に、8
8Ｃがトランスフェクトされた細胞におけるＣａ⁺⁺流出
を誘導した。

【００６６】Ｃａ⁺⁺流出はさらに、ケモカイン受容体結
合のモジュレーターを同定するためにもデザインされう
る。供試化合物の存在下で、前記した蛍光分析または顕
微鏡による分析に基づくアッセイを実施する。もしＣａ
⁺⁺流出が供試化合物の存在下で増加すれば、その供試化
合物はケモカイン受容体結合の活性化物質である。反対
に、Ｃａ⁺⁺流出の低減によって、当該供試化合物がケモ
カイン受容体結合の阻害物質であるとの同定がなされ
る。

【００６７】Ｂ．ホスファチジルイノシトール加水分
解リガンドまたはモジュレーターのための別のアッセイと
して、Hungら、J.Biol.Chem.、116巻、827〜832頁(199
2)に記載されるように、ホスフォリパーゼＣ活性をモニ
ターすることが挙げられる。先ず、ケモカイン受容体を
発現している宿主細胞を、２４時間、³Ｈ−イノシトー
ルに負荷する。次いで、供試化合物（すなわち、リガン
ドの可能性があるもの）を細胞に添加し、37℃にて１５
分間インキュベートする。次に細胞を20 mMのギ酸に曝
して、加水分解されたホスファチジルイノシトール代謝
の代謝物（すなわち、ホスフォリパーゼＣによって媒介
された加水分解の産物）を安定化及び抽出する。抽出物
は、ＡＧ1Ｘ8陰イオン交換カラム（フォルメート型）を
使用した、陰イオン交換クロマトグラフィーに供する。
イノシトールホスフェートを、2 Mギ酸アンモニウム塩
／0.1 Mギ酸で溶出し、その化合物に会合した³Ｈを液体
シンチレーションスペクトル光学測定法を使用して定量
する。このホスフォリパーゼＣアッセイは、ケモカイン
受容体活性のモジュレーターを同定するためにも利用す
ることができる。このアッセイは、モジュレーターの可
能性がある物質を添加すること以外は上述通りに実施さ
れる。検出可能な標識のレベルが上昇すれば、そのモジ
ュレーターがケモカイン受容体活性の活性化物質である
ことを示唆するであろうし、検出可能な標識のレベルが
低下すれば、そのモジュレーターがケモカイン受容体活
性の阻害物質であることを示唆するであろう。

【００６８】ホスフォリパーゼＣアッセイを実施して、
ＦＬＡＧでタグ付けした88Ｃ受容体のケモカインリガン
ドを同定した。トランスフェクション後およそ２４時間
で、88Ｃを発現しているＣＯＳ−7細胞を、透析したＦ
ＣＳを10％含有するイノシトール不含の培地中で、myo-
[2-³Ｈ]イノシトール（1μCi/ml）を用いて２０〜２４
時間標識付けした。標識付けされた細胞を、10 mMＬｉ
Ｃｌを含有するイノシトール不含のＤＭＥＭで洗浄し、
そして10 mMＬｉＣｌ及び以下のケモカイン、すなわ
ち、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−1β、ＭＩＰ−1α、ＭＣＰ
−1、ＩＬ−8、またはネズミＭＣＰ−1相同体のＪＥの
うちの１つを含有する、イノシトール不含のＤＭＥＭと
37℃にて１時間インキュベートした。イノシトールホス
フェート（ＩＰ）形成は、前節に記載の通りにアッセイ
した。ケモカインと共にインキュベートした後、培地を
吸引除去し、細胞は、20 mMの氷冷したギ酸を0.75 ml添
加することによって溶解した（３０分間）。上清画分
は、Ａｇ1−Ｘ8 Dowexカラム（Biorad、Hercules、カリ
フォルニア）に付し、続いて即座に50 mM Ｈ₄ＯＨを3
ml加えた。次いで、カラムを4 mlの40 mM ギ酸アンモ
ニウム塩で洗浄し、続いて2 Mのギ酸アンモニウム塩で
溶出した。イノシトールホスフェートの総量を、β線放
射を計数することによって定量した。

【００６９】ＩＬ8ＲＡ及びＩＬ8ＲＢなどの、特定のケ
モカイン受容体は、ＣＯＳ−7細胞にてシグナル伝達を
検出することができるに先駆けて外来性のＧタンパク質
と共にトランスフェクトする必要があることが示されて
いるので、88Ｃ受容体は、キメラＧタンパク質のＧqi5
と共に発現させた（Conklinら、Nature、363巻、274〜2
76頁(1993)。Ｇqi5は、スプライシングを受けてＧα_qに
なるＧi（受容体に結合する）のカルボキシル末端の５
つのアミノ酸を有するＧタンパク質である。Ｇqi5と共
にトランスフェクションを行って88ＣがＲＡＮＴＥＳ、
ＭＩＰ−1β、及びＭＩＰ−1αに応答して良好なシグナ
ル伝達を行うが、ＭＣＰ−1、ＩＬ−8、またはネズミＭ
ＣＰ−1相同体のＪＥには応答しないことが明らかにな
った。用量依存性曲線によって、ＲＡＮＴＥＳについて
は1 nM、ＭＩＰ−1βについては6 nM、そしてＭＩＰ−1
αについては22 nMの、ＥＣ₅₀値であることが明らかに
なった。

【００７０】88Ｃは、ＭＩＰ−1βに応答したシグナル
伝達を行うヒトの受容体で最初にクローニングされたも
のである。他のＣＣケモカイン受容体に比べて、ＭＩＰ
−1βは、明らかに独特な細胞での活性化パターンを有
している。それは、Ｔ細胞を活性化するようであるが、
単球は活性化しないらしく（Baggioliniら、前出）、こ
れは受容体刺激試験の結果に一致している。例えば、Ｍ
ＩＰ−1βは、ＣＣＣＫＲ1に結合するが、カルシウム流
出を誘導しない（Neoteら、前出）。対照的に、ＭＩＰ
−1α及びＲＡＮＴＥＳは、ＣＣＣＫＲ1及びＣＣＣＫＲ
5に結合して、シグナル伝達を惹き起こす（ＲＡＮＴＥ
Ｓは、ＣＣＣＫＲ3の活性化も惹き起こす）。ＭＩＰ−1
βは、かくのごとくＣＣケモカインファミリーの他のケ
モカインよりも随分選択性が高いようである。一般的な
前炎症性活性を惹き起こす複数の白血球個体集団なし
で、特定の有益な活性が刺激されうるので（ＨＩＶ感染
の抑制など）、かかる選択性は、治療的に重要なもので
ある。

【００７１】Ｃ．結合アッセイケモカインとの受容体の相互作用にかかる他のアッセイ
は、Ernstら、J.Immunol.、152巻、3541〜3549頁(1994)
によって記載されている結合アッセイを改変したもので
あった。ＭＩＰ−1βは、Bolton及びHunter試薬（二ヨ
ウ素剤、ＮＥＮ、Wilmington、デラウェア）を使用し
て、製造業者の指示に従って標識付けした。接合しなか
ったヨウ素は、ＰＢＳ及びＢＳＡ（1％重量／容量）で
平衡化されたＰＤ−10カラム（Pharmacia）を使用して
溶出することにより、標識付けされたタンパク質から分
離した。比活性は、典型的には2200 Ci/mmoleであっ
た。ポリプロピレンチューブ中にて、総容量で300μl
（50 mM ＨＥＰＥＳ、ｐＨ 7.4、1 mM ＣａＣｌ₂、Ｍｇ
Ｃｌ₂、0.5％ＢＳＡ）とした、ＦＬＡＧエピトープでタ
グ付けした88Ｃをトランスフェクトした、5 x 10⁵のＨ
ＥＫ−293細胞に、¹²⁵Ｉで標識付けしたリガンドを単独
で、または100倍量の過剰の標識付けしていないリガン
ドと共に添加し、150 rpmで攪拌しながら27℃にて９０
分間インキュベートすることによって、平衡結合（equi
lib-rium binding）を実施した。細胞は、Skatronセル
ハーベスター（Skatron Instruments Inc.、Sterling、
バージニア）を使用して、0.3％ポリエチレンイミン及
び0.2％ＢＳＡに予め浸しておいたガラス繊維フィルタ
ーの上に集めた。洗浄後、フィルターを取り出し、ガン
マ線放射を計数することによって結合していたリガンド
を定量した。標識付けしていないリガンドとの競合によ
るリガンド結合性は、5 x 10⁵のトランスフェクトされ
た細胞（前記の通り）を、1.5 nMの放射性同位体で標識
付けしたリガンド及び示唆された濃度の標識付けしてい
ないリガンドとインキュベートすることによって定量し
た。前記のごとくに試料を集め、洗浄し、計数した。デ
ータは、曲線適合（curve-fitting）プログラムであるP
rism（GraphPad Inc.、San Diego、カリフォルニア）及
び反復非回帰曲線プログラムであるＬＩＧＡＮＤ（ＰＭ
220）を使用して分析した。

【００７２】平衡結合アッセイにおいて、88Ｃ受容体
は、放射性同位体により標識付けしたＭＩＰ−1βに、
特異的且つ飽和可能な態様で結合した。Scatchardの方
法によるこの結合の分析によって、1.6 nMの解離定数
（Ｋｄ）が明らかにされた。標識付けしたＭＩＰ−1β
を使用した競合結合アッセイによって、ＭＩＰ−1β
（ＩＣ₅₀＝7.4 nM）、ＲＡＮＴＥＳ（ＩＣ₅₀＝6.9 n
M）、及びＭＩＰ−1α（ＩＣ₅₀＝7.4nM）の高親和性結
合が明らかになり、これは、前記Ｂセクションにおいて
議論したごとき、一過性にトランスフェクトされたＣＯ
Ｓ−7細胞にて得られたシグナル伝達にかかるデータに
一致していた。

【００７３】［実施例６］ケモカインであるＭＩＰ−1
α、ＭＩＰ−1β及びＲＡＮＴＥＳは、ヒト末梢血単核
球細胞及びＰＭ1細胞においてＨＩＶ−1及びＨＩＶ−2
の複製を阻害することが示されている（Cocchiら、前
出）。この発見に鑑みて、そして実施例５に記載した結
果に鑑みて、本発明は、88Ｃ受容体の活性化、またはそ
のリガンド結合によってＨＩＶ感染における防衛的役割
を提供しうることを企図するものである。

【００７４】近年、Ｇタンパク質にカップリングするオ
ーファン受容体であるフシン（fusin）が、ＨＩＶの進
入に対して共受容体として作用できることが報告されて
いる。フシン／ＣＸＣＲ4は、本来の（primary）ＨＩＶ
の受容体であるＣＤ4と組み合わされて、培養Ｔ細胞に
ＨＩＶ感染を明らかに促進する（Fengら、Science、272
巻、872〜877頁(1996)）。フシンとケモカイン受容体の
相同性ならびに88Ｃのケモカイン結合の概観に基づい
て、そして、88ＣがＴ細胞で構成的に発現されており、
マクロファージにて豊富に発現されているので、88Ｃ
は、ウイルス及びＨＩＶ感染に関わっているらしいと考
えられる。

【００７５】ＨＩＶに対する共受容体としての88Ｃ及び
88-2Ｂの機能は、ＣＤ4と共に88Ｃまたは88-2Ｂを発現
する細胞をトランスフェクトし、そしてそのコトランス
フェクトされた細胞をＨＩＶで攻撃することによって調
べた。ＣＤ4及び機能性を有するＨＩＶに対する共受容
体の双方を発現する細胞のみが、感染されるようになっ
た。ＨＩＶの感染は、様々な方法によって調べることが
できる。ＨＩＶ抗原の発現について試験するＥＬＩＳ
Ａ、例えば、Coulter ＨＩＶ−1 _p24抗原アッセイ（米
国特許第4,886,742号）、Coulter Corp.、11800 ＳＷ 1
47th Ave.、Miami、フロリダ 33196が市販されている。
あるいは、供試細胞を、ＨＩＶＬＴＲプロモーターに
付けたＬＡＣＺなどのレポーター遺伝子を発現するよう
に作出することができる［Kimptonら、J.Viol.、66巻、
2232〜2239頁(1992)］。この方法において、ＨＩＶで感
染された細胞は、比色分析アッセイによって検出され
る。

【００７６】88Ｃは、ヒトＣＤ4を発現するように安定
に形質転換しておいたネコ細胞系であるＣＣＣ［Claphe
mら、181巻、703〜715頁(1991)］に一過性にトランスフ
ェクトした（ＣＣＣ−ＣＤ4）。これらの細胞は、88Ｃ
を内在的に発現していないので、ＨＩＶ−1のいずれの
株による感染に対しても正常状態では耐性である。これ
らの実験において、ＣＣＣ/ＣＤ4細胞はリポフェクタミ
ン（Gibco BRL、Gaithersburg、メリーランド）を使用
して発現ベクターpcＤＮＡ3.1（Invitrogen Corp.、San
Diego、カリフォルニア）へとクローニングした88Ｃ
を、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト
を行った後２日目に、細胞をＨＩＶで攻撃した。４日間
インキュベートした後、細胞を固定し、ＨＩＶ感染の指
標としてp24抗原についての染色を行った。これらの細
胞による88Ｃ発現によって、かかる細胞がＨＩＶ−1の
様々な株による感染に対して感受性を有するようになっ
た。これらの株には、共受容体としてフシンではなく88
Ｃのみを使用することが示された初代の（primary）非
シンシチウム誘導性ＨＩＶ−1分離株（Ｍ23、Ｅ80、Ｓ
Ｌ−2及びＳＦ−162）が含まれていた。初代のＨＩＶ−
1の様々なシンシチウム誘導性ＨＩＶ−1分離株（2006、
Ｍ13、2028及び2076）は、共受容体として88Ｃまたはフ
シンのいずれかを使用した。また、２つの樹立されたク
ローンのＨＩＶ−1ウイルス（ＧＵＮ−1及び89.6）は、
88Ｃまたはフシンのいずれかを共受容体として使用し
た。

【００７７】ＨＩＶ−2のある株は所定のＣＤ4陰性細胞
系に感染でき、しかしてＣＤ4以外の受容体とのＨＩＶ
−2の直接的な相互作用が含意されることが報告されて
いる［Claphamら、J.Viol.、66巻、3531〜3537頁(199
2)］。ＨＩＶ−2のある株については、この感染は可溶
性ＣＤ4（sＣＤ4）の存在によって促進される。88-2Ｂ
はＨＩＶ共受容体（すなわち、88Ｃ及びフシン）として
作用する他のケモカイン受容体と高い配列の類似性を共
有しているので、88-2ＢはＨＩＶ−2の共受容体である
らしいと考えられた。ＨＩＶ−2共受容体としての88-2
Ｂの役割を、ＨＩＶ−2株であるＲＯＤ/Ｂを使用して立
証した。ＣＤ4を内在的に発現していないネコのＣＣＣ
細胞を88-2Ｂでトランスフェクトした。これらの実験に
おいて、細胞はリポフェクタミンを使用して88-2Ｂを含
むpcＤＮＡ3.1でトランスフェクトし、そしてＨＩＶ−2
で４８時間感染させた。感染後３日目に、細胞はＨＩＶ
−2エンベロープの糖タンパク質の存在について免疫染
色した。ＨＩＶ−2_ROD/Bによる攻撃の間にsＣＤ4が存在
することで、これらの細胞の感染は１０倍増加した。88
-2Ｂがトランスフェクトされた細胞へのＨＩＶ−2の進
入は、88-2Ｂに対するリガンドの１つであるエオタキシ
ン（eotaxin）400〜800 ng/mlの存在によって阻害する
ことができた。ＣＣＣ/88-2Ｂの感染性の基線レベル
（可溶性ＣＤ4を含まない場合）は、88-2Ｂでトランス
フェクトされなかったＣＣＣ細胞と同等であった。

【００７８】88-2Ｂ及び88ＣのＨＩＶに対する共受容体
としての役割は、88Ｃまたは88-2Ｂを発現するように安
定に形質転換した細胞系を調製し、様々なＨＩＶ及びＳ
ＩＶの株で攻撃することによって確認した。これらの結
果は実施例７に記載する。

【００７９】あるいは、88Ｃ及び88-2Ｂの共受容体とし
ての役割は、生存ウイルスの使用を必要としない実験方
法によって立証することができる。この方法では、88Ｃ
または88-2Ｂ、ＣＤ4及びＬＡＣＺレポーター遺伝子を
共に発現している細胞系を、ＨＩＶエンベロープ糖タン
パク質（ＥＮＶ）及び受容体遺伝子構築体のための転写
因子を共に発現している細胞系と混合する（Nussbaum
ら、J.Virol.、68巻、5411頁(1994)）。機能を有する、
ＨＩＶに対する共受容体を発現している細胞は、ＥＮＶ
を発現している細胞と融合し、それによってレポーター
遺伝子の発現が許容されるであろう。この方法におい
て、比色分析アッセイによるレポーター遺伝子産物の検
出によって、ＨＩＶに対する共受容体としての88Ｃまた
は88-2Ｂの機能が示唆される。

【００８０】ケモカインがウイルス感染を阻害する機構
は、未だ解明されていない。可能性が考えられる１つの
機構としては、ケモカインの結合による受容体の活性化
が挙げられる。ケモカインの結合によって、ウイルス感
染に対して細胞が耐性になり、及び／または、細胞内で
のウイルスの複製が防止されるシグナルトランスダクシ
ョンの事象が細胞内に惹起こされる。インターフェロン
誘導の場合と同様に、細胞がウイルス感染に対して耐性
となるように、または抗ウイルス状態が確立されるよう
に、細胞が分化するのかもしれない。あるいは、第２の
機構としては、ケモカイン結合によって共受容体にウイ
ルスエンベロープ糖タンパク質が接近することが阻害さ
れ、これによる細胞内へのウイルスの侵入の直接的な干
渉がなされることが挙げられる。この機構において、Ｇ
−タンパク質シグナル伝達は、ＨＩＶ感染のケモカイン
抑制には必要でない。

【００８１】ウイルスまたはＨＩＶ感染に対する共受容
体として機能しうる、88Ｃまたは88-2Ｂによる２つの機
構を区別するために、受容体へのケモカイン結合をシグ
ナルトランスダクションから分け、そしてウイルス感染
の抑制へのケモカインの効果を調べる。

【００８２】Ｇ−タンパク質によって媒介されるシグナ
ル伝達を阻害する化合物を添加することによって、リガ
ンド結合をシグナルトランスダクションから分かつこと
ができる。これらの化合物には、例えば、百日咳毒及び
コレラ毒が含まれる。加えて、下流のエフェクターポリ
ペプチドは、ウォートマンニン（wortmannin）などの他
の化合物によって阻害されうる。もしウイルス感染の抑
制にＧ−タンパク質シグナル伝達が関わっているのであ
れば、かような化合物を添加することでケモカインによ
るウイルス感染の抑制は妨げられるであろう。あるい
は、Ｇ−タンパク質のカップリングに必要な、88Ｃまた
は88-2Ｂ受容体の鍵となる残基または受容体ドメイン
を、Ｇ−タンパク質のカップリングを改変または破壊さ
せるが、ケモカイン結合には影響を及ぼさないように改
変または欠失させることができる。

【００８３】これらの条件の下に、ケモカインがウイル
スまたはＨＩＶ感染を抑制できなければ、Ｇ−タンパク
質を通じたシグナル伝達がウイルスまたはＨＩＶ感染の
抑制に必要なのである。しかしながら、もしケモカイン
がウイルス感染を抑制することができれば、その場合は
Ｇ−タンパク質シグナル伝達経路はウイルス感染のケモ
カインによる抑制には不要なのであり、ケモカインの保
護的効果は、ウイルスに対する受容体の利用可能性のケ
モカインによる阻害に起因するかもしれないと考えられ
る。

【００８４】他の研究手段として、88Ｃまたは88-2Ｂに
対して作製した抗体の使用が挙げられる。Ｇ−タンパク
質シグナル伝達を導き出さないことが示されうる、88Ｃ
または88-2Ｂに結合する抗体は、ケモカインまたは受容
体のウイルス結合部位への接近を阻害するかもしれな
い。88Ｃまたは88-2Ｂに対する抗体の存在下にウイルス
感染が抑制されれば、その場合にはケモカインの保護的
効果の機構は、その受容体へのウイルスの接近を阻害す
ることにある。Fengらは、フシン受容体のアミノ末端に
対する抗体は、ＨＩＶ感染を抑制すると報告した（Feng
ら、1996）。

【００８５】［実施例７］ＨＩＶ感染における88Ｃ及び
88-2Ｂの役割の輪郭をさらに明らかにするために、88Ｃ
または88-2Ｂで細胞を安定に形質転換させた。Kimpton
及びEmermen、「Detection of Replication-Competent
and Pseudotyped Human ImmunodeficiencyVirus with a
Sensitive Cell Line on the Basis of Activation of
an Integrated Beta-Galactosidase Gene」J.Virol、66
巻5号、3026〜3031頁(1992)は、以前に指標（indicato
r）細胞系を記載しており、当該細胞は、本明細書にて
ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞とする。ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細
胞は、核に局在したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現
を駆動する、統合されたＨＩＶ−1 ＬＴＲのみならず、
ＣＤ4も発現するように安定に形質転換されているＨｅ
Ｌａ細胞である。細胞でのＨＩＶプロウイルスの統合に
よって、ウイルスのトランス活性化物質であるＴａｔの
生産が導かれ、次にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現
が開始される。in situ でβ−ガラクトシダーゼ活性に
対してＸ−ｇａｌで陽性に染まる細胞の数は、感染細胞
数に直接比例するものである。

【００８６】これらのＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞は、実験
室で馴化したＨＩＶ−1の分離株を検出することができ
るが、初代分離株についてはごくわずかしか検出できず
［Kimpton及びEmermen、前出］、そしてほとんどのＳＩ
Ｖ分離株は検出できない［Chackerianら、「Characteri
zation of a CD4-Expressing Macaque Cell Line that
can Detect Virus After A Single Replication Cycle
and can be infectedby Diverse Simian Immunodefi-ci
ency Virus Isolates」Virology、213巻2号、6499〜650
5頁(1995)］。

【００８７】加えて、Harrington及びGeballe、「Co-Fa
ctor Requirement for Human Immunodeficiency Virus
Type 1 Entry into a CD4-Expressing Human Cell Lin
e」J.Virol、67巻、5939〜5947頁(1993)は、ＣＤ4及び
同じＬＴＲ−β−ガラクトシダーゼ構築体を発現するよ
うに作出されていたＵ373細胞に基づく細胞系を記載し
ていた。この細胞系（本明細書中では、Ｕ373−ＭＡＧ
Ｉとしする）は以前に、ＨＩＶのいずれのＨＩＶ（Ｍま
たはＴ向性（tropic））株でも感染できないが、ＨｅＬ
ａ細胞との融合によって感受性とすることができること
が示されていた［Harrington及びGeballe、前出］。

【００８８】マクロファージまたはＴ細胞向性ウイルス
のいずれかを検出できる指標細胞系を構築するために、
エピトープでタグ付けをした88Ｃまたは88-2Ｂをコード
するＤＮＡを、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩまたはＵ373−ＭＡ
ＧＩ細胞にレトロウイルスベクターを用いた感染によっ
てトランスフェクトし、それぞれＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−
88ＣまたはＵ373−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞系をつくった。
細胞表面での共受容体の発現は、抗ＦＬＡＧＭ1抗体及
びＲＴ−ＰＣＲを使用して生存細胞を免疫染色すること
によって立証した。

【００８９】ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ及びＵ373−Ｍ
ＡＧＩ−88Ｃを構築するために利用した88Ｃ及び88-2Ｂ
遺伝子は、プロラクチンシグナルペプチドと、それに続
く、実施例４に記載したようなＦＬＡＧエピトープをコ
ードする配列を含んでいた。この遺伝子を、レトロウイ
ルスベクターのpBabe-Puro［Morgenstern及びLand、Nuc
leic Acids Research、18巻12号、3587〜3596頁(199
0)］に挿入した。ＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽分類した
（pseudo-typed）タイターの高いレトロウイルスベクタ
ーのストックを、Bartxら、J.Virol、70巻、2324〜2331
頁(1996)に記載のごとくに一過性トランスフェクション
によってつくり、そしてＨｅＬａ−ＭＡＧＩ及びＵ373
−ＭＡＧＩ細胞を感染させるために使用した。0.6μg/m
lのピューロマイシン（ＨｅＬＡ）または1μg/mlのピュ
ーロマイシン（Ｕ373）に対して耐性の細胞を集めた。
各プールには、少なくとも1000の別個のトランスダクシ
ョンの事象が含まれていた。元のＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細
胞の早期継代（第２継代）のストック［Kimpton及びEme
rman、前出］を使用して、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細
胞を作出した。

【００９０】指標細胞系のＨＩＶによる感染は、１２ウ
ェルのプレートにて、前記の通りＤＥＡＥ−Dextranの3
0μg/ml存在下に300μlのウイルスを連続的に10倍に希
釈して実施した［Kimpton及びEmerman、前出］。

【００９１】すべてのＨＩＶ株及びＳＩＶ_mac239は、Ｎ
ＩＨＡＩＤＳ Reference and Reagent Programから入
手した。初代のＨＩＶ−2_7312A［Gaoら、「Genetic Div
ersity of Human Immunodefi-ciency Virus Type 2: Ev
idence for Distinct Sequence Subtypes with Differe
nces in Virus Biology」、J.Virol、68巻11号、7433〜
7447頁(1992)］及びＳＩＶsmPbj1.9［Dewhurstら、「Se
quence Analysis andAcute Pathogenici-ty of Molecul
ar Cloned SIV_s1nm-PBj14」Nature、345巻、636〜640頁
(1990)］の分子クローンは、B.Hahn（ＵＡＢ）から入手
した。他のＳＩＶ_mne分離株はすべてJulie Overbaugh
（U. Washington、Seattle）から入手した。クローニン
グ化したプロウイルス由来のストックは、293細胞の一
過性トランスフェクションによって作製した。他のウイ
ルスのストックは、ヒト末梢血単核細胞にてまたはＣＥ
Ｍｘ174細胞（ＳＩＶストック用）にて、ウイルスを継
代することで作製した。ウイルスストックの標準化は、
ＨＩＶ−1及びＨＩＶ−2/ＳＩＶについてそれぞれ、Ｅ
ＬＩＳＡまたはp24^gag（Coulter Immunology）またはp2
7^gag（Coulter Immunology）によって、製造業者によっ
て提供された標準技術を用いて行った。

【００９２】Ｕ373−ＭＡＧＩ-88Ｃ細胞及びＵ373−Ｍ
ＡＧＩ細胞（対照）は、ＨＩＶ−1のＴ向性株（ＨＩＶ
_LAI）、Ｍ向性株（ＨＩＶ_YU-2）、及びＳＩＶ分離株で
あるＳＩＶ_MAC239を限界希釈して感染させた。感染性
は、ウイルスの単位容量当たりウェル当たりの青色細胞
数を計数することによって測定した（表２）。

【００９３】

【表２】

【００９４】感染後２日目に、細胞を固定し、Ｘ−gal
でβ−ガラクトシダーゼ活性に対する染色を行った。Ｕ
373由来のＭＡＧＩ細胞は、37℃にて１２０分間染色
し、ＨｅＬａ由来のＭＡＧＩ細胞は、37℃にて５０分間
染色した。バックグラウンドたる非感染細胞の染色は、
ウェル当たりおよそ３つの青色細胞を越えることはなか
った。濃青色の細胞のみを計数し、複数の核を有するシ
ンシチウムは、単一の感染細胞として計数した。感染の
タイターは、ウェル当たりの青色細胞の数にウイルスの
希釈率をかけて1 mlに標準化したものである。Ｕ373−
ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞へのＨＩＶ_YU-2のタイターは、2 x
10⁶であった。これに対して、Ｕ373−ＭＡＧＩ−88Ｃ細
胞へのＨＩＶ_LAIのタイターは、100未満であった。しか
して、88Ｃに対する特定のＨＩＶ株の特異性は、４桁の
大きさで変動するものであった。

【００９５】ＳＩＶ_MAC239の感染は、Ｕ373−ＭＡＧＩ
−88Ｃで4 x 10⁵に増大したが、このウイルスは明らか
にＵ373−ＭＡＧＩ細胞を感染した（表２）。

【００９６】次に、一連のクローン化されていない初代
ＨＩＶ株及びクローン化されたＨＩＶ−1のＭ向性株
を、88Ｃを発現している指標細胞系の感染能力について
分析した。

【００９７】前記したように、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ及び
ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞を、様々なＨＩＶ株を限
界希釈して感染させた。２つのクローン化されたＭ向性
ウイルスである、ＨＩＶ_JR-CSF及びＨＩＶ_YU-2は、双方
ともＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃを感染したがＨｅＬａ−
ＭＡＧＩ細胞は感染せず、双方の株が88Ｃを共受容体と
して使用することが示された（表３、注記ｃを参照のこ
と）、しかしながら、これら２つのウイルス株の各々が
ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞を感染する能力には大き
な格差が観察され、すなわち、ＨＩＶ_YU-2については6.
2 x 10⁵ IU/mlであり、ＨＩＶ_JR-CSFについては1.2 x 1
0⁴ IU/mlであった。ウイルスストックの感染性（表３）
は、物理的粒子数（ここでは、ウイルスコアタンパク質
の量で表す）当たりの感染単位数である。加えて、これ
らの２つのクローン化されたウイルス株の感染性は、別
々に調製されたウイルスストックで５０倍を越える相違
があることが観察された。

【００９８】本来のウイルスの分離株の感染性の多様性
について、３つの異なるクレード由来のクローン化され
ていないウイルスストックの異なる１２種を収集したも
のを分析することによってさらに実験した（表３）。地
理学的に別種の起源より由来する、３つのクレードＡ初
代分離株、３つのクレードＥ分離株、及び３つのさらな
るクレードＢ分離株を使用した。すべての９つの株で、
ＨＩＶの初代株は、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞で検
出できたが、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞では検出できなか
った（表３）。しかしながら、感染効率は、ngのp24^gag
当たり５感染単位から、ngのp24^gag当たり１００感染単
位を越えるまで、様々であった（表３）。これらの結果
から、Ｍ向性株の絶対的な感染性はかなり変動するもの
であり、クレードとは無関係であることが示唆される。
このような不一致を説明しうる仮説は、ＣＤ4結合の後
の88Ｃに対する各ウイルス株のＶ3ループの親和性に関
するものでありうる［Trkolaら、Nature、384巻6605
号、184〜187頁(1996)；Wuら、Nature、384巻6605号、1
79〜183頁(1996)］。

【００９９】

【表３】

【０１００】ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞のＨＩＶ−
2及び他のＳＩＶ株検出能力も調べた。ＨＩＶ−2
_Rodは、ＣＤ4が存在しなくても受容体としてフシンを使
用することが報告されている［Endresら、Cell、87巻4
号、745〜756頁(1996)］。ＨＩＶ−2_Rodは、ＨｅＬａ−
ＭＡＧＩ細胞に感染することができるのであるが、その
感染性は、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞で少なくとも
10倍増強される（表４）。ＨｅＬａ細胞は、内在的にフ
シンを発現している。しかして、ＨＩＶ−2_Rodの分子ク
ローンは双向性であり、ＣＸＣＲ4に加えて、その共受
容体の１つとして88Ｃを使用することができる。同様
に、ＨＩＶ−2_7312Aの初代株は、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−
88Ｃ細胞に感染したが、ＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞は感染
せず、ＨＩＶ−1の初代株と同様に、受容体として88Ｃ
を使用していることが示唆される。

【０１０１】

【表４】

【０１０２】試験を行ったＳＩＶ株のいずれも、ＨｅＬ
ａ−ＭＡＧＩ細胞に感染せず（表４）、また、88-2Ｂを
発現しているＨｅＬａ−ＭＡＧＩ細胞に感染したものも
なかった。このことから、Ｕ373細胞でＳＩＶによって
使用される択一的共受容体は、ＨｅＬａ細胞では発現さ
れておらず、またそれは88-2Ｂではないことが示唆され
る。試験を行ったすべてのＳＩＶ株は、ある程度ＨｅＬ
ａ−ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞に感染した（表３）ので、かか
る試験されたＳＩＶ株のすべてが、それらの共受容体の
うちの１つとして少なくとも88Ｃを使用することが示唆
されるものである。

【０１０３】ＨＩＶのＭ向性及びＴ向性株の分類は、従
来より、他の命名に従う「非シンシチウム誘導性」（Ｎ
ＳＩ）及び「シンシチウム誘導性」（ＳＩ）にそれぞれ
関連付けられることがよくある。本明細書に記載の細胞
系に基づくアッセイは、シンシチウム形成に対して感受
性である。感染された細胞は、複数の核を含んだ、大小
の感染巣を形成することができる［Kimpton及びEmerma
n、前出］。

【０１０４】複数の異なるウイルス株及びＵ373−ＭＡ
ＧＩ−88ＣまたはＨｅＬａ−ＭＡＧＩ−88Ｃを使用した
実験によって、正しい共受容体が存在していればすべて
のウイルス株がシンシチウムを形成したので、ＳＩ/Ｎ
ＳＩの命名は意味をなさないことが示唆される。これら
の実験から、向性による示唆よりむしろシンシチウム形
成が、感染細胞における適切な供受容体の存在の指標で
あるらしいことが示される。文献で、非シンシチウム形
成株であると報告されている、特にＳＩＶ_MAC239、ＳＩ
Ｖ_MNEc18、及びＳＩＶ_MNE170のＳＩＶ株でのＨｅＬａ−
ＭＡＧＩ−88Ｃ細胞については、単層に誘導されたシン
シチウムのサイズが、他のいかなるＨＩＶ株によって誘
導されたもののサイズよりも随分大きかったので、その
感染が顕著であった。

【０１０５】［実施例８］88Ｃを特異的に認識するモノ
クローナル抗体を調製した。抗体は、88Ｃのアミノ末端
の２０のアミノ酸に対応するペプチドでマウスを免疫付
けすることによって製造した。ペプチドは、製造業者の
指示（Pierce、Imject マレイミド活性化ＫＬＨ）に従
って、Keyhole Limpet Cyanin（ＫＬＨ）に接合し、完
全フロインドアジュバントに懸濁して５匹のマウスに注
射した。３週間の間隔で不完全フロインドアジュバント
に懸濁した接合ペプチドのさらなる注射を２回行った。
最後の注射から１０日後に、５匹の各々のマウスからの
血清を、ＥＬＩＳＡによって前記２０アミノ酸のペプチ
ドとの免疫反応性について試験した。加えて、血清の免
疫反応性は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により、
293細胞の表面上に発現される完全な88Ｃ受容体に対し
て試験した。最高の抗88Ｃ活性を有するマウスを脾臓細
胞融合用及び標準実験法によるモノクローナル抗体の製
造用に選択した。ＥＬＩＳＡによってペプチドを認識
し、ＦＡＣＳによって293細胞上の88Ｃタンパク質を認
識する抗体を製造する、５つのモノクローナル細胞系
（227Ｋ、227Ｍ、227Ｎ、227Ｐ、227Ｒ）を樹立した。
各抗体は、88Ｃを発現している293細胞のみと反応し、
密接に関連したＭＣＰ受容体（ＣＣＣＫＲ−2）を発現
している293細胞とは反応しないことが示された。各抗
体は、ＣＯＳ細胞で一過性に発現される88Ｃを認識する
ことも示された。

【０１０６】88Ｃに対して、ウサギポリクローナル抗体
も作製した。２羽のウサギに、前記の接合されたアミノ
末端ペプチドを注射した。さらにウサギは、接合アミノ
末端ペプチドで４回の免疫付けを行った。各ウサギ（23
37Ｊ及び2470Ｊ）からの血清を、88Ｃを発現している29
3細胞のＦＡＣＳによって調べた。血清は、293細胞の表
面上にある88Ｃを特異的に認識した。

【０１０７】５つの抗88Ｃモノクローナル抗体を、ＳＩ
Ｖ（ＨＩＶに密接に関連する、サル免疫不全ウイルス）
による細胞の感染をそれら抗体が阻害する能力について
試験した［Lehnerら、Nature Medicine、2巻、767頁(19
96)］。正常時にはＳＩＶによる感染に対して感受性を
有するサルＣＤ4⁺ Ｔ細胞を、１：５に希釈した抗88Ｃ
モノクローナル抗体上清の存在下にＳＩＶ_mac32HJ5クロ
ーンとインキュベートした。逆転写酵素（ＲＴ）検出及
び定量方法（Quan-Ｔ-ＲＴアッセイキット、Amersham、
Arlington Heights、イリノイ）を使用して、９日目に
逆転写酵素（ＲＴ）を定量することによってＳＩＶ感染
を測定した。抗体のうち４つが、ＳＩＶ感染を阻害する
ことができた。すなわち、227Ｋは53％、227Ｍは59％、
227Ｎは47％、そして227Ｐは81％阻害できた。抗体227
Ｒは、ＳＩＶ感染を阻害しなかった。

【０１０８】ヒト88Ｃアミノ末端ペプチドに対して作製
した５つのモノクローナル抗体は、マカーク88Ｃ（配列
番号：Ｘ）（アミノ末端ペプチド領域でヒト88Ｃと異な
る２つのアミノ酸を有する）に対する反応性についても
試験した。ヒト88Ｃ及びマカーク88Ｃのコード領域を、
発現ベクターpcＤＮＡ3（Invitrogen）にクローニング
した。これらの発現プラスミドを、ＤＥＡＥを使用して
ＣＯＳ細胞にトランスフェクトするために使用した。陰
性の対照として、空のベクターを使用した。トランスフ
ェクションから３日後に、細胞を回収して、５つの抗88
Ｃモノクローナル抗体とインキュベートし、そしてＦＡ
ＣＳ用に調製した。その結果、５つの抗体のうち４つ
（227Ｋ、227Ｍ、227Ｎ、227Ｐ）は、マカーク88Ｃを認
識したが、１つ（227Ｒ）は認識しなかった。５つの抗
体はすべて、トランスフェクトされたヒト88Ｃを認識
し、ベクター単独でトランスフェクトした細胞と交叉反
応するものはなかった。

【０１０９】［実施例９］本発明のケモカイン受容体の
リガンド及びモジュレーターを同定するために、さらな
る方法を使用してもよい。１つの実施態様において、本
発明はリガンドのための直接アッセイを企図する。検出
可能に標識付けされた供試化合物を、機能性のコンフォ
メーションにあるケモカイン受容体を呈示している膜調
製物に曝す。例えば、ＨＥＫ−293細胞、または組織培
養細胞を、ケモカイン受容体をコードする発現媒体を用
いてトランスフェクトする。次いで、ケモカイン受容体
を発現しているかかるトランスフェクトされた細胞か
ら、膜調製物を得る。膜調製物は、¹²⁵Ｉで標識付けさ
れた供試化合物（例えば、ケモカイン）に曝し、好適な
条件（例えば、37℃にて１０分間）下でインキュベート
する。次に、いくらか結合した供試化合物とともに、真
空濾過によってフィルター上に膜を集め、結合していな
い供試化合物を除去するために洗浄する。その後、フィ
ルターを液体シンチレーションスペクトル光学測定に供
することによって、結合した供試化合物に会合している
放射性活性を定量する。供試化合物結合の特異性は、標
識付けしていない供試化合物をアッセイ系に増加量存在
させて実験を繰り返し、受容体への結合についての競合
のレベルを知見することによって確認しうる。これらの
結合アッセイによって、ケモカイン受容体結合のモジュ
レーターも同定することができる。先に述べた結合アッ
セイに、以下の改変を加えて実施してもよい。検出可能
に標識付けされた供試化合物に加えて、モジュレーター
の可能性がある物質を膜調製物に曝す。膜に会合した標
識の量の増加によってモジュレーターの可能性を有する
物質は活性化物質であることが示唆され、膜に会合した
標識の量の減少によってモジュレーターの可能性を有す
る物質は阻害物質であることが示唆される。

【０１１０】別の実施態様において、本発明は、Ｇタン
パク質へのケモカイン受容体のカップリングを利用する
受容体リガンドを同定するための間接アッセイを企図す
る。Linderら、Sci.Am.、267巻56〜65頁(1992)に概説さ
れるように、シグナルトランスダクションに際して、活
性化された受容体はＧタンパク質と相互作用し、次に、
Ｇタンパク質を活性化する。Ｇタンパク質は、ＧＤＰを
ＧＴＰに交換することによって活性化される。次いで起
こるＧタンパク質が結合したＧＴＰの加水分解によって
Ｇタンパク質は不活性化される。従って、Ｇタンパク質
のための１つのアッセイでは、［γ-³²Ｐ］−ＧＴＰか
らの³²Ｐの遊離がモニターされる。例えば、本発明にか
かるプラスミドを収容しているおよそ5 x 10⁷のＨＥＫ
−293細胞が、ＭＥＭ＋10％ＦＣＳ中で生育される。生
育培地には、均一にヌクレオチドプールを標識付けする
ために、２時間にわたって5 mCi/mlの［³²Ｐ］−リン酸
ナトリウムが追加される。続いて細胞を、リン酸塩の低
い等張性緩衝液で洗浄する。洗浄後の細胞の一アリコー
トは、次いで供試化合物に曝され、他方細胞の第二のア
リコートは、供試化合物に曝されないことを除いて同様
に処理される。インキュベーション時間（例えば、１０
分間）を経過した後、細胞をペレット化し、溶解して1
M ＬｉＣｌでの展開による薄層クロマトグラフィーを使
用して、ヌクレオチド化合物を分画する。標識付けした
ＧＴＰ及びＧＤＰを、既知の標準物質と共に展開するこ
とによって同定する。標識付けされたＧＴＰ及びＧＤＰ
は、次いで当該技術分野における標準技術であるオート
ラジオグラフィー技術によって定量する。³²Ｐで標識付
けされたＧＤＰが比較的高レベルであれば、供試化合物
がリガンドとして同定される。このタイプのＧＴＰ加水
分解アッセイは、ケモカイン受容体結合のモジュレータ
ーの同定のためにも有用である。前記のアッセイは、モ
ジュレーターの可能性がある物質の存在下に実施され
る。³²Ｐで標識付けされたＧＤＰを生産する、ＧＴＰ加
水分解が相対的に増加することによって惹起こされるシ
グナルの増強によって、受容体活性の相対的な増加が示
唆される。従って、シグナルが増強することによって、
モジュレーターの可能性を有する物質が活性化物質とし
て同定される。逆に、受容体活性の減少の指標たる、³²
Ｐで標識付けされたＧＤＰに対するシグナルが相対的に
低減することによって、ケモカイン受容体結合の阻害物
質として、モジュレーターの可能性を有する物質が同定
される。

【０１１１】Ｇタンパク質エフェクター分子（例えば、
アデニル酸シクラーゼ、ホスフォリパーゼＣ、イオンチ
ャンネル、及びホスフォジエステラーゼ）の活性もま
た、アッセイに適用できる。これらエフェクター分子の
活性のためのアッセイは、以前に述べられている。例え
ば、環状アデノシンモノホスフェート（cＡＭＰ）の合
成を触媒するアデニル酸シクラーゼは、Ｇタンパク質に
よって活性化される。従って、Ｇタンパク質を活性化す
るケモカイン受容体へのリガンド結合が、次にアデニル
酸シクラーゼを活性化し、よって、本発明の組換え宿主
細胞におけるcＡＭＰレベルをモニターすることによっ
て当該リガンド結合を検出することができる。当該技術
分野において理解される適切な対照実験を実行して、細
胞内cＡＭＰレベルの上昇を、リガンドで誘導された受
容体活性の増大に帰することができ、それによってリガ
ンドが同定される。また、当該技術分野において理解さ
れる対照を使用して、cＡＭＰの濃度が相対的に低下す
ることで、受容体活性の阻害物質が間接的に同定されよ
う。cＡＭＰの濃度は、市販の酵素免疫アッセイによっ
て測定することができる。例えば、BioTrakキットは、
競合的免疫アッセイ用の試薬を提供するものである。
（Amersham, Inc.、Arlington Heights、イリノイ）。
製造業者の推奨事項に従ってこのキットを使用して、標
識付けしていないcＡＭＰと、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼを接合したcＡＭＰとの競合を含むように、反応を
設計する。標識付けしていないcＡＭＰは、例えば、本
発明のケモカイン受容体発現している活性化細胞から得
てもよい。２つの化合物を、固定化された抗cＡＭＰ抗
体への結合について競合させる。競合反応の後に、固定
化された西洋ワサビペルオキシダーゼ−cＡＭＰ接合体
をテトラメチルベンジディン/Ｈ ₂Ｏ₂単一ポット基質を
使用した酵素アッセイによって、450 nmに生じる呈色反
応産物の検出を用いて定量する。この結果によって、当
該技術分野における標準的な技術を使用して、標識付け
されていないcＡＭＰのレベル算出の基礎が提供される
のである。ケモカイン受容体へのリガンド結合を同定す
ることに加えて、cＡＭＰアッセイは、ケモカイン受容
体結合のモジュレーターを同定するためにも使用するこ
とができる。本発明の組換え宿主細胞を使用し、ケモカ
イン受容体結合のモジュレーターの可能性を有する物質
を添加して前記の通りにアッセイを実施する。当該技術
分野において理解される対照を使用することによって、
細胞内cＡＭＰレベルの相対的な増加または減少が、ア
デニル酸シクラーゼ活性の活性化または阻害を反映す
る。代わってアデニル酸シクラーゼ活性のレベルは、興
味の対象であるケモカイン受容体の相対的な活性を反映
する。相対的にケモカイン受容体活性のレベルが上昇し
ていれば活性化物質が同定され、相対的に受容体活性の
レベルが低下していればケモカイン受容体活性の阻害物
質が同定される。

【０１１２】本発明を、特定の実施態様に関して記載し
ているが、当業者にあっては変更及び修飾が想起される
であろうことは理解される。従って、本発明は請求の範
囲によってしか限定を受けるべきではない。

【０１１３】

【配列表】(1) 一般情報: (i)出願人: アイコスコーポレーション 98021 ワシントンボウゼル、エス．イー．、20スアベ
ニュー 22021 (ii)発明の名称: ケモカイン受容体物質及び方法 (iii)配列の数: 20 (iv)連絡先住所: (A)名宛人: マーシャル、オトゥール、ジェースティ
ン、マレーアンドボーラン (B)番地: 6300 シアーズタワー, 233 サウスワッカー
ドライブ (C)都市名:シカゴ (D)州名:イリノイ (E)国名:米国 (F)郵便番号: 60606 (v)コンピューター読取形式: (A)媒体:フロッピー（登録商標）ディスク (B)コンピューター: IBM PC互換機 (C)作動システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（登
録商標）（Ｄ）ソフトウェア:パテントインリリース #1.0、
バージョン #1.30 (vi)現出願データ: (A)出願番号: (B)出願日: (C)分類: (viii)弁護士/弁理士情報: (A)氏名:ノーランド、グレタイー. (B)登録番号: 35,302 (C)参照/事件番号: 27866/33670 (ix)通信情報: (A)電話: 312-474-6300 (B)ファックス: 312-474-0448 (2)配列番号:1の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 3383塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: cDNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: CDS (B)存在位置: 55..1110 (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88C ポリヌクレオチド及びアミノ酸
配列」 (xi)配列：配列番号:1: AGAAGAGCTG AGACATCCGT TCCCCTACAA GAAACTCTCC CCGGGTGGAA CAAG ATG 57 Met 1 GAT TAT CAA GTG TCA AGT CCA ATC TAT GAC ATC AAT TAT TAT ACA TCG 105 Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr Ser 5 10 15 GAG CCC TGC CAA AAA ATC AAT GTG AAG CAA ATC GCA GCC CGC CTC CTG 153 Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu Leu 20 25 30 CCT CCG CTC TAC TCA CTG GTG TTC ATC TTT GGT TTT GTG GGC AAC ATG 201 Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met 35 40 45 CTG GTC ATC CTC ATC CTG ATA AAC TGC AAA AGG CTG AAG AGC ATG ACT 249 Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met Thr 50 55 60 65 GAC ATC TAC CTG CTC AAC CTG GCC ATC TCT GAC CTG TTT TTC CTT CTT 297 Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu Leu 70 75 80 ACT GTC CCC TTC TGG GCT CAC TAT GCT GCC GCC CAG TGG GAC TTT GGA 345 Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe Gly 85 90 95 AAT ACA ATG TGT CAA CTC TTG ACA GGG CTC TAT TTT ATA GGC TTC TTC 393 Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe Phe 100 105 110 TCT GGA ATC TTC TTC ATC ATC CTC CTG ACA ATC GAT AGG TAC CTG GCT 441 Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala 115 120 125 GTC GTC CAT GCT GTG TTT GCT TTA AAA GCC AGG ACG GTC ACC TTT GGG 489 Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly 130 135 140 145 GTG GTG ACA AGT GTG ATC ACT TGG GTG GTG GCT GTG TTT GCG TCT CTC 537 Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser Leu 150 155 160 CCA GGA ATC ATC TTT ACC AGA TCT CAA AAA GAA GGT CTT CAT TAC ACC 585 Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr 165 170 175 TGC AGC TCT CAT TTT CCA TAC AGT CAG TAT CAA TTC TGG AAG AAT TTC 633 Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe 180 185 190 CAG ACA TTA AAG ATA GTC ATC TTG GGG CTG GTC CTG CCG CTG CTT GTC 681 Gln Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Val 195 200 205 ATG GTC ATC TGC TAC TCG GGA ATC CTA AAA ACT CTG CTT CGG TGT CGA 729 Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg 210 215 220 225 AAT GAG AAG AAG AGG CAC AGG GCT GTG AGG CTT ATC TTC ACC ATC ATG 777 Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile Met 230 235 240 ATT GTT TAT TTT CTC TTC TGG GCT CCC TAC AAC ATT GTC CTT CTC CTG 825 Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu Leu 245 250 255 AAC ACC TTC CAG GAA TTC TTT GGC CTG AAT AAT TGC AGT AGC TCT AAC 873 Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn 260 265 270 AGG TTG GAC CAA GCT ATG CAG GTG ACA GAG ACT CTT GGG ATG ACG CAC 921 Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His 275 280 285 TGC TGC ATC AAC CCC ATC ATC TAT GCC TTT GTC GGG GAG AAG TTC AGA 969 Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg 290 295 300 305 AAC TAC CTC TTA GTC TTC TTC CAA AAG CAC ATT GCC AAA CGC TTC TGC 1017 Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gln Lys His Ile Ala Lys Arg Phe Cys 310 315 320 AAA TGC TGT TCT ATT TTC CAG CAA GAG GCT CCC GAG CGA GCA AGC TCA 1065 Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gln Gln Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser Ser 325 330 335 GTT TAC ACC CGA TCC ACT GGG GAG CAG GAA ATA TCT GTG GGC TTG 1110 Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gln Glu Ile Ser Val Gly Leu 340 345 350 TGACACGGAC TCAAGTGGGC TGGTGACCCA GTCAGAGTTG TGCACATGGC TTAGTTTTCA 1170 TACACAGCCT GGGCTGGGGG TGGGGTGGGA GAGGTCTTTT TTAAAAGGAA GTTACTGTTA 1230 TAGAGGGTCT AAGATTCATC CATTTATTTG GCATCTGTTT AAAGTAGATT AGATCTTTTA 1290 AGCCCATCAA TTATAGAAAG CCAAATCAAA ATATGTTGAT GAAAAATAGC AACCTTTTTA 1350 TCTCCCCTTC ACATGCATCA AGTTATTGAC AAACTCTCCC TTCACTCCGA AAGTTCCTTA 1410 TGTATATTTA AAAGAAAGCC TCAGAGAATT GCTGATTCTT GAGTTTAGTG ATCTGAACAG 1470 AAATACCAAA ATTATTTCAG AAATGTACAA CTTTTTACCT AGTACAAGGC AACATATAGG 1530 TTGTAAATGT GTTTAAAACA GGTCTTTGTC TTGCTATGGG GAGAAAAGAC ATGAATATGA 1590 TTAGTAAAGA AATGACACTT TTCATGTGTG ATTTCCCCTC CAAGGTATGG TTAATAAGTT 1650 TCACTGACTT AGAACCAGGC GAGAGACTTG TGGCCTGGGA GAGCTGGGGA AGCTTCTTAA 1710 ATGAGAAGGA ATTTGAGTTG GATCATCTAT TGCTGGCAAA GACAGAAGCC TCACTGCAAG 1770 CACTGCATGG GCAAGCTTGG CTGTAGAAGG AGACAGAGCT GGTTGGGAAG ACATGGGGAG 1830 GAAGGACAAG GCTAGATCAT GAAGAACCTT GACGGCATTG CTCCGTCTAA GTCATGAGCT 1890 GAGCAGGGAG ATCCTGGTTG GTGTTGCAGA AGGTTTACTC TGTGGCCAAA GGAGGGTCAG 1950 GAAGGATGAG CATTTAGGGC AAGGAGACCA CCAACAGCCC TCAGGTCAGG GTGAGGATGG 2010 CCTCTGCTAA GCTCAAGGCG TGAGGATGGG AAGGAGGGAG GTATTCGTAA GGATGGGAAG 2070 GAGGGAGGTA TTCGTGCAGC ATATGAGGAT GCAGAGTCAG CAGAACTGGG GTGGATTTGG 2130 TTTGGAAGTG AGGGTCAGAG AGGAGTCAGA GAGAATCCCT AGTCTTCAAG CAGATTGGAG 2190 AAACCCTTGA AAAGACATCA AGCACAGAAG GAGGAGGAGG AGGTTTAGGT CAAGAAGAAG 2250 ATGGATTGGT GTAAAAGGAT GGGTCTGGTT TGCAGAGCTT GAACACAGTC TCACCCAGAC 2310 TCCAGGCTGT CTTTCACTGA ATGCTTCTGA CTTCATAGAT TTCCTTCCCA TCCCAGCTGA 2370 AATACTGAGG GGTCTCCAGG AGGAGACTAG ATTTATGAAT ACACGAGGTA TGAGGTCTAG 2430 GAACATACTT CAGCTCACAC ATGAGATCTA GGTGAGGATT GATTACCTAG TAGTCATTTC 2490 ATGGGTTGTT GGGAGGATTC TATGAGGCAA CCACAGGCAG CATTTAGCAC ATACTACACA 2550 TTCAATAAGC ATCAAACTCT TAGTTACTCA TTCAGGGATA GCACTGAGCA AAGCATTGAG 2610 CAAAGGGGTC CCATATAGGT GAGGGAAGCC TGAAAAACTA AGATGCTGCC TGCCCAGTGC 2670 ACACAAGTGT AGGTATCATT TTCTGCATTT AACCGTCAAT AGGCAAAGGG GGGAAGGGAC 2730 ATATTCATTT GGAAATAAGC TGCCTTGAGC CTTAAAACCC ACAAAAGTAC AATTTACCAG 2790 CCTCCGTATT TCAGACTGAA TGGGGGTGGG GGGGGCGCCT TAGGTACTTA TTCCAGATGC 2850 CTTCTCCAGA CAAACCAGAA GCAACAGAAA AAATCGTCTC TCCCTCCCTT TGAAATGAAT 2910 ATACCCCTTA GTGTTTGGGT ATATTCATTT CAAAGGGAGA GAGAGAGGTT TTTTTCTGTT 2970 CTTTCTCATA TGATTGTGCA CATACTTGAG ACTGTTTTGA ATTTGGGGGA TGGCTAAAAC 3030 CATCATAGTA CAGGTAAGGT GAGGGAATAG TAAGTGGTGA GAACTACTCA GGGAATGAAG 3090 GTGTCAGAAT AATAAGAGGT GCTACTGACT TTCTCAGCCT CTGAATATGA ACGGTGAGCA 3150 TTGTGGCTGT CAGCAGGAAG CAACGAAGGG AAATGTCTTT CCTTTTGCTC TTAAGTTGTG 3210 GAGAGTGCAA CAGTAGCATA GGACCCTACC CTCTGGGCCA AGTCAAAGAC ATTCTGACAT 3270 CTTAGTATTT GCATATTCTT ATGTATGTGA AAGTTACAAA TTGCTTGAAA GAAAATATGC 3330 ATCTAATAAA AAACACCTTC TAAAATAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 3383 (2)配列番号:2の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 352アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: タンパク質 (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88C アミノ酸配列」 (xi)配列：配列番号:2: Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu 20 25 30 Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn 35 40 45 Met Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met 50 55 60 Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu 65 70 75 80 Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe 85 90 95 Gly Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe 100 105 110 Phe Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu 115 120 125 Ala Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe 130 135 140 Gly Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser 145 150 155 160 Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr 165 170 175 Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn 180 185 190 Phe Gln Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu 195 200 205 Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys 210 215 220 Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile 225 230 235 240 Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu 245 250 255 Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser 260 265 270 Asn Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr 275 280 285 His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe 290 295 300 Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gln Lys His Ile Ala Lys Arg Phe 305 310 315 320 Cys Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gln Gln Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser 325 330 335 Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gln Glu Ile Ser Val Gly Leu 340 345 350 (2)配列番号:3の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 1915塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: cDNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: CDS (B)存在位置: 362..1426 (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88-2B ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列」 (xi)配列：配列番号:3: ATAATAATGA TTATTATATT GTTATCATTA TCTAGCCTGT TTTTTCCTGT TTTGTATTTC 60 TTCCTTTAAA TGCTTTCAGA AATCTGTATC CCCATTCTTC ACCACCACCC CACAACATTT 120 CTGCTTCTTT TCCCATGCCG GGTCATGCTA ACTTTGAAAG CTTCAGCTCT TTCCTTCCTC 180 AATCCTTTTC CTGGCACCTC TGATATGCCT TTTGAAATTC ATGTTAAAGA ATCCCTAGGC 240 TGCTATCACA TGTGGCATCT TTGTTGAGTA CATGAATAAA TCAACTGGTG TGTTTTACGA 300 AGGATGATTA TGCTTCATTG TGGGATTGTA TTTTTCTTCT TCTATCACAG GGAGAAGTGA 360 A ATG ACA ACC TCA CTA GAT ACA GTT GAG ACC TTT GGT ACC ACA TCC 406 Met Thr Thr Ser Leu Asp Thr Val Glu Thr Phe Gly Thr Thr Ser 1 5 10 15 TAC TAT GAT GAC GTG GGC CTG CTC TGT GAA AAA GCT GAT ACC AGA GCA 454 Tyr Tyr Asp Asp Val Gly Leu Leu Cys Glu Lys Ala Asp Thr Arg Ala 20 25 30 CTG ATG GCC CAG TTT GTG CCC CCG CTG TAC TCC CTG GTG TTC ACT GTG 502 Leu Met Ala Gln Phe Val Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Thr Val 35 40 45 GGC CTC TTG GGC AAT GTG GTG GTG GTG ATG ATC CTC ATA AAA TAC AGG 550 Gly Leu Leu Gly Asn Val Val Val Val Met Ile Leu Ile Lys Tyr Arg 50 55 60 AGG CTC CGA ATT ATG ACC AAC ATC TAC CTG CTC AAC CTG GCC ATT TCG 598 Arg Leu Arg Ile Met Thr Asn Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser 65 70 75 GAC CTG CTC TTC CTC GTC ACC CTT CCA TTC TGG ATC CAC TAT GTC AGG 646 Asp Leu Leu Phe Leu Val Thr Leu Pro Phe Trp Ile His Tyr Val Arg 80 85 90 95 GGG CAT AAC TGG GTT TTT GGC CAT GGC ATG TGT AAG CTC CTC TCA GGG 694 Gly His Asn Trp Val Phe Gly His Gly Met Cys Lys Leu Leu Ser Gly 100 105 110 TTT TAT CAC ACA GGC TTG TAC AGC GAG ATC TTT TTC ATA ATC CTG CTG 742 Phe Tyr His Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu 115 120 125 ACA ATC GAC AGG TAC CTG GCC ATT GTC CAT GCT GTG TTT GCC CTT CGA 790 Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg 130 135 140 GCC CGG ACT GTC ACT TTT GGT GTC ATC ACC AGC ATC GTC ACC TGG GGC 838 Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Val Thr Trp Gly 145 150 155 CTG GCA GTG CTA GCA GCT CTT CCT GAA TTT ATC TTC TAT GAG ACT GAA 886 Leu Ala Val Leu Ala Ala Leu Pro Glu Phe Ile Phe Tyr Glu Thr Glu 160 165 170 175 GAG TTG TTT GAA GAG ACT CTT TGC AGT GCT CTT TAC CCA GAG GAT ACA 934 Glu Leu Phe Glu Glu Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Pro Glu Asp Thr 180 185 190 GTA TAT AGC TGG AGG CAT TTC CAC ACT CTG AGA ATG ACC ATC TTC TGT 982 Val Tyr Ser Trp Arg His Phe His Thr Leu Arg Met Thr Ile Phe Cys 195 200 205 CTC GTT CTC CCT CTG CTC GTT ATG GCC ATC TGC TAC ACA GGA ATC ATC 1030 Leu Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile 210 215 220 AAA ACG CTG CTG AGG TGC CCC AGT AAA AAA AAG TAC AAG GCC ATC CGG 1078 Lys Thr Leu Leu Arg Cys Pro Ser Lys Lys Lys Tyr Lys Ala Ile Arg 225 230 235 CTC ATT TTT GTC ATC ATG GCG GTG TTT TTC ATT TTC TGG ACA CCC TAC 1126 Leu Ile Phe Val Ile Met Ala Val Phe Phe Ile Phe Trp Thr Pro Tyr 240 245 250 255 AAT GTG GCT ATC CTT CTC TCT TCC TAT CAA TCC ATC TTA TTT GGA AAT 1174 Asn Val Ala Ile Leu Leu Ser Ser Tyr Gln Ser Ile Leu Phe Gly Asn 260 265 270 GAC TGT GAG CGG AGC AAG CAT CTG GAC CTG GTC ATG CTG GTG ACA GAG 1222 Asp Cys Glu Arg Ser Lys His Leu Asp Leu Val Met Leu Val Thr Glu 275 280 285 GTG ATC GCC TAC TCC CAC TGC TGC ATG AAC CCG GTG ATC TAC GCC TTT 1270 Val Ile Ala Tyr Ser His Cys Cys Met Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe 290 295 300 GTT GGA GAG AGG TTC CGG AAG TAC CTG CGC CAC TTC TTC CAC AGG CAC 1318 Val Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg His Phe Phe His Arg His 305 310 315 TTG CTC ATG CAC CTG GGC AGA TAC ATC CCA TTC CTT CCT AGT GAG AAG 1366 Leu Leu Met His Leu Gly Arg Tyr Ile Pro Phe Leu Pro Ser Glu Lys 320 325 330 335 CTG GAA AGA ACC AGC TCT GTC TCT CCA TCC ACA GCA GAG CCG GAA CTC 1414 Leu Glu Arg Thr Ser Ser Val Ser Pro Ser Thr Ala Glu Pro Glu Leu 340 345 350 TCT ATT GTG TTT TAGGTCAGAT GCAGAAAATT GCCTAAAGAG GAAGGACCAA 1466 Ser Ile Val Phe 355 GGAGATGAAG CAAACACATT AAGCCTTCCA CACTCACCTC TAAAACAGTC CTTCAAACTT 1526 CCAGTGCAAC ACTGAAGCTC TTGAAGACAC TGAAATATAC ACACAGCAGT AGCAGTAGAT 1586 GCATGTACCC TAAGGTCATT ACCACAGGCC AGGGGCTGGG CAGCGTACTC ATCATCAACC 1646 CTAAAAAGCA GAGCTTTGCT TCTCTCTCTA AAATGAGTTA CCTACATTTT AATGCACCTG 1706 AATGTTAGAT AGTTACTATA TGCCGCTACA AAAAGGTAAA ACTTTTTATA TTTTATACAT 1766 TAACTTCAGC CAGCTATTGA TATAAATAAA ACATTTTCAC ACAATACAAT AAGTTAACTA 1826 TTTTATTTTC TAATGTGCCT AGTTCTTTCC CTGCTTAATG AAAAGCTTGT TTTTTCAGTG 1886 TGAATAAATA ATCGTAAGCA ACAAAAAAA 1915 (2)配列番号:4の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 355アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: タンパク質 (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88-2B アミノ酸配列」 (xi)配列：配列番号:4: Met Thr Thr Ser Leu Asp Thr Val Glu Thr Phe Gly Thr Thr Ser Tyr 1 5 10 15 Tyr Asp Asp Val Gly Leu Leu Cys Glu Lys Ala Asp Thr Arg Ala Leu 20 25 30 Met Ala Gln Phe Val Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Thr Val Gly 35 40 45 Leu Leu Gly Asn Val Val Val Val Met Ile Leu Ile Lys Tyr Arg Arg 50 55 60 Leu Arg Ile Met Thr Asn Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp 65 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Val Thr Leu Pro Phe Trp Ile His Tyr Val Arg Gly 85 90 95 His Asn Trp Val Phe Gly His Gly Met Cys Lys Leu Leu Ser Gly Phe 100 105 110 Tyr His Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr 115 120 125 Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Val Thr Trp Gly Leu 145 150 155 160 Ala Val Leu Ala Ala Leu Pro Glu Phe Ile Phe Tyr Glu Thr Glu Glu 165 170 175 Leu Phe Glu Glu Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Pro Glu Asp Thr Val 180 185 190 Tyr Ser Trp Arg His Phe His Thr Leu Arg Met Thr Ile Phe Cys Leu 195 200 205 Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile Lys 210 215 220 Thr Leu Leu Arg Cys Pro Ser Lys Lys Lys Tyr Lys Ala Ile Arg Leu 225 230 235 240 Ile Phe Val Ile Met Ala Val Phe Phe Ile Phe Trp Thr Pro Tyr Asn 245 250 255 Val Ala Ile Leu Leu Ser Ser Tyr Gln Ser Ile Leu Phe Gly Asn Asp 260 265 270 Cys Glu Arg Ser Lys His Leu Asp Leu Val Met Leu Val Thr Glu Val 275 280 285 Ile Ala Tyr Ser His Cys Cys Met Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val 290 295 300 Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg His Phe Phe His Arg His Leu 305 310 315 320 Leu Met His Leu Gly Arg Tyr Ile Pro Phe Leu Pro Ser Glu Lys Leu 325 330 335 Glu Arg Thr Ser Ser Val Ser Pro Ser Thr Ala Glu Pro Glu Leu Ser 340 345 350 Ile Val Phe 355 (2)配列番号:5の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 34塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「V28degf2」 (xi)配列：配列番号:5: GACGGATCCA TYGAYAGRTA CCTGGCYATY GTCC 34 (2)配列番号:6の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 32塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「V28degr2」 (xi)配列：配列番号:6: GCTAAGCTTT TRTAGGGDGT CCAYAAGAGY AA 32 (2)配列番号:7の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 21塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88c-r4」 (xi)配列：配列番号:7: GATAAGCCTC ACAGCCCTGT G 21 (2)配列番号:8の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 28塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88c-rlb」 (xi)配列：配列番号:8: GCTAAGCTTG ATGACTATCT TTAATGTC 28 (2)配列番号:9の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 27塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88-2B-3」 (xi)配列：配列番号:9: CCCTCTAGAC TAAAACACAA TAGAGAG 27 (2)配列番号:10の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 30塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88-2B-5」 (xi)配列：配列番号:10: GCTAAGCTTA TCACAGGGAG AAGTGAAATG 30 (2)配列番号:11の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 20塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88-2B-f1」 (xi)配列：配列番号:11: AGTGCTAGCA GCTCTTCCTG 20 (2)配列番号:12の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 20塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88-2B-r1」 (xi)配列：配列番号:12: CAGCAGCGTT TTGATGATTC 20 (2)配列番号:13の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 19塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88C-f1」 (xi)配列：配列番号:13: TGTGTTTGCT TTAAAAGCC 19 (2)配列番号:14の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 17塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「88C-r3」 (xi)配列：配列番号:14: TAAGCCTCAC AGCCCTG 17 (2)配列番号:15の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 28塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「CCCKR1(2)-5’プライマー」 (xi)配列：配列番号:15: CGTAAGCTTA GAGAAGCCGG GATGGGAA 28 (2)配列番号:16の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 25塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA (iv)アンチセンス: イエス (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「CCCKR-3’プライマー」 (xi)配列：配列番号:16: GCCTCTAGAG TCAGAGACCA GCAGA 25 (2)配列番号:17の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 28塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA（ゲノミック） (xi)配列：配列番号:17: GACAAGCTTC ACAGGGTGGA ACAAGATG 28 (2)配列番号:18の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 27塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: DNA（ゲノミック） (xi)配列：配列番号:18: GTCTCTAGAC CACTTGAGTC CGTGTCA 27 (2)配列番号:19の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 1059塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: cDNA (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: misc#feature (D)他の情報: /= 「V28degf2」 (xi)配列：配列番号:19: (ix)配列の特徴: (A)配列を表す記号: CDS (B)存在位置: 1..1056 (xi)配列：配列番号:19: ATG GAC TAT CAA GTG TCA AGT CCA ACC TAT GAC ATC GAT TAT TAT ACA 48 Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Thr Tyr Asp Ile Asp Tyr Tyr Thr 1 5 10 15 TCG GAA CCC TGC CAA AAA ATC AAT GTG AAA CAA ATC GCA GCC CGC CTC 96 Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu 20 25 30 CTG CCT CCG CTC TAC TCA CTG GTG TTC ATC TTT GGT TTT GTG GGC AAC 144 Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn 35 40 45 ATA CTG GTC GTC CTC ATC CTG ATA AAC TGC AAA AGG CTG AAA AGC ATG 192 Ile Leu Val Val Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met 50 55 60 ACT GAC ATC TAC CTG CTC AAC CTG GCC ATC TCT GAC CTG CTT TTC CTT 240 Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu 65 70 75 80 CTT ACT GTC CCC TTC TGG GCT CAC TAT GCT GCT GCC CAG TGG GAC TTT 288 Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe 85 90 95 GGA AAT ACA ATG TGT CAA CTC TTG ACA GGG CTC TAT TTT ATA GGC TTC 336 Gly Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe 100 105 110 TTC TCT GGA ATC TTC TTC ATC ATC CTC CTG ACA ATC GAT AGG TAC CTG 384 Phe Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu 115 120 125 GCT ATC GTC CAT GCT GTG TTT GCT TTA AAA GCC AGG ACA GTC ACC TTT 432 Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe 130 135 140 GGG GTG GTG ACA AGT GTG ATC ACT TGG GTG GTG GCT GTG TTT GCC TCT 480 Gly Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser 145 150 155 160 CTC CCA GGA ATC ATC TTT ACC AGA TCT CAG AGA GAA GGT CTT CAT TAC 528 Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Arg Glu Gly Leu His Tyr 165 170 175 ACC TGC AGC TCT CAT TTT CCA TAC AGT CAG TAT CAA TTC TGG AAG AAT 576 Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn 180 185 190 TTT CAG ACA TTA AAG ATG GTC ATC TTG GGG CTG GTC CTG CCG CTG CTT 624 Phe Gln Thr Leu Lys Met Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu 195 200 205 GTC ATG GTC ATC TGC TAC TCG GGA ATC CTG AAA ACT CTG CTT CGG TGT 672 Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys 210 215 220 CGA AAC GAG AAG AAG AGG CAC AGG GCT GTG AGG CTT ATC TTC ACC ATC 720 Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile 225 230 235 240 ATG ATT GTT TAT TTT CTC TTG TGG GCT CCC TAC AAC ATT GTC CTT CTC 768 Met Ile Val Tyr Phe Leu Leu Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu 245 250 255 CTG AAC ACC TTC CAG GAA TTC TTT GGC CTG AAT AAT TGC AGT AGC TCT 816 Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser 260 265 270 AAC AGG TTG GAC CAA GCC ATG CAG GTG ACA GAG ACT CTT GGG ATG ACA 864 Asn Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr 275 280 285 CAC TGC TGC ATC AAC CCC ATC ATC TAT GCC TTT GTC GGG GAG AAG TTC 912 His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe 290 295 300 AGA AAC TAC CTC TTA GTC TTC TTC CAA AAG CAC ATT GCC AAA CGC TTC 960 Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gln Lys His Ile Ala Lys Arg Phe 305 310 315 320 TGC AAA TGC TGT TCC ATT TTC CAG CAA GAG GCT CCC GAG CGA GCA AGT 1008 Cys Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gln Gln Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser 325 330 335 TCA GTT TAC ACC CGA TCC ACT GGG GAG CAG GAA ATA TCT GTG GGC TTG 1056 Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gln Glu Ile Ser Val Gly Leu 340 345 350 TGA 1059 (2)配列番号:20の情報 (i)配列特徴: (A)長さ: 352アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類: タンパク質 (xi)配列：配列番号:20: Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Thr Tyr Asp Ile Asp Tyr Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu 20 25 30 Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn 35 40 45 Ile Leu Val Val Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met 50 55 60 Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu 65 70 75 80 Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe 85 90 95 Gly Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe 100 105 110 Phe Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu 115 120 125 Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe 130 135 140 Gly Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser 145 150 155 160 Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Arg Glu Gly Leu His Tyr 165 170 175 Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn 180 185 190 Phe Gln Thr Leu Lys Met Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu 195 200 205 Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys 210 215 220 Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile 225 230 235 240 Met Ile Val Tyr Phe Leu Leu Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu 245 250 255 Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser 260 265 270 Asn Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr 275 280 285 His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe 290 295 300 Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gln Lys His Ile Ala Lys Arg Phe 305 310 315 320 Cys Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gln Gln Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser 325 330 335 Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gln Glu Ile Ser Val Gly Leu 340 345 350

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/02 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/566 33/53 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 33/566 Ｎ // Ａ６１Ｋ 39/395 45/00 Ａ６１Ｐ 7/02 45/00 17/06 Ａ６１Ｐ 7/02 19/02 17/06 29/00 19/02 31/12 29/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 31/12 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 15/00 ＣＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者シュウェイッカート，ヴィッキー，エル. アメリカ合衆国 98109 ワシントンシアトルオレンジプレイスノース 1421 (72)発明者レイポート，キャロル，ジェイ. アメリカ合衆国 98021 ワシントンボウゼルエス．イー． 211スストリート 2300

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：４に示されるケモカイン受容
体88-2Ｂのアミノ酸配列をコードする、精製及び単離さ
れたポリヌクレオチド。
【請求項２】前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである請
求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】前記ポリヌクレオチドがゲノミックＤＮ
Ａである請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】前記ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである
請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】前記ポリヌクレオチドが、全体または部
分的に化学合成されたＤＮＡである請求項１記載のポリ
ヌクレオチド。
【請求項６】請求項２記載のポリヌクレオチドのＲＮ
Ａ転写物。
【請求項７】前記ｃＤＮＡが配列番号：３に示される
ＤＮＡを含む、請求項４記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】請求項２記載のＤＮＡを含む、生物学的
機能を有するＤＮＡベクター。
【請求項９】前記ＤＮＡが、ＤＮＡ発現制御配列と作
動可能に連結されている請求項８記載のベクター。
【請求項１０】前記ＤＮＡの発現を許容するように、
請求項１記載のＤＮＡを用いて安定に形質転換またはト
ランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１１】 88-2Ｂポリペプチドを製造するための
方法であって、以下の工程すなわち、請求項１０記載の
宿主細胞を好適な普通培地中で生育し、そして該細胞ま
たは培地から前記ポリペプチドを単離する工程を含む方
法。
【請求項１２】 88-2Ｂポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番
号：３に示されるポリヌクレオチドとストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチド。
【請求項１３】配列番号：４に示されるケモカイン受
容体88-2Ｂのアミノ酸配列を含む、精製及び単離された
ポリペプチド。
【請求項１４】配列番号：４に示される88-2Ｂのアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体産
物。
【請求項１５】請求項１４記載の抗体産物を生産する
ハイブリドーマ。
【請求項１６】配列番号：２０に示されるマカークの
ケモカイン受容体88Ｃのアミノ酸配列をコードする、精
製及び単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである
請求項１６記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】前記ポリヌクレオチドがゲノミックＤ
ＮＡである請求項１７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】前記ポリヌクレオチドがｃＤＮＡであ
る請求項１７記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】前記ポリヌクレオチドが、全体または
部分的に化学合成されたＤＮＡである請求項１６記載の
ポリヌクレオチド。
【請求項２１】請求項１７記載のＤＮＡのＲＮＡ転写
物。
【請求項２２】前記ｃＤＮＡが配列番号：１に示され
るＤＮＡを含む、請求項１９記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】請求項１７記載のＤＮＡを含む、生物
学的機能を有するＤＮＡベクター。
【請求項２４】前記ＤＮＡが、ＤＮＡ発現制御配列と
作動可能に連結されている請求項２３記載のベクター。
【請求項２５】前記ＤＮＡの発現を許容するように、
請求項１７記載のＤＮＡを用いて安定に形質転換または
トランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２６】マカークの88Ｃポリペプチドを製造す
るための方法であって、以下の工程すなわち、請求項２
５記載の宿主細胞を好適な普通培地中で生育し、そして
該細胞または培地から前記ポリペプチドを単離する工程
を含む方法。
【請求項２７】 88Ｃポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、配列番
号：１９に示されるポリヌクレオチドとストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズす
るポリヌクレオチド。
【請求項２８】配列番号：２０に示されるマカークの
ケモカイン受容体88Ｃのアミノ酸配列を含む、精製及び
単離されたポリペプチド。
【請求項２９】配列番号：２０に示される88Ｃのアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体産
物。
【請求項３０】請求項２９記載の抗体産物を生産する
ハイブリドーマ。