JP2001000178A

JP2001000178A - 細胞分離方法及び細胞分離装置

Info

Publication number: JP2001000178A
Application number: JP11176754A
Authority: JP
Inventors: Shuji Terajima; 修司寺嶋; Masaya Sumida; 政哉澄田
Original assignee: Asahi Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 1999-06-23
Filing date: 1999-06-23
Publication date: 2001-01-09

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】フィルター上流側に残留した細胞集団をフィ
ルター内に導入し、回収必要細胞の回収率及び除去対象
細胞の除去率を飛躍的に高める細胞分離方法及び細胞分
離装置の提供。【解決手段】回収必要細胞と除去対象細胞を含む細胞
集団を、回収必要細胞を実質的に捕捉し、除去対象細胞
を実質的に通過させる及び／又は除去対象細胞の一部を
細胞分離フィルター内に強固に捕捉するような細胞分離
フィルター１で濾過し、該細胞分離フィルターを通過し
た除去対象細胞を該細胞分離フィルター下流側へ導出
し、次に該細胞分離フィルターの上流側から該細胞分離
フィルターへ空気を導入して該細胞分離フィルター上流
側に残留した細胞集団を該細胞分離フィルターで濾過
し、更に該細胞分離フィルター下流側から回収液を該細
胞分離フィルターへ導入することにより該細胞分離フィ
ルターに捕捉された回収必要細胞を該細胞分離フィルタ
ー上流側から回収することからなる細胞分離方法及び細
胞分離装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞集団から特定の細
胞を分離する方法及び装置に関する。

【０００２】

【従来技術】近年、白血病などの造血器腫瘍、再生不良
性貧血に見られる造血不能、固形癌の化学療法における
副作用である造血障害に対して、末梢血、骨髄、臍帯血
の中の造血幹細胞を移植することが盛んに行われてい
る。造血幹細胞は移植前まで凍結保存されることが多
く、保存スペース、解凍時の破壊赤血球による副作用が
問題となるため、また造血幹細胞提供者（ドナー）と患
者（レシピエント）の赤血球の型が異なるＡＢＯミスマ
ッチの場合の副作用防止のため、通常凍結前に造血幹細
胞の分離（赤血球除去）が行われている。従来、血液か
ら治療に必要な血球成分を分離する方法として、比重液
（例えばファルマシア社製Ｆｉｃｏｌｌ）を用いる比重
遠心法が採用されている。本法は比重液に原料細胞を重
層させる際に液面を乱してはならない等、非常に熟練を
要する煩雑な操作である。特開昭６１−８４５７７号公
報、特開平２−１３４５６４号公報等で操作の煩雑さを
解決すべく、多くの試みがなされているが、比重液を用
いるという点では変わらず、抜本的な解決には至ってい
ない。また、ヒドロキシエチルスターチと混和して、赤
血球の連銭形成により赤血球を沈降させ、白血球層を分
離する方法がある。本法も作業は煩雑であり、分離性能
も十分とは言えない。最近では、簡便法として、特開昭
５４−１１９０１６号公報、特開昭５７−１４５６６２
号公報等で、血液中の回収必要細胞をフィルターに捕捉
した後、フィルターに振動を与えながら回収液をフィル
ターに通液することにより回収必要細胞を回収するフィ
ルター法が散見されるようになった。一方、血液を保存
する場合、保存する容器内に存在する空気（酸素）は細
胞の代謝速度を増加させ、細胞の生存率、機能を低下さ
せるため、通常容器内の空気はできるだけ除去される。
フィルター法において、上述のような保存血液を処理す
る場合、処理される血液の容器内に空気がほとんどない
ため、フィルターに血液を流す最後の段階で血液容器内
が陰圧になってしまい、それ以上血液が流れず、フィル
ター上流側に血液が残留して有効利用されずに廃棄され
ていた。更に、回収必要細胞の回収率及び除去対象細胞
除去率が低くなるという問題があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、フィ
ルター上流側に残留した細胞集団をフィルター内に導入
し、回収必要細胞の回収率及び除去対象細胞の除去率を
飛躍的に高める細胞分離方法及び細胞分離装置を提供す
ることにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、回収必要細胞と除去対象細胞を含む細胞
集団を、回収必要細胞を実質的に捕捉し、除去対象細胞
を実質的に通過させる及び／又は除去対象細胞の一部を
細胞分離フィルター内に強固に捕捉するような細胞分離
フィルターで濾過し、該細胞分離フィルターを通過した
除去対象細胞を該細胞分離フィルター下流側へ導出し、
更に該細胞分離フィルター下流側から回収液を該細胞分
離フィルターへ導入することにより、該細胞分離フィル
ターに捕捉された回収必要細胞を該細胞分離フィルター
上流側から回収する細胞分離操作について鋭意検討した
結果、細胞集団を貯留する容器内にエアがないために該
細胞分離フィルターで濾過できない該細胞分離フィルタ
ー上流に残留した細胞集団を空気で該細胞分離フィルタ
ーへ送り込むことにより、従来技術では到底達し得なか
ったレベルにまで回収必要細胞の回収率及び除去対象細
胞の除去率を著しく向上できるという、驚くべき効果を
見出し、本発明を完成させたものである。即ち、本発明
は、回収必要細胞と除去対象細胞を含む細胞集団を、回
収必要細胞を実質的に捕捉し、除去対象細胞を実質的に
通過させる及び／又は除去対象細胞の一部を細胞分離フ
ィルター内に強固に捕捉するような細胞分離フィルター
で濾過し、該細胞分離フィルターを通過した除去対象細
胞を該細胞分離フィルター下流側へ導出し、次に該細胞
分離フィルターの上流側から該細胞分離フィルターへ空
気を導入して該細胞分離フィルター上流側に残留した細
胞集団を該細胞分離フィルターで濾過し、更に該細胞分
離フィルター下流側から回収液を該細胞分離フィルター
へ導入することにより該細胞分離フィルターに捕捉され
た回収必要細胞を該細胞分離フィルター上流側から回収
することからなる細胞分離方法である。また、本発明
は、回収必要細胞を実質的に捕捉し、除去対象細胞を実
質的に通過させる及び／又は除去対象細胞の一部を細胞
分離フィルター内に強固に捕捉する、少なくとも入口と
出口を有する細胞分離フィルターと、該細胞分離フィル
ターの入口より上流に接続される、回収必要細胞と除去
対象細胞を含む細胞集団を該細胞分離フィルターに導入
する手段と、該細胞分離フィルターの出口より下流に接
続される、該細胞分離フィルターを通過した除去対象細
胞を貯留するする手段と、該細胞分離フィルターの出口
より下流に接続される、該細胞分離フィルターに回収液
を導入する手段と、該細胞分離フィルターの入口より上
流に接続される、該細胞分離フィルターの入口側から該
細胞分離フィルターに捕捉された回収必要細胞を回収す
る手段と、該細胞分離フィルターの上流側に空気を導入
する手段を装置内に有する細胞分離装置である。

【０００５】本発明で言う、回収必要細胞と除去対象細
胞を含む細胞集団とは、骨髄、末梢血、臍帯血等、造血
幹細胞移植や免疫療法等に有用で分離回収を必要とする
細胞と、回収必要細胞と混在していると凍結解凍時の破
壊細胞によるドナーへの副作用や回収必要細胞の低回収
等の悪影響を持つ細胞が混在した細胞集団のことを言
う。本発明における回収必要細胞と除去対象細胞を含む
細胞集団の例としては、骨髄、末梢血、臍帯血あるいは
これらを遠心分離等により粗分離したものが挙げられ
る。また、回収必要細胞と除去対象細胞の組み合わせの
例をいくつか示す。回収必要細胞が白血球であり、除去
対象細胞が赤血球、血小板の場合、白血球は細胞分離フ
ィルターに捕捉され、赤血球、血小板は通過及び／又は
強固に捕捉し、回収液にて細胞分離フィルターに捕捉さ
れた白血球が回収される。また、回収必要細胞がリンパ
球であり、除去対象細胞が赤血球、血小板、顆粒球、単
球の場合、リンパ球は細胞分離フィルターに捕捉され、
赤血球、血小板、顆粒球、単球は通過及び／又は強固に
捕捉し、回収液にて細胞分離フィルターに捕捉されたリ
ンパ球が回収される。また、回収必要細胞がＣＤ３４陽
性細胞であり、除去対象細胞が赤血球、血小板、ＣＤ３
４陰性細胞である場合、ＣＤ３４陽性細胞は細胞分離フ
ィルターに捕捉され、赤血球、血小板、ＣＤ３４陰性細
胞は通過及び／又は強固に捕捉し、回収液にて細胞分離
フィルターに捕捉されたＣＤ３４陽性細胞が回収され
る。本発明で言う細胞分離フィルターとは、回収必要細
胞を実質的に捕捉し、除去対象細胞を実質的に通過させ
る及び／又は除去対象細胞の一部を細胞分離フィルター
内に強固に捕捉するフィルターを言う。本発明で言う回
収必要細胞を実質的に捕捉するとは、細胞集団中の回収
必要細胞の６０％以上を捕捉することを言う。本発明で
言う除去対象細胞を実質的に通過させるとは、細胞集団
中の除去対象細胞の６０％以上を通過させることを言
い、また除去対象細胞の一部を強固に捕捉するとは、細
胞分離フィルター内に捕捉された除去対象細胞の内、６
０％以上が回収液を細胞分離フィルターに導入後でも細
胞分離フィルター内に残留することを言う。

【０００６】本発明に用いる細胞分離フィルターとして
は、濾材を容器に充填したものが挙げられる。濾材とし
ては、水不溶性であればいかなる材質でも使用可能であ
るが、成形性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ま
しいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエス
テル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウ
レタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸
セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然
高分子、ハイドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、
チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン等の金属が
挙げられる。また、これらの濾材はこのままでも用いら
れるが、必要に応じ、アミノ酸、ペプチド、糖タンパク
（抗体、接着分子等のバイオリガンドを含む）といった
特定の細胞に親和性のあるリガンドを固定してもよい。
また、細胞分離フィルターに血小板通過性を付与する場
合、例えばＷＯ８７／０５８１２公報で提案されている
ように、非イオン性親水基と塩基性含窒素官能基とを有
する合成高分子等で濾材表面を改質してもよい。また、
濾材の形状としては粒状、繊維塊、織布、不織布、平
板、スポンジ状多孔質体等が挙げられるが、体積あたり
の表面積が大きいという点で繊維塊、織布、不織布、ス
ポンジ状多孔質体が好ましい。本発明で言う細胞分離フ
ィルターの上流側とは、細胞集団が細胞分離フィルター
に導入され、回収液が導出される側のことを言い、一
方、細胞分離フィルター下流とは、細胞集団が細胞分離
フィルターで濾過された濾液が導出され、回収液が導入
される側のことを言う。

【０００７】本発明では、先ず回収必要細胞と除去対象
細胞を含む細胞集団を、細胞分離フィルター上流側から
導入し、回収必要細胞をフィルターに実質的に捕捉し、
除去対象細胞を実質的に通過させる及び／又は除去対象
細胞の一部を細胞分離フィルター内に強固に捕捉する。
細胞集団を貯留する容器内の細胞集団が少なくなると、
該容器内が陰圧になりそれ以上細胞集団が流れなくな
る。即ち、細胞集団がフィルター上流側に残留する。本
発明では次に、空気をフィルターの上流側に入れること
により、フィルター上流側に残留した細胞集団をフィル
ター下流側に流す。この操作により、後述する回収操作
後、驚くほど混入する除去対象細胞が減り、回収必要細
胞の回収率が向上することが判った。本発明では次に、
回収液を細胞分離フィルターに導入して、細胞分離フィ
ルターに捕捉された回収必要細胞を回収する。細胞分離
フィルターに回収液を導入する方法としては、落差によ
る方法、バッグを押しつぶす方法、ローラーポンプを用
いる方法等が挙げられる。更に、回収必要細胞の回収率
をより高めるために、フィルターに振動を加えるとか、
ストップドフロー等を行ってもよい。回収液の流速は、
せん断応力を高め、回収必要細胞を高率で回収するため
にできるだけ高速が好ましいが、内圧上昇による細胞分
離フィルターとチューブ等の接続部のはずれや、回収必
要細胞へのダメージを起こさない流速に制御することが
好ましい。本発明で用いる回収液としては、目的細胞の
損傷がなく、かつ高率に回収可能なものが好ましい。好
ましいものを例示すると、市販の生理食塩水、ＰＢＳ
（リン酸緩衝液）やＨＢＳＳ（ハンクス液）等の緩衝
液、ＲＰＭＩ１６４０等の細胞培養用培地、ポリエチレ
ングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアル
コール等の合成高分子溶液、メチルセルロース、ゼラチ
ン、ヒドロキシエチルスターチ、デキストラン、キチン
誘導体、コラーゲン、フィブロネクチン、アルブミン、
グロブリン等の天然高分子溶液、グルコース、サッカロ
ース、マルトース、ソルビトール、グリセリン、ジメチ
ルスルホキシド等の有機物溶液及びこれらの混合物が挙
げられる。また、２価カチオンを除去して細胞剥離を容
易にする目的でキレート剤が含有されていてもよい。デ
キストランやヒドロキシエチルスターチ等の高分子溶液
は細胞外凍害保護剤としても機能するため、そのまま或
いはＤＭＳＯ等の細胞内凍害保護剤を更に添加すること
で凍結保存も可能である上、生理食塩水等に比し粘性を
上げることができ、回収時のせん断応力を向上できるた
め、我々の評価では好結果を得ており、回収液としてよ
り好ましい。以上述べた操作を行うことにより、回収必
要細胞と除去対象細胞を含む細胞集団からの回収必要細
胞の高回収率及び、除去対象細胞の高除去率が得られ
る。更に請求項２に記載されているように、回収必要細
胞と除去対象細胞を含む細胞集団を細胞分離フィルター
で濾過する際に該細胞分離フィルター下流へ押し出され
る、該細胞分離フィルター内と該細胞分離フィルター上
流及び下流の導管内の空気により該細胞分離フィルター
上流側に残留した細胞集団を該細胞分離フィルターへ送
り込むことにより、ほぼ完全に細胞集団を細胞分離フィ
ルターで処理することができるようになるため、最も高
い回収必要細胞の回収率及び除去対象細胞の除去率が得
られ、最も好ましい。

【０００８】以下、本発明を実施するにあたり、好まし
い細胞分離装置の態様について詳細に説明する。本発明
で言う細胞分離フィルターの入口より上流に接続され
る、回収必要細胞と除去対象細胞を含む細胞集団を細胞
分離フィルターに導入する手段とは、細胞集団を貯留す
る容器等に接続し得るもの、または細胞集団の存在する
生体組織に接続し得るものである。前者の具体例を挙げ
ると、例えば、細胞集団を貯留している容器が血液バッ
グであれば、スパイク針付きチューブ、ルアーアダプタ
ー（オス、メス）付きチューブ、或いは無菌接続器によ
る接続（以下「ＳＣＤ接続」という）を行うのであれば
単なるチューブ、というように適宜選択する。また、細
胞集団を貯留している容器が針付きシリンジであれば、
穿刺可能なセプタム付きチューブ、針無しでルアー口を
有するシリンジであれば、ルアーアダプター（メス）と
いうように上記手段を適宜選択する。後者の具体例を挙
げると、例えば臍帯血を対象とした場合、当該生体組織
は臍帯及び／又は胎盤であり、これらを穿刺することが
可能な金属針の付いたチューブが挙げられる。チューブ
の場合は、途中に流通開閉のためのクランプ、流量調整
のためのローラークランプ、凝集塊除去のためのメッシ
ュチャンバー、流速を付与するためのシリンジ（流路切
り替え手段を含む）等を有していても良い。また、シリ
ンジの場合、チューブを介さず細胞分離フィルターの入
口に直接接続しても良い。本発明で言う細胞分離フィル
ターの出口より下流に接続される、該細胞分離フィルタ
ーから排出された除去対象細胞を貯留する手段とは、除
去対象細胞を貯留する容器を予め接続しておくか、後か
ら接続可能とするかにより以下のように分類される。即
ち、バッグに回収する場合は、予めバッグを接続してお
くか、バッグと接続可能な手段、即ちスパイク針付きチ
ューブ、ルアーアダプター（オス、メス）付きチュー
ブ、或いはＳＣＤ接続を行うのであれば単なるチューブ
というように上記手段を適宜選択する。一方、コニカル
チューブに回収する場合は、先端が開放された手段であ
ればよく、ルアー口のシリンジで回収する場合はルアー
アダプター（メス）、三方活栓等を用いる。本発明で言
う細胞分離フィルターの出口より下流に接続される、該
細胞分離フィルターに回収液を導入する手段とは、細胞
分離フィルターに導入する回収液を入れた容器を予め接
続しておくか、後から接続可能とするかにより、また液
体の導入手段により分類される。細胞分離フィルターに
導入する回収液を入れた容器を後から接続する場合、シ
リンジを用いる場合はシリンジが接続可能である穿刺可
能なセプタム付きチューブ、ルアーアダプター（メス）
付きチューブ、三方活栓付きチューブ等が挙げられる。
バッグを用いる場合は、バッグと接続可能な手段、即
ち、スパイク付きチューブ、ルアアダプター（オス、メ
ス）付きチューブ、或いはＳＣＤ接続を行うのであれば
単なるチューブというように上記手段を適宜選択する。
また、シリンジの場合、チューブを介さず細胞分離フィ
ルターの出口に直接接続してもよい。本発明で言う細胞
分離フィルターの入口より上流に接続される、該細胞分
離フィルターの入口側から該細胞分離フィルターに捕捉
された回収必要細胞を回収する手段とは、細胞分離フィ
ルターから流出した細胞をいかなる容器で回収するかに
より、以下のように分類される。即ち、バッグに回収す
る場合は、予めバッグを接続しておくか、バッグと接続
可能な手段、即ちスパイク針付きチューブ、ルアーアダ
プター（オス、メス）付きチューブ、或いはＳＣＤ接続
を行うのであれば単なるチューブというように上記手段
を適宜選択する。このときのバッグが凍結に耐えうるも
の、例えば凍結バッグ等は、回収後に細胞を凍結バッグ
に移す作業が省けるので好ましい。凍結バッグの例とし
ては、「クリオサイト」（バクスター社製）、「セルフ
リーズバッグ」（チャーターメド社製）、「ヘモフリー
ズ」（ＮＰＢＩ社製）等の凍結バッグが挙げられる。一
方、コニカルチューブに回収する場合は、先端が開放さ
れた手段であればよく、ルアー口のシリンジで回収する
場合はルアーアダプター（メス）、三方活栓等を用い
る。また、シリンジの場合、チューブを介さず細胞分離
フィルターの入口に直接接続してもよい。

【０００９】本発明で言う細胞分離フィルターの上流側
に空気を導入する方法としては、細胞分離装置外部の空
気を利用する場合と、細胞分離装置内部の空気を利用す
る場合に分けられる。細胞分離装置外部の空気を利用す
る場合を、図１を用いて例示する。１は細胞分離フィル
ター、２は回収必要細胞と除去対象細胞を含む細胞集団
を細胞分離フィルターに導入する手段であり、２−１は
細胞集団を貯留する容器に接続する手段、２−２は導
管、２−３は閉鎖手段、３は細胞分離フィルターを通過
した除去対象細胞を貯留する手段であり、３−１は導
管、３−２は閉鎖手段、３−３は除去対象細胞を貯留す
る容器、４は細胞分離フィルターに回収液を導入する手
段、５は細胞分離フィルターに捕捉された回収必要細胞
を回収する手段、６は空気を導入する手段である。図１
の装置での細胞分離方法を以下に示す。まず、閉鎖手段
２−３を閉じ、細胞集団を貯留する容器に接続する手段
２−１を細胞集団を貯留する手段に、回収必要細胞を貯
留する容器に接続する手段５に回収必要細胞を貯留する
容器を接続する。次に、細胞集団を細胞分離フィルター
１で濾過し、除去対象細胞を貯留する容器３−３に細胞
分離フィルター１を通過した除去対象細胞を回収する。
細胞集団を貯留する容器が空になったら、空気を導入す
る手段６により細胞分離装置外の空気を細胞分離装置内
に流入して細胞分離フィルター１上流に残留した細胞集
団を細胞分離フィルター１へ導入する。最後に閉鎖手段
２−３及び３−２を閉じ、細胞分離フィルターに回収液
を導入する手段４より回収液を注入して細胞分離フィル
ター１に捕捉された回収必要細胞を、回収必要細胞を貯
留する容器に回収する。細胞分離装置外部の空気を利用
する場合の空気を導入する手段６は、空気の遮蔽、流入
を制御するシール部材を有しており、細胞集団を細胞分
離フィルターで濾過する際は細胞分離装置系内に空気が
流入するのを遮蔽し、その後細胞分離フィルター上流に
残留する細胞集団を細胞分離フィルターへ導入する際に
細胞分離装置系内に空気を流入させる機能を有し、細胞
分離フィルターより上流に位置する。具体的には、シリ
コンゴム等で系内への空気の流入を遮蔽し、注射針をそ
のゴムに穿刺して系外の空気を系内に流入させるもの、
ゴム栓やキャップ等で系内への空気の流入を遮蔽し、そ
れらを取り去ることで系外の空気を系内に流入させるも
の等が挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。細胞分離装置外部の空気を利用する場合の空気を導
入する手段としては、下記のものも含まれる。例えば、
図２は、細胞集団を貯留する手段である穿刺針の縦断面
図であるが、空気を導入する手段６が、細胞集団が流通
する流路７に連通し、細胞集団を貯留する容器に穿刺さ
れた穿刺部分８より下に位置するもの、図３のようにア
グリゲート除去手段９に具備されているもの、図４のよ
うに導管２−２から分岐して設置されているもの等であ
る。空気を導入する手段が、細胞分離フィルターに具備
されているものとしては、図５のように細胞集団流入側
のハウジング１１に設置されており、該細胞分離フィル
ター１の細胞集団流入空間１２と連通するものが挙げら
れる。図２の場合、空気を導入する手段６が細胞集団を
貯留する手段に最も近く、細胞分離フィルターに残留す
る血液を最も多く細胞分離フィルターへ送り込むことが
でき、好ましい。また、細胞分離装置外部の空気を利用
する場合の空気を導入する手段は、図６のように除菌作
用を有する多孔質膜１５と空気の遮蔽、流入を制御する
シール部材１６を有しているものも含まれ、細胞分離装
置内に無菌空気を導入できるため、無菌的に細胞を分離
したい場合には好ましい。本発明で言う除菌作用を有す
る多孔質膜とは、通気が容易でバクテリアやウィルスの
系内への混入を防止可能な孔径を有するもので、０．１
〜０．６μｍの孔径が好ましい。また、万一細胞集団や
血液に接触しても、湿らず通気が可能な疎水性のものが
好ましい。具体的には市販の滅菌用フィルター（例えば
アドバンテック東洋社製ＤＩＳＭＩＣ）にキャップを付
け、そのキャップを開閉するもの、シリコンゴム等で系
内への空気の流入を遮蔽し、前述の多孔質膜を具備した
通気針をそのゴムに穿刺して無菌空気を系内に流入させ
るもの等が挙げられるが、これらに限定されるものでは
ない。

【００１０】細胞分離装置内部の空気を利用する場合を
図７を用いて例示する。図７は、除去対象細胞を貯留す
る容器３−３に移動した、細胞分離フィルター１とその
上流及び下流の導管２−２及び３−１内部の空気を利用
する場合である。６−１は除去対象細胞を貯留する容器
３−３と導管２−２をつないだ導管、６−２は逆止弁で
ある。この場合の細胞分離方法を以下に述べる。まず、
閉鎖装置２−３を閉じ、細胞集団を貯留する容器に接続
する手段２−１を細胞集団を貯留する容器に、細胞分離
フィルターに捕捉された回収必要細胞を回収する手段５
に回収必要細胞を貯留する容器を接続する。次に、閉鎖
手段２−３を開け、細胞集団を細胞分離フィルター１で
濾過し、除去対象細胞を貯留する容器３−３に細胞除去
フィルター１を通過した除去対象細胞を回収する。次に
閉鎖手段を閉じ、除去対象細胞を貯留する容器３−３に
ある、細胞集団により押し出された導管２−２及び３−
１や細胞分離フィルター１内部の空気を、導管６−１を
経由して細胞集団を貯留する容器に一旦貯留する。次
に、閉鎖手段２−３、３−２を開き、前記細胞集団を貯
留する容器に一旦貯留した空気を細胞分離フィルター１
に導入して、細胞分離フィルター１上流に残留した細胞
集団を濾過させる。最後に、閉鎖手段２−３、３−２を
閉じ、回収液を導入する手段４より回収液を細胞分離フ
ィルター１に導入して細胞分離フィルター１に捕捉され
た回収必要細胞を、回収必要細胞を貯留する容器に回収
する。この場合の導管６−１は、回収必要細胞と除去対
象細胞を含む細胞集団を細胞分離フィルターで濾過する
際に、該細胞分離フィルター下流へ押し出される、該細
胞分離フィルター内と該細胞分離フィルター上流及び下
流の導管内の空気を、回収必要細胞と除去対象細胞を含
む細胞集団を貯留する容器に送る機能を有していればよ
く、図７の態様に限定されるものではない。即ち、図８
のように導管２−２と導管３−１を接続してもよく、図
９のように導管３−１と細胞集団を貯留する容器１７を
接続してもよく、図１０のように除去対象細胞を貯留す
る容器３−３と細胞集団を貯留する容器１７を接続して
もよい。この場合の逆止弁６−２は、細胞集団を濾過す
る際に細胞集団が導管６−１を流通せず、除去対象細胞
を貯留する容器３−３の空気を細胞集団を貯留する容器
１７に送る際に空気が導管６−１を流通する、液体や気
体の流通方向を限定する機能を持つものである。従っ
て、クランプ等の閉鎖装置で細胞集団を濾過する際に閉
じておき、除去対象細胞を貯留する容器３−３の空気を
細胞集団を貯留する容器に送る際に開くものでも代用可
能である。

【００１１】更に、細胞集団を貯留する容器に接続する
手段が、内部に２本の互いに独立した第一の流路及び第
二の流路を有する穿刺針の場合、細胞集団がフィルター
に導入されるのと同時に、細胞集団により押し出される
フィルター内及び導管内の空気を、細胞集団を貯留する
容器に移動させることができる。図１１に、上記穿刺針
の好ましい態様の縦断面図、図１２に上記穿刺針を用い
た場合の装置態様を例示する。穿刺針２−１’は、互い
に独立した第一の流路１８、及び第二の流路１９があ
り、第一の流路の開口部１８ｂは細胞分離フィルター１
へ連通し、細胞集団により押し出される細胞分離フィル
ター１と細胞分離フィルター１上流及び下流の空気は、
導管６−１を経由して第二の流路の開口部１９ｂから１
９ａへと抜けて細胞集団を貯留する容器に貯留される。
該空気は細胞集団を貯留する容器の上部に貯留されるた
め、細胞集団が細胞分離フィルター１に導入された後に
細胞分離フィルター１に導入され、細胞分離フィルター
１上流に細胞集団が残留しなくなる。細胞集団を貯留す
る容器に接続した際、該容器内に穿刺された穿刺針の穿
刺部分２０において、第一の流路の開口部１８ａの位置
を、第二の流路の開口部１９ａの位置より下側に配置
し、第一の流路の開口部１８ａの横断面積を、第二の流
路の開口部１９ａの横断面積より大きくすることによ
り、細胞集団を貯留する容器内から第一の流路の開口部
１８ａ、１８ｂを経由して細胞分離フィルター１へ導入
される血液に、第二の流路１９を流通する、細胞分離フ
ィルター１内と細胞分離フィルター１の上流及び下流の
導管２−２、３−１内の空気が巻き込まれないようにす
ることができる。

【００１２】この場合の細胞分離方法を以下に述べる。
まず、閉鎖手段３−２及び６−３を閉じ、細胞集団を貯
留する容器に接続する手段２−１’を細胞集団を貯留す
る容器に、細胞分離フィルターに捕捉された回収必要細
胞を回収する手段５に回収必要細胞を貯留する容器を接
続する。次に、閉鎖手段３−２を開け、穿針針２−１’
の第一の流路１８を通して導管２−２に血液を少量導入
した後閉鎖手段３−２を閉じるか、もしくは導管２−２
途中に導管よりも流路断面積の大きな軟質素材からなる
小袋状の貯留手段２１を設けて、これを握り、放すこと
により、細胞分離フィルター１内に重力落差を生じさせ
る。この操作により、細胞分離フィルター１と細胞分離
フィルター１上流及び下流の空気を導管６−１を経由し
て細胞集団を貯留する容器に送る流れの方向付けをする
ことができる。次に、閉鎖手段６−３を開ける。この操
作により、細胞集団は、貯留手段２１、細胞分離フィル
ター１の順に流下する。それと同時に細胞分離フィルタ
ー１と細胞分離フィルター１上流及び下流の空気は、細
胞集団に押されて、導管６−１、穿刺針２−１’の第二
の流路１９を経由して細胞集団を貯留する容器に貯留さ
れる。次に、細胞集団は、フィルター６−４に到達し、
流れが止まる。閉鎖手段６−３を閉じる。閉鎖手段３−
２を開け、細胞集団を細胞分離フィルター１で濾過す
る。次に、細胞集団を貯留する容器内の空気が細胞分離
フィルター１に導入され、流れが止まる。最後に、閉鎖
手段２−３及び３−２を閉じ、細胞分離フィルターに回
収液を注入する手段４より細胞分離フィルター１に回収
液を導入して細胞分離フィルター１に捕捉された回収必
要細胞を、回収必要細胞を貯留する容器に回収する。こ
の場合のフィルター６−４は、疎水性フィルター等、気
体は通すが、液体は通さないもの選択性を有するものを
言う。即ち、細胞集団により細胞分離フィルター１と細
胞分離フィルター１上流及び下流の空気はフィルター６
−４を通して細胞集団を貯留する容器に流れるが、細胞
集団が細胞分離フィルター１を経由してフィルター６−
４に到達した時点で流れが止まる。この場合の貯留装置
２１は、メッシュチャンバーを具備したアグリゲート除
去手段でもよい。

【００１３】また、細胞分離装置内部の空気を導入する
場合の空気を導入する手段としては、図１３の６−５の
ように、導管２−２から分岐した、内部に空気を充填し
た容器等も含まれる。空気を充填した容器としては、内
部に空気が充填されていて、その空気を細胞分離フィル
ターに導入できるように空気が移動できる機能があれば
よい。例えば、シリンジ、スポイト、血液バッグ、ゴム
風船、袋等が挙げられるが、これらの形状に限定される
ものではない。この場合の細胞分離方法を以下に述べ
る。まず、閉鎖手段２−３、６−６を閉じ、細胞集団を
貯留する容器に接続する手段２−１を細胞集団を貯留す
る容器に、細胞分離フィルターに捕捉された回収必要細
胞を回収する手段５を回収必要細胞を貯留する容器に接
続する。次に、閉鎖手段２−３を開け、細胞集団を細胞
分離フィルター１で濾過し、除去対象細胞を貯留する容
器３−３に細胞分離フィルター１を通過した除去対象細
胞を回収する。細胞集団を貯留する容器が空になり血液
の流れが止まったら、閉鎖手段２−３、３−２を閉じ
る。空気を充填した容器６−５より内部の空気を細胞集
団を貯留する容器に送り、閉鎖手段６−６を閉じる。閉
鎖手段２−３、３−２を開け、細胞分離フィルター１上
流に残留した細胞集団を細胞分離フィルター１へ導入す
る。最後に閉鎖手段２−３及び３−２を閉じ、細胞分離
フィルター１に回収液を導入する手段４より細胞分離フ
ィルター１に回収液を導入して細胞分離フィルター１に
捕捉された回収必要細胞を、回収必要細胞を貯留する容
器に回収する。細胞分離装置内部の空気を利用する場
合、装置全体を滅菌しておけば、滅菌空気をそのまま利
用できるため、空気の除菌装置、また除菌する操作が不
要のため好ましい。

【００１４】

【実施例】以下に実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。

【実施例１】空気を導入する手段を備えた細胞分離装置
での、ヒト臍帯全血から白血球を回収し、赤血球、血小
板を除去する細胞分離を例示する。細胞分離フィルターの作製上容器と下容器から成り、組み立てた後の内寸が縦３０
ｍｍ、横３０ｍｍ、高さ１２ｍｍ（有効濾過断面積９ｃ
ｍ^２、内容積１１ｃｍ^３）で液体流出口と液体流入口
を最長対角線上に持つポリカーボネート製容器の入口側
から、第一層目に平均繊維径１２μｍ、目付１００ｇ／
ｍ^２のポリエステル不織布２５枚を第二層目に平均繊
維径２．３μｍ、目付６０ｇ／ｍ^２のポリエステル不
織布１２枚を、上容器と下容器の周辺で挟み込むように
充填して容器入口側空間と出口側空間に分離した。尚、
本細胞分離フィルター内に充填された不織布の空隙率は
０．８１で、充填密度は、第一層目が０．２９ｇ／ｃｍ
^３、第二層目が０．２２ｇ／ｃｍ^３であった。また、
該細胞分離フィルターに血小板通過性を付与する目的
で、親水性ポリマーのコーティングを行った。即ち、ヒ
ドロキシエチルメタクリレート・ジメチルアミノエチル
メタクリレート共重合体（モル比で９７：３）の１％エ
タノール溶液を該細胞分離フィルターの液体流入口から
通液し、窒素ガスで余分なポリマー溶液をパージした
後、６０℃で８時間以上真空乾燥機で乾燥させた。細胞分離装置図３のアグリゲート除去手段９が具備された、図１の細
胞分離装置を用いた。導管２−２の管長は２５ｃｍ（ア
グリゲート除去手段の長さ含む）、導管３−１の管長は
３０ｃｍで、内径２．９ｍｍのポリ塩化ビニル製の導管
を用いた。アグリゲート除去手段は軟質ポリ塩化ビニル
製の円筒で、変形しても形状が復元できるものを用い
た。また、内容積は１０ｍｌ、メッシュ１０はポリエス
テル製の３３０メッシュ、４０μｍのオープニングの規
格を持つものを用いた。また、空気を導入する手段６に
は図６のように０．５μｍの除菌フィルターを具備した
もので、１６にはスクリュー式のキャップを用い、回転
させてキャップをはずすことにより装置内に空気を導入
できるものを用いた。また、この場合の２−１は穿刺針
で、血液バッグに穿刺して接続できる形状のものを用い
た。また４、５はルアーアダプターで、５には細胞浮遊
液濾過前に凍結バッグを接続し、４には細胞浮遊液濾過
後に３０ｍｌルアーシリンジが接続できるものであっ
た。細胞分離操作まず閉鎖手段２−３を閉じ、５に凍結バッグ（クリオサ
イト（バクスター社製））を接続した。次に、ＣＰＤ加
ヒト臍帯全血５０ｃｍ^３を貯留した血液バッグと穿刺
針２−１を接続した。次にアグリゲート除去手段９を指
でつぶしてアグリゲート除去手段内の空気を血液バッグ
に送り込み、アグリゲート除去手段が元の形状に復元す
る際に血液が貯留された。次に閉鎖手段２−３を開け、
細胞分離フィルター１の上流側から落差により通液して
白血球を捕捉した。血液バッグ内の空気が空気を導入す
る手段６に到達した時点で、キャップ１６を開け、無菌
空気を細胞分離フィルター１に導入し、細胞分離フィル
ター１上流の血液を細胞分離フィルター１に導入した。
この時、細胞分離フィルター１上流の血液はほぼ完全に
細胞分離フィルター１に導入された。細胞分離フィルタ
ー１を通過した血液は除去対象細胞を貯留する容器３−
３に回収し、閉鎖手段２−３、３−２を閉じた。その
後、１０％デキストラン生理食塩水溶液（ミドリ十字
「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを３％
になるように添加した液体２３ｃｍ^３を充填した３０
ｍｌルアーシリンジをルアーアダプター４に接続した。
細胞分離フィルター１の下流側から手でシリンジを勢い
よく押して３００ｃｍ^３／分前後の流速で通液し、凍
結バッグに白血球を回収した。本細胞分離操作での白血
球捕捉率、白血球回収率、赤血球除去率、血小板除去率
はそれぞれ９５％、８０％、８５％、８０％であった。
尚、細胞数のカウントは、自動血球計数装置（コールタ
ー社製ヘマトロジーアナライザー）を用い、回収率、捕
捉率、除去率は以下の式で算出した。回収率（％）＝１００×（回収細胞数／元細胞数）捕捉率（％）＝１００−１００×（除去対象細胞を貯留
する容器中の細胞数／元細胞数）除去率（％）＝１００−１００×（回収細胞数／元細胞
数）また、この場合の白血球の生存率は、分離前９５％、分
離後９３％であり、空気が血液と接触することによる白
血球の生存率低下は見られなかった。尚、生存率の測定
は、トリパンブルー排除法にて行った。

【００１５】

【実施例２】実施例１同様、空気を導入する手段を備え
た細胞分離装置での、ヒト臍帯全血から白血球を回収
し、赤血球、血小板を除去する細胞分離を例示する。細胞分離フィルターの作製実施例１と同じ。細胞分離装置図１３に示された細胞分離装置を用いた。空気を導入す
る手段６は、軟質の塩化ビニル製の円筒で、内容積３０
ｍｌのものを用いた。空気を充填した容器６−５内部の
空気を移送する導管上に閉鎖手段６−６を設けた。それ
以外は実施例１と同じであった。細胞分離操作まず、閉鎖手段２−３、６−６を閉じ、細胞分離フィル
ターに捕捉された回収必要細胞を回収する手段５に凍結
バッグ（クリオサイト（バクスター社製））を接続し
た。次に、ＣＰＤ加ヒト臍帯全血５０ｃｍ^３を貯留し
た血液バッグと穿刺針２−１を接続した。次に閉鎖手段
２−３を開け、細胞分離フィルター１の上流側から落差
により通液して白血球を捕捉した。血液バッグ内の血液
が空になり、血液の流れが止まった時点で、閉鎖手段２
−３を閉じた。次に閉鎖手段６−６を開け、空気を充填
した容器６−５を手で握り、内部の空気を血液バッグに
移送し、閉鎖手段６−６を閉じた。次に、閉鎖手段２−
３を開け、血液バッグ内の空気を細胞分離フィルター１
に導入し、細胞分離フィルター１上流の血液を細胞分離
フィルター１に導入した。この時、細胞分離フィルター
１上流の血液はほぼ完全に細胞分離フィルター１に導入
された。細胞分離フィルター１を通過した血液は除去対
象細胞を貯留する容器に回収し、閉鎖手段２−３、３−
２を閉じた。その後、１０％デキストラン生理食塩水溶
液（ミドリ十字「デキストラン４０注」）にヒト血清ア
ルブミンを３％になるように添加した液体２３ｃｍ^３
を充填した３０ｍｌルアーシリンジをルアーアダプター
４に接続した。細胞分離フィルター１の下流側から手で
シリンジを勢いよく押して３００ｃｍ^３／分前後の流
速で通液し、凍結バッグに白血球を回収した。本細胞分
離操作での白血球捕捉率、白血球回収率、赤血球除去
率、血小板除去率はそれぞれ９５％、８０％、８５％、
８０％であった。

【００１６】

【比較例１】ヒト臍帯全血から白血球を回収し、赤血
球、血小板を除去するが、空気を導入する手段がない細
胞分離装置での細胞分離を例示する。細胞分離フィルターの作製実施例１と同様の細胞分離フィルターを用いた。細胞分離装置実施例１の空気を導入する手段６がないものを用いた。細胞分離操作まず閉鎖手段２−３を閉じ、細胞分離フィルターに捕捉
された回収必要細胞を回収する手段５に凍結バッグ（ク
リオサイト（バクスター社製））を接続した。次に、Ｃ
ＰＤ加ヒト臍帯全血５０ｃｍ^３を貯留した血液バッグ
と穿刺針２−１を接続した。次に閉鎖手段２−３を開
け、細胞分離フィルター１の上流側から落差により通液
して白血球を捕捉し、濾過した血液は除去対象細胞を貯
留する容器３−３に回収した。血液バッグ内が空になっ
た時点で血液の流れが止まり、細胞分離フィルター１上
流に約８ｃｍ^３の血液が残留した。次に、閉鎖手段２
−３、３−２を閉じ、１０％デキストラン生理食塩水溶
液（ミドリ十字「デキストラン４０注」）にヒト血清ア
ルブミンを３％になるように添加した液体２３ｃｍ ^３
を充填した３０ｍｌルアーシリンジをルアーアダプター
４に接続した。細胞分離フィルター１の下流側から手で
シリンジを勢いよく押して３００ｃｍ^３／分前後の流
速で通液し、凍結バッグに白血球を回収した。本細胞分
離操作での白血球捕捉率、白血球回収率、赤血球除去
率、血小板除去率は、９６％、６０％、７０％、６５％
であった。

【００１７】

【発明の効果】本発明に記載された細胞分離方法及び細
胞分離装置により、従来技術に比べ細胞分離フィルター
上流に細胞集団が残留するのを飛躍的に低減し、細胞集
団を廃棄せずに有効利用できる。その結果、従来技術で
は到底達し得なかったレベルにまで、回収必要細胞と除
去対象細胞を含む細胞集団から、高率に回収必要細胞を
回収し、且つ高率に除去対象細胞を除去することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】細胞分離装置外部の空気を利用する場合の基本
構成を示す模式図

【図２】空気を導入する手段の実施態様の１例を示す模
式図

【図３】空気を導入する手段の実施態様の１例を示す模
式図

【図４】空気を導入する手段の実施態様の１例を示す模
式図

【図５】空気を導入する手段の実施態様の１例を示す模
式図

【図６】空気を導入する手段に除菌作用を有する多孔質
膜を具備した実施態様の一例を示す模式図

【図７】細胞分離装置内部の空気を利用する場合の実施
態様の一例を示す模式図

【図８】細胞分離装置内部の空気を利用する場合の実施
態様の一例を示す模式図

【図９】細胞分離装置内部の空気を利用する場合の実施
態様の一例を示す模式図

【図１０】細胞分離装置内部の空気を利用する場合の実
施態様の一例を示す模式図

【図１１】本発明穿刺針の実施態様の一例を示す模式図

【図１２】細胞分離装置内部の空気を利用する場合の実
施態様の一例を示す模式図

【図１３】細胞分離装置内部の空気を利用する場合の実
施態様の一例を示す模式図

【符号の説明】

１；細胞分離フィルター２；細胞集団を細胞分離フィルターに導入する手段２−１；細胞集団を貯留する容器に接続する手段２−１’；穿刺針２−２；導管２−３；閉鎖手段３；細胞分離フィルターを通過した除去対象細胞を貯留
する手段３−１；導管３−２；閉鎖手段３−３；除去対象細胞を貯留する容器４；細胞分離フィルターに回収液を導入する手段５；細胞分離フィルターに捕捉された回収必要細胞を回
収する手段６；空気を導入する手段６−１；導管６−２；逆止弁６−３；閉鎖手段６−４；フィルター６−５；空気を充填した容器７；細胞集団が流通する流路８；穿刺部分９；アグリゲート除去手段１０；メッシュ１１；細胞分離フィルターの細胞集団流入側ハウジング１２；細胞分離フィルターの細胞集団流入空間１３；濾材１４；細胞分離フィルターの細胞集団流出側ハウジング１５；多孔質膜１６；空気の遮蔽、流入を制御する部材１７；細胞集団を貯留する手段１８；穿刺針の第一の流路１８ａ；開口部１８ｂ；開口部１９；穿刺針の第二の流路１９ａ；開口部１９ｂ；開口部２０；穿刺部分２１；貯留手段

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｍ 1/04 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｈ 1/12 Ａ６１Ｂ 5/14 ３００ＣＧ０１Ｎ 33/48 Ｂ０１Ｄ 29/42 ５２０Ｆターム(参考） 2G045 BA10 BB05 BB19 JA07 4B029 AA09 BB11 CC01 CC02 CC10 HA06 4B065 AA90X BA22 BD18 CA44 4C038 TA10 4D006 GA07 KB14 MA22 PB17 PB24 PC41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】回収必要細胞と除去対象細胞を含む細胞
集団を、回収必要細胞を実質的に捕捉し、除去対象細胞
を実質的に通過させる及び／又は除去対象細胞の一部を
細胞分離フィルター内に強固に捕捉するような細胞分離
フィルターで濾過し、該細胞分離フィルターを通過した
除去対象細胞を該細胞分離フィルター下流側へ導出し、
次に該細胞分離フィルターの上流側から該細胞分離フィ
ルターへ空気を導入して該細胞分離フィルター上流側に
残留した細胞集団を該細胞分離フィルターで濾過し、更
に該細胞分離フィルター下流側から回収液を該細胞分離
フィルターへ導入することにより該細胞分離フィルター
に捕捉された回収必要細胞を該細胞分離フィルター上流
側から回収することからなる細胞分離方法。
【請求項２】前記細胞分離フィルターの上流側から空
気を導入する方法が、回収必要細胞と除去対象細胞を含
む細胞集団を該細胞分離フィルターで濾過する際に該細
胞分離フィルター下流へ押し出される、該細胞分離フィ
ルター内と該胞分離フィルター上流及び下流の導管内の
空気により該細胞分離フィルター上流側に残留した細胞
集団を該細胞分離フィルターへ送り込むことである請求
項１記載の細胞分離方法。
【請求項３】回収必要細胞を実質的に捕捉し、除去対
象細胞を実質的に通過させる及び／又は除去対象細胞の
一部を細胞分離フィルター内に強固に捕捉する、少なく
とも入口と出口を有する細胞分離フィルターと、該細胞
分離フィルターの入口より上流に接続される、回収必要
細胞と除去対象細胞を含む細胞集団を該細胞分離フィル
ターに導入する手段と、該細胞分離フィルターの出口よ
り下流に接続される、該細胞分離フィルターを通過した
除去対象細胞を貯留する手段と、該細胞分離フィルター
の出口より下流に接続される、該細胞分離フィルターに
回収液を導入する手段と、該細胞分離フィルターの入口
より上流に接続される、該細胞分離フィルターの入口側
から該細胞分離フィルターに捕捉された回収必要細胞を
回収する手段と、該細胞分離フィルターの上流側に空気
を導入する手段を装置内に有する細胞分離装置。
【請求項４】前記空気を導入する手段が、前記回収必
要細胞と除去対象細胞を含む細胞集団を細胞分離フィル
ターに導入する手段に具備されていることを特徴とする
請求項３記載の細胞分離装置。
【請求項５】前記回収必要細胞と除去対象細胞を含む
細胞集団を細胞分離フィルターに導入する手段内に、ア
グリゲート除去手段が具備され、該アグリゲート除去手
段に前記空気を導入する手段が具備されていることを特
徴とする請求項３記載の細胞分離装置。
【請求項６】前記空気を導入する手段が、前記細胞分
離フィルターに具備されていることを特徴とする請求項
３記載の細胞分離装置。
【請求項７】前記空気を導入する手段が、除菌作用を
有する多孔質膜と空気の遮蔽、流入を制御するシール部
材からなる請求項３〜６記載の細胞分離装置。
【請求項８】前記空気を導入する手段が、空気を充填
した容器であり、前記細胞分離フィルター上流側に接続
されていることを特徴とする請求項３記載の細胞分離装
置。
【請求項９】前記空気を導入する手段が、前記回収必
要細胞と除去対象細胞を含む細胞集団を細胞分離フィル
ターに導入する手段と前記細胞分離フィルターの下流側
をつなぐ導管であることを特徴とする請求項３記載の細
胞分離装置。