JP2000515487A

JP2000515487A - 安定化されたリン脂質組成物

Info

Publication number: JP2000515487A
Application number: JP09513213A
Authority: JP
Inventors: ダイビック，カリ; ダッグスタッド，ハラルド; スカルトビット，ロアルド; クラビネス，ジョー; オステンセン，ジョニー; 清人谷内
Original assignee: ナイコムドイメージングエーエス; 第一製薬株式会社
Priority date: 1995-09-27
Filing date: 1996-09-25
Publication date: 2000-11-21
Also published as: NO981340L; CA2233135A1; CN1202830A; NO981340D0; GB9519654D0; WO1997011683A2; WO1997011683A3; EP0857070A2

Abstract

(57)【要約】１５℃でのｐＨが９．５以下でありかつアンモニアまたは水溶性アミンを含む緩衝系を包含することによってリン脂質組成物の安定性を強化する。

Description

【発明の詳細な説明】安定化されたリン脂質組成物本発明は安定化された水性リン脂質組成物に関する。リン脂質組成物は、診断、治療、化粧などの様々な応用分野において使用されている。例えば、脂質組成物、特にリポソームは、遺伝物質の移動媒体として、免疫学的媒質として、あるいはワクチンの作成や癌の検出において、診断及び治療薬を包含する用途に用いられている。リン脂質の安定性が、包含した物質を減成反応から保護するため、またリン脂質自体の最適性能のために重要であることは明らかである。特に関連のある分野の一つに、診断画像法がある。造影剤は、様々な診断技術において画質向上効果をもたらすために用いられる。中でも最も重要なのは、Ｘ線画像法、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波画像法、及び核医学画像法の技術である。良好な貯蔵安定性と生体条件内での安定性の両方を備えた造影剤は常に必要とされている。また、特に関連のある別の分野として、加圧蒸気殺菌に関連する技術で用いられる安定したリン脂質組成物の開発がある。トロメタモール(trometamol)及び関連する緩衝剤化合物の使用がリン脂質の加水分解に特別な効果をもたらすことを示した研究が成されている。これらの研究の多くは、緩衝剤類の濃度を増加することによってリン脂質の加水分解を向上させる、トロメタモール緩衝剤による一般酸塩基触媒作用を示している(例、ジャーナル・オブ・ファーマスーティカル・サイエンス８２（Journal of Pharmac eutical Sciences 82）:362〜366頁(1993))。しかしながら、組成物中に含まれたトロメタモールとホスホリパーゼとの相互作用により、リン脂質組成物の加水分解が抑制されることも報告されている (例、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション８４(Biochemical and Biophysical Res．Comm.84):238〜247頁(1978);バイオケミストリー・ジャーナル２０３(Biochem.J.203):799〜801頁(1982);アーカイブ・オブ・インセクト・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー１４ (Archives of Insect Biochemistry and Physiology 14):1〜12頁(1990);ジャーナル・オブ・バクテリオロジー１７５(Journal of Bacteriology 175:4298〜 4306頁(1993))。ケミストリー・アンド・フィジックス・オブ・リピド６０(Chemistry and Ph ysics of Lipids 60):93〜99頁（1991）において、空気中での酸化減成に対するリポソーム水性懸濁液中のリン脂質の安定性の研究が成されている。この研究において、レシチンが、純水中よりもトロメタモール緩衝液中において、加水分解に対してより強い耐性を示すことが証明されている。これは、遊離基機構によって容易に過酸化作用を受ける、多価不飽和脂肪酸鎖を有する天然由来のリン脂質に特に関連して示されている。この開示に示されたように、水に超音波を照射するとヒドロキシル遊離基と過酸化水素の生成が促進され、また、これらの活性酸素類がリン脂質の酸化減成に関与することがよく知られている。トロメタモール緩衝液は加水分解に対する耐性を提供するようであり、この引例は、観察された酸化加水分解反応の減少は、トロメタモールがヒドロキシル遊離基の捕収剤として有効に作用することが原因であると示している。ジャーナル・ファーマスーティカル・ファーマコロジー４５(J.Pharm.Pharmacol.45):490〜495頁（1993）においても、同様の結論に達しており、トロメタモールなどの緩衝剤には脂質を過酸化反応から保護する効果があることが報告されている。ＷＯ−９５／２６２０5(Nycomed/Daiichi)には、少なくとも一つの画像剤を含みかつ前記画像剤を含む水性媒質に懸濁された多重層リポソームを含む診断用組成物であって、前記リポソームが中性リン脂質と荷電リン脂質から成り、前記リポソームの平均粒子径が５０〜３０００ｎｍであり、かつ前記リポソームの内部を満たす水性相における前記画像剤の濃度が前記リポソームが懸濁された水性媒質における濃度と実質的に同じである組成物が記載されている。そして現在、驚くことに、緩衝剤が実質的に飽和したリン脂質化合物を安定化させることができ、前記緩衝剤はリン脂質の水性加水分解の程度を減少させることが分かった。このように、本発明の一つの様相は、１５℃でのｐＨが９．５以下でありかつアンモニアまたは水溶性アミンを含む緩衝系を組み合わせた一つ以上の実質的に飽和したリン脂質を含む水性脂質組成物、好ましくはリポソーム組成物であり、好ましくは生理学的受容性のある形の組成物を提供することである。ただし、前記リン脂質が荷電リン脂質及び中性リン脂質の組み合わせを含み、かつ前記組成物が非イオン性多重ヒドロキシル化Ｘ線造影剤を含有するリポソーム組成物である場合は、前記造影剤はリポソームの内部と周囲の水性媒質中において実質的に同じ濃度で存在しないことを条件とする。従って、ＷＯ−９５／２６２０５に開示された診断用組成物については、特に権利を放棄する。本発明の別の様相は、実質的に飽和したリン脂質化合物中に、１５℃でのｐＨが９．５以下でありかつアンモニアまたは水溶性アミンを含む緩衝系を包含させることを含む方法であって、非イオン性多重ヒドロキシル化Ｘ線造影剤を含有しかつ前記造影剤が実質的に同じ濃度でリポソームの内部と周囲の水性溶媒内に存在するリポソーム組成物中に、前記緩衝系を添加すること以外によってである実質的に飽和したリン脂質組成物の安定方法を提供することである。リポソーム組成物に関しては、緩衝剤はリポソームの生成の前後に加えられる。本発明の更に別の様相は、造影剤を被験者（例、人間または人間でない動物、好ましくは哺乳類）に投与して被験者の画像を生成する造影強化画像法であって、造影効果物質を含有する本発明の組成物を前記造影剤として用いることを特徴とする方法を提供することである。好ましければ、例えば過分極化などによって前記造影効果物質を活性化させた後に前記造影剤を投与してもよい。本発明の更に別の様相は、治療または予防薬を被験者（例、人間または人間でない動物、好ましくは哺乳類）に投与する治療方法であって、前記治療または予防薬を含有する本発明の組成物を投与することを特徴とする方法を提供することである。本発明の更に別の様相は、化粧剤を被験者（例、人間または人間でない動物、好ましくは哺乳類）に施す化粧処理方法であって、前記化粧剤を含有する本発明の組成物を施すことを特徴とする化粧方法を提供することである。これらの方法において投与される組成物には、効果的な量、すなわち造影強化効果を得るのに十分な量、または望ましい治療、予防または化粧効果を得るのに十分な量の活性剤（造影効果物質、治療または予防薬、または化粧剤）が含まれていなければならない。本発明の組成物および方法において用いられるリン脂質は、荷電していても中性（実行電荷を持たない）でもよい。しかしながら、緩衝系が加水分解に対する保護効果を特に顕著に示すことから、中性リン脂質を使用することが特に好ましい。本発明の組成物中のリン脂質は、完全または実質的に完全に中性なリン脂質であることが特に好ましい。本発明の方法または組成物において使用される緩衝系は、好ましくは室温(１５℃)でのｐＨが６．０〜９．５、より好ましくは６．５〜８．０、特に好ましくは６．８〜７．８である。本発明の組成物は、前記の緩衝系を含まない製剤と比較すると、リン脂質の加水分解の程度が少ない。本発明における好ましい組成物は、一定期間（例、通常の貯蔵寿命、例えば３０日以上）における加水分解の程度が前記緩衝剤を含まない製剤よりも５％以上少ない。より好ましい組成物では１０％以上、最も好ましくは２５％以上少ない。得られる安定性は、貯蔵時、処理時、および加圧蒸気殺菌時などリン脂質組成物が温度にさらされる時において特に利点がある。本発明の一つの好ましい実施態様においては、リン脂質化合物が４℃から３０ ℃の温度範囲にて安定である；より好ましい実施態様においては、前記組成物が４℃から５０℃の温度範囲にて安定である；別のより好ましい実施態様においては、前記組成物が４℃から１２５℃の温度範囲（加圧蒸気殺菌を含む）にて安定である。前記リン脂質組成物は、好ましくは２年の貯蔵期間において安定であり、より好ましくは３年間安定であり、特に好ましくは５年間安定である。この文脈における「安定」とは、前記の貯蔵期間後に少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の未減成のリン脂質が組成物中に存在することをいう。上述のように、本発明の安定化方法において特に有利な点の一つは、得られるリン脂質組成物が短期間にて広い温度範囲に耐え得る能力を持つことである。従って、加圧蒸気殺菌するリン脂質組成物を安定させるために、加圧蒸気殺菌処理の前にあらかじめ前記緩衝系を添加しておくことが好ましい。本発明の方法または組成物において用いられる緩衝剤は、好ましくは以下の式（Ｉ）によって表される。ＮＲ¹Ｒ²Ｒ³ （Ｉ）この式におけるＲ¹、Ｒ²およびＲ³は、同種異種を問わず、それぞれ水素原子、糖残基、炭素数１〜６のアルキル基(ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、スルホン酸基、カルボキシアミド基、イミダゾリル基、インドリル基またはヒドロキシル置換フェニル基から１つ以上の基を含有する)、炭素数１〜６のアルキルチオ基および／または式ＮＲ⁴Ｒ⁵（Ｒ⁴とＲ⁵は、同種異種を問わず、それぞれ水素原子、カルボキシアミド基または−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ₂基、または炭素数１〜６のアルキル基を表す）の式にて表される基である。あるいは、Ｒ¹ 、Ｒ²およびＲ³の２つは、介在窒素元素を伴い、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン酸基またはカルボキシアミド基を有するピロリジン、モルホリンまたはピペリジン環であってもよい。従って、緩衝液として用いられる水溶性アミンの例として、アミノアルコールとアミノ糖が挙げられる。より好ましいアミンの例として、トロメタモール（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、またはＴＲＩＳと示す）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン(ＢＩＳ−ＴＲＩＳと示す)、２−アミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール(ＡＭＰＤと示す)、ＴＥＳ、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸(ＨＥＰＥＳと示す)、ジエタノールアミン、メグルミン、トリエタノールアミンおよびアンモニアが挙げられる。本発明で用いられる特に好ましいアミンとしては、有利な生理学的受容性および／または室温にて有利なｐＨ値を有することから、ＴＲＩＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＴＥＳおよびメグルミンが挙げられる。上述の通り、本発明の組成物に包含されるリン脂質は、実質的に飽和したリン脂質からなる。「実質的に飽和した」という用語は、リン脂質の脂肪酸残基が完全に飽和しているか(すなわち、Ｃ−Ｃ二重結合を含まない)、あるいは例えばヨウ素価が１０以下、好ましくは５以下であることにより示されるように、不飽和の程度が非常に低いことを意味する。全体の不飽和の程度が類似になるような少しの割合で不飽和リン脂質が本発明の組成物中に存在することも可能である。リン脂質は荷電していても中性でもよく、また、天然、合成または半合成由来のいずれでもよい(化学的に改質され、実質的に飽和したリン脂質を含む)。上述の通り、中性のリン脂質を使用することが好ましい。脂肪酸残基の炭素数は、通常は少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６である。また、脂肪酸残基の炭素数は、好ましくは２６以下、例えば２５以下、好ましくは２４以下である。本発明において有効な中性のリン脂質としては、例えば、完全に水素化した天然由来（例：ダイズ、または卵黄由来）または合成のホスファチジルコリン、特に半合成のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）またはジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）またはホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥ−ＰＥＧ）などの中性グリセロリン脂質が挙げられる。一種以上の中性リン脂質を用いてもよい。本発明において有効な荷電リン脂質の例としては、例えば、陽または陰に荷電したグリセロリン脂質が挙げられる。陰に荷電したリン脂質の例としては、例えば、完全に水素化した天然由来（例：ダイズ、または卵黄由来）または半合成のホスファチジルセリン、特に半合成のジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）またはジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）などのホスファチジルセリン；完全に水素化した天然由来（例：ダイズ、または卵黄由来）または半合成のホスファチジルグリセロール、特に半合成または合成のジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）などのホスファチジルグリセロール（ＰＧ）；またはジステアロイルホスファチジルグリセロール(ＤＳＰＧ)；完全に水素化した天然由来（例：ダイズ、または卵黄由来）または半合成のホスファチジルイノシトール、特に半合成または合成のジパルミトイルホスファチジルイノシトール(ＤＰＰＩ)、またはジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）などのホスファチジルイノシトール；完全に水素化した天然由来（例：ダイズ、または卵黄由来）または半合成のホスファチジン酸、特に半合成または合成のジパルミトイルホスファチジン酸(ＤＰＰＡ)、またはジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）などのホスファチジン酸が挙げられる。陽に荷電したリン脂質としては、例えば、ヒドロキシエチレンジアミンを伴うジパルミトイルホスファチジン酸またはジステアロイルホスファチジン酸のエステルなどのアミノアルコールを伴うホスファチジン酸のエステルが挙げられる。このような荷電リン脂質は通常単独で用いられるが、一種以上の荷電リン脂質を用いてもよい。本発明の方法または本発明の組成物において用いられる緩衝剤の濃度は、好ましくは２ｍＭ〜２００ｍＭ、より好ましくは２ｍＭ〜１００ｍＭ、特に好ましくは２ｍＭ〜２０ｍＭの範囲内である。本発明の組成物中の緩衝剤：脂質のモル比は、好ましくは１：６０〜２０００：１(例、１：６０〜１００：１)、より好ましくは１：６０〜１：０．０２、特に好ましくは１：６０〜１：０．１の範囲内である。診断および他の医療上の応用のあるものについては、好ましい緩衝剤：脂質のモル比の範囲が１：５０〜１：０．１、より好ましくは１：２０〜１：０．５、特に好ましくは１：５〜１：１である。画像法および医療上の応用において、本発明の組成物中のリン脂質の濃度は、好ましくは０．０１ｍＭ〜１２０ｍＭ、例えば１ｍＭ〜１２０ｍＭの範囲内である。本発明のリン脂質組成物は、通常使用されている、例えばリポソーム、エマルジョン、ミセル、マイクロエマルジョン、脂質粒子、脂質溶液およびマイクロバブルなど、どんな製剤の種類であってもよい。それぞれ特定の製剤の種類については、通常の手続きによって製造できる。本発明の方法およびリン脂質組成物は、様々な応用において好適に用いられ、安定性の向上が特に重要な応用分野において特に好適に用いられる。安定化した組成物は様々な診断、治療および化粧上の応用に使用され、特に、造影剤に関する使用（Ｘ線、磁気共鳴画像法、超音波、およびシンチグラフィ）や、癌療法、化学療法、真菌感染療法、および乾癬の治療での使用に関するリン脂質組成物について、特に言及する。診断用画像造影剤として使用するため、本発明のリポソーム組成物は、例えばリポソーム内部の空洞内や、リポソーム膜の内壁または外壁に結合するかまたは膜中に含有されたり、あるいはリポソームが分散された液媒質中などに、造影効果物質を包含する。ここで造影効果とは、その物質が、関連する画像法の様式において、造影を強化できることを意味する。例えば、Ｘ線、磁気共鳴、超音波、磁気断層撮影法、電気インピーダンス断層撮影法、シンチグラフィ、単一光子放出型コンピュータ断層撮影法、陽電子放射断層撮影法など通常の画像法の様式に関しては、適切な造影効果物質の性質がよく知られている。例えば、ガス(例、空気、キセノン、フッ素化合物等)、放射線エミッター、常磁性、超常磁性、フェリ磁性および強磁性物質(例、遷移金属またはランタニドの常磁性キレート)、例えばヨウ素化合物（例、トリヨードフェニル化合物）などの重原子（例、原子番号４７以上）化合物などである。造影効果物質が(環境温度または体温度において)、空気、キセノン、ヘリウム、アルゴン、水素、一酸化二窒素、酸素、窒素、二酸化炭素、六フッ化硫黄、メタン、アセチレン、フッ素含有低分子量（例、Ｃ₁〜Ｃ₇）炭化水素（好ましくはＣ₂Ｆ₆，Ｃ₃Ｆ₈，Ｃ₄Ｆ₁₀およびＣ₅Ｆ₁₂などのペルフルオロカーボン)、¹⁹Ｆ含有ガスなどの気体である場合、リポソーム膜中に含ませると都合がよい。造影効果物質が水溶性である場合(例えば、可溶性トリヨードフェニル化合物または常磁性金属キレートなど)、好ましくはリポソームのコア内部の溶液、また、特に好ましくは懸濁媒質の溶液中にも同様に存在する。リポソームのコア内部、リポソーム膜中または膜上、および／または懸濁媒質中には、治療薬または化粧剤を同様に分散することができる。リポソームによる投与が可能な通常の治療薬または化粧剤が使用できる。Ｘ線および磁気共鳴画像法核医学などに関する診断用組成物については、脂質内の造影剤の封入を強化するために、全脂質濃度は通常５mg/ml〜１００mg/ml( 例、２０〜１００mg/ml，好適には少なくとも４０〜５０mg/ml)、好ましくは１０mg/ml〜９０mg/ml)より好ましくは１０mg/ml〜８０mg/mlである。しかしながら、超音波診断用組成物については、全脂質濃度の好ましい範囲は通常０．０１ mg/ml〜２０mg/ml、好ましくは０．０１mg/ml〜１０mg/ml（例、０．５mg/ml〜１０mg/ml）である。薬剤をリン脂質中（特にリポソーム中）に封入する場合は、（体内の生理学的浸透圧に対して）等張溶液または懸濁液の形であることが好ましい。等張溶液または懸濁液を得るために、通常薬剤は等張液を調製する濃度にて媒質中に溶解または懸濁される。例えば薬剤の溶解性が不十分なため、その薬剤単独では等張液を調製できない場合は、他の通常の浸透圧調整剤（例、非毒性の水溶性物質）を媒質に添加することにより等張液を調製してもよい。このような物質の例としては、塩化ナトリウム等の塩；マンニトール、グルコース、スクロース、マンノース、ガラクトース、ソルビトール等の糖；プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコールなどが挙げられる。ソルビトールを用いる場合は、好ましくは１〜５００g/l、より好ましくは０．１〜２０g/100mlの濃度にて用いられる。グリセリンを用いる場合は、０．０５〜１０g/100mlの濃度にて用いることが好ましい。リン脂質組成物がリポソーム組成物である場合は、貯蔵および加圧蒸気殺菌中のリポソームの安定化を促進するため、塩の使用量はできる限り少ないことが好ましい。上記の物質により提供される等張液は、診断薬、治療薬または化粧剤を含まない本発明のリン脂質組成物にも同様に含まれることが好ましい。本発明のリン脂質組成物は、前記成分に加えて、種々の任意の成分を含有してもよい。例えば、脂質の全量に対して０．０１〜２モル％、好ましくは０．１〜１モル％の割合でビタミンＥ（α−トコフェロール）および／またはビタミンＥ酢酸エステルを抗酸化剤として添加してもよい。上述の診断薬、治療薬および化粧剤は、当技術分野において周知の技術によって本発明のリン脂質組成物に包含することができる。上述のように先行技術では、リン脂質の加水分解の抑制がホスホリパーゼの抑制を含む間接的な機構によるものであると述べている。関連組成物がホスホリパーゼを含まないので、このような機構が本発明には当てはまらないことは明らかである。同様に、先行技術で観察された不飽和リン脂質を用いた酸化加水分解の減少は、飽和リン脂質に関連する本発明の方法においては重要でない(ごく微量の不飽和リン脂質が存在し得ることは否定しない)。本発明の方法は、リン脂質エステルの酸塩基触媒加水分解の全般的な抑制に関連する、異なる抑制機構を証明するものと思われる。本発明の方法に関する正確な機構、特に貯蔵中の安定性の改善に関しては、十分に理解されていない。しかしながら、リン脂質が加水分解して遊離脂肪酸とリゾホスホリピドを生成し、それぞれグリセロリン化合物と遊離脂肪酸とに更に加水分解し、加水分解の最終段階においてはリン酸塩頭基の加水分解によりグルセロリン酸を生成することはよく知られている（例えば、ジャーナル・オブ・ファーマスーティカル・サイエンス 82：362〜366頁（1993）およびホスホリピド・ハンドブック(Phospholipid Handbook)(Marcel Dekker Inc.，1993)，323〜324 頁を参照)。遊離リン酸とグリセロールが検出されないことから、グリセロールとリン酸間のエステル結合の加水分解は困難と思われる。遊離脂肪酸の遊離の減少から分かるように、トロメタモールなどの緩衝剤の使用によって脂肪酸エステル基の酸塩基触媒加水分解が抑制されることは明らかである。加水分解の最終段階も同様に抑制される。しかしながら、他の加水分解機構が関連している可能性もある。以下の実施例によって本発明の方法と組成物を更に説明するが、これは本発明を制限するものではない。実施例１組成物：１ｍｌ中含有量：水素添加卵ホスファチジルコリン３２ｍｇ１，２‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン４ｍｇ１，２‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐３‐ホスファチジン酸ナトリウム４ｍｇソルビトール５０ｍｇ（トロメタモール１ｍｇ）注入用の水ａｄ１ｍｌ脂質を、クロロフォルム、メタノール、水の混合物（体積比 80：20：0.05）と混合することによって組成物を調製した。その混合物を水浴（５０℃）で加熱して脂質を溶解した。続いてその溶液を回転蒸発装置（５０℃）内で加熱することによって溶媒を除去した。次に通常の技術（ソルビトールの添加を含む）を用いて、均質化及び押出しによってリポソームを作成した。その後、その分散液を２分し、そのうちの１つにｐＨ７．４のトロメタモール／塩酸の緩衝液を添加した。続いて、結果組成物をバイアルに注ぎ、加圧殺菌した。サンプルを３０℃、４０℃、５０℃でそれぞれ１ヶ月間保存した。加圧殺菌前、加圧殺菌後及び保存後に、遊離脂肪酸の量を測定した。リン脂質組成物中の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の存在は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）板上への溶出によって調べた。そのＴＬＣはメタノール、クロロフォルム、アンモニアの混合物（体積比 120：70：8）を移動相として用いており、厚さ０．２５ｍｍのシリカゲル６０層でコートされている。そのサンプルをメタノール：ジクロロメタン１：10（体積比２：１）で希釈し、その希釈したサンプルを分取し、クロマトグラフ板に塗布した。ＦＦＡの量は、そのサンプルからのスポットと、１．２５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌの濃度に相当するパルミチン酸標準スポットとの強度比較によって半定量化した。そのスポットは硫酸銅スプレー薬を用いて、170℃約１時間で発生した。遊離脂肪酸として測定したリン脂質の減成（ｍｇ／ｍｌ）: 実施例２組成物：１ｍｌ中含有量：水素添加卵ホスファチジルコリン３６ｍｇ１，２‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐３‐ホスフォグリセロールナトリウム４ｍｇソルビトール５０ｍｇ（トロメタモール１ｍｇ）注入用の水ａｄ１ｍｌ実施例１と同様に調製した。遊離脂肪酸として測定したリン脂質の減成（ｍｇ／ｇｌ）: この結果は、トロメタモールを含有するサンプルは、トロメタモールを含有しないサンプルと比較して、遊離脂肪酸として測定されるリン脂質の減成が少ないということを実証している。さらなる実施例において、本発明の組成物を実施例１と同様にして下記の通り調製する。実施例３ホスファチジルコリン２０ｍｇホスファチジルエタノールアミン２０ｍｇグルコース５０ｍｇトロメタモール０．５ｍｇ注入用の水ａｄ１ｍｌ実施例４ホスファチジルグリセロール５ｍｇスクロース１００ｍｇトロメタモール１ｍｇ注入用の水ａｄ１ｍｌ実施例５ＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミン４０ｍｇソルビトール５０ｍｇトロメタモール１０ｍｇ注入用の水ａｄ１ｍｌ実施例６ホスファチジルコリン１５ｍｇ大豆油５０ｍｇグリセロール２４ｍｇトロメタモール１ｍｇ注入用の水ａｄ１ｍｌ実施例７本発明の方法を実証する更なる実施例として、下記組成物（ＷＯ−９５／２６２０５に開示されている）についても実施例１と同様にして分析した。組成物：１ｍｌ中含有量：水素添加卵ホスファチジルコリン（Ｈ−ＥＰＣ）５１ｍｇ水素添加卵ホスファチジルセリンナトリウム（Ｈ−ＥＰＳＮａ）５ｍｇイオジキサノール４００ｍｇソルビトール１７ｍｇ（トロメタモール１ｍｇ）注入用の水ａｄ１ｍｌリポソームの作成前にイオジキサノールとソルビトールの等張液をさらに添加した以外は実施例１と同様にして組成物を調製した。遊離脂肪酸として測定したリン脂質の減成（ｍｇ／ｍｌ）本実施例の結果は、造影剤をさらに含むリン脂質組成物を安定化する際に、本発明の方法を使用すること実証している。下の実施例８〜１３は、超音波の研究（実施例８〜１０）や磁気共鳴画像法の研究（実施例１１〜１３）の造影剤としての使用に適する安定化したリポソーム懸濁液を開示している。比及びパーセンテージは、脂質の比が重量比である以外は、別に記載がない限り体積比である。実施例８〜１０において、¹⁹Ｆ標識フルオロカーボン類を使用すれば、これらの組成物をＭＲ造影剤として使用できる。実施例８水素添加卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）とジパルミトイルホスフェート（１０：１）をクロロフォルム−メタノール（２：１）に溶解し、続いて回転蒸発装置で溶媒を除去した。次に脂質を蒸留水中に分散させ、その分産物を高速乳化機を備えた気密ガラスリアクターに導入する。リアクター内のガスは１０％Ｃ₅ Ｆ₁₂を含んだ空気である。ミクロ泡作成後、ＨＥＰＥＳ５ｍＭを添加する。実施例９ジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジパルミトイルホスフアチジン酸（ＤＰＰＡ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）を２５：１：２の比で、第三ブチルに溶解し、続いて回転蒸発装置で溶媒を除去する。その後、脂質を蒸留水中に分散させ、その分産物を高速乳化機を備えた気密ガラスリアクターに導入する。リアクター内のガスはＣ₃Ｆ₈である。ミクロ泡作成後、トロメタモール８ｍＭを添加する。実施例１０ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）(８：１：１)をクロロホルム‐メタノール‐水（１０：２０：０．５）に溶解し、続いて回転蒸発装置にて溶媒を除去する。その後、脂質を蒸留水中に分散させ、その分産物を高速乳化機を備えた気密ガラスリアクターに導入する。リアクター内のガスはＣ₄ Ｆ₁₀である。ミクロ泡作製後、ＴＥＳ１０ｍＭを添加する。実施例１１水素添加卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）及びメトキシ（ＰＥＧ）‐ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ‐ＤＳＰＥ）(９：１）を乾燥混合し、ガドジアミド−カルジアミド０．５Ｍ溶液中に分散させる。続いて均質化及び押出しによりリポソームを作成する。ＨＥＰＥＳ８ｍＭを添加し、生成物を加圧殺菌によって殺菌する。実施例１２水素添加卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）(９：１)を乾燥混合し、ジメグルミンガドペンテテート‐メグルミンジエチレントリアミンペンテテート‐メグルミン０５Ｍ溶液中に分散させる。続いて均質化及び押出しによりリポソームを作成する。ＴＲＩＳ５０ｍＭを添加し、加圧殺菌によって生成物を殺菌する。実施例１３水素添加卵ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）をガドジアミド０．５Ｍ溶液中に分散させる。続いて均質化及び押出しによってリポソームを作成する。ＴＥＳ５０ｍＭを添加し、加圧殺菌によって、生成物を殺菌する。実施例１４組成物：ＤＳＰＡ^** １０ｍｇＤＳＰＧ⁺⁺ １０ｍｇイオヘキソール３９０ｍｇ緩衝液十分な量注入用水ａｄ１ｍｌ^** ジステアロイルホスファチジル酸⁺⁺ ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ともに荷電リン脂質）ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳもしくはＴＥＳ緩衝液を用い、実施例１と同様にして組成物を調製した。ＴＥＳは１−[トリス（ヒドロキシメチル）メチル]‐２‐アミノエタンスルホン酸である。これらの緩衝液の濃度は、生成物中イオン強度が同一となるように選択した。ｐＨ及び減成のデータを表１、２に詳細に示す。表１遊離脂肪酸（mg/mL）表２ｐＨ実施例１５組成物：Ｈ−ＥＰＣ＊６０ｍｇイオジキサノール２００ｍｇソルビトール３７ｍｇ緩衝液十分な量注入用水ａｄ１ｍｌ＊水素添加卵ホスファチジルコリン（中性リン脂質）比較のために組成物を３セット調製した。第一の組成物では、緩衝液としてＴＲＩＳ，ＨＥＰＥＳまたはＴＥＳを使用した。第二の組成物では、緩衝液を使用せず、ＮａＯＨ／ＨＣｌを用いてｐＨを調整した。そして第三の組成物では、リン酸緩衝液またはリン酸／クエン酸緩衝液を使用した。これらの組成物は実施例１と同様にして調製した。加圧殺菌後及び４０℃で３ヶ月間保存後に、遊離脂肪酸（ｍｇ／ｍＬ）として測定されたリン脂質の減成は下記通りであった。（これらの緩衝液の濃度は、生成物のイオン強度が同一となるように選択した。）ｐＨ及び減成のデータを表３、４に詳細に示す。表３遊離脂肪酸（mg/mL）表４ｐＨこのように、３ヶ月保存後、ＴＲＩＳ及びＴＲＩＳ様の緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ及びＴＥＳ）の入ったサンプルは、他の緩衝液（リン酸緩衝液、リン酸／クエン酸緩衝液）並びに緩衝液を入れない溶液（ｐＨをＮａＯＨ／ＨＣｌにより調整した）と比較して、遊離脂肪酸のレベルが低いことからわかるように、リン脂質の減成が少ない。さらに、加圧殺菌後及び保存後に観察されたｐＨの低下は、他のサンプル（０．３０〜１．００ｐＨ単位低下）と比較して、ＴＲＩＳ，ＨＥＰＥＳ及びＴＥＳのサンプルでは低い（０．３０ｐＨ単位未満の低下）ことが明確に示された。実施例１６組成物：Ｈ−ＨＰＣ３６ｍｇＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ＊４ｍｇイオジキサノール３７０ｍｇ緩衝液十分な量注入用水ａｄ１ｍｌ＊メトキシ（ポリエチレングリコール）ジステアロイルホスファチジル‐エタノールアミン（中性リン脂質）比較のために組成物を３セット作成した。第一の組成物では、緩衝液として、ＴＲＩＳ，ＨＥＰＥＳまたはＴＥＳを使用した。第二の組成物では、緩衝液を使用せず、ＮａＯＨ／ＨＣｌを用いてｐＨを調整した。そして第三の組成物では、リン酸緩衝液またはリン酸／クエン酸緩衝液を使用した。これらの組成物は実施例１と同様にして調製した。加圧殺菌後、４０℃、５０℃で１ヶ月保存した後に、遊離脂肪酸（ｍｇ／ｍＬ）として測定されたリン脂質の減成は下記通りであった。（これらの緩衝液の濃度は、生成物のイオン強度が同一となるように選択した。）ｐＨ及び減成データを表５，６に詳細に示す。表５遊離脂肪酸（mg/mL）表６ｐＨ

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年１０月１７日（１９９７．１０．１７）【補正内容】請求の範囲１．緩衝系の包含時に加圧蒸気殺菌されている、１５℃でのｐＨが９．５以下であるアンモニアまたは水溶性アミンからなる緩衝系を組み合わせた、一つ以上の実質的に飽和されたリン脂質を含む水性脂質組成物であり、ただし、前記リン脂質が荷電リン脂質及び中性リン脂質の組み合わせを含み、かつ前記組成物が非イオン性の多重ヒドロキシル化Ｘ線造影剤を含有するリポソーム組成物である場合には、前記Ｘ線造影剤がリポソームの内部と周囲の水性媒質中に実質的に同じ濃度で存在しないことを条件とする水性脂質組成物。２．リポソームを含有する請求項１に記載の組成物。３．造影効果物質を含有する請求項１または２に記載の組成物。４．前記造影効果物質がエコー源性物質である請求項３に記載の組成物。５．前記造影効果物質が常磁性物質である請求項３に記載の組成物。６．前記造影効果物質が放射線放出物質である請求項３に記載の組成物。７．前記造影効果物質がヨウ素化有機化合物である請求項３に記載の組成物。８．前記造影効果物質が前記組成物のリポソーム内に存在する請求項３〜７のいずれかに記載の組成物。９．治療薬または予防薬を含有する請求項１または２に記載の組成物。１０．化粧剤を含有する請求項１または２に記載の組成物。１１．前記緩衝系がＴＲＩＳ，ＢＩＳ−ＴＲＩＳ，ＡＭＰＤ，ＨＥＰＥＳまたはＴＥＳを含む請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。１２．前記リン脂質が中性リン脂質である請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。１３．実質的に飽和したリン脂質組成物中に、１５℃でのｐＨが９．５以下でありかつアンモニアまたは水溶性アミンを含む緩衝系を包含させることおよび前記緩衝系含有組成物を加圧蒸気殺菌することを含み、前記緩衝系の包含が、非イオン性多重ヒドロキシル化Ｘ線造影剤を含みかつ前記Ｘ線造影剤が実質的に同じ濃度でリポソームの内部と周囲の水性媒質中に存在するリポソーム組成物に、前記緩衝系を添加することによる以外である実質的に飽和したリン脂質組成物の安定方法。１４．あらかじめ形成されたリポソーム組成物に前記緩衝系を添加する請求項１３に記載の方法。１５．前記緩衝系をリン脂質組成物に混合し、得られたリン脂質と緩衝剤を含有する混合物中にリポソームを生成する請求項１３に記載の方法。１６．請求項３〜９のいずれかに記載の組成物を造影剤として用いることを特徴とする、造影剤を被験者に投与して被験者の画像を生成する造影強化画像法。１７．画像生成がＸ線、超音波または磁気共鳴画像法によってもたらされる請求項１６に記載の方法。１８．請求項１０に記載の組成物を施すことを特徴とする、化粧剤を被験者に施す化粧処理方法。１９．請求項９に記載の組成物を投与することを特徴とする、治療薬または予防薬を被験者に投与する治療方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ダッグスタッド，ハラルドノルウェー、エヌ−0401 オスロー、ナイコヴェイエン１−２、ナイコムドイメージングエーエス (72)発明者スカルトビット，ロアルドノルウェー、エヌ−0401 オスロー、ナイコヴェイエン１−２、ナイコムドイメージングエーエス (72)発明者クラビネス，ジョーノルウェー、エヌ−0401 オスロー、ナイコヴェイエン１−２、ナイコムドイメージングエーエス (72)発明者オステンセン，ジョニーノルウェー、エヌ−0401 オスロー、ナイコヴェイエン１−２、ナイコムドイメージングエーエス (72)発明者谷内清人東京都中央区日本橋３丁目14番10号第一製薬株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】１．１５℃でのｐＨが９．５以下であるアンモニアまたは水溶性アミンからなる緩衝系を組み合わせた、一つ以上の実質的に飽和したリン脂質を含む水性脂質組成物であり、ただし、前記リン脂質が荷電リン脂質及び中性リン脂質の組み合わせを含み、かつ前記組成物が非イオン性多重ヒドロキシル化Ｘ線造影剤を含有するリポソーム組成物である場合には、前記Ｘ線造影剤がリポソームの内部と周囲の水性媒質中に実質的に同じ濃度で存在しないことを条件とする水性脂質組成物。２．リポソームを含有する請求項１に記載の組成物。３．造影効果物質を含有する請求項１または２に記載の組成物。４．前記造影効果物質がエコー源性物質である請求項３に記載の組成物。５．前記造影効果物質が常磁性物質である請求項３に記載の組成物。６．前記造影効果物質が放射線放出物質である請求項３に記載の組成物。７．前記造影効果物質がヨウ素化有機化合物である請求項３に記載の組成物。８．前記造影効果物質が前記組成物のリポソーム内に存在する請求項３〜７のいずれかに記載の組成物。９．治療薬または予防薬を含有する請求項１または２に記載の組成物。１０．化粧剤を含有する請求項１または２に記載の組成物。１１．前記緩衝系がＴＲＩＳ，ＢＩＳ−ＴＲＩＳ，ＡＭＰＤ，ＨＥＰＥＳまたはＴＥＳを含む請求項1〜１０のいずれかに記載の組成物。１２．前記リン脂質が中性リン脂質である請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。１３．実質的に飽和したリン脂質組成物中に、１５℃でのｐＨが９．５以下でありかつアンモニアまたは水溶性アミンを含む緩衝系を包含させることを含み、非イオン性多重ヒドロキシル化Ｘ線造影剤を含みかつ前記Ｘ線造影剤が実質的に同じ濃度でリポソームの内部と周囲の水性媒質中に存在するリポソーム組成物に、前記緩衝系を添加することによる以外である実質的に飽和したリン脂質組成物の安定方法。１４．あらかじめ形成されたリポソーム組成物に前記緩衝系を添加する請求項１３に記載の方法。１５．前記緩衝系をリン脂質組成物に混合し、得られたリン脂質と緩衝剤を含有する混合物中にリポソームを生成する請求項１３に記載の方法。１６．請求項３〜９のいずれかに記載の組成物を造影剤として用いることを特徴とする、造影剤を被験者に投与して被験者の画像を生成する造影強化画像法。１７．画像生成がＸ線、超音波または磁気共鳴画像法によってもたらされる請求項１６に記載の方法。１８．請求項１０に記載の組成物を施すことを特徴とする、化粧剤を被験者に施す化粧処理方法。１９．請求項９に記載の組成物を投与することを特徴とする、治療薬または予防薬を被験者に投与する治療方法。