JP2000510450A - 群体ホヤ類のリッソクリヌム種からの環状ヘプタ―ペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 抗腫瘍活性を有する新規な環状ヘプタペプチドのトランクアミドＡは、オーストラリアのグレートバリアリーフで採取したリッソクリヌム種（Lissoclinum sp．）から単離された。構造は式（Ｉ）であることが決定された。

Description

【発明の詳細な説明】 群体ホヤ類のリッソクリヌム種からの環状ヘプタ−ペプチド誘導体 本発明は、トランクアミドＡ（trunkamide A）に関する。 発明の背景 ホヤ類のリッソクリヌム（Lissoclinum）属は、新規な生物学的に活性な天然 産物の極めて豊富な供給源であることが証明されている。例えばリッソクリヌム ・パテラ（Lissoclinum patella）からは、２０以上のチアゾール含有環状ペプ チド、３つの非常に細胞毒性の強いチアゾール含有マクロライドおよび１つの抗 菌性ポリケチドラクトンが得られた（Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．，１９９４， １１，３５５および一連のそれ以前の報告）。別の種であるリッソクリヌム・ビ ストラツム（L．bistratum）は、環状ヘキサペプチド（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ，１９９２，４８，３４１；およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９２，５７，６ ６７１）、ヘプタペプチド（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９３，２ ８７１）および２つの極めて毒性のスピロケタールアミド（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ ｍ．，１９８９，３２，１３５４；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９８８，４４， ４５１；およびＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９２，１１４，１１１０を 参照のこと）を産生することが報告されている。リッソクリヌム・（ディデムヌ ム）・ヴォエルツコウイ（Lissoclinum（didemnum）voeltzkowi）は、抗白血病 性シクロペンテノンを産生する（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８８，１ １０，１３０８）が、一方リッソクリヌム・バリュー（L．vareau）は、明るい 赤色の複素環式芳香族顔料（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５４，４２５ ６）およびヒト大腸癌に対して細胞毒性のベンゾペンタチエピン（Ｊ．Ａｍｅｒ ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，１１３，４７０９）を産生する。 発明の要約 本発明は、式：の化合物トランクアミドＡおよびトランクアミドＡの薬剤学的に許容される酸付 加塩を提供する。 本発明の化合物のトランクアミドＡは、ヒト腫瘍から誘導される細胞株に対す る抗腫瘍活性を示す。例として、本化合物は細胞株Ｐ−３８８マウスリンパ腫、 Ａ−５４９ヒト肺癌、ＨＴ−２９ヒト大腸癌およびＭＥＬ−２８ヒト黒色腫に対 して活性である。従って、本発明はさらに、治療上有効量のトランクアミドＡま たはトランクアミドＡの薬剤学的に許容される酸付加塩を、罹患した個体に投与 することを含んでなる、トランクアミドＡに対して感受性の悪性腫瘍に罹患した 哺乳動物の治療方法を提供する。トランクアミドＡまたはその塩は、薬剤組成物 の形で投与することができる。 本発明はまた、トランクアミドＡもしくはその薬剤学的に許容される酸付加塩 と、薬剤学的に許容される担体とを含有する薬剤組成物、さらにはこのような組 成物の調製方法に関する。 本発明の薬剤組成物の例は、経口、局所、非経口またはさらに別の投与方法の ための、任意の固体（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤など）または液体（液剤 、懸濁剤または乳剤）処方を含む。これらは、他の薬理学的に活性な化合物と組 合せて本化合物を含有してもよい。非経口的に投与される時、これらの組成物は 無 菌であることが必要なこともある。 トランクアミドＡを含む薬剤組成物の正確な用量は、製剤処方、適用の方法、 および治療される特定の部位、宿主および細菌または腫瘍により変化する。年齢 、体重、性別、食餌、投与の時間、排泄の速度、宿主の健康状態、薬剤の組合せ 、反応感受性および疾患の重篤度のような他の要因も考慮される。投与は、最大 許容用量内で連続的または周期的に行うことができる。 本発明はさらに、新規化合物のトランクアミドＡの合成方法を提供する。トラ ンクアミドＡは、環状ペプチドであり、このようなペプチドの調製のための従来 法を容易に採用することができる。例えば、トランクアミドＡは、線状ペプチド のＬ−Ｐｒｏ−Ｔｚｎ．Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｄａｔ−Ｌ−Ｄａｓ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ −Ａｌａ（ここで、Ｔｚｎ．Ｐｈｅは、フェニルアラニンチアゾリンであり、Ｄ ａｔは、ジメチルアリルトレオニンであり、そしてＤａｓは、ジメチルアリルセ リンである）の環化された形態と見なすことができる。例として、このような線 状ペプチドは、以下の反応工程図により調製して環化することができる： この経路において、テトラペプチド単位のＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｉｌｅｕ は、ベンジルエステルまたは他の適切な基として保護されたＰｈｅのカルボキシ ルにより調製する。Ｓｅｒ−Ｔｈｒ単位は、容易に脱離可能な基で保護されたヒ ドロキシ基により別個に調製し、次にテトラペプチドと反応させる。生じたヘキ サペプチドは、例えば、Ｐｈｅ上のベンジルエステル、およびＴｈｒのアミノ基 を保護するＢｏｃ基を有する。このベンジル基は、加水分解により脱離し、そし てチアゾリン環は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６１，６５５６−６５６ ２に記載されるように、オキサゾールから作成することができる。次にＢｏｃ基 の脱離により、環化して環状保護ペプチドを得ることができる。ヒドロキシ保護 基の脱離、およびメシラートまたはトシラートによる置換により、２−メチル− ３−ブテン−２−オールによる求核置換が可能になる。 上記方法の小さな変更、または環化のための代替の線状ペプチドの合成に基づ く大きな変更のいずれによっても、他の合成方法を利用することができる。 トランクアミドＡは、オーストラリアのホヤ類の試料から単離された新規な環 状ヘプタペプチドである。小さい緑色および白色の群体ホヤ類のリッソクリヌム 種（Lissoclinum sp．）は、オーストラリアのグレートバリアリーフのブランブ ル（Bramble）およびリトルトランクリーフ（Little Trunk Reefs）で採取した 。ブランブルリーフの座標は、南緯１８．２５度、東経１４６．４３度であり、 リトルトランクリーフの座標は、南緯１８．２２度、東経１４６．５０度である 。このホヤ類は、リッソクリヌム・パテラ（Lissoclinum patella）と見分けが つかず、群体は一般に直径１〜３cmである。この群体は、グレートバリアリーフ 系内の他の多くのリーフに散在する。リッソクリヌム種（Lissoclinum sp．）の 保存標本は、オーストラリア、北クイーンズランド州、タウンズヴィル（Townsv ille）、熱帯北クイーンズランド博物館（the Museum of Tropical North Queen land）に寄託されている。 採取したリッソクリヌム種（Lissoclinum sp．）からの凍結乾燥組織をジクロ ロメタンにより抽出し、次にシリカゲルでこの抽出物を精製することにより、２ つの画分を得た。極性画分を逆相高性能液体クロマトグラフィーに付して、トラ ンクアミドＡおよび他の化合物を得た。 すなわち、本発明はまた、トランクアミドＡ産生ホヤ類のリッソクリヌム種（ Lissoclinum sp．）からの抽出を含んでなる、トランクアミドＡの調製方法を提 供する。 トランクアミドＡは、好ましくは実質的に純粋な形で提供される。詳細には、 トランクアミドＡは、通常リッソクリヌム種（Lissoclinum sp．）の細胞成分ま たは破片を実質的に含まない。 発明の例 本発明を下記の例によりさらに例示するが、これらは本発明の理解を助けるが 本発明を限定するものではない。本明細書に報告される全ての百分率は、他に記 載がなければ、重量による。全ての温度は、摂氏度で表される。全てのインキュ ベーションは、２８℃で実施し、フラスコは軌道振盪機（orbital shaker）中で ２５０rpmで振盪する。全ての培地およびレシピエントは、無菌であり、全ての 培養方法は無菌的である。 試料採取および抽出 小さい緑色および白色の群体ホヤ類のリッソクリヌム種（Lissoclinum sp．） は、スキューバ（SCUBA）（−３ｍ）を使用して１９９２年６月にオーストラリ アのグレートバリアリーフの中央部のブランブルおよびリトルトランクリーフで 採取し、凍結乾燥してから検討した。凍結乾燥したホヤ類（９１ｇ）は、最初に ジクロロメタンで、そして次にメタノールで徹底的に抽出した。ジクロロメタン 抽出物を濃縮して暗緑色の残渣（０．８８ｇ）を得た。この残渣を、軽油からア セトンそしてメタノールへの溶媒勾配により、迅速にシリカゲル（メルクシリカ ゲル（Merck Silica gel）、タイプ６０）のクロマトグラフィーに付した。軽油 ／アセトン（１：１）で溶出した画分を、軽油／アセトン（４：１）でさらにシ リカゲルのクロマトグラフィーに付して、リッソクリノイド（lissoclinoide） （１．４０mg）と多くのペプチドの混合物を含有する画分とを得た。このペプチ ド画分を逆相ＨＰＬＣ（メタノール／水（８／２）で溶出）で精製して、トラン クアミドＡ（２．１５mg、０．０１６％）を得た。 トランクアミドＡは、無色の油状物［α］Ｄ−２３１°（ｃ，０．０６ＣＨＣ ｌ₃中）として得た。実測値:（高分解能電子衝撃イオン化質量スペクト ル）Ｍ⁺、８３７．４４８７。Ｃ₄₃Ｈ₆₃Ｎ₇Ｏ₈Ｓの計算値：Ｍ⁺、８３７．４４５ ９。λ_max（ＥｔＯＨ）２４８nm（１４３００）。ν_max（ＣＨＣｌ₃）３６８３ 、３６１９、３４１３、３０１８、２９７６、１７２７、１６６７、１６６４、 １６０３、１５１７、１４７６、１４２４、１３９０、１２２２、１０７８、１ ０４６、９２９、９０９、８７７、８５０cm^-1。電子衝撃イオン化質量スペクト ルｍ／ｚ ８３７（Ｍ、４６％）、７６８（２８）、７１５（１００）、７００ （４８）、６５６（６６）、５８９（２５）、３０２（４０）、１８８（６９） 、１６７（７８）、１２６（６０）。 ＣＤＣｌ₃中のトランクアミドＡのＮＭＲスペクトルデータは以下の通りであ った： トランクアミドＡは、高分解能電子衝撃イオン化質量スペクトルにより分子式 Ｃ₄₃Ｈ₆₃Ｎ₇Ｏ₈Ｓを有することが証明された。¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルは、１２ ９．６および１２８．３ppm（それぞれ２つの等価の芳香族炭素原子に由来）の シグナル、および２５．６ppmの３つの一致したメチル炭素のシグナルを含む３ ９の共鳴を含んでいた。ＤＥＰＴとＣＨ−相関実験の組合せにより、全てのプロ トン化炭素を割り当てることができた。¹³Ｃ ＮＭＲスペクトル中の１７４〜１ ６７ppmの間の７つの第四級炭素シグナル、および¹Ｈ ＮＭＲスペクトルの５つ のアミドプロトン二重項は、ＰｒｏおよびＴｚｎ単位を有するヘプタペプチドを 示唆した。多重ＮＭＲ実験およびマーフィー（Marfey）誘導体化（Ｃａｒｌｓｂ ｅｒｇ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８４，４９，５９１）後の加水分解産物 のＨＰＬＣからのデータの分析により、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ａｌａ、 Ｌ−Ｄａｓ、Ｌ−ＤａｔおよびＴｚｎ−Ｌ−Ｐｈｅ残基が示された。Ｉｌｅを除 く各アミノ酸からのカルボニル炭素は、各β−プロトンから観察されたＨＭＢＣ 相関から疑いなく割り当てた。Ｄａｔ、Ｄａｓ、およびＩｌｅのα−プロトンの¹ Ｈ ＮＭＲ化学シフトは一致（４．５５ppmで）したため、この一群のシグナル への相関の解釈はあいまいであった。幸運にも、カルボニル炭素共鳴への多くの 他の相関により、アミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｔｚｎ−Ｐｈｅ−Ｄａｔ−Ｄａｓ−Ｉｌ ｅ−Ａｌａを確立することができた。ＡｌａのカルボニルをＰｒｏの窒素に結合 させるアミド結合を仮定して、サイクルを閉じた。この配列をさらに支持したの は、Ｎ．Ｏ．ｅ．示差実験であった。４．３８ppmのＰｒｏのα−プロトンと７ ．３０のＰｈｅ ＮＨの間、６．３２のＩｌｅ ＮＨと７．５５の Ｄａｓ ＮＨ、および４．４９ppmのＡｌａ α−プロトンと３．５０〜３．５ ２のＰｒｏ δ−プロトンの間の強力なＮ．Ｏ．ｅは、これらの対のアミノ酸の それぞれが空間的に極めて近接していることを示した。すなわちトランクアミド Ａは、所定の構造を有することが証明された。 トランクアミドＡの立体化学 典型的な加水分解において、ペプチド（０．４mg）を密閉ガラス管中の６ＮＨ Ｃｌ（5ml）中で１０３℃で２２時間加熱した。生じた加水分解産物を凍結乾燥 し、蒸留水（４０μｌ）に溶解して、アセトン（６０μｌ）中のＦＤＡＡ（０． ５mg）および１Ｎ重炭酸ナトリウム（２０μｌ）で４０℃で１時間誘導体化した 。反応の終了後、溶液を２Ｎ ＨＣｌ（１０μｌ）で酸性にして、分析するまで 暗所に保存した。ＦＤＡＡ誘導体化加水分解産物のＨＰＬＣ分析（Ｃ１８アクテ ィボンゴールドパック（Activon goldpak）カラム；線形勾配溶出、リン酸トリ エチルアンモニウム（５０mM、ｐＨ３．０）／アセトニトリル、４０分で９０： １０〜６０：４０；２．０ml／分；３４０nmでＵＶ検出）により、構成アミノ酸 の立体化学を確立した。クロマトグラフィー図の各ピークは、その保持時間を純 粋なアミノ酸標準品のＦＤＡＡ誘導体の保持時間と比較して同時注入することに より同定した。 トランクアミドＡの生物学的活性 １０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０^-2Ｍ重炭酸ナトリウムおよび０．１g/l ペニシリン−Ｇ＋硫酸ストレプトマイシンを補足した、アール平衡塩（Earle's Balanced Salts）、２．０mM Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸を含み、重炭酸 ナトリウムを含まないイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ／ｎｅａａ）中で細胞を 対数増殖期で維持した。 この化合物の抗腫瘍活性を決定して比較するために、Bergeronら［Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．Ｂｉｏｐｈ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９８４，１２１（３），８４８−８５ ４］により記載された方法の変法を用いて、簡便なスクリーニング方法を行った 。使用した抗腫瘍細胞は、Ｐ−３８８（ＤＢＡ−２マウスからのリンパ球腫瘍の 懸濁培養物）、Ａ−５４９（ヒト肺癌の単層培養物）、ＨＴ−２９（ヒト大腸癌 の単層培養物）およびＭＥＬ−２８（ヒト黒色腫の単層培養物）で あった。 Ｐ−３８８細胞は、１６mmウェルに所定濃度の薬剤を含有するＭＥＭ ５ＦＣ Ｓのアリコート１ml中の１ウェル当たり１×１０４細胞で接種した。薬剤を含ま ない別のセットの培養物を、細胞が指数増殖期に維持されていることを確認する ために、対照増殖として接種した。全ての測定は、二重測定で行った。３７℃、 １０％ ＣＯ₂で９８％加湿雰囲気で３日間インキュベーション後、薬剤を含む ウェルの増殖を対照ウェルの増殖に対して比較することにより概算ＩＣ５０を決 定した。 Ａ−５４９、ＨＴ−２９およびＭＥＬ−２８細胞は、１６mmウェルに所定濃度 の薬剤を含有するＭＥＭ １０ＦＣＳのアリコート１ml中の１ウェル当たり２× １０４細胞で接種した。薬剤を含まない別のセットの培養物を、細胞が指数増殖 期に維持されていることを確認するために、対照増殖として接種した。全ての測 定は、二重測定で行った。３７℃、１０％ ＣＯ₂で９８％加湿雰囲気で３日間 インキュベーション後、ウェルを０．１％クリスタルバイオレットで染色した。 薬剤を含むウェルの増殖を対照ウェルの増殖に対して比較することにより概算Ｉ Ｃ５０を決定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ガルシア，グラバロス，ドロレス スペイン国 イー―28760 トレス キャ ントス，カルレ ド ラ カレラ，３，フ ァルマ マル，ソシエダッド アノニマ内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 式： の化合物トランクアミドＡ、およびトランクアミドＡの薬剤学的に許容される酸 付加塩。 2. 式: のトランクアミドＡ、もしくはトランクアミドＡの薬剤学的に許容される酸付加 塩と、薬剤学的に許容される担体とを含有する薬剤組成物。 3. トランクアミドＡに感受性の悪性腫瘍に罹患した哺乳動物の治療方法であ って、治療上有効量の式：のトランクアミドＡまたはトランクアミドＡの薬剤学的に許容される酸付加塩を 、罹患した個体に投与することを含んでなる上記方法。