JP2000501606A

JP2000501606A - 酵素活性をスクリーニングする方法

Info

Publication number: JP2000501606A
Application number: JP9521457A
Authority: JP
Inventors: ショート，ジェイ，エム．
Original assignee: リコンビナントバイオカタリシス，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-12-07
Filing date: 1996-12-06
Publication date: 2000-02-15
Also published as: WO1997020918A1; ATE260987T1; EP1130090A2; DE69631787D1; EP0866853A1; DE69631787T2; CA2239686A1; AU1148997A; EP1130090A3; EP0866853A4; AU720334B2; JP2001078786A; IL124794A; EP0866853B1; IL124794A0

Abstract

(57)【要約】一種以上の生物から回収されたＤＮＡあるいはランダム指向性突然変異誘発にかけられたＤＮＡのプールから所望の酵素活性を同定する方法が開示される。該方法は、宿主細胞中でＤＮＡライブラリーを作製し、所望の活性についてスクリーニングすることを含む。該方法は、低温で改善された酵素活性を有する熱安定性タンパク質を開発することに応用できる。

Description

【発明の詳細な説明】酵素活性をスクリーニングする方法本出願は、1995年12月７日に出願されたアメリカ特許仮出願60/008,317号（係属中）の一部継続出願である1996年８月２日出願のアメリカ特許出願08/692,002 号（係属中）の一部継続出願であり、1995年12月７日に出願されたアメリカ特許仮出願60/008,316号（係属中）の一部継続出願である1996年５月22日出願のアメリカ特許出願08/651,568号（係属中）の一部継続出願であり、1995年12月７日に出願されたアメリカ特許仮出願60/008,311号（係属中）の一部継続出願である。本発明は、発現ライブラリーの作製及び酵素活性についてのそのスクリーニングに関し、特に、微生物のＤＮＡから選択されたＤＮＡを得ること、選択されたＤＮＡから製造された発現ライブラリーを酵素活性についてスクリーニングすること、ＤＮＡの指向性突然変異誘発、及び得られた特定のタンパク質、特に酵素、対象となる活性について突然変異を誘発されたＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすること、及び熱安定性酵素に関し、特に本発明は、高温で安定であり、低温では改良された活性を有する熱安定性酵素に関する。発明の概要産業界においては、広範な種類の産業的用途のための新規な酵素の必要性が認識されている。そこで、種々の微生物をスクリーニングしてその微生物が所望の酵素活性を有しているかどうか確認することが行われてきた。そのような微生物が所望の酵素活性を有していれば、それから酵素を回収する。本発明は、酵素をさらなる用途、例えば広範な工業的用途、医療用途、研究試薬として使用するためにキットにパッケージングすること等のために酵素を得る新規な方法を提供するものである。すなわち、本発明によれば、微生物から組換え酵素が生成され、これらは種々の酵素的特徴により分類されるものである。特に、本発明の一つの形態によれば、特定の酵素活性を有するクローンを同定するための方法であって、 (i)上記特定の酵素活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む少なくとも一種のプローブＤＮＡを使用することにより、少なくとも一種の微生物から得たＤＮＡから標的ＤＮＡを選択的に単離し、 (ii)単離された標的ＤＮＡを用いて宿主を形質転換して、活性ライブラリースクリーニングまたは核酸ライブラリースクリーニング法を使用して、好ましくは上記特定の酵素活性についてスクリーニングされるクローンのライブラリーを作製することにより調製されたクローンのライブラリー中で上記の特定の酵素活性についてスクリーニングすることを含む、前記方法が提供される。この形態の好ましい態様においては、少なくとも一種の微生物から得られるＤＮＡは、プローブＤＮＡ配列に例えばハイブリダイゼーションにより特異的に結合するＤＮＡから回収することにより選択される。一種以上の微生物から得たＤＮＡはゲノムＤＮＡであってもよく、あるいはゲノム遺伝子ライブラリーＤＮＡであってもよい。例えば、ベクター結合用に調製されたＤＮＡを使用することもできる。プローブは固相に直接または間接的に結合することができ、これにより、プローブにハイブリダイズしないかＤＮＡあるいは特異的に結合しないＤＮＡからそれを分離する。前記方法は、前記のハイブリダイズしたあるいは結合したＤＮＡを回収した後にそのプローブからＤＮＡを遊離させ、そのように遊離されたＤＮＡを増幅することも含んでもよい。本発明はまた、遺伝子クラスタータンパク質産物についての発現ライブラリーのスクリーニングを提供し、特に、原核生物または真核生物のＤＮＡから選択された遺伝子クラスターを得ること、及び対象の選択された遺伝子クラスターＤＮＡの発現から得られるタンパク質のファミリーの関連する活性を有するタンパク質の所望の活性について発現ライブラリーをスクリーニングすることを提供する。特に、この形態の一つの態様は、特定のタンパク質活性を有するクローンを同定するための方法であって、(i)対象となる特定の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む少なくとも一種のプローブポリヌクレオチドを使用することにより、少なくとも一種の生物から得たＤＮＡから標的遺伝子クラスターＤＮＡを選択的に単離し、(i i)単離された標的遺伝子クラスターＤＮＡを用いて宿主を形質転換して、上記の対象の特定の活性についてスクリーニングされるクローンのライブラリーを作製することにより調製されるクローンのライブラリー中で上記の特定の酵素活性についてスクリーニングすることを含む前記方法が提供される。例えば、λベクター中のＤＮＡを使用すると、この経路を使用してＤＮＡをパッケージし、細胞を感染させることができるであろう。この形態の特定の態様においては、生物のゲノムＤＮＡから得られた遺伝子クラスターＤＮＡは、プローブＤＮＡ配列に例えばハイブリダイゼーションにより特異的に結合するＤＮＡから回収することにより選択される。ポリヌクレオチドプローブは固相に直接または間接的に結合することができ、それにより、該プローブにハイブリダイズしないＤＮＡあるいは特異的に結合しないＤＮＡがそれから分離される。本発明の方法のこの形態のこの態様は、前記のハイブリダイズしているかあるいは結合したＤＮＡを回収した後にそのプローブから結合ＤＮＡを遊離させ、その遊離したＤＮＡを増幅することも含んでもよい。本発明の別の形態は、異種ＤＮＡ集団に由来する特定の酵素活性を有する酵素を得るための方法であって、特定の酵素活性の生成に対する指向性突然変異誘発にかけられた異種ＤＮＡ集団からのＤＮＡを含むクローンのライブラリーを、前記の特定の酵素活性についてスクリーニングすることを含む方法を提供する。本発明の別の形態は、特定の酵素活性を有する酵素を得るための方法であって、その特定の酵素活性と同じであってもよく異なるものであってもよい一以上の所望の特徴を有する酵素をコードするＤＮＡをクローンのライブラリーで生成する試みにおいて指向性突然変異誘発にかけられたＤＮＡ集団のプールからのＤＮＡを含むクローンのライブラリーを、その特異的な酵素活性についてスクリーニングすることを含む方法を提供する。好ましい態様においては、指向性突然変異誘発にかけられる前記ＤＮＡプールは、少なくとも一種の酵素的特徴、特に少なくとも一種の共通の(common)酵素活性を有する酵素をコードするように選択されたＤＮＡのプールである。また、遺伝子クラスターの異種集団に由来する特定の活性を有するタンパク質を得るための方法であって、対象となる特定のタンパク質活性の生成に対する指向性突然変異誘発にかけられた異種遺伝子クラスター集団からの遺伝子クラスターを含むクローンのライブラリーを、前記の特定の酵素活性についてスクリーニングすることによる方法を提供する。また、特定の活性を有する遺伝子クラスタータンパク質産物を得る方法であって、指向性突然変異誘発にかけられた遺伝子クラスター集団のプールからの遺伝子クラスターを含むクローンのライブラリーをその特定のタンパク質活性についてスクリーニングして、前記クローンのライブラリーにおいてその特定のタンパク質活性と同じであってもよく異なるものであってもよい一以上の所望の特徴を有するタンパク質をコードする遺伝子クラスターを生成することを含む方法を提供する。好ましくは、指向性突然変異誘発にかけられる前記遺伝子クラスターのプールは、少なくとも一種の治療的、予防的、あるいは生理学的制御活性の合成における酵素活性を有するタンパク質をコードするように選択されたものである。これらの形態の方法はいずれも、指向性突然変異誘発の前に、指向性突然変異誘発の前に観察される活性と同じであってもよく異なるものであってもよい少なくとも一種の共通の物理学的、化学的、あるいは機能的特徴を有するタンパク質をコードするポリシストロン性配列を含む遺伝子クラスターを遺伝子クラスターの異種集団から選択的に回収することをさらに含んでいてもよい。好ましくは、遺伝子クラスター調製物の回収は、対象となる遺伝子クラスターの少なくとも一部分についての、固相結合ハイブリダイゼーションプローブのような、特異的な結合相手と遺伝子クラスター集団を接触させることを含む。得られるタンパク質の共通の特徴は、上記に挙げた活性の種類、すなわち共通の合成経路の一部として関与する一連の酵素、あるいはホルモンもしくはシグナル伝達、または代謝経路または病原体におけるそれらの機能等の阻害ができるタンパク質などの種類のクラスとすることができる。遺伝子クラスターＤＮＡは、対象となる活性を示す異種遺伝子クラスター集団からのそのような遺伝子クラスターＤＮＡを含むクローンから回収される。好ましくは、指向性突然変異誘発は部位特異的指向性突然変異誘発である。この方法はさらに、指向性突然変異誘発にかける前に、上記対象となる活性と同じであってもよく異なるものであってもよい活性について、クローンのライブラリーを予備スクリーニングする工程を含むことができる。この活性は、例えば、対象となるタンパク質、あるいはタンパク質の関連ファミリーの発現から得られるものとすることができる。これらの形態の方法はいずれも、前記指向性突然変異誘発の前に、特定の酵素活性と同じであってもよく異なるものであってもよい少なくとも一つの共通の特徴を有する酵素をコードするＤＮＡ配列を、異種ＤＮＡ集団から選択的に回収することをさらに含んでいてもよい。好ましくは、ＤＮＡ調製物の回収は、コード配列の少なくとも部分についての、固相結合ハイブリダイゼーションプローブのような、特異的な結合相手とＤＮＡ集団を接触させることを含む。共通の特徴は、例えば酵素活性の一種、例えばヒドロラーゼ活性とすることができる。ＤＮＡは、酵素活性の一種を示す異種ＤＮＡ集団からのＤＮＡを含むクローンから回収される。好ましくは、指向性突然変異誘発は部位特異的指向性突然変異誘発である。この形態の方法はさらに、指向性の突然変異誘発にかける前に、特定の酵素活性と同じであってもよく異なるものであってもよい活性について、クローンのライブラリーを予備スクリーニングする工程を含むことができる。この活性は、例えば、対象となるタンパク質の発現から得られるものとすることができる。ＤＮＡライブラリーが誘導される異種ＤＮＡ集団はＤＮＡの複合的な混合物であり、例えば環境的なサンプルから得られるものである。そのようなサンプルは、培養できない、あるいは培養されていない、あるいは培養された複数あるいは単一の種の生物を含むものとすることができる。このような環境的サンプルは、例えば、北極及び南極の氷、水あるいは永久凍土ソース、火山起源の材料、熱帯地域の土壌あるいは植物ソース等から得られる。環境的サンプルを対象となる生物について濃縮するためには種々の公知の技術を使用することができ、鑑別培養 (differential culturing)、沈降勾配、アフィニティーマトリックス、毛細管電気泳動、光学ピンセット、蛍光活性化細胞ソーティング等が挙げられる。サンプルは単一の生物の培養物であってもよい。熱安定性酵素は60℃を越える温度で機能する酵素である。熱安定性酵素は産業的に、また生物医学的研究で、特定のいくつかの工程が著しく高い温度で行われるアッセイにおいて使用される。熱安定性酵素は、温泉、火山起源のもの、熱帯地域等において見られる好熱性生物から得ることができる。そのような生物の例としては、他の微生物の中でも、例えば、真性細菌及び古細菌のような原核微生物(Ｂronneomerier,Ｋ.and Ｓtaudenbauer,Ｗ.Ｌ.,Ｄ.Ｒ.Ｗoods(ed),the Ｃlos tridia and Ｂiotechnology,Ｂutterworth Ｐublishers,Ｓtoneham,Ｍ.Ａ.(1993))が挙げられる。熱安定性酵素は、その中温性の対応物と比較してより長い貯蔵寿命と有機溶媒耐性を示す。所望の最低温度で酵素活性を示す熱安定性酵素には産業上及び研究上の用途がある。この例は、分子診断においてレポーター分子が室温またはより高い温度での長期間の貯蔵において生存しなければならない場合、あるいは通常ではない環境下で機能しなければならない場合、ならびに熱安定性酵素の活性が一般的に非常に低い室温においてそれを使用するアッセイを行う場合等において見られる。従って、本発明の別の態様は、低温において改良された酵素活性を有し、酵素からなる群から選択されるメンバーである熱安定性酵素、または該酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する方法であって、 (a)少なくとも60℃の温度で安定な少なくとも一種の酵素を突然変異誘発にかけ、 (b)少なくとも60℃の温度で安定で、50℃未満の温度で酵素活性を有し、工程(a)の酵素よりも高い活性を有する突然変異酵素、または突然変異酵素をコードするポリヌクレオチドについて(a)で製造された突然変異体をスクリーニングすることを含む方法を提供する。本発明のこれらの形態及びその他の形態は本明細書の教示から当業者に明らかであろう。図面の簡単な説明図 1Ａ及び 1Ｂ。図 1Ａは、実施例２に記載した標準及びサンプルa〜fを含むアガロースゲルの写真である。サンプルc〜fは、実施例２に記載したように、２種の特異的なＤＮＡプローブを使用してゲノムＤＮＡライブラリーから回収し、遺伝子特異的なプライマーを使用して増幅したＤＮＡを示す。図 1Ｂも、実施例２に記載した標準及びサンプルa〜fを含むアガロースゲルの写真である。サンプルc〜fは、実施例２に記載したように、２種の特異的なＤＮＡプローブを使用してゲノムＤＮＡライブラリーから回収し、ベクター特異的なプライマーを使用して増幅したＤＮＡを示す。図２は、４つのコロニーハイブリダイゼーションプレートの写真である。プレートＡ及びＢは、陽性クローン、すなわち本発明に従って調整したＤＮＡを含み、プローブ配列も含むコロニーを示す。プレートＣ及びＤは対照であり、陽性クローンを示していない。図３は、サーモコッカス(Ｔhermococcus)9Ｎ2β-グリコシダーゼの完全長ＤＮＡ配列及び対応する推定アミノ酸配列を示す。好ましい態様の詳細な説明用語「得られた(derived)」または「単離された」は、物質が当初の環境（例えば天然に存在するものである場合は自然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生体動物中に存在する天然のポリヌクレオチドあるいはポリペプチドは単離されたものではないが、自然の系において共存するいくらかあるいは全ての物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されたものである。用語「エラーを起こしやすいＰＣＲ(error-prone ＰＣＲ)」は、ＤＮＡポリメラーゼのコピーの忠実度(fidelity)が低い条件下でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の全長にわたって高い確率で点突然変異が得られるようにした方法をいう(Ｌeung ，Ｄ.Ｗ.ら、Ｔechnique,1:11-15(1989)及びＣaldwell,Ｒ.Ｃ.＆Ｊoyce Ｇ.Ｆ. ,ＰＣＲＭethods Ａpplic.,2:28-33(1992))。用語「オリゴヌクレオチド指向性(directed)突然変異誘発」は、対象となる任意のクローン化されたＤＮＡセグメントにおいて部位特異的突然変異を生成させることができる方法をいう(Ｒeidhaar-Ｏlson，Ｊ.Ｆ．＆Ｓauer，Ｒ.Ｔ.ら、Ｓcience，241:53-57(1988))。用語「アセンブリーＰＣＲ(assembly ＰＣＲ)」は、小さいＤＮＡ断片の混合物からのＰＣＲ産物のアセンブリーを使用する方法をいう。同じバイアル中で多数の異なるＰＣＲ反応が平行して起こり、一つの反応の産物が他の反応の産物の生成を促す(priming)。用語「性的(sexual)ＰＣＲ突然変異誘発」は、配列相同性に基づいたＤＮＡ分子のランダム断片化により起こされる、異なっているが高度に相関しているＤＮＡ配列のＤＮＡ分子間のin vitroでの強制的な相同的組換えと、その後のＰＣＲ反応におけるプライマー伸長による乗換え(crossover)の固定をいう(Ｓtemmer，Ｗ.Ｐ. ，ＰＮＡＳ,ＵＳＡ,91:10747-10751(1994))。用語「in vivo突然変異誘発」は、一種以上のＤＮＡ修復経路に突然変異を有する大腸菌の株においてＤＮＡを増幅を使用する、対象となる任意のクローン化ＤＮＡにおいてランダム突然変異を生成する方法をいう。これらの「ミューテーター」株は野性型親株のものよりも高いランダム突然変異率を有する。これらの株の一つにおけるＤＮＡの増幅により、最終的に該ＤＮＡ中のランダム突然変異が生成される。用語「カセット突然変異誘発」は、二本鎖ＤＮＡ分子の小さい領域を、本来の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」により置換するための任意の方法をいう。該オリゴヌクレオチドは、完全に及び／または部分的にランダム化した本来の配列を含むものとすることが多い。用語「帰納的集合突然変異誘発(recursive ensemble mutagenesis)」は、表現型が関連する変異体の種々の集団であって、そのメンバーがアミノ酸配列において異なるものを製造するために開発されたタンパク質処理(engineering)（タンパク質突然変異誘発）のためのアルゴリズムをいう。この方法では、フィードバックメカニズムを使用して組合せカセット突然変異誘発の連続的なサイクルを制御する(Ａrkin,Ａ.Ｐ.及びＹouvan,Ｄ.Ｃ.,ＰＮＡＳ,ＵＳＡ,89:7811-7815(1992 ))。用語「指数的(exponential)集合突然変異誘発」は、ユニークで機能的な変異体を高いパーセンテージで含む組合せライブラリーを生成する方法をいい、この方法では、残基の小さい基(groups)が平行してランダム化され、各変化部分で機能的なタンパク質を与えるアミノ酸が同定されるものであり(Ｄelegrave，Ｓ．お及びＹouvan,Ｄ.Ｃ.，Ｂiotechnology Ｒesearch，11:1548-1552(1993))、またランダム及び部位指向性突然変異誘発(Ａrnold，Ｆ.Ｈ.，Ｃurrent Ｏpinion in Ｂiotechnology，4:450-455(1993))をいう。上記で挙げた文献はいずれも引用により全体を本明細書の一部とする。上記の形態のいずれかについて記載したように、本発明は、微生物から得られた選択されたＤＮＡを含むクローンの酵素活性についてのスクリーニングの方法であって、微生物のＤＮＡから選択されたＤＮＡを回収することにより製造されたクローンであって、選択されたＤＮＡが特定の活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列の部分の全部あるいは一部である少なくとも一種のＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションにより選択されたものである、複数のクローンを含むライブラリーを特定の酵素活性についてスクリーニングし、宿主を、選択されたＤＮＡで形質転換して特定の酵素活性についてスクリーニングされるクローンを生成することを含む前記方法を提供する。一つの態様においては、 (a)二本鎖ＤＮＡ集団を一本鎖ＤＮＡ集団にし、 (b)ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で(a)の一本鎖ＤＮＡ集団をリガンドに結合したＤＮＡプローブと接触させて、プローブとそれにハイブリダイズするＤＮＡ集団のメンバーの二本鎖複合体を生成し、 (c)(b)の二本鎖複合体を前記リガンドの固相特異的結合相手と接触させて固相複合体を生成し、 (d)(b)の一本鎖ＤＮＡ集団から固相複合体を分離し、 (e)プローブから固相結合プローブに結合した集団のメンバーを遊離させ、 (f)(e)の集団のメンバーから二本鎖ＤＮＡを形成し、 (g)(f)の二本鎖ＤＮＡを適当な宿主に導入して、選択されたＤＮＡを含む複数のクローンを含むライブラリーを形成し、 (h)該ライブラリーを特定の酵素活性についてスクリーニングすることにより、微生物から得られたＤＮＡライブラリーを選択手順にかけて、そこから特定の酵素活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列の全部あるいは一部である一種以上のプローブＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡを選択する。別の態様においては、 (a)ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で二本鎖ＤＮＡ集団をリガンドに結合したＤＮＡプローブと接触させて、プローブとそれにハイブリダイズするＤＮＡ集団のメンバーの複合体を生成し、 (b)(a)の複合体を前記リガンドの固相特異的結合相手と接触させて固相複合体を生成し、 (c)(b)の未結合ＤＮＡ集団から固相複合体を分離し、 (d)プローブから固相結合プローブに結合した集団のメンバーを遊離させ、 (e)(d)の二本鎖ＤＮＡを適当な宿主に導入して、選択されたＤＮＡを含む複数のクローンを含むライブラリーを形成し、 (f)該ライブラリーを特定の酵素活性についてスクリーニングすることにより、微生物から得られたＤＮＡライブラリーを選択手順にかけて、そこから特定の酵素活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列の全部あるいは一部である一種以上のプローブＤＮＡ配列にハイブリダイズする二本鎖ＤＮＡを選択する。別の形態においては、上記方法は、シグナル配列すなわち分泌配列を含むＤＮＡを回収するための予備選択を含む。このようにして、シグナル配列すなわち分泌配列を含むＤＮＡのみを上記のようにしてハイブリダイゼーションによりＤＮＡ集団から選択することが可能になる。以下のパラグラフに本発明のこの態様のプロトコール、一般的な分泌シグナル配列の種類と機能、及びそのような配列のアッセイや選択方法への具体的な例示的応用をを記載する。この形態の特に好ましい別の態様は、上記(a)の後、(a)の前に、 (i)所与のクラスのタンパク質にユニークな分泌シグナル配列に相補的なリガンド結合オリゴヌクレオチドプローブに、ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で(a)の二本鎖ＤＮＡ集団を接触させて二本鎖複合体を形成させ、 (ii)(a i)の複合体を該リガンドの固相特異的結合相手と接触させて固相複合体を形成し、 (iii)該固相複合体を未結合ＤＮＡ集団から分離し、 (iv)前記固相結合プローブに結合した集団のメンバーを遊離させ、 (v)固相結合プローブをそれに結合した集団のメンバーから分離することをさらに含む。シグナル配列を含むように選択され、単離されたＤＮＡは、次いで上記に記載した選択手順にかけ、そこから特定の酵素活性を有する酵素をコードするＤＮＡから得られた一種以上のプローブＤＮＡ配列に結合するＤＮＡを選択し、単離する。タンパク質が分類されて適切な細胞部位に運ばれる経路は、しばしばタンパク質ターゲッティング(targeting)経路と呼ばれている。これらターゲッティング系の全てにおいて重要な要素の１つは、新しく合成されたポリペプチドのアミノ末端にある、シグナル配列と呼ばれる短いアミノ酸配列である。このシグナル配列は、タンパク質を細胞内の適切な部位へ向かわせる。そして該タンパク質の輸送中または最終目的地へ到着した時にシグナル配列は除去される。ほとんどのリソソームタンパク質、膜タンパク質または分泌タンパク質は、小胞体内腔への輸送を定めるアミノ末端シグナル配列を有する。このグループのタンパク質について100個以上のシグナル配列が配列決定されている。これらの配列の長さはさまざまで、13から36アミノ酸残基である。 pMGと称するphoA発現ベクターは、TaphoAと同様、膜にまたがっている(membra ne-spanning)配列またはシグナルペプチドをコードする遺伝子を同定するのに有用である。Giladi ら，J．Bacteriol.，175(13)：4129-4136，1993。このクローニング系は、外膜および細胞周辺(periplasmic)アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の融合タンパク質と内膜ＡＰ融合タンパク質との区別を容易にするために、pM G 組換え体を大腸菌 KS330（StrauchおよびBeckwith，Proc．Natl．Acad．Sci． USA 85:1576-1580，1988 によって最初に記述された「ブルーハロー(blue halo) 」アッセイに使用された菌株）中に導入して形質転換することによって改変された。pMG/KS330r を用いたクローニングおよびスクリーニング方法は、開裂可能なシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする遺伝子を同定することができる。それゆえ、この方法は興味のあるポリペプチドをコードする遺伝子を同定するための第一工程として役立ちうる。本発明の別な実施態様は、特定の酵素活性の生成のために人為的(directed)突然変異誘発に暴露した異種ＤＮＡ集団由来のＤＮＡを有するクローンライブラリーを該特定の酵素活性についてスクリーニングすることによる、異種ＤＮＡ集団に由来する、特定の酵素活性を有する酵素を得る方法を提供する。この方法はさらに、上記の人為的突然変異誘発の前に、共通の特徴をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡを上記異種ＤＮＡ集団から選択的に回収することを含むことができる。この共通の特徴とは、該特定の酵素活性と同一でも異なっていてもよい。この共通の特徴は、たとえば、あるクラスの酵素活性であることができる。このことは、異種ＤＮＡ集団由来のＤＮＡを有するクローンから、上記クラスの酵素活性を示すＤＮＡを回収することを意味する。この実施態様においては、好ましくは、ＤＮＡ調製物の回収はＤＮＡ集団をコード配列の少なくとも一部に対する特異的結合パートナー（固相結合ハイブリダイゼーションプローブ等）と接触させることにより行われる。この実施態様の方法は、人為的突然変異誘発に暴露する前に上記クローンライブラリーをある活性（これは該特定の酵素活性と同じでも異なっていてもよい）についてプレスクリーニングすることをさらに含むことができる。上記クローンのプレスクリーニングは、例えば、興味のあるタンパク質の発現についてのスクリーニングでありうる。本発明の別の実施態様は、特定の酵素活性を有する酵素を得る方法を提供する。この方法は、該特定の酵素活性と同じ、または異なる１つ以上の所望の特徴を有する酵素をコードするＤＮＡをクローンライブラリーにおいて生成させるために、部位特異的でありうる人為的突然変異誘発に暴露したＤＮＡ集団のプール由来のＤＮＡを有するクローンライブラリーを該特定の酵素活性についてスクリーニングすることを含んでなる。この実施態様の方法は、人為的突然変異誘発に暴露する前に上記異種ＤＮＡ集団から少なくとも１つの共通する酵素特性（これは該特定の酵素活性と同じでも異なっていてもよい）をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡを選択的に回収することをさらに含むことができる。この実施態様においては、ＤＮＡ調製物の回収は、ＤＮＡ集団をコード配列の少なくとも一部に対する特異的結合パートナーと接触させることにより実施できる。特異的結合パートナーとは固相結合ハイブリダイゼーションプローブである。異種ＤＮＡ集団由来のＤＮＡを有し、上記クラスの酵素活性を示すクローンからＤＮＡを回収する。出願人は、低温において向上した活性を有する熱安定性酵素を提供することが可能であることを見いだした。より具体的には、出願人は、好熱性酵素の温度安定性を維持したまま、それら酵素の低温における活性を向上させることができることを見いだしたのである。さらに、熱安定性酵素、またはそのような酵素をコードするポリヌクレオチドを突然変異誘発にかけ、次に生じた変異体をスクリーニングして、熱安定性を保持し、かつ低温において対応する非突然変異酵素に較べて少なくとも２倍の酵素活性を有する突然変異した酵素、または突然変異した酵素をコードするポリヌクレオチドを同定することにより、低温における活性が向上した熱安定性酵素を得ることができることが見いだされた。熱安定性酵素および突然変異させた熱安定性酵素は、60℃までの温度において安定であり、好ましくは70℃までの温度において安定であり、より好ましくは95 ℃およびそれ以上の温度まで安定である。突然変異させた熱安定性酵素の低温における増大した活性とは、対応する野性型酵素の活性よりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、より好ましくは少なくとも10倍大きい活性を包含するものとする。低温における増大した酵素活性とは、50℃以下、好ましくは40℃以下、より好ましくは30℃以下において酵素活性が増大していることを意味する。したがって、突然変異させた酵素と非突然変異酵素の間で低温における酵素活性を比較すると、規定された低温における突然変異させた酵素の酵素活性は、対応する非突然変異酵素の酵素活性よりも少なくとも２倍大きい。したがって、低温および低温範囲は、熱安定性酵素が安定である温度よりも少なくとも５℃低い温度を含み、この温度は55℃、50℃、4 5℃、40℃、35℃、30℃、25℃および20℃より低い温度を含む。50℃より低い温度が好ましく、40℃より低い温度がより好ましく、30℃より低い温度（つまり、ほぼ室温）が最も好ましい。本発明のこの側面にしたがって、そこにおいてより大きい酵素活性が望まれる低温または低温範囲が決定され、そして熱安定性酵素、またはそのような酵素をコードするポリヌクレオチドが突然変異誘発にかけられ、生じた突然変異体をスクリーニングして、熱安定性を保持し、かつ上記所望の温度または温度範囲において酵素活性が所望される最低限の増大を有する突然変異した酵素（または突然変異酵素をコードするポリヌクレオチド）が決定される。熱安定性酵素とは、60℃より上の温度において活性を有する、すなわち分解しない酵素である。熱安定性酵素はまた、より長い保存寿命を有し、また有機溶媒に対して高い耐性を有する。熱安定性酵素は、温泉、火山地帯および熱帯などの高温中に見いだされる好熱性生物から単離することができる。好熱性生物の例としては、好熱菌（真正細菌および古細菌等）などの原核生物が挙げられる。次に、文献に記載されている利用可能な技法を用いて、これらの熱安定性生物由来のＤＮＡを単離することができる。この目的のためにる。または、酵素が発現されて陽性な熱安定性活性についてスクリーニング可能となるように発現ベクターに酵素をコードするＤＮＡを挿入し、以下に記述するような適切な宿主を形質転換することによって、熱安定性を有することが知られていない酵素を熱安定性についてスクリーニングすることができる。熱安定性酵素をコードする単離されたＤＮＡを、突然変異誘発技法にかける。好ましい種類の突然変異誘発技法は本明細書に記載されている。上に規定した突然変異誘発技法から分かるように、所望の活性を有する酵素をコードするＤＮＡを単独で、すなわち裸のＤＮＡとして突然変異誘発にかけてもよいし、または該ＤＮＡを本明細書に記述するような適切なベクターに挿入した後に突然変異誘発にかけてもよい。これらの技法をin vitro突然変異誘発と呼ぶ。または、ＤＮＡが細胞または生体内にある時に突然変異誘発にかける場合は、 in vivo突然変異誘発を行うことができる。この技法の好ましい例は、多数の異なる突然変異が短時間に起こるように、ＤＮＡ修復遺伝子 MutH、MutLおよびMut Sを欠失した大腸菌XL1 Red株(Stratagene，Inc.）を使用する。30時間以内に10, 000個までの突然変異が起こり得るので、当分野で公知の手順によって、突然変異させたＤＮＡから完全な突然変異ＤＮＡライブラリーが調製できる。突然変異が起こるのを可能とする適切な時間が経過した後、in vivo突然変異誘発の場合は宿主細胞から突然変異したＤＮＡを切り取り、別の適切なベクター中に挿入し、これを用いて非ミューテーター(mutator)宿主、例えば大腸菌XL1 B lue株を形質転換する。そして次に突然変異ＤＮＡライブラリーを調製する。in vitro突然変異誘発の場合には、もし突然変異ＤＮＡがすでに適切な発現ベクターに挿入されているならば、突然変異ＤＮＡライブラリーの調製のために該ベクターを用いて適切な非ミューテーター宿主を直接形質転換する。もし突然変異ＤＮＡが適切な発現ベクターに挿入されていないならば、以下のようにする。適切な生物を形質転換することによって、スクリーニングのためにライブラリーを調製する。突然変異したＤＮＡを有するベクターを、形質転換を促進する条件下で接種することにより人工的に導入して、宿主、特に本明細書に好ましいと具体的に同定されている宿主を形質転換する。次に、このようにして得られた形質転換クローンのライブラリーを、酵素活性の表現型アッセイを用いてスクリーニングし、興味のある酵素の活性を示すクローンを選択する。例えば、上記の技法の１つによって突然変異させたＤＮＡから多数のクローンを調製した後、興味のある特定の酵素活性についてこれらのクローンをスクリーニングする。例えば、突然変異したＤＮＡを有するクローンをスクリーニングにかけ、高温範囲内および所望の低温範囲内における活性を測定し、突然変異させていない対応する野性型熱安定性酵素に較べて該低温範囲内において所望の活性増加を有する突然変異体を同定する。陽性であると同定されたクローン、すなわち熱安定性であって、かつ低温範囲内の温度において対応する野性型酵素に較べて少なくとも２倍増大した活性を有する熱安定性酵素を発現する突然変異ＤＮＡ配列を有するクローンを単離し、配列決定し、該ＤＮＡ配列を同定する。例えば、上記クローンを、つまりは熱安定性酵素を低温に暴露し、そして適切な基質を開裂する能力を試験することによって、所望の低温範囲におけるホスファターゼ活性を同定することができる。実施例７においては、野性型酵素と突然変異誘発にかけた酵素を比較して、ホスファターゼ活性およびβ-ガラクトシダーゼ活性が測定される。報告される結果から分かるように、野性型ホスファターゼおよびβ-ガラクトシダーゼ好熱性酵素の突然変異誘発は、対応する野性型酵素よりも室温の低温範囲内においてそれぞれ３倍および2.5倍活性な突然変異酵素をもたらした。タンパク質を作製する場合には、好熱性酵素を突然変異誘発にかけた後、突然変異した酵素を所望の活性（すなわち、高温における活性を保持しつつ低温における活性が増大している）についてスクリーニングする。タンパク質突然変異誘発のための公知技法の任意のものを用いることができるが、特に好ましい突然変異誘発技法は上に論じた技法である。微生物由来のＤＮＡは、選択手順にかけて特定の酵素活性を有する酵素をコードするＤＮＡ由来のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを選択し単離するのに先立って、好ましくは適切なベクター（一般に、発現をもたらすための適切な調節配列を有するベクター）に挿入される。ライブラリーを調製することができる微生物は、真正細菌および古細菌等の原核微生物、ならびに真菌、ある種の藻類および原生動物等の下等真核微生物を含む。これらの微生物は培養微生物であってもよいし、または環境サンプルから得た非培養微生物であってもよい。そして、これらの微生物は好熱菌、超好熱菌、好冷菌、低温菌等の好局限性細菌であってよい。上に示すように、環境サンプルからライブラリーを作製することが可能である。この場合、ＤＮＡは微生物を培養せずに回収してもよいし、または培養微生物から回収してもよい。そこから標的ＤＮＡを得るための出発材料ライブラリーとしての微生物ＤＮＡの供給源は、環境サンプルを含むことが特に意図されている。例えば、北極および南極の氷、水または永久凍結帯の資源、火山性起源の物質、熱帯地方の土壌または植物に由来する物質、等から得られた環境サンプルである。したがって、例えば培養可能または培養不可能な微生物からＤＮＡを回収し、それを用いて適切な組換え発現ライブラリーを作製し、次に酵素活性を測定することができる。細菌および多くの真核生物は、それらの産物が関連プロセスに関与する複数の遺伝子を調節するための整合された(coordinated)作用機構を有する。これらの遺伝子は１本の染色体上に「遺伝子クラスター」と呼ばれる形で群をなしており、１つの調節配列（全クラスターの転写を開始させる１個のプロモーターを含む）の制御下で一緒に転写される。遺伝子クラスター、プロモーター、および調節に機能する付加的配列は全体として「オペロン」と呼ばれ、通常は2〜6個、最大で20個以上の遺伝子を含むことができる。したがって、遺伝子クラスターとは、通常は機能に関して、同一または関連している隣接する遺伝子の１群である。幾つかの遺伝子ファミリーは複数の同一メンバーからなっている。クラスターをなす遺伝子は必ずしも同一ではないが、クラスターを形成することは遺伝子間の同一性を維持するための必要条件である。遺伝子クラスターは、隣接する関連遺伝子に対して複製が生成される極端な場合から、数百の同一の遺伝子がタンデムな列をなして存在する場合まで異なっている。時々、特定の遺伝子の反復に何ら重要性が認められない場合がある。この主な例は、他の哺乳動物種においては１個のインスリン遺伝子で十分であるのに、幾つかの種において発現される重複インスリン遺伝子である。遺伝子クラスター、およびそれによってもたらされるタンパク質を発現するために該クラスターの全長はどの程度まで必要か、をさらに研究することは重要である。さらに、遺伝子クラスターは継続的再編成を受ける。したがって、例えば細菌または他の原核生物源から遺伝子クラスターの異種ライブラリーを作製する能力は、新規なタンパク質、特に、例えば多数の有用な活性を有するポリケチドの合成に関与するポリケチドシンターゼ等の酵素を含めて、タンパク質の供給源を決定するうえで価値がある。遺伝子クラスターの産物であるタンパク質の他の種類もまた、例えば抗生物質、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、インスリン等の調節タンパク質を含めて考慮されている。ポリケチドは、抗生物質（テトラサイクリンおよびエリスロマイシン）、抗癌剤（ダウノマイシン）、免疫抑制剤（FK506およびラパマイシン）、および動物薬（モネンシン）を含む生物活性の極めて豊かな供給源である分子である。多くのポリケチド（ポリケチドシンターゼによって生成される）は、治療剤として有益である。ポリケチドシンターゼとは、長さ並びに官能性および環化のパターンが異なる極めて多様な炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチドシンターゼ遺伝子は遺伝子クラスターに該当し、少なくとも１種類（Ｉ型と称する）のポリケチドシンターゼは大きいサイズの遺伝子および酵素を有し、それらは遺伝子操作およびこれら遺伝子／タンパク質のin vitro研究を複雑にしている。研究用の新規なポリケチドの作製のために、ポリケチドおよびポストポリケチド生合成遺伝子のライブラリーから所望の成分を選択して組み合わせる能力は興味深い。本発明の方法は、新規なポリケチドシンターゼのクローン化を容易にする。なぜなら、（特にｆ因子に基づくベクターを用いた場合は）大きい挿入断片を有するクローンを用いて遺伝子バンクを作製できるからであり、これは遺伝子クラスターのクローン化を容易にする。好ましくは、遺伝子クラスターＤＮＡはベクターに連結される。特に、検出可能なタンパク質の産生、または連結した遺伝子クラスター由来のタンパク質に関連する多数の活性を制御および調節することのできる発現調節配列をさらに含むベクターに連結することが好ましい。外因性ＤＮＡ導入のための極端に大きい容量を有するベクターの使用は、そのような遺伝子クラスターと共に使用するのに特に適切であり、例として大腸菌のｆ因子（または稔性因子）を含むものを本明細書に記述する。この大腸菌のｆ因子とは、接合中にそれ自身の高頻度移行をもたらすプラスミドであって、混合微生物サンプル由来の遺伝子クラスター等の大きいＤＮＡ断片を獲得し、それを安定に増殖させるのに理想的である。次に、文献に記載されている利用可能な技法を用いて、ＤＮＡを単（MicroProbe Corporation）が適当である。これらの微生物に由来する、またはそれらから単離されたＤＮＡは、選択されたＤＮＡを用いて釣り上げる前に、好ましくはベクターまたはプラスミドに挿入することができる。そのようなベクターまたはプラスミドは、好ましくはプロモーター、エンハンサー、等を含む発現調節配列を有するものである。そのようなポリヌクレオチドはベクターおよび／または構成物の一部であることができ、かつ、そのようなベクターおよび／または構成物は該ポリヌクレオチドの天然の環境ではないという意味で、該ポリヌクレオチドは単離されていることができる。特に好ましいファージまたはプラスミドおよびそれらへの導入およびパッケージング方法は、本明細書に定めるプロトコールに詳細に記述されている。以下は、培養可能な微生物および培養不可能な微生物の両方から発現ライブラリーを作製するための一般的手順の概略を示す。それらのライブラリーを特定のプローブＤＮＡで釣り上げて、ハイブリダイズするＤＮＡ配列を選択することができる。環境サンプルバイオマスを得る。ＤＮＡの単離（種々の方法）。ＤＮＡを剪断する（25ゲージの針）。ＤＮＡを平滑末端とする（マングビーンヌクレアーゼ）。ＤＮＡをメチル化する（Eco RIメチラーゼ）。 Eco RIリンカーに連結する（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）。リンカーを切り戻す（Eco RI制限エンドヌクレアーゼ）。大きさにより分画する（ショ糖勾配）。 λベクターに連結する(λ ZAP IIおよびgt11)。パッケージする（in vitro λパッケージング抽出物）。大腸菌宿主上に播き、増幅させる。目的の酵素活性を有するクローンをスクリーニングによって同定する。このスクリーニングは、ハイブリダイゼーションによって目的の酵素をコードするＤＮＡの存在を同定すること、または目的の酵素活性を検出することのいずれかによって実施することができる。少なくとも１つの微生物由来のＤＮＡから目的の標的ＤＮＡを選択的に単離するために用いるプローブＤＮＡは、公知の活性を有する酵素のＤＮＡの全長コード領域配列または部分コード領域配列であってよい。元のＤＮＡライブラリーを、好ましくは、特定の酵素活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む混合プローブを用いてプローブすることができる。これらのプローブまたはプローブライブラリーは好ましくは一本鎖であり、プローブされる微生物ＤＮＡは好ましくは一本鎖に変換されている。特に適切なプローブは、スクリーニングされるべき特定の酵素活性に類似した、または同一の活性を有する酵素をコードするＤＮＡに由来するものである。プローブＤＮＡは少なくとも約10塩基であり、好ましくは少なくとも15塩基である。１つの実施態様においては、プローブとして全コード領域を用いることができる。少なくとの１つのＤＮＡプローブの使用により標的ＤＮＡが選択的に単離されるハイブリダイゼーションの条件は、少なくとも約50％の配列同一性をもたらすハイブリダイゼーションストリンジェンシー、特に少なくとも約70％、好ましくは75％の配列同一性をもたらすストリンジェンシーを提供するように設計される。微生物ＤＮＡライブラリーをプローブして潜む目的のＤＮＡを単離するハイブリダイゼーション技法は当分野で周知であり、そして、文献に記載されている任意の技法、特に該微生物由来の残りのＤＮＡから分離するために固相に直接または間接的に結合したプローブＤＮＡを用いる技法は、本発明に使用するのに適する。プローブを固相に結合させた後、液相ハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。好ましくは、プローブＤＮＡは特異的結合ペアの一方のパートナー（すなわちリガンド）を用いて「標識」され、ペアの他方のパートナーは固相マトリックスに結合されて、標的をその供給源から分離するのを容易にする。リガンドおよび特異的結合パートナーは以下のものから、どちらの方向にも、選択することができる。すなわち、(1)抗原またはハプテンおよび抗体またはその特異的結合断片; (2)ビオチンまたはイミノビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン;(3 )糖およびそれに特異的なレクチン;(4)酵素およびそのインヒビター;(5)アポ酵素および補因子;(6)相補的ホモポリマー性オリゴヌクレオチド; および(7)ホルモンおよびその受容体である。固相は好ましくは(1)ガラスまたはポリマー表面;(2)ポリマービーズを充填したカラム;および(3)磁性または常磁性粒子から選択される。上記のように調製されたクローンライブラリーは、培養物の増殖、増幅、または他の補助的手順を必要とせずに、酵素活性について直接スクリーニングすることが可能である。しかし、１つの好ましい実施態様においては、各クローンから回収されたＤＮＡをＰＣＲ等によって増幅するとが望ましいと考えられる。さらに、単離された標的ＤＮＡの増幅を実施することは任意であるが、望ましい。この実施態様においては、標的ＤＮＡは単離後プローブＤＮＡから分離される。次に、宿主の形質転換に用いる前に該単離されたＤＮＡを増幅する。あらかじめ定められたＤＮＡ配列を少なくともその一部として含むように選択された二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変換し、増幅にかけ、再度アニーリングして、増幅された数の選択された二本鎖ＤＮＡをもたらすことができる。当分野では現在多数の増幅方法論が周知である。次に、選択されたＤＮＡを用いて適切な生物を形質転換することによってスクリーニングのためのライブラリーを調製することができる。宿主、特に本明細書中で好ましいと特に同定された宿主は、そのような形質転換を導く条件下で標的ＤＮＡを含むベクターを接種することによって人工的に導入して形質転換される。２本鎖環状または直鎖状ＤＮＡを用いて形質転換することが可能でり、または、１本鎖環状または直鎖状ＤＮＡを用いて形質転換する場合もあり得る。次に、このようにして得られた形質転換されたクローンのライブラリーを酵素活性の表現型アッセイにおいて、目的の酵素活性を示すクローンをスクリーニングする。ある生物から選択的に単離したＤＮＡに由来する多数のクローンを調製した後、これらのクローンを特定の酵素活性についてスクリーニングし、特定の酵素特性を有するクローンを同定する。酵素活性に関するスクリーニングは、個々の発現クローンを用いて実施してもよいし、または最初に発現クローンの混合物を用いて実施して該混合物が１以上の特定の酵素活性を有するかどうかを確認してもよい。もし混合物が特定の酵素活性を有するならば、次にその酵素活性またはより具体的な活性について個々のクローンを再スクリーニングすることができる。したがって、例えばもしクローン混合物がヒドロラーゼ活性を有するならば、次に個々のクローンを回収し、そしてスクリーニングしてどのクローンがドロラーゼ活性を有するか決定することができる。使用できる発現ベクターの代表的なものとして、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌性人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびＳＶ４０誘導体）、Ｐ１に基づく人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および目的の特定の宿主（枯草菌、アスペルギルス属菌、酵母、等）に特異的な他の任意のベクターを挙げることができる。したがって、例えば、ＤＮＡはポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのうちの任意の１つに含まれていればよい。そのようなベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列を含む。多数の適切なベクターが当業者には公知であり、市販されている。例として以下のベクターを挙げる。すなわち、細菌性：pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen); psiX174，pBluescript SK，pBluescript KS(Stratagene)；pTRC99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT2T(Pharmacia); 真核細胞性: pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene); pSVK3，pBPV， pMSG，pSVLSV40(Ｐharmacia)。しかし、宿主中で複製可能で、かつ生存可能であるかぎり、他の任意のプラスミドまたはベクターを用いることができる。本発明に用いるのに特に好ましい種類のベクターは、ｆ因子複製起点を有する。大腸菌のｆ因子（または稔性因子）は、接合中にそれ自身の高頻度移行、および細菌染色体自体のより頻度の低い移行をもたらすプラスミドである。特に好ましい実施態様は、「フォスミド(fosmid)」または細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ベクターと呼ばれるクローニングベクターを用いるものである。これらは、ＤＮＡの大きいセグメントを安定に組み込むことができる大腸菌ｆ因子に由来するものである。混合未培養環境サンプル由来のＤＮＡと統合された時、このベクターは大きいゲノム断片を安定した「環境ＤＮＡライブラリー」の形で獲得することを可能とする。微生物由来のＤＮＡを種々の手順によってベクター中に挿入することができる。一般に、該ＤＮＡ配列は当分野で公知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順およびその他は当業者の技術の範囲内であると認められる。発現ベクター中の該ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を指令するため、適切な発現制御配列（プロモーター）に機能しうる形で連結される。特に名前を挙げる細菌性プロモーターは、lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λP_R，P_Lおよびtrp を含む。真核細胞プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期および後記SV 40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネイン-I プロモーターを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分当業者の技術レベルの範囲内にある。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターをも含む。ベクターは発現を増幅させるための適切な配列を含むこともできる。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子から選択することができる。さらに、発現ベクターは形質転換宿主細胞の選択のために、好ましくは表現型的特徴を提供する１以上の選択マーカー遺伝子（例えば、真核細胞培養物のためにはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは大腸菌においてはテトラサイクリンあるいはアンピシリン耐性、等）を含む。一般に、組換え発現ベクターは複製起点、宿主細胞の形質転換を可能とする選択マーカー（例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびS.セレビシエ(S． cerevisiae)のTRPI遺伝子）、および下流構造配列の転写を指令するための、高発現遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、とりわけ3- ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)等の解糖酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロン由来のものであり得る。異種構造配列は、適切な段階で、翻訳開始および終結配列、ならびに好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外の培地への分泌を指令することのできるリーダー配列と共に組み立てられる。上記のように選択し、単離したＤＮＡを適切な宿主に導入し、ライブラリーを調製する。このライブラリーは、所望の酵素活性についてスクリーニングされる。好ましくは、選択されたＤＮＡは適切な制御配列を含むベクター中にすでに挿入されていて、酵素をコードする選択されたＤＮＡをそれによって発現させ、所望の活性を検出する。宿主細胞は、哺乳動物細胞等の高等真核細胞、または酵母細胞等の下等真核細胞でありうる。または、宿主細胞は細菌細胞等の原核細胞でありうる。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって実施することができる(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basi c Methods in Molecular Biology，(1986))。適切な宿主の代表的な例としては、大腸菌、ストレプトミセス(Streptomyces) 、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)等の細菌細胞；酵母等の真菌細胞；ショウジョウバエ(Drosophila)S2 およびスポドプテラ(Spodoptera)Sf9等の昆虫細胞；CHO、COSまたはBowes黒色腫等の動物細胞；アデノウイルス；植物細胞、等が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は、本明細書の教示より当業者の技術的範囲内にあると見なされる。組換えタンパク質を発現するのに用いることができる種々の哺乳動物細胞培養系を特に挙げるならば、哺乳動物発現系の例はGluzman，Cell，23:175(1981)によって記述されているサル腎臓繊維芽細胞COS-7細胞系、および和合性の(compat ible)ベクターを発現することができる他の細胞系、例えばC127、3T3、CHO、HeL aおよびBHK 細胞系等を含む。哺乳動物発現ベクターは複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、および任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終止配列、および5'隣接非転写配列を含む。SV40のスプライスおよびポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を用いて必要とされる非転写遺伝子エレメントを提供することができる。宿主細胞は一般にベクターを用いて遺伝子工学的に操作（形質導入または形質転換またはトランスフェクション）される。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化させ、形質転換体を選択し、または遺伝子を増幅するのに適切なように改変された常用の栄養培地中で培養することができる。培養条件（温度、ｐＨ、等）は発現のために選択された宿主細胞に対して以前に用いられたものであり、当業者には明らかである。当分野で公知の手順により、ライブラリーを特定の酵素活性についてスクリーニングすることができる。例えば、６つのＩＵＢクラス、すなわちオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼの１以上について酵素活性をスクリーニングすることができる。次に、１以上のＩＵＢクラスについて陽性であると確認された組換え酵素を、より特異的な酵素活性について再スクリーニングすることができる。または、より特殊化した酵素活性についてライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、ヒドロラーゼ活性について一般的にスクリーニングする代わりに、より特殊化した活性、すなわちヒドロラーゼが作用する結合の種類についてライブラリーをスクリーニングすることができる。したがって、例えばライブラリーをスクリーニングして、１以上の特定の化学的官能性、例えば(a)アミド（ペプチド結合）、すなわちプロテアーゼ；(b)エステル結合、すなわちエステラーゼおよびリパーゼ；(c)アセタール、すなわちグリコシダーゼ、等に作用するヒドロラーゼを突き止めることができる。次に、特定の酵素活性を有すると同定されたクローンを配列決定して、該特定の活性を有する酵素をコードするＤＮＡ配列を同定することができる。したがって、本発明によれば、(i)特定の酵素活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、(ii )そのような活性を有する酵素（そのアミノ酸配列を含む）を単離し同定して、そして(iii)そのような活性を有する組換え酵素を作製することができる。または、その活性についてスクリーニングを行なった酵素活性を有することが判明したクローンを配列決定し、次に人為的突然変異誘発にかけて所望の活性を有する新しい酵素を開発するか、または野性型酵素には存在しない、あるいはそれほど顕著でない特に望ましい特性（例えば、熱または有機溶媒に対する安定性）を有する改変酵素を開発することができる。人為的突然変異誘発のための公知技法のうち任意のものを本発明に適用することができる。例えば、本発明にしたがって使用するのに特に好ましい突然変異誘発技法は、以下に記載の技法を含む。本発明は、例えば下記の用途に用いることができる下記の活性を有する新規な酵素を同定または作製するのに用いることができる。１．リパーセ／エステラーゼａ．エステル（脂質）／チオエステルのエナンチオ選択的加水分解１）ラセミ混合物の分割２）メソジエステルからの光学活性な酸またはアルコールの合成ｂ．選択的合成１）炭水化物エステルの位置特異的加水分解２）環状第二級アルコールの選択的加水分解ｃ．光学活性なエステル、ラクトン、酸、アルコールの合成１）活性化／非活性化エステルのエステル交換反応２）インターエステリフィケーション３）ヒドロキシエステル由来の光学活性ラクトン４）無水物の位置選択的およびエナンチオ選択的開環ｄ．界面活性剤ｅ．脂肪／油変換ｆ．チーズの熟成２．プロテアーゼａ．エステル／アミド合成ｂ．ペプチド合成ｃ．アミノ酸エステルのラセミ混合物の分割ｄ．非天然アミノ酸の合成ｅ．界面活性剤／タンパク質加水分解３．グリコシダーゼ／グリコシルトランスフェラーゼａ．糖／ポリマー合成ｂ．グリコシド結合を開裂して単糖、二糖およびオリゴ糖を形成ｃ．複合オリゴ糖の合成ｄ．UDP-ガラクトシルトランスフェラーゼを用いたグリコシド合成ｅ．二糖、フッ化グリコシル、アリールガラクトシドのグリコシル転移ｆ．オリゴ糖合成におけるグリコシル転移ｇ．β−グルコシルスルホキシドのジアステレオ選択的開裂ｈ．非対称グリコシル化ｉ．食品加工ｊ．紙加工４．ホスファターゼ／キナーゼａ．リン酸エステルの合成／加水分解１）位置選択的、エナンチオ選択的リン酸化２）リン酸エステルの導入３）リン脂質前駆体の合成４）制御されたポリヌクレオチド合成ｂ．生物学的分子の活性化ｃ．保護基の不在下における選択的リン酸結合形成５．モノ／ジオキシゲナーゼａ．活性化されていない有機基質の直接的オキシファンクショナリゼーション (oxyfunctionalization) ｂ．アルカン、芳香族化合物、ステロイドのヒドロキシル化ｃ．アルケンのエポキシ化ｄ．エナンチオ選択的スルフォキシド化ｅ．位置選択的および立体選択的バイヤー−ビリガー(Bayer-Villiger)酸化６．ハロペロキシダーゼａ．求核部位へのハロゲン化物イオンの酸化的付加ｂ．次亜ハロゲン酸のオレフィン結合への添加ｃ．シクロプロパンの環開裂ｄ．オルトまたはパラ誘導体に変換された活性化芳香族基質ｅ．２−ハロ−誘導体に変換された1.3ジケトンｆ．硫黄および窒素含有基質のヘテロ原子酸化ｇ．酢酸エノール、アルキン、および活性化芳香族環の酸化７．リグニンペルオキシダーゼ／ジアリールプロパンペルオキシダーゼａ．Ｃ−Ｃ結合の酸化的開裂ｂ．ベンジルアルコールのアルデヒドへの酸化ｃ．ベンジルカーボンのヒドロキシル化ｄ．フェノール二量体化ｅ．二重結合をヒドロキシル化して、ジオールを形成ｆ．リグニンアルデヒドの開裂８．エポキシドヒドロラーゼａ．鏡像異性体的に純粋な生物活性化合物の合成ｂ．エポキシドの位置選択的およびエナンチオ選択的加水分解ｃ．モノオキシゲナーゼにより芳香族およびオレフィンをエポキシ化し、エポキシドを形成ｄ．ラセミエポキシドの分割ｅ．ステロイドエポキシドの加水分解９．ニトリルヒドラターゼ／ニトリラーゼａ．脂肪族ニトリルのカルボキシアミドへの加水分解ｂ．芳香族、複素環式、不飽和脂肪族ニトリルの対応する酸への加水分解ｃ．アクリロニトリルの加水分解ｄ．芳香族およびカルボキシアミド、カルボン酸（ニコチンアミド、ピコリンアミド、イソニコチンアミド）の生産ｅ．アクリルジニトリルの位置選択的加水分解ｆ．ａ-ヒドロキシニトリル由来のα-アミノ酸 10．トランスアミナーゼａ．オキソ酸へのアミノ基の転移 11．アミダーゼ／アシラーゼａ．アミド、アミジン、および他のＣ−Ｎ結合の加水分解ｂ．非天然アミノ酸の分割および合成以下の実施例は本発明を説明するものであって、その範囲を限定するものではない。実施例１哺乳動物ＤＮＡライブラリーの調製以下に、潜水調査中にSanta Catalina Basinの深さ1240メートルで見つけたクジラの骨の外部表面サンプルから遺伝子ライブラリーを作製するのに用いた方法の概要を説明する。ＤＮＡの単離製造業者の指示に従うIsoQuick法。ＤＮＡの剪断１．25G二重ハブ針および１ccシリンジにより約500回、ＤＮＡを激しく押引する。２．該ＤＮＡの大半が所望のサイズの範囲内（約３〜６kb）であることを確認するために、0.8％アガロースゲル上で少量（0.5μg）を調べる。ＤＮＡの平滑化１．以下のものを加える： H₂O 最終容量が405μlになるまで 45μl 10×Mung Bean緩衝液 2.0μl Mung Beanヌクレアーゼ（150u/μl）。２．37℃で15分間インキュベートする。３．フェノール／クロロホルムで１回抽出する。４．クロロホルムで１回抽出する。５．氷冷エタノール１mlを加えて沈殿させる。６．氷上に10分間放置する。７．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心する。８．70％エタノール１mlで洗浄する。９．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心し、乾燥する。ＤＮＡのメチル化１．ＤＮＡを26μl TEに穏やかに再懸濁する。２．以下のものを加える： 4.0μl 10×EcoRIメチラーゼ緩衝液 0.5μl SAM（32mM） 5.0μl EcoRIメチラーゼ（40u/μl）。３．37℃で１時間インキュベートする。平滑末端の確保１．該メチル化反応へ以下のものを加える： 5.0μl 100mM MgCl₂ 8.0μl dNTP混合物（dGTP、dATP、dTTP、dCTPのそれぞれの2.5mM ） 4.0μl クレノウ（５u/μl）２．12℃で30分間インキュベートする。３．450μl １×STEを加える。４．フェノール／クロロホルムで１回抽出する。５．クロロホルムで１回抽出する。６．氷冷エタノール１mlを加えて沈殿させ、氷上に10分間放置する。７．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心する。８．70％エタノール１mlで洗浄する。９．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心し、乾燥する。リンカーの連結１．ＤＮＡをTris−EDTA（TE）７μｌに穏やかに再懸濁する。２．以下のものを加える： 14μl リン酸化EcoRIリンカー（200ng/μl） 3.0μl 10×連結緩衝液 3.0μl 10mM rATP 3.0μl T4 ＤＮＡリガーゼ（４Wu/μl）。３．４℃で一晩インキュベートする。 EcoRI切断１．連結反応を68℃で10分間加熱して失活させる。２．以下のものを加える： 237.9μl H₂O 30μl 10×EcoRI緩衝液 2.1μl EcoRI制限酵素（100u/μl）。３．37℃で1.5時間インキュベートする。４．0.5M EDTA 1.5μlを加える。５．氷上に放置する。ショ糖勾配（2.2ml）サイズ分画１．サンプルを65℃に10分間加熱する。２．ショ糖勾配2.2ml上に穏やかにローディングする。３．ミニの超遠心機中、45K、20℃で４時間遠心する（中断なし）。４．勾配管の底に20G針で穴をあけ、その針を通してショ糖を流すことにより、画分を集める。Falcon2059管内に最初の20滴を集め、ついで10個の１滴画分（ 1〜10と標識）を集める。各滴は、約60μlの容量である。５．各画分５μlを0.8％アガロースゲル上を流し、そのサイズを確認する。６．画分１〜４（約10〜1.5kb）をプールし、別の管内に画分５〜７（約５〜0 .5kb）をプールする。７．氷冷エタノール１mlを加えて沈殿させ、氷上に10分間放置する。８．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心する。９．70％エタノール１mlで洗浄する。 10．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心し、乾燥する。 11．それぞれをTE緩衝液10μlに再懸濁する。ラムダアームに対する試験的な連結１．およその濃度を得るためにプレートアッセイを行なう。臭化エチジウムを含有するアガロース上に、標準物（既知濃度のＤＮＡサンプル）と共にサンプル 0.5μlをスポットする。紫外線中で観察し、該標準物と比較して濃度を推定する。画分１〜４＝＞1.0μg/μl。画分５〜７＝500ng/μl ２．以下の連結反応（５μl反応）を調製し、４℃で一晩インキュベートする。試験パッケージおよびプレート１．製造業者のプロトコールに従い、該連結反応物をパッケージングする。パッケージング抽出物当たり2.5μlをパッケージングする（１連結当たり２抽出物）。２．SM 緩衝液500μlでパッケージング反応を停止し、同じ連結に由来するパッケージングをプールする。３．それぞれの1.0μlを適当な宿主上で力価測定する（OD₆₀₀＝1.0）［ZAP ではXLI-Blue MRF、gtl1ではY1088］。 200μlの宿主（mM MgSO₄中）をFalcon2059管へ加える。パッケージングされたファージ１μlを接種する。 37℃で15分間インキュベートする。約３mlの48℃の重層寒天を加える。［150μlのIPTG（0.5M）および300μlのX-GAL（350mg/ml）を含有する50m lのストック］ 100mmプレート上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートする。４．効率の結果 gtl1：1.7×10⁴個の組換え体（95％バックグラウンド） ZAP II：4.2×10⁴個の組換え体（66％バックグラウンド）ショ糖勾配および有機抽出によりＤＮＡサンプル中の混入物は除去されたかもしれないが、該混入物が酵素反応を阻害した可能性がある。ＤＮＡサンプルは貴重であったため、クローニングのために末端を「固定（fix）」することを試みた。ＤＮＡの再平滑化１．ラムダアームに連結しなかった残りのすべてのＤＮＡ（画分１〜７）をプールし、最終容量が12μlになるまでH₂Oを加える。ついで以下のものを加える： 143μl H₂O 20μl 10×緩衝液２（StratageneのｃＤＮＡ Synthesis Kitから） 23μl 平滑化用dNTP（StratageneのｃＤＮＡ Synthesis Kitから） 2.0μl Pfu（StratageneのｃＤＮＡ Synthesis Kitから）２．72℃で30分間インキュベートする。３．フェノール／クロロホルムで１回抽出する。４．クロロホルムで１回抽出する。５．３M NaOAc 20μLおよび氷冷エタノール400μlを加えて沈殿させる。６．−20℃で一晩放置する。７．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心する。８．１mlの70％エタノールで洗浄する。９．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心し、乾燥する。（ＤＮＡは処理の第１ラウンドで既にメチル化されているため、ＤＮＡのメチル化は行なわない）アダプター連結１．ＤＮＡを８μlのEcoRIアダプター（StratageneのｃＤＮＡ Synthesis Kit から）に穏やかに再懸濁する。２．以下のものを加える： 1.0μl 10×連結緩衝液 1.0μl 10mM rATP 1.0μl T4 ＤＮＡリガーゼ（４Wu/μl）３．４℃で２日間インキュベートする。（今回はアダプターを使用しているため、切断はしない。その代わりに、リン酸化が必要である）アダプターのリン酸化１．連結反応を70℃で30分間加熱して失活させる。以下のものを加える： 1.0μl 10×連結緩衝液 2.0μl 10mM rATP 6.0μl H₂O 1.0μl PNK（StratageneのｃＤＮＡ Synthesis Kitから）３．37℃で30分間インキュベートする。４．31μlのH₂Oおよび５μlの10×STEを加える。５．Sephacryl S-500スピンカラム上でサイズ分画する（プール画分１〜３）。６．フェノール／クロロホルムで１回抽出する。７．クロロホルムで１回抽出する。８．氷冷エタノールを加えて沈殿させる。９．氷上で10分間放置する。 10．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心する。 11．１mlの70％エタノールで洗浄する。 12．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心し、乾燥する。 13．10.5μlのTE緩衝液に再懸濁する。プレートアッセイは行なわない。その代わりに、2.5μlのＤＮＡを使用し水を使用しないこと以外は前記のとおりに、アームに直接連結する。前記のとおりに、パッケージングおよび力価測定を行なう。効率の結果： gtl1：2.5×10⁶個の組換え体（2.5％バックグラウンド） ZAP II:9.6×10⁵個の組換え体（０％バックグラウンド）ライブラリーの増幅（各ライブラリーからの5.0×10⁵個の組換え体）１．3.0mlの宿主細胞（OD₆₆₀＝1.0）を２本の50ml円錐管へ加える。２．円錐管１本当たり2.5×10⁵pfuを接種する。３．37℃で20分間インキュベートする。４．最終容量が45mlになるまで、各管へ重層寒天を加える。５．該管を５枚の150mmプレートの全体にプレーティングする。６．プラークのサイズがピンの頭くらいの大きさになるまで、37℃で６〜８時間インキュベートする。７．８〜10mlのSM 緩衝液で重層し、４℃で一晩放置する（可能ならば、穏やかに振とうしながら）。ファージの収穫１．各プレートから50ml円錐管中へSM 緩衝液を注ぐことによりファージ懸濁液を回収する。２．３mlのクロロホルムを加え、激しく振とうし、室温で15分間インキュベートする。３．２K rpmで10分間遠心して、細胞デブリを除く。４．上清を無菌フラスコ中へ注ぎ、500μlのクロロホルムを加える。５．４℃で保存する。増幅ライブラリーの力価測定１．系列希釈を作製する。 10^-5＝１mlのSM 緩衝液中の１μlの増幅ファージ 10^-6＝１mlのSM 緩衝液中の１μlの10^-3希釈２．200μlの宿主（10mM MgSO₄中）を２本の管へ加える。３．一方に10μlの10^-6希釈物（10^-5）を接種する。４．もう一方に１μlの10^-6希釈物（10^-6）を接種する。５．37℃で15分間インキュベートする。６．約３ml、48℃の重層寒天を加える。［150μlのIPTG（0.5M）および375μlのX-GAL（350mg/ml）を含有する50ml のストック］７．100mmプレート上でプレーティングし、37℃で一晩インキュベートする。８．結果： gtl１： 1.7×10¹¹/ml ZAP II： 2.0×10¹⁰/ml 実施例２ピコプランクトンゲノムＤＮＡの安定で大きな挿入ＤＮＡライブラリーの構築細胞の採集およびＤＮＡの調製濃縮されたピコプランクトン細胞を含有するアガロースプラグを、オレゴン州ニューポートからハワイ州ホノルルまでの海洋巡航で採集されたサンプルから調製した。海水（30 リットル）をNiskinボトル内に採集し、10μmのNitrexに通してスクリーニングし、分子量30,000 カットオフポリスルホンフィルターに通す中空糸濾過（Amicon DC10）により濃縮した。濃縮された細菌プランクトン細胞を0.22μm、47mm Duraporeフィルター上で集め、１ml の２×STE緩衝液（１M Na Cl、0.1M EDTA、10mM Tris(pH8.0)）に再懸濁し、最終密度を約１×10¹⁰細胞/ml とした。該細胞懸濁液を、40℃まで冷却した１容量の１％溶融Seaplaque LMPアガロース（FMC）と混合し、ついで直ちに１mlシリンジ中に取った。該シリンジをパラフィルムで密封し、氷上で10分間放置した。該細胞含有アガロースプラグを10ml の溶解緩衝液（10mM Tris(pH8.0)、50mM NaCl、0.1M EDTA、１％Sarkosyl、0.2 ％デオキシコール酸ナトリウム、１mg/mlリゾチーム）中に押出し、37℃で１時間インキュベートした。ついで該アガロースプラグを40mlのESP 緩衝液（１％Sa rkosyl、１mg/mlプロテイナーゼ−K（0.5M EDTA中））に移し、55℃で16時間インキュベートした。該溶液をデカントし、新鮮なESP 緩衝液で置換し、55℃でさらに１時間インキュベートした。ついで該アガロースプラグを50mM EDTA中に入れ、海洋巡航の間、船に４℃で保存した。オレゴン海岸沖合いで採集したサンプルから調製したアガロースプラグ（72μ l）の１個の切片を、２mlの微量遠心管中、１mlの緩衝液Ａ（100mＭ NaCl、10mM Bis Tris Propane−HCl、100μg/mlアセチル化BSA:25℃でpH7.0）に対して４℃ で一晩透析した。該溶液を、10mＭ MgCl₂および１mM DTT を含有する250μlの新鮮な緩衝液Ａで置換し、振盪するプラットホーム上、室温で１時間インキュベートした。ついで該溶液を、４UのSau3A1（NEB）を含有する250μlの同じ緩衝液に変え、水浴中で37℃に平衡化し、ついで振盪するプラットホーム上、37℃のインキュベーター中で45分間インキュベートした。該プラグを1.5ml微量遠心管へ移し、68℃で30分間インキュベートして、該酵素を失活させ、アガロースを溶融した。該アガロースの消化および該ＤＮＡの脱リン酸化を、それぞれ、GelaseおよびHK−ホスファターゼ（Epicentre）を製造業者の推奨に従い使用して行なった。穏やかにフェノール／クロロホルムで抽出することによりタンパク質を除去し、該ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ペレット化し、ついで70％エタノールで洗浄した。pFOS1ベクターに連結するために、この部分消化されたＤＮＡを2.5ng/μl の濃度になるまで無菌水に再懸濁した。アガロースプラグのいくつかから得たPCR増幅の結果（データは示していない）は、有意量の古細菌（archaeal）ＤＮＡの存在を示した。１つのサンプルから抽出しオレゴン海岸沖合いの深さ200mで集めたｒＲＮＡを用いる定量的ハイブリダイゼーション実験は、この集合体内の浮遊古細菌が、全ピコプランクトン生物量の約4.7％を含むことを示した（このサンプルは、DeLongら，南極海洋のピコプランクトン中の古細菌の高い存在量(high abundance of Archaea in Antarcti c marine picoplankton)，Nature，371:695-698，1994の表１中の「PACl」−200 mに対応する）。アガロースプラグライゼート上で行なった古細菌偏向性（archa eal-biased）ｒＤＮＡＰＣＲ増幅の結果から、このサンプル中に比較的多量の古細菌ＤＮＡの存在が確認された。このピコプランクトンサンプルから調製したアガロースプラグを、後続のフォスミドライブラリーの調製のために選択した。この部位からのそれぞれ１mlのアガロースプラグは、7.5×10⁵個の細胞を含有していた。したがって、約5.4×10⁵個の細胞が、部分消化ＤＮＡの調製で用いた72μlの切片中に存在していた。ベクターアームは、文献記載（Kim ら，Ｆ因子に基づくベクター中のカスミドサイズのヒトＤＮＡ挿入断片の安定な増殖(Stable propagation of casmid size d human DNA inserts in an F factor based vector)，Nucl．Acids Res.，20:1 0832-10835，1992）のとおりpFOS1から調製した。簡単に言えば、該プラスミドをAstII で完全に消化し、HK ホスファターゼで脱リン酸化し、ついでBamHI で消化して、２つのアーム（それらはそれぞれ、35〜45kbpの連結ＤＮＡのクローニングおよびパッケージングのための適切な配向でcos部位を含有していた）を得た。部分消化されたピコプランクトンＤＮＡを、ベクターおよび挿入断片（それぞれ25ng）および１UのT4 ＤＮＡリガーゼ（Boehringer-Mannheim）を含有する15μl連結反応中、PFOS1アームに一晩連結した。４μlのこの反応液中の連結ＤＮＡを、Gigapack XLパッケージング系（Stratagene）を用いてin vitroパッケージングし、該フォスミド粒子を大腸菌（E．coli）DH10B株（BRL）にトランスフェクトし、該細胞をLB_cm15プレート上に広げた。得られたフォスミドクローンを、７％グリセロールが補充されたLB_cm15を含有する96ウェルマイクロタイター皿内に拾い入れた。ピコプランクトンＤＮＡ挿入断片の約40kbをそれぞれが含有する組換えフォスミドは、クローン化ＤＮＡの約1.4×10⁸塩基対を含有する3, 552個のフォスミドクローンのライブラリーを与えた。調べたクローンはすべて、38〜42kbpの範囲の挿入断片を含有していた。このライブラリーは、後の分析のために、−80℃で凍結保存した。実施例３ハイブリダイゼーション選択および発現ライブラリーの作製実施例１に記載のとおりに調製したプラスミドライブラリーから出発して、本実施例に記載のプロトコールに従いハイブリダイゼーション選択および発現ライブラリーの調製を行なった。該ライブラリーは、単離された微生物、富化培養物または環境サンプルからのＤＮＡを含有し得る。一本鎖ＤＮＡは、以下の２つの方法のうちの１つにより作製する。１）該プラスミドライブラリーを増殖させ、二本鎖プラスミドＤＮＡを単離することができる。F1遺伝子 II タンパク質およびエキソヌクレアーゼIII を用いて、該二本鎖ＤＮＡを一本鎖にする。遺伝子 I I タンパク質はF1起点で二本鎖プラスミドに切れ目を入れ、ExoIIIは、その切れ目が入った鎖を消化除去して、一本鎖環を与える。この方法は、Life Technolog iesのGeneTrapper^TMキットで用いられている。２）第２の方法は、二本鎖プラスミドの鎖の１つを「レスキュー」するためにヘルパーファージを使用することを含む。該プラスミドライブラリーを、一晩小培養により増殖させる。これの小さなアリコートをVCS-M13ヘルパーファージと混合し、再び一晩増殖させる。翌朝、該ファージミド（一本鎖ＤＮＡを含有するウイルス粒子）を培地から回収し、以下のプロトコールで使用する。プロトコール１．ライブラリー#17 からのレスキューされた一本鎖ＤＮＡ４μｇの６個のサンプルを、３×SSC緩衝液中で調製した。最終反応容量は30μlであった。２．これらの溶液へ、以下のうちの１つを加えた。 a)何も加えない b)無関係な配列からのビオチン化プローブ100ng c，d)生物#13 ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からのビオチン化プローブ100ng e，f)生物#17 ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子からのビオチン化プローブ100ng これらの生物のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一部をコードする約1300bp長の断片の PCR増幅により、ビオチン化プローブを調製した。該増幅産物は、増幅混合物中でビオチン化dUTPを使用して得た。合成中に、この修飾ヌクレオチドをＤＮＡの全体に取込ませる。QIAGEN PCR Clean-upキットを使用して、未取込みのヌクレオチドを除去した。３．95℃まで２分間加熱することにより、これらの混合物を変性させた。４．サンプルa、b、dおよびfについては70℃で90分間のハイブリダイゼーションを行なった。サンプルcおよびeは60℃でハイブリダイズさせた。５．洗浄しブロッキングしたMPGビーズの50μlを加え、各サンプルと混合した。これらの混合物を５分毎に合計30分間攪拌した。保存剤を含有する緩衝液中で MPGビーズを１mg/mlで送って、100μlの６セットを３×SSC 中で２回洗浄し、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡの100μgを含有する３×SSCの60μlに再懸濁した。６．該ＤＮＡ／ビーズ混合物を0.1×SSC／0.1％SDS 中室温で２回、0.1×SSC ／0.1％SDS 中42℃で2回、それぞれ10分間洗浄し、さらに３×SSC で室温で洗浄した。７．該ビーズを50μl TE中で70℃まで15分間加熱することにより、該結合ＤＮＡを溶出した。８．溶出したＤＮＡを希釈し、遺伝子特異的プライマーまたはベクター特異的プライマーのいずれかを使用してPCR増幅を行なった。該ライブラリーＤＮＡの希釈物を標準として使用した。９．該ＤＮＡ内に含有されているＤＮＡ挿入断片を、ベクター特異的プライマーを使用するPCRにより増幅した。TAクローニング系（Invitrogen）を使用して、これらの挿入断片をクローニングした。 10．サンプルｄおよびｆからの92個の白色コロニーおよび４個の青色コロニーの重複体を一晩増殖させ、サザンブロット用にコロニーリフト（colonylift）を調製した。 11．生物#17 プローブを使用してコロニーをプローブするために、Boehringer Mannheimからのジゴキシゲニン系を使用した。結果 PCR定量図 1Aおよび 1B。図 1Aは、遺伝子特異的プライマーとハイブリダイズさせた場合に、実施例２のサンプル溶液a〜fからのＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションアガロースゲル電気泳動カラムから得たオートラジオグラムの写真である。図 1Bは、ベクター特異的プライマーとハイブリダイズさせた場合に、実施例２のサンプル溶液a〜fからのＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションアガロースゲル電気泳動カラムから得たオートラジオグラムの写真である。サンプルaおよびbの遺伝子特異的ＤＮＡ増幅は、該ビーズに対する非特異的結合が最小であることを示している。他の条件下で結合したＤＮＡの量から、以下のとおり富化が推定される。遺伝子特異的当量合計富化 c 50ng 100pg 500× d 50ng 30pg 1667× e 20ng 50pg 400× f 20ng 20pg 1000× コロニーハイブリダイゼーション図２は、陽性クローン（すなわち該プローブ中に含有されている配列を含有し、本発明に従い調製したライブラリーからのＤＮＡを含有するコロニー）を示すプレートAおよびBから得た４個のコロニーハイブリダイゼーションプレートの写真である。プレートCおよびDは対照であり、陽性クローンを示さなかった。パニングされたサンプルからの92個のコロニーのうちの７個が、該プローブ中に含まれる配列に関して陽性であった。パニングされていないサンプル中に陽性クローンは見出されなかった。実施例４酵素活性アッセイ以下は、実施例１に従い調製した発現ライブラリーをヒドロラーゼ活性に関してスクリーニングする方法の代表的な実施例である。実施例１に記載のとおりに調製したライブラリーのプレートを使用して、各ウェル内に200μLのLB Amp/Meth,グリセロールを含有する単一のプレートに複数接種する。この工程は、１％漂白剤、水、イソプロパノール、各接種間の風乾滅菌サイクルを含むBeckman BiomekのHigh Density Replicating Tool（HDRT）を用いて行なう。該単一プレートを37℃で２時間増殖させ、ついで、各ウェル内に25 0μLのLB Amp/Meth,グリセロールを含有する２個の白色の96ウェルDynatechマイクロタイター娘プレートに接種するのに使用する。もとの単一プレートを37℃で 18時間インキュベートし、ついで−80℃で保存する。その２個の濃縮娘プレートも、37℃で18時間インキュベートする。ついで該濃縮娘プレートを70℃で45分間加熱して細胞を殺し、宿主大腸菌（E．coli）酵素を失活させる。DMSO 中５mg/m Lのモルホウレアフェニルアラニル−7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン（MuPheAFC、「基質」）のストック溶液を、界面活性剤であるドデシルマルトシドの0.6mg/mLを含有する50mM（pH7.5）Hepes緩衝液で600μMになるまで希釈する。 MuPheAFC 600μM MuPheAFC溶液の50μLを、Biomekを用いる単一の100μL混合サイクルで白色の濃縮プレートの各ウェルへ加えて、基質の最終濃度を約100μMとする。基質の添加直後に（t＝０）、プレート読み取り蛍光光度計上で蛍光値を記録する（励起＝400nm、発光＝505nm）。該プレートを70℃で100分間インキュベートし、ついでさらに15分間、室温度にまで冷却する。該蛍光値を再び記録する（t＝1 00）。t＝100での値からt＝０での値を引き算して、活性クローンが存在するか否かを判定する。これらのデータは、ある特定のウェル中のクローンの１つが該基質を加水分解しているかどうかを示すであろう。該活性を保持する個々のクローンを確認するために、その起源ライブラリープレートを解凍し、個々のクローンを用いて、LB Amp/Meth,グリセロールを含有する新たなプレートに１つずつ接種する。前記のとおり、該細胞を増殖させるために該プレートを37℃でインキュベートし、宿主酵素を失活させるために70℃で加熱し、600μM MuPheAFCの50μLを、Biomekを用いて加える。該基質を加えた後、t＝０の蛍光値を記録し、該プレートを70℃でインキュベートし、t＝100分の値を前記のとおり記録する。これらのデータは、該活性クローンがどのプレート中に存在するかを示すであろう。該基質に関するエナンチオ選択比の値（Ｅ）を以下の式から求める： E＝ln[(1−c(1+ee_p)]／ln[(1−c(1-ee_p)] ［式中、ee_p加水分解生成物のエナンチオマー過剰率（ee）であり、ｃは反応の変換率（％）である］。WongおよびWhitesides，Enzymes in Synthetic Organic Chemistry，1994，Elsevier，Tarrytown，New York，p．9-12を参照のこと。エナンチオマー過剰率は、キラル高速液体クロマトグラフィー（HPLC）またはキラルキャピラリー電気泳動（CE）のいずれかにより測定する。アッセイは、以下のとおり行なう。200μLの適当な緩衝液、ついで50μLの部分精製または完全精製された酵素溶液を、96ウェルの白色のマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、50μLの基質を加え、該基質の50％が消費されるか反応が停止するかのいずれかが最初に生じるまで、蛍光の増加を時間に対してモニターする。実施例５陽性酵素活性クローンの突然変異誘発ここに記載する２つの異なる戦略を用いて２つの異なる酵素（アルカリホスファターゼおよびβ−グリコシダーゼ）上で突然変異誘発を行って、野生型酵素より高い活性度を示す新規酵素を製造した。アルカリホスファターゼ製造業者のプロトコールに従い、生物OC9aからのアルカリホスファターゼ遺伝子をコードするゲノムクローン27a3a（プラスミドpBluescript 中）でXLI-Red株（Stratagene）を形質転換した。LB＋0.1mg/mlアンピシリンの培養液５mlに該形質転換体200μlを接種した。該培養物を37℃で30時間増殖させた。ついで該培養上でミニプレップを行ない、製造業者のプロトコールおよび以下に概要を示す方法（「XL1 Blue細胞の形質転換」の後）に従い、得られたＤＮＡ２μlをXL-1 Blue細胞（Stratage ne）中に形質転換することによりスクリーニングを行なった。スクリーニングアッセイにおいて、突然変異したOC9aホスファターゼは発色に10分を要し、野生型酵素は発色に30分を要した。標準的なアルカリホスファターゼスクリーニングアッセイ XL1 Red株の形質転換→LB/amp培養液５mlに形質転換体200μlを接種し、37℃ で30時間インキュベートする→ＤＮＡのミニプレップ→XL1 Blue細胞の形質転換 →LB/ampプレート上でのプレーティング→Duralon UV（Stratagene）またはHATF （Millipore）メンブレンによるコロニーのリフト→クロロホルム蒸気中での30 秒間の溶菌→85℃で30分間の加熱殺菌→BCIP緩衝液中室温でのフィルターの現像 →フィルターが現像されるにつれて観察し、最も早く現像するコロニー（「陽性体」）を同定し拾う→BCIPプレート上に「陽性体」を再びストリークする。BCIP 緩衝液： 20mm CAPS pH9.0 １mm MgCl₂ 0.01mm ZnCl₂ 0.1mg/ml BCIP β−グリコシダーゼこのプロトコールを用いて、サーモコッカス（Themococcus）9N2 β−グリコシダーゼを突然変異誘発させた。PCR 反応２マイクロリットルのdNTP（10mMストック） 10マイクロリットルの10×PCR緩衝液 0.5マイクロリットルのベクターＤＮＡ−31GIA−100ナノグラム 20マイクロリットルの3'プライマー（100pmol） 20マイクロリットルの5'プライマー（100pmol） 16マイクロリットルのMnCl 4H₂O（1.25mMストック） 24.5マイクロリットルのH₂O １マイクロリットルのTaqポリメラーゼ（5.0単位）合計100マイクロリットル反応サイクル 95℃で15秒間 58℃で30秒間 72℃で90秒間 25サイクル（72℃〜4℃で10分の延長インキュベーション）１％アガロースゲル上で５マイクロリットルを流し、反応を調べる。 Qiaquickカラム（Qiagen）上で精製する。 50マイクロリットルのH₂Oに再懸濁する。制限消化 25マイクロリットルの精製されたPCR産物 10マイクロリットルのNEB緩衝液#2 ３マイクロリットルのKpnI（10U/マイクロリットル）３マイクロリットルEcoRI（20U/マイクロリットル） 59マイクロリットルのH₂O 37℃で２時間切断する。 Qiaquickカラム（Qiagen）上で精製する。 35マイクロリットルのH₂Oで溶出する。連結反応 10マイクロリットルの消化されたPCR産物５マイクロリットルのベクター（EcoRI/KpnI で切断し、シュリンプアルカリホスファターゼでホスファターゼ処理したもの）４マイクロリットルの５×連結緩衝液１マイクロリットルのT4 ＤＮＡリガーゼ（BRL）一晩連結させる。エレクトロポレーションによりM15pREP4細胞中に形質転換する。 100または200マイクロリットルをLB amp meth kanプレート上にプレーティングし、摂氏37℃で一晩増殖させる。β−グリコシダーゼアッセイ以下のとおりに突然変異体に関してスクリーニングするためにグリコシダーゼアッセイを行なう。該フィルターアッセイには、基質 5−ブロモ−4−クロロ−3 −インドリル−β−o−グルコピラノシド（XGLU）（Diagnostic Chemicals Limi tedまたはSigma）の１mg/mlを含有する緩衝液Z（後記の調製法を参照されたい）を使用する。Z −緩衝液：（Miller，J.H.（1992）A Short Course in Bacterial Genetics，p .445を参照のこと）１リットル当たり： Na₂HPO₄−7H₂O 16.1g NaH₂PO₄−H₂O 5.5g KCl 0.75g MgSO₄−7H₂O 0.246g β−メルカプトエタノール 2.7ml pHを7.0に調整する（１）Millipore HATF メンブレンフィルターを使用してコロニーリフトを行なう。（２）150mmガラスペトリ皿中でクロロホルム蒸気でコロニーを溶菌する。（３）１mg/ml XGLUを含有するZ緩衝液で飽和したWhatman 3MM濾紙１枚を含有する100mmガラスペトリ皿へフィルターをトランスファーする。溶菌コロニーを担持するフィルターを該ガラスペトリ皿へトランスファーした後、皿を室温で維持する。（４）フィルターメンブレン上で「陽性体」が青色の斑点として観察された（「陽性体」は、早期に出現する斑点である）。以下のフィルターレスキュー法により、溶菌された陽性コロニーからプラスミドを回収する。パスツールピペット（またはガラス毛細管）を使用して、該フィルターメンブレン上の青色斑点の中心部を抜き取る。小さなフィルターディスクを、20μlの水を含有するEpp管に入れる。該Epp管を75℃で５分間インキュベートし、ついでボルテックスしてプラスミドＤＮＡをフィルターから溶出させる。このＤＮＡをエレクトロコンピテント（electrocompetent）大腸菌（E．coli）細胞中に形質転換する。形質転換プレート上でフィルター−リフトアッセイを繰り返して、「陽性体」を同定する。フィルターリフトの後、形質転換プレートを37℃のインキュベーターへ戻して、コロニーを再生させる。再精製した陽性体を３mlのLBamp液に接種し、37℃で一晩インキュベートする。これらの培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、プラスミド挿入断片を配列決定する。実施例７陽性酵素活性クローンの定方向突然変異誘発ここに記載する２つの異なる戦略を用いて２つの異なる酵素（アルカリホスファターゼおよびβ−グリコシダーゼ）上で定方向突然変異誘発を行って、野生型酵素より高い活性度をより低温で示す新規酵素を製造した。アルカリホスファターゼ製造業者のプロトコールに従い、生物OC9aからのアルカリホスファターゼをコードするＤＮＡ（プラスミドpBluescript中）でXL1-Red株（Stratagene）を形質転換した。LB＋0.1mg/mlアンピシリンの培養液５mlに該形質転換体200μlを接種した。該培養物を37℃で３０時間増殖させた。ついで該培養上でミニプレップを行ない、製造業者のプロトコールに従い、得られたＤＮＡ２μl をXL-1 Blue細胞（Stratagene）中に形質転換することによりスクリーニングを行なった。標準的なアルカリホスファターゼスクリーニングアッセイ →LB/ampプレート上でのプレーティング→Duralon UV（Stratagene）またはHA TF（Millipore）メンブレンによるコロニーのリフト→クロロホルム蒸気中での3 0秒間の溶菌→85℃で30分間の加熱殺菌→BCIP緩衝液中室温でのフィルターの現像→フィルターが現像されるにつれて観察し、最も早く現像されるコロニー（陽性体）を同定し拾う→BCIPプレート上に「陽性体」を再びストリークする。BCIP 緩衝液： 20mm CAPS pH9.0 １mm MgCl₂ 0.01mm ZnCl₂ 0.1mg/ml BCIP スクリーニングアッセイにおいて、突然変異したOC9aホスファターゼは発色に 10分を要し、野生型酵素は発色に30分を要した。 β−グリコシダーゼこのプロトコールを用いて、サーモコッカス（Thermococcus）9N2 β−グリコシダーゼをコードするＤＮＡを突然変異誘発させた。このＤＮＡ配列は図１に記載されている。PCR ２マイクロリットルのdNTP（10mMストック） 10マイクロリットルの10×PCR緩衝液 β−グリコシダーゼＤＮＡ（100ナノグラム）を含有する0.5マイクロリットルのpBluescriptベクターＤＮＡ 20マイクロリットルの3'プライマー（100pmol） 20マイクロリットルの5'プライマー（100pmol） 16マイクロリットルのMnCl 4H₂O（1.25mMストック） 24.5マイクロリットルのH₂O １マイクロリットルのTaqポリメラーゼ（5.0単位）合計100マイクロリットル反応サイクル 95℃で15秒間 58℃で30秒間 72℃で90秒間 25サイクル（72℃〜４℃で10分の延長インキュベーション）１％アガロースゲル上で５マイクロリットルを流し、反応を調べる。 Qiaquickカラム（Qiagen）上で精製する。 50マイクロリットルのH₂Oに再懸濁する。制限酵素消化 25マイクロリットルの精製されたPCR産物 10マイクロリットルのNEB緩衝液#2 ３マイクロリットルのKpnI（10U/マイクロリットル）３マイクロリットルのEcoRI（20U/マイクロリットル） 59マイクロリットルのH₂O 37℃で２時間切断する。 Qiaquickカラム（Qiagen）上で精製する。 35マイクロリットルのH₂Oで溶出する。連結反応 10マイクロリットルの消化されたPCR産物５マイクロリットルのpBluescriptベクター（EcoRI/KpnI で切断し、シュリンプアルカリホスファターゼでホスファターゼ処理したもの）４マイクロリットルの５×連結緩衝液１マイクロリットルのT4 ＤＮＡリガーゼ（BRL）一晩連結させる。エレクトロポレーションによりM15pREP4細胞中に形質転換する。 100または200マイクロリットルをLB amp meth kanプレート上にプレーティングし、摂氏37℃で一晩増殖させる。β−グリコシダーゼアッセイ以下のとおりに突然変異体に関してスクリーニングするためにグリコシダーゼアッセイを行なう。フィルターアッセイには、基質 5−ブロモ−4−クロロ−3− インドリル−β−o−グルコピラノシド（XGLU）（Diagnostic Chemicals Limite dまたはSigma）の１mg/mlを含有する緩衝液Z（後記の調製法を参照されたい）を使用する。Z- 緩衝液：（Miller，J.H．（1992）A Short Course in Bacterial Genetics，p .445を参照のこと）１リットル当たり： Na₂HPO₄−7H₂O 16.1g NaH₂PO₄−H₂O 5.5g KCl 0.75g MgSO₄−7H₂O 0.246g β−メルカプトエタノール 2.7ml pHを7.0に調整する（１）Millipore HATFメンブレンフィルターを使用してコロニーリフトを行なう。（２）150mmガラスペトリ皿中でクロロホルム蒸気でコロニーを溶菌する。（３）１mg/ml XGLUを含有するZ緩衝液で飽和したWhatman 3MM濾紙１枚を含有する100mmガラスペトリ皿へフィルターをトランスファーする。溶菌コロニーを担持するフィルターを該ガラスペトリ皿へトランスファーした後、皿を室温で維持する。（４）フィルターメンブレン上で「陽性体」が青色の斑点として観察された（「陽性体」は、早期に出現する斑点である）。以下のフィルターレスキュー法により、溶菌された陽性コロニーからプラスミドを回収する。パスツールピペット（またはガラス毛細管）を使用して、該フィルターメンブレン上の青色斑点の中心部を抜き取る。小さなフィルターディスクを、20μｌの水を含有するEpp管に入れる。該Epp管を75℃で５分間インキュベートし、ついでボルテックスしてプラスミドＤＮＡをフィルターから溶出させる。このＤＮＡをエレクトロコンピテント（electrocompetent）大腸菌（E．coli）細胞中に形質転換する。形質転換プレート上でフィルター−リフトアッセイを繰り返して、「陽性体」を同定する。フィルターリフトの後、形質転換プレートを37℃のインキュベーターへ戻して、コロニーを再生させる。再精製した陽性体を３mlのLBamp液に接種し、37℃で一晩インキュベートする。これらの培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、プラスミド挿入断片を配列決定する。突然変異誘発に供したβ−グリコシダーゼは、野生型β−グリコシダーゼより 2.5倍効率的にXGLUに作用した。前記の教示を考慮して、本発明の多数の修飾および変形が可能である。したがって、本発明は、請求の範囲の範囲内において、特に記載されていないものであっても実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／００８，３１７ (32)優先日平成７年12月７日(1995．12．7) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／６５１，５６８ (32)優先日平成８年５月22日(1996．5．22) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／６９２，００２ (32)優先日平成８年８月２日(1996．8．2) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＩＬ，ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】１．特定の酵素活性を有するクローンを同定するための方法であって、 (i)特定の酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を含む少なくとも一種の核酸または核酸様ハイブリダイゼーションプローブを使用することにより、少なくとも二種の微生物から得た核酸集団から標的核酸を選択及び回収し、 (ii)回収した標的核酸を用いて宿主を形質転換して、特定の活性についてスクリーニングされる当初の核酸集団のサブセットを含むクローンのライブラリーを作製することにより調製したクローンのライブラリー中で該特定の酵素活性についてスクリーニングすることを含む前記方法。２．前記の微生物の核酸から得られる核酸が、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変換し、変換された一本鎖核酸から、プローブ核酸にハイブリダイズする標的一本鎖核酸を回収し、宿主を形質転換するために回収した標的一本鎖核酸を二本鎖核酸に変換することにより選択される請求項１に記載の方法。３．前記プローブを固相に直接または間接的に結合し、これによりそのようにハイブリダイズしない一本鎖核酸からそれを分離する請求項２に記載の方法。４．一本鎖核酸を前記プローブから遊離させ、その遊離した一本鎖核酸を二本鎖核酸に変換する前に増幅する工程をさらに含む請求項３に記載の方法。５．前記標的核酸が遺伝子クラスターまたはその部分をコードする請求項１に記載の方法。６．少なくとも一種の微生物から得られた核酸ライブラリーを選択手順にかけてそこから特定のタンパク質活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の全部あるいは一部である一種以上のプローブ核酸配列にハイブリダイズする二本鎖核酸を選択する方法であって、 (a)ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、二本鎖核酸集団を、リガンドに結合した核酸プローブと接触させて、プローブとそれにハイブリダイズする核酸集団のメンバーの複合体を生成させ、 (b)(a)の複合体を前記リガンドの固相特異的結合相手と接触させて、固相複合体を生成させ、 (c)(b)の未結合核酸集団から固相複合体を分離し、 (d)プローブから固相結合プローブに結合した集団のメンバーを遊離させ、 (e)(d)の二本鎖核酸を適当な宿主に導入して、選択された核酸を含む複数のクローンを含むライブラリーを形成し、 (f)該ライブラリーを特定のタンパク質活性についてスクリーニングすることを含む前記方法。７．前記標的核酸が遺伝子クラスターまたはその部分をコードする請求項６に記載の方法。８．上記(a)の前に、さらに (i)所与のクラスのタンパク質にユニークな(i)のコンセンサス配列に相補的なリガンド結合オリゴヌクレオチドプローブに、ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で(a)の二本鎖核酸集団を接触させて二本鎖複合体を形成させ、 (ii)(i)の複合体を該リガンドの固相特異的結合相手と接触させて固相複合体を形成し、 (iii)該固相複合体を未結合核酸集団から分離し、 (iv)前記固相結合プローブに結合した集団のメンバーを遊離させ、 (v)該固相結合プローブをそれに結合した集団のメンバーから分離する工程を含む請求項６に記載の方法。９．異種核酸集団に由来する特定のタンパク質活性を有するタンパク質を得るための方法であって、該特定の活性が生じるように改変あるいは突然変異誘発された異種核酸集団からの核酸を含むクローンのライブラリーを、前記特定の酵素活性についてスクリーニングすることを含む方法。 10．前記突然変異誘発の前に、前記特定の活性と同じであってもよく異なってもよい共通の特徴をコードする核酸配列を含む核酸を異種核酸集団から選択的に回収することをさらに含む請求項９に記載の方法。 11．核酸調製物の回収が、核酸集団を前記配列の少なくとも部分の特異的結合相手と接触させることを含む請求項10に記載の方法。 12．特異的結合相手が固相結合ハイブリダイゼーションプローブである請求項11 に記載の方法。 13．前記共通の特徴が酵素活性の一種である請求項10に記載の方法。 14．前記酵素活性の一種を示す異種核酸集団からの核酸を含むクローンから核酸を回収することを含む請求項13に記載の方法。 15．前記突然変異誘発が部位指向またはランダム指向突然変異誘発である請求項９に記載の方法。 16．突然変異誘発にかける前に、前記特定の活性と同じであってもよく異なるものであってもよい活性について前記クローンのライブラリーを予備スクリーニングすることを含む請求項９に記載の方法。 17．対象となるタンパク質の発現について前記クローンを予備スクリーニングすることを含む請求項16に記載の方法。 18．特定のタンパク質活性を有するタンパク質を得るための方法であって、その特定のタンパク質活性と同じであってもよく異なるものであってもよい一以上の所望の特徴を有するタンパク質をコードする核酸をクローンのライブラリーで生成する試みにおいて突然変異誘発にかけられた核酸集団のプールからの核酸を含むクローンのライブラリーを、その特異的な活性についてスクリーニングすることを含む前記方法。 19．前記突然変異誘発の前に、特定のタンパク質活性と同じであってもよく異なるものであってもよい少なくとも１つの共通のタンパク質の特徴をコードする核酸配列を含む核酸を前記異種核酸集団から選択的に回収することをさらに含む請求項18に記載の方法。 20．前記少なくとも１つの共通の特徴が少なくとも一の通常の酵素活性である請求項19に記載の方法。 21．核酸調製物の回収が、核酸集団を、前記配列の少なくとも部分の特異的結合相手と接触させることを含む請求項20に記載の方法。 22．前記特異的結合相手が固相結合ハイブリダイゼーションプローブである請求項 21に記載の方法。 23．酵素活性の一種を示す異種核酸集団からの核酸を含むクローンから核酸を回収することを含む請求項22に記載の方法。 24．前記突然変異誘発が部位指向またはランダム突然変異誘発である請求項18に記載の方法。 25．低温において改良された酵素活性を有し、酵素からなる群から選択されるメンバーである熱安定性酵素、または該酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する方法であって、 (a)少なくとも60℃の温度で安定な少なくとも一種の酵素を突然変異誘発にかけ、 (b)少なくとも60℃の温度で安定で、その至適温度範囲の少なくとも10℃低い温度で酵素活性を有し、工程(a)の酵素よりも高い活性を有する突然変異酵素、または突然変異酵素をコードするポリヌクレオチドについて(a)で得られた突然変異体をスクリーニングすることを含む前記方法。 26．少なくとも一種の微生物から得られた核酸ライブラリーを選択手順にかけてそこから特定のタンパク質活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の全部あるいは一部である一種以上のプローブ核酸配列にハイブリダイズする二本鎖核酸を選択する方法であって (a)ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、二本鎖核酸集団を、リガンドに結合した核酸プローブと接触させて、プローブとそれにハイブリダイズする該核酸集団のメンバーの複合体を生成させ、 (b)未結合核酸集団から該複合体を分離し、 (c)該プローブから該プローブに結合した集団のメンバーを遊離させ、 (d)(c)の二本鎖核酸を適当な宿主に導入して、選択された核酸を含む複数のクローンを含むライブラリーを形成し、 (e)該ライブラリーを該特定のタンパク質活性についてスクリーニングすることを含む前記方法。