JP2000247999A

JP2000247999A - 固定化蛋白質の製造法

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Publication number: JP2000247999A
Application number: JP11049559A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Iwakura; 正寛巖倉
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2000-09-12
Anticipated expiration: 2019-02-26
Also published as: JP3047020B1

Abstract

(57)【要約】【課題】シアノシステイン残基を介したアミド結合形
成反応を利用して蛋白質のカルボキシル末端のカルボキ
シルを介して担体に固定化する方法において、固定化収
率を改善すること。【解決手段】一般式（１）NH₂-R₁-COOH （式中、Ｒ₁
は任意のアミノ酸残基の連鎖を表す。）で示される蛋白
質の固定化において、一般式（２）NH₂-R₁-CO-NH-CH(CH
₂-SCN)-CO-NH-R₂-COOH（式中、Ｒ₁は上記の意味を有
し、Ｒ₂は中性付近で強く負に荷電し、且つ式（２）の
化合物の等電点を酸性にもたらす、酸性アミノ酸に富む
任意のアミノ酸残基の連鎖を表す。）で示されるシアノ
基を有する蛋白質を、一般式（３）NH₂-Y（式中、Ｙは
一級アミンを官能基として有する固定化担体を表す。）
で示される固定化担体と反応させることにより、一般式
（４）NH₂-R₁-CO-NH-Y（Ｒ₁およびＹはともに上記の意
味を有する。）で示される固定化蛋白質を製造する方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、固定化蛋白質の効
率的な製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質の広範囲な利用法特に繰り返して
利用することを目的として、可溶性の蛋白質を、例えば
アガロースゲルなどの不溶性の担体と結合させ、固定化
蛋白質とする利用が試みられている。例えば、レセプタ
ー蛋白質を固定化し、レセプターが認識するリガンドの
検出を表面プラズモン共鳴現象で検出する装置（商品
名：ビアコア）とか、酵素蛋白質を不溶性担体に結合し
た固定化酵素の開発及びそれを利用した酵素反応器の作
製などが行われている。

【０００３】酵素の固定化には、蛋白質を構成するアミ
ノ酸の側鎖の反応性を利用して、不溶性担体と化学的に
結合することが主に行われている。例えば、システイン
残基には、官能基としてSH基がある。SH基の反応とし
て、ジスルヒド化、アルキル化、アシル化などが知られ
ており、この反応性を利用することにより、システイン
残基の側鎖を介して蛋白質の固定化を行うことができ
る。また、リジン残基は、アミノ基を側鎖に有する。こ
のアミノ基は、カルボジイミドを用いカルボキシル基と
アミド結合を形成できる。同様に、アスパラギン酸及び
グルタミン酸はカルボキシル基を有することから、カル
ボジイミドを用い一級アミンとアミド結合を形成するこ
とができる。しかしながら、このような側鎖の官能基を
利用する固定化反応は、蛋白質のアミノ酸配列に依存す
ること、また、蛋白質中には同種のアミノ酸が複数含ま
れることから固定化部位を特定できない、複数の箇所で
固定化される可能性を排除できないなどの問題がある。

【０００４】これらの問題を解消するために、シアノシ
ステイン残基を介したアミド結合形成反応（特開平10-4
5798号公報参照）を利用して蛋白質のカルボキシ末端の
カルボキシル基を介して固定化する反応が開発され、蛋
白質をカルボキシ末端の一箇所で且つ主鎖を介して結合
する手段が開発されている（特願平10−283669号参
照）。

【０００５】蛋白質をカルボキシ末端の一箇所で且つ主
鎖を介して結合することにより、変性の可逆性を高める
ことができ、固定化蛋白質の熱殺菌を可能にする固定化
酵素を作製できるなどの利点が得られた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、シアノ
システイン残基を介したアミド結合形成反応は、反応式 (１) NH₂-R-CO-NH-CH(CH₂-SCN)-CO-X + NH₂-B →
NH₂-R-CO-NH-B （式中、Ｒは任意のアミノ酸残基の連鎖、Ｘは、ＯＨも
しくは任意のアミノ酸残基もしくは任意のアミノ酸残基
の連鎖、NH₂−Bは任意の一級アミン化合物を表す。）で
表される。

【０００７】このアミド結合形成反応は、反応式 (２) NH₂-R-CO-NH-CH(CH₂-SCN)-CO-X + H₂O → N
H₂-R-COOH + Z （式中、Ｒは任意のアミノ酸残基の連鎖、Ｘは、ＯＨも
しくは任意のアミノ酸残基もしくは任意のアミノ酸残基
の連鎖、ＺはＸの2-イミノチアゾリン-4-カルボキシリ
ル誘導体を表す。）

【０００８】で表されるペプチド鎖切断反応（G.R.Jaco
bson, M.H.Schaffer, G.R.Stark, T.C.Vanaman, J.Biol
ogical Chemistry, 248, 6583-6591(1973)参照）、及び (３) NH₂-R-CO-NH-CH(CH₂-SCN)-CO-X → NH₂-R-CO-N
H-C(CH₂)-CO-X （式中、Ｒは任意のアミノ酸残基の連鎖、Ｘは、ＯＨも
しくは任意のアミノ酸残基もしくは任意のアミノ酸残基
の連鎖を表す。）

【０００９】で示されるチオシアノ基が脱離する、β−
脱離反応でシアノシステイン残基がデヒドロアラニンに
転換する反応（Y.Degani, A.Patchornik, Biochemistr
y, 13,1-11(1974)参照）の反応と競争的に起こることか
ら、反応収率に関して問題が生じた。すなわち、反応式
（１）を用いた蛋白質の固定化は、カルボキシ末端の一
箇所で且つ主鎖を介して結合できるという長所をもちな
がら、固定化収率において難点を有することが問題点と
してあげられている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、反応式（１）
で示されるアミド結合形成反応の反応効率を向上させる
ために鋭意研究を行った結果、一般式 NH₂-Yで示され
る固定化担体は、通常用いられる反応pHにおいてプラス
に荷電することから、蛋白質の等電点を酸性側にするこ
とによりイオン相互作用で効率よく吸着させることをキ
ャプチャー反応とすることまた、固定化担体に吸着する
ことにより反応式（１）で示されるアミド結合形成反応
の反応効率が高まるとの着想を得た。

【００１１】即ち、本発明は、下記一般式（１）で表さ
れる蛋白質配列を固定化するために、一般式（１）と、
下記一般式（６）で表されるシアノシステイン残基を含
有するペプチドで且つ中性付近で負に荷電するペプチド
配列をカルボキシ末端側に有するペプチドとが結合して
得られた配列を有する下記一般式（２）で表されるシア
ノ基を有する蛋白質を、下記一般式（３）で表される一
級アミンを有する固定化担体と反応させることにより、
下記一般式（４）で表される固定化蛋白質を効率よく製
造する方法を提供する。

【００１２】一般式（１） NH₂-R₁-COOH 一般式（２） NH₂-R₁-CO-NH-CH(CH₂-SCN)-CO-NH-R₂-CO
OH 一般式（３） NH₂-Y 一般式（４） NH₂-R₁-CO-NH-R₂-CO-NH-Y 一般式（６） NH₂-CH(CH₂-SCN)-CO-NH-R₂-COOH [式中、Ｒ₁は任意のアミノ酸残基の連鎖、Ｒ₂は、中性
付近で強く負に荷電し、且つ一般式（２）の化合物の等
電点を酸性にもたらす、酸性アミノ酸に富む任意のアミ
ノ酸残基の連鎖、Ｙは一級アミンを官能基として有する
固定化担体を表す。］

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明を実施するにあたり、一般
式（１）で示される蛋白質の固定化のためには、一般式
（２）で示される融合蛋白質を作製する必要がある。そ
の作製は、いわゆる組換えＤＮＡ手法と化学修飾法を用
いて行うことができる。

【００１４】即ち、一般式（１）で示される蛋白質をコ
ードする遺伝子と一般式（７） NH₂-CH(CH₂-SH)-CO-NH-R₂-COOH （７）（式中、Ｒ₂は上記の意味を有する。）で示されるペプ
チド配列をコードする遺伝子とを結合することにより、
一般式（８） NH₂-R₁-CO-NH-CH(CH₂-SH)-CO-NH-R₂-COOH （８） [式中、Ｒ₁は上記の意味を有し、Ｒ₂は、中性付近で強
く負に荷電し、且つNH₂-R₁-CO-NH-CH(CH₂-SH)-CO-NH-R₂
-COOHの等電点を酸性にできる任意のアミノ酸残基の連
鎖を表す。］

【００１５】で示される融合蛋白質をコードする遺伝子
を作製し、これを大腸菌などの宿主生物で発現させ、そ
の後、発現した蛋白質を分離精製することにより得るこ
とができる。このような融合蛋白質は公知技術（例え
ば、M. Iwakura et al., J. Bio.Chem. 111:37-45 (199
2)参照）を利用することにより、当業者であれば誰でも
が作製できることから、一般式（８）で示される融合蛋
白質の作製方法で本発明が限定されないことは、明白で
ある。あるいは、上記融合蛋白質は、遺伝子工学的手法
と慣用の蛋白合成技術との組み合わせ、または、蛋白合
成技術のみによっても作製することができる。

【００１６】一般式（２）または（８）におけるＲ₂と
しては、アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列
が好適である。蛋白質の等電点は、構成するアミノ酸の
種類と数に依存する。例えば、リジンやアルギニンなど
の塩基性アミノ酸を多く含む場合は、塩基性アミノ酸の
総数を超える数のアスパラギン酸やグルタミン酸が必要
である。蛋白質の等電点の計算は、当業者であれば容易
に計算により推定できる。好ましくは、一般式（２）ま
たは（８）の等電点を４から５の間の値になるように、
アスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列をデザイ
ンする。

【００１７】そのような配列のうち好適な配列としてア
ラニル-ポリアスパラギン酸をあげることができる。な
ぜならば、シアノシステインの次のアミノ酸をアラニン
にすることにより、シアノシステイン残基を介したアミ
ド結合形成反応が好都合あることと、アミノ酸側鎖の中
でアスパラギン酸のカルボキシル基が最も酸性であるか
らである。即ち、本発明の実施態様において、一般式
（８）の蛋白質の好適例は、一般式（９） NH₂-R₁-CO-NH-CH(CH₂-SH)-CO-NH-CH₂(CH₃)-CO-[NH-CH(CH₂-COOH)-CO]_n-OH （９）

【００１８】（式中、Ｒ₁は任意のアミノ酸残基の連
鎖、ｎは自然数を表す。）である。また一般式（２）の
蛋白質の好適例は、一般式（５） NH₂-R₁-CO-NH-CH(CH₂-SCN)-CO-NH-CH₂(CH₃)-CO-[NH-CH(CH₂-COOH)-CO]_n-OH （５）（式中、Ｒ₁およびｎは上記の意味を有する。）であ
る。

【００１９】一般式（８）[即ち、上記式NH₂-R₁-CO-NH-
CH(CH₂-SH)-CO-NH-R₂-COOH]から、一般式（2）[即ち、
上記式NH₂-R₁-CO-NH-CH(CH₂-SCN)-CO-NH-R₂-COOH]への
転換、いわゆるシアノ化反応は、シアノ化試薬を用いて
行うことができる。

【００２０】シアノ化試薬としては、通常、２-ニトロ-
５-チオシアノ安息香酸(2-nitro-5-thiocyanobennzoic
acid (NTCB)) (Y.Degani, A.Ptchornik, Biochemistry,
13,1-11 (1974)参照）または、１−シアノ-４-ジメチ
ルアミノピリジニウムテトラフルオロ硼酸(1-cyano-4di
methylaminopyridinium tetrafluoroborate(CDAP))など
を用いる方法が簡便である。NTCBおよびCDAPは市販のも
のをそのまま用いることができる。NTCBを用いたシアノ
化は、pH7〜9の間で効率よく行うことができ、且つ遊離
するチオニトロ安息香酸の412nmの吸光度の増加（分子
吸光係数=13,600M^-1cm^-1）で反応効率を調べることがで
きる。また、SH基のシアノ化は文献(J.Wood & Catsipoo
las, J.Biol.Chem. 233, 2887(1963)参照)の記載の方法
に従っても行うことができる。

【００２１】本発明に用いられる一般式(3)「NH₂-Y」で
示される固定化担体としては、一級アミノ基を有する不
溶性担体であれば何でも用いることができる。一級アミ
ノ基を有する市販の担体としては、アミノ−セルロファ
イン（生化学工業で販売）、AF-アミノトヨパール（TOS
OHで販売）、EAH-セファローズ４Ｂ及びリジン-セファ
ローズ４Ｂ（アマシャムファルマシアで販売）、ポラス
２０NH（ベーリンガーマンハイムで販売）などが利用可
能である。また、シラン化合物で一級アミンを有する化
合物（例えば、３−アミノプロピルメトキシシランな
ど）を用いてガラスビーズなどに一級アミンを導入し、
利用することも可能である。

【００２２】一般式（2）[即ち、上記式 NH₂-R₁-CO-NH-
CH(CH₂-SCN)-CO-NH-R₂-COOH]で示されるシアノ化された
融合蛋白質と一般式(3)[即ち、上記式NH₂-Y]で示される
固定化担体の反応は、弱アルカリ条件下（ｐＨ8〜10）
に、室温で行うことができる。弱アルカリ反応条件化に
おいて、一般式（2）で示されるシアノ化された融合蛋
白質は負に帯電し、一方一般式(3)で示される固定化担
体は正に帯電し、静電相互作用により互いに結合するこ
とから、反応式（１）で示されるアミド結合形成反応の
キャプチャー反応として利用できる。この静電相互作用
は溶媒中の塩濃度に依存することから、用いられる溶媒
としてはできるだけ塩濃度が低いものが好ましい。本発
明の実施例においては、10mMの硼酸緩衝液、pH9を用い
ているが、静電相互作用が適正に行われる塩濃度であれ
ばどのような条件でも可能である。

【００２３】従って、固定化反応を行う溶液であるが、
上記静電相互作用を保証し、且つ、一般式（2）で示さ
れるシアノ化した融合蛋白質が溶ける溶媒で且つｐＨを
調整できる溶媒であれば利用可能である。リン酸緩衝
液、硼酸緩衝液などの種々の緩衝液、メタノール、エタ
ノールなどのアルコール類の他、ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホオキサイドなどが利用可能である。
反応温度は、室温で高い反応効率が得られるが、用いる
溶媒が凍結もしくは沸騰しない範囲、及び一般式（２）
で示されるシアノ化した融合蛋白質が変性の結果凝集し
ない温度範囲であれば問題なく用いることができる。

【００２４】本発明で用いるシアノシステインが関与す
る反応には、副反応として加水分解反応、即ち上記反応
式（２）、および上記反応式（３）の反応が起こりうる
が、このような可能な副反応から生成する反応物は全て
溶媒に溶けるため、反応後、固定化担体を適当な溶媒で
洗うことにより副反応生成物を取り除くことができる。
従って、本発明で用いられる固定化反応により、作製さ
れる固定化酵素は全て一般式（４）NH₂-R₁-CO-NH-Y（式
中、Ｒ₁およびＹは上記の意味を有する。）で表され、
目的とする蛋白質のカルボキシ末端一箇所で固定化担体
に結合する。

【００２５】このようにして得られた固定化蛋白質の特
徴としては、担体にカルボキシ末端が一箇所だけで結合
していることがあげられるが、このことにより蛋白質の
機能が良好に発揮される。例えば、固定化蛋白質として
触媒機能を有する酵素蛋白質を用いた場合、温度を上げ
るとか、変性剤を食われることにより一度変性させる
と、触媒機能を失うが、本発明に固定化によって作製し
た固定化酵素は、変性させる条件を取り除くことによ
り、その機能を完全に再生することができる（特願平10
-283669号参照）。

【００２６】本発明の蛋白質固定化方法が実際有効であ
ることを示すために、後記の実施例では、アミノ酸数15
9個よりなる大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素の変異
酵素（AS-DHFR-G4と略す）を用いて実証している。

【００２７】

【実施例】以下に、実施例を示して本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はその実施例によって制限され
ないものとする。＜実施例＞固定化用ジヒドロ葉酸還元酵素の作製及び固定化反応に
及ぼすイオン相互作用の効果

【００２８】本実施例においては、一般式（１）に該当
する蛋白質として、AS-DHFR-G4を用いている。AS-DHFR-
G4のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。本実施例にお
いては、AS-DHFR-G4のカルボキシ末端に、Cys-Ala(CAと
略す), Cys-Ala-Asp-Asp (CAD2と略す), Cys-Ala-Asp-A
sp-Asp-Asp (CAD4と略す),Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-As
p-Asp (CAD6と略す), Cys-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-As
p-Asp-Asp (CAD8と略す)の5種類のポリペプチドを融合
した蛋白質を合成して、計算される等電点と、一級アミ
ンを有する固定化担体との結合との関係を調査検討し
た。AS-DHFR-G4と CA, CAD2, CAD4, CAD6,及びCAD8との
それぞれの融合蛋白質を、AS-DHFR-G4-CA, AS-DHFR-G4-
CAD2, AS-DHFR-G4-CAD4, AS-DHFR-G4-CAD6,及び AS-DHF
R-G4-CAD8とそれぞれ略す。

【００２９】AS-DHFR-G4-CA, AS-DHFR-G4-CAD2, AS-DHF
R-G4-CAD4, AS-DHFR-G4-CAD6,及びAS-DHFR-G4-CAD8それ
ぞれのアミノ酸配列を配列番号：２、配列番号：３、配
列番号：４、配列番号：５、及び配列番号：６に示す。
AS-DHFR-G4-CA, AS-DHFR-G4-CAD2, AS-DHFR-G4-CAD4, A
S-DHFR-G4-CAD6,及びAS-DHFR-G4-CAD8の作製は、AS-DHF
Rの遺伝子を用いて遺伝子工学的に行った。すでに、AS-
DHFRの遺伝子が既知である(M. Iwakura, B.E. Jones,
J. Luo, & C.R.Matthews, J. Biochemistry, 117： 480
-488 (1995) 参照）。

【００３０】遺伝子発現に必要なプロモータ配列及びリ
ボゾーム結合配列を含んだAS-DHFR遺伝子の塩基配列を
配列番号：７に示す。配列番号：７に示されるAS-DHFR
の遺伝子は「pTZDHFR20」と名付けられたプラスミドに
組み込まれている(M. Iwakura, B.E. Jones, J. Luo, &
C.R. Matthews, J. Biochemistry, 117： 480-488 (19
95) 参照）。

【００３１】この遺伝子配列を基に、２本のプライマー
DNA、5'-GGGGATCCTC TTGACAATTA GTTAACTATT TGTTATAAT
G TATTC -3'（配列番号：8）及び 5'-GGGGATCCCT TATGC
ACAGC CACCGCCACC ACGACGCTCG AGGATTTCG-3'（配列番
号：9）を用い、pTZDHFR20を鋳型として、PCR法により
増幅することにより、AS-DHFR-G4-CAを発現できる遺伝
子配列を作製した。次に、このようにして作製したAS-D
HFR-G4-CA遺伝子を鋳型とし、配列番号:８と配列番号：
10の２本のプライマーDNAを用いることにより、PCR法に
より増幅することにより、AS-DHFR-G4-CAD2を発現でき
る遺伝子配列を作製した。以下同様に、AS-DHFR-G4-CAD
2遺伝子を鋳型とし配列番号:８と配列番号：11の２本の
プライマーDNAを用いAS-DHFR-G4-CAD4遺伝子を、AS-DHF
R-G4-CAD4遺伝子を鋳型とし配列番号:８と配列番号：12
の２本のプライマーDNAを用いAS-DHFR-G4-CAD6遺伝子
を、AS-DHFR-G4-CAD6遺伝子を鋳型とし配列番号:８と配
列番号：13の２本のプライマーDNAを用いAS-DHFR-G4-CA
D8遺伝子を作製した。

【００３２】AS-DHFR-G4-CA, AS-DHFR-G4-CAD2, AS-DHF
R-G4-CAD4, AS-DHFR-G4-CAD6,及びAS-DHFR-G4-CAD8それ
ぞれの遺伝子の塩基配列を配列番号：14、配列番号：1
5、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18に示
す。増幅して得られたそれぞれのDNAを制限酵素BamHIで
切断後、BamHIで切断したクローニングベクターpUC19と
結合し、得られた組み替えプラスミドを大腸菌に導入す
ることにより、AS-DHFR-G4-CA, AS-DHFR-G4-CAD2, AS-D
HFR-G4-CAD4, AS-DHFR-G4-CAD6,及び AS-DHFR-G4-CAD8
それぞれを大腸菌菌体中に発現でき、大腸菌をトリメト
プリム耐性及びアンピシリン耐性に形質転換した。

【００３３】このようにして得られた大腸菌を、３リッ
ターの培地（15 gの食塩、15gの酵母エキス、24ｇのト
リプトン、30 mgのアンピシリンナトリウムを含んでい
る）で、３７度で一晩培養し、湿重量約１０ｇの菌体を
得た。この菌体の無細胞抽出液に、ストレプトマイシン
硫酸処理、硫安分画、メソトレキセートアフィニティク
ロマトグラフィー及びDEAEトヨパールクロマトグラフィ
ーの精製操作を施すことにより、均一にまで蛋白質を精
製し、約100 mgの均一なAS-DHFR-G4-CA, AS-DHFR-G4-CA
D2, AS-DHFR-G4-CAD4, AS-DHFR-G4-CAD6,及び AS-DHFR-
G4-CAD8がそれぞれを得られた。それぞれの蛋白質濃度
は、AS-DHFRの280nmの分子吸光係数31100 M^-1cm^-1を用
いて、280nmの吸光度より決定した。

【００３４】得られたAS-DHFR-G4-CA, AS-DHFR-G4-CAD
2, AS-DHFR-G4-CAD4, AS-DHFR-G4-CAD6,及び AS-DHFR-G
4-CAD8それぞれの配列中164番目のアミノ酸であるシス
テイン残基のシアノ化は、5mMのエチレンジアミン４酢
酸(EDTA)を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液、pH 7.4、中で、
AS-G4CA（約0.032 mM)の５倍量（0.16 mM）の２-ニトロ
-５-チオシアノ安息香酸(NTCB)を加え、室温で４時間反
応させることにより行った。遊離するチオニトロ安息香
酸の412nmの吸光度の増加（分子吸光係数=13,600M^-1cm
^-1）から、ほぼ定量的にシステイン残基がシアノ化され
たことが確かめられた。

【００３５】シアノ化反応液からの未反応のNTCB及びチ
オニトロ安息香酸の除去は、セファデックスG50カラム
（カラムサイズ：φ25 x 150 mm）を用いたゲル濾過に
より行った。溶離液としては、5mMのエチレンジアミン
４酢酸(EDTA)を含む10mM硼酸酸緩衝液、pH 9.5を用い
た。このようにして得られたシアノ化蛋白質を固定化反
応に速やかに用いた。

【００３６】得られたシステインがシアノ化されたAS-D
HFR-G4-CA, AS-DHFR-G4-CAD2, AS-DHFR-G4-CAD4, AS-DH
FR-G4-CAD6,及び AS-DHFR-G4-CAD8それぞれ約20 mg（約
10^-8moles)用いて、5mlのアミノセルロファイン（生化
学工業で販売；アミン含有量、約10^-5moles NH₂/ml ゲ
ル）と混合し、混合直後の遊離蛋白量を測定した。遊離
蛋白量の測定は、反応液を1000回転２分間遠心分離し、
上清の280nmの吸光度を測定することにより行った。混
合直後の時点では、固定化反応がほとんど進まないた
め、投入蛋白量から遊離蛋白量を差し引いた蛋白質の量
が、イオン相互作用によりアミノセルロファインに結合
したものと考えられる。その後、室温で24時間で緩やか
に混合を続けながら固定化反応を行わせた。これに終濃
度1MとなるようにKClを加え、遊離蛋白量を測定した。
終濃度1MとなるようにKClを加えることにより、イオン
相互作用だけで結合している蛋白質は、アミノセルロフ
ァインから遊離することになり、投入蛋白量から、遊離
蛋白質の量を除いた量が固定化された蛋白量として求め
られた。

【００３７】このようにして求めた固定化された蛋白質
の量の見積が正しいことは、次のようにして確認され
た。得られた各々の固定化酵素をそれぞれカラムに詰
め、一度４Ｍの塩酸グアニジン溶液を通し、非特異的に
結合している蛋白質を完全に洗い流した後、10ｍＭリン
酸緩衝液、pH 7.0で平衡化し、塩酸グアニジン処理によ
り変性した固定化蛋白質を完全に再生した。これにDHFR
の強力な阻害剤であるメソトレキセート(MTX)(0.1 mM)
を通し固定化した蛋白質に結合させた後、1ＭのKClを含
む10ｍＭリン酸緩衝液、pH 7.0で非特異的に結合したMT
Xを洗い出し、その後、４Ｍの塩酸グアニジン溶液を流
すことにより、固定化蛋白質を再度変性させ、結合した
MTXを溶出させ、溶出したMTXを回収し、回収MTXの量を
測定し、（MTXの分子吸光係数；22100 M^-1cm^-1)、固定
化された蛋白質で且つMTX結合機能を有するものの蛋白
量を測定した。以上の結果を、表１にまとめて示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】この結果は、固定化担体であるアミノセル
ロファインと混合直後の遊離蛋白質の減少量がほぼ固定
化蛋白量と一致することから、正に荷電したアミノセル
ロファインと負に荷電した蛋白質とのイオン結合が、キ
ャプチャー反応として利用できることを示唆している。
このことを、確かめるために、用いた硼酸緩衝液の濃度
を50mMに高め、上記と同様に固定化効率を測定した。固
定化効率（％）は、100x固定化蛋白量／投入蛋白量で与
えられる。

【００４０】表２に、10mM及び50mM硼酸緩衝液を用いた
時の固定化効率を比較して示している。また、同時に、
アミノ酸組成から求めた各々の蛋白質の等電点、pH７に
おける電荷をも示している。

【００４１】

【表２】

【００４２】表２から明らかなように、固定化効率は、
カルボキシ末端側に中性〜アルカリ性で負に荷電するポ
リアスパラギンを導入することにより、著しく改善する
ことが示された。また、硼酸緩衝液の濃度（即ち塩濃
度）を上げることにより、固定化効率が低下するが、ポ
リアスパラギンの長い方が、塩濃度の影響を受けにくく
なることが明らかである。このことは、混合直後の遊離
蛋白質の減少が主にイオン相互作用によることを示して
おり、本発明で意図した「イオン相互作用によるキャプ
チャー反応」が確かに働くことを示している。

【００４３】

【発明の効果】本発明では、目的蛋白質をカルボキシ末
端のカルボキシ基を介して、投入量の約70％という高い
収率で固定化することができる。既に特願平10-283669
号に記載されているように、カルボキシ末端のカルボキ
シ基を介して固定化された固定化蛋白質は、全てその機
能を発揮できることと、一度溶媒条件を変えて変性させ
ても、元の溶媒条件にすると、完全に元の機能を回復で
きる、即ち、変性の完全可逆化ができるものであり、実
用的価値の高いものである。

【００４４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DIRECTOR - GENERAL OF AGENCY OF INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> PROCESS FOR PREPARING IMMOBILIZED PROTEINS <130> 11900258 <160> 18 <170> Windows 95 <210> 1 <211> 163 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Ala Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Ser Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly <210> 2 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of AS-DHFR-G4-CA. <400> 2 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Ala Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Ser Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Cys Ala 165 <210> 3 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of AS-DHFR-G4-CAD2. <400> 3 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Ala Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Ser Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Cys Ala Asp Asp 165 <210> 4 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of AS-DHFR-G4-CAD4. <400> 4 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Ala Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Ser Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Cys Ala Asp Asp Asp Asp 165 <210> 5 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of AS-DHFR-G4-CAD6. <400> 5 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Ala Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Ser Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Cys Ala Asp Asp Asp Asp Asp Asp 165 170 <210> 6 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of AS-DHFR-G4-CAD8. <400> 6 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Ala Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Ser Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Cys Ala Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 165 170 <210> 7 <211> 554 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 ttgacaatta gttaactatt tgttataatg tattcatgag cttaactaac taatccggaa 60 aaggaggaac ttccatgatc agtctgattg cggcgctagc ggtagatcgc gttatcggca 120 tggaaaacgc catgccatgg aacctgcctg ccgatctcgc ctggtttaaa cgcaacacct 180 taaataaacc cgtgattatg gggcgccata cctgggaatc aatcggtagg cctttgcccg 240 gccgcaaaaa tattatcctc agcagtcaac ccgggaccga tgatcgggtt acctgggtta 300 aatcggtcga cgaagccatc gcggccgcag gtgacgtacc agaaatcatg gtgattggcg 360 gcggacgcgt ttatgaacag ttcttgccaa aagcgcaaaa gctttatctg acgcatatcg 420 atgcagaagt ggaaggcgac acccattttc cggattacga gccggatgac tgggaatcgg 480 tattcagcga attccacgat gctgatgcgc agaactcgca tagctattcg ttcgaaatcc 540 tcgagcgtcg ttaa 554 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for the amplification of AS-DHFR-G4-CA gene . <400> 8 ggggatcctc ttgacaatta gttaactatt tgttataatg tattc 45 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for the amplification of AS-DHFR-G4-CA gene . <400> 9 ggggatccct tatgcacagc caccgccacc acgacgctcg aggatttcg 50 <210> 10 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for the amplification of AS-DHFR-G4-CAD2 ge ne. <400> 10 ggggatccct taatcatctg cacagccacc gccaccacga cgctcgagga tttcg 55 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for the amplification of AS-DHFR-G4-CAD4 ge ne. <400> 11 ggggatccct taatcatcat catctgcaca gccaccgcca ccacgacgct cgagg 55 <210> 12 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for the amplification of AS-DHFR-G4-CAD6 ge ne. <400> 12 ggggatccct taatcatcat catcatcatc tgcacagcca ccgccaccac gacgc 55 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for the amplification of AS-DHFR-G4-CAD8 ge ne. <400> 13 ggggatccct taatcatcat catcatcatc atcatctgca cagccaccgc caccacgacg 60 <210> 14 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a nucleotide sequence of AS-DHFR-G4-CA gene. <400> 14 ggggatcctc ttgacaatta gttaactatt tgttataatg tattcatgag cttaactaac 60 taatccggaa aaggaggaac ttccatgatc agtctgattg cggcgctagc ggtagatcgc 120 gttatcggca tggaaaacgc catgccatgg aacctgcctg ccgatctcgc ctggtttaaa 240 cgcaacacct taaataaacc cgtgattatg gggcgccata cctgggaatc aatcggtagg 300 cctttgcccg gccgcaaaaa tattatcctc agcagtcaac ccgggaccga tgatcgggtt 360 acctgggtta aatcggtcga cgaagccatc gcggccgcag gtgacgtacc agaaatcatg 420 gtgattggcg gcggacgcgt ttatgaacag ttcttgccaa aagcgcaaaa gctttatctg 480 acgcatatcg atgcagaagt ggaaggcgac acccattttc cggattacga gccggatgac 540 tgggaatcgg tattcagcga attccacgat gctgatgcgc agaactcgca tagctattcg 600 ttcgaaatcc tcgagcgtcg tggtggcggt ggctgtgcat aagggatccc c 651 <210> 15 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a nucleotide sequence of AS-DHFR-G4-CAD2 gene. <400> 15 ggggatcctc ttgacaatta gttaactatt tgttataatg tattcatgag cttaactaac 60 taatccggaa aaggaggaac ttccatgatc agtctgattg cggcgctagc ggtagatcgc 120 gttatcggca tggaaaacgc catgccatgg aacctgcctg ccgatctcgc ctggtttaaa 240 cgcaacacct taaataaacc cgtgattatg gggcgccata cctgggaatc aatcggtagg 300 cctttgcccg gccgcaaaaa tattatcctc agcagtcaac ccgggaccga tgatcgggtt 360 acctgggtta aatcggtcga cgaagccatc gcggccgcag gtgacgtacc agaaatcatg 420 gtgattggcg gcggacgcgt ttatgaacag ttcttgccaa aagcgcaaaa gctttatctg 480 acgcatatcg atgcagaagt ggaaggcgac acccattttc cggattacga gccggatgac 540 tgggaatcgg tattcagcga attccacgat gctgatgcgc agaactcgca tagctattcg 600 ttcgaaatcc tcgagcgtcg tggtggcggt ggctgtgcag atgattaagg gatcccc 657 <210> 16 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a nucleotide sequence of AS-DHFR-G4-CAD4 gene. <400> 16 ggggatcctc ttgacaatta gttaactatt tgttataatg tattcatgag cttaactaac 60 taatccggaa aaggaggaac ttccatgatc agtctgattg cggcgctagc ggtagatcgc 120 gttatcggca tggaaaacgc catgccatgg aacctgcctg ccgatctcgc ctggtttaaa 240 cgcaacacct taaataaacc cgtgattatg gggcgccata cctgggaatc aatcggtagg 300 cctttgcccg gccgcaaaaa tattatcctc agcagtcaac ccgggaccga tgatcgggtt 360 acctgggtta aatcggtcga cgaagccatc gcggccgcag gtgacgtacc agaaatcatg 420 gtgattggcg gcggacgcgt ttatgaacag ttcttgccaa aagcgcaaaa gctttatctg 480 acgcatatcg atgcagaagt ggaaggcgac acccattttc cggattacga gccggatgac 540 tgggaatcgg tattcagcga attccacgat gctgatgcgc agaactcgca tagctattcg 600 ttcgaaatcc tcgagcgtcg tggtggcggt ggctgtgcag atgatgatga ttaagggatc 660 ccc 663 <210> 17 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a nucleotide sequence of AS-DHFR-G4-CAD6 gene. <400> 17 ggggatcctc ttgacaatta gttaactatt tgttataatg tattcatgag cttaactaac 60 taatccggaa aaggaggaac ttccatgatc agtctgattg cggcgctagc ggtagatcgc 120 gttatcggca tggaaaacgc catgccatgg aacctgcctg ccgatctcgc ctggtttaaa 240 cgcaacacct taaataaacc cgtgattatg gggcgccata cctgggaatc aatcggtagg 300 cctttgcccg gccgcaaaaa tattatcctc agcagtcaac ccgggaccga tgatcgggtt 360 acctgggtta aatcggtcga cgaagccatc gcggccgcag gtgacgtacc agaaatcatg 420 gtgattggcg gcggacgcgt ttatgaacag ttcttgccaa aagcgcaaaa gctttatctg 480 acgcatatcg atgcagaagt ggaaggcgac acccattttc cggattacga gccggatgac 540 tgggaatcgg tattcagcga attccacgat gctgatgcgc agaactcgca tagctattcg 600 ttcgaaatcc tcgagcgtcg tggtggcggt ggctgtgcag atgatgatga tgatgattaa 660 gggatcccc 669 <210> 18 <211> 675 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a nucleotide sequence of AS-DHFR-G4-CAD8 gene. <400> 18 ggggatcctc ttgacaatta gttaactatt tgttataatg tattcatgag cttaactaac 60 taatccggaa aaggaggaac ttccatgatc agtctgattg cggcgctagc ggtagatcgc 120 gttatcggca tggaaaacgc catgccatgg aacctgcctg ccgatctcgc ctggtttaaa 240 cgcaacacct taaataaacc cgtgattatg gggcgccata cctgggaatc aatcggtagg 300 cctttgcccg gccgcaaaaa tattatcctc agcagtcaac ccgggaccga tgatcgggtt 360 acctgggtta aatcggtcga cgaagccatc gcggccgcag gtgacgtacc agaaatcatg 420 gtgattggcg gcggacgcgt ttatgaacag ttcttgccaa aagcgcaaaa gctttatctg 480 acgcatatcg atgcagaagt ggaaggcgac acccattttc cggattacga gccggatgac 540 tgggaatcgg tattcagcga attccacgat gctgatgcgc agaactcgca tagctattcg 600 ttcgaaatcc tcgagcgtcg tggtggcggt ggctgtgcag atgatgatga tgatgatgat 660 gattaaggga tcccc 675

【００４５】

【配列表フリーテキスト】

配列番号２： AS-DHFR-G4-CAのアミノ酸配列を示す。配列番号３： AS-DHFR-G4-CAD2のアミノ酸配列を示す。配列番号４： AS-DHFR-G4-CAD4のアミノ酸配列を示す。配列番号５： AS-DHFR-G4-CAD６のアミノ酸配列を示
す。配列番号６： AS-DHFR-G4-CAD８のアミノ酸配列を示
す。配列番号８： AS-DHFR-G4-CA遺伝子増幅用のプライマー
を示す。配列番号９： AS-DHFR-G4-CA遺伝子増幅用のプライマー
を示す。配列番号１０： AS-DHFR-G4-CAD2遺伝子増幅用のプライ
マーを示す。配列番号１１： AS-DHFR-G4-CAD4遺伝子増幅用のプライ
マーを示す。配列番号１２： AS-DHFR-G4-CAD６遺伝子増幅用のプラ
イマーを示す。配列番号１３： AS-DHFR-G4-CAD８遺伝子増幅用のプラ
イマーを示す。配列番号１４： AS-DHFR-G4-CA遺伝子のヌクレオチド配
列を示す。配列番号１５： AS-DHFR-G4-CAD2遺伝子のヌクレオチド
配列を示す。配列番号１６： AS-DHFR-G4-CAD4遺伝子のヌクレオチド
配列を示す。配列番号１７： AS-DHFR-G4-CAD６遺伝子のヌクレオチ
ド配列を示す。配列番号１８： AS-DHFR-G4-CAD８遺伝子のヌクレオチ
ド配列を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年１２月２２日（１９９９．１２．
２２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１２】一般式（１） NH_２-R_１-COOH 一般式（２） NH_２-R_１-CO-NH-CH(CH_２-SCN)-CO-NH-R
_２-COOH 一般式（３） NH_２-Y 一般式（４） NH_２-R_１-CO-NH-Y 一般式（６） NH_２-CH(CH_２-SCN)-CO-NH-R_２-COOH [式中、Ｒ_１は任意のアミノ酸残基の連鎖、Ｒ_２は、中
性付近で強く負に荷電し、且つ一般式（２）の化合物の
等電点を酸性にもたらす、酸性アミノ酸に富む任意のア
ミノ酸残基の連鎖、Ｙは一級アミンを官能基として有す
る固定化担体を表す。］

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】このようにして得られた固定化蛋白質の特
徴としては、担体にカルボキシ末端が一箇所だけで結合
していることがあげられるが、このことにより蛋白質の
機能が良好に発揮される。例えば、固定化蛋白質として
触媒機能を有する酵素蛋白質を用いた場合、温度を上げ
るとか、変性剤を加えることにより一度変性させると、
触媒機能を失うが、本発明に固定化によって作製した固
定化酵素は、変性させる条件を取り除くことにより、そ
の機能を完全に再生することができる（特願平10-28366
9号参照）。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（１） NH₂-R₁-COOH (1) （式中、Ｒ₁は任意のアミノ酸残基の連鎖を表す。）で
示される蛋白質の固定化において、一般式（２） NH₂-R₁-CO-NH-CH(CH₂-SCN)-CO-NH-R₂-COOH (2) （式中、Ｒ₁は上記の意味を有し、Ｒ₂は中性付近で強く
負に荷電し、且つ式（２）の化合物の等電点を酸性にも
たらす、酸性アミノ酸に富む任意のアミノ酸残基の連鎖
を表す。）で示されるシアノ基を有する蛋白質を、一般
式（３） NH₂-Y （３）（式中、Ｙは一級アミンを官能基として有する固定化担
体を表す。）で示される固定化担体と反応させることに
より、一般式（４） NH₂-R₁-CO-NH-Y （４）（Ｒ₁およびＹはともに上記の意味を有する。）で示さ
れる固定化蛋白質を製造する方法。
【請求項２】一般式（２）の蛋白質が、一般式（５） NH₂-R₁-CO-NH-CH(CH₂-SCN)-CO-NH-CH₂(CH₃)-CO-[NH-CH(CH₂-COOH)-CO]_n-OH （５）（式中、Ｒ₁は上記の意味を有し、ｎは自然数を表
す。）で示されるシアノ基を有する蛋白質であることを
特徴とする請求項１に記載の方法。