JPH07278200A - ＰＥ４０Ａｂを含有するタンパク質抗ガン剤 - Google Patents
ＰＥ４０Ａｂを含有するタンパク質抗ガン剤Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 細胞選択性に優れた抗癌剤
【構成】 シュードモナスエキソトキシンＡの３７２位
と３７９位の２つのシステイン残基を、ジスルフィド結
合を形成しない同じかまたは異なっていてもよい２つの
アミノ酸で置換または除去することにより改変したシュ
ードモナスエキソトキシンＡ断片（ＰＥ４０Ａｂ）とそ
れに結合したタンパク質ターゲティング剤領域とからな
るハイブリッドタンパク質。 【効果】 本ハイブリッドタンパク質は選択的細胞毒性
において優れている。
と３７９位の２つのシステイン残基を、ジスルフィド結
合を形成しない同じかまたは異なっていてもよい２つの
アミノ酸で置換または除去することにより改変したシュ
ードモナスエキソトキシンＡ断片（ＰＥ４０Ａｂ）とそ
れに結合したタンパク質ターゲティング剤領域とからな
るハイブリッドタンパク質。 【効果】 本ハイブリッドタンパク質は選択的細胞毒性
において優れている。
Description
【０００１】伝統的なガンの化学療法は、薬物がガン患
者の腫瘍細胞を殺す能力に依存している。不幸なこと
に、これらの同じ薬物が腫瘍細胞とともに正常な細胞を
も殺すことがしばしばある。ガン薬が正常細胞を殺さず
に腫瘍細胞を殺す程度は、その化合物の腫瘍細胞に対す
る選択性の度合の指標である。ガン薬の腫瘍細胞に対す
る選択性を高める一つの方法は、薬物を腫瘍細胞に重点
的に送達し、正常細胞集団には近づけないことである。
化学療法剤を特定の細胞集団に選択的に送達することを
言い表わす言葉として、「ターゲティング（targetin
g）」という言葉もある。腫瘍細胞への薬物のターゲテ
ィングはいくつかの方法によって行うことができる。一
つの方法は、腫瘍細胞の表面に見い出される特定の受容
体（receptor）分子の存在に依存する方法である。「タ
ーゲティング剤」と称される他の分子がこのような細胞
表面の受容体を認識してそれに結合するのである。これ
らの「ターゲティング剤」には、たとえば抗体、成長因
子（growth factor）あるいはホルモンなどがある。特
定の細胞表面受容体を認識してそれに結合する「ターゲ
ティング剤」は、そのような受容体を有する細胞を標的
にするといわれている。たとえば、多くの腫瘍細胞は、
その表面に表皮性（epidermal）成長因子受容体と呼ば
れるタンパク質を有する。表皮性成長因子（ＥＧＦ）お
よび転換性（transforming）成長因子α（ＴＧＦ−α）
を含むいくつかの成長因子は、腫瘍細胞上のＥＧＦ受容
体を認識してこれに結合する。それゆえＥＧＦやＴＧＦ
−αはこれらの腫瘍細胞に対する「ターゲティング剤」
である。
者の腫瘍細胞を殺す能力に依存している。不幸なこと
に、これらの同じ薬物が腫瘍細胞とともに正常な細胞を
も殺すことがしばしばある。ガン薬が正常細胞を殺さず
に腫瘍細胞を殺す程度は、その化合物の腫瘍細胞に対す
る選択性の度合の指標である。ガン薬の腫瘍細胞に対す
る選択性を高める一つの方法は、薬物を腫瘍細胞に重点
的に送達し、正常細胞集団には近づけないことである。
化学療法剤を特定の細胞集団に選択的に送達することを
言い表わす言葉として、「ターゲティング（targetin
g）」という言葉もある。腫瘍細胞への薬物のターゲテ
ィングはいくつかの方法によって行うことができる。一
つの方法は、腫瘍細胞の表面に見い出される特定の受容
体（receptor）分子の存在に依存する方法である。「タ
ーゲティング剤」と称される他の分子がこのような細胞
表面の受容体を認識してそれに結合するのである。これ
らの「ターゲティング剤」には、たとえば抗体、成長因
子（growth factor）あるいはホルモンなどがある。特
定の細胞表面受容体を認識してそれに結合する「ターゲ
ティング剤」は、そのような受容体を有する細胞を標的
にするといわれている。たとえば、多くの腫瘍細胞は、
その表面に表皮性（epidermal）成長因子受容体と呼ば
れるタンパク質を有する。表皮性成長因子（ＥＧＦ）お
よび転換性（transforming）成長因子α（ＴＧＦ−α）
を含むいくつかの成長因子は、腫瘍細胞上のＥＧＦ受容
体を認識してこれに結合する。それゆえＥＧＦやＴＧＦ
−αはこれらの腫瘍細胞に対する「ターゲティング剤」
である。
【０００２】「ターゲティング剤」はそれ自身では腫瘍
細胞を殺さない。細胞毒あるいは毒素といった他の分子
が「ターゲティング剤」と結合して、腫瘍細胞ターゲテ
ィング領域と細胞毒素領域との両方を有する複合（hybr
id）分子を作ることができるのである。これらの複合分
子はその腫瘍細胞を標的にする能力に基づく腫瘍細胞選
択性の毒物として機能し、かくしてその毒素成分により
これらの細胞を殺す。これらの複合分子を作るのに最も
よく用いられる細胞毒のうちのいくつかのものは、哺乳
動物細胞内におけるタンパク質合成を阻害する細菌性毒
素である。シュードモナス外毒素（pseudomonas exotox
in）Ａはこのような細菌性毒素の一つであり、複合「タ
ーゲティング−毒素」分子を構成するのに用いられてき
た（米国特許第４，５４５，９８５号）。
細胞を殺さない。細胞毒あるいは毒素といった他の分子
が「ターゲティング剤」と結合して、腫瘍細胞ターゲテ
ィング領域と細胞毒素領域との両方を有する複合（hybr
id）分子を作ることができるのである。これらの複合分
子はその腫瘍細胞を標的にする能力に基づく腫瘍細胞選
択性の毒物として機能し、かくしてその毒素成分により
これらの細胞を殺す。これらの複合分子を作るのに最も
よく用いられる細胞毒のうちのいくつかのものは、哺乳
動物細胞内におけるタンパク質合成を阻害する細菌性毒
素である。シュードモナス外毒素（pseudomonas exotox
in）Ａはこのような細菌性毒素の一つであり、複合「タ
ーゲティング−毒素」分子を構成するのに用いられてき
た（米国特許第４，５４５，９８５号）。
【０００３】シュードモナス外毒素Ａは、まず哺乳動物
細胞表面に結合し、次に細胞質内に侵入して、タンパク
質合成に必要な細胞タンパク質である延長因子（elonga
tionfactor）２を不活性化して細胞を中毒させる。シュ
ードモナス外毒素Ａは、モノクローナル抗体とタンパク
質ホルモンを用いて抗ガン複合分子を作るのに用いられ
ている。しかしながら、このような複合分子にまつわる
一つの問題は、それらが正常細胞に対して毒性を示すこ
とである。シュードモナス外毒素Ａを含む複合分子に係
る毒性の少なくとも一部は、シュードモナス外毒素Ａ自
体が多くの種類の哺乳動物細胞に結合してその中に侵入
する能力を有することによるものである。それゆえ、シ
ュードモナス外毒素Ａと特定の「ターゲティング剤」と
の間に形成された複合分子は、その「ターゲティング
剤」によって認識される細胞に加えて、多くの正常細胞
にも結合することができる。この問題に対処するための
一つの方法は、シュードモナス外毒素Ａを改変して、そ
れがもはや正常細胞には結合できないようにすることで
ある。これはシュードモナス外毒素Ａ分子の細胞結合能
力に係わる部分を除去することによって達成できる。シ
ュードモナス外毒素Ａ分子の先端を切り取った形のもの
が作られており、これは延長因子２を不活性化する能力
を保持しているが、もはや哺乳動物細胞に結合すること
はできない。この改変シュードモナス外毒素Ａ分子はシ
ュードモナス外毒素４０あるいはＰＥ40と呼ばれている
（Hwang 他、Cell４８：１２９−１３６ １９８７）。
細胞表面に結合し、次に細胞質内に侵入して、タンパク
質合成に必要な細胞タンパク質である延長因子（elonga
tionfactor）２を不活性化して細胞を中毒させる。シュ
ードモナス外毒素Ａは、モノクローナル抗体とタンパク
質ホルモンを用いて抗ガン複合分子を作るのに用いられ
ている。しかしながら、このような複合分子にまつわる
一つの問題は、それらが正常細胞に対して毒性を示すこ
とである。シュードモナス外毒素Ａを含む複合分子に係
る毒性の少なくとも一部は、シュードモナス外毒素Ａ自
体が多くの種類の哺乳動物細胞に結合してその中に侵入
する能力を有することによるものである。それゆえ、シ
ュードモナス外毒素Ａと特定の「ターゲティング剤」と
の間に形成された複合分子は、その「ターゲティング
剤」によって認識される細胞に加えて、多くの正常細胞
にも結合することができる。この問題に対処するための
一つの方法は、シュードモナス外毒素Ａを改変して、そ
れがもはや正常細胞には結合できないようにすることで
ある。これはシュードモナス外毒素Ａ分子の細胞結合能
力に係わる部分を除去することによって達成できる。シ
ュードモナス外毒素Ａ分子の先端を切り取った形のもの
が作られており、これは延長因子２を不活性化する能力
を保持しているが、もはや哺乳動物細胞に結合すること
はできない。この改変シュードモナス外毒素Ａ分子はシ
ュードモナス外毒素４０あるいはＰＥ40と呼ばれている
（Hwang 他、Cell４８：１２９−１３６ １９８７）。
【０００４】ＰＥ40はＴＧＦ−αを含むいくつかのター
ゲティング分子と結合されている（Chaudhary 他、ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ８４：４５３８−４５４２ １９８７）。
ＴＧＦ−αの場合、ＰＥ40領域とＴＧＦ−α領域とを含
む複合分子は、ＥＧＦ受容体を有する腫瘍細胞に特異的
に結合して、タンパク質合成を阻害することによりこれ
らの細胞を中毒させる。この複合分子が効率的にＥＧＦ
受容体に結合するためには、それが適当なコンホメーシ
ョンを有していなければならないと考えられる。効率的
な受容体との結合はまた、「ターゲティング領域」が適
当に露出していて結合にあやかれるようになっているか
どうかということにも依存する。ＴＧＦ−αとＰＥ40と
の複合分子を組換えＤＮＡ法を用いて細菌中において融
合タンパク質として産生する場合には、多くの複合分子
は弱いＥＧＦ受容体結合活性しか示さない。
ゲティング分子と結合されている（Chaudhary 他、ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ８４：４５３８−４５４２ １９８７）。
ＴＧＦ−αの場合、ＰＥ40領域とＴＧＦ−α領域とを含
む複合分子は、ＥＧＦ受容体を有する腫瘍細胞に特異的
に結合して、タンパク質合成を阻害することによりこれ
らの細胞を中毒させる。この複合分子が効率的にＥＧＦ
受容体に結合するためには、それが適当なコンホメーシ
ョンを有していなければならないと考えられる。効率的
な受容体との結合はまた、「ターゲティング領域」が適
当に露出していて結合にあやかれるようになっているか
どうかということにも依存する。ＴＧＦ−αとＰＥ40と
の複合分子を組換えＤＮＡ法を用いて細菌中において融
合タンパク質として産生する場合には、多くの複合分子
は弱いＥＧＦ受容体結合活性しか示さない。
【０００５】なお、本発明に関連する文献としては、以
下のものが挙げられる。 １． 米国特許第４，５４５，９８５号は、シュードモ
ナス外毒素Ａを抗体や表面成長因子に結合させることが
できることを教示する。同特許はまた、これらの結合体
を用いてヒト腫瘍細胞を殺すことができることも教示す
る。 ２． 米国特許第４，６６４，９１１号は、植物から得
られる毒素であるリシンのＡ鎖またはＢ鎖に抗体を結合
することができることを教示する。同特許はまた、これ
らの結合体を用いてヒト腫瘍細胞を殺すことができるこ
とも教示する。 ３． 米国特許第４，６７５，３８２号は、メラニン細
胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）のようなホルモンをペプチド
結合によりジフテリア毒素タンパク質の一部に結合する
ことができることを教示する。同特許はまた、これらの
タンパク質をコードする遺伝子を組換えＤＮＡ法を用い
てつなぎ合わせて複合融合タンパク質の合成を行わせる
ことができることも教示する。この融合タンパク質はＭ
ＳＨ受容体を有する細胞に結合する能力を有する。 ４． Murphy他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８３：８２５８−８
２６２ １９８６，Genetic construction, expressio
n, and melanoma-selective cytotoxicity of adiphthe
ria toxin-related alpha-melanocyte-stimulating hor
mone fusion protein（ ジフテリア毒素関連αメラニン
細胞刺激ホルモン融合タンパク質の遺伝子構成、発現、
および黒色腫選択的細胞毒性）。この文献は、組換えＤ
ＮＡ法を用いて細菌中で産生され、αメラニン細胞刺激
ホルモンと結合したジフテリア毒素タンパク質の一部か
らなる複合融合タンパク質が、ヒト黒色腫細胞に結合し
てこれを殺すことを教示する。
下のものが挙げられる。 １． 米国特許第４，５４５，９８５号は、シュードモ
ナス外毒素Ａを抗体や表面成長因子に結合させることが
できることを教示する。同特許はまた、これらの結合体
を用いてヒト腫瘍細胞を殺すことができることも教示す
る。 ２． 米国特許第４，６６４，９１１号は、植物から得
られる毒素であるリシンのＡ鎖またはＢ鎖に抗体を結合
することができることを教示する。同特許はまた、これ
らの結合体を用いてヒト腫瘍細胞を殺すことができるこ
とも教示する。 ３． 米国特許第４，６７５，３８２号は、メラニン細
胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）のようなホルモンをペプチド
結合によりジフテリア毒素タンパク質の一部に結合する
ことができることを教示する。同特許はまた、これらの
タンパク質をコードする遺伝子を組換えＤＮＡ法を用い
てつなぎ合わせて複合融合タンパク質の合成を行わせる
ことができることも教示する。この融合タンパク質はＭ
ＳＨ受容体を有する細胞に結合する能力を有する。 ４． Murphy他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８３：８２５８−８
２６２ １９８６，Genetic construction, expressio
n, and melanoma-selective cytotoxicity of adiphthe
ria toxin-related alpha-melanocyte-stimulating hor
mone fusion protein（ ジフテリア毒素関連αメラニン
細胞刺激ホルモン融合タンパク質の遺伝子構成、発現、
および黒色腫選択的細胞毒性）。この文献は、組換えＤ
ＮＡ法を用いて細菌中で産生され、αメラニン細胞刺激
ホルモンと結合したジフテリア毒素タンパク質の一部か
らなる複合融合タンパク質が、ヒト黒色腫細胞に結合し
てこれを殺すことを教示する。
【０００６】５． Kelley他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８５：
３９８０−３９８４ １９８８，Interleukin ２−diph
theria toxin fusion protein can abolish cell-media
tedimmunity in vivo（インターロイキン２−ジフテリ
ア毒素融合タンパク質は生体の細胞性免疫を破壊するこ
とができる）。この文献は、組換えＤＮＡ法を用いて細
菌中で生産され、インターロイキン２に結合したジフテ
リア毒素タンパク質の一部からなる複合融合タンパク質
が、ヌードマウス中において細胞性免疫を抑制する作用
を呈することを教示する。 ６． Allured 他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８３：１３２０−
１３２４ １９８６，Structure of exotoxin A of Pseu
domonas aeruginosa at ３．０ Angstrom（３．０オン
グストロームでのシュードモナス・エルギノーサの外毒
素Ａの構造）。この文献は、シュードモナス外毒素Ａタ
ンパク質の三次元構造を教示する。 ７． Hwang 他、Cell４８：１２９−１３６ １９８
７，Functional Domainsof Pseudomonas Exotoxin Iden
tified by Deletion Analysis of the Gene Expressed
in E. Coli（大腸菌中で発現した遺伝子の欠失分析によ
って同定されたシュードモナス外毒素の作用領域）。こ
の文献は、シュードモナス外毒素Ａタンパク質が３つの
異なる機能領域に分割することができ、それらはそれぞ
れ、哺乳動物細胞への結合、リソソーム膜を横切っての
上記毒素タンパク質の移動、および哺乳動物細胞内での
延長因子（ribosylating elongation factor）２のＡＤ
Ｐリボシル化に関与することを教示する。この文献はま
た、これらの機能領域がシュードモナス外毒素Ａタンパ
ク質の異なる領域に対応していることも教示する。
３９８０−３９８４ １９８８，Interleukin ２−diph
theria toxin fusion protein can abolish cell-media
tedimmunity in vivo（インターロイキン２−ジフテリ
ア毒素融合タンパク質は生体の細胞性免疫を破壊するこ
とができる）。この文献は、組換えＤＮＡ法を用いて細
菌中で生産され、インターロイキン２に結合したジフテ
リア毒素タンパク質の一部からなる複合融合タンパク質
が、ヌードマウス中において細胞性免疫を抑制する作用
を呈することを教示する。 ６． Allured 他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８３：１３２０−
１３２４ １９８６，Structure of exotoxin A of Pseu
domonas aeruginosa at ３．０ Angstrom（３．０オン
グストロームでのシュードモナス・エルギノーサの外毒
素Ａの構造）。この文献は、シュードモナス外毒素Ａタ
ンパク質の三次元構造を教示する。 ７． Hwang 他、Cell４８：１２９−１３６ １９８
７，Functional Domainsof Pseudomonas Exotoxin Iden
tified by Deletion Analysis of the Gene Expressed
in E. Coli（大腸菌中で発現した遺伝子の欠失分析によ
って同定されたシュードモナス外毒素の作用領域）。こ
の文献は、シュードモナス外毒素Ａタンパク質が３つの
異なる機能領域に分割することができ、それらはそれぞ
れ、哺乳動物細胞への結合、リソソーム膜を横切っての
上記毒素タンパク質の移動、および哺乳動物細胞内での
延長因子（ribosylating elongation factor）２のＡＤ
Ｐリボシル化に関与することを教示する。この文献はま
た、これらの機能領域がシュードモナス外毒素Ａタンパ
ク質の異なる領域に対応していることも教示する。
【０００７】８．１９８８年３月３０日に公開された欧
州特許出願第０ ２６１ ６７１号は、シュードモナス
外毒素Ａタンパク質の全体が有する細胞結合機能は欠い
ているがシュードモナス外毒素Ａタンパク質の全体が有
する前記移動機能およびＡＤＰリボシル化機能は有する
シュードモナス外毒素Ａの一部分を作ることができるこ
とを教示する。このシュードモナス外毒素Ａタンパク質
の全体が有する移動機能およびＡＤＰリボシル化機能を
保持しているシュードモナス外毒素Ａタンパク質の一部
分は、シュードモナス外毒素４０またはＰＥ−４０と呼
ばれる。ＰＥ−４０は、Gray他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８
１：２６４５−２６４９ １９８４において規定された
シュードモナス外毒素Ａタンパク質全体のアミノ酸残基
２５６−６１３を構成する。この特許出願はまた、組換
えＤＮＡ法を用いることにより、ＰＥ−４０をトランス
フォーム成長因子αに結合した細胞内で産生される複合
融合タンパク質を形成することができることも教示す
る。
州特許出願第０ ２６１ ６７１号は、シュードモナス
外毒素Ａタンパク質の全体が有する細胞結合機能は欠い
ているがシュードモナス外毒素Ａタンパク質の全体が有
する前記移動機能およびＡＤＰリボシル化機能は有する
シュードモナス外毒素Ａの一部分を作ることができるこ
とを教示する。このシュードモナス外毒素Ａタンパク質
の全体が有する移動機能およびＡＤＰリボシル化機能を
保持しているシュードモナス外毒素Ａタンパク質の一部
分は、シュードモナス外毒素４０またはＰＥ−４０と呼
ばれる。ＰＥ−４０は、Gray他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８
１：２６４５−２６４９ １９８４において規定された
シュードモナス外毒素Ａタンパク質全体のアミノ酸残基
２５６−６１３を構成する。この特許出願はまた、組換
えＤＮＡ法を用いることにより、ＰＥ−４０をトランス
フォーム成長因子αに結合した細胞内で産生される複合
融合タンパク質を形成することができることも教示す
る。
【０００８】９． Chandhary他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８
４：４５３８−４５４２ １９８７，Activity of a re
combinant fusion protein between transforming grow
th factor type alpha and Pseudomonas toxin（転換成
長因子α型とシュードモナス毒素との組換え融合タンパ
ク質の活性）。この文献は、ＰＥ−４０と転換成長因子
αとの間で形成され、組換えＤＮＡ法を用いて細菌中で
産生される複合融合タンパク質が、表皮性成長因子受容
体を有するヒト腫瘍細胞に結合してこれを殺すことを教
示する。 １０． Bailon, Biotechnology,１３２６−１３２９頁
１９８８年１１月，Purification and Partial Charact
erization of an Interleukin ２−Pseudomonas Exotox
in Fusion Protein（インターロイキン２−シュードモ
ナス外毒素融合タンパク質の精製および部分的特徴づ
け）。この文献は、ＰＥ−４０とインターロイキン２と
の間で形成され、組換えＤＮＡ法を用いて細菌中で産生
される複合融合タンパク質が、インターロイキン２受容
体を有するヒト細胞系に結合してこれを殺すことを教示
する。
４：４５３８−４５４２ １９８７，Activity of a re
combinant fusion protein between transforming grow
th factor type alpha and Pseudomonas toxin（転換成
長因子α型とシュードモナス毒素との組換え融合タンパ
ク質の活性）。この文献は、ＰＥ−４０と転換成長因子
αとの間で形成され、組換えＤＮＡ法を用いて細菌中で
産生される複合融合タンパク質が、表皮性成長因子受容
体を有するヒト腫瘍細胞に結合してこれを殺すことを教
示する。 １０． Bailon, Biotechnology,１３２６−１３２９頁
１９８８年１１月，Purification and Partial Charact
erization of an Interleukin ２−Pseudomonas Exotox
in Fusion Protein（インターロイキン２−シュードモ
ナス外毒素融合タンパク質の精製および部分的特徴づ
け）。この文献は、ＰＥ−４０とインターロイキン２と
の間で形成され、組換えＤＮＡ法を用いて細菌中で産生
される複合融合タンパク質が、インターロイキン２受容
体を有するヒト細胞系に結合してこれを殺すことを教示
する。
【０００９】標的剤（targeting agent）と改変ＰＥ40
分子との間に形成されたハイブリッド分子を標的剤を認
識する細胞受容体に効果的に結合させるＰＥ40の改変体
を提供することが本発明の１つの目的である。標的剤と
改変ＰＥ40との間で産生されたハイブリッドたん白を細
菌の融合たん白として回収する方法を提供することが本
発明のもう１つの目的である。本発明の別の目的は細胞
受容体結合ドメイン（すなわち、領域）及びＰＥ40ドメ
イン（すなわち、領域）を有するハイブリッド（すなわ
ち、融合）たん白を提供することである、ここにＰＥ40
ドメインは表皮成長因子受容体へのハイブリッドたん白
の結合、又は改変ＰＥ40と結合した標的剤が結合する受
容体へのハイブリッドたん白の結合を改良するために改
変されている。さらに別の目的は、ずっと容易に精製さ
れるハイブリッドたん白を提供することである。本発明
のこれらの及び他の目的は以下の記載から明らかになる
であろう。
分子との間に形成されたハイブリッド分子を標的剤を認
識する細胞受容体に効果的に結合させるＰＥ40の改変体
を提供することが本発明の１つの目的である。標的剤と
改変ＰＥ40との間で産生されたハイブリッドたん白を細
菌の融合たん白として回収する方法を提供することが本
発明のもう１つの目的である。本発明の別の目的は細胞
受容体結合ドメイン（すなわち、領域）及びＰＥ40ドメ
イン（すなわち、領域）を有するハイブリッド（すなわ
ち、融合）たん白を提供することである、ここにＰＥ40
ドメインは表皮成長因子受容体へのハイブリッドたん白
の結合、又は改変ＰＥ40と結合した標的剤が結合する受
容体へのハイブリッドたん白の結合を改良するために改
変されている。さらに別の目的は、ずっと容易に精製さ
れるハイブリッドたん白を提供することである。本発明
のこれらの及び他の目的は以下の記載から明らかになる
であろう。
【００１０】本発明はたん白標的ドメインに結合した改
変ＰＥ40ドメインを含むハイブリッド分子を提供する。
この改変ＰＥ40ドメインはこのハイブリッド分子の受容
体結合活性を改良する。ＰＥ40中のシステイン残基に替
えて他のアミノ酸、例えばアラニンの使用、又はシステ
イン残基の除去は、標的ドメインによって認識された受
容体へのハイブリッド分子の結合を改良する。本発明の
ハイブリッド分子は非改変ＰＥ40を有するハイブリッド
分子よりもずっと効果的に、ヒト腫瘍の標的とされる受
容体へ結合する。
変ＰＥ40ドメインを含むハイブリッド分子を提供する。
この改変ＰＥ40ドメインはこのハイブリッド分子の受容
体結合活性を改良する。ＰＥ40中のシステイン残基に替
えて他のアミノ酸、例えばアラニンの使用、又はシステ
イン残基の除去は、標的ドメインによって認識された受
容体へのハイブリッド分子の結合を改良する。本発明の
ハイブリッド分子は非改変ＰＥ40を有するハイブリッド
分子よりもずっと効果的に、ヒト腫瘍の標的とされる受
容体へ結合する。
【００１１】ＴＧＦ−αとＰＥ40との間で形成されたハ
イブリッド分子は三つの主なアッセイによって特徴付け
られる。これらのアッセイは次のものを含む。 １ 哺乳類細胞たん白合成を阻害するＴＧＦ−α−ＰＥ
40の酵素活性を評価する延長因子２のＡＤＰリボシル
化。 ２ ＴＧＦ−α−ＰＥ40のＥＧＦ受容体結合活性を評価
するＡ４３１からの膜ベシクルのＥＧＦ受容体に結合す
る放射能標識したＥＧＦの阻害。 ３ ＴＧＦ−α−ＰＥ40への暴露に続いて腫瘍の生存を
評価するために使用されるホルマサンへの３−［４，５
−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニ
ルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の変換によって評
価される細胞の増殖。
イブリッド分子は三つの主なアッセイによって特徴付け
られる。これらのアッセイは次のものを含む。 １ 哺乳類細胞たん白合成を阻害するＴＧＦ−α−ＰＥ
40の酵素活性を評価する延長因子２のＡＤＰリボシル
化。 ２ ＴＧＦ−α−ＰＥ40のＥＧＦ受容体結合活性を評価
するＡ４３１からの膜ベシクルのＥＧＦ受容体に結合す
る放射能標識したＥＧＦの阻害。 ３ ＴＧＦ−α−ＰＥ40への暴露に続いて腫瘍の生存を
評価するために使用されるホルマサンへの３−［４，５
−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニ
ルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の変換によって評
価される細胞の増殖。
【００１２】これらのアッセイは前記の通り行なわれる
（Dominic et al., Infection andImmunity１６：８３
２−８４１ １９７７，Cohen et al., J. Biol. Chem.
２５７：１５２３−１５３１ １９８２，Riemen et a
l., Peptides ８：８７７−８８５ １９８７，Mosmann
J. Immunol. Methods ６５：５５−６３ １９８
３）。
（Dominic et al., Infection andImmunity１６：８３
２−８４１ １９７７，Cohen et al., J. Biol. Chem.
２５７：１５２３−１５３１ １９８２，Riemen et a
l., Peptides ８：８７７−８８５ １９８７，Mosmann
J. Immunol. Methods ６５：５５−６３ １９８
３）。
【００１３】優れた受容体結合特性を有する新規なＴＧ
Ｆ−α−ＰＥ40ハイブリッド分子を造るために、我々は
まずＴＧＦ−α−ＰＥ40か又はＴＧＦ−α−ＰＥ40の特
異的改変体（specifically modified versions）かのい
ずれかをコードする一連の組換ＤＮＡ分子を製造した。
原又は親ＴＧＦ−α−ＰＥ40遺伝子は、実施例２に記載
されるクローン化ＤＮＡの別個のセグメントを使用して
細菌のＴＡＣ発現プラスミドベクター（ｐＴＡＣ ＴＧ
Ｆ５７−ＰＥ40）に分子的にクローン化された。このｐ
ＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡクローンを、ＴＧＦ
−α−ＰＥ40ＤＮＡの特異的な改変体を構造するための
出発試薬として使用した。ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ
40ＤＮＡの特異的改変は、ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ
40ＤＮＡのＰＥ40ドメイン内のシステインコドンの２又
は４を他のアミノ酸のためのコドンで置換するために必
要なＤＮＡコード配列中に部位特異的変異を含んでい
る。また、部位特異的変異をうまく処理して、ｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ40のＰＥ 40ドメイン内のシステイン
コドンの２又は４を除去することができる。ｐＴＡＣＴ
ＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡ中の部位特異的変異はWinter e
t al., Nature ２９９：７５６−７５８ １９８２の方
法を使用して構造される。変異させられたｐＴＡＣ Ｔ
ＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡの具体例が実施例３に示されて
いる。ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡによってコー
ドされるハイブリッドたん白のアミノ酸配列が第３図に
示されている。親ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッドたん
白のＰＥ40中の４つのシステイン残基は残基Ｃｙ
ｓ265，Ｃｙｓ287，Ｃｙｓ372，及びＣｙｓ379で表わさ
れる（第３図）。アミノ酸残基はGray et al., ＰＮＡ
Ｓ ＵＳＡ８１：２６４５−２６４９（１９８４）にお
いて定義されたように番号が付けられている。特異的に
変異させられたｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡか
らの改変ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッドたん白は、残
基［Ｃｙｓ265及びＣｙｓ2 87］又は［Ｃｙｓ372及びＣ
ｙｓ379］、又は［Ｃｙｓ265，Ｃｙｓ287，Ｃｙｓ37 2，
及びＣｙｓ379］の置換又は除去を含む。これらの変異
ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡから産生された改
変ハイブリッドたん白を記述するための命名を簡単にす
るために、我々は位置２６５及び２８７のアミノ酸残基
に「Ａ」座を指定しそして位置３７２及び３７９の残基
に「Ｂ」座を指定する。システインが親ＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40ハイブリッド分子におけるようにアミノ酸残基２６
５及び２８７に存在する場合、座は大文字（すなわち、
「Ａ」）で表わされる。システインが他アミノ酸、例え
ばアラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン又は
イソロイシンで置換されているか又は残基２６７および
２８７から除去されている場合、座は小文字「ａ」によ
って表わされる。同様に、位置３７２及び３７９のアミ
ノ酸残基がシステインである場合、座は大文字の「Ｂ」
によって表わされるが、一方、位置３７２及び３７９の
アミノ酸残基が他のアミノ酸で置換されているか又は除
去されている場合には小文字「ｂ」がこの座を表わす。
従って、ＴＧＦ−α−ＰＥ40のＰＥ40ドメインの４つの
システイン残基すべてがアラニンで置換されている場
合、改変ハイブリッドたん白はＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ
と表わされる。同様な方法において、アミノ酸残基の位
置２６５，２８７，３７２及び３７９にシステインを有
する親ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッドたん白をＴＧＦ
−α−ＰＥ40ＡＢと表わすことができる。
Ｆ−α−ＰＥ40ハイブリッド分子を造るために、我々は
まずＴＧＦ−α−ＰＥ40か又はＴＧＦ−α−ＰＥ40の特
異的改変体（specifically modified versions）かのい
ずれかをコードする一連の組換ＤＮＡ分子を製造した。
原又は親ＴＧＦ−α−ＰＥ40遺伝子は、実施例２に記載
されるクローン化ＤＮＡの別個のセグメントを使用して
細菌のＴＡＣ発現プラスミドベクター（ｐＴＡＣ ＴＧ
Ｆ５７−ＰＥ40）に分子的にクローン化された。このｐ
ＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡクローンを、ＴＧＦ
−α−ＰＥ40ＤＮＡの特異的な改変体を構造するための
出発試薬として使用した。ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ
40ＤＮＡの特異的改変は、ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ
40ＤＮＡのＰＥ40ドメイン内のシステインコドンの２又
は４を他のアミノ酸のためのコドンで置換するために必
要なＤＮＡコード配列中に部位特異的変異を含んでい
る。また、部位特異的変異をうまく処理して、ｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ40のＰＥ 40ドメイン内のシステイン
コドンの２又は４を除去することができる。ｐＴＡＣＴ
ＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡ中の部位特異的変異はWinter e
t al., Nature ２９９：７５６−７５８ １９８２の方
法を使用して構造される。変異させられたｐＴＡＣ Ｔ
ＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡの具体例が実施例３に示されて
いる。ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡによってコー
ドされるハイブリッドたん白のアミノ酸配列が第３図に
示されている。親ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッドたん
白のＰＥ40中の４つのシステイン残基は残基Ｃｙ
ｓ265，Ｃｙｓ287，Ｃｙｓ372，及びＣｙｓ379で表わさ
れる（第３図）。アミノ酸残基はGray et al., ＰＮＡ
Ｓ ＵＳＡ８１：２６４５−２６４９（１９８４）にお
いて定義されたように番号が付けられている。特異的に
変異させられたｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡか
らの改変ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッドたん白は、残
基［Ｃｙｓ265及びＣｙｓ2 87］又は［Ｃｙｓ372及びＣ
ｙｓ379］、又は［Ｃｙｓ265，Ｃｙｓ287，Ｃｙｓ37 2，
及びＣｙｓ379］の置換又は除去を含む。これらの変異
ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ40ＤＮＡから産生された改
変ハイブリッドたん白を記述するための命名を簡単にす
るために、我々は位置２６５及び２８７のアミノ酸残基
に「Ａ」座を指定しそして位置３７２及び３７９の残基
に「Ｂ」座を指定する。システインが親ＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40ハイブリッド分子におけるようにアミノ酸残基２６
５及び２８７に存在する場合、座は大文字（すなわち、
「Ａ」）で表わされる。システインが他アミノ酸、例え
ばアラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン又は
イソロイシンで置換されているか又は残基２６７および
２８７から除去されている場合、座は小文字「ａ」によ
って表わされる。同様に、位置３７２及び３７９のアミ
ノ酸残基がシステインである場合、座は大文字の「Ｂ」
によって表わされるが、一方、位置３７２及び３７９の
アミノ酸残基が他のアミノ酸で置換されているか又は除
去されている場合には小文字「ｂ」がこの座を表わす。
従って、ＴＧＦ−α−ＰＥ40のＰＥ40ドメインの４つの
システイン残基すべてがアラニンで置換されている場
合、改変ハイブリッドたん白はＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ
と表わされる。同様な方法において、アミノ酸残基の位
置２６５，２８７，３７２及び３７９にシステインを有
する親ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッドたん白をＴＧＦ
−α−ＰＥ40ＡＢと表わすことができる。
【００１４】ＴＧＦ−α−ＰＥ40ＡＢハイブリッドたん
白及び改変ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッドたん白は、
Linemeyer et al., Bio−Technology ５：９６０−９６
５１９８７によって記載されたＴＡＣ発現ベクター系を
使用してE. Coli において産生される。これらの細菌に
おいて産生された組換ハイブリッドたん白は収集され、
そしてグアニジンヒドロクロリド中で細菌を溶解させた
後、亜硫酸ナトリウム及び四チオン酸ナトリウムを添加
することによって精製される。次に、この反応混合物を
透析して尿素を加えて溶液から沈澱したたん白を可溶化
する。次に、この混合物を遠心して不溶性たん白を除去
し、そしてイオン交換クロマトグラフィー、次にサイズ
除外クロマトグラフィー、次に再びイオン交換クロマト
グラフィーを使用して組換ハイブリッドＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40たん白を分離する。精製されたＴＧＦ−α−ＰＥ40
雑種たん白を次に、ハイブリッドたん白内に対のシステ
イン残基の間でジスルフィド結合を形成させるために還
元剤、例えばβ−メルカプトエタノールに暴露する。最
後に、折りたたんだ状態に戻された雑種たん白をサイズ
除外及びイオン交換クロマトグラフィーにかけて高純度
のＴＧＦ−α−ＰＥ40たん白を単離する。この精製の概
要の詳細は実施例２に記載されている。ひとたび精製さ
れ、折りたたんだ状態に戻されたこれら雑種たん白の生
物学的活性は、前記ＡＤＰリボシル化、ＥＧＦ受容体結
合、及び細胞増殖アッセイを使用して特徴づけることが
できる。
白及び改変ＴＧＦ−α−ＰＥ40ハイブリッドたん白は、
Linemeyer et al., Bio−Technology ５：９６０−９６
５１９８７によって記載されたＴＡＣ発現ベクター系を
使用してE. Coli において産生される。これらの細菌に
おいて産生された組換ハイブリッドたん白は収集され、
そしてグアニジンヒドロクロリド中で細菌を溶解させた
後、亜硫酸ナトリウム及び四チオン酸ナトリウムを添加
することによって精製される。次に、この反応混合物を
透析して尿素を加えて溶液から沈澱したたん白を可溶化
する。次に、この混合物を遠心して不溶性たん白を除去
し、そしてイオン交換クロマトグラフィー、次にサイズ
除外クロマトグラフィー、次に再びイオン交換クロマト
グラフィーを使用して組換ハイブリッドＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40たん白を分離する。精製されたＴＧＦ−α−ＰＥ40
雑種たん白を次に、ハイブリッドたん白内に対のシステ
イン残基の間でジスルフィド結合を形成させるために還
元剤、例えばβ−メルカプトエタノールに暴露する。最
後に、折りたたんだ状態に戻された雑種たん白をサイズ
除外及びイオン交換クロマトグラフィーにかけて高純度
のＴＧＦ−α−ＰＥ40たん白を単離する。この精製の概
要の詳細は実施例２に記載されている。ひとたび精製さ
れ、折りたたんだ状態に戻されたこれら雑種たん白の生
物学的活性は、前記ＡＤＰリボシル化、ＥＧＦ受容体結
合、及び細胞増殖アッセイを使用して特徴づけることが
できる。
【００１５】ＴＧＦ−α−ＰＥ40の重要な実用性はＥＧ
Ｆ受容体を所有する細胞に結合しそして細胞を殺すその
能力にある。多くのヒト腫瘍細胞はＥＧＦ受容体をもっ
ており、従って、ＴＧＦ−α−ＰＥ40の細胞を殺す効力
に対して感受性が強い。ケラチン生成細胞を含む他の癌
にかかっていないヒトの細胞はＥＧＦ受容体をもってい
て、やはり、ＴＧＦ−α−ＰＥ40の細胞を殺す活性に対
して感受性が強い。いくつかのヒトの病気は、乾癬及び
疣贅を含むケラチン生成細胞の増加した増殖によって特
徴づけられる。
Ｆ受容体を所有する細胞に結合しそして細胞を殺すその
能力にある。多くのヒト腫瘍細胞はＥＧＦ受容体をもっ
ており、従って、ＴＧＦ−α−ＰＥ40の細胞を殺す効力
に対して感受性が強い。ケラチン生成細胞を含む他の癌
にかかっていないヒトの細胞はＥＧＦ受容体をもってい
て、やはり、ＴＧＦ−α−ＰＥ40の細胞を殺す活性に対
して感受性が強い。いくつかのヒトの病気は、乾癬及び
疣贅を含むケラチン生成細胞の増加した増殖によって特
徴づけられる。
【００１６】以下の実施例は本発明を説明するためのも
のであり、本発明はそれに限定されない。分子生物学上
の取り扱いのために必要な酸素反応のすべては、特に断
わりのない限り、Maniatis et al.,（１９８２）In: Mo
lecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Press に記載されている通りに行なわれた。
のであり、本発明はそれに限定されない。分子生物学上
の取り扱いのために必要な酸素反応のすべては、特に断
わりのない限り、Maniatis et al.,（１９８２）In: Mo
lecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Press に記載されている通りに行なわれた。
【００１７】
【実施例】実施例１ 組換えＴＧＦ−アルファーＰＥ40融合蛋白質の製造と単
離 ：融合蛋白質の製造 形質転換されたE. Coli ＪＭ−１０９細胞を１００μｇ
／ｍｌのアンピシリンの存在下５００ｍｌＬＢ−ブロス
（ＬＢ−Broth）入りの１リットル振とうフラスコ中で
培養した。Ａ６００分光光度吸収値０．６に達した後
で、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド
を最終濃度１ｍＭになるまで加えた。２時間後、細胞を
遠心分離して回収した。融合蛋白質のＳ−スルフォネート化 細胞を８Ｍグアニジン塩酸塩、ｐＨ８．０の５０ｍＭト
リス緩衝液、１ｍＭＥＤＴＡ中に室温で、２時間で溶解
した。溶解混合液に固体試薬を加えて、０．４Ｍ亜硫酸
ナトリウム及び０．１Ｍ四チオン酸ナトリウムとし、そ
して１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ９．０に調節した。室温で１
６時間反応させた。クロマトグラフィー用の準備 蛋白質液を１０，０００倍過剰容量の１ｍＭ ＥＤＴＡ
で４℃で透析した。混合液を室温で６Ｍ尿素、５０ｍＭ
ｐＨ８．０トリス緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌとし、
２時間攪拌した。不溶解分は３２，０００ｘｇ、３０分
の遠心分離により除去した。
離 ：融合蛋白質の製造 形質転換されたE. Coli ＪＭ−１０９細胞を１００μｇ
／ｍｌのアンピシリンの存在下５００ｍｌＬＢ−ブロス
（ＬＢ−Broth）入りの１リットル振とうフラスコ中で
培養した。Ａ６００分光光度吸収値０．６に達した後
で、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド
を最終濃度１ｍＭになるまで加えた。２時間後、細胞を
遠心分離して回収した。融合蛋白質のＳ−スルフォネート化 細胞を８Ｍグアニジン塩酸塩、ｐＨ８．０の５０ｍＭト
リス緩衝液、１ｍＭＥＤＴＡ中に室温で、２時間で溶解
した。溶解混合液に固体試薬を加えて、０．４Ｍ亜硫酸
ナトリウム及び０．１Ｍ四チオン酸ナトリウムとし、そ
して１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ９．０に調節した。室温で１
６時間反応させた。クロマトグラフィー用の準備 蛋白質液を１０，０００倍過剰容量の１ｍＭ ＥＤＴＡ
で４℃で透析した。混合液を室温で６Ｍ尿素、５０ｍＭ
ｐＨ８．０トリス緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌとし、
２時間攪拌した。不溶解分は３２，０００ｘｇ、３０分
の遠心分離により除去した。
【００１８】ＤＥＡＥ Ｆ．Ｆ．セファロースクロマト
グラフィー 前工程の透明上澄み液を６Ｍ尿素、５０ｍＭ ｐＨ８．
０トリス緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡させた２６
×４０ｃｍ ＤＥＡＥ Fast Flow Column（Pharmacia
LKB Biotechnology Inc 製）に流速１ｍｌ／分でかけ
た。カラムを平衡緩衝液ですべての不吸着物がなくなる
まで洗浄した。これはカラムを出た平衡緩衝液のＵＶ２
８０吸光度が０．１以下になったことで証明された。吸
着された融合蛋白質は１０００ｍｌの５０〜３５０ｍＭ
ＮａＣｌで勾配溶離され、ＹＭ−３０膜を付けた攪拌
セルアミコン（Amicon）濃縮器で濃縮された。
グラフィー 前工程の透明上澄み液を６Ｍ尿素、５０ｍＭ ｐＨ８．
０トリス緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡させた２６
×４０ｃｍ ＤＥＡＥ Fast Flow Column（Pharmacia
LKB Biotechnology Inc 製）に流速１ｍｌ／分でかけ
た。カラムを平衡緩衝液ですべての不吸着物がなくなる
まで洗浄した。これはカラムを出た平衡緩衝液のＵＶ２
８０吸光度が０．１以下になったことで証明された。吸
着された融合蛋白質は１０００ｍｌの５０〜３５０ｍＭ
ＮａＣｌで勾配溶離され、ＹＭ−３０膜を付けた攪拌
セルアミコン（Amicon）濃縮器で濃縮された。
【００１９】セファクリルＳ−３００ 濃縮融合蛋白質（８ｍｌ）を６Ｍ尿素、５０ｍＭ ｐＨ
８．０トリス緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡させた
２．６×１００ｃｍセファクリル（Sephacryl）Ｓ−３
００Column（Pharmacia LKB Biotechnology Inc 製)に
流速０．２５ｍｌ／分でかけた。カラムを平衡緩衝液で
溶離し、３ｍｌのフラクションを得た。ＴＧＦ−アルフ
ァーＰＥ40活性を持つフラクションがまとめられた。Ｑ−セファロースクロマトグラフィー Ｓ−３００カラムからのまとめられたフラクションを６
Ｍ尿素、５０ｍＭ ｐＨ８．０トリス緩衝液、５０ｍＭ
ＮａＣｌで平衡させた１．６×４０ｃｍ Ｑ−Sephar
ose Column（Pharmacia LKB Biotechnology Inc 製）
に流速０．７ｍｌ／分でかけた。カラムを平衡緩衝液で
洗浄し、６００ｍｌの５０〜４５０ｍＭＮａＣｌで勾配
溶離した。ＴＧＦ−アルファーＰＥ40活性を持つフラク
ションがまとめられ、ｐＨ９．０の５０ｍＭグリシンで
透析し、零下２０℃で貯蔵した。
８．０トリス緩衝液、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡させた
２．６×１００ｃｍセファクリル（Sephacryl）Ｓ−３
００Column（Pharmacia LKB Biotechnology Inc 製)に
流速０．２５ｍｌ／分でかけた。カラムを平衡緩衝液で
溶離し、３ｍｌのフラクションを得た。ＴＧＦ−アルフ
ァーＰＥ40活性を持つフラクションがまとめられた。Ｑ−セファロースクロマトグラフィー Ｓ−３００カラムからのまとめられたフラクションを６
Ｍ尿素、５０ｍＭ ｐＨ８．０トリス緩衝液、５０ｍＭ
ＮａＣｌで平衡させた１．６×４０ｃｍ Ｑ−Sephar
ose Column（Pharmacia LKB Biotechnology Inc 製）
に流速０．７ｍｌ／分でかけた。カラムを平衡緩衝液で
洗浄し、６００ｍｌの５０〜４５０ｍＭＮａＣｌで勾配
溶離した。ＴＧＦ−アルファーＰＥ40活性を持つフラク
ションがまとめられ、ｐＨ９．０の５０ｍＭグリシンで
透析し、零下２０℃で貯蔵した。
【００２０】再生（Refolding） 蛋白質サンプルを解凍し、ｐＨ１０．５の５０ｍＭグリ
シン中でＵＶ Ａ２８０での分光光度吸収値が０．１に
なるまで希釈した。ベータ−メルカプトエタノールを蛋
白質試料中のＳ−スルフォネート基の理論値の４：１モ
ル比以上になるまで加えた。４℃で１６時間反応し、１
０，０００倍過剰容量の生理緩衝食塩水で透析し、零下
２０℃で貯蔵した。
シン中でＵＶ Ａ２８０での分光光度吸収値が０．１に
なるまで希釈した。ベータ−メルカプトエタノールを蛋
白質試料中のＳ−スルフォネート基の理論値の４：１モ
ル比以上になるまで加えた。４℃で１６時間反応し、１
０，０００倍過剰容量の生理緩衝食塩水で透析し、零下
２０℃で貯蔵した。
【００２１】実施例２ ＴＧＦ−アルファーＰＥ40ＤＮＡを含む組換えクローン
の構築 ：ＴＧＦ−アルファーＤＮＡセグメントをDefeo-
Jones他のMolecular and Cellular Biology ８：２９９
９−３００７．１９８８記載の三組の合成オリゴヌクレ
オチドを使用して構築した。この合成ＴＧＦ−アルファ
ー遺伝子をｐＵＣ−１９にクローン化した。組換えヒト
ＴＧＦ−アルファーを含むｐＵＣ−１９クローンからの
ＤＮＡをＳｐｈ Ｉ及びＥｃｏ ＲＩで消化した。この
消化はｐＵＣ−１９とＴＧＦ−アルファーの５’部分の
全てを含む２．８ｋｂ ＤＮＡフラグメントを産生し
た。２．８ｋｂフラグメントを精製し、ゲル電気泳動法
で分離した。Ｅｃｏ ＲＩ乃至Ｓｐｈ Ｉオリゴヌクレ
オチド・カセットを合成した。この合成カセットは以下
に示す配列を有した。
の構築 ：ＴＧＦ−アルファーＤＮＡセグメントをDefeo-
Jones他のMolecular and Cellular Biology ８：２９９
９−３００７．１９８８記載の三組の合成オリゴヌクレ
オチドを使用して構築した。この合成ＴＧＦ−アルファ
ー遺伝子をｐＵＣ−１９にクローン化した。組換えヒト
ＴＧＦ−アルファーを含むｐＵＣ−１９クローンからの
ＤＮＡをＳｐｈ Ｉ及びＥｃｏ ＲＩで消化した。この
消化はｐＵＣ−１９とＴＧＦ−アルファーの５’部分の
全てを含む２．８ｋｂ ＤＮＡフラグメントを産生し
た。２．８ｋｂフラグメントを精製し、ゲル電気泳動法
で分離した。Ｅｃｏ ＲＩ乃至Ｓｐｈ Ｉオリゴヌクレ
オチド・カセットを合成した。この合成カセットは以下
に示す配列を有した。
【化１】
【００２２】便宜上、このオリゴヌクレオチド・カセッ
トを５７と名付けた。カセット５７をアニールし、ＴＧ
Ｆ−アルファーを含む２．８ｋｂフラグメントに連結し
て環化プラスミドを形成した。カセットを含んだクロー
ンを放射性同位元素でラベルされたカセット５７ＤＮＡ
とハイブリダイズさせて同定した。ヒトＴＧＦ−アルフ
ァーの存在はＤＮＡ配列決定をすることで確認された。
配列決定は又ＴＧＦ−アルファー配列の３’末端に新し
く導入されたＦｓｐ Ｉ部位の存在も確認した。ＴＧＦ
−アルファー５７／ｐＵＣ−１９と名付けられたこのプ
ラスミドをＦｓｐ Ｉ及びＨｉｎＤ IIIによって消化し
ＴＧＦ−アルファー遺伝子（ＴＧＦ−アルファー５７）
を含む１６８ｂｐフラグメントを産生した。ｐＵＣ−１
９の別の標品をＥｃｏ ＲＩ及びＨｉｎＤ IIIによって
消化し２．６８ｋｂ ｐＵＣ−１９ベクターＤＮＡを産
生した。ＰＥ40ＤＮＡをプラスミドｐＶＣ８（Chaudhar
y他ＰＮＡＳ ＵＳＡ８４：４５３８−４５４２．１９
８７）から分離した。ｐＶＣ８をＮｄｅ Ｉを使用して
消化した。それから平滑末端をこのＤＮＡ上にKlenow反
応（Maniatis他、同上ｐ．１１３）の標準条件を使用し
て作った。平滑末端ＤＮＡを次いでＥｃｏ ＲＩによる
２回目の消化に掛け、ＰＥ40を含む１．３ｋｂ Ｅｃｏ
ＲＩ−Ｎｄｅ Ｉ（平滑末端）とした。ＴＧＦ−アル
ファー５７ＨｉｎＤ III−Ｆｓｐ Ｉフラグメント（１
６８ｂｐ）を２．６８ｋｂ ｐＵＣ−１９ベクターに連
結した。一夜インキュベートした後、１．３ｋｂ Ｅｃ
ｏ ＲＩ−Ｎｄｅ Ｉ（平滑末端）ＰＥ40ＤＮＡフラグ
メントを連結混合物に加えた。この第２連結反応は一夜
行なわれた。
トを５７と名付けた。カセット５７をアニールし、ＴＧ
Ｆ−アルファーを含む２．８ｋｂフラグメントに連結し
て環化プラスミドを形成した。カセットを含んだクロー
ンを放射性同位元素でラベルされたカセット５７ＤＮＡ
とハイブリダイズさせて同定した。ヒトＴＧＦ−アルフ
ァーの存在はＤＮＡ配列決定をすることで確認された。
配列決定は又ＴＧＦ−アルファー配列の３’末端に新し
く導入されたＦｓｐ Ｉ部位の存在も確認した。ＴＧＦ
−アルファー５７／ｐＵＣ−１９と名付けられたこのプ
ラスミドをＦｓｐ Ｉ及びＨｉｎＤ IIIによって消化し
ＴＧＦ−アルファー遺伝子（ＴＧＦ−アルファー５７）
を含む１６８ｂｐフラグメントを産生した。ｐＵＣ−１
９の別の標品をＥｃｏ ＲＩ及びＨｉｎＤ IIIによって
消化し２．６８ｋｂ ｐＵＣ−１９ベクターＤＮＡを産
生した。ＰＥ40ＤＮＡをプラスミドｐＶＣ８（Chaudhar
y他ＰＮＡＳ ＵＳＡ８４：４５３８−４５４２．１９
８７）から分離した。ｐＶＣ８をＮｄｅ Ｉを使用して
消化した。それから平滑末端をこのＤＮＡ上にKlenow反
応（Maniatis他、同上ｐ．１１３）の標準条件を使用し
て作った。平滑末端ＤＮＡを次いでＥｃｏ ＲＩによる
２回目の消化に掛け、ＰＥ40を含む１．３ｋｂ Ｅｃｏ
ＲＩ−Ｎｄｅ Ｉ（平滑末端）とした。ＴＧＦ−アル
ファー５７ＨｉｎＤ III−Ｆｓｐ Ｉフラグメント（１
６８ｂｐ）を２．６８ｋｂ ｐＵＣ−１９ベクターに連
結した。一夜インキュベートした後、１．３ｋｂ Ｅｃ
ｏ ＲＩ−Ｎｄｅ Ｉ（平滑末端）ＰＥ40ＤＮＡフラグ
メントを連結混合物に加えた。この第２連結反応は一夜
行なわれた。
【００２３】連結反応生成物をＪＭ１０９細胞を形質転
換するために使用した。ｐＵＣ−１９中にＴＧＦ−アル
ファー５７ＰＥ40を含むクローンを放射性同位元素でラ
ベルされたＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ40ＤＮＡとハイ
ブリダイズさせて同定し、このクローンからのＤＮＡを
分離した。ＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ40をｐＵＣ−１
９ベクターから切り出し、Linemeyer他（Bio-Technolog
y ５：９６０−９６５．１９８７）に記載のＴＡＣベク
ター系に移した。ｐＵＣ−１９中のＴＧＦ−アルファー
５７ＰＥ40をＨｉｎＤ III及びＥｃｏ ＲＩによって消
化し、ＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ40を含む１．５ｋｂ
フラグメントを産生した。このＤＮＡフラグメント上に
Klenow反応（Maniatis他、同上）の標準条件を使用して
平滑末端を作った。ＴＡＣベクターをＨｉｎＤ III及び
Ｅｃｏ ＲＩで消化した。平滑末端をKlenow反応（Mani
atis他、同上）の標準条件を使用して消化したＴＡＣベ
クターＤＮＡ上に作った。２．７ｋｂ平滑末端を持つベ
クターをゲル電気泳動法で分離した。平滑末端を持つＴ
ＧＦ−アルファー５７ＰＥ40フラグメントを次で平滑末
端ＴＡＣベクターに連結した。この連結で得たプラスミ
ドをＪＭ１０９細胞を形質転換するために使用した。Ｔ
ＧＦ−アルファー５７ＰＥ40を含む候補クローンを上記
ハイブリダイゼーションで同定し配列決定した。所期の
構成を持つクローンをｐＴＡＣ ＴＧＦ−５７−ＰＥ４
０と命名した。これらの操作で得られたプラスミドを図
面に掲げる。ｐＴＡＣ ＴＧＦ−５７−ＰＥ４０中にコ
ード化された、ＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ40のアミノ
酸コドンのヌクレオチド配列を第２表に掲げる。ＴＧＦ
−５７−ＰＥ４０遺伝子によってコード化されたアミノ
酸配列を第３表に示す。
換するために使用した。ｐＵＣ−１９中にＴＧＦ−アル
ファー５７ＰＥ40を含むクローンを放射性同位元素でラ
ベルされたＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ40ＤＮＡとハイ
ブリダイズさせて同定し、このクローンからのＤＮＡを
分離した。ＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ40をｐＵＣ−１
９ベクターから切り出し、Linemeyer他（Bio-Technolog
y ５：９６０−９６５．１９８７）に記載のＴＡＣベク
ター系に移した。ｐＵＣ−１９中のＴＧＦ−アルファー
５７ＰＥ40をＨｉｎＤ III及びＥｃｏ ＲＩによって消
化し、ＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ40を含む１．５ｋｂ
フラグメントを産生した。このＤＮＡフラグメント上に
Klenow反応（Maniatis他、同上）の標準条件を使用して
平滑末端を作った。ＴＡＣベクターをＨｉｎＤ III及び
Ｅｃｏ ＲＩで消化した。平滑末端をKlenow反応（Mani
atis他、同上）の標準条件を使用して消化したＴＡＣベ
クターＤＮＡ上に作った。２．７ｋｂ平滑末端を持つベ
クターをゲル電気泳動法で分離した。平滑末端を持つＴ
ＧＦ−アルファー５７ＰＥ40フラグメントを次で平滑末
端ＴＡＣベクターに連結した。この連結で得たプラスミ
ドをＪＭ１０９細胞を形質転換するために使用した。Ｔ
ＧＦ−アルファー５７ＰＥ40を含む候補クローンを上記
ハイブリダイゼーションで同定し配列決定した。所期の
構成を持つクローンをｐＴＡＣ ＴＧＦ−５７−ＰＥ４
０と命名した。これらの操作で得られたプラスミドを図
面に掲げる。ｐＴＡＣ ＴＧＦ−５７−ＰＥ４０中にコ
ード化された、ＴＧＦ−アルファー５７ＰＥ40のアミノ
酸コドンのヌクレオチド配列を第２表に掲げる。ＴＧＦ
−５７−ＰＥ４０遺伝子によってコード化されたアミノ
酸配列を第３表に示す。
【００２４】実施例３ ＴＧＦ−α−ＰＥ40を有する組換えＤＮＡクローンの修
飾変換体の構築 ：システインに対してのアラニン置換 ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ クローンｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０はＳｐｈＩお
よびＢａｍＨＩで消化され、そして７５０ｂｐ Ｓｐｈ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（ＴＧＦ−αのＣ末端５アミノ酸と
ＰＥ40のＮ末端２４３アミノ酸を特定する）は単離され
た。Ｍ１３ｍｐ１９ベクターＤＮＡはＳｐｈＩおよびＢ
ａｍＨＩにより切断され、ベクターＤＮＡは単離され
た。７５０ｂｐ ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ ＴＧＦ−α−
ＰＥ40断片は１５℃で一晩中Ｍ１３ベクターに継ぎ合わ
された。バクテリア宿主細胞はこの継ぎ合せ混合物によ
って形質転換され、候補クローンが単離され、そしてそ
れからのプラスミドＤＮＡはこれらクローンが適切な組
換えＤＮＡｓを含むことを確実にするため配列決定され
た。１本鎖ＤＮＡが突然変異生成のため調製された。
飾変換体の構築 ：システインに対してのアラニン置換 ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ クローンｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０はＳｐｈＩお
よびＢａｍＨＩで消化され、そして７５０ｂｐ Ｓｐｈ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（ＴＧＦ−αのＣ末端５アミノ酸と
ＰＥ40のＮ末端２４３アミノ酸を特定する）は単離され
た。Ｍ１３ｍｐ１９ベクターＤＮＡはＳｐｈＩおよびＢ
ａｍＨＩにより切断され、ベクターＤＮＡは単離され
た。７５０ｂｐ ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ ＴＧＦ−α−
ＰＥ40断片は１５℃で一晩中Ｍ１３ベクターに継ぎ合わ
された。バクテリア宿主細胞はこの継ぎ合せ混合物によ
って形質転換され、候補クローンが単離され、そしてそ
れからのプラスミドＤＮＡはこれらクローンが適切な組
換えＤＮＡｓを含むことを確実にするため配列決定され
た。１本鎖ＤＮＡが突然変異生成のため調製された。
【００２５】オリゴヌクレオチド（オリゴ＃１３２）が
合成され、突然変異生成を指示する部位で使用され、そ
してＨｐａＩ部位をＰＥ40のアミノ酸位置２７２でＴＧ
Ｆ−α−ＰＥ40ＤＮＡに導入した：
合成され、突然変異生成を指示する部位で使用され、そ
してＨｐａＩ部位をＰＥ40のアミノ酸位置２７２でＴＧ
Ｆ−α−ＰＥ40ＤＮＡに導入した：
【化２】 この部位特異的突然変異は、結果としてＰＥ40中の２７
２番目の残基をフェニルアラニンからシステインへ変換
した。この突然変異誘発はウインター（Winter）らのNa
ture，第２９９巻：第７５６−７５８頁１９８２年で記
載されるように行なわれた。
２番目の残基をフェニルアラニンからシステインへ変換
した。この突然変異誘発はウインター（Winter）らのNa
ture，第２９９巻：第７５６−７５８頁１９８２年で記
載されるように行なわれた。
【００２６】新しく形成されたＨｐａＩ部位を有する候
補クローンが単離、配列決定され、突然変異した遺伝子
配列が存在することが明かにされた。次にこのクローン
はＳｐｈＩとＳａｌＩにより切断される。ＴＧＦ−αの
Ｃ末端５アミノ酸およびＰＥ 40のＮ末端７０アミノ酸を
規定し、そして新しく導入されたＨｐａＩ部位を有する
２１０ｂｐ断片が単離され、もとのｐＴＡＣ ＴＧＦ５
７−ＰＥ４０プラスミドにＳｐｈＩ−ＳａｌＩ部位でサ
ブクローン化された。バクテリア宿主細胞が形質転換さ
れ、候補クローンが単離され、そのプラスミドＤＮＡが
配列決定され、このクローンが適切な組換えＤＮＡを有
することが確証された。便宜上、このクローンをｐＴＡ
Ｃ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２と名付けた。ｐＴＡ
Ｃ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２はＳｐｈＩとＨｐａ
Ｉにより消化され、３．９６ｋｂＤＮＡ断片が単離され
た。ＴＧＦ−αのＣ末端５アミノ酸およびＰＥ40のＮ末
端３２アミノ酸をカバーし、ＳｐｈＩとＨｐａＩ用の末
端を有する合成オリゴヌクレオチドカセット（オリゴ＃
１５３）が合成され、消化されたｐＴＡＣ ＴＧＦ５７
−ＰＥ４０−１３２に継ぎ合わされた：
補クローンが単離、配列決定され、突然変異した遺伝子
配列が存在することが明かにされた。次にこのクローン
はＳｐｈＩとＳａｌＩにより切断される。ＴＧＦ−αの
Ｃ末端５アミノ酸およびＰＥ 40のＮ末端７０アミノ酸を
規定し、そして新しく導入されたＨｐａＩ部位を有する
２１０ｂｐ断片が単離され、もとのｐＴＡＣ ＴＧＦ５
７−ＰＥ４０プラスミドにＳｐｈＩ−ＳａｌＩ部位でサ
ブクローン化された。バクテリア宿主細胞が形質転換さ
れ、候補クローンが単離され、そのプラスミドＤＮＡが
配列決定され、このクローンが適切な組換えＤＮＡを有
することが確証された。便宜上、このクローンをｐＴＡ
Ｃ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２と名付けた。ｐＴＡ
Ｃ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２はＳｐｈＩとＨｐａ
Ｉにより消化され、３．９６ｋｂＤＮＡ断片が単離され
た。ＴＧＦ−αのＣ末端５アミノ酸およびＰＥ40のＮ末
端３２アミノ酸をカバーし、ＳｐｈＩとＨｐａＩ用の末
端を有する合成オリゴヌクレオチドカセット（オリゴ＃
１５３）が合成され、消化されたｐＴＡＣ ＴＧＦ５７
−ＰＥ４０−１３２に継ぎ合わされた：
【化３】
【００２７】このヌクレオチドカセットはＴＧＦ−α−
ＰＥ40ＤＮＡ中の変化を組込んでおり、残基２６５でシ
ステインを特定していたコドンは今度はアラニンを特定
する。
ＰＥ40ＤＮＡ中の変化を組込んでおり、残基２６５でシ
ステインを特定していたコドンは今度はアラニンを特定
する。
【００２８】便宜上、このプラスミドＤＮＡはｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２，１５３と名付けた。
バクテリア宿主細胞がｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０
−１３２，１５３ＤＮＡにより形質転換された。候補ク
ローンはハイブリッド形成により確認され、単離され、
それらのプラスミドＤＮＡが配列決定され、適切な組換
えＤＮＡを有することが確証された。ｐＴＡＣ ＴＧＦ
５７−ＰＥ４０−１３２，１５３ＤＮＡはＨｐａＩとＳ
ａｌＩにより消化され、３．９５ｋｂベクターＤＮＡが
単離された。ＰＥ40のアミノ酸残基２７２から３０９を
カバーし、ＨｐａＩとＳａｌＩ用の末端を有する合成オ
リゴヌクレオチドカセット（オリゴ＃１４２）が合成さ
れ、３．９５ｋｂ ｐＴＡＣ ＴＧＦ／ＰＥ４０−１３
２，１５３ＤＮＡに継ぎ合わされた：
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２，１５３と名付けた。
バクテリア宿主細胞がｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０
−１３２，１５３ＤＮＡにより形質転換された。候補ク
ローンはハイブリッド形成により確認され、単離され、
それらのプラスミドＤＮＡが配列決定され、適切な組換
えＤＮＡを有することが確証された。ｐＴＡＣ ＴＧＦ
５７−ＰＥ４０−１３２，１５３ＤＮＡはＨｐａＩとＳ
ａｌＩにより消化され、３．９５ｋｂベクターＤＮＡが
単離された。ＰＥ40のアミノ酸残基２７２から３０９を
カバーし、ＨｐａＩとＳａｌＩ用の末端を有する合成オ
リゴヌクレオチドカセット（オリゴ＃１４２）が合成さ
れ、３．９５ｋｂ ｐＴＡＣ ＴＧＦ／ＰＥ４０−１３
２，１５３ＤＮＡに継ぎ合わされた：
【化４】
【００２９】このオリゴヌクレオチドカセットは残基２
８７でシステインを特定するコドンが変化しており、こ
のコドンは今度はアラニンを特定した。便宜上、この突
然変異したプラスミドＤＮＡをｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−
ＰＥ４０−１３２，１５３，１４２と名付けた。バクテ
リア宿主細胞がこのプラスミドに形質転換され、そして
候補クローンがハイブリッド形成により確認された。こ
れらのクローンは単離され、これらプラスミドＤＮＡが
配列決定され、適切な組換えＤＮＡを有することが確認
された。ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２，１
５３，１４２プラスミドは座“Ａ”の両方のシステイン
がアラニンに置換されたＴＧＦ−α−ＰＥ40変異体をコ
ードした。そのため、前述した命名法に従い、ＴＧＦ−
α−ＰＥ 40のこの修飾変換体はＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ
と名付けられた。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ遺伝子により
コードされたアミノ酸配列を表４に示す。
８７でシステインを特定するコドンが変化しており、こ
のコドンは今度はアラニンを特定した。便宜上、この突
然変異したプラスミドＤＮＡをｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−
ＰＥ４０−１３２，１５３，１４２と名付けた。バクテ
リア宿主細胞がこのプラスミドに形質転換され、そして
候補クローンがハイブリッド形成により確認された。こ
れらのクローンは単離され、これらプラスミドＤＮＡが
配列決定され、適切な組換えＤＮＡを有することが確認
された。ｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２，１
５３，１４２プラスミドは座“Ａ”の両方のシステイン
がアラニンに置換されたＴＧＦ−α−ＰＥ40変異体をコ
ードした。そのため、前述した命名法に従い、ＴＧＦ−
α−ＰＥ 40のこの修飾変換体はＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ
と名付けられた。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ遺伝子により
コードされたアミノ酸配列を表４に示す。
【００３０】ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ：クローンｐＴＡ
Ｃ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０はＳｐｈＩとＢａｍＨＩによ
り消化されて、７５０ｂｐ ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片
（ＴＧＦ−αのＣ末端５アミノ酸とＰＥ40のＮ末端２５
２アミノ酸を特定する）が単離された。Ｍ１３ｍｐ１９
ベクターをＳｐｈＩとＢａｍＨＩにより切断し、ベクタ
ーＤＮＡを単離した。７５０ｂｐ ＳｐｈＩ−ＢａｍＨ
Ｉ ＴＧＦ−α−ＰＥ40断片は１５℃で一晩中Ｍ１３ベ
クターＤＮＡへ継ぎ合わされた。バクテリア宿主細胞は
連結反応混合物により形質転換され、候補クローンが単
離され、それらのプラスミドＤＮＡが配列決定され、こ
れらクローンが適切な組換えＤＮＡｓを有することが確
認された。一本鎖ＤＮＡが突然変異生成のために調製さ
れた。
Ｃ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０はＳｐｈＩとＢａｍＨＩによ
り消化されて、７５０ｂｐ ＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片
（ＴＧＦ−αのＣ末端５アミノ酸とＰＥ40のＮ末端２５
２アミノ酸を特定する）が単離された。Ｍ１３ｍｐ１９
ベクターをＳｐｈＩとＢａｍＨＩにより切断し、ベクタ
ーＤＮＡを単離した。７５０ｂｐ ＳｐｈＩ−ＢａｍＨ
Ｉ ＴＧＦ−α−ＰＥ40断片は１５℃で一晩中Ｍ１３ベ
クターＤＮＡへ継ぎ合わされた。バクテリア宿主細胞は
連結反応混合物により形質転換され、候補クローンが単
離され、それらのプラスミドＤＮＡが配列決定され、こ
れらクローンが適切な組換えＤＮＡｓを有することが確
認された。一本鎖ＤＮＡが突然変異生成のために調製さ
れた。
【００３１】オリゴヌクレオチド（オリゴ＃１３３）を
合成し、部位特異的突然変異誘発に使用され、ＰＥ40の
アミノ酸位置３６９でＴＧＦ−α−ＰＥ40にＢｓｔｅＩ
Ｉ部位が導入された：
合成し、部位特異的突然変異誘発に使用され、ＰＥ40の
アミノ酸位置３６９でＴＧＦ−α−ＰＥ40にＢｓｔｅＩ
Ｉ部位が導入された：
【化５】 この突然変異誘発の結果としてＰＥ40の位置３６９のセ
リン残基がスレオニンに変換された。
リン残基がスレオニンに変換された。
【００３２】新しく生成したＢｓｔｅＩＩ部位を有する
ＤＮＡクローンが確認され、単離され、配列決定され、
適切な組換えＤＮＡが存在することが確認された。この
クローンは次にＡｐａＩとＳａｌＩの制限酵素により消
化された。新しく生成したＢｓｔｅＩＩ部位を有する１
２０ｂｐ挿入ＤＮＡ断片が単離され、ＡｐａＩとＳａｌ
Ｉにより消化されたｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０に
継ぎ合わされた。バクテリア宿主細胞が形質転換され、
候補クローンが単離されて配列決定され、適切な組換え
ＤＮＡが存在することが確認された。この新しく生成し
たプラスミドＤＮＡはｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０
−１３３と名付けられた。それはＢｓｔｅＩＩとＡｐａ
Ｉにより消化され、２．６５ｋｂベクターＤＮＡ断片が
単離された。ＢｓｔｅＩＩからＡｐａＩまでのオリゴヌ
クレオチドカセット（オリゴ＃１５５）が合成された。
これはＢｓｔｅＩＩとＡｓａＩの制限酵素により消化さ
れたｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３では欠失
しているＴＧＦ−α−ＰＥ40領域をカバーする。このカ
セットはまたＢｓｔｅＩＩとＡｐａＩ用の末端ヌクレオ
チド配列を特定した。
ＤＮＡクローンが確認され、単離され、配列決定され、
適切な組換えＤＮＡが存在することが確認された。この
クローンは次にＡｐａＩとＳａｌＩの制限酵素により消
化された。新しく生成したＢｓｔｅＩＩ部位を有する１
２０ｂｐ挿入ＤＮＡ断片が単離され、ＡｐａＩとＳａｌ
Ｉにより消化されたｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０に
継ぎ合わされた。バクテリア宿主細胞が形質転換され、
候補クローンが単離されて配列決定され、適切な組換え
ＤＮＡが存在することが確認された。この新しく生成し
たプラスミドＤＮＡはｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０
−１３３と名付けられた。それはＢｓｔｅＩＩとＡｐａ
Ｉにより消化され、２．６５ｋｂベクターＤＮＡ断片が
単離された。ＢｓｔｅＩＩからＡｐａＩまでのオリゴヌ
クレオチドカセット（オリゴ＃１５５）が合成された。
これはＢｓｔｅＩＩとＡｓａＩの制限酵素により消化さ
れたｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３では欠失
しているＴＧＦ−α−ＰＥ40領域をカバーする。このカ
セットはまたＢｓｔｅＩＩとＡｐａＩ用の末端ヌクレオ
チド配列を特定した。
【化６】
【００３３】このヌクレオチドカセットはＰＥ40の残基
３７２と３７９でのシステインに対するコドンをアラニ
ンを特定するコドンに変化させた。オリゴヌクレオチド
カセット＃１５５は２．６５ｋｂベクターＤＮＡ断片に
継ぎ合わされた。バクテリア宿主細胞が形質転換され、
候補クローンが単離され、配列決定され、適切な組換え
ＤＮＡが存在することが確認された。この新しく生成し
たＤＮＡはｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３，１
５５と名付けられた。それは座“Ｂ”で両方のシステイ
ンがアラニンに置換されたＴＧＦ−α−ＰＥ40変異体を
コードした。そのため、前述の命名法に従いＴＧＦ−α
−ＰＥ40のこの修飾変換体をＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂと
名付けた。ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ遺伝子にコードされ
たアミノ酸配列は表５に示される。
３７２と３７９でのシステインに対するコドンをアラニ
ンを特定するコドンに変化させた。オリゴヌクレオチド
カセット＃１５５は２．６５ｋｂベクターＤＮＡ断片に
継ぎ合わされた。バクテリア宿主細胞が形質転換され、
候補クローンが単離され、配列決定され、適切な組換え
ＤＮＡが存在することが確認された。この新しく生成し
たＤＮＡはｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３，１
５５と名付けられた。それは座“Ｂ”で両方のシステイ
ンがアラニンに置換されたＴＧＦ−α−ＰＥ40変異体を
コードした。そのため、前述の命名法に従いＴＧＦ−α
−ＰＥ40のこの修飾変換体をＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂと
名付けた。ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ遺伝子にコードされ
たアミノ酸配列は表５に示される。
【００３４】ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ：ＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40ａＢをコードするｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０
−１３２，１５３，１４２プラスミドはＳａｌＩとＡｐ
ａＩによって消化され、その結果生じた３．８ｋｂベク
ターＤＮＡ断片が単離された。ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ
をコードするｐＴＡＣ−ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３
３，１５５プラスミドもＳａｌＩとＡｐａＩにより消化
され、ＰＥ40のアミノ酸残基３７２と３７９がシステイ
ンからアラニンへ変っている１４０ｂｐＤＮＡ断片が単
離された。これらの２つのＤＮＡは一緒に継ぎ合わさ
れ、バクテリア宿主細胞を形質転換するのに使用され
た。候補クローンはｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−
１３３，１５５からの放射性同位元素を使用して標識さ
れた１４０ｂｐＤＮＡを用いたハイブリッド形成により
同定された。候補クローンからプラスミドＤＮＡが単離
され、配列決定され、適切な組換えＤＮＡの存在が確認
された。この新しく生成したＤＮＡクローンはｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２，１５３，１４２，１
３３，１５５と名付けられた。このプラスミドは座
“Ａ”と“Ｂ”の４個のシステイン全部がアラニンに置
換されたＴＧＦ−α−ＰＥ40変異体をコードした。その
ため、前述した命名法に従い、ＴＧＦ−α−ＰＥ40のこ
の修飾変換体はＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂと名付けられ
た。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ遺伝子によりコードされた
アミノ酸配列を表６に示す。
Ｅ40ａＢをコードするｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０
−１３２，１５３，１４２プラスミドはＳａｌＩとＡｐ
ａＩによって消化され、その結果生じた３．８ｋｂベク
ターＤＮＡ断片が単離された。ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ
をコードするｐＴＡＣ−ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３
３，１５５プラスミドもＳａｌＩとＡｐａＩにより消化
され、ＰＥ40のアミノ酸残基３７２と３７９がシステイ
ンからアラニンへ変っている１４０ｂｐＤＮＡ断片が単
離された。これらの２つのＤＮＡは一緒に継ぎ合わさ
れ、バクテリア宿主細胞を形質転換するのに使用され
た。候補クローンはｐＴＡＣ ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−
１３３，１５５からの放射性同位元素を使用して標識さ
れた１４０ｂｐＤＮＡを用いたハイブリッド形成により
同定された。候補クローンからプラスミドＤＮＡが単離
され、配列決定され、適切な組換えＤＮＡの存在が確認
された。この新しく生成したＤＮＡクローンはｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２，１５３，１４２，１
３３，１５５と名付けられた。このプラスミドは座
“Ａ”と“Ｂ”の４個のシステイン全部がアラニンに置
換されたＴＧＦ−α−ＰＥ40変異体をコードした。その
ため、前述した命名法に従い、ＴＧＦ−α−ＰＥ40のこ
の修飾変換体はＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂと名付けられ
た。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ遺伝子によりコードされた
アミノ酸配列を表６に示す。
【００３５】実施例４ 組換え体ＴＧＦ−α−ＰＥ40の修飾体を含むＤＮＡクロ
ーンの構築：システイン残基の選択 ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ、及
びＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂはまた座“Ａ”及び／又は座
“Ｂ”におけるシステイン残基の除去によって構成され
ることもできる。ＴＧＦ−α−ＰＥ40のこれらの変形の
構築は次のことを除いては実施例３に述べられたと全く
同じに遂行される。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢに関しては
オリゴヌクレオチドカセット１５３を変えて位置２６５
のアラニンコドンが削除されオリゴヌクレオチドカセッ
ト１４２を変えて位置２８７のアラニンコドンが削除さ
れる。ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂに関してはオリゴヌクレ
オチドカセット１５５を変えて残基３７２及び３７９の
アラニンコドンが削除される。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ
に関してはこの組換え体遺伝子を構成するために使われ
るＤＮＡ断片がこの実施例に記載されたＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40ａＢとＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ遺伝子から取り出さ
れる。
ーンの構築：システイン残基の選択 ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ、及
びＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂはまた座“Ａ”及び／又は座
“Ｂ”におけるシステイン残基の除去によって構成され
ることもできる。ＴＧＦ−α−ＰＥ40のこれらの変形の
構築は次のことを除いては実施例３に述べられたと全く
同じに遂行される。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢに関しては
オリゴヌクレオチドカセット１５３を変えて位置２６５
のアラニンコドンが削除されオリゴヌクレオチドカセッ
ト１４２を変えて位置２８７のアラニンコドンが削除さ
れる。ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂに関してはオリゴヌクレ
オチドカセット１５５を変えて残基３７２及び３７９の
アラニンコドンが削除される。ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ
に関してはこの組換え体遺伝子を構成するために使われ
るＤＮＡ断片がこの実施例に記載されたＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40ａＢとＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ遺伝子から取り出さ
れる。
【００３６】実施例５ ＴＧＦ−α−ＰＥ40ＡＢ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40Ａｂ、Ｔ
ＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ、及びＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ蛋
白質の生物学的活性 雑種融合蛋白質ＴＧＦ−α−ＰＥ40ＡＢ、ＴＧＦ−α−
ＰＥ40Ａｂ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ、ＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40ａｂは細菌宿主内で発現され実施例１で述べられた
ように単離された。そして各蛋白質はＡ４３１細胞膜小
胞上の表皮成長因子レセプターへの放射能ラベルされた
表皮成長因子の結合を阻害する能力及び前述のＭＴＴ細
胞増殖アッセイにおいて測定されるようなＡ４３１細胞
を殺す能力について特徴付けられる。次の表はこれらの
蛋白質の生物学的活性を要約している。
ＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ、及びＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ蛋
白質の生物学的活性 雑種融合蛋白質ＴＧＦ−α−ＰＥ40ＡＢ、ＴＧＦ−α−
ＰＥ40Ａｂ、ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａＢ、ＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅ40ａｂは細菌宿主内で発現され実施例１で述べられた
ように単離された。そして各蛋白質はＡ４３１細胞膜小
胞上の表皮成長因子レセプターへの放射能ラベルされた
表皮成長因子の結合を阻害する能力及び前述のＭＴＴ細
胞増殖アッセイにおいて測定されるようなＡ４３１細胞
を殺す能力について特徴付けられる。次の表はこれらの
蛋白質の生物学的活性を要約している。
【表１】
【００３７】実施例６ ＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂのＴＧＦ−α領域の表皮成長因
子レセプターへ結合する他の「ターゲット試薬」への置
換 ＴＧＦ−α−ＰＥ40の有用性はその表皮成長因子レセプ
ターを有する細胞へ結合し殺す能力にある。他の「ター
ゲット試薬」も、ＥＧＦレセプターに結合する本願発明
の改質されたＰＥ40で雑種分子を作るのに用いることが
できる。例えば、表皮成長因子又はウロガストロン又は
ショープ（Shope）ファイブローマウイルス成長因子、
又はバクシニア（vaccinia）ウイルス成長因子のための
遺伝子は、ＰＥ40のための遺伝子に連結され表皮成長因
子−ＰＥ40、又はウロガストロン−ＰＥ40、又はショー
プファイブローマウイルス成長因子−ＰＥ40、又はバク
シニアウイルス成長因子−ＰＥ40雑種融合蛋白質の合成
を指令するために用いられることができる。しかしなが
ら、夫々の場合に於いてここで述べられたＰＥ40の変形
は、表皮成長因子レセプターを有する細胞へのこれらの
他の雑種融合蛋白質の結合を改善する。
子レセプターへ結合する他の「ターゲット試薬」への置
換 ＴＧＦ−α−ＰＥ40の有用性はその表皮成長因子レセプ
ターを有する細胞へ結合し殺す能力にある。他の「ター
ゲット試薬」も、ＥＧＦレセプターに結合する本願発明
の改質されたＰＥ40で雑種分子を作るのに用いることが
できる。例えば、表皮成長因子又はウロガストロン又は
ショープ（Shope）ファイブローマウイルス成長因子、
又はバクシニア（vaccinia）ウイルス成長因子のための
遺伝子は、ＰＥ40のための遺伝子に連結され表皮成長因
子−ＰＥ40、又はウロガストロン−ＰＥ40、又はショー
プファイブローマウイルス成長因子−ＰＥ40、又はバク
シニアウイルス成長因子−ＰＥ40雑種融合蛋白質の合成
を指令するために用いられることができる。しかしなが
ら、夫々の場合に於いてここで述べられたＰＥ40の変形
は、表皮成長因子レセプターを有する細胞へのこれらの
他の雑種融合蛋白質の結合を改善する。
【００３８】実施例７ ＴＧＦ−α−ＰＥ40のＴＧＦ−α領域の哺乳類細胞上の
他のレセプターへ結合する他の「ターゲット試薬」への
置換 本発明はＰＥ40と哺乳動物細胞の特定のレセプターを認
識する他の「ターゲット試薬」との間の雑種融合蛋白質
におけるＰＥ40領域の変形にも関するものであると理解
される。例えば、蛋白質と本願発明の変形ＰＥ40との間
に形成された、Ｘがインターロイキン２、又はインター
ロイキン３、又はインターロイキン４、又はインターロ
イキン６、又は成長因子から誘導された血小板、又は特
定の哺乳類細胞レセプターを認識し結合する何か他の蛋
白質をあらわす一般式Ｘ−ＰＥ40の融合蛋白質はそれら
の夫々の細胞レセプターに対しての改良された結合特性
を有する。
他のレセプターへ結合する他の「ターゲット試薬」への
置換 本発明はＰＥ40と哺乳動物細胞の特定のレセプターを認
識する他の「ターゲット試薬」との間の雑種融合蛋白質
におけるＰＥ40領域の変形にも関するものであると理解
される。例えば、蛋白質と本願発明の変形ＰＥ40との間
に形成された、Ｘがインターロイキン２、又はインター
ロイキン３、又はインターロイキン４、又はインターロ
イキン６、又は成長因子から誘導された血小板、又は特
定の哺乳類細胞レセプターを認識し結合する何か他の蛋
白質をあらわす一般式Ｘ−ＰＥ40の融合蛋白質はそれら
の夫々の細胞レセプターに対しての改良された結合特性
を有する。
【００３９】実施例８ ヒトのケラチノサイトに対するＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂ
の生物学的活性 モスマン、ジェー・インミュノル・メソーズ６５（Moss
mann, J. Immunol. Methods ６５）５５−６３頁（１９
８３）の細胞増殖アッセイを用いたところ、ＴＧＦ−α
−ＰＥ40ａｂは、そのアッセイにおいて用いられるヒト
のケラチノサイトを容易に殺した。ケラチノサイトの５
０％を殺すのに必要なＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂの濃度
（ＥＤ５０）は１１ｎＭであった。
の生物学的活性 モスマン、ジェー・インミュノル・メソーズ６５（Moss
mann, J. Immunol. Methods ６５）５５−６３頁（１９
８３）の細胞増殖アッセイを用いたところ、ＴＧＦ−α
−ＰＥ40ａｂは、そのアッセイにおいて用いられるヒト
のケラチノサイトを容易に殺した。ケラチノサイトの５
０％を殺すのに必要なＴＧＦ−α−ＰＥ40ａｂの濃度
（ＥＤ５０）は１１ｎＭであった。
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【図１】実施例２の操作で得られたプラスミドを示す図
である。
である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年３月３日
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ 39/395 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 デボラ デー．ジョーンズ アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴァニ ア，ランスデール，カンタベリー ドライ ヴ 1126 (72)発明者 グウイネス エム．エドワーズ アメリカ合衆国，19426 ペンシルヴァニ ア．カレッジヴィル，グランジ アヴェニ ュー 987
Claims (16)
- 【請求項１】 ３７２位と３７９位の２つのシステイン
残基を、ジスルフィド結合を形成しない同じかまたは異
なっていてもよい２つのアミノ酸で置換または除去する
ことにより改変されたＰＥ40領域と、それに結合したタ
ンパク質ターゲティング剤領域とからなり、ターゲティ
ング剤により認識された受容体に結合するハイブリッド
タンパク質。但しＰＥ40は細胞結合領域を欠くシュード
モナスエキソトキシンＡの分子量４０ｋＤの断片であ
る。 - 【請求項２】 ターゲティング剤が成長因子、ホルモ
ン、または抗体である請求項１記載のハイブリッドタン
パク質。 - 【請求項３】 ３７２位と３７９位の２つのシステイン
残基が置換されている請求項１記載のハイブリッドタン
パク質。 - 【請求項４】 少なくとも１つのシステイン残基がアラ
ニンで置換されている請求項３記載のハイブリッドタン
パク質。 - 【請求項５】 ３７２位と３７９位の２つのシステイン
残基がアラニンで置換されている請求項３記載のハイブ
リッドタンパク質。 - 【請求項６】 少なくとも３７２位と３７９位のどちら
か１つのシステイン残基が、ジスルフィド結合を形成し
ないアラニン以外のアミノ酸で置換されている請求項３
記載のハイブリッドタンパク質。 - 【請求項７】 ３７２位と３７９位のシステイン残基
が、ジスルフィド結合を形成しないアラニン以外のアミ
ノ酸で置換されている請求項３記載のハイブリッドタン
パク質。 - 【請求項８】 ３７２位と３７９位のシステイン残基が
除去されている請求項１記載のハイブリッドタンパク
質。 - 【請求項９】 ３７２位と３７９位の１つのシステイン
残基が、ジスルフィド結合を形成しないアミノ酸で置換
されており、１つのシステイン残基が除去されている請
求項１記載のハイブリッドタンパク質。 - 【請求項１０】 請求項１のハイブリッドタンパク質を
コードするＤＮＡを含有し、適切な原核生物または真核
生物宿主にハイブリッドタンパク質を発現させるのに適
合したプラスミド。 - 【請求項１１】 請求項１のハイブリッドタンパク質を
コードするＤＮＡを含有するプラスミドを、適切な原核
生物または真核生物宿主細胞に挿入し、ハイブリッドタ
ンパク質が産生される条件下で宿主細胞を成長させるこ
とよりなる請求項１のハイブリッドタンパク質を産生す
る方法。 - 【請求項１２】 細胞毒有効量の請求項１記載のハイブ
リッドタンパク質と、生理学的に許容される担体とを含
有する組成物。 - 【請求項１３】 ヒト以外の哺乳動物に請求項１記載の
ハイブリッドタンパク質の細胞毒有効量からなる組成物
を投与することからなる、標的細胞を選択的に殺す方
法。 - 【請求項１４】 組成物が生理学的に許容される担体を
含有するものである請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 ケラチン生成細胞の増殖を阻止するの
に効果的な量の請求項１記載のハイブリッドタンパク質
で増殖細胞を処理することよりなる、ケラチン生成細胞
の増殖を処置する方法。 - 【請求項１６】 ターゲティング剤が成長因子、ホルモ
ン、または抗体である請求項１５記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US31254089A | 1989-02-17 | 1989-02-17 | |
| US38909289A | 1989-08-03 | 1989-08-03 | |
| US44918789A | 1989-12-21 | 1989-12-21 | |
| US449187 | 1989-12-21 | ||
| US312540 | 1989-12-21 | ||
| US389092 | 1989-12-21 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2037126A Division JPH07106159B2 (ja) | 1989-02-17 | 1990-02-17 | タンパク質抗ガン剤 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07278200A true JPH07278200A (ja) | 1995-10-24 |
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Family
ID=27405603
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2037126A Expired - Fee Related JPH07106159B2 (ja) | 1989-02-17 | 1990-02-17 | タンパク質抗ガン剤 |
| JP7050281A Expired - Fee Related JP2510846B2 (ja) | 1989-02-17 | 1995-02-02 | ＰＥ４０Ａｂを含有するタンパク質抗ガン剤 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2037126A Expired - Fee Related JPH07106159B2 (ja) | 1989-02-17 | 1990-02-17 | タンパク質抗ガン剤 |
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|---|---|
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| JP (2) | JPH07106159B2 (ja) |
| KR (1) | KR0169729B1 (ja) |
| AT (1) | ATE133993T1 (ja) |
| AU (1) | AU617039B2 (ja) |
| CA (1) | CA2010256C (ja) |
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| DE (1) | DE69025211T2 (ja) |
| DK (1) | DK0383599T3 (ja) |
| ES (1) | ES2085329T3 (ja) |
| FI (1) | FI102383B (ja) |
| GR (1) | GR3019836T3 (ja) |
| HK (1) | HK15597A (ja) |
| IE (1) | IE71934B1 (ja) |
| IL (1) | IL93425A (ja) |
| NO (1) | NO300595B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ232564A (ja) |
| PT (1) | PT93178B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020170002A (ja) * | 2015-10-05 | 2020-10-15 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | がん細胞の検出方法、がん細胞内に物質を導入するための試薬、及びがん治療用組成物 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU631200B2 (en) * | 1989-02-17 | 1992-11-19 | Merck & Co., Inc. | Production of modified pe40 |
| ATE138688T1 (de) * | 1989-04-21 | 1996-06-15 | Us Health | Rekombinantes antikörper-toxin-fusion-protein |
| IL98528A0 (en) * | 1990-06-21 | 1992-07-15 | Merck & Co Inc | Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells |
| GB2246779B (en) * | 1990-08-03 | 1994-08-17 | Delta Biotechnology Ltd | Tumour-associated protease inhibitors targeted to tumour cells |
| AUPM959894A0 (en) * | 1994-11-22 | 1994-12-15 | Crc For Biopharmaceutical Research Pty Ltd | Fusion proteins with cytotoxic activity against cells overexpressing erbb2-4 |
| US6500646B1 (en) * | 1996-12-27 | 2002-12-31 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Cell membrane-directed drugs |
| NZ500656A (en) * | 1997-05-12 | 2001-11-30 | Tno | Vector containing a nucleic acid insertion expressing a hybrid polypeptide with a protease inhibitor domain and a receptor binding domain |
| GB0008802D0 (en) * | 2000-04-10 | 2000-05-31 | Univ London | Molecule |
| US8362206B2 (en) | 2004-06-28 | 2013-01-29 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Chimeric proteins and uses thereof |
| JPWO2015076121A1 (ja) | 2013-11-20 | 2017-03-16 | 株式会社村田製作所 | 多層配線基板およびこれを備えるプローブカード |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL90047A (en) * | 1982-10-19 | 1992-12-01 | Cetus Oncology Corp | Cysteine-depleted biologically active muteins other than interferon - ' |
| IE56026B1 (en) * | 1982-10-19 | 1991-03-27 | Cetus Corp | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| US4545985A (en) * | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
| US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
| ATE138688T1 (de) * | 1989-04-21 | 1996-06-15 | Us Health | Rekombinantes antikörper-toxin-fusion-protein |
-
1990
- 1990-02-15 DK DK90301639.2T patent/DK0383599T3/da active
- 1990-02-15 ES ES90301639T patent/ES2085329T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-15 AT AT90301639T patent/ATE133993T1/de not_active IP Right Cessation
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