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JP2000224939A - 血管組織特異的にアンジオテンシンｉｉ２型受容体を発現するトランスジェニック動物 - Google Patents

血管組織特異的にアンジオテンシンｉｉ２型受容体を発現するトランスジェニック動物

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Publication number
JP2000224939A
JP2000224939A JP11029354A JP2935499A JP2000224939A JP 2000224939 A JP2000224939 A JP 2000224939A JP 11029354 A JP11029354 A JP 11029354A JP 2935499 A JP2935499 A JP 2935499A JP 2000224939 A JP2000224939 A JP 2000224939A
Authority
JP
Japan
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receptor
vascular
transgenic animal
angiotensin
animal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP11029354A
Other languages
English (en)
Inventor
Tatsuya Kurihara
達也 栗原
Hiroaki Matsubara
弘明 松原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suntory Ltd
Original Assignee
Suntory Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Ltd filed Critical Suntory Ltd
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Priority to KR1020007011073A priority patent/KR20010052237A/ko
Priority to PCT/JP2000/000615 priority patent/WO2000045633A1/ja
Priority to EP00902092A priority patent/EP1070454A1/en
Priority to CA002324863A priority patent/CA2324863A1/en
Publication of JP2000224939A publication Critical patent/JP2000224939A/ja
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Abstract

(57)【要約】 【課題】血管組織特異的にAT2受容体遺伝子を発現させ
るトランスジェニック動物を作製して、AT2受容体の血
管生理作用及び／又は血圧調節作用を解析する動物モデ
ルを提供する。 【解決手段】血管組織特異的にアンジオテンシンII２型
受容体が発現することを特徴とするトランスジェニック
動物及びその子孫。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】本発明は、アンジオテンシンII２
型受容体（AT2受容体）の生理作用、とりわけ血管生理
作用及び／又は血圧調節作用を研究するための動物モデ
ルとして有効であり、かつAT2受容体及び／又はアンジ
オテンシンII１型受容体（AT1受容体）に作用する化合
物の薬効を解明するために有効なトランスジェニック動
物に関する。
【０００２】
【従来の技術】アンジオテンシンII（以下、AngIIとい
うこともある）は血圧を維持する生体内で最も重要な昇
圧系であり、その作用は1型（以下、AT1）、2型（以
下、AT2）の特異的受容体を介して発揮される（Matsuba
ra, H. et al, Molecular insights into angiotensin
II type 1 and type 2 receptors : expression, signa
ling and physiological function and clinical appli
cation of its antagonists. Endocr. J. 1998;45:137
-150.）。AT1受容体は、生体内で最も強力な血管収縮作
用を発揮し、成人の血管平滑筋細胞に主として発現す
る。AT1受容体ノックアウトマウスの成績では平均血圧
で約35mmHgもの低下が報告されている（Sugaya, T. et
al, Angiotensin II type 1a receptor-deficient mice
with hypotension and hyperreninemia. J. Biol. Ch
em. 1995;270:18719-18722.）。
【０００３】一方、AT2受容体は胎児型受容体であり、
胎児期には全身に間葉系を中心として発現するが、生後
急速に発現量は低下する。成人では脳基底核を含む脳の
多くの部位と、子宮で高発現する。成人血管での発現量
は少なく、従来までは血圧調節への関与は少ないと考え
られていた（Matsubara, H., Pathophysiological role
s of angiotensin II type2 receptor in cardiovascul
ar and renal diseases. Circ. Res. 1998;83:1182-11
91.）。
【０００４】1995年にAT2受容体ノックアウトマウスが
作製され（Ichiki, T. et al, Effects on blood press
ure and exploratory behavior of mice lacking angio
tensin II type-2 receptor. Nature. 1995;377: 748-
750.、 Hein, L. et al, Behavioraland cardiovascula
r effects of disrupting the angiotensin II type-2r
eceptor gene in mice. Nature. 1995;377: 744-74
7.）、基礎血圧が野生型に比べ上昇し、さらにAngIIに
よる昇圧が過剰反応を示した。この結果は、AT2受容体
を介して中枢性・末梢性に何らかの血圧調節作用のある
ことが示唆されるが、成体血管系においてAT2受容体の
発現が見いだせないことから、その作用機序は未だに不
明であった。
【０００５】1998年に心臓特異的AT2受容体過剰発現ト
ランスジェニックマウスが作製され（Masaki, H. et a
l, Cardiac-specific overexpression of angiotensin
II AT2 receptor causes attenuated response to AT1
receptor-mediated pressor and chronotropic effect
s. J.Clini.Invest. 1998;101: 527-535.）、このマウ
スでは、AngII投与による昇圧反応や頻脈反応が起きに
くく、AngIIの心筋MAPkinase活性化が抑制されることか
ら、AT2受容体が、AT1受容体の作用（昇圧、頻脈）を抑
えることが示された。しかし、この作用は心臓に対する
ものであり、AT2受容体の血管系に対する血圧調節作用
は、依然不明のままであった。
【０００６】また、AT2受容体の細胞内シグナルはチロ
シンフォスファターゼを活性化し、細胞増殖抑制作用を
発揮することが知られていたが、AT2受容体の血圧調節
作用との関連は不明であった（Matsubara, H., Pathoph
ysiological roles of angiotensin II type2 receptor
in cardiovascular and renal diseases. Circ. Res.
1998;83: 1182-1191.）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、これまで全
く予想が困難であったAT2受容体の血管生理作用及び／
又は血圧調節作用を研究するためのモデルとして有用な
トランスジェニック動物を提供するものである。AT2受
容体の作用の研究が困難であった理由は、胎児期には全
身に発現するが、生後急速に発現量は低下し、成人血管
での発現量が少ないこと、また動物においても成体血管
では発現が見いだせないことによると考えられる。AT2
受容体は、肥大心、梗塞心、障害血管内皮でその発現が
上昇することが知られているが、その病態生理学的意義
は全く不明であった。
【０００８】本発明の目的は、血管組織特異的にAT2受
容体遺伝子を発現させるトランスジェニック動物を作製
して、AT2受容体の血管生理作用及び／又は血圧調節作
用を解析する動物モデルを提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上述の目的を達成するた
めに、本発明の発明者らは、様々な組織でAT2受容体遺
伝子を発現させて、AT2受容体の機能を解析する研究を
している中に、血管平滑筋に発現する血管平滑筋α-ア
クチン遺伝子のプロモーターにAT2受容体を連結させた
組換え体遺伝子を動物に導入した場合、AT2受容体が血
管に発現し、血圧調節作用が見られるという点に着案し
て本発明を完成するに至った。
【００１０】即ち、本発明は、血管組織特異的にアンジ
オテンシンII２型受容体が発現することを特徴とするト
ランスジェニック動物及びその子孫を提供する。本発明
において好ましいのは、血管組織で発現するタンパク質
遺伝子由来のプロモーター領域と、アンジオテンシンII
２型受容体遺伝子とを含むトランスジェニック動物作製
用組換え遺伝子を導入した全能性細胞を個体発生させて
得られる、血管組織特異的にアンジオテンシンII２型受
容体が発現することを特徴とするトランスジェニック動
物及びその子孫である。
【００１１】本発明はさらに、血管組織で発現するタン
パク質遺伝子由来のプロモーター領域と、アンジオテン
シンII２型受容体遺伝子とを含むトランスジェニック動
物作製用組換え遺伝子を全能性細胞に挿入し、当該全能
性細胞を仮親動物に移植し、前記仮親動物を飼育出産さ
せて所望の形質が発現された仔動物である始祖動物を得
る工程を含む前記トランスジェニック動物の作製方法を
提供する。
【００１２】本発明はさらに、血管組織で発現するタン
パク質遺伝子由来のプロモーター領域と、アンジオテン
シンII２型受容体遺伝子とを含むトランスジェニック動
物作製用組換え遺伝子を提供する。
【００１３】本発明はさらに、前記トランスジェニック
動物に由来する血管組織断片又は血管細胞を提供する。
本発明はさらに、前記トランスジェニック動物を用いて
in vivoでアンジオテンシンII２型受容体の血管生理作
用及び／又は血圧調節作用を解析する方法を提供する。
【００１４】本発明はさらに、前記血管組織断片又は血
管細胞を用いてin vitroでアンジオテンシンII２型受容
体の血管生理作用及び／又は血圧調節作用を解析する方
法を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明において用いることができ
る血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来のプロモー
ター領域としては、血管平滑筋で発現するタンパク質遺
伝子由来のプロモーター領域が好ましい。特に好ましい
のは血管平滑筋α-アクチン遺伝子由来であるプロモー
ター領域であり、ヒトまたはマウス等哺乳類由来のもの
を使用することができる。
【００１６】本発明において用いることができるAT2受
容体遺伝子の由来は特に限定されるものではなく、ヒト
またはマウス等哺乳類由来のものを使用することができ
る。本発明のトランスジェニック動物作製用組換え遺伝
子の調製は当業者に公知の方法を用いて行うことがで
き、調製方法の一例を図１に模式図として示す。
【００１７】本発明では、血管組織で発現するタンパク
質遺伝子由来のプロモーター領域の下流に、AT2受容体
遺伝子を連結して得られるトランスジェニック動物製造
用組換え遺伝子を導入した全能性細胞を個体発生させて
得られる哺乳動物及びその子孫であって、血管組織特異
的にAT2受容体が発現することを特徴とするトランスジ
ェニック動物を提供する。
【００１８】対象となる哺乳動物は、技術的にはヒト以
外の全ての動物種が可能であるが、特に近交系が多数作
出されており、しかも受精卵の培養、体外受精などの技
術が整っている齧歯類が望ましく、特にマウスが好まし
い。
【００１９】ここで全能性細胞とは、潜在的に全ての細
胞に分化する能力を有する細胞をいう。全能性細胞とし
ては、例えばマウスの場合、受精卵や初期胚のほか、多
分化能を有するＥＳ細胞のような培養細胞を対象とする
ことができる。培養細胞へのＤＮＡ断片の導入法として
は、静電パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法
などが利用できる。特に受精卵へのＤＮＡ溶液の物理的
注入（マイクロインジェクション）法が好ましい。本発
明に係るトランスジェニック動物の作製方法に用いる組
換え遺伝子は受精卵の胚発生期に挿入することが望まし
い。
【００２０】ＤＮＡを注入した細胞を仮親動物に移植
し、前記仮親動物を飼育出産させて所望の形質が発現さ
れた仔動物である目的のトランスジェニック動物（始祖
トランスジェニック動物）を得る。当該動物中における
所望の形質の発現を確認するには、当該動物の体の一部
（例えば尾部先端）を切断し、体細胞中のＤＮＡを抽出
して、PCR法やサザンブロット法などにより導入遺伝子
の存在を確認する。
【００２１】さらに、始祖トランスジェニック動物と正
常動物とを交配させてＦ１動物（子孫動物）を得て、当
該Ｆ１動物のうち形質が発現されたトランスジェニック
動物を交配させて同型集合体Ｆ２動物（子孫動物）を得
る工程を更に含むことにより、本発明に係るトランスジ
ェニック動物の子孫動物を作製することができる。
【００２２】本発明で得られた始祖トランスジェニック
動物及びその子孫動物の導入遺伝子の確認を、抽出精製
された尾DNAを用いてPCR法、及び３％アガロース電気泳
動にて検定した。その結果、図２に示すように、350 bp
のAT2受容体特異的バンドが、始祖トランスジェニック
動物及びその子孫動物で認められた。
【００２３】また、野生型動物及びトランスジェニック
動物（いずれも成体）から、大動脈、左心室、腎臓、及
び脳の組織を切除し、RT-PCR法により導入遺伝子の発現
解析を行った。図３に示すように、野生型動物からはい
ずれの臓器（大動脈、左心室、腎臓）においてもAT2受
容体のバンドが全く検出できなかったが、トランスジェ
ニック動物からは、大動脈、左心室、腎臓、及び脳の各
臓器とも720 bpのAT2受容体特異的バンドが検出され
た。これらの臓器はいずれも血管をもつ臓器であり、血
管組織特異的にAT2受容体が発現していることが確認さ
れた。
【００２４】本発明はさらに、前記トランスジェニック
動物を用いてin vivoでAT2受容体の血管生理作用及び／
又は血圧調節作用を解析する方法を提供する。例えば、
トランスジェニック動物にAngII、AngII拮抗薬、あるい
はこれらと同等の作用を示す可能性のある候補化合物を
投与し、血管生理的反応及び／又は血圧調節反応を観察
することにより、AT2受容体拮抗薬及び作動薬のスクリ
ーニングができる。さらに、現在使用されているAT1受
容体に作用する可能性のある薬物も存在するので、本発
明に係るトランスジェニック動物を用いて、AT1拮抗薬
又はAT1作動薬のAT2受容体への作用、とりわけ副作用を
評価することも可能である。以下の実施例４に示すよう
に、AngIIを持続投与した本発明のトランスジェニック
動物では、発現されたAT2受容体が、AngIIによる昇圧反
応を抑制することを示した。
【００２５】本発明はさらに、本発明のトランスジェニ
ック動物に由来する血管組織断片又は血管細胞を提供す
る。好ましい血管組織断片は例えば摘出大動脈血管平滑
筋組織断片などの血管平滑筋組織断片である。また、好
ましい血管細胞は例えば血管平滑筋細胞である。このよ
うな血管組織断片又は血管細胞を用いてin vitroでAT2
受容体の血管生理作用及び／又は血圧調節作用を解析す
る方法を提供する。例えば、トランスジェニック動物の
摘出大動脈を用いて、AT2受容体又はAT1受容体の作動
薬、拮抗薬又はこれらと同等の作用を示す可能性のある
候補化合物を後述する実施例５に係る方法に従い、灌流
液に添加後、当該摘出大動脈の収縮性を測定することに
より行うことができる。さらに、トランスジェニック動
物の摘出大動脈を用いて、AT2受容体又はAT1受容体の作
動薬、拮抗薬又はこれらと同等の作用を示す可能性のあ
る候補化合物を、後述する実施例６及び７に係る方法に
従い、灌流液に添加後、摘出大動脈のcGMP産生やkinino
genase活性などを測定することによっても行うことがで
きる。これによりAT2受容体拮抗薬及び作動薬のスクリ
ーニング、AT1受容体の拮抗薬及び作動薬のスクリーニ
ングを行うことも可能である。
【００２６】本発明によるトランスジェニック動物の摘
出血管組織断片を用いてAT2受容体の血管生理作用及び
／又は血圧調節作用について以下の知見が得られた。 １）AT2受容体が、AngIIによる摘出血管の血管収縮性を
低下させた。 ２）AT2受容体が、AngIIによるcGMP産生を有意に上昇さ
せていること、また、この上昇が内皮由来血管弛緩因子
であるNO、及びbradykininを介していることを示した。
すなわち、AT2受容体が降圧システムとして知られてい
るbradykinin/NO/cGMP産生系を活性化することで、AngI
Iによる摘出血管の血管収縮性を低下させ、降圧作用を
発揮していることが示唆された。 ３）AT2受容体が、AngIIによるkininogenaseの活性化に
関与することを示した。すなわち、kininogenaseがkini
nogenからbradykininヘの産生量を増加させることによ
り、降圧システムであるbradykinin/NO/cGMP産生系を介
して、AngIIによる摘出血管の血管収縮性を低下させ、
降圧作用を発揮していることが示唆された。
【００２７】以下、実施例によって本願発明を更に詳細
に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。種
々の変更、修飾が当業者には可能であり、本発明はこれ
らの変更、修飾も含むことを意図する。
【００２８】
【実施例】実施例１ トランスジェニック動物作製用組
換え遺伝子の調製 先ず、図１に示すようにマウスAT2受容体を含むプラス
ミドpBS-mAT2（Biophys. Biochem. Res. Commun. 1993;
197:393-399 、ATCC S67465）をSpeI-NotIで二重消化
し、2.9 KbのcDNA断片を得た。
【００２９】次に、本実施例では大阪大学遺伝情報実験
施設、三輪岳志博士から恵与されたプラスミドpBS-HSMA
-EA4.7を使用した。なお、プラスミドpBS-HSMA-EA4.7は
以下の方法で得ることもできる。
【００３０】ヒトゲノムDNAライブラリー（HK1067j, Cl
onetech社製品、CA, USA）を鋳型DNAとし、Long-PCRに
てヒト血管平滑筋α−アクチンプロモーターを取得す
る。先行技術（Gene. 1991;99:285-289）に記載された
遺伝子の一次配列を参考にし、EcoRI部位を含む上流プ
ライマー（SMA-FE, -891, 5'-GATTATGGAGATTAGAATTC-
3',20mer, 20uM）と、BamHI部位を含む下流プライマー
（SMA-RB, +3828, 5'-CTGGATCCGCTTCACAGGATTC-3', 22m
er, 20uM）を作製する。TaKaRa Z-Taqキットを用いてLo
ng-PCRを行い、PCR産物（4.7kb）を得る。そのDNA断片
の両末端をEcoRIとBamHIで部分消化して4.7kbのDNA断片
を単離、精製した後、pBluescript II KS- ベクター（S
tratagene社、La Jolla, CA, USA）のEcoRI/BamHI部位
にライゲーションし、プラスミドpBS-HSMA-EA4.7を得
る。
【００３１】次に、pBS-HSMA-EA4.7のマルチプルクロー
ニングサイト中に単独で存在する制限酵素SpeIとNotIで
二重消化し、前記の2.9 kbのcDNA断片をライゲーション
し、E.coli JM109株（東洋紡績株式会社製品）を形質転
換してプラスミドpBS-SM-AT2を得た。
【００３２】マイクロインジェクション用のDNA溶液を
調製するために、プラスミドpBS-SM-AT2をBssHIIで消化
し、7.7KbのDNA断片（smaAT2-DNA）を得た。 実施例２ トランスジェニック動物の作製 まず、smaAT2-DNAを注入する受精卵を得るためのマウス
（採卵用マウス）はC57BL6/J純系マウスで、日本クレア
株式会社から購入して使用した。８週齡以上の雌を過排
卵処理して８週齡以上の雄と交配させ、多数の受精卵を
採取し、M2培地に移し、３７℃で5%炭酸ガスインキュベ
ータの中で培養した。
【００３３】次に、前記受精卵の雄性前核にDNA注入ピ
ペットで２plのsmaAT2-DNA溶液をマイクロインジェクシ
ョン法により注入した。smaAT2-DNA溶液を注入された受
精卵をM16培地に移し、３７℃で5%炭酸ガスインキュベ
ータのなかで一夜培養した。
【００３４】次に、smaAT2-DNA溶液を注入された受精卵
を妊娠・出産・保育するための雌マウス（仮親マウス）
及びそれと交配させる雄マウスはICR近交系マウスで、
日本クレア株式会社から購入して使用した。精管結紮手
術をした８週齡以上の雄マウスは、８週齡以上の雌マウ
スと交配させ、膣栓のあるものを仮親として使用した。
仮親は、ネンブタール注射液（ダイナボット株式会社製
品、ペントバルビタールナトリウム、50mg/ml）を希釈
液（プロピレングリコール20ml、エタノール10ml、滅菌
水70mlの混合液）にて１２％に希釈した麻酔薬0.01ml/g
体重を腹腔内注射し外科的手術により左右の輸卵管を体
外に露出させた。
【００３５】smaAT2-DNA溶液が注入された受精卵を一夜
培養し、２細胞胚に発生したものを選んで、１０〜１５
個ずづ左右の輸卵管内に挿入した後、手術部位を縫合し
た。仮親は３週間飼育し、出産した場合仔マウスを５週
後に、尾を約１ｃｍ切断し、染色体DNAをEasy-DNA Kit
（Invitrogen社製品）を用いて抽出精製した。
【００３６】この尾DNAを用いて、PCR法により導入遺伝
子の存在を確認した。導入遺伝子の存在を確認したマウ
スは、始祖トランスジェニックマウスとして７週齡に達
した後、７週齡以上の野生型C57BL6/Jと自然交配して子
孫のトランスジェニックマウスを得た。
【００３７】即ち、本実施例により以下の結果が得られ
た。採卵用マウスC57BL6/Jの累計179匹から、2878個の
卵を得、そのうち1182個が受精卵と確認され、smaAT2-D
NA溶液を注入した。翌日858個（73%）が、２細胞胚に発
生し、これを累計33匹の仮親の輸卵管に移植した。20匹
の仮親が妊娠し、累計85匹（10%）の仔マウスを出産し
た。尾DNAのPCR法による導入遺伝子の検定により、累計
7匹（8%）の始祖トランスジェニックマウス（雄１匹、
雌６匹）が得られた。これらの始祖トランスジェニック
マウスは、野生型C57BL6/Jと自然交配して子孫を得た
が、１匹の雌以外は、６匹とも、雄雌両方に導入遺伝子
を伝達した。 実施例３ トランスジェニック動物の遺伝子解析 導入遺伝子の確認は、抽出精製された尾DNAを用いてPCR
法により行った。鋳型DNAとして尾DNA試料１ul、2.5mM
のdGTP, dATP, dTTP, dCTP混合液4 ul、5 u/ulTaKaRa T
aq（宝酒造株式会社製品）0.5 ul、10ｘPCR Buffer（Ta
KaRa Taq付属の緩衝液、宝酒造株式会社製品）5 ul、上
流プライマー（EaTg-F、5'-TAACGGTCAGAGGATAG-3', 17m
er, 20 uM）2 ul、下流プライマー（AT2-R、5'-TTCTGCT
GGTGGCAGCA-3', 17mer, 20 uM）2 ulをふくむ50 ulの反
応液を93℃で１分間、50℃で１分間、72℃で１分間の３
段階反応を３０回行った。
【００３８】PCR反応後、10 ulを分注して３％アガロー
ス電気泳動にて検定した。図２は、この実験結果とし
て、始祖トランスジェニックマウス及びその子孫マウス
が導入DNAを染色体に含んでいることを示している。M
は、DNA分子量マーカーで上から、1000、700、500+52
5、400、300、200、100、及び50 bpの泳動位置を示して
いる。鋳型DNAとして、レーン１は蒸留水、レーン２は
野生型マウス、レーン３は始祖トランスジェニックマウ
ス、レーン４は始祖トランスジェニックマウスの子孫マ
ウス、レーン５は始祖トランスジェニックマウスの別の
子孫マウス、レーン６は陽性対照として導入DNAであ
る。350 bpのAT2受容体特異的バンドが、始祖トランス
ジェニックマウス及びその子孫マウスで認められた。
【００３９】導入遺伝子の発現解析はRT-PCR法により行
った（図３）。野生型マウス及びトランスジェニックマ
ウスから、大動脈、左心室、腎臓、及び脳の組織を切除
し、常法によりtotal RNAを抽出精製した。RNA 15 ugを
使用して、上流プライマー（AT2-F3、5'-GAGTGCATGCGGG
AGCTGAGT-3', 21mer, 20 uM）と下流プライマー（AT2-R
2、5'-GGTGTCCATTTCTCTAAGAG-3', 20mer, 20 uMをもち
いてRT-PCRを行った。その結果、野生型のマウスからは
バンドが検出できなかったが、トランスジェニックマウ
スからは、各臓器とも720 bpのAT2受容体特異的バンド
が検出された。 実施例４ アンジオテンシンII持続投与後の血圧変化 アンジオテンシンII（AngII）慢性投与による覚醒時の
平均血圧の変化をトランスジェニックマウスと野生型で
比較した。AngII（0.7mg/day/Kg）はマウス背中に埋め
込んだ浸透圧ポンプを用いて慢性投与し、マウスの血圧
は尾よりtail-cuff法にて測定した（表１）。平均血圧
は野生型マウスでは2週後には38mmHgの上昇を認めた
が、血管平滑筋特異的AT2受容体発現（AT2-TG）マウス
では全く血圧は変化しなかった。これは、トランスジェ
ニックマウスでは、発現されたAT2受容体が、AngIIによ
る昇圧反応を抑制したことを示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】実施例５ アンジオテンシンIIによる摘出
大動脈の収縮性 摘出大動脈血管のAngIIによる血管収縮性をトランスジ
ェニックマウスと野生型で比較した。マウスを開腹後に
腹部大動脈を摘出し、ミオグラフを用いて0.8gの一定張
力をかけて懸垂切片を作製した。Tyrode solution（137
mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl, 1.8 mmol/LCaCl2, 1.1
mmol/L MgCl2, 0.42 mmol/L NaH2PO4,12 mmol/L NaHCO3
and 5.7 mmol/L glucose, pH 7.4）で潅流し、AngII添
加後の血管張力の変化を記録した（表２）。摘出大動脈
のAngIIによる収縮性はAT2受容体阻害薬（PD123319、1-
[[4-(Dimethylamino)-3-methylphenyl]-5-(diphenylace
tyl)-4567-tetrahydro-1H-imidazo[45-c]pyridine-6-ca
rboxylic acid, ditriflouroacetate, monohydrate、PA
RKE-DAVIS社製品、Ann Arbor, Michigan）存在下では、
非存在下に比較してAT2-TGマウスにおいて約24％増加し
ていた。
【００４２】一方、野生型マウスではPD123319による収
縮性変化は見られなかった。これは、トランスジェニッ
クマウスでは、発現されたAT2受容体が、AngIIによる摘
出血管の血管収縮性を低下させることが示された。
【００４３】
【表２】
【００４４】実施例６ アンジオテンシンIIによる摘出
大動脈のcGMP産生 次に、AngIIの血管拡張作用が、cGMPを介しているかど
うかを検証するために、摘出大動脈血管のAngIIによるc
GMP産生をトランスジェニックマウスと野生型で比較し
た。マウスを開腹後に腹部大動脈を摘出し、エタノール
中でsonicationにより均一化した大動脈抽出物を窒素乾
固し、acetylation reagent (acetic anhydride:trieth
ylamine=1:2)で処理後、抗cGMP抗体を用いてradioimmun
oasssayを行い、cGMP量を定量した（表３）。摘出大動
脈のcGMP産生量は野生型マウスではAng II+AT1拮抗薬CV
11974（AT2受容体刺激、(±)-1-(cyclohexyloxy-carbon
yloxy)ethyl-2ethoxy-1-[[2'-(1-H-tetrazol-5-yl) bip
henyl -4yl]methyl]-1H-benzimidazole-7carboxylate、
武田薬品工業（株）製品）により変化しなかったが、AT
2-TGマウス血管では105％増加した。この増加は内皮除
去、NO synthase 阻害薬（L-NAME）、bradykinin recep
tor antagonist (icatibant）で完全に抑制された。こ
れは、トランスジェニックマウスでは、発現されたAT2
受容体が、cGMP産生を有意に上昇させていること、ま
た、この上昇が内皮由来血管弛緩因子であるNO、及びbr
adykininを介していることを示した。すなわち、降圧シ
ステムとして知られているbradykinin/NO/cGMP産生系を
活性化することで、実施例５で示したように、AngIIに
よる摘出血管の血管収縮性を低下させ、降圧作用を発揮
していることが示唆された。
【００４５】
【表３】
【００４６】実施例７ アンジオテンシンIIによる摘出
大動脈のkininogenase活性 次に、血管平滑筋でkininogenからbradykininを産生す
る酵素である摘出大動脈血管kininogenaseの活性をトラ
ンスジェニックマウスと野生型で比較した。マウスを開
腹後に腹部大動脈を摘出し、プロテアーゼ阻害薬を含む
0.1Mリン酸バッファー（0.2％ bacitracin, 3mM 0-phen
anthroline, 30 mM EDTA-Na2）存在下で均一化した大動
脈抽出物を90％エタノール下で窒素乾固した。乾固物は
アンジオテンシン変換酵素阻害薬を含むバッファーで溶
解し、ウシkininogenを基質として産生されたカリクレ
インをradioimmunoasssayにて測定し、Kininogenase活
性とした（表４）。摘出大動脈のkininogenase活性は野
生型マウスではAng II+AT1拮抗薬CV11974（AT2受容体刺
激）により変化しなかったが、AT2-TGマウス血管では15
0％増加した。この増加は内皮除去、NO synthase 阻害
薬(L-NAME）、bradykinin receptor antagonist (icati
bant)で完全に抑制された。
【００４７】これは、トランスジェニックマウスでは、
発現されたAT2受容体が、AngIIによるkininogenaseの活
性化に関与することを示した。すなわち、kininogenase
がkininogenからbradykininヘの産生量を増加させるこ
とにより、降圧システムであるbradykinin/NO/cGMP産生
系を介して、実施例５で示したように、AngIIによる摘
出血管の血管収縮性を低下させ、降圧作用を発揮してい
ることが示唆された。
【００４８】
【表４】
【００４９】
【発明の効果】上記説明したとおりの技術的操作を行う
ことにより、血管組織にAT2受容体が発現されたトラン
スジェニック動物を得ることができ、これはAT2受容体
の血管生理作用及び／又は血圧調節作用の機序を研究す
るためのモデルとして有用であり、AT2受容体又はAT1受
容体の拮抗薬及び作動薬の検定システムなどの研究分野
で有用に利用できる。
【００５０】
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> Suntory Ltd. <120> Transgenic Animal Having Angiotensin II Type
2 Receptor <160> 6 <210> 1 <211> 20 <212> Primer <213> Artificial Sequence <400> GATTATGGAG ATTAGAATTC <210> 2 <211> 22 <212> Primer <213> Artificial Sequence <400> CTGGATCCGC TTCACAGGAT TC <210> 3 <211> 17 <212> Primer <213> Artificial Sequence <400> TAACGGTCAG AGGATAG <210> 4 <211> 17 <212> Primer <213> Artificial Sequence <400> TTCTGCTGGT GGCAGCA <210> 5 <211> 21 <212> Primer <213> Artificial Sequence <400> GAGTGCATGC GGGAGCTGAG T <210> 6 <211> 20 <212> Primer <213> Artificial Sequence <400> GGTGTCCATT TCTCTAAGAG
【図面の簡単な説明】
【図１】トランスジェニック動物作製用組換え遺伝子の
構築を示す模式図である。
【図２】トランスジェニック動物の尾DNAのPCR解析の結
果を示す図（電気泳動の写真）である。
【図３】トランスジェニック動物の各種組織のRT-PCR発
現解析の結果を示す図（電気泳動の写真）である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA63 BA80 CA04 CA20 DA02 DA06 EA04 FA02 GA12 GA18 HA11 4B063 QA05 QQ79 QR77 QS31 QS38 QX10 4B065 AA91X AA91Y AA93Y AB01 AC14 AC20 BA04 BA21 BA30 BD50 CA24 CA46

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】血管組織特異的にアンジオテンシンII２型
    受容体が発現することを特徴とするトランスジェニック
    動物及びその子孫。
  2. 【請求項２】血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来
    のプロモーター領域と、アンジオテンシンII２型受容体
    遺伝子とを含むトランスジェニック動物作製用組換え遺
    伝子を導入した全能性細胞を個体発生させて得られる、
    請求項１記載の血管組織特異的にアンジオテンシンII２
    型受容体が発現することを特徴とするトランスジェニッ
    ク動物及びその子孫。
  3. 【請求項３】齧歯類であることを特徴とする請求項１又
    は２記載のトランスジェニック動物及びその子孫。
  4. 【請求項４】マウスであることを特徴とする請求項３記
    載のトランスジェニック動物及びその子孫。
  5. 【請求項５】血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来
    のプロモーター領域と、アンジオテンシンII２型受容体
    遺伝子とを含むトランスジェニック動物作製用組換え遺
    伝子を全能性細胞に挿入し、当該全能性細胞を仮親動物
    に移植し、前記仮親動物を飼育出産させて所望の形質が
    発現された仔動物である始祖動物を得る工程を含む請求
    項１記載のトランスジェニック動物の作製方法。
  6. 【請求項６】プロモーター領域が血管平滑筋タンパク質
    遺伝子由来である請求項５記載のトランスジェニック動
    物の作製方法。
  7. 【請求項７】プロモーター領域が血管平滑筋α-アクチ
    ン遺伝子由来である請求項６記載のトランスジェニック
    動物の作製方法。
  8. 【請求項８】血管組織で発現するタンパク質遺伝子由来
    のプロモーター領域と、アンジオテンシンII２型受容体
    遺伝子とを含むトランスジェニック動物作製用組換え遺
    伝子。
  9. 【請求項９】プロモーター領域が血管平滑筋タンパク質
    遺伝子由来である請求項８記載の組換え遺伝子。
  10. 【請求項１０】プロモーター領域が血管平滑筋α-アク
    チン遺伝子由来である請求項８記載の組換え遺伝子。
  11. 【請求項１１】請求項１記載のトランスジェニック動物
    に由来する血管組織断片又は血管細胞。
  12. 【請求項１２】血管平滑筋組織断片である請求項１１記
    載の血管組織断片。
  13. 【請求項１３】血管平滑筋細胞である請求項１１記載の
    血管細胞。
  14. 【請求項１４】請求項１記載のトランスジェニック動物
    を用いてin vivoでアンジオテンシンII２型受容体の血
    管生理作用及び／又は血圧調節作用を解析する方法。
  15. 【請求項１５】請求項１１記載の血管組織断片又は血管
    細胞を用いてin vitroでアンジオテンシンII２型受容体
    の血管生理作用及び／又は血圧調節作用を解析する方
    法。
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