JP2000212198A - ペプチド混合物の製造法及びペプチド混合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】高濃度蛋白条件下であっても、酵素分解によっ
て不溶性沈殿物を生じることなく、分離の工程を必要と
しない高収率なペプチド混合物製造法及びペプチド混合
物を提供することを課題とする。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、植物性蛋白溶
液を界面活性剤存在下、中性からアルカリ性で加熱処理
することにより透明感のある溶解液を得た後、プロテア
ーゼを作用させることにより、不溶性沈殿物を生じない
酵素分解方法を見出し、上記の課題を達成出来た。本発
明により、得られたペプチド混合物溶液を凍結乾燥、ス
プレードライ乾燥等の種々の乾燥方法により粉末乾燥化
するか、または、RO（逆浸透）膜などで濃縮して様々な
用途に利用することができ、用途としては、化粧品、ト
レイタリー製品をはじめ、幅広い工業分野における使用
が可能になった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明はペプチド混合物の
製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、蛋白質をプロテアーゼで分解
してペプチド混合物が得られることは周知であるが、蛋
白質が高濃度になるにつれて不溶性沈殿物を生じ、生産
収率の低下を招く分離工程を必要とするものであった。
一方、蛋白質と界面活性剤との相互作用の研究は、膜か
らの蛋白質の単離、蛋白製剤の可溶化、SDS −ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（SDS −PAGE）、酵素添加洗剤
など、いくつかの分野で応用されている。しかし、一般
的にはプロテアーゼによる反応系に界面活性剤が存在す
ると、プロテアーゼ活性は阻害されるものと見なされて
おり（Ｌ．Ｋｒａｖｅｔｚ，Ｋ．Ｆ．Ｇｕｉｎ ｅｔ．
ａｌ．，ＪＡＯＣＳ，Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．５，９４３
〜９４９，１９８５）、界面活性剤存在下におけるプロ
テアーゼ作用に関する知見は少なく、その機構について
も不明な点が多い。

【０００３】最近になって、未変性卵白蛋白溶液に界面
活性剤存在下、微生物由来アルカリプロテアーゼを作用
させた報告がなされている（重田美智子ら、大阪教育大
学紀要, 43巻, 45-57 頁, 1994、同44巻, 161-178, 199
6 ）。これによると、未変性卵白蛋白の加水分解はプロ
テアーゼ単独の場合よりも界面活性剤存在下、特にアニ
オン界面活性剤存在下での方が促進されることが述べら
れている。この理由として、界面活性剤が優先的に蛋白
に吸着し、コンフォメーション（立体構造の意味）変化
を引き起こし、内部のペプチド鎖が蛋白表面により現れ
易くなるためにプロテアーゼ作用が受けやすくなるため
と考えられている。

【０００４】しかしこの研究は洗浄性の向上という観点
から、衣料用洗剤共存溶液中におけるプロテアーゼ作用
のメカニズム解明を目的としたものであり、蛋白分解ペ
プチド混合物を効率的に得ようとする様な目的のもので
はない。

【０００５】ペプチド混合物の製造法に関する特許公報
等は、数多く公開されている。関連する主要な先願とし
て、特開平９−１２１８５７号公報では、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ属微生物が産生し、界面活性剤溶液中での残存活性
が比較的高いアルカリプロテアーゼ、その製造方法、用
途及びプロテアーゼを産生する微生物について述べてい
る。しかし、ペプチド製造の実施例も無く、また蛋白質
の酵素分解時に沈澱物が生じないなどの記載は無い。一
方、特開平５−３０８９６６号公報では、アルカリプロ
テアーゼが各種の界面活性剤中で安定であり洗剤用酵素
として優れていることを述べている。しかしながら、こ
の中で積極的に界面活性剤を添加しペプチド混合物を製
造している記載は無い。不溶性沈澱物を抑制し、高収率
のペプチド混合物を製造する目的で界面活性剤を利用し
た本発明とは全く異なるものである。このように蛋白質
を酵素で加水分解する際に生じる不溶性沈殿物は、その
後の分離工程を必要とするため、工業生産において収率
低下を招いている。またこの時生じる不溶性沈殿物は一
般に動物性蛋白質よりも植物性蛋白質で、また蛋白濃度
の上昇に伴い更に増大し、収率低下をきたすことが知ら
れている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】高濃度蛋白条件下であ
っても、酵素分解によって不溶性沈殿物を生じることな
く、分離の工程を必要としない高収率なペプチド混合物
製造法を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決すべく鋭意検討を重ねた結果、植物性蛋白溶液乃至ペ
ーストを界面活性剤存在下、中性からアルカリ性で加熱
処理することにより透明感のある溶解液を得た後、プロ
テアーゼを作用させることにより、不溶性沈殿物を生じ
ない酵素分解方法を見出し、本発明に至った。本発明
は、植物性蛋白溶液乃至ペーストを界面活性剤存在下、
中性からアルカリ性で加熱処理を行った後、プロテアー
ゼを作用させることを特徴とする植物性蛋白分解ペプチ
ド混合物の製造法である。更に詳しくは、界面活性剤は
親水性部分がスルホン酸型または硫酸エステル型もしく
はカルボン酸型であるアニオン系界面活性剤が好まし
く、加熱処理時のｐＨ条件は７〜１２の範囲が好まし
い。また、本発明は以上の製造法により得られるペプチ
ド混合物である。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する
と、 本発明におけるペプチド混合物の製造法において
は、植物性蛋白質からその蛋白質分解酵素を用いてペプ
チド混合物を得る工程において、蛋白質濃度が高くなる
と共に生成・増大する不溶性沈澱物を防ぎ、よって沈澱
物の分離工程を省略して、ペプチド混合物の収率を極大
にする方法を提供することに関する。

【０００９】本発明で用いる用語を説明する。植物性蛋
白質は、豆類（大豆、小豆、エンドウ豆、などが例示出
来る）、穀類（米、麦、トウモロコシ、などが例示）、
ナッツ類（ピーナッ、カシューナッツ、ピスタチオ、が
例示）などを由来とする蛋白質が例示される。界面活性
剤は、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性
界面活性剤、非イオン性界面活性剤の種々の界面活性剤
があるが、とりわけアニオン界面活性剤が蛋白質溶液を
透明感のある溶解液にするには有効である。この様なア
ニオン界面活性剤としては、ジアルキルスルホこはく酸
塩、アルカンスルホン酸塩、アルファオレフィンスルホ
ン酸塩、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル
ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレインスルホン
酸塩、ナフタレインスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮
合物、N −メチル−N −アシルタウリン塩など親水性部
分がスルホン酸型であるものや、アルキル硫酸塩、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、油脂硫酸エス
テル塩など親水性部分が硫酸エステル型であるもの、更
にはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩など親
水性部分がカルボン酸型である界面活性剤が挙げられ
る。中性からアルカリ性のｐＨは７〜１２、より好まし
くは７．５〜１０．０がよい。

【００１０】プロテアーゼとしては、前処理としての蛋
白溶液の加熱処理を中性からアルカリ性で行うことか
ら、工程上はこの領域で活性を持つものを選択する方が
好ましい。この様なプロテアーゼとして、バシラス属や
スタフィロコッカス属等の細菌由来のもの、アスペルギ
ルスやリゾプス属の様なカビ由来のもの、パパイン、ブ
ロメライン等の植物由来のもの、トリプシン等動物由来
のもの等が例示される。ペプチドとは、アミノ酸がペプ
チド結合によって２個以上共有結合したものを言うが、
ここで言うペプチド混合物は、蛋白質の加水分解物を意
味し、分子量５０，０００以下の、とりわけ２００弱〜
２０，０００程度のものが主成分である。加熱処理は、
植物性蛋白質の溶液・ペースト・水和物を加熱出来る処
理・方法であればよく、例えば回分式のジャケットによ
る加熱や高温短時間で直接に水蒸気を吹き込む直接方式
やプレート式熱交換を行う間接加熱方式等のＵＨＴ法、
また、マイクロ波、レトルト処理、通電加熱などが挙げ
られる。

【００１１】蛋白質の定量は公知のケルダール法又はそ
れに準ずる方法で、Ｎ（窒素）量を定量し、窒素係数
（６．２５）を乗じて算出する。

【００１２】本発明は、蛋白溶液を界面活性剤が存在
下、中性からアルカリ性で、蛋白質が可溶化するのに必
要で褐変などの品質劣化の少ない範囲（８０℃から１４
５℃でＦ値＝０．００１〜４０）で加熱処理した後、続
いて各種プロテアーゼを用いて酵素分解を行うことによ
り、酵素分解時に不溶性沈殿物を生じず、そのためにそ
の後の分離工程を必要としないペプチド混合物の製造法
である。

【００１３】植物性蛋白質の濃度はｐＨや還元剤使用の
有無により一概には言えないが、従来技術の場合よりも
高い蛋白質濃度を用いることが出来る。例示として大豆
蛋白質の場合、１３％又はそれ以上の濃度も用い得る。
植物性蛋白質の種類によりその溶液粘度が異なるので、
蛋白質分解酵素反応が出来る粘度を示す濃度であれば良
い。界面活性剤の量は、加熱処理して蛋白溶液乃至ペー
ストを透明乃至半透明にする量であり、通常０．０１〜
５％の範囲でよい。

【００１４】加熱処理時のｐＨは７〜１２の中性からア
ルカリ性で蛋白溶液を有効に透明感のある溶解液にする
ことが出来る。好ましくはｐＨ７．５〜１０の範囲であ
る。ｐＨが低いと蛋白溶液の透明感が悪くなり、これは
５% 以上の蛋白溶液では特に顕著になる。逆にｐＨが１
２を超えると透明感は増すが変色、変臭等の化学変化を
伴うために好ましくはない。以上の点から、ｐＨ７. ５
〜１０の条件で加熱処理を行うのが、透明感のある溶解
性および品質の面から、より好ましい。また、必要に応
じて、この加熱処理時に亜硫酸水素ナトリウム（SBS と
略記した）やメルカプトエタノールなどの還元剤を使用
可能な範囲内で用いることにより、蛋白溶液の透明感の
ある溶解性を一層高めることができ、より高濃度の蛋白
溶液を分解することが出来る。

【００１５】続いて、このようにして得られた透明感の
ある溶解液を各種プロテアーゼで加水分解することが可
能である。プロテアーゼによる加水分解の方法は、特に
限定しないが、植物性蛋白質を含む溶液・ペースト・水
和物からペプチド混合物を得る方法・装置であればよ
く、一般的なバッチ法の他に、連続的なリアクター、膜
型リアクターなどを用いることも出来る。プロテアーゼ
の使用量は、使用するプロテアーゼの活性や蛋白質の分
解条件（基質、ｐＨ、温度、時間など）にもよるが、一
般的な目安の例示として酵素活性を考慮して溶液中の基
質である蛋白質濃度の０．０１％以上から５％以下で良
い。プロテアーゼによる加水分解の時間は特に限定しな
いが、植物性蛋白質を含む溶液・ペースト・水和物から
ペプチド混合物を得る時間であればよく、目安の例示と
して１時間から１０時間程度が適当な時間である。

【００１６】本発明により、通常酵素分解反応中に見受
けられる不溶性沈殿物の生成を抑えることができ、酵素
分解後の不溶化沈殿物の分離工程を経ずに、ほぼ全ての
酵素分解ペプチド混合物をそのまま利用することができ
る。本発明により得られたペプチド混合物液は、必要に
応じて遠心分離、MF（精密濾過）膜、UF（限外濾過）膜
などによる精製や電気透析等による脱塩を行った後に、
凍結乾燥、スプレードライ乾燥等の種々の乾燥方法によ
り粉末乾燥化するか、または、RO（逆浸透）膜などで濃
縮して様々な用途に利用することができる。用途として
は、化粧品、トレイタリー製品をはじめ、その他幅広い
工業分野における使用が考えられる。

【００１７】

【実施例】以下に本発明の有効性を実施例と共に示す
が、 これらの例示によって本発明の技術思想が限定され
るものではない。

【００１８】調製例１分離大豆蛋白（フジプロR 、不二
製油社製）の5%溶液を調製し、これに種々の界面活性剤
を1%濃度となる様に添加して十分攪拌した後、酸・アル
カリでｐＨ８．０に調整した溶液を煮沸加熱し、溶液の
透明度を肉眼で観察した。界面活性剤は、アニオン界面
活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエ
チレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ラウリルベン
ゼンスルホン酸ナトリウム、α−オレフィンスルホン酸
ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸
ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン
酸ナトリウム、カチオン界面活性剤として、塩化ラウリ
ルトリメチルアンモニウム、ノニオン界面活性剤とし
て、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、モノオレイ
ン酸ポリオキシエチレンソルビタンを用いた。その結
果、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウ
リルエーテル硫酸ナトリウムまたはポリオキシエチレン
ラウリルエーテル酢酸ナトリウムを添加したものではほ
ぼ完全に透明溶液が得られた。また、ラウリルベンゼン
スルホン酸ナトリウムまたはα−オレフィンスルホン酸
ナトリウムを添加したものは、ややくすみ感があるもの
の、透明感のある溶液が得られた。一方、その他カチオ
ン界面活性剤、ノニオン界面活性剤を添加したものは透
明性に劣るものであった。以上の結果から、アニオン界
面活性剤が蛋白溶液の可溶化に有効であり、とりわけ親
水性部分がスルホン酸型、硫酸エステル型またはカルボ
ン酸型であるアニオン系界面活性剤が効力を発揮するこ
とが分かった。

【００１９】実施例１ ５．０% 〜１２. ５% 濃度の分離大豆蛋白（フジプロ
Ｒ、不二製油社製）の懸濁液を調製し、これに界面活性
剤としてポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナト
リウム（日光ケミカル社製）を１% 濃度となる様に添加
して十分攪拌した後、ｐＨ７〜９に調整し、UHT 加熱処
理（１４１℃、１０秒）による蛋白溶液の可溶化を行っ
た。また、この時、UHT 加熱処理前に蛋白に対して０.
１% の亜硫酸水素ナトリウム（SBS ）を加えたものにつ
いても同様の操作を行った。得られた加熱処理後の各蛋
白溶液について肉眼観察を行った。その結果、界面活性
剤を添加した蛋白溶液のｐＨを中性からアルカリ性に調
整した後、UHT 加熱処理を行うことにより、蛋白溶液の
可溶化に、より効果的であり、より高濃度な蛋白溶液を
可溶化することができる。また、亜硫酸水素ナトリウム
の様な還元剤の添加は一層この効果を向上させることが
分かった。肉眼観察の結果を表１に示した。

【００２０】 表１ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ｐＨ７区 ｐＨ８区 ｐＨ９区 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 分離大豆蛋白濃度 SBS添加量 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ５. ０% 0 % 半透明 透明 透明 ５. ０% SBS 添加50ppm 透明 透明 透明 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ７. ５% ０% 不透明 透明 透明 ７. ５% SBS 添加75ppm 半透明 透明 透明 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １０. ０% ０% 不透明 半透明 透明 １０. ０% SBS 添加100ppm 半透明 透明 透明 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １２. ５% ０% 不透明 不透明 半透明 １２. ５% SBS 添加125ppm 不透明 半透明 透明 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００２１】実施例２ 分離大豆蛋白（フジプロR、不二製油社製）１kgに水道
水約１８kgを加え、ホモゲナイザーで十分に懸濁する。
この懸濁液に、界面活性剤としてポリオキシエチレンラ
ウリルエーテル硫酸ナトリウム（日光ケミカル社製）を
終濃度１% 、また還元剤として、亜硫酸水素ナトリウム
を蛋白質に対し０. １% となるように添加し、５Ｎ水酸
化ナトリウムでｐＨ９となる様に調整した。さらにこの
溶液をUHT加熱処理（１４１℃、７秒）を行うことによ
り、透明感のある４．９％大豆蛋白溶液１９．２ｋｇを
得た。続いて、この透明な大豆蛋白溶液５ｋｇを用い
て、Bacillus Subtilus 起源のエンド型プロテアーゼ
を蛋白に対し１% 加え、５０℃で５時間酵素による分解
を行った。このとき、酵素分解反応中に通常見られる不
溶性沈殿物は現れることなく、５時間反応後も透明溶液
の状態を保っていた。得られた酵素分解液の分子量分布
を、ゲル濾過HPLC分析により調べた結果を図１に示し
た。また、2, 4, 6 −トリニトロベンゼンスルホン酸ナ
トリウム（TNBS）によるアミノ態窒素量の測定から、ペ
プチド混合物の平均分子量は５８０であった。更に、こ
の反応液を完全に清澄な酵素分解液にするために遠心分
離した時の収率は９８% であった。

【００２２】実施例３ 実施例２で用いた、ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル硫酸ナトリウムの代わりにポリオキシエチレンラウリ
ルエーテル酢酸ナトリウム（第一工業製薬社製）を用い
る以外は実施例１の方法により清澄な酵素分解液を得
た。この時の収率は９８% 、平均分子量は５９５であっ
た。

【００２３】比較例１ 先の実施例において、界面活性剤の代わりに水を加えた
大豆蛋白懸濁液について、同様にUHT 加熱処理を行うこ
とにより、白濁不透明な約５% 大豆蛋白溶液を得た。こ
の白濁不透明な大豆蛋白溶液５Ｌを用いて、Bacillus
Subtilus 起源のアルカリプロテアーゼを蛋白に対し１
% 加え、５０℃で５時間酵素分解を行った。このとき、
酵素分解反応中に明らかな不溶性沈殿物の生成が観察さ
れた。得られた酵素分解液の分子量分布を、ゲル濾過HP
LC分析により調べた結果を図１に示した。またTNBSによ
るアミノ態窒素量の測定から、ペプチド混合物の平均分
子量は６６１であった。更に、反応液を遠心分離によ
り、酵素分解に伴う不溶性沈殿物を除去し、完全に清澄
な酵素分解液を得た。この時の収率は約６５% であっ
た。

【００２４】

【発明の効果】本発明により、懸濁状で不透明な蛋白溶
液を透明な可溶化液にすることができ、続いてこの溶解
液のプロテアーゼによる分解反応で不溶性沈殿物を生じ
ることなく、透明な溶液のままで分解反応を行うことが
できる。よって、不溶性沈殿物の除去による収率低下を
招くことなく、１００% 近い高収率で完全に清澄なペプ
チド混合物溶液を得ることが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１及び比較例１で得られた各酵
素分解物（分離前）のゲル濾過ＨＰＬＣ分析チャート
で、各分子量の分布を示したものである。このチャート
は、ペプチド高分子成分が実施例で、より分解している
ことを示している。ＨＰＬＣ分析条件は、次の通りであ
る。 カラム：TSKgelG3000XL （7.8 ×300 ） 移動相：1%SDS ／0.2MNaCl／25mM ナトリウムリン酸緩
衝液 (ｐＨ6.8) 流速：0.8ml ／min 検出：OD 220nm

フロントページの続き Ｆターム(参考） 4H045 AA20 CA31 CA33 EA15 FA70 GA01 HA02 HA30

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】植物性蛋白溶液乃至ペーストを界面活性剤
   存在下、中性からアルカリ性で加熱処理を行った後、プ
   ロテアーゼを作用させることを特徴とする植物性蛋白分
   解ペプチド混合物の製造法。
2. 【請求項２】界面活性剤の親水性部分がスルホン酸型ま
   たは硫酸エステル型もしくはカルボン酸型であるアニオ
   ン系界面活性剤による請求項１に記載の製造法。
3. 【請求項３】加熱処理時のｐＨが７〜１２の範囲である
   請求項１から請求項２に記載の製造法。
4. 【請求項４】請求項１から請求項３までのいずれかに記
   載の製造法により得られるペプチド混合物。