JP2000175680A - 高クロロフィル含有耐塩性クロレラ - Google Patents
高クロロフィル含有耐塩性クロレラInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 クロロフィル含量が高く、養魚用ワムシの餌
とした場合、海水から食物連鎖で濃縮されるダイオキシ
ン類等の環境汚染物質での汚染が減少した養殖魚類を供
給することができ、かつ海水中での生存期間が長く海面
養殖飼料、水産飼料等に適した高クロロフィル含有耐塩
性クロレラを提供すること。 【解決手段】 クロレラに、複数回の紫外線照射による
変異処理及びメタンスルホン酸エステルもしくはアクリ
フラビン等の変異薬剤による変異処理を施し、塩化ナト
リウム１重量％以上を含む培地で生育可能かつ全クロロ
フィル含有量が乾燥重量にて４％以上の高クロロフィル
含有耐塩性クロレラ属変異株を作出する。
とした場合、海水から食物連鎖で濃縮されるダイオキシ
ン類等の環境汚染物質での汚染が減少した養殖魚類を供
給することができ、かつ海水中での生存期間が長く海面
養殖飼料、水産飼料等に適した高クロロフィル含有耐塩
性クロレラを提供すること。 【解決手段】 クロレラに、複数回の紫外線照射による
変異処理及びメタンスルホン酸エステルもしくはアクリ
フラビン等の変異薬剤による変異処理を施し、塩化ナト
リウム１重量％以上を含む培地で生育可能かつ全クロロ
フィル含有量が乾燥重量にて４％以上の高クロロフィル
含有耐塩性クロレラ属変異株を作出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、食品の着色素材で
あり、かつ抗胃潰瘍作用、抗アレルギー作用、抗脳血管
性障害作用、消臭作用、抗変異原作用、ダイオキシン類
排泄促進作用等の機能を有するクロロフィルを高濃度に
含有し、健康食品、機能性食品、医薬原材料として優
れ、かつ海水中での生存期間が長く海面養殖飼料、水産
飼料等に適した高クロロフィル含有耐塩性クロレラ等に
関する。
あり、かつ抗胃潰瘍作用、抗アレルギー作用、抗脳血管
性障害作用、消臭作用、抗変異原作用、ダイオキシン類
排泄促進作用等の機能を有するクロロフィルを高濃度に
含有し、健康食品、機能性食品、医薬原材料として優
れ、かつ海水中での生存期間が長く海面養殖飼料、水産
飼料等に適した高クロロフィル含有耐塩性クロレラ等に
関する。
【０００２】
【従来の技術】クロレラは、クロロコックム目に属する
単細胞緑藻であり、生育速度が比較的速く、タンパク質
含量が高く、必須アミノ酸であるリジン等を多く含むた
め、健康食品源あるいは養魚用ワムシの餌として従来か
ら大量に培養されている。また、クロレラに含まれるク
ロロフィルには、従来報告されている抗胃潰瘍作用、抗
肝障害作用、抗アレルギー作用、抗脳血管性障害作用、
消臭作用の他に、抗変異原作用やダイオキシン類排泄促
進作用もあることが最近報告されている（「食品と開
発」VOL.33,NO.8,1998,p18-20）。この報告によると、
環境汚染物質として最も問題になっているダイオキシン
類をヒトが体内に取り込むのは、９０％以上が食物から
の摂取であり、殊に海水から食物連鎖で濃縮された魚介
類からの摂取はその６０％にもなっており、またダイオ
キシン類は一般に小腸からの吸収率が高く代謝されにく
いので脂肪組織や肝臓に蓄積されていくとされている。
単細胞緑藻であり、生育速度が比較的速く、タンパク質
含量が高く、必須アミノ酸であるリジン等を多く含むた
め、健康食品源あるいは養魚用ワムシの餌として従来か
ら大量に培養されている。また、クロレラに含まれるク
ロロフィルには、従来報告されている抗胃潰瘍作用、抗
肝障害作用、抗アレルギー作用、抗脳血管性障害作用、
消臭作用の他に、抗変異原作用やダイオキシン類排泄促
進作用もあることが最近報告されている（「食品と開
発」VOL.33,NO.8,1998,p18-20）。この報告によると、
環境汚染物質として最も問題になっているダイオキシン
類をヒトが体内に取り込むのは、９０％以上が食物から
の摂取であり、殊に海水から食物連鎖で濃縮された魚介
類からの摂取はその６０％にもなっており、またダイオ
キシン類は一般に小腸からの吸収率が高く代謝されにく
いので脂肪組織や肝臓に蓄積されていくとされている。
【０００３】他方、従来クロレラ中のクロロフィル含量
を高める技術としては、培養液中の溶存酸素濃度を０．
５から６ｐｐｍの範囲で調節し、培養液をｐＨ５．５か
ら７．５の範囲に調節し、蛋白質の加水分解物或いはア
ミノ酸を０．１ｍｇ〜０．５ｇ／培地Ｌの範囲で添加
し、且つ連続培養液のグルコースの量を１０〜４０ｍｇ
／培地Ｌに調整して、クロレラを光照射なしにタンク内
で培養する培養方法による技術（特公昭５８−４０４６
２号公報）や、クロレラを紫外線照射処理することによ
って、全クロロフィル含有量が乾燥重量にて３％以上で
ある高クロロフィル含有クロレラを作出する変異処理に
よる技術（特許第２６２００４５号公報）が知られてい
る。しかし、この全クロロフィル含有量が３％以上の高
クロロフィル含有性クロレラ属変異株は塩化ナトリウム
含有培地で生育できないものであった。
を高める技術としては、培養液中の溶存酸素濃度を０．
５から６ｐｐｍの範囲で調節し、培養液をｐＨ５．５か
ら７．５の範囲に調節し、蛋白質の加水分解物或いはア
ミノ酸を０．１ｍｇ〜０．５ｇ／培地Ｌの範囲で添加
し、且つ連続培養液のグルコースの量を１０〜４０ｍｇ
／培地Ｌに調整して、クロレラを光照射なしにタンク内
で培養する培養方法による技術（特公昭５８−４０４６
２号公報）や、クロレラを紫外線照射処理することによ
って、全クロロフィル含有量が乾燥重量にて３％以上で
ある高クロロフィル含有クロレラを作出する変異処理に
よる技術（特許第２６２００４５号公報）が知られてい
る。しかし、この全クロロフィル含有量が３％以上の高
クロロフィル含有性クロレラ属変異株は塩化ナトリウム
含有培地で生育できないものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】最近の環境ホルモンへ
の関心の高まりから、ダイオキシン類等の環境汚染物質
で汚染されていない安全な食品や食品素材が求められて
いる。ワムシ等を餌とし海水で養殖されている魚類もそ
の例外でなく、海水から食物連鎖で濃縮されたダイオキ
シン類等の環境汚染物質での汚染が少ない魚類への期待
が大きくなっている。かかる養殖魚類を供給するために
は、その餌であるワムシ等の餌となるクロレラとして、
抗変異原作用やダイオキシン類排泄促進作用を有するク
ロロフィル含量の高いクロレラを用いることが有効であ
る。
の関心の高まりから、ダイオキシン類等の環境汚染物質
で汚染されていない安全な食品や食品素材が求められて
いる。ワムシ等を餌とし海水で養殖されている魚類もそ
の例外でなく、海水から食物連鎖で濃縮されたダイオキ
シン類等の環境汚染物質での汚染が少ない魚類への期待
が大きくなっている。かかる養殖魚類を供給するために
は、その餌であるワムシ等の餌となるクロレラとして、
抗変異原作用やダイオキシン類排泄促進作用を有するク
ロロフィル含量の高いクロレラを用いることが有効であ
る。
【０００５】他方、水産飼料として実際にクロレラを利
用する場合、海面に撒かれたクロレラはシオミズツボワ
ムシ等の生き餌となるが、耐塩性をもたないクロレラを
海面に撒くと海水中で生育することができないことから
次第に死滅し、養魚用ワムシ等の餌として当初の期待以
下となるばかりか、死滅したクロレラが残餌となるた
め、水質を悪化させる可能性が高く、このため、従来の
クロレラは多少クロロフィル含量が高いものであって
も、水産飼料としての有用性の面で満足できるものでは
なかった。そして、クロレラに耐塩性をもたせ、海水に
適応させることは従来知られていなかった。
用する場合、海面に撒かれたクロレラはシオミズツボワ
ムシ等の生き餌となるが、耐塩性をもたないクロレラを
海面に撒くと海水中で生育することができないことから
次第に死滅し、養魚用ワムシ等の餌として当初の期待以
下となるばかりか、死滅したクロレラが残餌となるた
め、水質を悪化させる可能性が高く、このため、従来の
クロレラは多少クロロフィル含量が高いものであって
も、水産飼料としての有用性の面で満足できるものでは
なかった。そして、クロレラに耐塩性をもたせ、海水に
適応させることは従来知られていなかった。
【０００６】本発明の課題は、クロロフィル含量が高
く、養魚用ワムシの餌とした場合、海水から食物連鎖で
濃縮されるダイオキシン類等の環境汚染物質での汚染が
減少した養殖魚類を供給することができ、かつ海水中で
の生存期間が長く海面養殖飼料、水産飼料等に適した高
クロロフィル含有耐塩性クロレラを提供することにあ
る。
く、養魚用ワムシの餌とした場合、海水から食物連鎖で
濃縮されるダイオキシン類等の環境汚染物質での汚染が
減少した養殖魚類を供給することができ、かつ海水中で
の生存期間が長く海面養殖飼料、水産飼料等に適した高
クロロフィル含有耐塩性クロレラを提供することにあ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めには、高クロロフィル含量と耐塩性という２つの性質
を併せもつクロレラを作出すればよいとの知見に辿り着
いた本発明者は、クロレラに紫外線処理及びアクリフラ
ビン処理を施すことにより、海水で生育可能で、かつク
ロロフィルを高濃度で含有するクロレラを再現性よく作
出することができることを見い出し、本発明を完成する
に至った。
めには、高クロロフィル含量と耐塩性という２つの性質
を併せもつクロレラを作出すればよいとの知見に辿り着
いた本発明者は、クロレラに紫外線処理及びアクリフラ
ビン処理を施すことにより、海水で生育可能で、かつク
ロロフィルを高濃度で含有するクロレラを再現性よく作
出することができることを見い出し、本発明を完成する
に至った。
【０００８】すなわち本発明は、塩化ナトリウム１重量
％以上を含む培地で生育可能で、かつ親株より全クロロ
フィル含有量が高いことを特徴とする高クロロフィル含
有耐塩性クロレラ（請求項１）や、塩化ナトリウム１重
量％以上を含む培地で生育可能で、かつ全クロロフィル
含有量が乾燥重量にて４％以上であることを特徴とする
高クロロフィル含有耐塩性クロレラ（請求項２）や、ク
ロレラが、クロレラ属に属する変異株Ｍ−２０７Ａ７で
あることを特徴とする上記高クロロフィル含有耐塩性ク
ロレラ（請求項３）や、変異処理を施すことによって得
られることを特徴とする塩化ナトリウム１重量％以上を
含む培地で生育可能な耐塩性クロレラ（請求項４）や、
全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上であるこ
とを特徴とする高クロロフィル含有クロレラ（請求項
５）に関する。
％以上を含む培地で生育可能で、かつ親株より全クロロ
フィル含有量が高いことを特徴とする高クロロフィル含
有耐塩性クロレラ（請求項１）や、塩化ナトリウム１重
量％以上を含む培地で生育可能で、かつ全クロロフィル
含有量が乾燥重量にて４％以上であることを特徴とする
高クロロフィル含有耐塩性クロレラ（請求項２）や、ク
ロレラが、クロレラ属に属する変異株Ｍ−２０７Ａ７で
あることを特徴とする上記高クロロフィル含有耐塩性ク
ロレラ（請求項３）や、変異処理を施すことによって得
られることを特徴とする塩化ナトリウム１重量％以上を
含む培地で生育可能な耐塩性クロレラ（請求項４）や、
全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上であるこ
とを特徴とする高クロロフィル含有クロレラ（請求項
５）に関する。
【０００９】また本発明は、上記のクロレラを従属栄養
的培養方法により培養し、耐塩性及び／又は高クロロフ
ィル含量のクロレラ藻体を採取することを特徴とするク
ロレラ藻体の製造法（請求項６）や、上記高クロロフィ
ル含有耐塩性クロレラや耐塩性クロレラを有効成分とす
ることを特徴とする水産飼料（請求項７）や、クロレラ
に、紫外線照射による変異処理及びメタンスルホン酸エ
ステルもしくはアクリフラビンによる変異処理を施すこ
とを特徴とする変異株の作出方法（請求項８）や、変異
株が、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可
能かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上の
高クロロフィル含有耐塩性クロレラ属変異株であること
を特徴とする上記変異株の作出方法（請求項９）に関す
る。
的培養方法により培養し、耐塩性及び／又は高クロロフ
ィル含量のクロレラ藻体を採取することを特徴とするク
ロレラ藻体の製造法（請求項６）や、上記高クロロフィ
ル含有耐塩性クロレラや耐塩性クロレラを有効成分とす
ることを特徴とする水産飼料（請求項７）や、クロレラ
に、紫外線照射による変異処理及びメタンスルホン酸エ
ステルもしくはアクリフラビンによる変異処理を施すこ
とを特徴とする変異株の作出方法（請求項８）や、変異
株が、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可
能かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上の
高クロロフィル含有耐塩性クロレラ属変異株であること
を特徴とする上記変異株の作出方法（請求項９）に関す
る。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の高クロロフィル含有耐塩
性クロレラ、耐塩性クロレラ又は高クロロフィル含有ク
ロレラは親クロレラ株に変異処理を施すことによって作
出することができる。かかる変異処理としては、紫外線
照射及び／又は変異薬剤による変異処理を挙げることが
できる。
性クロレラ、耐塩性クロレラ又は高クロロフィル含有ク
ロレラは親クロレラ株に変異処理を施すことによって作
出することができる。かかる変異処理としては、紫外線
照射及び／又は変異薬剤による変異処理を挙げることが
できる。
【００１１】本発明においてクロレラとは、クロロコッ
クム目のクロレラ（Chlorella）属に属する単細胞緑藻
をいい、変異処理に付される親クロレラ株としては、例
えば湖沼から採取した水ならびに砂泥から分離されるク
ロレラ野生株や、保存株であってもよく、これらクロレ
ラ属に属するクロレラとして、クロレラ・ソロキニアナ
（C.sorokiniana）、クロレラ・ブルガリス（C.vulgari
s）、クロレラ・エリプソイディア（C.ellipsoidea）、
クロレラ・ルテオビリディス（C.luteoviridis）、クロ
レラ・プロトセコイディス（C.protothecoides）、クロ
レラ・ゾフィンギエンシス（C.zopfingiensis）、クロ
レラ・バイエガータ（C.vaiegata）、クロレラ・キサン
セーラ（C.xanthella）、クロレラ・サッカロフィリア
（C.saccharophilia）、クロレラ・ミニアータ（C.mini
ata）等を例示することができる。
クム目のクロレラ（Chlorella）属に属する単細胞緑藻
をいい、変異処理に付される親クロレラ株としては、例
えば湖沼から採取した水ならびに砂泥から分離されるク
ロレラ野生株や、保存株であってもよく、これらクロレ
ラ属に属するクロレラとして、クロレラ・ソロキニアナ
（C.sorokiniana）、クロレラ・ブルガリス（C.vulgari
s）、クロレラ・エリプソイディア（C.ellipsoidea）、
クロレラ・ルテオビリディス（C.luteoviridis）、クロ
レラ・プロトセコイディス（C.protothecoides）、クロ
レラ・ゾフィンギエンシス（C.zopfingiensis）、クロ
レラ・バイエガータ（C.vaiegata）、クロレラ・キサン
セーラ（C.xanthella）、クロレラ・サッカロフィリア
（C.saccharophilia）、クロレラ・ミニアータ（C.mini
ata）等を例示することができる。
【００１２】また、親株と変異株共に、有機物を炭素源
とする従属栄養増殖で培養可能なクロレラ株が好まし
い。かかるクロレラ株の培養用培地ならびに変異株の選
択培養用培地としては、クロレラ株が増殖しうるもので
あればどのような培地でもよく、ＹＭブロス液又は第１
表に組成を示すＹＭ寒天培地（いずれもDifco社製）や
第２表に組成を示すクロレラ培養用培地を例示すること
ができる。
とする従属栄養増殖で培養可能なクロレラ株が好まし
い。かかるクロレラ株の培養用培地ならびに変異株の選
択培養用培地としては、クロレラ株が増殖しうるもので
あればどのような培地でもよく、ＹＭブロス液又は第１
表に組成を示すＹＭ寒天培地（いずれもDifco社製）や
第２表に組成を示すクロレラ培養用培地を例示すること
ができる。
【００１３】
【表１】
【００１４】
【表２】
【００１５】紫外線照射による変異処理は、親株から目
的とする変異株が得られるのであればどのような変異処
理でもよく、かかる紫外線照射による変異処理として
は、例えば波長２５４ｎｍを有する紫外線ランプによる
照射を用いる処理方法を例示することができる。紫外線
照射による変異は、図１に示すように、例えば４〜１０
ｋｅｒｇ／ｍｍ2 の範囲の紫外線照射量で行うと目的と
する変異株が比較的得られやすい。また、複数回照射の
方が一回照射より効率よく目的とする変異株を得ること
ができる場合が多い。
的とする変異株が得られるのであればどのような変異処
理でもよく、かかる紫外線照射による変異処理として
は、例えば波長２５４ｎｍを有する紫外線ランプによる
照射を用いる処理方法を例示することができる。紫外線
照射による変異は、図１に示すように、例えば４〜１０
ｋｅｒｇ／ｍｍ2 の範囲の紫外線照射量で行うと目的と
する変異株が比較的得られやすい。また、複数回照射の
方が一回照射より効率よく目的とする変異株を得ること
ができる場合が多い。
【００１６】また、変異薬剤による変異処理は、親株か
ら目的とする変異株が得られる変異処理であればどのよ
うなものでもよく、かかる変異薬剤による変異処理とし
ては、例えばメタンスルホン酸エステル、アクリフラビ
ン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジ
ン、５−ブロモウラシル、ヒドロキシルアミン等の変異
薬剤を用いる処理方法を例示することができるが、これ
らの中でも、特にメタンスルホン酸エステルやアクリフ
ラビンが目的とするクロレラ変異株を作出する上で好ま
しい。これら変異薬剤の処理濃度や処理時間は、親株か
ら目的とする変異株が効率よく得られるように、変異薬
剤の種類に応じて適宜設定することができるが、通常１
〜５００ｐｐｍの濃度で１０〜６０分間の条件で処理さ
れる。例えばメタンスルホン酸エステルやアクリフラビ
ンの処理濃度は、それぞれ２０〜２００ｐｐｍ、５〜５
０ｐｐｍが好ましい。
ら目的とする変異株が得られる変異処理であればどのよ
うなものでもよく、かかる変異薬剤による変異処理とし
ては、例えばメタンスルホン酸エステル、アクリフラビ
ン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジ
ン、５−ブロモウラシル、ヒドロキシルアミン等の変異
薬剤を用いる処理方法を例示することができるが、これ
らの中でも、特にメタンスルホン酸エステルやアクリフ
ラビンが目的とするクロレラ変異株を作出する上で好ま
しい。これら変異薬剤の処理濃度や処理時間は、親株か
ら目的とする変異株が効率よく得られるように、変異薬
剤の種類に応じて適宜設定することができるが、通常１
〜５００ｐｐｍの濃度で１０〜６０分間の条件で処理さ
れる。例えばメタンスルホン酸エステルやアクリフラビ
ンの処理濃度は、それぞれ２０〜２００ｐｐｍ、５〜５
０ｐｐｍが好ましい。
【００１７】さらに、紫外線照射による変異処理と変異
薬剤による変異処理を併用することが特に好ましい。例
えば本発明の、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地
で生育可能な耐塩性クロレラや塩化ナトリウム１重量％
以上を含む培地で生育可能で、かつ親株より全クロロフ
ィル含有量が高い高クロロフィル含有耐塩性クロレラ、
殊に塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能
で、かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上
である高クロロフィル含有耐塩性クロレラは、紫外線照
射による変異処理だけでは再現性をもって作出すること
は殆ど困難であるが、複数回の紫外線処理と、メタンス
ルホン酸エステルやアクリフラビン等の変異薬剤による
変異処理とを併用することにより、再現性よく作出する
ことができる。また、本発明者らによると、これら耐塩
性株の選抜率はおよそ１／１０6であることが実験によ
り確かめられている。
薬剤による変異処理を併用することが特に好ましい。例
えば本発明の、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地
で生育可能な耐塩性クロレラや塩化ナトリウム１重量％
以上を含む培地で生育可能で、かつ親株より全クロロフ
ィル含有量が高い高クロロフィル含有耐塩性クロレラ、
殊に塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地で生育可能
で、かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上
である高クロロフィル含有耐塩性クロレラは、紫外線照
射による変異処理だけでは再現性をもって作出すること
は殆ど困難であるが、複数回の紫外線処理と、メタンス
ルホン酸エステルやアクリフラビン等の変異薬剤による
変異処理とを併用することにより、再現性よく作出する
ことができる。また、本発明者らによると、これら耐塩
性株の選抜率はおよそ１／１０6であることが実験によ
り確かめられている。
【００１８】そして、２回の紫外線処理とアクリフラビ
ンによる変異処理とを併用することにより、塩化ナトリ
ウム１重量％以上を含む培地で生育可能で、かつ全クロ
ロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上である高クロロ
フィル含有耐塩性クロレラの一例として、クロレラ属に
属する変異株であるＭ−２０７Ａ７株を作出した。この
Ｍ−２０７Ａ７株は、群馬県高崎市宮原町３ 麒麟麦酒
株式会社応用開発センター内に保存され、特許法第２７
条の３の規定に準じて分譲されるものである。
ンによる変異処理とを併用することにより、塩化ナトリ
ウム１重量％以上を含む培地で生育可能で、かつ全クロ
ロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上である高クロロ
フィル含有耐塩性クロレラの一例として、クロレラ属に
属する変異株であるＭ−２０７Ａ７株を作出した。この
Ｍ−２０７Ａ７株は、群馬県高崎市宮原町３ 麒麟麦酒
株式会社応用開発センター内に保存され、特許法第２７
条の３の規定に準じて分譲されるものである。
【００１９】本発明において、塩化ナトリウム１重量％
以上を含む培地で生育可能とは、１重量％塩化ナトリウ
ムを添加したＹＭ寒天培地に接種し、３５℃、７日間暗
所で培養した場合に生育することをいい、また、全クロ
ロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上とは、上記第２
表に組成を示すクロレラ培養用培地に接種し、２００ｒ
ｐｍの振とう培養を３５℃、３日間行った場合に全クロ
ロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上となることをい
う。
以上を含む培地で生育可能とは、１重量％塩化ナトリウ
ムを添加したＹＭ寒天培地に接種し、３５℃、７日間暗
所で培養した場合に生育することをいい、また、全クロ
ロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上とは、上記第２
表に組成を示すクロレラ培養用培地に接種し、２００ｒ
ｐｍの振とう培養を３５℃、３日間行った場合に全クロ
ロフィル含有量が乾燥重量にて４％以上となることをい
う。
【００２０】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
るが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定
されるものではない。
るが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定
されるものではない。
【００２１】実施例１［高クロロフィル含有耐塩性クロ
レラの取得］ （親株の単離）１９９７年５月から７月にかけ、群馬県
内の湖沼から採取した水ならびに砂泥から、第３表に示
すＡ１０培地（東京大学分子生物学研究所編IAM Catalo
gue ofStrains.ｐ４０４．１９９３）に第４表に組成を
示す抗生物質混液Ｎ６（発酵工学会平成３年度大会要旨
４７１頁）を１％加えた寒天培地上で、３５℃、７日
間、日照周期明暗１２時間１２時間で培養し、クロレラ
属の単細胞緑藻類を単離した。次に、これをピペット洗
浄法（「藻類学研究法」共立出版株式会社１９７９年１
２月１日発行、ｐ７０）により完全に無菌化した。この
無菌株をＹＭブロス液に接種し、３５℃、７日間暗所で
培養し、増殖した株をＹＭ寒天培地を用いて単離し親株
とした。
レラの取得］ （親株の単離）１９９７年５月から７月にかけ、群馬県
内の湖沼から採取した水ならびに砂泥から、第３表に示
すＡ１０培地（東京大学分子生物学研究所編IAM Catalo
gue ofStrains.ｐ４０４．１９９３）に第４表に組成を
示す抗生物質混液Ｎ６（発酵工学会平成３年度大会要旨
４７１頁）を１％加えた寒天培地上で、３５℃、７日
間、日照周期明暗１２時間１２時間で培養し、クロレラ
属の単細胞緑藻類を単離した。次に、これをピペット洗
浄法（「藻類学研究法」共立出版株式会社１９７９年１
２月１日発行、ｐ７０）により完全に無菌化した。この
無菌株をＹＭブロス液に接種し、３５℃、７日間暗所で
培養し、増殖した株をＹＭ寒天培地を用いて単離し親株
とした。
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】（高クロロフィル変異株の選抜）上記親株
を１０7 〜１０8 個／ｍｌの細胞密度で無菌水に懸濁し
た液に、５ｋｅｒｇ／ｍｍ2 の照射量の紫外線処理を２
回行い、ＹＭ寒天培地上で３５℃、７日間暗所で培養
し、出現したコロニーで親株よりも緑色の濃いコロニー
５０株を選択・単離した。この単離した５０株の変異株
にさらに２０ｐｐｍのアクリフラビンを用いて３０分間
の接触処理を行い、緑色の濃いコロニーの単離を繰り返
し、再度５０株を選択・単離した。
を１０7 〜１０8 個／ｍｌの細胞密度で無菌水に懸濁し
た液に、５ｋｅｒｇ／ｍｍ2 の照射量の紫外線処理を２
回行い、ＹＭ寒天培地上で３５℃、７日間暗所で培養
し、出現したコロニーで親株よりも緑色の濃いコロニー
５０株を選択・単離した。この単離した５０株の変異株
にさらに２０ｐｐｍのアクリフラビンを用いて３０分間
の接触処理を行い、緑色の濃いコロニーの単離を繰り返
し、再度５０株を選択・単離した。
【００２５】（耐塩性株の選抜）高クロロフィル含有株
５０株を１重量％塩化ナトリウムを添加したＹＭ寒天培
地に接種し、３５℃、７日間暗所で培養し、出現したコ
ロニー３０株から高クロロフィル含有かつ耐塩性変異株
M−２０７Ａ７株を選択・単離した。この変異株の主な
性状を第５表に示す。この性状から、変異株M−２０７
Ａ７株は塩化ナトリウム１重量％で生育可能であること
がわかる。
５０株を１重量％塩化ナトリウムを添加したＹＭ寒天培
地に接種し、３５℃、７日間暗所で培養し、出現したコ
ロニー３０株から高クロロフィル含有かつ耐塩性変異株
M−２０７Ａ７株を選択・単離した。この変異株の主な
性状を第５表に示す。この性状から、変異株M−２０７
Ａ７株は塩化ナトリウム１重量％で生育可能であること
がわかる。
【００２６】
【表５】
【００２７】（クロロフィル含量の測定）上記で得られ
たＭ−２０７Ａ７株と比較例としての市販品Ｂ−１株を
第２表に組成を示すクロレラ培養用培地で培養した。ま
た対照としてのクロレラ・ブルガリスＣ−２７を第３表
に組成を示すＡ１０培地で培養した。培養は５００ｍｌ
容三角フラスコに各培地を１００ｍｌ入れ、２００ｒｐ
ｍの振とう培養を３５℃、３日間行い、培養後、培養液
を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離処理し、藻体を回
収した。全クロロフィル含有量は、藻体のメタノール抽
出液を６５０ｎｍ及び６６５ｎｍの吸光度を測定する方
法（「藻類学研究法」共立出版株式会社１９７９年 １
２月１日発行、ｐ４９８に記載されている方法）により
測定した。結果を第６表に示す。
たＭ−２０７Ａ７株と比較例としての市販品Ｂ−１株を
第２表に組成を示すクロレラ培養用培地で培養した。ま
た対照としてのクロレラ・ブルガリスＣ−２７を第３表
に組成を示すＡ１０培地で培養した。培養は５００ｍｌ
容三角フラスコに各培地を１００ｍｌ入れ、２００ｒｐ
ｍの振とう培養を３５℃、３日間行い、培養後、培養液
を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離処理し、藻体を回
収した。全クロロフィル含有量は、藻体のメタノール抽
出液を６５０ｎｍ及び６６５ｎｍの吸光度を測定する方
法（「藻類学研究法」共立出版株式会社１９７９年 １
２月１日発行、ｐ４９８に記載されている方法）により
測定した。結果を第６表に示す。
【００２８】
【表６】
【００２９】（ワムシでの給餌試験）天然海水：水道水
＝３：１のワムシ飼育用溶液３Ｌを入れた５Ｌ容ビーカ
ーに、ワムシの初発濃度が１５０〜２００個体／ｍｌと
なるようにワムシを入れ、水温を２７℃に保ちながら、
クロレラＰＣＶ（Packed Cell Volume）６０ｖ／ｖ％の
懸濁液をワムシ１００個体あたり、朝に０．１ｍｌ、晩
に０．２ｍｌとなるように４日間給餌した。この実験を
７回繰り返し、本発明のＭ−２０７Ａ７株と比較例とし
ての市販品Ｂ−１株についてワムシの増殖（４日後）の
差異を調べた。７回平均の結果を第７表に示す。第７表
より、ワムシが海水で生存可能な耐塩性株をよく食べる
ことが検証された。
＝３：１のワムシ飼育用溶液３Ｌを入れた５Ｌ容ビーカ
ーに、ワムシの初発濃度が１５０〜２００個体／ｍｌと
なるようにワムシを入れ、水温を２７℃に保ちながら、
クロレラＰＣＶ（Packed Cell Volume）６０ｖ／ｖ％の
懸濁液をワムシ１００個体あたり、朝に０．１ｍｌ、晩
に０．２ｍｌとなるように４日間給餌した。この実験を
７回繰り返し、本発明のＭ−２０７Ａ７株と比較例とし
ての市販品Ｂ−１株についてワムシの増殖（４日後）の
差異を調べた。７回平均の結果を第７表に示す。第７表
より、ワムシが海水で生存可能な耐塩性株をよく食べる
ことが検証された。
【００３０】
【表７】
【００３１】（Ｍ−２０７Ａ７株の大量培養）５０Ｌ容
ジャーファーメンターに第４表に記載の培地を４０Ｌ入
れ、通気量３０Ｌ／分、撹拌３００ｒｐｍ、暗所３５℃
で３日間培養後、培養液を回収し、３０００ｒｐｍ１５
分間遠心分離処理してクロレラ藻体を得た。上記方法で
全クロロフィル含量を求めたところ４．３％（乾燥重量
あたり）であった。この結果、高クロロフィル含有耐塩
性クロレラを、タンク内における通常の従属栄養的培養
方法によって、優れた性状を保持した状態で工業的規模
で大量に培養できることがわかった。
ジャーファーメンターに第４表に記載の培地を４０Ｌ入
れ、通気量３０Ｌ／分、撹拌３００ｒｐｍ、暗所３５℃
で３日間培養後、培養液を回収し、３０００ｒｐｍ１５
分間遠心分離処理してクロレラ藻体を得た。上記方法で
全クロロフィル含量を求めたところ４．３％（乾燥重量
あたり）であった。この結果、高クロロフィル含有耐塩
性クロレラを、タンク内における通常の従属栄養的培養
方法によって、優れた性状を保持した状態で工業的規模
で大量に培養できることがわかった。
【００３２】実施例２［再現性試験］ 親株の採取源である湖沼の場所を異にする他は、実施例
１と同様にして、高クロロフィル含有耐塩性クロレラを
単離した。実施例１と異なる８カ所の湖沼からも、表８
に示すように、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地
で生育可能で、かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量に
て４％以上である高クロロフィル含有耐塩性クロレラを
得ることができた。
１と同様にして、高クロロフィル含有耐塩性クロレラを
単離した。実施例１と異なる８カ所の湖沼からも、表８
に示すように、塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地
で生育可能で、かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量に
て４％以上である高クロロフィル含有耐塩性クロレラを
得ることができた。
【００３３】
【表８】
【００３４】
【発明の効果】本発明によると、クロロフィル含量が高
く、養魚用ワムシの餌とした場合、海水から食物連鎖で
濃縮されるダイオキシン類等の環境汚染物質での汚染が
減少した養殖魚類を供給することができ、かつ海水中で
の生存期間が長く海面養殖飼料、水産飼料等に適した高
クロロフィル含有耐塩性クロレラを、タンク内における
通常の従属栄養的培養方法によって、優れた性状を保持
した状態で工業的規模で大量に培養することができる。
く、養魚用ワムシの餌とした場合、海水から食物連鎖で
濃縮されるダイオキシン類等の環境汚染物質での汚染が
減少した養殖魚類を供給することができ、かつ海水中で
の生存期間が長く海面養殖飼料、水産飼料等に適した高
クロロフィル含有耐塩性クロレラを、タンク内における
通常の従属栄養的培養方法によって、優れた性状を保持
した状態で工業的規模で大量に培養することができる。
【図１】紫外線照射によるクロレラの死滅率を表す図で
ある。
ある。
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Claims (9)
- 【請求項１】 塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地
で生育可能で、かつ親株より全クロロフィル含有量が高
いことを特徴とする高クロロフィル含有耐塩性クロレ
ラ。 - 【請求項２】 塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地
で生育可能で、かつ全クロロフィル含有量が乾燥重量に
て４％以上であることを特徴とする高クロロフィル含有
耐塩性クロレラ。 - 【請求項３】 クロレラが、クロレラ属に属する変異株
Ｍ−２０７Ａ７であることを特徴とする請求項２記載の
高クロロフィル含有耐塩性クロレラ。 - 【請求項４】 変異処理を施すことによって得られるこ
とを特徴とする塩化ナトリウム１重量％以上を含む培地
で生育可能な耐塩性クロレラ。 - 【請求項５】 全クロロフィル含有量が乾燥重量にて４
％以上であることを特徴とする高クロロフィル含有クロ
レラ。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか記載のクロレラ
を、従属栄養的培養方法により培養し、耐塩性及び／又
は高クロロフィル含量のクロレラ藻体を採取することを
特徴とするクロレラ藻体の製造法。 - 【請求項７】 請求項１〜３のいずれか記載の高クロロ
フィル含有耐塩性クロレラ又は塩化ナトリウム１重量％
以上を含む培地で生育可能な耐塩性クロレラを有効成分
とすることを特徴とする水産飼料。 - 【請求項８】 クロレラに、紫外線照射による変異処理
及びメタンスルホン酸エステルもしくはアクリフラビン
による変異処理を施すことを特徴とする変異株の作出方
法。 - 【請求項９】 変異株が、塩化ナトリウム１重量％以上
を含む培地で生育可能かつ全クロロフィル含有量が乾燥
重量にて４％以上の高クロロフィル含有耐塩性クロレラ
属変異株であることを特徴とする請求項８記載の変異株
の作出方法。
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