JP2000039435A

JP2000039435A - 歯周ポケットエラスターゼ測定試薬

Info

Publication number: JP2000039435A
Application number: JP10219889A
Authority: JP
Inventors: Masakatsu Hashimoto; 正勝橋本; Katsuhisa Asami; 勝久浅見; Hikari Kitamura; 光北村
Original assignee: SHIMA KENKYUSHO KK
Current assignee: SHIMA KENKYUSHO KK
Priority date: 1998-07-21
Filing date: 1998-07-21
Publication date: 2000-02-08

Abstract

(57)【要約】［目的］歯周病変の進行度に比例する、歯周ポケット
内の顆粒球由来エラスターゼを、簡単な操作で検出、測
定する。［構成］スケーラー等で採取した歯周ポケット内容物
を、溶血剤とインヒビターを含む希釈液で溶血・希釈
し、溶解したエラスターゼを粒子スライド凝集法、粒子
免疫比濁法、固相免疫標識抗体測定法、イムノクロマト
法等の免疫学的測定試薬により検出、測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は歯槽膿漏等の歯周病の早
期診断に有用な歯周ポケットエラスターゼ測定試薬にか
かるものである。

【０００２】

【従来の技術】歯槽膿漏は成人の７５％以上が罹患して
おり、国民病の一種にあげられ、その予防、治療が重要
視されている。

【０００３】歯は子供で２０本、成人で２８本あるが、
健康な歯はあごの骨の歯槽骨に、強靭な筋状の歯根膜を
介して歯の根がしっかりと保持され、その外側を歯茎に
よって保護されている。

【０００４】歯茎と歯の接合するくびれた部分が歯周ポ
ケットといわれ、歯周ポケット内にたまったプラークが
歯石となって虫歯や炎症の原因となり、歯周病原性細菌
に感染して化膿し、慢性・進行化すると歯槽膿漏にな
る。

【０００５】歯周組織は歯周病原性細菌に感染すると、
白血球の浸潤により好中球等の顆粒球が集まり、感染を
くい止めようとするが、適切な処置、治療を怠ると歯肉
内縁上皮が次第に破壊され、歯との上皮付着は根尖方向
に移行し、その結果歯周ポケットは深くなり、いわゆる
盲嚢が形成される。

【０００６】上記病的歯周ポケットの治療には歯石除
去、根面滑沢、洗浄、薬物貼付、消毒などの他に、歯肉
切除、歯肉剥離掻爬等の外科的手術等、種々の治療方法
があり、どの治療方法を用いるかは症状にもよるが、い
ずれにしても早期診断・早期治療が最も重要であり、効
果的である。

【０００７】歯周病の診断方法には歯科医師の肉眼的観
察による歯肉炎指数の測定、ペリオドンタル・プローブ
による歯周ポケットの深さの測定、感温素子を有する測
定針による歯周ポケット温度を測定する方法、レントゲ
ン写真による歯槽骨吸収度の測定、歯周病原性細菌の測
定等がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
には、歯科医師の判定基準に個人差があること、測定に
長時間を要すること、診断コストが高いこと、歯周病の
炎症部位が活動期か静止期かの判断がしにくい等の問題
点がある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者等は歯周病変に
先だって、歯周ポケットの歯肉内縁部に、白血球特に顆
粒球が早期に浸潤する事に着目し、顆粒球由来のエラス
ターゼを測定することにより、歯周病の診断を迅速且つ
客観的に行い得るに至り、本発明を完成した。すなわち
本発明は、歯周ポケット内容物希釈液と顆粒球エラスタ
ーゼ測定試薬からなることを特徴とする歯周ポケットエ
ラスターゼ測定試薬にかかるものである。

【００１０】測定試料として歯肉溝液、歯周浸出液、歯
周ポケット部プラーク等が使用でき、これらは、例えば
手用スケーラー等で採取し、希釈液で溶解、懸濁、希釈
する。

【００１１】希釈液は通常用いられる緩衝液組成のもの
で、例えばリン酸、トリス−塩酸、グリシン−ＮａＯＨ
等で、ｐＨ７〜９、０．１５ＭＮａＣｌを含有し、０．
０５〜０．５（ｗ／ｖ）％のＢＳＡ、カゼイン等の蛋白
を加えることができる。

【００１２】歯周組織に浸潤する白血球成分としては、
好中球が４５〜６５％、抗酸球が０〜５％、好塩基球が
０〜０．５％、単球が３〜１０％、リンパ球が２０〜４
０％それぞれ存在し、細胞内に顆粒を有する好中球、抗
酸球、好塩基球を顆粒球と称している。従って、顆粒球
は白血球の４５〜７０％を占め、細胞内に多量の酵素を
含有するが、特にエラスターゼは強力な蛋白分解酵素活
性を有し且つ含有量も多いので、エラスターゼ濃度から
歯周組織の損傷程度を判断することが可能である。

【００１３】顆粒球は歯周病原性細菌等を貪食し、空胞
内でエラスターゼ等の酵素処理を繰り返し行うが、やが
て自らも死に、細胞内容物が漏出する。これが多量にな
ると膿となるが、初期の段階では歯肉溝液、歯周浸出液
中に流入する。又、顆粒球は補体、抗原抗体複合物、エ
ンドトキシン、サイトカイン等の刺激に反応して活性化
し、顆粒成分を放出する。それらの顆粒成分のうち異物
に対して破壊・殺菌作用を持つのは中性プロテアーゼと
活性酸素であり、顆粒球エラスターゼは放出される中性
プロテアーゼの中で最も大量に含まれ且つ酵素活性が強
い。

【００１４】顆粒球エラスターゼは、基質特異性が低
く、エラスチン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィ
ブロネクチン等ほとんどすべての生体構成蛋白を容易に
分解し得るため、α１−プラスミンインヒビター、α２
−マクログロブリン等のインヒビターにより、必要以上
のエラスターゼ活性が発揮されないようコントロールさ
れている。反面、前記活性酸素はそれ自体強力な殺菌作
用を有しているが、これらのインヒビターを不活性化し
て顆粒球エラスターゼ活性を持続させる働きも有してい
る。これにより、活性化された顆粒球の周辺のみと極め
て限定された範囲で、強力な感染防御機能が発揮され
る。

【００１５】又、歯周組織に浸潤して歯肉溝液等に混入
した顆粒球中のエラスターゼを測定可能にするために
は、溶血剤により顆粒球を溶血、破壊し、内容物を放出
させる。溶血剤としては、ドデシルトリメチルアンモニ
ウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロ
ライド、サポニン、レシチン、コール酸、ドデシル硫酸
ナトリウム、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエー
テル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル等があ
る。溶血剤の濃度は、０．００１〜５（Ｗ／Ｖ）％好ま
しくは０．０５〜１（Ｗ／Ｖ）％の水溶液として用い
る。又、他の一般的な溶血手段、例えば超音波等を用い
る方法によってもよい。

【００１６】顆粒球由来のエラスターゼは分子量２９５
００で、血漿中及び体組織中ではα１−プラスミンイン
ヒビター、α２−マクログロブリン等のインヒビターと
直ちに結合して不活性化される。エラスターゼ−α１−
プラスミンインヒビター複合体とエラスターゼ−α２−
マクログロブリン複合体の存在比率は９：１であり、ほ
とんどがα１−プラスミンインヒビターとの複合体であ
る。α１−プラスミンインヒビターは分子量５１０００
であるため、エラスターゼ−α１−プラスミンインヒビ
ター複合体の分子量は８０５００となるので、顆粒球エ
ラスターゼを定量測定するためには、測定対象物の分子
量を一定にしておくことが望ましい。

【００１７】そのため、前記希釈液中にα１−プラスミ
ンインヒビターを添加しておくとよい。α１−プラスミ
ンインヒビターはウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ等
の動物血漿中に多量に含まれているので、これらの動物
血漿を０．０５〜２（Ｖ／Ｖ）％添加すればよい。更
に、顆粒球エラスターゼはガラス容器の壁面に吸着され
やすいため、プラスチック容器を希釈用容器として使用
する必要がある。

【００１８】顆粒球由来のエラスターゼを測定する手段
としては、特異性、測定精度の点から免疫学的な手法に
よるのが望ましい。エラスターゼに対する抗体は、公知
の方法でエラスターゼを精製し、或いは市販の好中球由
来精製エラスターゼを用い、ウサギ、ヤギ、モルモッ
ト、ニワトリ等に免疫して得られるポリクローナル抗体
を使用してもよい。又、マウスに免疫して得られる抗エ
ラスターゼ抗体陽性の脾細胞とマウスのミエローマ細胞
とをポリエチレングリコールにより細胞融合して得られ
るハイブリドーマから産生される抗エラスターゼモノク
ローナル抗体を、一種類又は二種類以上組み合わせて使
用してもよい。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体いずれの抗体とも、自家調製品若しくは市販品が使用
可能である。

【００１９】免疫学的測定法としては、抗エラスターゼ
抗体をラテックス粒子、金属コロイド粒子、リポソーム
等の担体粒子に不溶化して使用する粒子スライド凝集法
若しくは粒子比濁法、平底のウエル又はビーズに抗エラ
スターゼ抗体を不溶化した固相化抗体と酵素、化学発光
物質、蛍光物質、放射性物質等の標識物質を抗エラスタ
ーゼ抗体に結合した標識抗体とを用いる酵素免疫測定
法、化学発光分析法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法
等の固相免疫標識抗体分析法等、或いはイムノクロマト
法が使用できる。

【００２０】例えば、ラテックスを用いた粒子スライド
凝集法では担体粒子として３μｍ以下、好ましくは０．
２〜１．０μｍのラテックス粒子を用い、前記抗エラス
ターゼ抗体を不溶化する方法としては、一般的な物理的
吸着法、或いは水溶性カルボジイミドや二官能性試薬に
よる化学結合法が用いられ、必要に応じてペプシン処理
により抗エラスターゼ抗体のＦｃ部分を除去したＦ（ａ
ｂ’）２抗体フラグメントも使用できる。エラスターゼ
含有試料と抗エラスターゼ抗体感作ラテックス試液とを
スライド板上で混合すると、エラスターゼと抗エラスタ
ーゼとの抗原抗体反応により凝集塊が形成されるので、
目視により凝集の有無を確認し、測定試料中にエラスタ
ーゼの有無を判定する。

【００２１】又、ラテックスを用いた粒子比濁法では、
担体粒子として１．６μｍ以下好ましくは０．０５〜
０．５μｍのラテックス粒子を用い、前記と同様の方法
で抗エラスターゼ抗体を不溶化することができる。自動
分析装置やラテックス凝集測定装置により測定を行い、
測定波長はラテックスの粒子径にもよるが５００〜９５
０ｎｍ、好ましくは５５０〜８００ｎｍである。

【００２２】酵素免疫測定法の例としては、マイクロタ
イター用９６穴若しくは分割型の平底トレイのウエル又
はビーズに抗エラスターゼ抗体を不溶化した固相化抗体
と、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の
酵素を抗エラスターゼに結合した標識抗エラスターゼ抗
体を用いて、サンドイッチＥＩＡ法により、測定試料中
のエラスターゼ量に比例した複合体を形成し、該複合体
中の酵素量を、ペルオキシダーゼの場合は過酸化水素と
オルトフェニレンジアミンを組み合わせて基質として用
い、アルカリフォスファターゼの場合は４−ニトロフェ
ニルリン酸を基質としてそれぞれ用いて発色させ光学的
に測定する。

【００２３】更に、イムノクロマト測定試薬は、クロマ
トグラフ媒体に、試料添加部、粒子標識抗エラスターゼ
抗体含有部、検出部、吸収部を展開移動方向に順次設け
て構成する。

【００２４】クロマトグラフ媒体としては、被検出物質
としての歯周ポケット内容物を希釈した希釈試料中の顆
粒球エラスターゼ−α１−プラスミンインヒビター複合
体と、粒子標識抗体含有部に含浸された粒子標識抗エラ
スターゼ抗体とが抗原抗体反応をしながら同期して検出
部の方向に展開移動し得る多孔質の素材であればよく、
検出部に抗エラスターゼ抗体を固相化する方法により材
質を選択する。例えば、固相化抗体として抗エラスター
ゼ抗体を直接固定して使用する場合は、多孔性ニトロセ
ルロースメンブラン、活性化ナイロンメンブランが抗体
の結合・固相化が容易であることから望ましい。又、抗
エラスターゼ抗体をラテックス等の担体粒子に吸着又は
化学結合した抗体固相化ラテックスとして、クロマトグ
ラフ媒体に間接固定して用いる場合は、抗体固相化ラテ
ックスの展開移動を妨げる孔径のグラスファイバー、織
布、不織布等が用いられ、特にボロシリケート・グラス
ファイバーが好適である。

【００２５】該クロマトグラフ媒体は全体を同一の多孔
質素材で構成してもよく、試料添加部、粒子標識抗エラ
スターゼ抗体含有部、検出部、吸収部等の各区分毎に最
適の素材を配置して、これらの間をを連続的に展開移動
できるよう構成してもよい

【００２６】試料添加部は、クロマトグラフ媒体の一端
側に設け、次いで粒子標識抗エラスターゼ抗体含有部を
形成する。粒子標識抗体としては抗エラスターゼ抗体を
着色ラテックス、色素含有リポソーム、金属コロイド粒
子に吸着又は化学結合し、反応を増幅・可視化するとよ
い。粒子標識抗体の色の有無はクロマトグラフ媒体の色
との相対的なものであり、クロマトグラフ媒体が白色の
場合は標識抗体の有色性は可視化判定上必要であるが、
クロマトグラフ媒体を黒色又は比較的濃い色で染色して
おくことにより、白色の粒子標識抗体も使用できる。粒
子標識抗体用の抗エラスターゼ抗体はモノクローナル抗
体、ポリクローナル抗体のいずれの抗体とも使用可能で
あるが、モノクローナル抗体のほうがエラスターゼと粒
子標識抗体との抗原抗体反応結合物どうしの二次的な凝
集が起こらないため、検出感度が高く、高濃度のエラス
ターゼが存在してもクロマトグラフ媒体内の展開移動が
可能となり検出濃度範囲が広くなる。

【００２７】該粒子標識抗エラスターゼ抗体はクロマト
グラフ媒体内を展開移動し得るよう、蛋白成分、糖、界
面活性剤等を添加して、クロマトグラフ媒体に含浸さ
せ、乾燥して保存する。

【００２８】次に、検出部はクロマトグラフ媒体として
ニトロセルロースメンブラン、活性化ナイロンメンブラ
ン等を使用する場合には、粒子標識抗エラスターゼ抗体
含有部の展開移動方向下流側に、抗エラスターゼ抗体溶
液をスポットするか、該クロマトグラフ媒体の幅方向に
１〜２ｍｍの幅で抗エラスターゼ抗体溶液を塗布し、更
に数ｍｍの間隔をおいて複数本塗布してもよい。抗エラ
スターゼ抗体を固相化した部分以外の活性部分は粒子標
識抗エラスターゼ抗体含有部の形成に先立ってＢＳＡ、
カゼイン等の蛋白質でブロックしておき、非特異反応を
防止しておく。又、クロマトグラフ媒体としてグラスフ
ァイバーを用いる場合には、抗エラスターゼ抗体感作ラ
テックスを同様に粒子標識抗エラスターゼ抗体含有部の
展開移動方向下流側に含浸するか、該クロマトグラフ媒
体の幅方向に１〜２ｍｍの幅で塗布・含浸し、更に数ｍ
ｍの間隔をおいて複数本形成してもよい。これらの検出
部形成用の抗エラスターゼ抗体はポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体のいずれでもよい。

【００２９】更に、吸収部は被検出物質であるエラスタ
ーゼ−α１−プラスミンインヒビター複合体や粒子標識
抗体のクロマトグラフ媒体内の展開移動を促進するため
に検出部の展開移動方向下流側に、濾紙、織布、不織
布、吸水パッド等を接触配置して吸水部を形成する。

【００３０】

【作用】０．１５ＭＮａＣｌ−２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８．５）に０．５（Ｖ／Ｖ）％のヒツジ血漿及び
０．０１（Ｖ／Ｖ）％のドデシルトリメチルアンモニウ
ムブロマイドを加えた希釈液を希釈容器に０．３ｍｌと
り、これに手用スケーラーで採取した歯周ポケット内容
物を添加し、撹拌して溶解、希釈する。歯周ポケット内
容物中に白血球が存在すると界面活性剤の溶血作用によ
り、白血球中の内容物が放出される。白血球中に好中球
等の顆粒球が存在すれば、これらの顆粒球内の顆粒から
エラスターゼ等の酵素が溶出する。

【００３１】この歯周ポケット内容物希釈試料をスライ
ド反応板に７μｌとり、０．１（Ｗ／Ｖ）％ＢＳＡ−
０．１５ＭＮａＣｌ−０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐ
Ｈ８．５）（反応用グリシン緩衝液）を１００μｌ加え
て均一に撹拌し、次いで抗エラスターゼ抗体感作ラテッ
クス試液を５０μｌ加えて、スライド反応板を回転揺動
すると、希釈試料中のエラスターゼと抗エラスターゼ抗
体感作ラテックス試液とが、抗原抗体反応により凝集塊
を形成し、約２分間で目視により凝集の有無が判定でき
る。凝集が認められた場合、顆粒球エラスターゼの存在
が明らかとなり、歯周ポケット内容物中に顆粒球が存在
するか、又は歯周組織に浸潤した顆粒球から顆粒が放出
されたことになり、歯周病陽性と判断される。又凝集が
認められない場合は顆粒球エラスターゼの存在は否定さ
れ、歯周病陰性と判断される。

【００３２】ラテックス比濁法で測定する場合は、前記
歯周ポケットエラスターゼ内容物希釈液５μｌを前記反
応用グリシン緩衝液２００μｌに添加・撹拌し、次いで
抗エラスターゼ抗体感作ラテックス試液４０μｌを添加
・撹拌すると、希釈試料中のエラスターゼと抗エラスタ
ーゼ抗体感作ラテックスに感作された抗エラスターゼ抗
体とが抗原抗体反応し、抗体感作ラテックスがエラスタ
ーゼ濃度に応じて凝集する。抗体感作ラテックス試液を
添加・撹拌後、適宜の測定波長例えば６６０ｎｍにより
吸光度を測定し、更に数分後に同一波長により吸光度を
測定して吸光度差を計算する。

【００３３】予めエラスターゼの標準液を同様の操作で
測定して標準曲線を作成しておき、該標準曲線により前
記希釈試料中のエラスターゼ濃度を計算する。

【００３４】又、固相免疫標識抗体分析法の場合は、前
記希釈試料の一定量をマウス抗エラスターゼモノクロー
ナル抗体を吸着したウエルに添加し、室温で３０分一次
反応し、次いでペルオキシダーゼ標識抗エラスターゼポ
リクローナル抗体を添加し、室温で３０分二次反応し、
洗浄液で洗浄後、オルトフェニレンジアミン及び過酸化
水素からなる基質溶液を加え、室温で１５分間反応後２
Ｍ硫酸を加えて反応を停止し、イムノリーダーを用いて
４９０ｎｍの吸光度を測定する。

【００３５】標準液の測定も以上と同様の操作で行って
標準曲線を作成し、以下前述のラテックス比濁法の場合
と同様に希釈試料中のエラスターゼ濃度が計算される。

【００３６】イムノクロマト試薬の場合は、前記と同様
の操作で歯周ポケット内容物の希釈を行い、該希釈容器
にクロマトグラフ媒体の試料添加部を挿入する。希釈試
料中のエラスターゼはクロマトグラフ媒体内を毛細管現
象で展開移動し、粒子標識抗エラスターゼ抗体含有部に
到達し、例えば赤色の着色ラテックス粒子等で標識され
た抗エラスターゼ抗体と抗原抗体反応を起こしながら更
に上部の検出部に到達する。該検出部には抗エラスター
ゼ抗体がクロマトグラフ媒体に固相化されているので、
到達してくるエラスターゼと赤色ラテックス標識抗エラ
スターゼ抗体との抗原抗体複合体は、固相化抗エラスタ
ーゼ抗体と抗原抗体反応して固相化抗エラスターゼ抗体
に結合し、該検出部の抗エラスターゼ抗体固相化部位が
赤色に着色する。更に時間の経過とともに、余分の粒子
標識抗体が上方に展開移動し、吸収部に吸収され、前記
検出部のみに赤色の着色バンドが残る。これにより、希
釈試料中にエラスターゼの存在が確認され、歯周部に顆
粒球の浸潤ありと判断される。

【００３７】前記検出部に固相化抗エラスターゼ抗体の
バンドを３本形成しておくことにより、希釈試料中のエ
ラスターゼ量が多い場合は、展開移動とともに下流側の
固相化抗エラスターゼ抗体のバンドから順次着色し、エ
ラスターゼ量に比例して２本或いは３本の着色バンドが
発現する。従って、着色したバンドの本数にエラスター
ゼ量が比例し、歯周部の顆粒球の浸潤の程度も判断でき
る。

【００３８】

【実施例】実施例１市販の粒子径０．２μｍのポリスチレンラテックス粒子
にヒツジ抗エラスターゼ抗体（バインディングサイト
社）を常法により物理吸着させて感作した。０．１％Ｂ
ＳＡを含む０．２Ｍグリシン−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．２）（以下ＢＳＡ−ＧＳＢとする）により浮遊し、
抗エラスターゼ抗体感作ラテックス試液を得た。

【００３９】０．１（Ｗ／Ｖ）％ＢＳＡ−０．１５ＭＮ
ａＣｌ−０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）
（反応用グリシン緩衝液）に０．５（Ｖ／Ｖ）％のヒツ
ジ血漿及び０．０１（Ｖ／Ｖ）％のドデシルトリメチル
アンモニウムブロマイドを加えて希釈液を調製する。好
中球由来エラスターゼ（コスモバイオ社）を前記希釈液
で希釈した標準液希釈列を、光学的反応容器にそれぞれ
１０μｌ採取し、反応用グリシン緩衝液を２００μｌ添
加・撹拌し、次いで前記抗エラスターゼ抗体感作ラテッ
クス試液を４０μｌ添加・撹拌し、反応開始後１分及び
５分の吸光度を波長６６０ｎｍで測定し、吸光度差を計
算し、標準液の各濃度とそれぞれの吸光度差との関係を
プロットすると共に、３次元のログ−ロジット計算式に
より

【図１】に示す標準曲線を作成した。

【００４０】前記希釈液を分割型マイクロタイタートレ
イのウェルにそれぞれ０．３ｍｌとり、これに手用スケ
ーラーで採取した歯周ポケット内容物を添加し、撹拌し
て溶解、希釈する。歯周病を疑われる部位が複数箇所あ
る場合には、前記スケーラーの先端を脱脂綿で拭い、順
次別の歯周ポケットから内容物を採取し、同様に溶解、
希釈する。歯周ポケット内容物中に白血球が存在すると
界面活性剤の溶血作用により、白血球中の内容物が放出
される。白血球中に好中球等の顆粒球が存在すれば、こ
れらの顆粒球内の顆粒からエラスターゼ等の酵素が溶出
する。

【００４１】各歯周ポケット内容物希釈試料を前記標準
液と同様の操作で測定し、各希釈試料の６６０ｎｍにお
ける１分及び５分の吸光度差から、前記標準曲線により
エラスターゼ濃度を計算により求めた。

【００４２】実施例２マウス抗エラスターゼモノクローナル抗体（オルガノン
テクニカ社）を平底マイクロタイタートレイの各ウエル
に吸着固定し、洗浄後ＢＳＡ溶液でブロッキングして固
相化抗体トレイを調製した。抗エラスターゼポリクロー
ナル抗体（バインディングサイト社）にホースラディッ
シュペルオキシダーゼを常法により標識した。

【００４３】前記実施例１の希釈試料３μｌを、前記エ
ラスターゼモノクローナル抗体を不溶化した平底マイク
ロタイタートレイのウエルに加え、０．１（Ｗ／Ｖ）％
ＢＳＡを含むＰＢＳを１００μｌ追加し、室温で３０分
間一次反応した。次に前記標識抗体溶液１００μｌを加
え、室温で３０分二次反応した。洗浄後に基質溶液（オ
ルトフェニレンジアミン／過酸化水素）を加え、室温で
１５分間反応した後、３Ｎ硫酸溶液にて反応を停止し、
４９０ｎｍにて吸光度を測定し、ゼロブランクの吸光度
との差を計算した。

【００４４】エラスターゼの標準液についても上記と同
様の操作で吸光度を測定し、０ブランクの吸光度との差
を計算し、標準液の各濃度とそれぞれの吸光度差との関
係をプロットすると共に、３次元のログ−ロジット計算
式により

【図２】に示す標準曲線を作成した。該標準曲線により
前記希釈試料の吸光度差からエラスターゼ濃度を計算し
た。

【００４５】実施例３粒径０．２７μｍのスチレン−メタクリル酸共重合ラテ
ックスの赤色着色粒子（日本合成ゴム社）に、前記実施
例１と同様の方法で抗エラスターゼモノクローナル抗体
（オルガノンテクニカ社）を感作し、０．６（Ｗ／Ｖ）
％ポリビニルアルコール−ＢＳＡ−ＧＳＢで浮遊して、
赤色ラテックス標識抗エラスターゼ抗体を得た。

【００４６】孔径８μｍのニトロセルロースメンブラン
（ザルトリウス社）を長さ８０ｍｍｘ幅６０ｍｍの大き
さに切断し、抗エラスターゼポリクローナル抗体（バイ
ンディングサイト社）のＩｇＧ画分２ｍｇ／ｍｌ溶液
を、直径１ｍｍのノズルから正確な量の試薬を射出する
ことのできるマイクロプロセッサ制御式超小型注射器を
用いて、ニトロセルロースメンブランの長さ方向の一端
（下端）から３７ｍｍ、３９ｍｍ、４２ｍｍのところ
に、幅１ｍｍの線を６０ｍｍの幅方向に描くように３本
塗布して検出部を形成し、室温で１時間乾燥させた後、
２（Ｗ／Ｖ）％ＢＳＡ溶液に室温で３０分浸漬し、ニト
ロセルロースメンブランの余分の結合部位をブロックし
た。該ニトロセルロースメンブランを精製水で十分すす
いだ後、３０℃で３０分乾燥した。

【００４７】次に、６０（Ｗ／Ｖ）％のサッカロースを
精製水に溶かした溶液を、マイクロプロセッサ制御シス
テムを取り付けたエアブラシにより、前記ニトロセルロ
ースメンブランの検出部を形成した側の片面に、全面塗
布して下塗り層を形成した。

【００４８】更に、前記赤色ラテックス標識抗エラスタ
ーゼ抗体を、前記エアブラシにより、前記下塗り層を形
成したニトロセルロースメンブランの下端から７ｍｍあ
けて幅方向に１０ｍｍの幅で、前記エアブラシにより前
記下塗り層の上に直接塗布して、着色粒子標識抗エラス
ターゼ抗体含有部を形成し、３０℃で３０分乾燥した。
該ニトロセルロースメンブランの下端から７ｍｍの範囲
を試料添加部とした。

【００４９】このニトロセルロースメンブランを６ｍｍ
の幅で長さ方向に切断し、アクリル樹脂製支持体（６ｘ
８０ｍｍ）に両面接着テープにより貼付し、イムノクロ
マト用吸水パッド６ｘ１０ｍｍ（ポール社）を、前記ニ
トロセルロースメンブランに形成した検出部の上方（展
開移動方向下流側）に貼付して吸収部を形成しイムノク
ロマト用測定試薬を調製した。

【００５０】前記実施例１と同様の方法で採取・希釈し
た歯周ポケット内容物希釈試料の入った分割型のマイク
ロタイタートレイのウエルに、イムノクロマト測定試薬
の試料添加部を差し込んで立てると、希釈試料中の顆粒
球エラスターゼ等の成分が、水とともに下塗り層を溶か
しながらしみ込むようにして、クロマトグラフ媒体であ
るニトロセルロースメンブラン内を毛細管現象によって
上方に展開移動し始める。

【００５１】希釈試料中のエラスターゼ等の成分が着色
粒子標識抗エラスターゼ抗体含有部に到達すると、エラ
スターゼが存在する場合は、エラスターゼと赤色ラテッ
クスで標識された抗エラスターゼ抗体とが抗原抗体反応
し、抗原抗体複合体を形成しながら更に上方に展開移動
する。赤色ラテックスで標識された抗エラスターゼ抗体
はモノクローナル抗体であるので、エラスターゼと抗原
抗体反応して結合するが、抗エラスターゼモノクローナ
ル抗体と結合したエラスターゼは、周囲にある他の抗エ
ラスターゼモノクローナル抗体とは二次反応できないた
め、大きな凝集塊が形成されることなく、クロマトグラ
フ媒体内を展開移動する。

【００５２】エラスターゼ抗原抗体複合体が検出部に到
達すると、該検出部に固相化された抗エラスターゼポリ
クローナル抗体に、エラスターゼ−赤色ラテックス標識
抗エラスターゼ抗体の抗原抗体複合体が、抗原抗体反応
により順次捕捉され、上流側の抗エラスターゼ抗体固相
化部位に第一の着色バンドが発現する。前記歯周ポケッ
ト内容物希釈試料中にエラスターゼが存在しなければ、
抗原抗体反応は起こらず、着色バンドは認められない。
又エラスターゼが比較的多く存在する場合には、第一の
抗エラスターゼ固相化部位が飽和されて、捕捉出来なか
った抗原抗体複合体が第二の抗エラスターゼ抗体固相化
部位で捕捉されて第二の着色バンドが発現する。更にエ
ラスターゼが大量に存在する場合は、第二の抗エラスタ
ーゼ抗体固相化部位が飽和され、第三の着色バンドが発
現する。約１５分で上端の吸水パッドに赤色ラテックス
標識抗エラスターゼ抗体が移行し終わり、目視により検
出部の赤色に染まったバンドを確認して、判定した。

【００５３】

【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、歯周
ポケット採取試料中の白血球のうち顆粒球由来のエラス
ターゼを、溶血希釈して免疫学的測定試薬で検出・測定
することにより、比較的簡単に、短時間で精度よく歯周
ポケットエラスターゼを測定できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例を示した説明図である。

【図２】本発明の他の実施例を示した説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｃ 19/04 ＺＦターム(参考） 2G045 AA25 BB29 BB40 BB42 CA21 CB01 CB05 CB06 CB21 DA20 FA18 FB01 FB03 FB06 FB07 FB11 GA05 GC12 4B063 QA01 QA07 QA19 QQ02 QQ36 QQ96 QR48 QR84 QS03 QS20 QS33 QS36 QX01 4C052 AA20 NN01 NN11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】歯周ポケット内容物希釈液と顆粒球エラ
スターゼ測定試薬とからなることを特徴とする歯周ポケ
ットエラスターゼ測定試薬。
【請求項２】歯周ポケット内容物が歯肉溝液、歯周浸
出液、歯周ポケット部プラークである請求項１記載の歯
周ポケットエラスターゼ測定試薬。
【請求項３】歯周ポケット内容物希釈液が溶血剤、α
１−プラスミンインヒビターの少なくともいずれかを含
有する請求項１記載の歯周ポケットエラスターゼ測定試
薬。
【請求項４】溶血剤が界面活性剤である請求項３記載
の歯周ポケットエラスターゼ測定試薬。
【請求項５】顆粒球エラスターゼ測定試薬が、抗エラ
スターゼ抗体感作粒子を用いる請求項１記載の歯周ポケ
ットエラスターゼ測定試薬。
【請求項６】抗エラスターゼ抗体感作粒子の担体粒子
が菌体細胞、金属コロイド粒子、ラテックス粒子、合成
粒子のいずれかである請求項５記載の歯周ポケットエラ
スターゼ測定試薬。
【請求項７】顆粒球エラスターゼ測定試薬が目視によ
るスライド凝集判定試薬、粒子凝集比濁法のいずれかで
ある請求項５記載の歯周ポケットエラスターゼ測定試
薬。
【請求項８】顆粒球エラスターゼ測定試薬が、固相化
抗エラスターゼ抗体と標識化抗エラスターゼ抗体とを用
いる請求項１記載の歯周ポケットエラスターゼ測定試
薬。
【請求項９】抗エラスターゼ抗体がポリクローナル抗
体、一種類又は２種類以上のモノクローナル抗体である
請求項５又は請求項８記載の歯周ポケットエラスターゼ
測定試薬。
【請求項１０】標識物が酵素である請求項８記載の歯
周ポケットエラスターゼ測定試薬。
【請求項１１】顆粒球エラスターゼ測定試薬がイムノ
クロマトエラスターゼ測定試薬である請求項１記載の歯
周ポケットエラスターゼ測定試薬。
【請求項１２】クロマトグラフ媒体に試料添加部、粒
子標識抗エラスターゼ抗体含有部、検出部、吸収部を展
開移動方向に順次設けてなる請求項１１記載の歯周ポケ
ットエラスターゼ測定試薬。
【請求項１３】粒子標識抗エラスターゼ抗体が抗エラ
スターゼ抗体感作着色粒子、抗エラスターゼ抗体感作着
色物質含有リポソーム、金属コロイド粒子標識抗エラス
ターゼ抗体のいずれかである請求項１２記載の歯周ポケ
ットエラスターゼ測定試薬。
【請求項１４】検出部に抗エラスターゼ抗体固相化部
位を一カ所、又は２カ所以上有する請求項１２記載の歯
周ポケットエラスターゼ測定試薬。
【請求項１５】標識抗エラスターゼ抗体が抗エラスタ
ーゼモノクローナル抗体で、固相化抗エラスターゼ抗体
が別の抗エラスターゼモノクローナル抗体又は抗エラス
ターゼポリクローナル抗体である請求項１３又は１４記
載の歯周ポケットエラスターゼ測定試薬。