ITUB20150108A1 - Molecola antimicotica sintetica e metodo per sintetizzare una molecola antimicotica - Google Patents
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Description
D E S C R I Z I O N E
annessa a domanda di brevetto per invenzione industriale avente per titolo: MOLECOLA ANTIMICOTICA SINTETICA E METODO PER SINTETIZZARE UNA MOLECOLA ANTIMICOTICA
DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto una molecola antimicotica sintetica ed un metodo per sintetizzare una molecola antimicotica.
In particolare, la presente invenzione ha per oggetto una molecola antimicotica sintetica che sia biocompatibile rispetto ad organi e tessuti umani e che, quantomeno a temperature comprese tra 0?C e 40?C, presenti un?elevata solubilit? in acqua.
La presente invenzione nasce a seguito di esigenze manifestatesi nel settore della chirurgia oftalmica, in particolare con riferimento alla conservazione ed alla decontaminazione delle cornee espiantate destinate al trapianto. Successivamente, tuttavia, a fronte dei risultati raggiunti, si ? compreso come questa invenzione possa trovare anche molte altre applicazioni in campo medico e chirurgico, come descritto nel seguito.
Attualmente, nel settore oftalmico in generale, ed in quello dei trapianti di cornea in particolare, ? prassi consolidata che vengano utilizzati numerose composizioni sia in forma di dispositivi medici sia in forma di medicamenti. In particolare, come tutti gli interventi chirurgici, anche quelli nel settore oftalmico espongono il paziente al rischio di infezioni che possono insorgere nel decorso post-operatorio, cosicch?, per ridurre tale rischio ? prassi utilizzare sostanze antibiotiche di varia natura non solo nel corso dell?intervento chirurgico e/o della successiva convalescenza, ma anche in fase di conservazione delle cornee destinate al trapianto. Come per qualsiasi altro tessuto o organo, ? infatti fondamentale garantire che il materiale biologico che si va ad impiantare nel paziente (la cornea) sia privo di contaminazioni; in caso contrario, infatti, il paziente sarebbe esposto ad un elevato rischio di successiva insorgenza di infezioni; e in effetti, secondo alcune statistiche, le endoftalmiti post-operatorie sembrano in aumento negli ultimi anni.
In accordo con l?attuale stato dell?arte nel settore dei trapianti di cornea, proprio per rimuovere eventuali contaminazioni dalla cornea espiantata, ? noto conservare la stessa almeno temporaneamente in un bagno contenente oltre a molti altri ingredienti, un cocktail di antibiotici tale da fornire una copertura ad ampio spettro. Attualmente, tuttavia, vi sono degli evidenti limiti per quanto riguarda gli antibiotici utilizzati all?interno di tale cocktail, dato che mentre sono presenti appositi antibiotici per quanto riguarda i batteri gram positivi e quelli gram negativi, non risultano essere presenti sostanze antimicotiche. La ragione di ci? ? che nessuna delle molecole antimicotiche note presenta, quantomeno nel range di temperatura compreso tra 0?C e 40?C (le cornee vengono generalmente conservate o a 4?C o a 37?C a seconda della tecnica di conservazione), una sufficiente solubilit? in acqua (generalmente la solubilit? ? tale da non garantire nemmeno il raggiungimento della concentrazione necessaria per avere una minima azione fungicida), cosa che ne rende difficile se non pressoch? impossibile l?utilizzo all?interno dei liquidi di conservazione o di processazione delle cornee, che sono tutti a base d?acqua (si noti che mentre con la definizione liquido di conservazione si intende un liquido in cui la cornea pu? essere conservata per periodi di tempo relativamente lunghi - alcuni giorni - grazie alla presenza anche di nutrienti, con la definizione liquido di processazione si intende un liquido con cui la cornea pu? essere messa a contatto solo per un periodo di tempo limitato o in quanto privo di nutrienti o in quanto a lungo andare potenzialmente tossico per la cornea stessa; esempi di liquidi di processazione sono i liquidi di decontaminazione, i liquidi di lavaggio ed i liquidi di deturgescenza).
Va peraltro notato che per cercare di ovviare al problema dell'insolubilit? degli antimicotici noti, ? noto utilizzare amfotericina B legata in forma micellare a deossicolato; la micella di queste due sostanze presenta infatti una certa ?solubilit?? in acqua che ne permette l'impiego in soluzione. Quello che si ottiene tuttavia, non ? una soluzione ma una miscela eterogenea con la conseguenza che, a causa del proprio peso molecolare elevato, con il passare del tempo la micella amfotericina B-deossicolato tende ad iperconcentrarsi verso il fondo del contenitore; a tale iperconcentrazione, tuttavia, corrisponde un aumento della tossicit? che, in caso di utilizzo in liquidi di conservazione e/o processazione per cornee, rischierebbe di compromettere la cornea. In aggiunta, alcuni studi hanno messo in dubbio la biocompatibilit? del deossicolato.
Ovviamente, problemi analoghi nella prevenzione e/o nel trattamento delle infezioni micotiche si hanno poi in tutte quelle applicazioni mediche in cui sarebbe opportuno disporre di un antimicotico solubile in acqua.
In questo contesto il compito tecnico alla base della presente invenzione ? realizzare una molecola antimicotica sintetica, e mettere a punto un metodo per sintetizzare una molecola antimicotica, che pongano rimedio agli inconvenienti citati.
? in particolare compito tecnico della presente invenzione realizzare una molecola antimicotica sintetica che sia biocompatibile rispetto ad organi e tessuti umani (almeno per i tempi di contatto di interesse nelle applicazioni suddette) e che presenti un?elevata solubilit? in acqua, quantomeno tale da garantire una concentrazione che garantisca il manifestarsi delazione fungicida a temperature biocompatibili (indicativamente tra gli 0?C e 40?C).
Ulteriormente ? compito tecnico della presente invenzione mettere a punto una composizione a base d?acqua per la conservazione e/o la processazione di cornee e/o altri tessuti o organi espiantati che presenti anche adeguate propriet? antimicotiche.
Il compito tecnico e gli scopi indicati sono sostanzialmente raggiunti da una molecola antimicotica sintetica e da un metodo per sintetizzare una molecola antimicotica in accordo con quanto descritto nelle unite rivendicazioni.
Ulteriori caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione appariranno maggiormente evidenti dalla descrizione dettagliata che segue di alcune forme preferite, ma non esclusive, di una molecola antimicotica sintetica e di un metodo per sintetizzare una molecola antimicotica.
La molecola antimicotica sintetica oggetto della presente invenzione ? costituita da una catena di unit? di base o da un analogo strutturale di tale catena di unit? di base, in cui ciascuna unit? di base della catena ha la seguente struttura:
dove:
per ciascuna unit? di base della catena, uno tra R3 ed R4 ? un gruppo solfato con struttura:
(nella rappresentazione grafica della struttura del gruppo il puntino rappresenta il punto di legame al resto della rispettiva unit? di base) con R6 che rappresenta o un atomo di idrogeno, o uno tra un atomo metallico ed un gruppo funzionale con comportamento metallico o cationico (es. NH4), legati al corrispondente atomo di ossigeno O con un legame ionico monovalente; in altri termini, quando R6 rappresenta un atomo metallico o un gruppo funzionale, la catena ? salificata rispetto al caso in cui R6 ? costituito da un atomo di idrogeno H;
per una pluralit? di unit? di base della catena, almeno uno tra Ri, R2, e quello tra R3 e R4 che non ? il gruppo solfato di cui al punto precedente, ? un gruppo con propriet? antimicotiche che presenta a propria volta la struttura:
(anche in questo caso nella rappresentazione grafica della struttura del gruppo il puntino rappresenta il punto di legame al resto della rispettiva unit? di base);
per ciascuna unit? di base della catena, R5 rappresenta o un atomo di idrogeno, o uno tra un atomo metallico ed un gruppo funzionale con comportamento metallico o cationico (es. NH4), legati al corrispondente atomo di ossigeno O con un legame ionico monovalente; in altri termini, quando R5 rappresenta un atomo metallico o un gruppo funzionale, la catena ? salificata rispetto al caso in cui R5 ? costituito da un atomo di idrogeno H;
quantomeno la maggior parte dei restanti Ri, R2, R3 ed R4 dell?intera catena sono costituiti ciascuno da un gruppo -OH.
Nelle forme preferite, comunque, tutti i restanti R-?, R2, R3 ed R4, che non sono un gruppo solfato 0 un gruppo con propriet? antimicotiche, sono costituiti ciascuno da un gruppo -OH.
Preferibilmente, inoltre, ogni unit? di base della catena comprende al massimo uno solo di detti gruppi con propriet? antimicotiche, anche se in forme realizzative meno preferite ? possibile che ne comprenda anche pi? di uno.
Vantaggiosamente, inoltre, non tutte le unit? di base comprendono uno 0 pi? gruppi con propriet? antimicotiche; al contrario, in accordo con le forme preferite della molecola, il numero di unit? di base della catena che presentano almeno un gruppo con propriet? antimicotiche rientra nel range tra l?1% ed il 50% del numero totale di unit? di base.
A seconda delle esigenze pu? poi essere previsto che il gruppo solfato occupi la stessa posizione in tutte le unit? di base 0 meno; nella forma realizzativa preferita, comunque, esso ? sempre nella stessa posizione e corrisponde al gruppo R4 della formula (I).
Per quanto riguarda R5 ed R6 nelle forme realizzative preferite sono vantaggiosamente costituiti ciascuno da un atomo di sodio Na, da un atomo di potassio K 0 da un catione ammonio NH4.
Oltre alla molecola in quanto tale, formano oggetto della presente invenzione anche delle composizioni che comprendano una miscela a base d?acqua, al cui interno sia presente anche la molecola antimicotica sin qui descritta.
In particolare, in tali composizioni vantaggiosamente la molecola antimicotica ? vantaggiosamente sciolta nell?acqua (acqua e molecola antimicotica tra loro formano quindi una soluzione).
Preferibilmente, inoltre, la miscela comprende in percentuale peso/volume tra l?1% ed il 30% della molecola antimicotica, ed ancor pi? preferibilmente tra il 2% ed il 10%.
Nelle forme realizzative preferite della presente invenzione, poi, la miscela si presenta in forma di idrogel almeno in un range di temperature comprese tra 0?C e 40?C.
In particolare, tra tutte le possibili composizioni che rientrano nell?ambito della presente invenzione, sono di particolare rilevanza liquidi di conservazione e/o di processazione di organi e/o tessuti destinati al trapianto che contengano la molecola o la miscela sin qui descritte.
Peraltro, rientra nell?ambito della presente invenzione anche l?uso della molecola antimicotica o di una miscela che la contiene per la decontaminazione di organi o tessuti destinati al trapianto, nonch? il corrispondente metodo di trattamento.
In considerazione poi delle propriet? antimicotiche dimostrate dalla molecola oggetto della presente invenzione e del fatto che la stessa si ? dimostrata biocompatibile rispetto ad organi e tessuti umani, formano oggetto della presente invenzione anche in generale gli usi della molecola antimicotica sin qui descritta o di una miscela che la contenga come medicinale, nonch? in particolare gli usi della stessa nel trattamento di infezioni micotiche ed in chirurgia oftalmica.
Come gi? anticipato forma infine oggetto della presente invenzione un metodo per sintetizzare una molecola antimicotica, in particolare del tipo sopra descritto, in cui la molecola viene ottenuta per funzionalizzazione di una molecola di condroitin solfato o di un sale di condroitin solfato o di un altro analogo strutturale del condroitin solfato mediante legame estereo con una o pi? molecole di Amfotericina B, che, una volta legate alla molecola di condroitin solfato vanno a costituire il sopra citato gruppo antimicotico. Si noti che quanto descritto in relazione al metodo deve intendersi valido anche con riferimento alla molecola, e viceversa, se compatibile.
Tale metodo, pi? in dettaglio, comprende innanzitutto le fasi operative di prendere del condroitin solfato od un sale di condroitin solfato od un altro analogo strutturale del condroitin solfato, e di prendere della amfotericina B. Per quanto riguarda il condroitin solfato, esso ? costituito da una catena di unit? di base ciascuna delle quali ha la struttura definita dalla formula (I) sopra riportata dove sia R5 sia R6 o sono costituiti da un atomo di idrogeno o sono assenti (lasciando quindi il relativo atomo di ossigeno in forma di ione negativo), mentre per quanto riguarda l?amfotericina B, ciascuna molecola presenta un?estremit? carbossilica con struttura -COOH.
Il metodo prevede quindi di funzionalizzare il condroitin solfato o il sale di condroitin solfato o l?altro analogo strutturale del condroitin solfato creando un legame estereo tra l?estremit? carbossilica deN?amfotericina B ed un gruppo ossidrile del condroitin solfato o del sale di condroitin solfato o dell?altro analogo strutturale del condroitin solfato.
Preferibilmente, il condroitin solfato od il sale di condroitin solfato o l?altro analogo strutturale del condroitin solfato hanno un peso molecolare compreso fra circa 10 kDa e 200 kDa, ed ancora pi? preferibilmente fra circa 20 kDa e 150 kDa.
Nelle forme attuative preferite della presente invenzione, il metodo prevede inoltre una fase di attivazione dell?estremit? carbossilica deN?amfotericina B allo scopo di facilitare la formazione del legame estereo suddetto aumentando la reattivit? chimica deN?amfotericina B. Vantaggiosamente, la fase di attivazione pu? prevedere di far reagire l?amfotericina B con un agente copulante quale l?1-isobutoxycarbonyl-2-isobutoxy-1,2-dihydroquinoline (IIDQ) oppure con un agente quale 1,1?-carbonildiimidazolo (ODI) che ? in grado convertire un acido carbossilico nella corrispondente imidazolide, la forma reattiva di un agente acilante. Vantaggiosamente, nel caso di utilizzo di CDI, viene effettuata innanzitutto una prima reazione del gruppo carbossilico libero deN?amfotericina B con il carbonildiimidazolo (ODI). La reazione avviene a temperature comprese tra i 35?C e i 40?C ed ha una durata di 1-2 ore. A tale reazione segue la funzionalizzazione del condroitin solfato, ad esempio con una reazione effettuata a temperatura ambiente per 24 ore. Nel caso di utilizzo invece dell?IIDQ, inizialmente ? prevista una miscelazione dei due componenti la reazione (condroitin solfato ed amfotericina B) in un solvente aprotico come ad esempio N-metilpirrolidone (NMP) o il dimetilsolfossido (DMSO), e successiva aggiunta in quantit? stechiometrica dell?IIDQ. La reazione avviene ad una temperatura compresa tra 25?C e 40?C.
Nella forma realizzativa preferita della presente invenzione, in cui si utilizza condroitin solfato, poich? il condroitin solfato ? un composto fortemente idrofilico, mentre l?amfotericina B ? idrofobica, ? previsto di rendere uno dei reagenti compatibile con i solventi appropriati per l?altro reagente. Vantaggiosamente, questo risultato pu? essere ottenuto prevedendo una fase preliminare in cui il condroitin solfato viene trasformato in un sale di ammonio, come il sale cetiltrimetilammonio (CTA) oppure, preferibilmente, il sale di tetrabutilammonio (TBA). La formazione del sale ammonio pu? essere semplicemente realizzata neutralizzando condroitin solfato con l?idrossido del catione ammonico, oppure per scambio ionico in resine solfoniche. Si tratta di una reazione che procede con resa del 100%, e il prodotto risultante ? solubile in dimetilsolfossido (DMSO) o N-metilpirrolidone (NMP) in cui ? solubile anche l?amfotericina B.
Il condroitin solfato sostituito con ammonio e il composto amfotericina B ?attivato? (nel caso dell?utilizzo del ODI) vengono quindi fatti reagire in DMSO o NMP; la reazione ad esempio pu? avvenire in 24 ore a 40 ?C. Da un punto di vista chimico la reazione consiste nella condensazione della funzionalit? carbossilica dell?amfotericina B (attivata con ODI) con il gruppo idrossilico nelle unit? N-acetilgalattosamina del condroitin solfato. Il rapporto delle unit? di N-acetilgalattosamina alle quali viene legata l?amfotericina B sul numero totale di tali unit? presenti nel condroitin solfato pu? essere vantaggiosamente compreso fra 1 % e 50%.
Una volta ottenuta la molecola oggetto della presente invenzione, essa pu? poi essere aggiunta ad acqua, che normalmente pu? essere acqua bidistillata, ad una soluzione salina tampone, ad una soluzione fisiologica oppure ad un medium di coltura, in una quantit? tale che la sua concentrazione risultante sia compresa fra 1% e 30% p/v, preferibilmente fra 2% e 10% p/v, ottenendo una delle composizioni oggetto della presente invenzione sopra menzionate.
Agendo come fin qui descritto, tutte le concentrazioni della molecola antimicotica in acqua comprese fra 1% e 30% p/v danno luogo a delle soluzioni trasparenti uniformi, spesso in forma di idrogel.
RISULTATI SPERIMENTALI
Nel seguito verranno discussi i risultati sperimentali ottenuti in relazione ad una molecola antifunginea sintetizzata in accordo con la presente invenzione (nel seguito e nelle tavole allegate denominata ?Amfotericina B-Chondroitin?), per la quale si ? proceduto ad un esame di stabilit? ed attivit? antimicotica in confronto a quelle sia deiramfotericina pura (nel seguito e nelle tavole allegate richiamata come ?Amfotericina B-insolubile?), sia della miscela micellare amfotericina+deossicolato (nel seguito e nelle tavole allegate richiamata come ?Amfotericina B-deossicolato?).
Sintesi Amfotericina B-Chondroitin
In un pallone da 50 mi sono stati sciolti 220 mg (0.2 eq.) di amfotericina B in NMP, ed, a completa solubilizzazione, sono stati aggiunti 74 mg (0,2 eq.) di IIDQ. La miscela di reazione ? stata quindi lasciata in agitazione per 20 min a temperatura ambiente.
Sono poi aggiunti 400 mg (1 eq.) di sale di tetrabutil ammonio del condroitin solfato (condroitin TBA) con peso molecolare compreso nel range 20-30 kDa, e la reazione ? lasciata decorrere a temperatura ambiente over night. La mattina dopo il tutto ? stato trasferito in un becker da 500 mi.
Sono stati quindi aggiunti in sequenza:
- 10 mi di acqua molto lentamente e sotto agitazione;
- 5 mi di soluzione satura di NaCI goccia a goccia e sotto agitazione; - 50 mi di acetone lentamente e sotto agitazione.
A quel punto si ? lasciato decantare il precipitato.
Successivamente si ? eliminato il surnatante effettuando 2 lavaggi con 50 mi di acetone freddo ognuno.
II rimanente ? stato poi lavato con una miscela fredda Etanolo/acqua 80/20, sino a completa eliminazione del NaCI (saggio con AgN03 sul surnatante); sono serviti quattro lavaggi da 50 mi ognuno.
Dopo avere eliminato completamente l'NaCI si ? lavato con etanolo 100% (2 lavaggi da 50 mi ognuno).
Infine si ? lavato con acetone 100% (2 lavaggi da 50 mi ognuno).
Le operazioni di lavaggio ed eliminazione del surnatante sono state effettuate attraverso gouch 4G (oppure capsula di filtrazione da 0,22 pm o 0,45 pm) avendo cura di non mandare mai completamente a secco il precipitato.
In alternativa il precipitato pi? la soluzione di lavaggio avrebbero potuto essere centrifugati, con centrifugazione non superiore a 3000 giri/min, e il surnatante eliminato per aspirazione.
La miscela ? stata poi dializzata contro acqua MilliQ utilizzando una membrana con cutoff 15 KDa per 5 giorni, ed il dializzato ? stato filtrato con filtro 0,45 pm.
Il prodotto ottenuto per liofilizzazione ? stato pari a 180 mg.
Metodi
I test sono stati effettuati aggiungendo le diverse sostanze a liquidi di conservazione per cornee. In particolare, i liquidi commerciali che sono stati utilizzati sono:
- EUSOL-C commercializzato da AI.Chi.Mi.A. S.r.l.
Italia: si tratta di un liquido per la conservazione delle cornee a 4?C per periodi fino a quattordici giorni; e
- OPTISOL-GS commercializzato dalla Bausch & Lomb Incorporated : anche in questo caso si tratta di un liquido per la conservazione delle cornee a 4?C.
Innanzitutto, per ciascun liquido di conservazione (EUSOL-C e OPTISOL-GS) sono state preparate tre diverse soluzioni sterili:
- soluzione 1: soluzione con 10 pg/ml di Amfotericina B-Chondroitin;
- soluzione 2: soluzione con 10 pg/ml Amfotericina B-deossicolato;
- soluzione 3: soluzione con 10 pg/ml di Amfotericina B-insolubile.
Sono state inoltre preparate due ulteriori soluzioni come controllo:
- soluzione 4 (primo controllo): soluzione con 10 pg/ml di una miscela amfotericina-deossicolato in acqua;
- soluzione 5 (secondo controllo): soluzione con 10 pg/ml di amfotericina pura in DMSO.
Tutte le soluzioni sono state poi conservate in flaconi a 4?C per quattordici giorni senza agitazione. Al quattordicesimo giorno dopo l?ultimo esame, il flacone ? stato agitato ed ? stato eseguito un ulteriore esame.
L?attivit? antimicotica di ogni soluzione ? stata testata tramite il test di diffusione su agar. In particolare, dopo 0, 1, 2, 7 e 9 giorni di conservazione a 4?C, ogni soluzione ? stata prelevata e depositata sulle piastre di agar seminate con Candida Albicans (CA). Il diametro dell?alone d?inibizione di crescita di CA, indotto da ogni soluzione ? stato misurato sulla piastra dopo 24h d?incubazione a 31 ?C. Per ogni intervallo di tempo, 6 campioni di ogni soluzione, corrispondenti a 3 prelievi da due flaconi diversi, sono stati testati.
Risultati
La figura 1 mostra i risultati ottenuti per le soluzioni da 1 a 3 in OPTISOL-GS.
In particolare, il grafico mostra l?andamento dell?alone di inibizione generato dalle soluzioni su una piastra in agar; i valori in ordinata rappresentano la variazione percentuale del diametro dell?alone rispetto al valore iniziale (giorno 0), mentre i valori in ascissa rappresentano il tempo espresso in giorni.
La figura 2 ? un grafico analogo a quello di figura 1 che si riferisce al caso delle soluzioni in EUSOL-C.
Le figure 3 e 4 ripresentano i medesimi dati, rispettivamente per la soluzione 1 e la soluzione 2, delle figure 1 e 2, in un diverso formato e con l?aggiunta in figura 4 dell?andamento degli aloni di inibizione per la soluzione 4 di controllo. La freccia indica il momento in cui il flacone ? stato sottoposto ad agitazione.
Per quanto riguarda il comportamento delle soluzioni a base di OPTISOL-GS, come si pu? vedere in Fig. 1 , fino a nove giorni di conservazione a 4?C l?attivit? della soluzione 1 (con Amfotericina B-Chondoritin) ? risultata superiore all?attivit? della soluzione 2 ad ogni tempo analizzato. Dopo quattordici giorni di conservazione, la soluzione 1 non ha formato nessun alone d?inibizione mentre la soluzione 2 ha formato un alone di diametro pari al 35% del diametro degli aloni iniziali. Dopo l?agitazione, eseguita come detto solo dopo quattordici giorni di conservazione, la soluzione 1 e la soluzione 2 hanno formato aloni con diametro pari rispettivamente al 46% e 55% del diametro iniziale. L'attivit? della soluzione 1 in OPTISOL GS ? inoltre rimasta stabile con la formazione di un alone di diametro pari al 92% di quello iniziale fino a sette giorni di conservazione a 4?C senza agitazione. Dopo nove giorni, si ? invece osservata una riduzione del 44% del diametro dell?alone d?inibizione sulle piastre di candida albicans. Dopo 14 giorni e in assenza dell?agitazione dei flaconi, la soluzione 1 non ha formato alcun alone. Alla fine dell?esperimento (dopo i quattordici giorni), l?agitazione dei flaconi di soluzione 1 in OPTISOL-GS ha permesso di recuperare l?attivit? antimicotica della soluzione 1 con l?apparizione degli aloni d?inibizione corrispondenti a circa il 46% del diametro iniziale.
La soluzione 1 in OPTISOL-GS ? inoltre apparsa limpida alla valutazione visiva fino a nove giorni di conservazione mentre dopo quattordici giorni si ? formato un precipitato giallo.
Per quanto riguarda la soluzione 2 in OPTISOL-GS, essa ? rimasta stabile fino a 2 giorni di conservazione a 4?C senza agitazione. Dopo sette, nove e 14 giorni, si ? osservata una riduzione di circa 25%, 55% e 65% del diametro degli aloni d?inibizione sulle piastre di candida albicans. Alla fine dell?esperimento (quattordici giorni), l?agitazione dei flaconi di soluzione 2 in OPTISOL-GS ha permesso di evidenziare il recupero dell?attivit? antimicotica con apparizione degli aloni d?inibizione corrispondenti a circa 55% del diametro iniziale. Anche la soluzione 2 in OPTISOL-GS ? inoltre apparsa limpida alla valutazione visiva fino a nove giorni di conservazione mentre dopo quattordici giorni si ? formato un precipitato giallo.
Vediamo ora i risultati per quanto riguarda le soluzioni in EUSOL-C.
Come si pu? vedere, in questo caso l?attivit? della soluzione 1 ? risultata paragonabile all?attivit? della soluzione 2 ad ogni tempo analizzato. L?unica differenza ? stata osservata dopo l?agitazione effettuata allo scadere dei quattordici giorni di conservazione a 4?C; a seguito dell?agitazione, infatti, solo la soluzione 2 ha formato aloni di inibizione con un diametro pari al 51% del diametro iniziale, mentre la soluzione 1 non ha formato nessun alone d?inibizione, indicando una possibile degradazione deN?Amfotericina B-Chondroitin in EUSOL-C. L'attivit? della soluzione 1 in EUSOL-C ? rimasta stabile fino a 2 giorni di conservazione a 4?C senza agitazione. Dopo sette, nove e quattordici giorni si ? invece osservata una riduzione del diametro degli aloni di circa 38%, 69% e 100% rispettivamente. La soluzione 1 in EUSOL-C ? infine apparsa limpida per tutto il periodo dell?esperimento.
Sempre in EUSOL-C, l'attivit? della soluzione 2 ? rimasta stabile fino a 2 giorni di conservazione a 4?C senza agitazione. Dopo sette, nove e quattordici giorni si ? invece osservata una riduzione del diametro degli aloni di circa 37%, 70% e 94%. L?agitazione del flacone di soluzione 2 in EUSOL-C alla fine dell? esperimento ha permesso di recuperare circa 52% dell?attivit? iniziale. La soluzione 2 in EUSOL-C ? rimasta limpida fino a nove giorni di conservazione. Dopo quattordici giorni si ? invece formato un precipitato giallo.
Si noti infine che la soluzione 4, usata come soluzione di controllo ha formato gli aloni di diametro pari al 78% del diametro iniziale dopo quattordici giorni di conservazione a 4?C senza agitazione (Fig. 4).
Alla luce dei risultati riportati nelle figure, si pu? comunque concludere che la molecola secondo la presente invenzione, oggetto dei test, ? rimasta attiva quantomeno fino a nove giorni di conservazione a 4?C sia in OPTISOL che in EUSOL-C, risultando al contempo pi? stabile in OPTISOL GS che in EUSOL-C.
Infatti, mentre in OPTISOL-GS dopo quattordici giorni di conservazione ha mostrato una perdita di attivit? del 55% e con formazione di un gradiente di concentrazioni (evidenziato dal cambiamento dei risultati a seguito dell?agitazione), in EUSOL-C ha mostrato una progressiva perdita di attivit? del 37% (a sette giorni), del 68%(a nove giorni) e del 100% (a quattordici giorni) abbinata ad una probabile degradazione della molecola.
La figura 5 mostra infine l?andamento degli aloni di inibizione per le soluzioni 3 (sia in OPTISOL-C sia in EUSOL-C) e per la soluzione 5.
Come si pu? vedere, mentre la soluzione 5 ? rimasta stabile fino a nove giorni di conservazione a 4?C e dopo quattordici giorni si ? osservata la diminuzione del 11% del diametro degli aloni, le soluzioni 3 non hanno formato alcun alone d?inibizione sulle piastre di candida albicans.
La soluzione 5 ? inoltre rimasta limpida per tutto il periodo dell?esperimento. Alla luce dei risultati sopra riportati si pu? quindi concludere che la molecola antimicotica oggetto della presente invenzione ha ottenuto i risultati sperati e consegue quindi importanti vantaggi.
La molecola antimicotica sintetica oggetto della presente invenzione ? infatti biocompatibile rispetto ad organi e tessuti umani (almeno per i tempi di contatto previsti nelle applicazioni di interesse) e presenta un?elevata solubilit? in acqua abbinata ad attivit? antimicotica significativa quantomeno a temperature biocompatibili (indicativamente tra gli 0?C e 40?C).
In secondo luogo, grazie alla presente invenzione ? stato possibile mettere a punto una composizione a base d?acqua per la conservazione e/o la processazione di cornee e/o altri tessuti o organi espiantati che presenta ottime propriet? antimicotiche, propriet? invece assolutamente assenti nelle composizioni oggi in commercio.
Ulteriormente, grazie alla presente invenzione ? stato possibile mettere a punto un medicamento antimicotico che pu? essere facilmente somministrato in soluzione acquosa.
Va infine rilevato che la presente invenzione risulta di relativamente facile realizzazione e che anche il costo connesso alla sua attuazione non risulta molto elevato.
L?invenzione cos? concepita ? suscettibile di numerose modifiche e varianti, tutte rientranti neN?ambito del concetto inventivo che la caratterizza.
Tutti i dettagli sono rimpiazzabili da altri tecnicamente equivalenti ed i materiali impiegati potranno essere qualsiasi a seconda delle esigenze.
Claims (26)
- RIVENDICAZIONI 1. Molecola antimicotica sintetica costituita da una catena di unit? di base o da un un analogo strutturale della catena di unit? di base, ciascuna unit? di base avendo struttura:in cui: per ciascuna unit? di base della catena, uno tra R3 ed R4 ? un gruppo solfato con strutturacon R6 che rappresenta o un atomo di idrogeno, o uno tra un atomo metallico ed un gruppo funzionale con comportamento metallico o cationico, legati al corrispondente atomo di ossigeno O con un legame ionico monovalente; per una pluralit? di unit? di base della catena, almeno uno tra R1, R2, e quello tra R3 e R4 che non ? il detto gruppo solfato, ? un gruppo con propriet? antimicotiche che presenta a propria volta la struttura:per ciascuna unit? di base della catena, R5 rappresenta o un atomo di idrogeno, o uno tra un atomo metallico ed un gruppo funzionale con comportamento metallico o cationico, legati al corrispondente atomo di ossigeno O con un legame ionico monovalente; e quantomeno la maggior parte dei restanti Ri, R2, R3 ed R4 dell?intera catena sono costituiti ciascuno da un gruppo -OH.
- 2. Molecola antimicotica secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dal fatto che ogni unit? di base della catena comprende al massimo uno solo di detti gruppi con propriet? antimicotiche.
- 3. Molecola antimicotica secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dal fatto che ogni unit? di base della catena presenta al massimo due di detti gruppi con propriet? antimicotiche.
- 4. Molecola antimicotica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzata dal fatto che solo tra il 1% ed il 50% delle unit? di base della catena presenta almeno uno di detti gruppi con propriet? antimicotiche.
- 5. Molecola antimicotica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzata dal fatto che per ciascuna unit? di base della catena il gruppo solfato ? il gruppo R4.
- 6. Molecola antimicotica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzata dal fatto che tutti detti restanti R1, R2, R3 ed R4 sono costituiti ciascuno da un gruppo -OH.
- 7. Molecola antimicotica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per uso come medicinale.
- 8. Molecola antimicotica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per uso nel trattamento di infezioni micotiche.
- 9. Molecola antimicotica secondo la rivendicazione 8 per uso in chirurgia oftalmica.
- 10. Miscela acquosa comprendente una molecola antimicotica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6.
- 11. Miscela acquosa secondo la rivendicazione 10 caratterizzata dal fatto di comprendere in percentuale peso/volume tra l?1% ed il 30% della molecola antimicotica.
- 12. Miscela acquosa secondo la rivendicazione 11 caratterizzata dal fatto di comprendere in percentuale peso/volume tra il 2% ed il 10% della molecola antimicotica.
- 13. Miscela acquosa secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 12 caratterizzata dal fatto di presentarsi in forma di idrogel almeno in un range di temperature comprese tra 0?C e 40?C.
- 14. Miscela acquosa secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 13 caratterizzata dal fatto che la molecola antimicotica ? sciolta nell?acqua della miscela.
- 15. Miscela acquosa secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 14 per uso come medicinale.
- 16. Miscela acquosa secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 14 per uso nel trattamento di infezioni micotiche.
- 17. Miscela acquosa secondo la rivendicazione 16 per uso in chirurgia oftalmica.
- 18. Liquido per la conservazione e/o la processazione di organi o tessuti destinati al trapianto comprendente una molecola in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 o una miscela in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 17.
- 19. Uso di una molecola in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 o di una miscela in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 17 per la decontaminazione di organi o tessuti destinati al trapianto.
- 20. Metodo per il trattamento di organi o tessuti destinati al trapianto in cui l?organo o il tessuto viene immerso in una composizione a base d?acqua che comprende al proprio interno una molecola antimicotica in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 o una miscela in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 17.
- 21. Metodo per sintetizzare una molecola antimicotica comprendente le fasi operative di: prendere del condroitin solfato od un sale di condroitin solfato o un altro analogo strutturale di un condroitin solfato, il condroitin solfato essendo costituito da una catena di unit? di base ciascuna delle quali ha struttura: in cui:- per ciascuna unit? di base della catena, uno tra R3 ed R4 ? un gruppo solfato con struttura e l?altro un gruppo ossidrile -OH; R1, R2 sono costituiti ciascuno da un gruppo ossidrile -OH; e - per ciascuna unit? di base della catena, R5 rappresenta un atomo di idrogeno; prendere della amfotericina B, ciascuna molecola della quale presenta un?estremit? carbossilica con struttura -COOH; funzionalizzare il condroitin solfato 0 il sale di condroitin solfato o l?altro analogo struttura del condroitin solfato creando, per una pluralit? di unit? di base, un legame estereo tra l?estremit? carbossilica deN?amfotericina B ed uno di detti gruppi ossidrile del condroitin solfato 0 del sale di condroitin solfato o dell?altro analogo strutturale del condroitin solfato.
- 22. Metodo per sintetizzare una molecola antimicotica secondo la rivendicazione 21 in cui il condroitin solfato od il sale di condroitin solfato solfato o l?altro analogo strutturale del condroitin solfato hanno un peso molecolare compreso fra circa 10 kDa e 200 kDa.
- 23. Metodo per sintetizzare una molecola antimicotica secondo la rivendicazione 21 0 22 in cui ? prevista inoltre una fase di attivazione dell?estremit? carbossilica deN?amfotericina B.
- 24. Metodo per sintetizzare una molecola antimicotica secondo la rivendicazione 23 in cui la fase di attivazione prevede di far reagire l?amfotericina B con 1,1?-carbonildiimidazolo (ODI).
- 25. Metodo per sintetizzare una molecola antimicotica secondo la rivendicazione 23 in cui la fase di attivazione prevede di far reagire l?amfotericina B con 1-isobutoxycarbonyl-2-isobutoxy-1,2-dihydroquinoline (IIDQ).
- 26. Metodo per sintetizzare una molecola antimicotica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 18 a 22 in cui ? prevista una fase preliminare di formazione di un sale di tetrabutil ammonio 0 di cetiltrimetilammonio del condroitin solfato 0 del suo sale o dell?altro analogo strutturale del condroitin solfato di partenza, che viene poi fatto reagire con l?amfotericina B nella fase di funzionalizzazione.
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