ITRM960559A1 - Complessi bioadesivi di polycarbophil e farmaci antifungini o antipro= tozoari azolitici - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione avente per titolo: "Complessi bioadesivi di polycarbophil e farmaci antifungini o antiprotozoari azolici"

La presente invenzione concerne complessi bioadesivi di polycarbophil e farmaci antifungini o antiprotozoari azolici. Più in particolare, l'invenzione riguarda la formulazione di un complesso tra un acido poliacrilico reticolato con spiccate caratteristiche mucoadesive, noto con il nome di polycarbophil, e un derivato imidazolico o triazolico ad attività antimicotica o antiprotozoaria, in forma basica, per l'uso nel trattamento topico di affezioni mucosa!).

Come è noto, le patologie di origine microbica che colpiscono le mucose, per la terapia delle quali sono utilizzate vie di somministrazione transmucosali, sono numerose e ampiamente diffuse. In particolare, tra le patologie di questo genere che colpiscono l’apparato genito-urinario sono molto comuni le infezioni di tipo micotico, e tra queste in modo specifico le candidosi.

Candida albicane rappresenta la specie appartenente al genere Candida più comunemente implicata nelle candidosi umane, e l'unica patogena in animali da laboratorio. Essa è ritenuta responsabile della maggioranza delle micosi superficiali (muco-cutanee) e di alcune gravi micosi profonde, ed è comunemente presente sulle superfici mucose quali quelle del cavo orale e del tratto gastrointestinale deli'uomo, in equilibrio con la flora endemica di tali distretti. Nella popolazione sana si stabiliscono, normalmente, condizioni di equilibrio tra la capacità invasiva del micete ed i meccanismi di difesa dell'ospite, atti a limitare l'invasione tissutale ed eventualmente eradicare l'infezione dalle mucose superficiali; l’insorgenza di un processo patologico è conseguenza della rottura di tale equilibrio, e ciò può essere dovuto sia alla diversa virulenza del lievito infettante sia alla diminuita resistenza dell'ospite. L'importanza dei meccanismi di difesa dell'ospite, sia naturali che acquisiti, nei confronti delle candidosi è fortemente avvalorata dall'Incidenza di infezioni micotiche, in particolare proprio candidosi, in individui immunocompromessi.

Le candidosi dell'apparato genito-urinario, assai più diffuse nelle donne che negli uomini, sono caratterizzate da prurito e perdite e, ai riscontri clinici, da eritema ed edema, e talvolta lesioni ulcerate o papulari. Statistiche epidemiologiche sull'incidenza delle candidosi vaginali sono difficili da stabilire, anche se si può ritenere che l'incidenza sia notevolmente aumentata negli ultimi anni, anche in relazione al sempre più vasto uso di contraccettivi ormonali e di antibiotici antibatterici. Tali patologie, e in generale tutte le affezioni di tipo micotico del sistema genito-urinario, possono essere trattate terapeuticamente con farmaci antimicrobici ad uso topico, in modo specifico derivati imidazolici come econazolo, tioconazolo, miconazolo e simili, o derivati triazolici come il terconazolo, o anche con farmaci somministrati oralmente, in particolare di tipo triazolico come il fluconazolo. Viene in genere raccomandato di utilizzare inizialmente la terapia azoiica topica, salvo sostituirla con una terapia sistemica in pazienti che non rispondono o che sono intolleranti verso la terapia locale; questo a causa della lieve tossicità dei farmaci ad uso sistemico rispetto ai farmaci che esplicano la loro attività in situ , e della necessità di limitare l'uso di questi farmaci per evitare l'insorgenza di ceppi resistenti.

Tra i farmaci antifungini sopra menzionati, è particolarmente diffuso e ampiamente sperimentato l'econazolo, 1-[2-{4-clorofenil)metossi]-2-(2,4-diclorofenil)etil-1H-imidazolo, sintetizzato ne! 1969 da Godefroi et al. (J. Med. Chem., 12, 1969, 784, nonché brevetto USA No. 3.717.655). L'attività antimicrobica deH'econazolo, che è stata ampiamente dimostrata in vitro, è esercitata contro una vasta varietà di miceti e contro alcuni batteri Gram-positivi, mentre è assente un'attività sui Gram-negativi. Il principale sito dell'azione antimicrobica è rappresentato dal sistema di membrana cellulare, analogamente a quanto avviene per gii altri farmaci antifungini imidazolici. Esperimenti in vitro con Trichophyton rubrum, Saccharomyces cerevisiae e Candida aibicans hanno mostrato un aumento della permeabilità dell'involucro cellulare esposto all'econazolo, che si verifica sia nelle cellule in crescita che non, dimostrando con ciò che l'attività antimicrobica è dovuta ad un'azione sulle membrane formate e non alla formazione di membrane difettose nella fase di crescita. L'azione principale del farmaco è l'inibizione della 14-a-demetiiasi, un sistema enzimatico microsomiale ciocromo P450-dipendente importante per la sintesi degli steroli. Tale azione ha due effetti: determina un accumulo di 14-ametilsteroli, e compromette la biosintesi dell'ergosterolo necessario per la membrana citoplasmatica. I metilsteroli accumulati possono disgregare lo stretto impaccamelo delle catene aciliche dei fosfolipidi, compromettendo le funzioni di certi sistemi enzimatici legati alla membrana.

L'econazolo è usato prevalentemente per somministrazione topica nel trattamento delle dermatomicosi e delle candidosi vaginali, e attualmente esistono in commercio numerose specialità che lo contengono come principio attivo, specialmente per applicazione vaginale. Nella maggior parte di tali specialità esso è presente non come econazolo base, ma in forma di nitrato.

Un altro tipo di patologie microbiche per le quali sono utilizzate terapie a base di principi attivi azotici, da somministrare normalmente per via transmucosale, sono le infezioni da protozoi del genere Trichomonas, che si manifestano generalmente nella donna come cerviciti, vaginiti e vulvovaginiti e che possono anche essere associate con candidosi o altre infezioni batteriche. Il principio attivo d'elezione per le trichomoniasi è il metronidazolo, anch'esso appartenente al gruppo dei derivati imidazolici. Per la terapia topica, sia nell’uomo che nella donna, delle infezioni da trichomonas, il metronidazolo viene vantaggiosamente associato con un altro derivato imidazolico ad azione prevalentemente antifungina, il clotrimazolo.

Le forme di somministrazione tradizionali utilizzate per gli antimicrobici topici dei tipi sopra descritti sono più comunemente le creme, gli ovuli e le compresse. Nel caso dell'econazolo, ad esempio, sono disponibili per applicazione vaginale ovuli e creme a base di econazolo nitrato, che rappresentano le preparazioni d'elezione, nonché lavande e schiume per uso esterno, sia in forma di nitrato che come econazolo base, che sono generalmente utilizzate come coadiuvanti nella terapia. Ovuli (che contengono 50 o 150 mg di farmaco) e creme (all'1% in peso di farmaco, da applicare in dosi di 5 g) vengono somministrati una volta al giorno, preferibilmente al momento di coricarsi per facilitare la ritenzione. Tali forme non consentono, in generale, di ottenere una biodisponibilità ottimale del farmaco; affinché la terapia esplichi al massimo la sua efficacia, infatti, è necessario che si verifichino le seguenti condizioni: a) una buona adesione della medicazione sul sito infetto, e b) la completa liberazione del principio attivo. Ciò spesso non si verifica con le medicazioni in uso: per gli ovuli, in particolare, si pone il problema della ritenzione in quanto, a fusione avvenuta, (a formulazione può fuoriuscire rapidamente dal sito di applicazione.

Un adeguato spargimento della formulazione sul sito infetto, possibilmente seguito da un'interazione con lo strato mucoso di detto sito, potrebbe portare ad un notevole aumento della biodisponibilità del farmaco. Tale risultato può essere raggiunto aumentando la durata e l'intimità del contatto tra la medicazione e la mucosa: su questa base il concetto di bioadesione, e in particolare di mucoadesione, ha assunto negli ultimi tempi notevole importanza nella formulazione di sistemi per il rilascio controllato di farmaci per somministrazione transmucosale, ivi compresi, ma non esclusivamente, i sistemi per l'applicazione topica vaginale.

Con il termine bioadesione si intende l'instaurarsi di un intimo contatto, per un periodo di tempo prolungato, tra un materiale farmaceutico ed un substrato biologico, dovuto a formazione di legami chimici, a forze interfacciali e/o a semplici interazioni fìsiche tra le due superfici. Quando l’interazione bioadesiva viene ad instaurarsi tra la forma farmaceutica ed il muco che riveste gran parte dei tessuti, il fenomeno viene definito come mucoadesione. I vantaggi ottenibili somministrando un principio attivo mediante una forma farmaceutica bioadesiva sono molteplici, e possono essere sintetizzati nei seguenti punti:

• localizzazione del farmaco in una regione specifica: è vantaggiosa nel caso di una terapia topica, perché l'aumento della durata e dell’intimità del contatto tra forma farmaceutica e tessuto migliora la biodisponibilità del farmaco;

• aumento del tempo di residenza in situ: la forma farmaceutica ha un'efficacia prolungata, e questo consente la riduzione del numero di somministrazioni giornaliere migliorando l’osservanza (compliance) del paziente;

• contatto ottimale con la superficie di assorbimento: consente una maggiore permeazione del farmaco attraverso i tessuti, inibisce l'attività enzimatica degradativa sul principio attivo e riduce la produzione di muco;

• mantenimento di un elevato gradiente dì concentrazione tra la forma farmaceutica ed il sito di assorbimento: consente un rilascio ottimale del farmaco, in obbedienza alle note leggi che descrìvono la diffusione passiva.

Negli ultimi anni è stato dimostrato un notevole interesse per l'inserimento di polimeri bioadesivi nelle forme farmaceutiche convenzionali. Le forme bioadesive così ottenute sono costituite prevalentemente da materiali polimerici in grado di interagire con il muco o con le mucine. Le caratteristiche richieste ad un polimero bioadesivo per essere utilizzabile - a livello farmaceutico possono essere schematizzate come segue:

• assenza di tossicità;

• capacità di formare un forte legame di tipo non covalente con le cellule epiteliali delle superfici mucose, e di aderire velocemente alle superfici umide;

• capacità di incorporare facilmente ed in maniera riproducibile il farmaco, senza esercitare alcun effetto negativo sul suo rilascio.

Vari polimeri bioadesivi sono utilizzabili, in particolare, in formulazioni vaginali: tra gli idrogeli naturali possono essere citati l'amido, il collagene, la gelatina, alcuni destrani ed anche derivati cellulosici, tra cui ridrossipropilmetilcellulosa, ridrossipropilcellulosa e la carbossimetilcellulosa sodica. Tra i polimeri sintetici in grado di formare idrogeli solamente due classi appaiono usate per formulazioni a rilascio vaginale: i polietilenossidi (glicoli polietilenici ad alto peso molecolare) e gli acidi poliacrilici.

Tra questi ultimi, particolarmente vantaggioso per le sue proprietà bioadesive è ii poiycarbophil (prodotto dalla B.F. Goodrich Company, di Cleveland, Oh. come Noveon® AA-1), un polimero di acido acrilico leggermente reticolato con un glicol divinilico, in particolare con una quantità compresa tra lo 0,5 e Γ1 % in peso di 3,4-diidrossi-1,5-esadiene, il quale corrisponde al No. di CAS 9003-01-04. Le particelle che lo costituiscono rigonfiano ma sono insolubili in acqua, e rigonfiano anche in varia misura in solventi organici, in acidi minerali forti ed in basi, pur essendo ancora insolubili. Le caratteristiche di rigonfiamento in acqua dipendono sia dal pH che dalla forza ionica della soluzione: il grado di rigonfiamento aumenta al crescere del pH. La quantità di acqua che il polimero può assorbire va da 15-35 mi per grammo, a bassi valori del pH (1-3), fino a raggiungere i 100 mi per grammo, in ambiente neutro o basico. Il poiycarbophil è descritto, assieme ad altri polimeri di analoga costituzione chimica, nel brevetto USA No. 3.202.577 (R.L. Markus, 1965), dove ne viene proposto l'uso per il trattamento della diarrea, proprio a causa della sua marcata capacità di rigonfiarsi assorbendo i liquidi.

Successivamente, si è rilevato che il poiycarbophil presenta eccellenti caratteristiche mucoadesive, che sono state ampiamente descritte in letteratura (si veda, ad es. H. Park e J. R. Robinson, J. Controlled Release, 2, 1985, 47-57; KV.R. Rao e P. Buri, Int. J. Pharm, 52, 1989, 265-270). L'interazione del polimero con la mucina è facilitata dal fatto che le catene polimeriche subiscono rigonfiamento in acqua, e questo permette un buon grado di interpenetrazione con le catene glicoproteiche del muco presente sulla superficie dei tessuti.

Le citate caratteristiche mucoadesive sono appunto alla base dei documenti brevettuali europei No. 0 163 696 e No. 0 501 523, a nome Columbia Laboratories Ine., riguardanti l'uso di una classe di prodotti polimerici, di cui il polycarbophil è l'esempio preferito, come bioadesivi per la produzione di farmaci a rilascio protratto. In questi documenti (di cui il secondo è una domanda divisionale del primo) il prodotto polimerico bioadesivo viene proposto per l'uso in miscela con principi attivi farmaceutici o cosmetici, ma è anche stato proposto, dallo stesso gruppo di ricerca, di utilizzare il polycarbophil da solo, per il trattamento di varie patologie oftalmiche, vaginali e del cavo orale, che si manifestano con sensazione di eccessiva secchezza delle mucose. In questo contesto è stato recentemente introdotto sul mercato, con il nome commerciale di Replens®, un reidratante vaginale contenente polycarbophil, che si afferma essere in grado di aderire alla mucosa, rilasciando gradualmente per circa 72 ore il suo contenuto in acqua (S.H. Leung e J.R. Robinson, Poiym. News, 15, 1990, 333-342).

Sulla base di un tale stato deN'arte, si può prevedere che le caratteristiche del polycarbophil sarebbero sfruttabili con vantaggio per la produzione di miscele mucoadesive con farmaci antifungini e/o antiprotozoarici di tipo azolico per somministrazione transmucosale, in particolare per uso topico vaginale. Allo scopo di ottenere prodotti bioadesivi a rilascio protratto in cui l'ancoraggio del farmaco alla mucosa da trattare sia massimo, e siano di conseguenza ulteriormente esaltati i già menzionati vantaggi conseguibili con l’uso di un eccipiente bioadesivo, la presente invenzione propone di attuare una vera e propria complessazione tra il polycarbophil e il principio attivo azolico, nella sua forma basica, così da dar luogo non ad una semplice miscela fisica di farmaco e carrier mucoadesivo, ma ad un’entità chimica in cui detto farmaco è strettamente legato all'agente bioadesivo.

Ciò è reso possibile dalla stessa natura chimica del polimero bioadesivo prescelto, dotato di gruppi carbossilici reattivi, e dei principi attivi azolici, i quali, quando non salificati, sono di natura basica. Posti in contatto tra loro in opportune condizioni di reazione, i composti formano complessi i quali non solo godono delle proprietà bioadesive del polycarbophil, ma presentano anche un rilascio del principio attivo estremamente prolungato nel tempo e caratterizzato da una velocità uniforme. In pratica, le formulazioni risultanti sono in grado: a) di aderire alia mucosa ad opera delia componente polimerica, e b) di rilasciare il derivato azolico base in situ molto lentamente e con velocità costante.

La somministrazione di complessi azolo-polycarbophil presenta, rispetto alla somministrazione della corrispondente base libera o di un suo sale (ad esempio, il nitrato) tutti i vantaggi già citati a proposito dei sistemi bioadesivi. Ma anche rispetto alla somministrazione di una miscela fisica tra il polycarbophil e il principio attivo, come sarà evidente nel seguito, si ottengono superiori caratteristiche di costanza e durata del rilascio, oltre che, come è intuitivo, un contatto più intimo e durevole tra il principio attivo e la superficie mucosa. L’aumento del tempo di residenza in situ, unitamente al tipo di rilascio dei farmaco dal complesso, portano ad una efficacia prolungata, rendendo così possibile una riduzione del numero di somministrazioni giornaliere ed un miglioramento della compliance del paziente. Inoltre, l'intimità del contatto tra il complesso e la mucosa può consentire una maggiore entità e velocità di permeazione del farmaco attraverso i tessuti, riducendo nel contempo l'attività enzimatica degradativa sul principio attivo.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un complesso antimicrobico mucoadesivo tra il polycarbophil, acido poliacrilico reticolato con proprietà bioadesive, e un derivato azolico ad attività antifungina o antiprotozoaria, nella sua forma basica.

In particolare, detto derivato azolico può essere un derivato imidazolico, scelto dal gruppo consistente in: econazolo, clotrimazolo, metronidazolo, miconazolo, tioconazolo, fenticonazolo, isoconazolo, ketoconazolo, sulconazolo, bifonazolo, omoconazoio, azanidazolo, butoconazoio e ossiconazolo. Particolarmente preferiti per l’uso nei complessi dell'invenzione sono econazolo, clotrimazolo e metronidazolo, i primi due ad attività antifungina e il terzo ad attività antitrichomonas.

In alternativa, il derivato azolico può essere un derivato triazolico, come fluconazolo, terconazolo e itraconazolo. Tali composti presentano lo stesso spettro antimicotico e lo stesso meccanismo d'azione dei derivati imidazolici antifungini ma alcuni di essi, a differenza degli imidazoli, possono anche essere somministrati per via sistemica. In ogni caso, data la loro natura chimica, il meccanismo di complessazione con polycarbophil è analogo.

I complessi antimicrobici mucoadesivi secondo l'invenzione possono essere ottenuti, in generale, dissolvendo ciascuno dei due prodotti di partenza in un solvente comune, unendo le due soluzioni in quantità relative tali da contenere lo stesso numero di equivalenti di prodotto, e facendo quindi evaporare il solvente. Preferibilmente, il prodotto solido ottenuto dall'evaporazione viene successivamente essiccato, polverizzato e setacciato. La quantità di polycarbophil necessaria viene preventivamente calcolata determinandone l'equivalente di neutralizzazione mediante titolazione potenziometrica. Tale valore è risultato, nella sperimentazione condotta nell'ambito della presente invenzione, pari a circa 7 meq/g.

Secondo alcune forme di realizzazione preferite dell'invenzione, i complessi econazofo-polycarbophil, clotrimazolo-polycarbophil e metronidazolo-polycarbophil vengono ottenuti preparando due soluzioni metanoliche, l'una contenente il farmaco, nella sua forma basica, e l'altra contenente il polimero, le quantità relative di farmaco e di polimero da solubilizzare essendo state calcolate in modo tale da ottenere nelle due soluzioni un uguale numerò di equivalenti di reagente. Per il polycarbophil l'equivalente di neutralizzazione è stato determinato mediante titolazione potenziometrica eseguita con NaOH 0,01 N su 100 mg di polimero, ed ha dato, come già notato, un valore di 7 meq/g. Le soluzioni metanoliche vengono unite e la soluzione risultante viene posta in un evaporatore rotante termostatato a 40 °C. Il prodotto solido ottenuto viene successivamente essiccato sotto vuoto a 50 eC, polverizzato e setacciato.

I complessi bioadesivi secondo l'invenzione possono essere utilizzati per la produzione di prodotti farmaceutici antimicotici e/o antiprotozoari a rilascio protratto, incorporandoli in adatte formulazioni in unione con veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili. Allo scopo di aumentare ulteriormente la bioadesività del prodotto, oltre al complesso vero e proprio può essere presente nella formulazione una quantità in eccesso di polycarbophil non complessato, che può anche essere utile per regolare la viscosità e la consistenza del prodotto. Le formulazioni contenenti i complessi dell'invenzione, con un'appropriata scelta degli eccipienti, possono avere una qualsiasi delle forme farmaceutiche già note ed utilizzate per i prodotti da somministrare per via transmucosale. Per la produzione di specialità antimicotiche e/o antiprotozoarie per uso vaginale è particolarmente preferita la forma in gel, in cui il complesso dell'invenzione, eventualmente con un eccesso di polycarbophil, nonché altri eccipienti convenzionali, quali ad esempio conservanti e addensanti, sono formulati in gel di glicoi propilenico e/o poiietiienglicol.

A titolo esclusivamente esemplificativo sono riportate nel seguito alcune formulazioni in gel contenenti i complessi secondo l'invenzione, adatte per l'applicazione topica vaginale.

ESEMPI DI FORMULAZIONI IN GEL PER APPLICAZIONE VAGINALE

formulazione 1 ) econazolo base (nel complesso) 3,00 g polycarbophil 2,12 g

(di cui 1,12 g complessati con l'econazolo) metil-parabene 0,20 g

propil-parabene 0,02 g glicol propilenico q.b. a 100,0 g Formulazione 2 econazolo base (nel complesso) 2,00 g polycarbophil 1 ,75 g (di cui 0,75 g complessati con l'econazolo) idrossipropilcellulosa 2,00 g metil-parabene 0,20 g propil-parabene 0,02 g glicol propilenico q.b. a 100,0 g Formulazione 3 econazolo base (nel complesso) 3,00 g polycarbophil 2,12 g (di cui 1,12 g complessati con l'econazolo) idrossipropilmetilcellulosa 1 ,50 g metil-parabene 0,20 g propil-parabene 0,02 g polietilengiicol 200 50,0 g glicol propilenico q.b. a 100,0 g Formulazione 4 clotrimazolo base (nel complesso) 1 ,00 g polycarbophil 1,41 g (di cui 0,41 g complessati con l'econazolo) idrossipropilmetilcellulosa 1,50 g metil-parabene 0,20 g propil-parabene 0,02 g polietilengiicol 200 50,0 g glicol propilenico q.b. a 100,0 g Formulazione 5 metronidazolo base (nel compì.) 3,00 g

polycarbophil (ne! complesso) 2,50 g

pectina 3,00 g

metil-parabene 0,20 g

propi l-parabene 0,02 g

glicoi propilenico q.b. a 100,0 g

Alcuni risultati sperimentali relativi alle caratteristiche dei complessi antimicrobici bioadesivi della presente invenzione e alle loro prestazioni come agenti terapeutici a rilascio protratto sono riportati nel seguito, assieme ad alcuni diagrammi rappresentati nelle figure allegate, in cui:

la figura 1 mostra, a confronto, i termogrammi ottenuti mediante calorimetria differenziale a scansione (DSC) dell’econazolo base e del complesso econazolo-polycarbophil secondo l’invenzione;

la figura 2 mostra i termogrammi ottenuti mediante DSC del clotrimazolo base e del metronidazolo base e, a confronto con questi, rispettivamente, i termogrammi dei complessi clotrimazolo-polycarbophil e metronidazolo-polycarbophil;

la figura 3 rappresenta, a confronto, i profili di rilascio dell’econazolo dal complesso secondo l’invenzione e da una miscela fisica di polycarbophil ed econazolo; e

la figura 4 rappresenta, a confronto, i profili di rilascio deli'econazolo da due formulazioni farmaceutiche in gel, una con il complesso econazolo-polycarbophil secondo l'invenzione e l’altra con econazolo base.

Misure di bioadesione sui polvcarbophil non complessato

In uno studio preliminare condotto nell'ambito della ricerca che ha portato alla presente invenzione le proprietà mucoadesive del poiycarbophil e di altri polimeri di riferimento sono state valutate misurando la forza richiesta per separare due superfici rivestite di mucina (dispersione di mucina gastrica suina al 25 % p/p adsorbita su carta da filtro) fra cui era posta una matrice ottenuta per compressione diretta de) polimero in esame. I polimeri di riferimento utilizzati sono il Carbopol® 940 (polimero idrosolubile di acido acrilico reticolato con polialchenil polieteri, prodotto dalla F.B. Goodrich), la pectina, la gomma xantan, l'idrossipropilcellulosa (HPC), l'alcool polivinilico (PVA) e l'idrossipropilmetilcellulosa (HPMC).

L'apparecchiatura usata per le misure consiste in una microbilancia cui viene attaccato, al di sotto del piatto, un corpo cilindrico A del peso di 8,2 g, mediante un filo di nylon. Al corpo A viene fissata una delle due superfici mucose, mentre l'altra viene assicurata ad un secondo corpo cilindrico B, dello stesso diametro del corpo A. Il prodotto polimerico allo studio, una volta applicato sulla superficie mucosa fissata al corpo A, viene messo a contatto con lo strato mucoso applicato al corpo B. Il tutto è posizionato, con il corpo A dalla parte superiore e al di sotto della bilancia, in un becher a doppia parete termostatato a 37 °C, posto al di sopra di una piattaforma mobile. Dopo aver mantenuto il contatto tra i due strati di mucosa e il polimero per un minuto, la piattaforma viene fatta discendere ad una velocità costante (2,5 mm/min), provocando così la rottura del legame tra superficie polimerica e superficie mucosa. Prima dell'applicazione

sulle superfici di mucina le matrici polimeriche vengono idratate per 5

minuti in acqua distillata. Il motore elettrico della piattaforma e la bilancia sono collegati ad un sistema computerizzato per l'acquisizione e l'elaborazione dei dati.

La forza necessaria per distaccare la superficie polimerica

dallo strato mucoso viene registrata in funzione della distanza tra le

due superfici, e dai grafici ottenuti viene calcolata l'area sotto la curva,

che rappresenta il lavoro di adesione. L'elaborazione dei dati viene

effettuata utilizzando il software KaleidaGraph (Synergy Software). I

risultati delle prove di adesione, espressi in termini di lavoro di

adesione per unità di superficie, per i vari materiali esaminati sono

esposti nella seguente tabella.

TABELLA 1

Misure di bioadesione

Dai valori che precedono si nota come i polimeri acrìlici Carbopol® 940 e (in misura anche maggiore) polycarbophil mostrano una mucoadesività molto maggiore di quella offerta dagli altri polimeri esaminati.

Caratterizzazione dei complessi azolo-polvcarbophil

Complessi econazolo-polycarbophil, clotrimazolo-polycarbophil e metronidazolo-polycarbophil, prodotti secondo il metodo preferito già descritto, sono stati sottoposti a studi di calorimetria differenziale a scansione (DSC), e il loro comportamento è stato confrontato con quello delle corrispondenti basi. Per l'analisi, campioni esattamente pesati dei materiali sono stati riscaldati alla velocità di 5 kcal/min in un intervallo di temperatura da 50 a 150 °C.

I termogrammi così ottenuti per l'econazolo base e per il relativo complesso con il polycarbophil sono riportati nella figura 1: come si può rilevare, la formazione del complesso è confermata dal fatto che nel relativo termogramma (curva b) è completamente scomparso il picco endotermico di fusione dell'econazolo (curva a).

Analogamente, nella figura 2 si può osservare che nei termogrammi relativi ai complessi clotrimazolo-polycarbophil (curva b) e metronidazolo-polycarbophil (curva d) sono completamente scomparsi i picchi esotermici di fusione delle corrispondenti basi non complessate (rispettivamente, clotrimazolo: curva a, e metronidazolo: curva c).

Studi di rilascio in vitro

• Rilascio del farmaco dal complesso e confronto con la miscela fìsica Gli studi di rilascio deN'econazoio sono stàti eseguiti utilizzando il metodo a flusso continuo descritto in FU, IX ed.. L'apparecchiatura a flusso continuo è costituita da una cella cilindrica nella quale viene messo il campione di polvere da esaminare, da un serbatoio per il mezzo di dissoluzione e da una pompa peristaltica che invia detto mezzo alla cella. La parte utile della cella è un cilindro, alto 30 mm, con un diametro interno di 22,6 mm, alla cui estremità superiore è posto un filtro di fibra di vetro che evita la fuoriuscita di particelle non disciolte. La parte inferiore, di forma conica, munita di un foro (diametro 1 mm) ette permette il flusso del liquido di dissoluzione, viene riempita con sferette di vetro (diametro 3 mm) allo scopo di garantire una distribuzione uniforme del mezzo di dissoluzione su tutta la sezione della cella. L'agitazione è assicurata dalla circolazione, dal basso verso l'alto, di solvente, che risulta sempre fresco operando a circuito aperto.

Una quantità esattamente pesata del complesso econazolopolycarbophil (300 mg) viene introdotta nella cella, centrandola sull'apposito supporto in acciaio inox. Il liquido di dissoluzione termostatato a 37°C (acido lattico a pH 4,5) viene introdotto nella cella, mediante la pompa peristaltica, ad una portata di 3,0 ml/min. La concentrazione di farmaco nella fase ricevente viene determinata mediante spettrofotometro, che esegue letture di assorbenza in continuo (λ = 272 nm).

I risultati di una prova di confronto tra il complesso secondo l'invenzione e una miscela fisica di polycarbophil ed econazolo sono mostrati nella figura 3, in cui il profilo di rilascio del farmaco dal complesso è contraddistinto dai simboli □ e il profilo di rilascio dello stesso dalla miscela fisica è contraddistinto dai simboli 0. Si può osservare che in entrambi i casi esiste una correlazione lineare tra la percentuale di farmaco ceduto e il tempo (y = 3,792x 0,901, con r -1,000 per il complesso e y = 17,907x 2,488, con r = 0,997 per la miscela fisica), e quindi il farmaco viene rilasciato a velocità costante da entrambe le polveri. Risulta invece significativamente diverso il valore della velocità di rilascio, il complesso econazolo-polycarbophil cedendo il farmaco molto più lentamente rispetto a quanto avviene per la miscela fisica. In pratica, il 70% del farmaco viene rilasciato in 18,5 ore dal complesso, mentre la stessa quantità viene rilasciata dalla miscela fisica in 4 ore.

Ovviamente, la lenta cessione deU'econazolo dal complesso costituisce una caratteristica vantaggiosa, in quanto nella somministrazione in vivo consente un'attività farmacologica prolungata nel tempo.

• Rilascio del farmaco da formulazioni in gel

Per le prove di rilascio deU'econazolo da formulazioni in gel, in cui esso era contenuto sia in forma di complesso che come econazolo base non complessato, è stata utilizzata una cella di diffusione verticale del tipo Gummer con area diffusionale di 2,3 cm2 e compartimento ricevente con una capacità di 11,0 mi; la cella era termostatata a 36 ± 0,5 °C. La fase ricevente era costituita da un tampone acetato a pH 4,5, agitata ad una velocità costante di 600 giri/min. Una quantità esattamente pesata (1 g) di gel veniva posto nel compartimento donatore a contatto con una membrana da dialisi Spectrapor, usata come supporto.

II contenuto in farmaco della fase ricevente, prelevata ad intervalli di tempo appropriati e filtrata, veniva determinato spettrofotometricamente (λ = 254 nm).

Gli studi di rilascio riportati nel seguito riguardano due formulazioni, una con il complesso econazolo-polycarbophil secondo l'invenzione (formulazione A) e l'altra con econazolo base non complessato, al quale era aggiunta idrossipropilcelluiosa in qualità di eccipiente bioadesivo (formulazione B). Specificamente, le due formulazioni confrontate avevano le seguenti composizioni:

formulazione A) econazolo base (nel complesso) 3,00 g

polycarbophil 2,12 g

(di cui 1,12 g complessati con ('econazolo)

glicol propilenico q.b. a 100,0 g

formulazione B) econazolo base 3,00 g

idrossipropilcelluiosa 2,12 g

glicol propilenico q.b. a 100,0 g

I risultati delle prove sono riportati nella figura 4, in cui il profilo di rilascio del farmaco dalla formulazione A è contraddistinto dai simboli O e il profilo di rilascio dello stesso dalla formulazione B è contraddistinto dai simboli 0. Appare evidente come l'econazolo viene rilasciato molto più lentamente dalla formulazione secondo l'invenzione, in cui si complessa con il polycarbophil, che non dalla formulazione di confronto.

Prove di attività microbiologica in vitro

La sperimentazione presentata nel seguito aveva lo scopo di saggiare l’attività del complesso econazolo-polycarbophil nei confronti di ceppi diversi di Candida albicans, verificando, in primo luogo, la capacità del complesso econazolo-polycarbophil di rilasciare completamente il principio attivo, nonché di confrontarne l'attività con quella dell'econazolo da solo. La sensibilità dei germe all'associazione antimicotico-bioadesivo è stata valutata in antimicogrammi effettuati in terreno solido o in terreno liquido.

Per i saggi sono stati utilizzati due ceppi standard della American Type Culture Collection (ATCC), indicati con le sigle ATCC 48867 e ATCC 23866. L’econazolo base e il complesso econazolopolycarbophil sono stati preparati utilizzando concentrazioni diverse del principio attivo in base alle necessità di saggio e diversi solventi (glicole propilenico, DMSO), con la presenza o meno di una sostanza eccipiente addensante (idrossipropilcellulosa). È stata inoltre saggiata l'attività di ciascuno dei solventi, nonché quelle dell'eccipiente e del polycarbophil da soli.

• Antimicogramma su terreno solido.

L'attività antimicotica è stata valutata in un saggio su terreno solido che utilizzava piastre di Petri contenenti terreno Sabouraud con agar al 2%. Le piastre venivano seminate uniformemente, con l'ausilio di un tampone sterile, con una sospensione acquosa contenente C. albicans ad una densità di 2 Me Farland. Con uno strumento del diametro di 6 mm si praticavano incisioni per ottenere cavità regolari nello spessore deH'agar. In ciascuna di queste cavità veniva posta una delle sostanze da saggiare in quantità variabili da 50 a 100 pi. Si procedeva, poi, a incubazione delle piastre per 24 h in un termostato a 37° C. L'attività antimicotica delle sostanze analizzate veniva valutata misurando il diametro di inibizione della crescita di C. albicane attorno alle cavità.

L'antimicogramma su terreno solido si è rivelato un saggio altamente sensibile e riproducibile anche con i composti saggiati. Per i due differenti ceppi e per tutti i composti analizzati sono stati effettuati almeno cinque esperimenti separati di determinazione degli aloni di inibizione. I risultati, per ciascun composto, sono stati similmente ottenuti in tutti gli esperimenti effettuati. I risultati ottenuti per i due ceppi di C. albicans saggiati sono stati sempre comparabili, dimostrando la simile suscettibilità dei due stipiti ai composti analizzati.

Nella tabella 2 sono riportati i risultati degli esperimenti effettuati con il ceppo ATCC 48867. Il polycarbophil, da solo, non ha mostrato alcuna attività inibitoria sulla crescita dei due ceppi di C albicans. Il complesso econazolo-polycarbophil (EC-PC) e l’econazolo base hanno mostrato una simile attività di inibizione, che è stata valutata in diverse condizioni di concentrazione e in presenza o in assenza di idrossipropilcellulosa (HPC).

TABELLA 2

Antimicogramma su terreno solido

• Test di suscettibilità in micropiastra (terreno liquido).

Di econazolo base ed econazolo-polycarbophil sono state ottenute delle soluzioni stock sciogliendo i composti in DMSO ad una concentrazione 1,5 mg/ml. Dalle soluzioni stock sono state effettuate due diluizioni seriali in base 10 in DMSO, fino ad una concentrazione di 15 pg/ml. Da questa concentrazione ciascun composto è stato, successivamente, diluito nel terreno Yeast Nitrogen Base addizionato di 0,5% di glucosio e 0,05% di albumina bovina e distribuito, a diverse concentrazioni, in pozzetti di micropiastre (in un volume di 90 μΙ ciascuno). In ciascun pozzetto sono stati, poi, inoculati 10 μ! di una sospensione di C. albicans ottenuta diluendo 1/10 una preparazione avente una torbidità di 2 Me Farland. Dopo 48 h di incubazione a 37° C

dalle micropiastre veniva letta la concentrazione minima inibente la

crescita (MIC) del micete, in base alla presenza o assenza di torbidità

ad una determinata concentrazione di farmaco.

Come mostrato nella seguente tabella, la concentrazione

minima inibente nei confronti di C. afbicans è risultata, per le due sostanze, compresa tra 6,2 e 5,3 pg/ml, valori non dissimili da quelli

riportati in letteratura per l'econazolo e ottenuti in diversi tipi di saggi di

suscettibilità.

TABELLA 3

Test di suscettibilità in micropiastra

Come risulta dai dati che precedono, lo studio in vitro non ha dimostrato alcuna attività inibitoria del polimero polycarbophii, saggiato

da solo, sulla crescita dei ceppi di Candida albicans, rilevando invece, da parte del complesso econazolo-polycarbophil, un completo rilascio

dell'antimicotico, che ha così mostrato pienamente la sua azione anti¬

candida, ad un livello equivalente a quello del principio attivo non

complessato.

Prove di attività microbiologica in vivo

Nell’ambito della sperimentazione microbiologica sui prodotti dell’invenzione è stata inoltre saggiata l'attività farmacologica in vivo del complesso econazolo-polycarbophil, in confronto con l'econazolo base, nel trattamento topico di un'infezione intravaginale sperimentale con Candida albicans, riprodotta in un modello murino.

La candidosi vaginale nei roditori è inducibile solamente in condizioni di pseudoestro (P.L. Fidel, M.E. Lynch, J.D. Sobel, Infection and Immunity, 61 (5), 1993, 1990). Per tale ragione, 72 ore prima della inoculazione vaginale i topi, CBA/J (H-2K) descritti come sensibili a tale infezione (P.L. Fidel, J.L. Cutright, J.D. Sobel, Infection and Immunity, 63 (10), 1995, 4191), sono stati trattati con 0,5 mg di estradiolo valerato, dissolto in olio di sesamo, somministrato per via sottocutanea. La somministrazione di estrogeni è stata ripetuta settimanalmente fino a completamento dello studio. Blastoconidi (5 x 10s) di Candida albicans, ceppo ATCC 48867, sono stati inoculati nella vagina dei topi precedentemente trattati con estrogeni. Dopo una settimana dall'inoculazione, il grado di infezione veniva valutato tramite lavaggio vaginale e successiva conta delle unità formanti colonie (CFU) su piastre di agar Sabouraud addizionate con cloramfenicolo e gentamicina.

Gli animali risultati infettati sono stati suddivisi in tre gruppi di studio, ciascuno dei quali è stato sottoposto ad un trattamento terapeutico per cinque giorni consecutivi (dal giorno 1 al 5), costituito rispettivamente da: 1) econazolo base (0,5% o 1% in peso); 2) econazolo-polycarbophil (0,5% o 1% in peso calcolato come econazolo); 3) eccipienti (gruppo dì controllo). Allo scopo di meglio evidenziare l'efficacia terapeutica topica del nuovo delivery System mucoadesivo (complesso econazolo-polycarbophil), dopo 4 ore dalle somministrazioni farmacologiche veniva effettuato un abbondante lavaggio vaginale con PBS, per rimuovere la quantità di farmaco non adeso alla mucosa.

Il grado di infezione è stato controllato prima dell'inizio del trattamento ed al termine del trattamento stesso (giorno 6). Gli animali sono stati considerati guariti quando tutte le colture risultavano negative, sensibilmente migliorati quando venivano ritrovate meno di 100 colonie in 50 μ] di PBS, migliorati quando il numero delle colonie era compreso tra 100 e 990 in 50 μ! di PBS; per un numero di colonie superiore a 990 il trattamento è stato considerato inefficace. La valutazione statistica dei risultati è stata condotta mediante il test χ2.

Ad una settimana dalla inoculazione intravaginale con C. albicans, circa i due terzi degli animali risultavano infettati. La candidosi vaginale nei topi trattati con estrogeni si è dimostrata una infezione stabile; infatti, il trattamento degli animali con i soli eccipienti (gruppo di controllo) non ha mostrato influenza sul decorso dell’infezione.

La terapia condotta come sopra descritto con il complesso econazolo-polycarbophil è risultata sensibilmente più efficace rispetto al trattamento con il solo econazolo. Il lavaggio vaginale, effettuato dopo circa 4 ore dalla somministrazione farmacologica, ha permesso di evidenziare l'efficacia mucoadesiva del complesso econazolo-polycarbophil e di accentuare le differenze tra i due trattamenti. Una certa differenza di efficacia, anche se non statisticamente apprezzabile (p =

0,3), è già riscontrabile tra le due diverse preparazioni in un primo

esperimento in cui la concentrazione di econazolo era dello 0.5% in

peso di principio attivo, e i cui risultati sono mostrati nella seguente

tabella.

TABELLA 4

Saggi in vivo - Econazolo allo 0,5% in peso

Ripetendo l'esperimento con due preparazioni in cui la concentrazione di econazolo era dell'l %, come mostrato nella tabella

che segue, la differenza di attività tra le due formulazioni è risultata

statisticamente significativa (p = 0,0371).

TABELLA 5

Saggi in vivo - Econazolo all’1% in peso

Inoltre, è da notare che i trattamenti con econazolo-polycarbophil ed econazolo sono risultati ancor più significativamente differenti quando la frequenza di animali guariti veniva sommata a quella degli animali sensibilmente migliorati nei due gruppi a confronto (68.75% per gli animali trattati con il complesso secondo l’invenzione contro 25% per quelli trattati con econazolo base; p = 0.0131).

L'attività farmacologica del nuovo delivery System (complesso econazolo-polycarbophil), saggiata in vivo, ha evidenziato una superiore efficacia nel trattamento della candidosi vaginale murina, rispetto alla terapia con il solo econazolo. Ciò è evidentemente da attribuire al fatto che il complesso mucoadesivo-principio attivo consente una permanenza dei farmaco nel sito d’azione estremamente prolungata e un contatto più intimo tra il principio attivo e la mucosa, rendendo possibile, di conseguenza, una più efficace risoluzione del l'infezione.

La presente invenzione è stata descritta con riferimento particolare ad alcune sue forme di realizzazione specifiche, ma è da intendersi che variazioni e modifiche potranno essere ad essa apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Complesso antimicrobico mucoadesivo tra il polycarbophil, acido poiiacrilico reticolato con proprietà bioadesive, e un derivato azolico ad attività antifungina o antiprotozoarìa, nella sua forma basica.
2. 2. Complesso secondo la rivendicazione 1 in cui detto derivato azoiico è un derivato imidazoiico.
3. 3. Complesso secondo la rivendicazione 2 in cui detto derivato imidazoiico è scelto dal gruppo consistente in: econazolo, clotrimazolo, metronidazoio, miconazolo, tioconazolo, fenticonazolo, isoconazolo, ketoconazolo, sulconazolo, bifonazolo, omoconazolo, azanidazolo, butoconazolo, ossiconazolo.
4. 4. Complesso secondo la rivendicazione 3, in cui detto derivato imidazoiico è econazolo.
5. 5. Complesso secondo la rivendicazione 1 in cui detto derivato azolico è un derivato triazolico.
6. 6. Complesso secondo la rivendicazione 5 in cui detto derivato triazolico è scelto dal gruppo consistente in: fluconazolo, terconazolo e itraconazolo.
7. 7. Complesso antimicrobico mucoadesivo tra il polycarbophil, acido poliacrilico reticolato con proprietà bioadesive, e un derivato azolico ad attività antifungina o antiprotozoarìa, nella sua forma basica, ottenibile dissolvendo ciascuno di detti due prodotti in un solvente comune, unendo le due soluzioni in quantità relative tali da contenere lo stesso numero di equivalenti di prodotto, e facendo quindi evaporare il solvente.
8. 8. Complesso secondo la rivendicazione 7, in cui il prodotto solido ottenuto dall'evaporazione viene successivamente essiccato, polverizzato e setacciato.
9. 9. Complesso secondo ognuna delle rivendicazioni 7 o 8, in cui la quantità di polycarbophil necessaria viene preventivamente calcolata determinandone l'equivalente di neutralizzazione mediante titolazione potenziometrica.
10. 10. Complesso econazolo-polycarbophil, ciotrimazolo-polycarbophil o metronìdazolo-polycarbophil ottenibile secondo ognuna delle rivendicazioni 7-9, in cui detto solvente comune è metanolo.
11. 11. Formulazione antimicrobica bioadesiva a base di un complesso polycarbophil-derivato azolico secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in unione con veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili.
12. 12. Formulazione secondo la rivendicazione 11 comprendente, inoltre, un eccesso di polycarbophil non complessato.
13. 13. Formulazione secondo ognuna delle rivendicazioni 11 o 12 in forma di gel.
14. 14. Formulazione secondo la rivendicazione 13 comprendente un complesso econazolo-polycarbophil, con un eccesso di polycarbophil, in forma di gel in glicol propilenico.
15. 15. Complessi bioadesivi di polycarbophil e farmaci antifungini o antiprotozoari azotici e formulazioni che li contengono secondo le rivendicazioni 1-14, sostanzialmente come in precedenza descritto.