ITMI980810A1 - Mutante di rhodobacter sphaeroides rv e suo impiego nella produzione di idrogeno - Google Patents

Description

"Mutante di Rhodobacter sphaeroides RV e suo impiego nella produzione di idrogeno".

Descrizione

L'invenzione riguarda il mutante di Rhodobacter sphaeroides RV CBS 100467 incapace ad accumulare poliidrossialcanoati (PHAs) ed un procedimento per la produzione di idrogeno che impiega detto mutante.

L'idrogeno rappresenta l'elemento più abbondante nel sole e gioca un ruolo chiave nella generazione di energia. Sulla terra, invece, insieme all'ossigeno è il composto fondamentale per il ciclo biologico dell’energia.

La quantità di idrogeno contenuta nella zona più bassa dell'atmosfera è stimabile a circa 2,2xl0<9 >tonnellate, pari a circa 0,55 ppm per volume di aria. Confrontate con le 1,1 x IO<15 >tonnellate di 02, l'idrogeno è certamente da considerarsi sulla terra un gas raro. L'idrogeno, comunque, a differenza dei gas nobili, è continuamente prodotto ed utilizzato da un largo numero di microorganismi sia in condizioni aerobiche che anaerobiche, in presenza od assenza di luce.

Da un punto di vista energetico, l’idrogeno rappresenta sicuramente una fonte ideale avendo un potere calorico superiore ad ogni altro. Inoltre può essere facilmente conservato, non è inquinante ed il prodotto finale della sua ossidazione, l'acqua, non solo non è tossico, ma risulta un composto indispensabile a garantire la vita sulla terra .

La capacità dei microorganismi di sviluppare idrogeno, unitamente al progressivo esaurimento delle fonti energetiche tradizionali ed ai gravi problemi ambientali ad esse associati, ha stimolato da tempo un considerevole sforzo di ricerca per ottenere per via biologica questa fonte di energia.

Nell'ambiente naturale sono presenti numerosi organismi che possono produrre l'idrogeno spontaneamente .

Tra questi organismi, i batteri fotosintetici anossigenici, come i batteri rossi non sulfurei che comprendono fra gli altri i generi Rhodooseudomonas . Rhodobacter e Rhodospirillum.

sono particolarmente adatti per la produzione di idrogeno. Essi, infatti, sono capaci non solo di utilizzare una sorgente di energia a costo zero, la luce, ma possono utilizzare come substrato per la loro crescita sostanze di scarto, abbinando così la produzione di energia allo smaltimento di rifiuti che rappresentano un serio problema ambientale.

Tuttavia, questi batteri presentano gli inconvenienti derivanti dalle basse rese di produzione di idrogeno. Ne consegue che l'uso di questi microorganismi rende difficile lo sviluppo di processi per la bioproduzione di idrogeno interessanti da un punto di vista pratico ed economico .

E' noto in letteratura, infatti, che i batteri rossi non sulfurei sono anche caratterizzati dalla capacità di sintetizzare, in condizioni di crescita sbilanciate, elevate quantità di sostanze di riserva, generalmente indicate con il termine di poliidrossialcanoati (PHA). I PHA vengono accumulati sotto forma di corpi di inclusione citoplasmatici ed arrivano a rappresentare una rilevante percentuale (fino al 70%) del peso cellulare. Anche per il ceppo R.sohaeroides RV, che overproduce idrogeno, è stata dimostrata una competizione tra l'accumulo di poliidrossialcanoati (PHAs) e la fotoproduzione di idrogeno in funzione delle condizioni di crescita.

Infatti, l'evoluzione di idrogeno gassoso e la sintesi di PHAs rappresentano due vie metaboliche alternative per consumare il potere riducente cellulare.

Per migliorare la capacità di produzione di idrogeno da parte di R.sohaeroides RV in termini di durata e quindi di quantità totale di H2 prodotto, è stato ora costruito un mutante incapace ad accumulare poliidrossialcanoati (PHAs).

Tale mutante, denominato SMV071, è stato depositato il 16.02.1998 presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures dove ha ricevuto il numero CBS 100467.

Pertanto costituisce uno scopo della presente invenzione un mutante di R.sphaeroides RV CBS 100467 incapace ad accumulare poliidrossialcanoati (PHAs).

Costituisce un ulteriore scopo della presente invenzione un processo per la produzione di idrogeno che utilizza il mutante di R.sphaeroides RV CBS 100467.

Breve descrizione delle figure

Figura 1: si riporta la mappa di restrizione del plasmide pSM774

Figura 2(A-C): mostra la sequenza nucleotidica ed amminoacidica del gene phaC sintasi di R.sphaeroides RV wild-type mancante delle prime 30 basi e delle ultime 60 basi.

Figura 3: si riporta la mappa di restrizione del plasmide pSM583.

Figura 4: Analisi Southern Blot su DNA genomico dei cloni mutanti No 1-10 (linee 1-10) e del ceppo wild-type R.sohaeroides RV digeriti con l'enzima di restrizione EcoRI e ibridati con una sonda specifica per il gene phaC.

Figura 5: gas cromatogrammi del ceppo R.sohaeroides RV wild-type e del ceppo mutante SMV071 che mostrano, rispettivamente, la presenza e l'assenza del picco caratteristico del PHB.

A: standard del metil estere dell'acido β-idrossibutirrico (picco a RT = 10,28);

B: estratto della coltura cellulare di R.sphaeroides RV wild-type dopo 14 giorni di fermentazione (picco a RT = 10,96);

C: estratto della coltura cellulare del mutante SMV071 dopo 15 giorni di fermentazione (nessun picco a RT caratteristico dell'acido β-idrossibutirrico).

Figura 6 : rappresentazione schematica del bioreàttore dove: 1 = serbatoio del substrato; 2 = gas Argon flussato per mantenere le condizioni di anaerobiosi; 3 = pompa peristaltica che regola l'immissione del terreno nel fotobioreattore; 4 = fotobioreattore; 5 = piastra magnetica per mantenere l'agitazione all'interno del fotobioreattore; 6 = collegamento elettrico per le lampade alogene collocate all'interno del fotobioreattore; 7 = uscita comune del terreno esausto, della biomassa e del biogas; 8 = trappola; 9 = contatore digitale del biogas evoluto; 10 = scarico del biogas; 11 = pompa peristaltica per l'eliminazione del terreno e biomassa esausti; 12 = scarico del terreno e biomassa e sanitizzazione. Descrizione dettagliata dell'invenzione

Nella maggior parte dei batteri che sono in grado di accumulare PHAs, tra i quali R.sphaeroides RV, il poli(3-idrossibutirrato) (PHB) rappresenta il polimero maggiormente prodotto.

E' noto in letteratura che nel batterio più studiato, Alcaligenes eutrophus, la sintesi di PHB è realizzata attraverso una via metabolica che coinvolge in successione tre differenti enzimi: una β-chetotiolasi,una acetoacetil-CoA riduttasi ed una sintasi che catalizza la polimerizzazione del monomero per dare il poliestere PHB.

La presente invenzione si basa sulla considerazione che la sintasi rappresenti l'enzima chiave della via metabolica. Questo enzima, infatti, ha una relativa bassa specificità di substrato, e quindi potrebbe usare come substrati intermedi diversi provenienti da vie metaboliche alternative.

Pertanto si è pensato di eliminare l'ultimo stadio della biosintesi di PHB, mediante inattivazione del gene (phaC ) che codifica per tale enzima, dopo aver verificato la sua presenza nel genoma di R.sohaeroides RV.

Per la sua inattivazione possono essere utilizzate metodiche convenzionali come la mutagenesi random, che si basa sull’impiego di trasposoni, o la mutagenesi mirata che utilizza interposoni. Questi elementi, dopo inserimento nel genoma, oltre a provocare un' interruzione nella sequenza di un gene, che si manifesta attraverso una mutazione fenotipica, conferiscono all'ospite la resistenza ad un particolare antibiotico.

Secondo una forma di attuazione preferita della presente invenzione, l’inattivazione del gene phaC sintasi di R.sohaeroides RV wild-type è stata effettuata mediante inserimento all'interno del gene sintasi, previamente isolato e caratterizzato (figura 2), di una cassetta genica (interposone) che codifica per la resistenza alla kanamicina e successiva selezione dei ceppi mutagenizzati su un terreno addizionato con questo antibiotico.

Infatti, teoricamente, solo i cloni in cui è avvenuta l'integrazione dell'interposone nel DNA genomico del ceppo possono crescere su tale terreno selettivo .

La costruzione dell 'interposone è stata condotta utilizzando in primo luogo il ceppo E.coli TG1 come ospite e pUC18 come vettore.

L'analisi di restrizione delle colonie ottenute dopo trasformazione ha confermato l'isolamento di un clone positivo contenente il gene della kanamicina inserito nel gene phaC sintasi. La sequenza nucleotidica di tale clone ha evidenziato l’inserimento dell 'interposone in orientamento opposto rispetto alla direzione di trascrizione del gene phaC sintasi.

Il gene sintasi interrotto è stato poi clonato in un vettore suicida, cioè un vettore che è incapace di replicarsi in R.sohaeroides e la costruzione finale è stata introdotta mediante coniugazione nel ceppo E.coli S17-1 e nel ceppo wild-type R.sohaeroides RV reso resistente all'antibiotico rifampicina.

La selezione dei mutanti di R.sohaeroides RV è stata condotta in due stadi: il primo stadio è consistito nella selezione su kanamicina per confermare l'avvenuta ricombinazione fra la copia mutagenizzata del gene ohaC. portata dal vettore suicida, e la copia funzionale che si trova sul DNA genomico ed il secondo stadio nella selezione su gentamicina per verificare la perdita del vettore suicida utilizzato per la mutagenesi.

I cloni sono stati caratterizzati mediante analisi Southern blot per confermare la natura ed il sito dell'evento di mutagenesi. I DNA genomici sono stati estratti, digeriti con l'enzima di restrizione EcoRI ed ibridìzzati con un oligonucleotide sintetico specifico per il gene ohaC. Il DNA genomico wild-type, preparato nelle stesse condizioni è stato utilizzato come controllo negativo .

Per uno di questi cloni è stata evidenziata una banda di ibridazione delle dimensioni attese.

Questo clone, denominato SMV071, è stato caratterizzato fisiologicamente mediante crescita in differenti terreni. Questo clone ha mostrato, similmente al ceppo wild-type, una stessa capacità di crescita in terreni completi, ad esempio aSy (J.Miyake, X.Y. Mao and S.Kawamura, J.Ferment. Technol., 62:531-535, 1984) e substrati provenienti da scarti di mercato, e nessuna crescita in terreno che induce la sintesi di PHB. Tale risultato ha confermato indirettamente l'incapacità di attivare questa via metabolica. Inoltre, la determinazione della produzione di PHB, condotta mediante analisi gascromatografica sul clone SMV071, non ha evidenziato alcun picco, confermando così l'incapacità del ceppo mutante ad accumulare PHB.

Il mutante di R,sohaeroides RV della presente invenzione è quindi particolarmente adatto nello sviluppo di processi di fermentazione per la produzione di idrogeno.

La fermentazione può essere condotta in un mezzo acquoso contenente sorgenti assimilabili di carbonio e di azoto nonché diversi cationi, anioni ed, eventualmente, tracce di vitamine o di amminoacidi.

Sorgenti di carbonio assimilabili includono acidi organici quale piruvato, malato, lattato, succinato od altre sorgenti di carbonio convenzionali. Fonti di azoto possono essere scelte, ad esempio, tra sali d'ammonio minerali, quali nitrato di ammonio, solfato di ammonio, cloruro di ammonio o carbonato di ammonio e urea o materiali contenenti azoto organico o inorganico come peptone, estratto di lievito o estratto di carne .

Esempi non limitativi di cationi ed anioni possono essere scelti tra potassio, sodio, magnesio, ferro, calcio, fosfati acidi, solfati, cloruri, manganese e nitrati.

Secondo una forma di attuazione preferita del procedimento della presente invenzione si utilizza come substrato un materiale derivante dalla fermentazione acidogenica controllata di rifiuti mercatali (E. D'Addario et al. (1992), Wat.Sci .Tech. 22, 183-192) avente la composizione riportata nell'esempio 7.

La fermentazione è condotta in anaerobiosi, garantita dal flusso continuo di argon, in presenza di luce con una intensità luminosa compresa tra 6.000 e 20.000 lux, ad una temperatura compresa tra 25°C e 40°C, preferibilmente tra 30°C e 37°0.

Il pH del mezzo di fermentazione è mantenuto entro valori compresi tra 6,50 e 8,0 e di preferenza tra 6,8 e 7,3. La regolazione del pH può essere effettuata, ad esempio, mediante aggiunta di una soluzione acquosa basica quale una soluzione acquosa di ammoniaca, di idrossido di potassio, di idrossido di sodio, carbonato di sodio oppure di potassio. Preferibilmente si utilizza una soluzione di idrossido di sodio 1-5 M.

Durante la fermentazione si procede al recupero dell'idrogeno mediante tecniche convenzionali.

Il processo può essere condotto in continuo in apparecchiature del tipo mostrato in figura 6.

Operando nelle condizioni preferite, si è osservato che la quantità di H2 prodotta dal mutante era circa il 26% più elevata rispetto al ceppo wild-type, poiché la fotoproduzione di H2 da parte del mutante continuava per altri dieci giorni (26 giorni in tutto) confrontata ai 16 giorni del ceppo wild-type.

I seguenti esempi, che hanno l'unico scopo di descrivere in maggior dettaglio la .presente invenzione, non devono in alcun modo essere interpretati come una limitazione agli scopi della stessa.

Esempio 1

Estrazione del DNA genomico da R.sphaeroides RV Una beuta da 500 mi contenente 100 mi di terreno LB (10 g/1 triptone, 5 g/1 yeast extract, 10 g/1 NaCl) è stata inoculata con il ceppo R .sphaeroides RV (fornito dal National Institute of Bioscience and Human-technology (NIBH), Tsukuba, Giappone) e la miscela risultante è stata mantenuta sotto agitazione (220 rpm) a 30°C per 48 in condizioni di aerobiosi/buio.

Quindi, le cellule sono state recuperate mediante centrifugazione della brodocoltura in un rotore SS34 modello Sorvall RC-5B (a 4°C e 5000 rpm per 10 minuti) e poi lavate (2x120 mi) con la soluzione tampone TE (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4). La sospensione risultante è stata nuovamente centrifugata come sopra riportato e le cellule sono state recuperate e risospese in 9,5 mi di soluzione tampone TE. Dopo aggiunta di 0,5 mi di 10% SDS (sodio dodecilsolfato) e 50 pi di una soluzione di Proteinasi K (20 mg/ml), la sospensione è stata incubata a 37°c per 1 ora.

Quindi sono stati addizionati 1,8 mi di NaCl 5 M e 1,5 mi di una soluzione costituita da 10% esadeciltrimetil ammonio bromuro (CTAB) in 0,7 M NaCl e la soluzione risultante è stata incubata a 65°C per 20 minuti.

Successivamente la soluzione è stata deproteinizzata con uguale volume di cloroformio :isoamil alcol (24:1, v/v) ed il DNA è stato precipitato con 0,6 volumi di isopropanolo.

Il DNA è stato lavato con 1 mi di etanolo (70%) e recuperato con una bacchetta di vetro. Infine il DNA raccolto è stato disciolto in 4 mi di TE e la sua concentrazione è stata determinata mediante lettura spettrofotometrica a 260 nm.

Il DNA genomico è stato ulteriormente purificato mediante centrifugazione su gradiente di CsCl (1%) contenente 0,1 mg/ml di bromuro di etidio (55.000 rpm per 16 ore in rotore Beckman V65Ti).

La banda di DNA è stata visualizzata sotto luce UV ed il bromuro di etidio è stato allontanato mediante estrazione con butanolo saturo in acqua. Dopo dialisi contro tampone TE, il DNA è stato precipitato con etanolo e risospeso nel volume desiderato.

Esempio 2

Isolamento del gene sintasi phaC

Il DNA genomico ottenuto come riportato nell'esempio 1 è stato amplificato mediante la tecnica della Polymerase Chain Reaction (PCR), secondo le indicazioni riportate da Leung et al. (Leung D.W., Chen E., Goeddel D.V., Technique - a journal of methods in celi and molecular biology, 1, n° 1 (1989): pp. 11-15), utilizzando come primers la seguente coppia di oligonucleotidi:

(1) 5'CGTGACGCTC AGTTCGAGCG TCTGAAC 3' (FORWARD) (2) 5'CGGCGCGAGC TCGGGATGTT TCGAATC3' (REVERSE) Questi oligonucleotidi sono stati sintetizzati sulla base di sequenze amminoacidiche conservate di sintasi batteriche, tenendo conto dell'uso preferenziale dei codoni in R.sohaeroides RV.

L'amplificazione è stata condotta in una apparecchiatura DNA Thermal Cycler 480 (Perkin -Elmer Cetus) utilizzando una miscela di reazione (100 μΐ) contenente:

- 500 ng di DNA genomico

- 10 mM Tris HC1 pH 8,3

- 2 mM MgS04

- 25 mM KC1

- 5 mM (NHJ2S04

- 100 picomoli dei due primers

- 200 pM di dNTPS (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

- 2,5 Unità di Pwo polimerasi (Perkin Elmer).

Dopo denaturazione per 2 minuti a 98°C, è stato fatto partire il programma ciclico, che comprendeva:

1 minuto a 98°C (denaturazione)

1 minuto a 60’c (annealing)

2 minuti a 72°C (allungamento)

per 25 cicli complessivi, seguita da 8 minuti a 72°C (estensione finale).

Il prodotto di amplificazione così ottenuto è stato trattato con fenolo-cloroformio (1:1), precipitato con NaCl (1/10 vol/vol) ed EtOH (2 voi) e risospeso in 20 pi di H20. Quindi un frammento di circa 1700 bp è stato purificato su gel low-melting (SeaPlaque, FMC BioProducts) allo 0,6% e dopo eluizione dal gel è stato clonato nel plasmide PUC18 (Boheringer) previamente digerito con l'enzi-ma di restrizione Smal.

In pratica il plasmide pUC18 ed il frammento sono stati ligati in 30 pi di miscela di reazione (DNA 5 pg/ml) e 2 pi di detta miscela sono stati utilizzati per trasformare cellule di E.coli TG1 rese elettrocompetenti (Dower W.J. et al., Nucleic Acids Research, 16, 6127-6145, 1988).I trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB agarizzato contenente 100 pg/ml di Ampicillina.

L'analisi del DNA plasmidico estratto dai cloni positivi ha evidenziato la presenza di un frammento di circa 1700 bp corrispondente alle dimensioni attese. Il plasmide contenuto nel clone positivo è stato denominato pSM774 (figura 1).

Il plasmide è stato poi sottoposto ad analisi di sequenza utilizzando il DNA sequencer ABI 373 (Perkin Elmer). La sequenza ha confermato che il frammento di 1738 bp corrispondeva al gene phaC sintasi mancante delle prime 30 basi e delle ultime 60 basi (figura 2).

Esempio 3

Inattivazione del gene sintasi phaC

Il plasmide pSUP2021 (R. Simon et al., (1983), Bio/Technology, 1 : 784-791) (5 μg) contenente il gene che codifica per la resistenza alla kanamicina (neo), è stato digerito con 5 unità degli enzimi di restrizione Sali e HindlII (Boehringer) a 37 “C per 1 ora. La miscela di digestione è stata quindi addizionata con 0,5 mM dNTPs e 8 unità di Klenow Polymerase<,s> >incubando a 30’C per 15 minuti.

Dopo aver bloccato la reazione enzimatica a 75°C per 10 minuti, la miscela di digestione è stata caricata su gel di agarosio low melting (Seaplaque) allo 0,6% e corsa a 70 volts per 4 ore.

Quindi il frammento Sall-HindlII di circa 1500 paia di basi (bp), comprendente il gene strutturale codificante la resistenza alla kanamicina e la regione promotore a monte di tale gene, è stato eluito dal gel.

Parallelamente il plasmide pSM774 (2 pg) è stato digerito con l'enzima Styl e trattato con Klenow Polymerase<® >nelle stesse condizioni opera-tive riportate sopra.

Quindi il plasmide pSM774 digerito ed il frammento Sall-HindlII sono stati ligati in 20 pi di tampone ligasi in presenza di 1 unità di T4 DNA ligasi utilizzando un rapporto plasmide:frammento di 1:3. La reazione di ligasi è stata condotta a 23’C per circa 16 ore.

La miscela di ligasi è stata quindi utilizzata per trasformare cellule elettrocompetenti di E.coli TG1 . La selezione dei transformanti è stata condotta su piastre di terreno LB agarizzato contenenti 20 μg/ml di kanamicina e 100 pg/ml di ampicillina.

L'analisi dei cloni positivi ha evidenziato la presenza di un clone (n.56) con l'inserimento atteso del gene della kanamicina nel gene sintasi phaC. L'analisi di restrizione e l'analisi di sequenza nucleotidica ha rivelato che il gene neo era inserito nell'orientamento opposto rispetto al gene phaC.

Esempio 4

Il clone n.56 è stato digerito con gli enzimi di restrizione Asp718 e XbaI a 37°C per 1 ora. Il vettore suicida pWKR102A (Colonna-Romano, S. et al., 1990, Mol.Gen.Genet., 223, 138-147) è stato digerito con l'enzima di restrizione HindlII. Quindi i prodotti di digestione sono stati miscelati e trattati con Klenow Polimerasi in presenza di dNTPs a 25’C per 30 minuti per creare dei terminali compatibili.

Il campione è stato poi estratto con fenolo/cloroformio e precipitato con etanolo. Il pellet è stato risospeso in tampone ligasi contenente 5 unità/pg di DNA di T4 DNA ligasi. La reazione è stata condotta a 23”C per 16 ore.

La miscela di ligasi è stata utilizzata per trasformare cellule competenti di E.coli TG1 mediante elettroporazione . La selezione dei trasformanti è stata effettuata su piastre di LB agar contenenti 20 ng/ml di cloramfenicolo e 20 pg/ml di kanamicina. Tra i cloni positivi è stato isolato un clone contenente un plasmide, indicato pSM583 (figura 3), con l'inserto corretto.

Il plasmide pSM583 è stato trasferito nel ceppo E .coli S17-1 che possiede i geni necessari alla coniugazione, ottenendo il ceppo chiamato SMC490. Esempio 5

Coniugazione di E.coli con R.sphaeroides RV Il ceppo E.coli SMC490 è stato inoculato in 5 mi di terreno LB contenente 20 μg/ml di cloramfenicolo e 20 ^ig/ml di kanamicina e coltivato a 37°C per una notte.

Il ceppo R.sphaeroides RV wild-type è stato reso resistente all'antibiotico rifampicina (Rif) mediante pressione selettiva fino ad un massimo di 150 μg/ml di antibiotico.

Il ceppo R. sphaeroides RV (Rif<R>) è stato :inoculato in 40 mi di terreno aSy avente la seguente composizione:

in condizioni aerobiche al buio per due giorni.

Quindi, 3 mi della coltura di R.sphaeroides RV (Rif<R>) sono stati miscelati in tubi Falcon<R >con un volume di SMC490 corrispondente a 1/10 della densità ottica della coltura di R.sohaeroides RV.

I batteri sono stati recuperati per centrifugazione a 3000 rpm, a temperatura ambiente per 10 minuti, risospesi in 100 μΐ di terreno aSy e aliquote di tale sospensione sono state distribuite su piastre dello stesso terreno agarizzato.

Le piastre sono state incubate a 35’C per 6 ore così da consentire lo scambio di materiale genetico fra i due tipi di cellule. Quindi, le cellule sono state recuperate dalle piastre, risospese in 400 μΐ di terreno aSy ed aliquotate su piastre di terreno aSy contenente rifampicina (150 μg/ml) e kanamicina (20 μg/ml).

Dopo 6-7 giorni di crescita al buio in condizioni aerobiche, su ciascuna piastra sono state ottenute circa 40-50 colonie kanamicina resistenti (Km<R>), rifampicina resistenti (Rif<R>).

Circa 200 di queste colonie sono state prelevate ed inoculate in tre piastre da 96 pozzetti (Corning) in 200 μl di terreno aSy contenenti kanamicina (20 μg/ml). Le piastre sono state incubate a 30°C al buio in condizioni aerobiche.

Dopo 2 giorni le colonie sono state prelevate, diluite con terreno aSy addizionato con 5 μg/ml di gentamicina {10 μΐ delle colture in 190 μΐ di terreno fresco) ed inoculate in tre piastre da 96 pozzetti.

Dopo 1 giorno di incubazione a 30'C si è osservato che su 200 colonie, 50 non erano cresciute. Il fenotipo di queste ultime colonie (Km<R >e Gm<s>) era consistente con l'inserimento dell 'interposone nel genoma mediante doppio crossover e la conseguente perdita del plasmide suicida .

Per confermare il sito di mutagenesi, sono stati condotti degli esperimenti mediante analisi Southern Blot con il DNA genomico isolato da 10 di queste colonie.

Il ceppo R.sohaeroides RV wild-type (Rif<R>) ed i mutanti sono stati inoculati in 5 mi di LB contenente 20 μg/ml di kanamicina ed incubati a 30°C per 2 giorni in condizioni aerobiche al buio.

Poi il DNA genomico è stato estratto e digerito con l'enzima di restrizione EcoRI, che non taglia nei geni sintasi (phaC) e kanamicina (neo).

I prodotti della digestione sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio. Dopo la separazione elettroforetica è stato eseguito un Southern blot secondo procedure standard e la membrana su cui era stato fissato il DNA è stata sottoposta ad ibridazione con una sonda specifica per il gene phaC.

Lo sviluppo dell'autoradiografia ha mostrato la presenza, nel mutante n.10, di un'unica banda di circa 1,6 kb più alta rispetto a quella del ceppo wild-type (figura 4). Questo dimostrava l'avvenuto doppio crossover e quindi la presenza sul DNA genomico del gene phaC inattivato per mutagenesi da interposone .

Gli altri mutanti invece mostravano un profilo giustificabile con un singolo crossover che aveva generato sul DNA genomico una duplicazione genica e cioè la presenza di un gene mutato accanto al gene wild-type .

Il mutante n.10 è stato indicato con la sigla SMV071.

Esempio 6

Crescita del ceppo mutante SMV071

Il ceppo mutante SMV071 è stato coltivato in diversi terreni e la sua crescita è stata confrontata con quella del ceppo wild-type.

I terreni utilizzati avevano le seguenti composizioni:

I terreni sono stati sterilizzati per filtrazione con filtri Nalgene da 0, 2 μ e ogni traccia di ossigeno è stata eliminata gorgogliando Argon per 30 minuti .

Le colture sono state incubate alla luce con lampade al tungsteno ad un'intensità di 9.500 lux, a 30°C per 3 giorni in provette per anaerobiosi contenenti 24 mi di terreno. Al termine della crescita sono state misurate le densità ottiche a 600 nm. I risultati sono riportati in Tabella 1.

Dai valori riportati in Tabella, si osserva che la mutazione nel gene ohaC ha influenzato negativamente la crescita del ceppo mutante solo nel terreno B, dove l'unica fonte di carbonio disponibile è rappresentata da sodio acetato, caratteristico del terreno d'induzione per la produzione di PHA.

Esempio 7

Fotoproduzione di idrogeno

La fotoproduzione d'idrogeno per il ceppo mutante SMV071 è stata valutata con un esperimento di fermentazione eseguito in parallelo con il ceppo wild type R.sohaeroides RV.

I due ceppi sono stati coltivati in due chemostati da 1 litro muniti di agitatore magnetico, di un modulo per il controllo del pH, di 2 lampade alogene da 100 Watt poste all'interno per garantire l'illuminazione della coltura e di un sistema refrigerante per mantenere la temperatura a 30 “C (figura 6).

II preinoculo per la fermentazione è stato preparato in due passaggi successivi descritti qui di seguito:

1. 50 μΐ di glicerinato in 25 mi di terreno aSy sono stati incubati a 30°C, in aerobiosi/buio, per due giorni;

2. Una diluizione 1:10 della precedente coltura è stata utilizzata per il successivo inoculo in provette per anaerobiosi contenenti 60 mi dello stesso terreno usato per la crescita in chemostato. Le provette sono state incubate a 30°C in anaerobiosi, alla luce (lampade al tungsteno, 9.500 lux) per 2 giorni.

I due chemostati sono stati inoculati con una diluizione del secondo inoculo (2) calcolando una densità ottica iniziale a 600 nm di 0,2.

II terreno di coltura utilizzato deriva dalla fermentazione acidogenica controllata di rifiuti mercatali (E. D'Addario et al. (1992), Wat .Sci.Tech. 22, 183-192). La composizione media di questo tipo di terreno è la seguente:

Per la fermentazione dei due ceppi il terreno è stato prima diluito 1:10 con acqua distillata così da ottenere una concentrazione di acido lattico di 3,6 g-1<"1 >e poi addizionato con i seguenti componenti:

L'anaerobiosi è stata mantenuta con un flusso continuo di argon. L'intensità di luce utilizzata è stata regolata a 6.000 lux e le due fermentazioni sono state fatte partire in batch.

Quando dopo circa 24 ore è iniziata la produzione di idrogeno, la fermentazione è stata condotta in continuo.

Poiché la velocità di flusso (F) del terreno nel chemostato era stata fissata ad un valore di 31 ml/ora ed il volume del reattore (V) era di 930 mi, secondo l'equazione D=F/V, dove D corrisponde alla velocità di diluizione, il valore di HRT (tempo di residenza idraulica) (1/D) era pari a 30, cioè teoricamente ogni 30 ore il fotobioreattore subiva un ricambio totale di terreno.

La fermentazione è stata seguita valutando i seguenti parametri analitici:

1. la densità ottica misurata a 600 nm per seguire la crescita batterica;

2. il pH era mantenuto automaticamente ad un valore di 7,0 mediante aggiunta di NaOH 1 M;

3. il biogas totale prodotto misurato mediante un contatore digitale collegato ad una delle uscite del chemostato;

4 . la percentuale di idrogeno contenuta nel biogas determinata con un gas-cromatografo VARIAN 3400 equipaggiato con una colonna Carbosieve II 80-100 mesh Supelco 200x3 mm;

5. la quantità di poliidrossibutirrati accumulati dalla cellula mediante analisi gas-cromatografica.

L'intensità della luce è stata misurata prima dell 'inoculo sulla superficie esterna del reattore utilizzando un LSI luxmetro.

Dai valori del biogas prodotto e dalla percentuale di idrogeno è stata calcolata la quantità di idrogeno evoluta/litro di reattore/giorno (ml Hz/1 reattore/giorno).

Nella Tabella 2 che segue vengono riportati i valori di biogas totale prodotto dai due ceppi durante la fermentazione:

Nella Tabella 3 si riporta la produzione di idrogeno calcolata in base ai valori di biogas totale della Tabella 2 ed alla percentuale di idrogeno misurata al gas-cromatografo e valutata essere 80-90% per entrambi i ceppi.

La fermentazione del ceppo R.sohaeroides RV wild-type è stata fermata al 17' giorno quando la produzione di idrogeno aveva raggiunto livelli non significativi. La produzione di idrogeno del ceppo mutante SMV071 è rimasta alta fino al 18' giorno ed è proseguita per altri 8 giorni (27’ giorno), fino al raggiungimento degli stessi valori minimi del ceppo wild-type. Considerando che il biogas prodotto contiene circa il 90% di idrogeno, il ceppo wild-type ha prodotto in 16 giorni 16 litri di idrogeno, mentre il ceppo mutante SMV071, in 26 giorni ha prodotto 21 litri di idrogeno e cioè il 26% in più rispetto al wild-type.

L'analisi al gas-cromatografo dei poliidrossibutirrati (secondo il metodo di Brandi et al.,(1988), Appl. Environ. Microbiol. 54, 1977-1982) ha mostrato nel ceppo mutante SMV071 l'assenza del picco caratteristico dell'estere metilico dell'acido β-idrossibutirrico, presente invece nel ceppo wild-type (figura 5).

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Mutante di Rhodobacter sohaeroides RV incapace ad accumulare poliidrossialcanoati depositato con il numero CBS 100467.
2. 2. Procedimento in continuo per la fotoproduzione di idrogeno che comprende: a) il coltivare il mutante Rhodobacter sohaeroides RV CBS 100467 in un mezzo acquoso contenente sorgenti assimilabili di carbonio e di azoto nonché diversi cationi, anioni, in condizioni di anaerobiosi, ad una temperatura compresa tra 25‘C e 40°C, ad un pH da 6,5 a 8,0, e sotto una intensità di luce compresa tra 6.000 e 20.000 lux, b) il separare e recuperare l'idrogeno evoluto.
3. 3. Il procedimento della rivendicazione 2, dove le sorgenti assimilabili di carbonio sono scelte tra gli acidi organici quale piruvato, malato, lattato, succinato od altre sorgenti di carbonio convenzionali. 4. Il procedimento della rivendicazione 2, dove le fonti di azoto sono scelte tra sali d'ammonio minerali, quali nitrato di ammonio, solfato di ammonio, cloruro di ammonio o carbonato di ammonio e urea o materiali contenenti azoto organico o inorganico come peptone, estratto di lievito o estratto di carne.
4. 4. Il procedimento della rivendicazione 2, dove i cationi ed anioni sono scelti tra potassio, sodio, magnesio, ferro, calcio, fosfati acidi, solfati, cloruri, manganese e nitrati.
5. 5. Il procedimento della rivendicazione 2, dove il mezzo di fermentazione è un materiale derivato dalla fermentazione acidogenica controllata di rifiuti mercatali.
6. 6. Il procedimento secondo la rivendicazione 2, dove il mezzo acquoso contiene tracce di vitamine o di amminoacidi.
7. 7. Il procedimento secondo la rivendicazione 2, dove l'intensità luminosa è scelta tra 6.800 e 10.000 lux.
8. 8. Il procedimento secondo la rivendicazione 2, dove il pH è scelto tra 6,8 e 7,3.
9. 9. Il procedimento secondo la rivendicazione 2, dove la temperatura è scelta tra 30°C e 37°C,