CN104450594B - 生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明的基因工程菌是真氧罗氏菌的基因缺失株或将甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG导入真氧罗氏菌或真氧罗氏菌的基因缺失株中得到的；所述真氧罗氏菌的基因缺失株是将真氧罗氏菌的2‑甲基柠檬酸合酶‑1的编码基因和2‑甲基柠檬酸合酶‑2的编码基因中至少一个缺失得到的。利用本发明所构建的重组菌生产聚羟基丁酸－戊酸酯，具有以下优点：菌株安全，原料相对低廉，发酵过程容易控制，易于规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
由于塑料工业对石油的依赖性以及塑料废弃物对环境的污染的严重性，迫使人们去寻找能替代化工塑料的环保的可持续发展的材料。聚-3-羟基丁酸酯(以下简称聚羟基丁酸酯，PHB)是基于生物基生产并可以被生物降解的高分子材料，其性能类似塑料。但是PHB性脆，后处理加工有一定的难度，若在PHB中掺入3-羟基戊酸(3HV)组分，得到的聚-3-羟基丁酸共聚3-羟基戊酸酯(以下简称聚羟基丁酸－戊酸酯，PHBV)可以使材料的性能获得改善，硬度、强度、熔点均下降，但分解温度不降，这更利于拓宽产品的应用范围。PHBV可用于组织和器官修复的支架平台，缓释药物的外包装，骨再生引导膜，构建心脏生物瓣膜，医用纺织品，可降解包装材料和吸附材料等等。
目前规模化生产PHBV时使用的唯一生产用菌株是真养罗氏菌突变株，但需要在培养时添加丙酸(盐)或戊酸(盐)。丙酸(盐)合成丙酰辅酶A，丙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合生成戊酰辅酶A，是合成3-羟基戊酸(3HV)的直接前体物，戊酸(盐)可以直接合成戊酰辅酶A。而丙酸(盐)或戊酸(盐)有细胞毒性，且价格较贵。因此，现有技术生产PHBV时需要严格控制丙酸(盐)或戊酸(盐)的流加过程，既达到一定的细胞量，又能够满足丙酰辅酶A合成的需要。现有技术生产PHBV的控制过程复杂且增加了生产成本，使应用受限。近些年来，研究人员利用基因工程技术改造菌株，但菌株的性能远达不到实现商业化生产的要求，且宿主菌或为致病菌。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组菌。
本发明提供的重组菌是将甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG导入宿主真氧罗氏菌Ralstonia eutropha得到的。
上述重组菌中，所述宿主真氧罗氏菌为真氧罗氏菌Rem-1或真氧罗氏菌Rem-3或真氧罗氏菌Rem-5或真氧罗氏菌Rem-7。
上述重组菌中，所述Rem-3是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-1基因prpC1后得到的菌；所述真氧罗氏菌Rem-1可以通过同源重组敲除prpC1基因，或者通过插入灭活prpC1基因，还可以通过诱变获得prpC1基因缺失的菌株；所述Rem-3的具体获得方法是：
(1)将如序列表中序列3所示的DNA片段插入pJQ200mp18Tc载体的多克隆位点，得到的重组载体记作pJQ200mp18Tc：：ΔprpC1；
(2)将所述pJQ200mp18Tc：：ΔprpC1载体转化E.coli S17-1，得到的重组菌记作ΔprpC1pJQ200/S17-1，作为供体菌；
(3)以Rem-1为受体菌，将所述供体菌ΔprpC1pJQ200/S17-1与受体菌Rem-1进行接合转移，使Rem-1中的prpC1基因缺失，得到的重组菌即为所述Rem-3。
上述重组菌中，所述Rem-5是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；所述真氧罗氏菌Rem-1可以通过同源重组敲除prpC2基因，或者通过插入灭活prpC2基因，还可以通过诱变获得prpC2基因缺失的菌株；所述Rem-5的具体获得方法是：
(1)将如序列表中序列6所示的DNA片段插入pJQ200mp18Tc载体的多克隆位点，得到的重组载体记作pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2；
(2)将所述pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2载体转化E.coli S17-1，得到的重组菌记作ΔprpC2pJQ200/S17-1，作为供体菌；
(3)以Rem-1为受体菌，将所述供体菌ΔprpC2pJQ200/S17-1与受体菌Rem-1进行接合转移，得到prpC2基因缺失的Rem-1记作ΔprpC2/Rem-1，即所述Rem-5。
上述重组菌中，所述Rem-7是真氧罗氏菌Rem-1缺失所述2-甲基柠檬酸合酶-1基因prpC1和所述2-甲基柠檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；所述真氧罗氏菌Rem-1可以通过同源重组敲除prpC1和prpC2基因，或者通过插入灭活prpC1和prpC2基因，还可以通过诱变获得prpC1和prpC2基因缺失的菌株；所述Rem-7的具体获得方法是：
(1)将如序列表中序列6所示的DNA片段插入pJQ200mp18Tc载体的多克隆位点，得到的重组载体记作pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2；
(2)将所述pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2载体转化E.coli S17-1，得到的重组菌记作ΔprpC2pJQ200/S17-1，作为供体菌；
(3)以所述Rem-3为受体菌，将所述供体菌ΔprpC2pJQ200/S17-1与受体菌Rem-3进行接合转移，得到prpC2基因缺失的Rem-3记作ΔprpC2/Rem-3，即所述Rem-7。
上述重组菌中，所述2-甲基柠檬酸合酶-1的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述2-甲基柠檬酸合酶-1的编码基因序列如序列表序列1中自5′端第878-2035位核苷酸分子所示；所述2-甲基柠檬酸合酶-2的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述2-甲基柠檬酸合酶-2的编码基因序列如序列表中序列4中自5′端第1032-2229位核苷酸分子所示。
上述重组菌中，所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、所述GTP激酶的编码基因argK和所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG通过重组表达载体pZMwf导入所述宿主真氧罗氏菌。
上述重组菌中，所述重组表达载体pZMwf的构建方法包括如下步骤：将如序列表中序列7所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表达载体pLXM1的多克隆位点中，得到的重组载体记作pZMwf。
上述重组菌中，所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示；所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。
本发明的另一个目的是提供一种含有甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG的重组表达载体。
本发明提供的含有甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG的重组表达载体是将如序列表中序列7所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表达载体pLXM1的多克隆位点中得到的。
上述重组表达载体中，所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示；所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。
本发明还有一个目的是提供上述所述的Rem-3或上述所述的Rem-5或上述所述的Rem-7。
上述所述的重组菌或上述所述的重组表达载体或上述所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7在生产聚羟基丁酸－戊酸酯中的应用也属于本发明的保护范围。
上述所述的重组菌或上述所述的重组表达载体或上述所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7在提高菌株合成PHBV中3HV组分含量中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的最后一个目的是提供一种生产聚羟基丁酸－戊酸酯的方法。
本发明提供的生产聚羟基丁酸－戊酸酯的方法包括如下步骤：以葡萄糖为底物，发酵培养上述所述的重组菌或上述所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7，得到所述聚羟基丁酸－戊酸酯。
上述方法中，所述发酵培养基为基础培养基；所述基础培养基的制备方法：每升基础培养基含有6.7g Na2HPO4·2H2O、1.5g KH2PO4、1g(NH4)2SO4、0.2g MgSO4·7H2O、1ml的微量元素和20g葡萄糖；所述微量元素的制备方法：每升的微量元素中含有0.3g H3BO3、0.2gCoCl2、0.1g ZnSO4·7H2O、0.03g MnCl2·4H2O、0.02g NaMoO4·2H2O、0.02g NiCl2·6H2O、0.01g CuSO4·5H2O、0.01g CaCl2·2H2O和0.06g Fe(NH4)2(SO4)2。
上述方法中，所述发酵培养的培养基中不含有丙酸或丙酸盐或戊酸或戊酸盐。
利用本发明所构建的重组菌生产聚羟基丁酸－戊酸酯具有以下优点：菌株安全，原料相对低廉，发酵过程容易控制，易于规模化生产。
附图说明
图1为敲除载体ΔprpC1pJQ200mp18Tc和ΔprpC2pJQ200mp18Tc的验证。
图2为带有yliK-argK-ygfG基因簇表达载体pZMwF的示意图。
图3为PHBV标准品的GC测定结果。
图4为Rem-1合成PHBV的GC测定结果。
图5为基因工程菌合成PHBV的GC测定结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
真氧罗氏菌(Ralstonia eutropha)H16购自DSM。
真氧罗氏菌(Ralstonia eutropha)Rem-1(曾命名为65-7)是真氧罗氏菌(Ralstonia eutropha)H16经诱变处理后得到的菌株，真氧罗氏菌(Ralstonia eutropha)Rem-1在文献“陈琦等，利用葡萄糖发酵产聚β-羟基丁酸菌株的选育，微生物学通报，1994，21(6),333-335”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
E.coli S17-1在文献“Simon R PU,Püller A.,A broad host rangemobilization system for in vivo genetic engineering:transposon mutagenasis ingram negative bacteria,Nat.Biotechnol.,1983,1(9):784-789”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
pJQ200mp18Tc载体在文献“Potter M.,Steinbüchel A.,Poly(3-hydroxybutyrate)granule-associated proteins:impacts on poly(3-hydroxybutyrate)synthesis and degradation,Biomacromolecules,20056(2),552-60.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
pLXM1质粒在文献“卢雪梅等，Ralstonia eutropha W50的L-阿拉伯糖代谢途径工程改造,微生物学报,2013,53(12)1147－1155.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
大肠杆菌W3110在文献“Barfknecht T.R.,Smith K.C.,Ultraviolet radiation-induced mutability of isogenic uvrA and uvrB strains of Escherichia coli K-12W3110.Photochemistry and photobiology,1977(26),643-645.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
pMDT19-simple质粒购买于宝生物工程有限公司，产品目录号为TAKARA Code：D104。
PG培养基的配制方法：每升PG培养基中含蛋白胨10g、酵母粉5g、葡萄糖3g、硫酸铵3g。
基础培养基的制备方法：每升基础培养基含有6.7g Na2HPO4·2H2O、1.5g KH2PO4、1g(NH4)2SO4、0.2g MgSO4·7H2O、1ml的微量元素和20g葡萄糖。
每升的微量元素中含有0.3g H3BO3、0.2g CoCl2、0.1g ZnSO4·7H2O、0.03gMnCl2·4H2O、0.02g NaMoO4·2H2O、0.02g NiCl2·6H2O、0.01g CuSO4·5H2O、0.01g CaCl2·2H2O和0.06g Fe(NH4)2(SO4)2。
实施例1、prpC1与prpC2的基因敲除载体的构建
1、prpC1基因敲除载体的构建
以真养罗氏菌(Ralstonia eutropha)H16的基因组DNA为模板，采用prpC1df/prpC1dr引物进行PCR扩增。引物序列如下所示：
prpC1df：5’-TAGATCTCAAGCGCGCCGGCTACCGGGCC-3’；
prpC1dr：5’-TTCTAGACAGGTCGAACTTCAGCACGCGCT-3’。
将扩增得到的大小为3222bp的片段，连接到质粒pMDT19-simple上，得到的重组载体记作pMD19-prpC1，将重组载体pMD19-prpC1转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提取质粒进行测序。测序结果表明：PCR扩增产物的序列如序列表中序列1所示，其中包含prpC1基因及其两端同源臂的DNA片段。prpC1基因的核苷酸序列如序列表序列1中自5′端第878-2035位核苷酸分子所示；prpC1基因编码的2-甲基柠檬酸合酶-1的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
用限制性内切酶SacⅡ对上述获得的pMD19-prpC1进行酶切，由于prpC1基因片段中含有两个SacⅡ的酶切位点，因此该质粒酶切后从序列表中序列1的内部移除了1222bp的片段，回收大片段，用T4连接酶自连后得到重组载体记作pMD19-ΔprpC1，将pMD19-ΔprpC1转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提取质粒用prpC1df/prpC1dr引物对进行测序。测序结果表明：该质粒上携带序列表中序列3所示的DNA分子，记作ΔprpC1DNA片段，该片段为将序列表中序列1自5’末端第1001-2222位的核苷酸去除后得到的序列。
用限制性内切酶BglⅡ和XbaⅠ对pMD19-ΔprpC1进行双酶切并平滑化后与pJQ200mp18Tc载体经Sma I酶切并去磷酸化的片段用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在含有四环素的LB平板上，得到转化子。提取转化子的质粒，用KpnI酶切。pJQ200mp18Tc载体有两个Kpn I酶切位点，无外源基因时，酶切的结果为两条3kb大小的片段；当有外源基因在多克隆位点插入时，用KpnI酶切后，核酸凝胶电泳得到两条大小不等的条带，说明质粒中有外源片段的插入。该质粒为含有prpC1基因同源片段的敲除载体，命名为pJQ200mp18Tc：：ΔprpC1(图1)。
2、prpC2基因敲除载体的构建
以真养罗氏菌H16的基因组DNA为模板，采用引物prpC2df/prpC2dr进行PCR扩增，引物序列如下所示：
prpC2df：TGAGCTCCGTGCATCCTTCCGAGGTCTTGT；
prpC2dr：TCTCGAGTCGAAGGATGATGCGATGGCATT。
将扩增得到3218bp的DNA片段，连接到质粒pMDT19-simple上，得到的重组载体记作pMD19-prpC2，将重组载体pMD19-prpC2转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提取质粒进行测序。测序结果表明：PCR扩增产物的序列如序列表中序列4所示，该PCR产物为包含prpC2基因及其两端同源臂的DNA片段。prpC2基因的核苷酸序列如序列表中序列4中自5′端第1032-2229位核苷酸分子所示；prpC2基因编码的2-甲基柠檬酸合酶-2的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
用限制性内切酶PstⅠ和ClaⅠ对pMD19-prpC2酶切，酶切后重组载体pMD19-prpC2中从序列表中序列4的内部移除了1443bp的基因片段，回收大片段，用T4连接酶自连后得到重组载体记作pMD19-ΔprpC2，将pMD19-ΔprpC2转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提取质粒用prpC2df/prpC2dr引物对进行测序，该质粒上携带如序列表中序列6所示的DNA分子，共1775bp，命名为ΔprpC2DNA片段，该片段为将序列表中序列4自5’末端的第922-2364位的核苷酸去除后得到的序列。
用限制性内切酶SacⅠ和XhoⅠ对pMD19-ΔprpC2进行双酶切并平滑化后与pJQ200mp18Tc载体经Sma I酶切并去磷酸化的片段用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在含有四环素的LB平板上，得到转化子。提取转化子的质粒，用KpnI酶切。pJQ200mp18Tc载体有两个Kpn I酶切位点，无外源基因时，酶切的结果为两条3kb大小的片段；当有外源基因在多克隆位点插入时，用KpnI酶切后，核酸凝胶电泳得到两条大小不等的条带，说明质粒中有外源片段的插入。该质粒为含有prpC2基因同源片段的敲除载体，命名为pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2(图2)。
实施例2、prpC1与prpC2基因敲除菌株的构建
1、prpC1基因敲除菌株的构建
通过接合转移的方法进行基因敲除。将pJQ200mp18Tc：：ΔprpC1敲除载体转化E.coli S17-1，涂布在含有四环素的LB平板上，筛选出正确转化子，命名为ΔprpC1pJQ200/S17-1。
ΔprpC 1pJQ200/S17-1用作接合转移的供体菌与受体菌Rem-1进行接合转移。接合转移的过程如下：首先将受体菌Rem-1接种于PG培养基，于30℃培养至OD值为1.0；将供体菌ΔprpC 1pJQ200/S17-1接种于LB培养基于37℃培养，生长至OD值为0.4；分别取100μl受体菌和供体菌培养液，3000转/分钟离心去上清，将两株菌用100μl新鲜的PG培养基悬浮混合，置30℃培养12h后涂布于含有氨苄青霉素(50μg/ml)和四环素(5μg/ml)的双抗LB平板上，30℃培养。由于Rem-1能够在50μg/ml氨苄青霉素平板上生长，而E.coli S17-1却不能在氨苄青霉素平板上生长，因此30℃培养48h后，只有在双抗平板上长出的菌落为一次交换的Rem-1菌落，筛出目的菌株，划线于含20％蔗糖的LB平板，挑取单菌落，以prpC1df/prpC1dr为引物用菌落PCR筛选出正确的基因敲除菌株ΔprpC1/Rem-1，得到的菌株命名为Rem-3。以prpC1df/prpC1dr为引物，对Rem-3进行菌落PCR验证，获得的片段大小为2kb，而用prpC1df/prpC1dr引物对原始菌落Rem-1进行菌落PCR获得的片段大小为3.2kb，证明Rem-3中prpC1均已被敲除。
2、prpC2基因敲除菌株的构建
除将pJQ200mp18Tc：：ΔprpC1敲除载体替换为pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2转化E.coli S17-1，得到ΔprpC2pJQ200/S17-1用作结合转移的供体菌，以prpC2df/prpC2dr为引物用菌落PCR筛选正确的基因敲除菌株外，基因敲除菌株ΔprpC2/Rem-1的构建方法与上述基因敲除菌株ΔprpC1/Rem-1的构建方法相同，得到的菌株命名为Rem-5。以prpC2df/prpC2dr为引物，对Rem-5进行菌落PCR验证，获得的片段大小为1.8kb，而用prpC2df/prpC2dr引物对原始菌落Rem-1进行菌落PCR获得的片段大小为3.2kb，证明Rem-5中prpC2均已被敲除。
3、prpC1与prpC2的基因同时敲除菌株的构建
在Rem-3中敲除prpC2基因。具体操作除将pJQ200mp18Tc：：ΔprpC1敲除载体替换为pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2转化E.coli S17-1，得到ΔprpC2pJQ200/S17-1用作结合转移的供体菌，将受体菌Rem-1替换为Rem-3及以prpC2df/prpC2dr为引物用菌落PCR筛选正确的基因敲除菌株外，ΔprpC1ΔprpC2/Rem-1的构建方法与上述基因敲除菌株ΔprpC1/Rem-1的构建方法相同，得到的菌株命名为Rem-7。以prpC1df/prpC1dr为引物，对Rem-7进行菌落PCR验证，获得的片段大小为2kb，以prpC2df/prpC2dr为引物，对Rem-7进行菌落PCR验证，获得的片段大小为1.8kb，证明Rem-7中prpC1和prpC2均已被敲除。
实施例3、产PHBV基因工程菌的构建
1、构建含有外源基因簇yliK-argK-ygfG的表达载体pZMwf
以大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，采用引物muyayf/muyayr，经PCR扩增得到大小为3929bp的yliK-argK-ygfG基因簇，将所述yliK-argK-ygfG基因簇，连接到pMD19-Tsimple上，得到的重组载体记作pT-yliK-argK-ygfG，将重组载体pT-yliK-argK-ygfG转化大肠杆菌，挑取单菌落，提取质粒进行测序。引物对的序列如下：
上游引物Muyayf：5’-TGCGAGCTCATCGTTAATTCTTCAGAAGCGTTCGT-3’；
下游引物Muyayr：5’-TATAAGCTTTTAATGACCAACGAAATTAGGTT-3’。
用限制性内切酶XbaI和HindIII对pT-yliK-argK-ygfG进行双酶切，获得yliK-argK-ygfG基因簇片段，用限制性内切酶XbaI和HindIII对表达载体pLXM1进行双酶切，得到的大片段；将yliK-argK-ygfG基因簇片段与大片段连接，得到的重组载体记作pZMwf(如图2所示)；将pZMwf转化大肠杆菌DH5α，氯霉素抗性筛选，挑取阳性克隆的质粒。
测序结果表明：在pLXM1载体的Xba I和Hind III酶切位点间插入的yliK-argK-ygfG基因簇片段如序列表中序列7的核苷酸分子所示，表明载体正确。yliK-argK-ygfG基因簇编码的蛋白为甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶、GTP激酶和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶。其中，甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示，甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因序列如序列表中序列7的第1至2143位核苷酸分子所示；GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示，GTP激酶的编码基因序列如序列表中序列7的第2138至3131位核苷酸分子所示；甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示，甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的的编码基因序列如序列表中序列7的第3144至3929位核苷酸分子所示。
2、产PHBV基因工程菌的构建
将带有目的基因簇yliK-argK-ygfG的表达载体pZMwf通过电击转化的方法导入Rem-1的感受态细胞，在氯霉素平板上筛选阳性克隆子，经菌落PCR验证获得基因工程菌，命名为Rem-2。Rem-2含有序列表中序列7的核苷酸分子所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段。
真氧罗氏菌Rem-1感受态细胞的制备：将真氧罗氏菌Rem-1单菌落在固体PG培养基上培养过夜，随后接种于30ml的液体PG培养基中，30℃培养8h，之后将菌液置于冰浴冷却15min，离心收集细胞。用预冷的10％甘油重复洗涤3次细胞；最后加入100μl灭菌的冷10％甘油，悬浮细胞，冰浴20min，分装后于-80℃保存或直接用于电击转化。
用上述方法将带有目的基因簇yliK-argK-ygfG的表达载体pZMwf通过电击转化的方法导入Rem-3的感受态细胞，在氯霉素平板上筛选阳性克隆子，经菌落PCR验证获得基因工程菌，命名为Rem-4。Rem-4含有序列表中序列7的核苷酸分子所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段。
用上述方法将带有目的基因簇yliK-argK-ygfG的表达载体pZMwf通过电击转化的方法导入Rem-5的感受态细胞，在氯霉素平板上筛选阳性克隆子，经菌落PCR验证获得基因工程菌，命名为Rem-6。Rem-6含有序列表中序列7的核苷酸分子所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段。
用上述方法将带有目的基因簇yliK-argK-ygfG的表达载体pZMwf通过电击转化的方法导入Rem-7的感受态细胞，在氯霉素平板上筛选阳性克隆子，经菌落PCR验证获得基因工程菌，命名为Rem-8。Rem-8含有序列表中序列7的核苷酸分子所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段。
实施例4、基因工程菌发酵生产聚羟基丁酸－戊酸酯
分别挑取Rem-2，Rem-3，Rem-4，Rem-5，Rem-6，Rem-7和Rem-8单菌落，在固体PG培养基上划线培养过夜，然后接入含20μg/mL氯霉素基础培养基，30℃培养18-20h，将培养物以10％的接种量转接到装有现配制的基础培养基的摇瓶中(培养Rem-2，Rem-4，Rem-6和Rem-8时添加0.1-15μM VB12)，继续培养。在发酵培养过程中，分别于8小时，24小时，32小时添加葡萄糖3次，每次添加1ml 20％的葡萄糖，同时调节pH至7.0，发酵培养48h。同时，用相同条件培养Rem-1菌作为对照。
发酵结束后取发酵液10mL，12000转/分钟，离心5min收集菌体，将菌体用水洗两次，70℃烘干后称重。称取20-30g干燥菌体，将干燥菌体转移至厌氧管，加入2mL苯甲酸酸化甲醇和2mL氯仿，加帽盖严后，100℃水浴4h，取出放置室温后，加入2mL去离子H2O抽提，移至10mL厌氧管，采用气相色谱法检测3－羟基丁酸甲酯(3HB甲酯)和3－羟基戊酸甲酯(3HV甲酯)组分。
气相色谱分析使用岛津GC-2010气相色谱仪，色谱柱为DB-5(SHIMADZU公司)，柱长25米，0.25um厚，内径0.25m，FID检测器。用高纯的氮气为载气，氢气为燃气，空气为助燃气。柱温：180℃，进样口温度250℃，使用分流模式，分流比为2。检测器温度250℃。聚羟基丁酸－戊酸酯(PHBV)标准品购自Sigma公司。实验设三次重复，结果取平均值。
聚羟基丁酸－戊酸酯(PHBV)标准品的气相色谱分析图谱如图3所示，3HB甲酯的出峰时间为3.3min，3HV甲酯的出峰时间为3.9min。对照菌株发酵产物的气相色谱分析图谱如图4所示。基因工程菌发酵产物(Rem-2摇瓶发酵产物)的气相色谱分析图谱如图5所示，保留时间为3.3min的峰为3HB甲酯，保留时间为3.9min的峰为3HV甲酯。
将prpC1基因敲除或prpC2基因敲除或prpC1和prpC2同时敲除后获得的基因工程菌菌株的发酵实验结果如表1所示。
表1、Rem-1、Rem-3、Rem-5和Rem-7的摇瓶发酵实验
注：表中的L代表发酵液的体积
结果表明：与Rem-1相比，Rem-3的3HV组分含量提高了57.6％，Rem-5的3HV组分含量提高了24.2％，Rem-7的3HV组分含量提高了3倍。上述结果说明阻断丙酰辅酶A的代谢旁路可以明显提高菌株PHBV合成中3HV组分的含量。
在不同宿主菌中表达yliK-argK-ygfG基因簇，基因工程菌发酵产PHBV的结果如表2所示。
表2、Rem-2，Rem-4，Rem-6和Rem-8的摇瓶发酵实验
注：表中的L代表发酵液的体积
结果表明，与Rem-1相比，Rem-2的3HV组分含量提高了24.8倍，说明增强丙酰辅酶A的合成可以显著提高菌株PHBV合成中3HV组分的含量。与Rem-3相比，Rem-4的3HV组分含量提高了27.9倍；与Rem-5相比，Rem-6的3HV组分含量提高了14.4倍；与Rem-7相比，Rem-8的3HV组分含量提高了20.8倍。上述结果说明阻断丙酰辅酶A的代谢旁路，同时增强丙酰辅酶A的合成可以显著提高菌株PHBV合成中3HV组分的含量。
Claims (6)
1.重组菌，将甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG导入宿主真氧罗氏菌(Ralstoniaeutropha)，得到所述重组菌；所述宿主真氧罗氏菌为真氧罗氏菌Rem-1或真氧罗氏菌Rem-3或真氧罗氏菌Rem-5或真氧罗氏菌Rem-7；
所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示；
所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；
所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示；
所述真氧罗氏菌Rem-1为真氧产碱杆菌65-7；
所述Rem-3是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-1基因prpC1后得到的菌；
所述Rem-5是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；
所述Rem-7是真氧罗氏菌Rem-1缺失所述2-甲基柠檬酸合酶-1基因prpC1和所述2-甲基柠檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；
所述2-甲基柠檬酸合酶-1的氨基酸序列如序列表中序列2所示；
所述2-甲基柠檬酸合酶-2的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、所述GTP激酶的编码基因argK和所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG通过重组表达载体pZMwf导入所述宿主真氧罗氏菌；
所述重组表达载体pZMwf的构建方法包括如下步骤：将如序列表中序列7所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表达载体pLXM1的多克隆位点中，得到的重组载体记作pZMwf。
3.权利要求1或2所述的重组菌在生产聚羟基丁酸－戊酸酯中的应用。
4.权利要求1或2所述的重组菌在提高菌株合成聚-3-羟基丁酸共聚3-羟基戊酸酯中3-羟基戊酸组分含量中的应用。
5.一种生产聚羟基丁酸－戊酸酯的方法，包括如下步骤：以葡萄糖为底物，发酵培养权利要求1或2所述的重组菌，得到所述聚羟基丁酸－戊酸酯。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的培养基中不含有丙酸或丙酸盐或戊酸或戊酸盐。
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