HUT77034A

HUT77034A - Ribonukleinsavak hasítására szolgáló oligonukleotid konjugátumok, készítmények és eljárás

Info

Publication number: HUT77034A
Application number: HU9701971A
Authority: HU
Inventors: Jonathan Hall; Dieter Hüsken; Robert Häner; Heinz Moser
Original assignee: Novartis Ag.
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 1998-03-02
Also published as: EP0778845A1; FI970696A0; CA2197785A1; NO970885D0; JPH10505353A; AU3519095A; WO1996007667A1; FI970696L; NO970885L

Description

SVÁJC

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/EP95/03408

A nemzetközi közzététel száma: WO 96/07667

A találmány tárgyát olyan oligonukleotid konjugátumok képezik, amelyekben az oligonukleotid dezoxiribonukleinsav, nem természetes, szintetikus nukleotid vagy peptidnukleinsav építőelemekből épül fel, az oligonukleotidhoz átészterező vagy hidrolizáló katalizátor — előnyösen texafirin-fém-komplex — kötődik, és az oligonukleotid belső szekvenciája részben nem-komplementer egy természetben előforduló cél-RNS-sel.

A találmány szerinti oligonukleotid konjugátumok kiválóan alkalmasak komplementer cél-RNS hasítására, ahol az oligonukleotid a hasítási reakció után újra szabaddá válik és ezáltal katalitikus hatást fejt ki.

Gyógyászatban diagnosztikai és terápiás célra alkalmazható.

c (°)A( v 9

63.455/PA

II-,

Tíleíon: 34 ^;‘H ko-Ha

·. Andrássy úí ι1 ,

-24-950, Fax: 34-24-323

Ribonukleinsavak hasítására szolgáló oligonukleotid konjugátumok, készítmények és eljárás

Novartis AG, BÁZEL, SVÁJC

Feltalálók: HÜSKEN, Dieter,	FREIBURG,	NÉMETORSZÁG
MOSER, Heinz,	MÖHLIN,	SVÁJC
HÁNER, Róbert,	FEHREN,	SVÁJC
HALL, Jonathan,	DONNERBÜHLWEG, SVÁJC

A bejelentés napja:

1995

Elsőbbsége

1994. 09. 02. (2694/94-5),

SVÁJC

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/EP95/03408

A nemzetközi közzététel száma: WO 96/07667

A találmány tárgyát képezik átészterező vagy hidrolizáló katalizátorokkal rendelkező oligonukleotid konjugátumok, amelyeknek az oligonukleotid-szekvenciája részben nem-komplementer egy természetben előforduló cél-ribonukleinsavval (cél-RNS); eljárás cél-RNS szekvencia-specifikus hasítására fiziológiai körülmények között és az oligonukleotid-asszociátum hatására; inért hordozó anyagból és az oligonukleotid-asszociátumból álló készítmény ugyanúgy, mint ezek alkalmazása.

Egyszálú RNS-ek hidrolitikus hasítása fémionok katalitikus hatására már régóta ismert. A hasítás alapvetően az RNS pár nélküli — angolul „loop-nak (huroknak) nevezett — részén következik be. Krzyzosiak és munkatársai az ólom-diacetát használatát ajánlják [ Biochemistry 27, 5771-5777 (1988)] . Murakawa és munkatársai az 1,1O-fenantrolin réz komplexeinek bevetését írják le [ Nucleic Acid Research 17, 5361-5375 (1989)] . Ugyanezen alkalma_z Phe zás céljára, tRNS hasitasara Ciesiolka és munkatársai az európium-trikloridot teszik közzé [Eur. J. Biochem. 182, 445-450 (1989)] . Chow és munkatársai ugyanezen RNS-hez ruténium- és ródium-komplexeket használnak fenantrolin ligandumokkal [ J. Am.

Chem. Soc. 112, 2839-2841 (1990)] . Behlen és munkatársai ólomPhe diacetáttal létrehozott tRNS mutánsokat említenek [ Biochemistry 29, 2515-2523 (1990)] . Továbbá Hayashi és munkatársai leírják [ Inorg. Chem. 32, 5899-5900 (1993)] , hogy tRNS-ek hasítására lantanida fénomplexek is alkalmasak.

Kappen és munkatársai [Biochemistry 32, 13138-13145 (1993) leírják, hogy egy- vagy kettősszálú DNS-nek neokarcinosztatinnal történő oxidatív hasításánál azután egy helyzetspecifikus hasítás következik be, amikor például pár nélküli részek egy DNS szálon kitüremkedéshez vezetnek. Williams és munkatársai [ Nucleic Acid Research 16, 11607-11615 (1988)] azt teszik közzé, hogy kettőszálú DNS-nek réz-fenantrolinnal való hidrolitikus reakciójánál a hasítás előnyösen olyan helyeken következik be, amelyek kiegészítésként egy pár nélküli citidint tartalmaznak a láncban.

A DE-A 2451358 számú szabadalmi iratban már leírják, hogy az egy kettősszálú (rl_n. rC_n)-komplexszel történő utánzott interferon képződésénél csökken a toxicitás az interferon termelődés fennmaradása alatt, ha az rC_n-lánc módosításával szerkezeti zavart idézünk elő oly módon, hogy az rC_n-lánc a sejtekben nukleázok által könnyebben hidrolizálódjon. Szerkezeti zavarként egy olyan nukleotid bevezetését ajánlják, amely megakadályozza a komplexben a párképződést. Meg kell még említeni, hogy Kolasa és munkatársai [Inorg. Chem. 32, 3983-3984 (1993)] rámutatnak, hogy DNSRNS hibridekben az RNS-ek háromértékű lantanid ionokkal nem hasadnak .

Továbbá leírták, hogy európium(III)-texafirin-ből és DNS építőköveket tartalmazó oligonukleotidokból álló konjugátumok cél-RNS-t hasítani képesek, ahol az RNS/oligonukleotid komplexben a texafirin-komplexek területén csupán körülbelül 30%-os megnövekedett hasítás figyelhető meg [D. Magda et al., J. Am. Chem. Soc. 116, 7439-7440 (1994)] . Ezeknél a texafirin-komp4 lexeknél hátrányos még az is, hogy a ligandumokhoz kiegészítésként hidroxi-propil-csoportot kell kötni, amellyel kielégítő oldhatóságot biztosítunk. Továbbá a ligandumok iminocsoportjai hidrolízisre hajlamosak, így vizes környezetben a hatékonyság gyorsan alábbhagy, illetve túl csekély tartózkodási idővel rendelkezik terápiás felhasználáshoz. A ligandumok hidrolízise révén ráadásul a fém szabaddá válik, amely komoly toxikológiai problémát és az RNS nem-specifikus hasítását idézheti elő. Továbbá ezek gyenge Lewis-savak, mivel az Eu-kationoknak egy töltését egy ligandum semlegesíti és ezáltal egy kettős töltésű komplex jön létre. A vázolt komplexek ezenfelül csak szintetikus, költséges eljárásokkal kaphatók meg.

A WO 94/29316 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés nyilvánosságra hoz egy foszfát-észter hidrolízisére szolgáló eljárást oligonukleotidnak texafirin-fém-komplexszel alkotott konjugátuma felhasználásával. Egy példában olyan konjugátumokat írnak le, amelyek fémként diszprózium(III)-at tartalmaznak, és amelyeknek az oligonukleotid-szekvenciáját úgy választják meg, hogy az oligonukleotid-szekvenciá kötődése a cél-RNShez ennél egy vagy több nukleotidból álló hurkot hoz létre.

Ismert, hogy sejtekben a fiziológiailag károsodott polipeptidek keletkezése a gének által irányított mRNS képződéséből következik. Betegségek legyőzésére illetve megakadályozására ezért kívánatosak olyan szerek, amelyek a mRNS hatását megakadályozzák. Különösen azt kell elérni, hogy a mRNS-t egy meghatározott helyen irreverzibilis hasítás révén tönkretegyük és ezáltal az i::rmació-tartalom elvész. Továbbá kívánatos az RNS láncoknak * Λ szekvencia-specifikus hasítása révén olyan széttört darabok előállítása, amelyek megfelelő oligonukleotidoknak az „antiszenzterületen történő gyorsabb azonosítására, diagnosztikai célra (bioszenzorok), vagy a sejtben végbemenő anyagcsere-folyamatok befolyása alatt álló betegségek gyógyítására alkalmazhatók.

A fent említett szerekkel szemben magas követelményeket állítanak. A cél-RNS-sel specifikusan hibridizálniuk kell és nem befolyásolhatnak más előforduló DNS és/vagy RNS molekulákat. Különösen hatásosnak kell lenniük már kis mennyiségekben is, és stabilnak kell lenniük a test saját immunanyagai (például nukleázok) által okozott lebontással szemben.

Azt találtuk, hogy olyan oligonukleotidok, amelyeknek a szekvenciája csak részben komplementer egy cél-RNS-sel, és amelyekhez egy átészterező vagy hidrolizáló katalizátor kötődik, nagyon hatásosak és velük egy cél-RNS-ben akár szekvencia-specifikus hasítások is elvégezhetők. Továbbá azt találtuk, hogy öszszehasonlítható reakció körülmények között jelentősen kevesebb oligonukleotid-átészterező katalizátor szükséges, mint szabad, tehát nem oligonukleotidhoz kötődő átészterező katalizátor. A cél-RNS-nek kettősszálú területen történő hasítása révén az RNS/oligonukleotid komplexek instabilitása az RNS hasítása után erősen megnő és megkönnyíti a szabad RNS darabokra és a szabad oligonukleotidból és hidrolízis ill. átészterező katalizátorból álló - konjugátumra történő szétesést. Ennek következtében kibontakozhat a konjugátum katalitikus aktivitása és a bevetési mennyiségek jelentősen csökkenthetők.

A találmány tárgyát dezoxiribonukleotidokból (NS), nem tér• · · mészetes szintetikus nukleotidokból vagy peptid-nukleinsavakból (PNS) álló oligonukleotid képezi, amelyben az oligonukleotid átészterező vagy hidrolizáló katalizátorhoz kötődik, és az oligonukleotidok belső szekvenciája részben nem-komplementer egy természetben előforduló cél-RNS-sel.

A találmány keretein belül a cél-RNS azt jelenti, hogy a célpontban egy RNS szekvenciának kell lennie. Ennek megfelelően rendelkezésre állhatnak poli-ribonukleinsavak (poli-RNS-ek). Előnyösen mRNS-ről (messenger RNS) , elő-mRNS-ről, tRNS-ről (transzfer RNS), snRNS-ről (kis nukleáris RNS), rRNS-ről (riboszómális RNS) és vírus RNS-ről van szó. Lehetnek azonban RNS-ből és poli-dezoxiribonukleinsavakból (DNS) álló keverék szekvenciák is, például a kiméra RNS-DNS Okazaki-fragmentum. Az RNS annyi építőelemből áll, hogy az oligonukleotiddal komplex (kettős szál) képződhet.

A találmány keretein belül a részben nem-komplementer azt jelenti, hogy az oligonukleotid szekvenciája egy szerkezeti zavart tartalmaz oly módon, hogy a cél-RNS megfelelő nukleotid építőelemeivel nem következik be bázispárosodás (például a célRNS-ben és az oligonukleotidban a következő komplementer nukleozidok bázispárosodását jelenti: A-U, T/U-A, G-C és C-G). Egy kiviteli alakban hiányzik a cél-RNS-hez egyébként komplementer oligonukleotid-szekvencia egy vagy több, egymás után következő nukleotid építőeleme. Ezáltal a cél-RNS-ben kitüremkedés keletkezik, amely különösen instabil átészterezésre és/vagy hidrolízisre. Egy másik kiviteli alakban az oligonukleotid egy vagy több, egymás után következő olyan nukleotid építőelemet tártál7 • · « máz, amelyek a cél-RNS megfelelő nukleotid építőelemeivel nem képeznek párt. Az RNS a kettős hélixben bekövetkezett szerkezeti zavar miatt ezeken a területeken átészterező és/vagy hidrolízis reakciókkal szemben instabil. Az oligonukleotidnak előnyösen 110, különösen előnyösen 1-4 és egészen különösen előnyösen 1 vagy 2 egymást követő nukleotidja hiányzik. Egy másik kiviteli alakban az oligonukleotid előnyösen 1-10, különösen előnyösen 14 és egészen különösen előnyösen 1 vagy 2 egymást követő, párt nem képező nukleotidot tartalmaz (ezeket a szerkezeti zavarásokat angolul „internál loop (belső hurok) és „mismatch (hibás párosítás) elnevezésekkel illetik).

A találmány keretein belül a belső szekvencia azt jelenti, hogy a szekvenciának például 10, előnyösen 5, különösen előnyösen 3 és egészen különösen előnyösen 1 vagy 2 külső építőeleméig nem kell komplementernek lennie a cél-RNS-sel. Ez olyan vonatkozásban előny lehet, hogy egy szekvencia végéhez kötött átészterező vagy hidrolizáló katalizátor mozgékonyabb és ezáltal hatékonyabb lehet.

Az oligonukleotid részben vagy teljes egészében felépülhet a cél-RNS-sel komplementer természetes DNS építőelemekből vagy a cél-RNS-sel szintén teljes egészében komplementer nem természetes, szintetikus nukleotidokból, ahol részben azt jelenti, hogy az oligonukleotid-szekvenciában a cél-RNS-sel komplementer természetes DNS építőelemeket szintén komplementer nem természetes, szintetikus nukleotidokkal helyettesítjük. Szintetikus építőelemek felölelik természetes építőelemek módosításait a nukleinbézisban, a furanóz-gyűrűben és/vagy az oligonukleotid hidat ké8 pező csoportjaiban. Szintetikus építőelemeket általában azért építünk be, hogy erősítsük a komplexkötést a duplex-szerkezetben és/vagy megnöveljük az oligonukleotid stabilitását például a nukleázok okozta lebontással szemben. Komplementer oligonukleotidok szintézisére vagy módosítására szolgáló módosított nukleozidok az „antiszenz-technológia területén nagy számban váltak ismertté és ezért azokat itt nem taglaljuk közelebbről [ lásd például E. Uhlmann et al., Chemical Reviews 90(4) , 543-584 (1990)] .

Módosításként a nukleinbázisban (például szubsztitúciók, szubsztituensek kihagyása), a nukleotid-híd csoportban (például változtatás a foszforsav-észter csoportban vagy annak helyettesítése más hídképző csoportokkal) és a furanóz-gyűrűben (például szubsztitúciók a 2' -hidroxilcsoporton, a furanóz O-atomjának helyettesítése, a furanóz-gyűrű kicserélése mono- vagy dikarbacilgyűrűvel, a furanóz-gyűrű kicserélése nyíltláncú szerkezetekkel) történő változtatások jönnek szóba.

Az építőelemek választékát és sorrendjét az oligonukleotid szekvenciájában egy cél-RNS-sel való szükséges duplexképződés segítségével határozzuk meg. A katalizátor fajtája és kapcsolódási helye is befolyásolhatja az építőelemek választékát és sorrendjét .

A párt nem képző nukleotidoknál olyan természetes nukleotidokról lehet szó, amelyeket úgy választunk ki, hogy azok nemkomplementerek a cél-RNS nukleotidjaival (a Watson/Crick féle definíciónak megfelelően például az olyan párok, mint A-A, U-U,

A-G, A-C, G-T, T-U) . A párt nem képző nukleotidoknál azonban szóba jöhetnek nem természetes, szintetikus nukleotidok is. Ezek a nukleotidok lehetnek a nukleotidbázisnál, a nukleotid-foszforsav-észter hídnál vagy a furanóz-gyűrűnél módosítottak. Ilyen típusú módosított és szintetikus, nem-komplementer építőelemek nagy számban váltak ismertté és a szakember számára közismertek. Egy előnyben részesített kiviteli alakban az oligonukleotid nem természetes komplementer nukleotidokból épül fel, ahol az oligonukleotid különösen előnyösen nem-komplementer nem természetes építőelemeket is tartalmaz.

Az építőelemek számát az oligonukleotidban úgy mérjük meg, hogy hibridizációt végzünk a cél-RNS-sel. Az oligonukleotidok tartalmazhatnak például 5-100, előnyösen 5-50, különösen előnyösen 8-30 és egészen különösen előnyösen 10-25 építőelemet. Azok a területek, amelyek a cél-RNS-sel való párképződést megakadályozzák (hiányzó illetve párt nem képző nukleotid építőelemek), előnyösen az oligonukleotid középső szekvenciáiban helyezkednek el, például a szekvenciának a mindenkori utolsó előtti negyedik vagy a mindenkori utolsó előtti harmadik vagy a mindenkori utolsó előtti vagy a mindenkori utolsó építőelemei között. Egy 20 építőelemből álló oligonukleotidnál például hiányoznak, vagy párt nem képző építőelemek találhatók előnyösen a negyediktől a tizenhetedik építőelemig terjedő területen. A találmány szerint olyan oligonukleotidokat részesítünk előnyben, amelyekben nukleotidok hiányoznak.

Előnyben részesítjük a purin és pirimidin sorozat nukleozidjaiból felépülő oligonukleotidokat. Különösen előnyben részesítjük a 2' -dezoxi-2-amino-adenozinból, 2' -dezoxi-5-metil-citidin10

* · a a • .·· ··. :·· ··· ·»·.·· bői, 2' -dezoxiadenozinból, 2' -dezoxicitidinből, 2' -dezoxiuridinből, 2' -dezoxiguanozinból és 2' -dezoxitimidinből felépülőket. Egészen különösen előnyben részesítjük a 2' -dezoxiadenozint (A), 2' -dezoxicitidint (C) , 2' -dezoxiguanozint (G) és 2' -dezoxitimidint (T). Módosított építőelemek előnyösen adenozinból, citidinből, guanozinból, 2-amino-adenozinból, 5-metil-citozinből, timidinből és az előzőekben megnevezett dezoxi-származékokból vezethetők le. A nukleozidoknál 2' -módosított ribonukleozidok is szóba jöhetnek.

A találmánynak egy egészen különösen előnyben részesített kiviteli alakjában a cél-RNS-sel részben komplementer oligonukleotid (1) természetes dezoxinukleozidokból — különösen előnyösen a 2' -dezoxiadenozint (A) , 2' -dezoxicitidint (C) , 2' -dezoxiguanozint (G) és 2' -dezoxitimidint (T) tartalmazó csoportból — vagy komplementer nem természetes szintetikus építőelemekből épül fel, és (2) a csak részben komplementer sajátság előnyösen 1-4, különösen előnyösen 1-3, és egészen különösen előnyösen 1-2 építőelem hiánya révén jön létre az egyébként komplementer szekvenciában. A találmány keretein belül különösen előnyben részesítünk ilyen módosított nukleozidokat, amelyek megnövelik az oligonukleotid stabilitását nukleázokkal szemben.

Az oligonukleotid peptidnukleinsavak (PNS) szekvenciáiból is állhat, ahol a katalizátor előnyösen a nukleinbázishoz, az amino- vagy a karboxi-elágazáshoz kötött. A nukleinbázisok a peptid-szekvencia amid-N-atomjához kötöttek. A komplementer szekvencia állhat természetes vagy nem természetes szintetikus aminosav építőelemekből, ahol az előzőekben leírt nem-komplementer • · β sajátság építőelemek elhagyása révén vagy nem-komplementer építőelemek beépítése révén érhető el. A PNS szekvencia felépítésére ugyanazok az előnyben részesítések érvényesek, mint az oligonukleotidokra. PNS-ekre példák találhatók a Science 254, 14971500 publikációban.

Átészterező és/vagy hidrolizáló katalizátor adott esetben kötődhet hidat képező csoporton keresztül N-, S- vagy O-atomokhoz az oligonukleotid-szekvencia 3’ vagy 5’ végcsoportjaiban. A katalizátorok kötődhetnek azonban nukleinbázisok C-, N- vagy 0atomjaihoz a szekvencia belsejében vagy végén, 0-, S- vagy Natomokhoz furanóz-gyűrűk 2’-helyzetében a szekvencia belsejében vagy végén, vagy a nukleotid hídképző csoportjának 0-, S- vagy N-atomjaihoz a szekvencia belsejében. A kötés jellege a katalizátor típusától és funkciós csoportjainak fajtájától függ. Egy katalizátor molekula például közvetlenül vagy hídképző csoporton keresztül kötődhet az oligonukleotidhoz. Hídképző csoport lehet például egy olyan átalakított funkciós csoport, amely a maga részéről közvetlenül vagy összekötő csoporton keresztül képes a katalizátorhoz és/vagy az oligonukleotidhoz kötődni. Az oligonukleotidhoz való kötődés lehet ionos és előnyösen kovalens. A katalizátorok kötődhetnek egy karbociklusos nukleotid-analóg 6’szénatomjához is.

A hídképző csoport előnyösen megfelelhet például az I. általános képletnek,

-x₁-x₂-x₃-(x₄)_x- (I.) amelyben X₃ közvetlen kötést vagy olyan kétértékű, 1-22 szénatomos nyíltláncú vagy ciklusos szénhidrogén csoportot, amely meg12 • · · szakítás nélküli vagy az -S-, -NR-, -0(0)-0-, -C(O)-NR- csoportok maradékaival megszakított, vagy 1-12 oxa-alkilén egységet és az alkilénben 2 vagy 3 szénatomot tartalmazó polioxa-alkilénmaradékot jelent; X₂ -0-, -S-, -NR-, -NH-C(0)-NH-, -NH-C (S)-NH-,

-0-C (O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -0-C (0)-0-, -0(0)-0-, -C (S) -0-,

-0-C(0)-, -O-C(S)-, -C(O)-NR-, -RN-C(O)-, -S (0)-0-,-0-S (0) ₂~,

-S(O)₂-NR-, -NR-S(O)-, -P (0) - (OM)-0-, -0-P (0) - (OM)-, -P(0)-(0M)-NR-, -NR-P (0) - (OM)-, -PH(O)-O-, -O-PH(O)-, -PH(O)-NR- és

-NR-PH(O)- csoportokat szemléltet; X₃ függetlenül X_x jelentésével bír és x 0-val azonos, ha X₃ közvetlen kötést szemléltet; X₄ egy nukleozid építőelem 0-, N- vagy C-atomjához való kötődést jelent, vagy X₄ -0-P (0) (OM)-0-, -NR-P (0) (OM)-0-, -0-P (0) (OM)-NR-, vagy -NR-P(O)(OM)-NR- csoportokat szemléltet, ha x 1-gyel azonos és X₃ nem közvetlen kötés; R H-, Cj-Cg-alkil-, fenil- vagy benzilcsoport; Μ H-, C₁-C₆-alkil-, fenil- vagy benzilcsoport, alkálifém kation vagy ammónium kation helyén áll; és x 0 vagy 1.

X_T kétértékű szénhidrogén csoportként előnyösen 1-18, különösen előnyösen 1-12 és egészen különösen előnyösen 1-8 szénatomot; és polioxa-alkilén-maradékként — a -CH₂-CH₂-O- és -CH₂-CH(CH₃)-O- csoportból — előnyösen 1-6, különösen előnyösen 1-4 oxa-alkilén egységet tartalmaz. A szénhidrogén csoportnál például lineáris vagy elágazó C₁-C₂₂-alkilén-, előnyösen C₁-C₁₈-alkilén-, különösen előnyösen C₁-C₁₂-alkilén- és egészen különösen előnyösen C₁-C₈-alkilén-; C₃-C₈-cikloalkilén-, előnyösen C₅-vagy Cg-cikloalkilén-; C₆-C₁₂-arilén- vagy C₇-C₁₂-aralkilén-csoportok jöhetnek szóba. Néhány példa kétértékű szénhidrogén csoportokra a metilén-, etilén-, 1,2- vagy 1,3-propilén-, 1,2-, 1,3- vagy • ·

1.4- butilén-, 1,2-, 1,3-, 1,4- vagy 1,5-pentilén-, 1,2-, 1,3-,

1.4- , 1,5- vagy 1,6-hexilén-, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6- vagy 1,7-heptilén-, 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7- vagy 1,8oktilén-, és izomer nonilén-, decilén-, undecilén-, dodecilén-, tridecilén-, teradecilén-, pentadecilén-, hexadecilén-, heptadecilén-, oktadecilén-, nonadecilén- és eikozilén-csoportok; ciklopentilén-, ciklohexilén-; naftilén- és különösen fenilén-; benzilén- és fenil-etilén-csoport. Néhány példa polioxa-alkilénmaradékra etilénoxi-, dietilénoxi-, trietilénoxi-, tetraetilénoxi- és 1,2-propoxi-csoportok.

Alkilcsoportként R előnyösen 1-4 szénatomos és előnyösen metil- vagy etilcsoport. Különösen előnyösen R H-nel azonos.

Ha M alkilcsoportot jelent, akkor előnyösen 1-4 szénatomos; különösen előnyösen metil- vagy etilcsoport. Alkálifém és ammónium kationokként Na⁺, K⁺, NH4⁺ és N (C1-C₆-alkil) ₄ ⁺ kationokat részesítünk előnyben.

Az I. általános képlet hídképző csoportjainak előnyben részesített alcsoportjai azok, ahol X_x közvetlen kötés és előnyösen C₁-C₄-alkilén-, fenilén- vagy benziléncsoportot jelent, ahol az alkilén-csoportot -C(0)-0- vagy -C(O)-NH- csoportok szakíthatják meg; X₂C(O)-O-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH- vagy -NH-C (S)-NH-; X₃ C₂~ C₁₈-alkilén-, előnyösen C2-C₁₂-alkilén-csoportot szemléltet; X₄ 0-P (0) (OM) -0-, -NR-P (0) (OM)-0-, -0-P (0) (OM)-NR- vagy -NR-P(O)- (OM)-NR- csoportokat jelent (magyarázatként: az -0-P(0) (OM)-0-,

-NR-P (0) (OM)-0-, -0-P (0) (OM)-NR- vagy -NR-P (0) (OM)-NR- maradékoknál ezekbe a hídképző csoportokba a nukleozid építőelemek Νέε 0-atomjair integráltuk).

·>

·»·

Oligonukleotidhoz kötődő katalizátorokként például polipeptidek (transzferázok/hidrolázok), fémsók és fémkomplexek jönnek szóba, ahol a fémeket előnyösen az elemek periódusos rendszerének mellékcsoportjaiból, valamint főcsoportjaiból, In, TI, Sn, Pb és Bi választjuk ki. Példák a Se, Y, La, lantanidák, Ti, Zr,

Hf, V, Nb, Ta, Cr, Mo, W, Mn, Fe, Ru, Os, Co, Rh, ír, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Cd és Hg. Előnyben részesítjük a szkandiumot, ittriumot, lantánt, lantanida fémeket, rezet és ólmot. A lantanida fémeken belül előnyben részesítjük a következőket: Ce,

Eu, Gd, és Sm. A fémek előnyösen két- vagy háromértékű kationként állnak rendelkezésre.

A fémsókhoz és fémsó-komplexekhez megfelelő anionokat a következő csoportból választhatunk: halogenid (például Cl , Br és I ) , oxisavak anionja, BF₄ , PF₆ , SiF₆ és AsF₆ .

Az oxisavak anionjainál például szulfát-, foszfát- perklorát-, perbromát-, perjodát-, antimonát-, arzenát-, nitrát-, karbonát-, C₁-C₈-karbonsav anionja, mint például formiát-, acetát-, propionát-, butirát-, benzoát-, fenil-acetát-, mono-, divagy triklór- vagy -fluoracetát-, szulfonát-, mint például metil-szulfonát-, etil-szulfonát-, propil-szulfonát-, butil-szulfonát-, trifluor-metil-szulfonát- (triflat-), adott esetben C₄C₄-alkillel, C₁-C₄-alkoxival vagy halogénnel, különösen fluorral, klórral vagy brómmal szubsztituált fenil-szulfonát- vagy benzilszulfonát-, mint például tozilát-, mezilát-, brozilát-, p-metoxi- vagy p-etoxi-fenil-szulfonát-, pentafluor-fenil-szulfonátvagy 2,4,6-triizopropil-szulfonát- és foszfonátok-, mint például metil-foszfonát-, etil-foszfonát-, propil-foszfonát-, butil15 foszfonát-, fenil-foszfonát-, p-metil-fenil-foszfonát- és benzil-foszfonát- jöhet számításba.

Fémkomplex katalizátorok előnyösen hetero-organikus vegyületekkel, mint komplexképzőkkel képzett fémsó-komplexként állnak rendelkezésre, ahol a komplexképző az oligonukleotidhoz kapcsolódik. Komplexképzők nagy számban ismertek. Az 0, S, N és P csoportból kiválasztott hetero-atomokat tartalmazó nyíltláncú vagy ciklusos szerves vegyületekről lehet szó. Előnyben részesítünk összesen 8-26, előnyösen 12-20 gyűrűtagot tartalmazó és 2-12, előnyösen 4-12, és különösen előnyösen 6-12 hetero-atommal rendelkező ciklusos vagy policiklusos szerves vegyületeket. A hetero-atomok közül az O-t és különösen a N-t részesítjük előnyben. Néhány példa komplexképzőkre a koronaéter, cianin, ftálocianin, porfirin, fenantrolin, nyílt és ciklusos di- és terpiridin, etilén-diamin-tetraecetsav és dietilén-triamin-pentaacetát.

Egy előnyben részesített kiviteli alakban a találmány szerinti katalitikusán hatásos oligonukleotidok esetében a II. általános képletű konjugátumról van szó,

A-B-oligó (II.) amelyben A a B-hez előnyösen szénatomon keresztül kötődő ciklusos vagy policiklusos fémsókomplex, amelyet olyan komplexképzővel állítunk elő, amely a gyűrűben legalább 12 gyűrűatomot és legalább 4 hetero-atomot — N és 0 csoportból - tartalmaz kétértékű vagy háromértékű fémionokhoz kötve, amelyeket a szkandiumot, ittriumot, lantánt és lantanida fémeket tartalmazó csoportból választottunk ki; B az I. általános képlet hídképző csoportjául szolgál és oligó olyan oligonukleotidot jelent, amelynek belső szekvenciája cél-RNS-sel részben nem-komplementer.

Az oligóra és B-re az előzőekben megadott előnyben részesítések érvényesek.

A komplexképző legtöbb 22, előnyösen 6-20, előnyösebben ΙΣΣΟ és különösen előnyösen 14-20 gyűrűatomot tartalmazhat, ahol a gyűrűatomok a hetero-atomokon kívül előnyösen C-atomok. A N és/vagy 0 hetero-atomok száma előnyösen 4-12, különösen előnyösen 4-10, és egészen különösen előnyösen 4-8. Kisebb gyűrűméreteknél (például 6-12 gyűrűatom) alacsonyabb hetero-atom tartalmat részesítünk előnyben, 4-8, előnyösebben 4-6. Előnyben részesített alcsoportnál a komplexképző 16-20 és különösen 18 gyűrűatomot, valamint 6-10 és előnyösebben 8 N-atomot tartalmaz, ahol a fennmaradó gyűrűtagok esetében C-atomokról van szó, és az 1-6.

és előnyösen a 2-4. gyűrűre nem-szubsztituált és szubsztituált

-CH=CH-CH=CH- csoportok kötődnek 1,3 helyzetben, és a gyűrű Natomjaival piridinocsoportot alkotnak. Ez a komplexképző előnyösen 2-4 piridin-csoportot és további 4 N-atomot tartalmaz a gyűrűben. Előnyben részesített fémionok a La, Ce, Nd, Eu és Gd. Előnyben részesített anionok a fémsókomplexekben a halogenidek (Cl-, Br-), szulfát-, PF₆ , nitrát-, acetát-, metil-szulfonét-, trifluor-metil-szulfonát-, karbonát-, hidrogén-szulfát-, hidrogén-karbonát- és perklorát-.

Egy különösen előnyben részesített kiviteli alakban a II. és

III. általános képlet szerinti konjugátumokról van szó,

ahol R₂ és R₇ egymástól függetlenül H-, C₁-C₄-alkil-, C₁-C₄-alkoxi- C₇-C₁₂-aralkil- vagy C_e-C_ie-arilcsoportot jelent,

R₃ és R₆ egymástól függetlenül H-, C₁-C₄-alkil-, C₇-C₁₂-aralkilvagy C₆-C₁₆-arilcsoport,

R₄ H-, C₁-C₂₀-alkil-, C₅-C₈-cikloalkil-, C₆-C₁₂-aril- vagy C₇-C₁₂aralkilcsoport helyén áll,

Me lantán, lantanid fém, ittrium vagy szkandium helyén áll,

Y egy aniont helyettesít, n 2 vagy 3, és m 1,2 vagy 3, ahol az alkil-, cikloalkil-, aralkil- és aril-maradékok nemszubsztituáltak vagy C_x-C₄-alkoxi-, F-, Cl-, Br-, -CN, C₁-C₄-alkil- vagy -NO₂ csoporttal szubsztituáltak,

R₅ a IV. általános képlet maradéka -B-oligó (IV.) és R_T K vagy egy szubsztituens vagy • · ·

R₅ H vagy egy szubsztituens és R₄ a IV. általános képlet egy maradékát jelenti, ahol B és oligó az előzőekben megadott jelentésekkel rendelkeznek, beleértve az előnyben részesítéseket. Alkalmas és szintén előnyben részesített anionokat Y^m-re az előzőekben említettünk. Különösen előnyben részesítjük ha Y^m = Cl .

R₂, R₃, Rg és R₇ alkilcsoportként előnyösen metil- vagy etilcsoportot, alkoxi-csoportként előnyösen metoxi- vagy etoxicsoportot, aralkil-csoportként előnyösen benzilén- vagy fenil-etilén- és árucsoportként előnyösen naftil- és különösen benzilcsoportot jelent. Egy előnyben részesített kiviteli alakban R₂és R₇ H-t és R₃ és Rg alkilcsoportot jelent. Különösen előnyösen R₂ és R₇ H-t valamint R₃ és Rg C₁-C₄-alkil- és egészen különlegesen metilcsoportot jelent. R₂, R₃, Rg és R₇ esetében 0, S, N hetero-atomokkal C₄-C₁₂-hetero-arilcsoportról is lehet szó. Példák a pirridil-, tiazolil-, imidazolil-, oxazolil-, furanozil-, pirrolil-, tiofenil-csoportok. Továbbá szóba jöhetnek ^-C^-alkiltio-, halogenid, di-(C₁-C₄-alkil)-amino-, szulfonamid- és karboxamid-csoportok.

R-l és R₅ szubsztituensként előnyben részesítjük a Cj-C^-alkil-, C₁-C₄-alkoxi-, C₇-C₁₂-aralkil- vagy C₆-C₁₆-aril-, az 0, S, N hetero-atomokkal rendelkező C₄-C₁₂-hetero-aril-, C₁-C₄-alkiltio-, di-(C₁-C₄-alkil)-amino-, halogenid, szulfonamid- és karboxamidcsoportokat.

R₄ és R₅ előnyösen p-helyzetben kötődik a piridin-gyűrű Natomj ához.

R₄ alkilcsoportként előnyösen 1-12, különösen előnyösen 1-8 és egészen különösen 1-4 C-atomot tartalmaz. Néhány példa alkil19 csoportokra a metil- és etil- és az izomer propil-, butil-, pentil-, hexil-, heptil-, oktil-, nonil-, decil-, undecil-, dodecil-, tridecil-, tetradecil-, pentadecil-, hexadecil-, oktadecil-, nonadecil- és eikozil-csoportok.

R₄ cikloalkil-csoportként előnyösen 5 vagy 6 gyűrű-szénatomot tartalmaz. Néhány példa cikloalkil-csoportokra a ciklopropil-, ciklobutil-, ciklopentil-, ciklohexil-, cikloheptil- és ciklooktil-csoport.

R₄ arilcsoportként előnyösen naftil- és különösen fenilcsoportot szemléltet. Ha R₄ aralkil-csoport, előnyösen benzil- vagy fenil-etil-csoport jön szóba.

Előnyben részesített alcsoport R₄-re H-, Cj-C^-alkil-, különösen metil-, valamint fenil- vagy benzilcsoport.

R_x illetve R₅ alkilcsoportként metil- vagy etilcsoportot, alkoxi-csoportként előnyösen metoxi- vagy etoxi-csoportot, arilcsoportként naftil- vagy fenilcsoportot és aralkil-csoportként előnyösen fenil- vagy fenil-etil-csoportot jelent. R₂ illetve R₅előnyösen H-, metil-, etil-, metoxi- vagy etoxicsoport.

A III. általános képletű vegyületek előnyben részesített alcsoportjai azok, amelyekben R₂ és R₇ H- helyén áll, R₃ és R₆ CjC₄-alkilcsoportot jelent, R₄ H-, C₁-C₄-alkil-, fenil- vagy benzilcsoportot szemléltet, R₂ az -X₁-X₂-X₃-(X₄)_x-oligó csoport és R₅H-, metil- vagy metoxicsoport vagy R₅ az -X_x-X₂-X₃- (X₄) _x-oligó csoport és R-l H-, metil- vagy metoxicsoport, X₂ közvetlen kötés vagy C₂-C₆-alkilén-, X₂ -0-, -NH-, -C(O)-O-, -C(0)-NH-, -NH-C(O)-NH- vagy -NH-C (S) -NH-csoportot jelent, X₃ C₂-C₁₂-alkilén- vagy fenilén-csoportot szemléltet, X₄ nukleozid építőelem 0, N, vagy .’· .·· ····. :··. :··.

• · · ·

C-atomjához való kötődést jelent, vagy X₄ -O-P(O) (OM)-O-csoportot szemléltet, x 0 vagy 1 helyett áll, Me jelenthet La, Ce, Nd, Eu vagy Gd fémeket, n 2 vagy 3 és m 1 vagy 2 helyett áll, Y mutathat Cl-, Br-, CH₃C(O)O-, C1O₄-, BF₄ , PF₆ , F₃C-SO₃- vagy tozilát aniont, M állhat H, Na vagy K helyett, és oligó egy olyan oligonukleotidot jelent, amelynek belső szekvenciája egy cél-RNS-sel csak részben komplementer, és amely természetes dezoxiribonukleotid építőelemekből vagy nem természetes szintetikus nukleotid építőelemekből épül fel, ahol a cél-RNS-re vonatkoztatva 1-4 építőelem hiányzik.

Alkalmas átészterező és hidrolizáló katalizátorok a nukleázok is vagy nukleáz fragmentumok, bázikus polipeptidek, amidinés guanidin-származékok, oligo-aminok és diimidazolok. Ezek ugyanolyan hídképző csoportokon keresztül kötődhetnek az oligonukleotidhoz, mint a fémkomplexek.

A találmány egy további tárgyát olyan oligonukleotidok előállítására irányuló eljárás képezi, amelyekhez átészterező vagy hidrolizáló katalizátor kötődik, és az oligonukleotid belső szekvenciái részben nem-komplementerek egy természetben előforduló cél-RNS-sel, és az oligonukleotid természetes dezoxiribonukleotid építőelemekből vagy nem természetes szintetikus nukleotid építőelemekből épül fel. Az eljárás azzal jellemezhető, hogy az alapvázhoz kötve funkciós csoportot felmutató, átészterező vagy hidrolizáló katalizátort egy nukleotid építőelem funkciós csoportjával vagy egy nukleotid építőelem funkcionálisan módosított csoportjával kicseréljük.

Példák olyan funkciós csoportokra, amelyek adott esetben

hídképző csoporton keresztül kapcsolódnak az alapvázhoz, -OH, -SH, -NCO, -NCS, -CN, -O-CH₂-OH, -NHR, -C(O)OR, -C(O)SH, -C(0)-NHR, -C(O)Hal halogenidként F-, Cl- vagy Br-, -C(S)SR, C(S)NHR, -C(S)OR, -SO₃R, -SO₂NHR, -SO₂C1, -P(O)(OH)₂, -P (0) (OH)NHR, P(S)-(SH)₂, -P(S) (SH)NHR, -P(S) (0H)₂, -P (S) (OH) NHR, -P(O)(SH)₂,

-P (0) (SH) NHR, -P(O)(OH)H, -P(O)(NHR)H, -P(S)(SH)H, -P(S)(NHR)H,

-P(S)(OH)H, -P(0) (SH)H, ahol R H, Cj-Cg-alkil-, -C_zH_2z-NH₂,

-C_zH_2z-SH vagy -(C_zH_2zO)_y-H csoportokat jelent, és z 2 és 6 közötti szám, és y 1 és 20 közötti szám. Példák funkcionálisan módosított csoportokra a hidroxi-alkoxi- vagy amino-alkoxicsoportok, amelyek adott esetben linkeren -— például -P(0)OM-O-csoporton — keresztül kötődnek egy nukleotid építőelemhez. A funkciós csoport kötődhet közvetlenül vagy egy X₃ csoporton keresztül az alapvázhoz, és X_x csoport előnyösen C₁-C₁₂-alkilén-, C₁-C₁₂-alkenilén-, C₁-C₁₂-alkinilén-, C₅-C₈-cikloalkilén-, C₈-C₁₂-arilénvagy C₇-C₁₂-aralkilén-csoport.

A találmány szerinti eljárás oligonukleotid konjugátumok előállítására például oly módon végezhető, hogy egy adott esetben funkcionalizált oligonukleotidot oldószerben vagy oldószer keverékben feloldunk és azután egy funkciós csoportot hordozó átészterező vagy hidrolizáló katalizátort adunk hozzá és ezekután a reakciókeverék, adott esetben rázásra, reagálni fog. A képződött konjugátumot azután ehhez kapcsolódóan ismert módon tisztíthatjuk és kívánság szerint izolálhatjuk.

A reakció hőmérséklete lehet például 0-120 °C, előnyösen 2080 °C. Különösen előnyben részesítjük a szobahőmérsékleten végzett reakciót.

• ·

Ha észterező, átészterező vagy amidálási reakció összekapcsolásáról van szó, megfelelő karbonsav-csoporotokat előzőleg ismert módon aktiválunk, például karbodiimidekkel és N-hidroxiszukcinimiddel végzett reakcióval.

Alkalmas oldószerek például a víz és olyan poláros aprotikus oldószerek, amelyek előnyösen vízzel keverhetők. Példák ilyen oldószerekre az alkoholok (metanol, etanol, n- vagy i-propanol, butanol, etilénglikol, propilénglikol, etilénglikol-monometil-éter, dietilénglikol, dietilénglikol-monometil-éter), éter (dietil-éter, dibutil-éter, tetrahidrofurán, dioxán, etilénglikol-dimetil-éter, etilénglikol-dietil-éter, dietilénglikol-dietil-éter, trietilénglikol-dimetil-éter) , halogénezett szénhidrogének (metilén-klorid, kloroform, 1,2-diklór-etán) 1,1,1-triklór-etán, 1,1,2,2-tetraklór-etán, klór-benzol), karbonsavészterek és laktonok (ecetsav-etilészter, propionsav-metilészter, benzoesav-etilészter, 2-metoxi-etilacetát, γ-butirolakton, δ-valerolakton, pivalolakton), N-alkilezett karbonsav-amidok és laktámok (Ν,Ν-dimetil-formamid, N,N-dietil-formamid, N,N-dimetil-acetamid, tetrametil-karbamid, hexametil-foszforsav-triamid, N-metil-y-butirolaktám, N-metil-e-kaprolaktám, N-metil-pirrolidon), szulfoxidok (dimetil-szulfoxid, tetrametilén-szulfoxid), szulfonok (dimetil-szulfon, dietil-szulfon, trimetilén-szulfon, tetrametilén-szulfon), tercier aminok (trimetil-amin, trietliamin, N-metil-piperidin, N-metil-morfolin, piridin) , szubsztituált benzolok (klór-benzol, o-diklór-benzol, 1,2,4-triklór-benzol, nitro-benzol, toluol, xilol) és nitrilek (acetonitril, propionitril, benzonitril, fenil-acetonitril).

A reagáltatandó anyagokat célszerűen moláris arányokbar visszük be. A katalizátort vagy az oligonuklectidot azonban alkalmazna ί ok feleslegben is.

Tisztításhoz alkalmazhatjuk a szokásos módszereket, előnyösen például· dialízise, eleksroforéziss és kromaoográfiás eljárásoké, már. nagy nyomású folyadékkromatográfiát ÍHPLC), reverz fázisú HPLC-t, affinitás kromatográfiás, ioncserés kromatográfiás és géikromatográfiás.

Az alkalmazandó, adcfs esesben funkcionalizáit oligonukleosidot ismert módon előállíthatjuk kereskedelemben kapható, automatikus szinsesizáló segítségével. E szmsézishez nukleozidok ismertek, részben kereskedelemben kaphatók vagy analóg eljárásokkal eikészíehetők.

ló η Ί

Funkciós csoporsokkal rendelkező ásészterező vagy nidrolizákatalizátorok ismertek, részben megvásárolhatók vagy ismert, etve analóg eljárásokkal elkészíthetők.

A 111. általános képlet szerinsi alapvázzal rendelkező funkcionalizált kiindulási vegyületek újak. Megkaphatok azáltal, hogy az V. általános képlet egy terpiridinjét

9

9 oiriorn-cta.

ο ι r><

iei vagy a

VI. általános ké:

a a L· szí di n - dl ke a c r.n a 1

(VI) általános kéolet szenti aie i , _n/-,p kondenzáljuk, ahol R,, R₂, R₃, R₄, R₅, R-, R₇, Me, Y, n és m az előzőleg megadott jelentésekkel bírnak.

Az eljárást elvégezhetjük például égy, hogy az V., VI. és

VII. általános képlet szerinti vegyületeket egyenlő mennyiségben feloldjuk egy oldószerben és azután megemelt hőmérsékleten egymással összehozzuk. Célszerűen felhasználunk kondenzáctős katalizátorokat, például koncentrált ásványt savakat, különösen sósavat vagy savas ioncserélőt. Célszerű lehet vízkötő anyag hoziesKcioeiecjvzáadása vagy a reakció során keletkezett víznek a bői történő eltávolítása.

A reakció hőmérséklete lehet például 4C-22C

0 — 1 o 0 C .

Oldószerként előnyösen szerves, poláros aprotikus oldó.

használhatók. Ilve.n oldószereket említettünk az előzőekben.

naovreszt mi

;saz isterfeκ nos κ e o — e' , zunrotos csórón talmaz.ó veovüle . oz • · • // • · »· ♦· hoz [Polyhedron 2(24), 2531-2536 (1988)] hasonló módon történhet, ahol a funkciós csoportokat adott esetben védőcsoportokkal látjuk el .

Άζ V. és VI. általános képletű vegyületek funkciós csoportokkal vagy anélkül nagyrészt ismertek, vagy ismert illetve analóg eljárásokkal előállíthatok. Az olyan VI. általános képletű vegyületek, ahol R₄ H helyett, R₅ C₂-C₁₈-alkilén-X₅ helyett áll, és X₅ -C(O)-OR, -C(O)-NHR, -SO₂-R vagy -SO₂-NHR csoportot jelent, valamint R H vagy C₈-Cg-alki 1csoport, újak és a következő módon kaphatók meg: egy megfelelő 3-haiogén-piridin-l,5-dikarbonsavésztert palládium katalizátor mellett CH₂=CH-C₁-C₁₆-alkilén-karbonsav-észtér általános képletű alkénnel alkenilezünk, az alkéncsoportot hrdráljuk, például katalitikusán, ehhez kapcsolódóan hidráljuk a megfelelő 1,5-dihidroxi-metil-piridin-alkil-karbonsav-észterré, a hidroxi-meti1-csoportot aldehidcsoporttá oxidáljuk és adott esetben az észtercsoportot karbonsav-csoporttá hidrolizáljuk vagy az észtercsoportot karbonsavamiddá amidáljuk.

Az olyan VI. általános képletű vegyületek, ahol R₈ R vagy

C;-C₁₂-alki lesöpört helyett, R₅ C₂-C_i8-alkilén-X₅ helyett áll, és X₅ -C(O)-OR, -C(O)-NHR, -SO₂-R vagy -SO₂-NHR csoportot jelent, valamint R H vagy C^Cg-alkilcsoport, újak és a következő módon kaphatók meg: egy megfelelő, például acetillel védett 3-halogén1,5-dihidroxi-metil-piridint (a megfelelő 3,5-dikarbonsav-metilészterekből kapható redukcióval) palládium katalizátor mellett

CH₂ = CH-C--C_{: e}-alkilén-karbonsav-észfer altalános képletű alkénnel vesszük a h r d sok;

aoot t • ·

esetben megfelelő 3,5-piridin-aldehidaé, amelynek az aldehidcsoportjai például Grinard-reagenssel C₁-C₁₂-alkilezhetők, az észter-csoportot adott esetben karbonsav-csoporttá hídrólizál3uk vagy az észtercsoportot karbonsav-araiddá amiaáljuk és a másodlagos alkoholcsoportokat ketocsoportokká oxidáljuk.

A találmány szerinti oligonukleotidok kiválóan alkalmasak

RNS szekvenciák különleges, szekvencia-specifikus hasíoására, ahol katalitikus hatás kifejtésére való képességük révén csak meglepően alacsony mennyiségben kell bevinni azokat.

A találmánynak egy további tárgyát ribonukleinsavak nukleotidfoszfát hídjainak — fiziológiai körülmények között és szintetikus átészterező és/vagy hidrolizáló kaoalizátor hatására történő — hasítására szolgáló eljárás képezi, azzal jellemezve, hogy a (a) komplexbe visszük a cél-RNS-t egy olyan oligonukleotiddal, amelynek belső szekvenciája részben nem-komplementer a cél-RNS-sel, és amely átészterező és/vagy hidrolizáló katalizátorhoz kötődik, és (b) azután hagyjuk reagálni és hasadni.

A találmány szerinti eljárás in vivő az oligonukleotid beadásával, vagy in vitro egy cél-RNS és egy találmány szerint alkalmazandó oligonukleotid összehozásával végezhető.

Fiziológiai körülmények ismertek a szakember számára és felölelik például az eljárás véghezvitelét vizes közegben és 5-9, előnyösen 5-8 és különösen előnyösen 5-7,5 terjedő pH taruományban, ahol a vizes közeg további, inért alkotórészeket tartalmazhat, például alkálifém-sókat vagy alkáiiföldfém-sókat és különösen puffer-rendszereket.

Az eljárás elvégezhető például 0-100 'C, előnyösen 21-50 0 ··

Q és különösen előnyösen 30-40 C között.

A találmány szerinti eljárásnál a hasítás a foszfát-híd kötés átészterezésénél következik be egy 2' , 3' -ciklikus foszfátvégcsoporttal rendelkező hasítási darab, és egy további, 5' -hidroxi-elágazást tartalmazó hasítási darab létrejöttével. A ciklikus foszfát-csoport ehhez kapcsolódóan tovább hidrolizálhat.

A találmány szerinti oligonukleotidokat gyógyszerként használjuk fel. A találmány szerinti oligonukleotidok ráadásul nagy stabilitást mutatnak nukleázok okozta lebontással szemben. Különösen meglepő kiváló párképző sajátságuk komplementer RNS típusú nukleinsav szálakkal. Ezenfelül várakozáson felül magas sejtbe történő felvételt mutatnak. A találmány szerinti oligonukleotidok ezért különösen alkalmasak antiszenz-technológiához, amely nem-kívánatos fehérje termékek kifejeződésének gátlását jelenti a mRNS megfelelő komplementer nukleotid-szekvenciájához történő kötődés révén (266,099 számú európai szabadalmi leírás, 87/07300 és 89/08146 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés).

Bevethetők fertőzések és betegségek kezelésére, például bioaktív fehérjék kifejeződésének a nukleinsavak (például onkogének) szintjén történő blokkolása révén. A találmány szerint előállított oligonukleotid hasítási darabok alkalmasak diagnos zti kürtként és felhasználhatók gén-szondaként vírusfertőzések vagy genetikai eredetű betegségek kimutatására az egy- vagy kétszálú nukleinsavak szintjén történő szelektív kölcsönhatás („gén próbák ) segítségével.

A találmány egy további tárgyát a találmány szerint előállított oligonukleotidoknak - vírusfertőzések vagy genetikai erede• · • · ·· • · ·· ·· • · • · · · · · • · · tű betegségek kimutatására — diagnosztikumként történő felhasználása képezi.

A találmánynak egy másik tárgyát szintén a találmány szerinti o.l i gonukleotidoknak a felhasználása képezi, melegvérűek — beleértve az embert — betegségeinek kezelésére irányuló olyan terápiás eljárásban, ahol nukieotio-szekvenciákat inaktiválunk a testben. Körülbelül 10 kg testtömegű melegvérűeknek történő beadásnál az adagolás lehet például 0,01-1000 mg naponta. A beadás előnyösen gyógyszerészeti készítmény formájában történik parenterálisan (gyomor- és bélrendszeren kívül), például intravénásán (vénába adva) vagy intraperitoneálisan (hashártyán át). Parenterális beadáshoz elsősorban vízoldható hatóanyag vizes oldatai alkalmasak, például vízoldható, fiziológiailag jelentéktelen sóé, vagy olyan hatóanyagok vizes szuszpenziói, amelyek viszkozitást növelő anyagokat - mint például nátrium-karboximetil-cellulózt, szorbitot és/vagy dextránt és adott esetben stabiiizátc-rokat - tartalmaznak. A hatóanyag - adott esetben segédanyagokkal együtt - liofilizátum formájában is rendelkezésre állhat, és a beadás előtt megfelelő oldószerek hozzáadásával oldatba vihető.

A találmánynak egy további tárgyát olyan vizes készítmény és különösen vizes oldaton vagy szuszpenzión alapuló gyógyszerészeti preparátum képezi, amely egy találmány szerinti oligonukleotidot hatékony mennyiségben egymagában vagy más hatóanyagokkal együtt, gyógyszerészeti hordozóanyagként előnyösen jelentős mennyiségű vizez, és adott esetben segédanyagokat tartalmaz.

A gyógyszerészetileg hatékony találmány szerinti cligonukle·· otid parenterálisan beadható készítmények vagy infúziós oldatok formájában alkalmazható. Ilyen oldatok előnyösen izotóniás vizes oldatok vagy szuszpenziók, ahol ezek — például liofilizált preparátumoknál, amelyek a hatóanyagot egymagában vagy hordozóanyaggal , példáu1 mánnitta! egvüut tarráírnázzák - felhasználás előtt készíthetők el. A gyógyszerészeti készítmények lehetnek sterilizáltak és/vagy tartalmazhatnak segédanyagokat, például konzerváló, stabilizáló, térnálósító és/vagy emulgeáló anyagokat, oldhatóságot fokozókat, sókat az ozmózisnyomás szabályozására és/vagy fuffereket. A gyógyszerészéül készítményeket - amelyek kívánság szerint további, gyógyszerészetileg hatékony anyagokat, mint például antibiotikumokat tartalmazhatnak — ismert módon, például szokásos feloldási vagy liofilizálási eljárások segítségével állítjuk elő, és körülbelül 0,1-90%, különösen körülbelül 0,5-30%, például 1-5% hatóanyago(ka)t tartalmaznak. A találmány szerinti konjugátumok inhalálással vagy liposzómás beadási formában is alkalmazhatók.

A találmány szerinti konjugátumok felhasználást nyerhetnek diagnosztikai célra, vagy mint molekuláris biológiai segédanyag, szekvencia-specifikus endoribonukleázként.

Az ábrákon példaszerűen mutatjuk be egy találmány szerinti antiszenz-oligonukleotid konjug&tumból és cél-RNS molekulából álló hibrid szerkezetének különböző lehetőségeit, ahol a konjugátum szerkezetét mindenkor úgy választjuk meg, hogy a cél-RNSsel képzett hibridben legalább egy páratlan nukleotid kelethez2 Q

Az 1. ábra vázlatosan mutatja egy cél-RNS („5'-vei jelölt • · vonal) és egy antiszenz-oligonukleotid („3'-vei jelölt vonal) — amelyhez a találmány szerint egy komplex („Ln-nel jelölt vonal), mint átészterező illetve hidrolizáló katalizátor kötődődik (úgynevezett konjugátum) — hibridjét, ahol a komplex kötőhelye az antiszenz-oligonukleotid-szekvenc:ár belül található. A megadott számozás a cél-RNS nukleotid építőelemeire vonatkozik, ahol a számozás úgy halad, hogy az antiszenz-oligonukleotidnak a komplexet kötő nukleotidjával komplementer cél-RNS nukleotidot jelöljük „0-val. A további számozás növekvő sorrendben (+1, +2 stb.) 3' -irányban illetve csökkenő sorrendben (-1, -2 stb.) 5' irányban halad a cél-RNS-en. Egy, az antiszenz-oligonukleotid szerkezete alapján a cél-R.NS-en fellépő páratlan nukleotidot (lehet több páratlan nukleotid is) kitüremkedésként ábrázolunk és a jelen esetben ez a 0. helyzetből kiindulva 3'-irányban (itt a +2. helyzetben) található a cél-RNS-en.

A 2. ábra vázlatosan mutatja egy cél-RNS és egy találmány szerinti antiszenz-oligonukleotid-konjugátum hibridjét, ahol egy páratlan nukleotid a 0. helyzetből kiindulva 5' -irányban (ebben az esetben a -2. helyzetben) található a cél-RNS-en. Egyébként az 1. ábrához megadott megfelelő definíciók érvényesek.

A 3. ábra vázlatosan mutatja egy cél-RNS és egy találmány szerinti antiszenz-oligonukleotid-konjugátum hibridjét, amelynél a komplex kötőhelye az antiszenz-oligonukleotid végén található, és ahol egy páratlan nukleotid a 0. hely: jtből kiindulva 5' irányban (ebben az esetben a -3. helyzetben) található a célRNS-en. Egyék ként az 1. ábrához megadott megfelelő definíciók érvényesek.

A következő példák világossá teszik a találmányt -

• « terplridm-iantanid-komplexek kiindulási vegyuM előállítása

Al, példa: Terpiridin-bisz-hidrazino-vegyületek előállítása

a) o-acetil-2-bróm-pirrdin (100 mM) 200 mi metancdos oldatához jégfürdcber. történő hűtés közben 40 ml 2 M vizes kálium-hidroxid oldatot adunk. A megfelelően szubsztituált banzaldehid (400 mM) hozzáadása után eltávolítjuk a hűtőfürdőt és a keveréket 4 órán át szobahőmérsékleten tovább keverjük. A terméket leszűrjük, háromszor mossuk vízzel és kétszer hideg metanollal és erős vákuumban szárítjuk.

Ezen előírás szerint állítjuk elő az a/1. (Rí.: fe.nil-4-OCH₃;

mM) és vei le^-

b) Az a,β-telítetlen karbonil-vegyületet a)-bői (30 mM), (2-brőm-piridil-karbonil-metil)-piridin-jodidot (12,1 g, 30 és ammónium-acetátot (13,9 g, 180 mM) egy lombikba helyezőül

100 ml ecetsavval vegyítjük. A keveréket visszafolyó hőt felszerelve forraljuk. 2 óra után szobahőmérsékletre hűtjük, szűrj ok és az így kapott terméket erős vákuumban regszárítjuk • · • · ·

Ξ Ζ θ Ω G

Mt: 497,1)

Titán(absz . ) szc tium-alumín

Ο nercig

Hozzáadjuk lőírás szerint állítjuk elő és b/2. (R : fenil-4-NO₂; Mt:

tetraklorid oldatához (30 mM) üahőmérsékleten argon átmos;

íum-hidridet (22 mM) adagolu szobahőmérsékleten keverjük, a b/2. vegyületet (10 mik) és a b/1. (Rí: fenil-4-OCH₃

512) vegyületeket.

ml tetrahidrczuránba zférában részletekben li nk. A kapott szuszpenzió maja 0 ^-ra lennejuk a szuszpenziót 30 perei szobahőmérsékleten keverjük. 0 C-on, 50 ml víz cseppenként tör tén.ő óvatos hozzáadása után 25 ml 25%-os ammónium-hidroxid clda tet adunk hozzá. A keveréket 150 mi kloroformmal elegyítjük é celiten szűrjük. A vizes fázist elválasztjuk és háromszor extra háljuk kloroformmal. Minden szerves fázist egyesítünk, egvsze mossuk vízzel, nátrium-szulfáton szárítjuk és koncentráljuk.

Ezen előírás szerint állítjuk elő a b/3. (íb: fenil-4-NH₂

Mt: 432,5) vegyületet.

A megfelelő dibrőm-terpiridm vegyületet b)-bői (10 mM) 3 ml metil-hidrazinban oldjuk és 17 órán át visszafolyó hűtőve felszerelve forraljuk. Szobahőmérsékletre történő lehűtés utá beoároljuk és a maradékot 20 ml metanolban zelvesszun. A termé két leszűrjük és erős vákuumban megszárítjuk.

Ezen előírás szerint állítjuk elő a o/l. (b: fenil-4-OCE₃ • · • */'· · · * υ · · ·

Μΐ /2. (Ft-, : f enil-4-NH_? ; Mt :

igyületeket.

“ih;

szusz— tendáljuk és jeges fürdőben történő hűtés közben 20 perc bor-tribrcmid (50 mM) 1 mólos metiién-kioridos oldatával elegyítjük. k szuszpenziót 5 napig visszafolyó hűtővel felszerelve forraljuk. Szobahőmérsékletre történő lehűtés után 300 ml jeges vízre öntjük, 200 ml 2 M vizes sósavval megsavanyítjuk. Éterrel történő kétszeri extrakció után a vizes fázist 10%-os vizes nátrium-karbonát oldattal pH 9,0-re állítjuk be és 30 percig keverjük. A kicsapódó terméket c/3. (R_:: fenrl-4-ΟΗ; Mt: 413,5) leszűrjük és erős vákuumban megszárítjuk.

(c)

A2, példa: 3- [4'- (2' ,6'-diformil-piridin)]-propionsav előállítása

a) 3,5 g 4-bróm-piridin-2,6-karbonsav-dimetilésztert, 390 mg tritol11-foszfint, 9,3 ml akrilsav-tercier-butilésztert, 7,1 mi trietil-amrnt, 30 ml dimetil-formamidot és 237 mg palládium-acetátot keverünk össze és 110 °C-ra melegítjük. 90 perc után a reakciókeveréket szobahőmérsékletre hűtjük le, éter-'metilén-klorid uk es avmeuiuv-Klórra/v;

;rves ráz is' 'ZUZd-S pár l· en : ez mérví z f ák é s erí n ve kuuvhen ve «·

C Η Ν számított 59,81 5,96 4,36 kapott 59,8 6,0 4,1

250 mg palládiumot aktív szénen (5%) és a fent kapott vegyület 2,5 g-ját 250 ml metanolban oldunk és egy éjszakán át szobahőmérsékleten hidrogén atmoszférában hidráljuk. A rerméket Hyflo-n szűrjük, a szűrletet rotációs bepárlón betöményírjük és szobahőmérsékleten erős vákuumban megszárítjuk.

C

H

N

számított	59,43	6, 55	4,33
kapott	59,3	6, 6	4,3

A fent Kapott vegyület 5,0 g-ját 50 ml metanolban és 50 ml tetrahidrofuránban oldjuk. 0 ^CC-ra történő lehűtés után 1,1 g NaBH^-et adunk hozzá. 50 perc elteltével további 1,1 g NaBH₄-et adunk hozzá és 130 perc múlva további 0,5 g NaBH/j-et adunk hozzá. Összesen 165 perc után szobahőmérsékletre melegítjük fel. Újra lehűtjük 0 °C-ra. 3,5 óra múlva mégegyszer 1,1 g NaBH₄-et adunk hozzá. 6 óra elteltével 60 ml térfogatra pároljuk be. Ezután telített ammónium-klorid oldatot csepegtetünk hozzá, négyszer extraháljuk metilén-kloriddal, a szerves fázisokat egyszer mossuk ammónium-kíorid oldattal, nátrium-szulfáton szárítjuk, leszűrjük és bepároljuk.

	C	H	K
számítót!	6 2, 90	7, 92	5,24
kapott	63,0	7,9	1 ?

kaocsolc :e.er:-aio nk hozza

A fent kapóit vegyület 19,

ICL

0 ml dioxánban oldjuk.

· .’· .·· :>···:· :··♦ ciókeveréket 100 °C-ra melegítjük fel és keverjük, 45 perc múlva szobahőmérsékletre hűtjük le. További két órás keverés után a

reakciókeveréket	szűrjük és	rotációs	bepárlón betöményítjük.
	C	H	N
számított	63, 87	6, 51	5,32
kapott	64,14	6, 53	5,43
A fent kapó	tt vegyület	4,7 g-já	t 17,2 ml jéghideg tnfluor
ecetsavhoz adjuk	. Az összeöntés után	a keveréket 0 fc-on betörné
n y 11 j ü k .
	C	H	N
számított	57, 97	4, 38	6,76
kapott	57,55	4,21	6,61
b) 5 g 4-bróm-piridir	ι-2,6-karbonsav-dimetilésztert 175 m

tetrahidrofuránban oldunk szobahőmérsékleten. Ehhez kapcsolódóan 75 ml metanolt adunk hozzá. 0 °C-ra hűtjük, 45 perc alatt részletekben 3,44 g nátrium-bórhidridet adunk hozzá és hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. 1 óra múlva 30 ml acetont csepegtetünk hozzá 10 percen belül. A reakciókeveréket 1 óra hosszat visszafolyó hűtővel felszerelve melegítjük, majd a reakciókeveréket rotációs bepárlón szárazra pároljuk. A maradékot szobahőmérsékleten 50 ml piridinbe keverjük bele. Ehhez 0,1 g 4-dimetil-ami0 no-piriaint adunk, majd 0 C-ra lehűtjük. 30 percen belül 34,4 ml ecetsavanhidridet csepegtetünk hozzá. A szuszpenziót hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni. 50 ml tetrahidrofuránt adunk hozzá. Egy éjszakán ét szobahőmérsékleten történő keverés után a reakciókeveréket szűrjük és kétszer 50-50 ml tetrahidrofuránnal mossuk. A szűrletet rotációs bepárlón koncentráljuk. Kristályo36 ·· ·-·. .’· ,·· .·· ϊ :··. ··· i..

··· ·· .. · .· · · sítással 4-bróm-2,6-di(acetoxi-metil)-piridint kapunk.

(Olvadáspont: 66-69 C.)

0,982 g 4-bróm-2,6-di(acetoxi-metil)-piridint, 1,5 g 3-(tributil-sztannil)-akrilsav-etilésztert és 176 mg palládium-tetrakisz-(trifenil-foszfin)-t oldunk 25 mi dioxánban és 90 °C-ra melegítjük fel. 90 perc múlva a reakciókeveréket lehűtjük. A szilárd terméket elválasztjuk és hexán/ecetsav-észter eleggyel átkristályosítjuk. Mt : 321 (M )

A fent kapott vegyület 2,74 g-ját és 70 mg Wilkinson-katalizátort 150 ml benzolban oldunk. 12,2 ml trietil-szilánt adunk hozzá és az oldatot visszafolyó hűtővel felszerelve forraljuk. 270 mg katalizátor trietil-szilánt feleslegben adagolunk egy órán belül részletekben. A terméket kromatográfiásan tisztítjuk.

Mt: 323.

267 mg nátriumot oldunk 50 ml etanolban. Ennek az oldatnak

7,2 ml-ét a fent kapott vegyület 1,845 g-jának 35 ml etanolban történt feloldásával kapott oldathoz adjuk hozzá. 2,5 óra szobahőmérsékleten történő keverés után a reakciókeveréket Kieselgélen szűrjük és a szűrletet szárazra pároljuk. A terméket egy éjszakán át erős vákuumban szárítjuk.

NMR(CDC1₃)Ő7, 0(2H, s) , 4, 7 (4H, s) , 4, 1 (2H, q) , 2, 9 (2H, t) , 1,2 (3H, t)

A fent kapott vegyület 1,27 g-ját 30 ml dioxánban oldjuk.

Ehhez adunk 714 mg szelén-dioxidot. A teakorókeveréket felmelegítjük és 2 óra múlva vattán szűrjük. A szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot ecetsav-észter/metiién-klorrd (51) elegyben felvesszük es Kreselgélen szűrjük.

Έ NME (CDCl δ!0, 1 (2H, s ) , 8, 0 (2H, s ) , 4 , 1 (2H, q) , 3 , 1 (2H, t) , 2 , 7 (2H, t) , • ·

1,2(3Η,ο)

Q ml éter és 350 mg fent kapott vegyület oldatához 0 C-on egy előzőleg elkészített oldat (0,949 g réz-bromid, dimetilszolfid 10 ml éterben 0 °C-ra hűtve és 5,9 ml metil-lítiumot hozzáadva) 13 ml-ét adjuk. 5,5 óra szobahőmérsékleten történő keverés után 0 °C-ra hűtjük. Hozzáadunk 2 ml jégecetet 8 ml éterben és 8 ml etánuiolt. Egy éjszakán át szobahőmérsékleten történő keverés után 60 ml vizet adunk hozzá és metilén-kloriddal négyszer kirázzuk. A szerves fázist nátrium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük, rotációs bepárlón betöményítjük és kromatográfiásan tisztítjuk. Mt: 266 (M+H) o

4,5 ml metilén-klorid és oxalil-klorid oldatához -78 C-on

0,5 ml DMSO-t adunk. 15 perc után ezt az oldatot a fent kapott vegyület 193 mg-ját 4 ml metilén-kloridban tartalmazó oldathoz adjuk. Két óra -78 C-on tartás után 1,5 ml trietil-amint adunk o

hozzá. 30 perces 0 C-on történő keverés után 15 ml vizet adunk hozzá és dietil-éterrel négyszer kirázzuk. A szerves fázist nátrium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük, rotációs bepárlón betöményítjük és kromatográfiásan tisztítjuk.

számított kapott

63, 87

3,96

6,51

6,55

5, 32

5,4 5

A fent kapott vegyület 0,464 qml 4 M sósavat együtt u0 C-ra melegítünk. 90 perc elteltével a reakciókeverékei szobahőmérsékletre hűfjük vissza és jeges vízzel hígítjuk. Kristályos terméket kanunk.

• · · • · számított

61,27

5,57

5,95 kapott

61,2

5,5

B) A terpiridin-lantanid-komplexek előállítása

Bl. példa:

a) Az Al· c) példából a megfelelő terpiridin-bisz-hidrazinovegyület 1 mM-ját argon áramban 60 ml abszolút metanolban veszszük fel, lantanid (111)-acetáttal (1 mii) elegyítjük és 10 percig visszafolyó hűtővel felszerelve felforraljuk. Ehhez az oldathoz egymás után a megfelelő 2,6-dikarbonil-vegyűlet 1,2 mM-ját és 5 mM koncentrált vizes sósavat adunk. 2 napig forraljuk. Szobahőmérsékletre történő lehűtés után a terméket leszűrjük és erős vákuumban szárítjuk.

Ezen leírás szerint állítjuk elő az 1. táblázatban az 1.1től 1.28-ig terjedő vegyületeket.

b) Az Al. c) példából a megfelelő terpiridin-bisz-hidrazinovegyület 1 mM-ját argon áramban 60 ml abszolút metanolban veszszük fel, lantanid (111)-klorid (1 mM) elegyítjük és 10 percig visszafolyó hűtővel felszerelve felforraljuk. Ehhez az oldathoz egymás után adjuk az A2. a) példában kapott vegyület 1,2 mM-ját. Egy éjszakán át forraljuk. Szobahőmérsékletre történő lehűtés után az oldószert lehúzzuk és a terméket dimetil-szulfoxidból és toiuolbói történő átknstályosítással kapjuk.

Ezen leírás szerint állítjuk elő az 1. táblázatban tői 1.32-ig terjedő vegyületeket.

az 1.2939 tahu

R.

Rs


/gyület	Lr/	Rí	υ	R;	Μ Α ? τ Q ro ζ* ~ Γ Μ — υ
					számított/ kap-
1 . 1	La	?h-H	H	Η	706/705
1.2	La	Ph-OH	H	Η	722,4/722,3
Ί j. .	La	?h-OCH₃	H	Η	736,4/735,6
1 . 4	La	Ph-NH₂	u	Η
1 . 5	La	Ph-H	CH₃	Η	734,4/734,4
1 . 6	La	Ph-OH	ch₃	Η	/50,1/ / υ 0,
1 . 7	La	?h-OCH₃	ch₃	Η	764,5/755,0
1 . 3	Í-.G	Ph-NK₂	ch₃	Η	7 4 9,5/74 9,5
1 . 9	T? ? i	?h-H	Η	Η	719,4/718,9
1 .10	Eu	Ph-OH	Η	Η	/ 3 υ _f ο
1.11	Ευ	?h-OCH-_;	Η	Η	7 4 9, 5 174 9 ,3
__ , J, F.	υ υ	Ph-NHR	Η	Η	/ 0 4 , 0 / /01,0

CHR • · · • ·

1 . 15	Eu	Ph-OCH₃	ch₃	u	777 ,	5/777,	3
1.16	Eu	Ph-NH₂	ch₃	H	762,	5/762,	c
1 . 17	Ce	Ph-NH₂	ch₃	H	750,	7/749,	3
1 . 18	Pr	Ph-NH₂	ch₃	H	751,	4/750,	9
1.19	Nd	Ph-NH₂	ch₃	H	754 ,	8/752,	7
1.20	Gd	Ph-NH₂	ch₃	H	767,	8/766,	3
1.21	Tb	Ph-NH₂	ch₃	H	769,	5/768,	7
1.22	Dy	Ph-NH₂	ch₃	H	773,	1/773,	2
1 . 23	Ho	Ph-NH₂	ch₃	H	775,	5/774,	ú
1 . 24	Er	Ph-NH₂	ch₃	H	777,	8/776,	Q
1.25	Tm	Ph-NH₂	ch₃	H	77 9,	5/778,	8
1.26	Yb	Ph-NH₂	ch₃	H	783,	6/783,	0
1 . 27	Lu	Ph-NH₂	ch₃	H	7 8 5,	5/784,	7
1 .28	Y	Ph-NH₂	ch₃	H	699,	4/698,	1
1 .29	La	H	H	ch₂	CH₂COOH
1.30	Eu	H	H	ch₂	ch₂cooh
1 . 31	La	Ph-H	H	<---2	CPbCOOH		k
1 . 32	Eu	Ph-H	H	C H ₂	CHoCOOH		X *
Ph: 4-fenil	én
★			c	H	N		Cl
számított	+2DMSO)		45, 81	4,16	11,55 1	0,9 6
kapott			45,3	4,3	11,8		0, 6
X ★			C	H	N		Cl
számított	+2DMSO+4H₂O)	42,11	4 , r 8	10,62 1	0, 07
kapott			4 2,2	r Γ ί-, - r ~~	10, 6		Ϊ f

• · • ··· ··· ·

Β2. példa: Izotiocianát-származékok előállítása

4,4 mM nátrium-dikarbonátből és 3,5 mM tiofoszgénből 4 ml kloroformban készült szuszpenzióhoz az 1. táblázat megfelelő komplexének oldatát adjuk. A keveréket szobahőmérsékleten 2,5 órán át erőteljesen keverjük. A kloroformcs fázist elválasztjuk és egyszer mossuk vízzel. Minden vizes fázist egyesítünk és megszárít₃uk. A.z így kapott, a 2. táblázatban 2.1-től 2.15-ig jelölt termékeket további tisztítás nélkül tovább felhasználjuk.

2. táblázat

Vegyület	Ln ^J	^R1	^R4	^R5	Móltömeg [ M-Cl] számított/kapott
2.1	Ce	Ph-NCS	ch₃	H	792,7/792,7
2 . 2	Pr	Ph-NCS	CPE	H	793,5/791,2
2.3	Gd	Ph-NCS	CH₃	H	809,9/807,4
2.4	Tb	Ph-NCS	ch₃	H	811,5/811,7
2.5	Dy	Ph-NCS	ch₃	H	815,1/815,9
2.6	Ho	Ph-NCS	ch₃	H	817,5/816,2
2.7	Er	Ph-NCS	ch₃	H	819,9/819,0
2.8	Tm	Ph-NCS	ch₃	p	821,5/820,1
2 . 9	Yb	Ph-NCS	che	H	825,6/826,4
2 .10	Eu	Ph-NCS	ch₃	H	827,6/825,5
2.11	á	Ph-NCS	CH'.·		741,5/740,2
2.12	La	Ph-NCS	CH ς	H	791,5/792,1

Eu oh j

804,6/804,7

2.13

2.14

Z 'V

Eu

Ph-NCS

C) Amino-oligonukleotidck előállítása

Az ellenőrzött pórusé üveg („oontrcied poré glass = G?G) szilárd fázisából körülbelül 30 mg-ct mérünk be egy standard, biológiai rendszerekhez alkalmazott edénybe (Applied 3iosystem) 1,5 pM szintézishez. Az 1. képletű CPG szilárd fázis hordozza a szintetizálandó· ammo-oligonukleotid védett 3' -építőelemét (a oéldában dC).

CPG • · · · ·· · · · ··· ··· • · · · · · · ,z oligomerizáláshoz a 6., 7., 8. és 3. képletű foszfor-amidit •együleteket visszük be.

O

p—och₂ch₂cn N(CH(CH₃)₂)₂

/ p—OCH₂CH₂CN

N(CH(Cf-y₂), • · · • · · 9 '9 • · · · · · • · · · · 9 9

N(CH(CH₃)₂)₂

P — OCH-CH,CN I

N(CH(CH₃)₂)₂ • · · • ·

^ff

A szintézis ciklusokat az Applied Biosvstem 394-es számú szintézis automatájával (Svntheseautomat 394) végezzük az

Applied Biosvstem cég standard leírásának (User Manual Version

2.0 (1992) 1.0 pMol Cyclus, Appen. 1-41) megfelelően, a következő változtatással: a 6., 7., 8. és 9. dezoxi-sorba tartozó foszfor-amidit kapcsolási ideje 2 percet tesz ki, a 10. és 11.

foszíor-amidité 10 percet tesz kr, a 12. képletűé 5 percig és a :é 40 percig tart; a 13. képletű fcszfor-amiditet 10013. kéol szoros .eslecmen visszük be.

;vaooi, KeresKeoe_emben ki

0,1 M fos • · tetrazol/aoetonitril: 4%, 96%, tercier-buti 1-fenoxi-ecetsavanhidrid/piridin/tetrahidrofurán:

10%, 10%, 80%,

N-meuil-imrdazol/tetrahidrofurán: 16%, 84%, urrklór-ecetsav/dimetil-klór-metán: 2%, 93%,

V YΟ p ο η z o z υ ι, / a -ε szintetizáljuk:

(8

, ahol T timm

5' -GTA GAC TGG helyet

CGA GA

Opm

• · · (631)

3’-GA TCG GCT GAC GGC TAG AGC

Terein din-lan tanid-oliconukle konnoátumok előállítása

Dl. példa: Olyan konjugátumok előállítása, amelyeknél az oligonukleotid a lantanid-komplex terpiridin részéhez kötődik

a) A megfelelő oligonukleotid 0,2 mg-ját 150 ul ptridin/viz/ /trietil-amin (30:15:1) elegyében oldjuk. A 2. táblázat megfeleegvs

20%

6,0, cen őszi .zoftocianát-kcmplexe 1 mg-jának hozzáadása urán a keveréket :án ár szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A reakciókevereket zer 0,1 M kálium-klond oldatra! és háromszor vízzel szemben izáljuk. A terméket reverz fázisú H?LC-n (gradiens: 0-30% omtril 0,05 M trietil-ammónium-acetátban, 90 percig) kétől nukleozil-C₁₈-oszlopra, vagy ioncserélő H?LC-n (gradiens: 1 M kálium-klorid oldat és 80% 20 mM kálium-foszfát oldat pH amely 20% acetonitrilt tartalmaz, 10 percig; azután 60 perbeiül 80% kálium-kiorid oldat) keresztül 60 °C-on 3VDI.4000Aopra (5 pm) visszük fel, amely azután a 3. táblázat 3.1-től

-rg és 3.18-tól 3.21-rg terjedő tiszta konjugátumait eredméD2. példa: Olyan konjugátumok előállítása, amelyeknél az oligonukleotid a lantanid-komplex piridin részéhez kötődik

Az 1.29-től 1.32-tg terjedő megfelelő karbonsav-származék 3 gM-jának 200 ul dtmetil-szulfcxidos oldatát 3,3 uM dicikiohexil-karbodrtmiddei és 3,3 uh N-hrdrcxi-szukcinimrddel elegyítjük és • · ·

-diizopropil-etil-amm hozzáadása után a megfelelő amino-oligo nukleotid 0,2 mg-ját adjuk hozzá. Négy nap szobahőmérséklete tartás után kétszer 50 mM trietil-ammór.ium-hidrogén-karbor.átta és kétszer vízzel szemben dializáljuk. P. reverz fázisú H?LC-ve történő tisztítás (lásd a)-t) a 3. táblázat 3.14-3.17, 3.19

3.20 és 3.22-3.25 vegyületeit eredményezi.

Vegy	ölet	, 3 + !	^4	Rg	Rg		MM		RZ
	1	La	ch₃	Ph-691	H	7 0	82/7093
3 .	p	Eu	fi -Ί	Ph-691	H	0 >>	95/7090
3 .	3	C Θ	ch₃	Ph-691	H			2	7,	/1
3 .	4	?r		Ph-691	H			4	2,	5*
3 .	G	Cg	ch₃	Ph-691	H			o	7 ,	0
3 .	6	ib	CH,	Ph-6 91	H			2	t
3 .	7	Dv	ch₃	p b - 5 3 p	H			-	^! l	ö
3 .	6	Ho		? G ~ 6 9 3	H			3	t	-
₃	9	-		pu-A 93	u			0	0	0
			-						¹

* ·« · · • · ·

3.10	Tm	ch₃	Ph-691	H	27,5
3 . 11	Yb	ch₃	Ph-691	H		28,8
3 . 12	Lu	ch.	Ph-691	H		27, 9
3 . 13	Y	ch₃	Ph-691	H		27,4
3.14	Eu	H	fenil-	A-691	7064/7086
3.15	La	H	fenil-	A- 691	7051/7072
3.16	Eu	H	H	A-691
3.17	La	H	H	A-691
3 . 18	Eu	ch₃	Ph-821	H	9843/9853
3.19	La	H	feni 1-	A-821	9800/9800
3.20	Eu	H	fenil-	A-821	9813/9839
3.21	Eu	ch₃	Ph-823	H	9842/9861
3.22	La	H	fenil-	A-82 3		3 5,6*
3.23	Eu	H	fenil-	A-823	9811/9826
3.24	La	H	fenil-	A-940	9757/9829
3.25	Eu	H	fenil-	A-940	9770/9794
MM: szárnitott/kapott móltömeg
RZ: ioncserél	ő HPLC retenciós idő	(perc)
Ph-691 :	-feni	1-N(H) C (S) -	oligó 691
Ph-821 :	-feni	1-N(H)C (S) -	oligó 821
Ph-323 :	-feni	1-N(H)C(S)-	oligó 823
A-691 :	-ch₂ck	₂C (0)-oligó	691
A-821 :	-ch₂ce	₂C (0) -oligó	821
A-823 :	-ck₂ch	₂C (0) -oligó	823
A-94 0 :	-ch₂ce	₂C (Op -oligó	940
* reverz	fázis	ú HPLC retenciós idő	(perc)

• * » a « »5 * ·♦

RN lítái kén v okokból

visszük be.

OCH₃ ó O-Si(CH₃)₂-C(CH₃)₃ /

P — OCH-CH-CN

I

Ν(ΟΗ(ΟΗ3)₂)₂

• ·

N(CH(CH₃)₃)₂ (4)

OCH₃ o 0-Si(CHj₂-C(CHj₃ (5)

P —OCH.CH.CN I

N(CH(CH₃)₂)₂

Ο

och₃ ο ρ—och_?ch₂cn I

N(CH(CH₃)₂)₂

p—och₇ch₂cn 1

N(CH(CPy )₂

A szintézis ciklusokat az Applied Biosystem 394-es számú szintézis automatájával (Syntheseautomat 394) végezzük az Applied Biosystem cég standard leírásának (User Manual Version 2.0 (1992) 1.0 pMoi Cvclus, Appen. 1-41) megtelelően, a következő változtatással: a ribo-sorba tartozó bősttor-amidit kapcsolási ideje 10 percet tesz ki.

A további, kereskedelemben kapható reagenseket alkalmazzuk:

teszt;

te seprőnél' tercier-butil-fenoxi-ecetsavanhidrid/piridin/tetrahidrofurán:

10%, 10%, 80%,

N-metil-imrdazol/tetrahidrofurán: 16%, 84%, triklór-ecetsav/dimetil-klór-metán: 2%, 98%, j ód/víz/pirrdin/tetrahidrofurán: 3%, 2%, 20%, 75%

A következő szubsztrát-RNS-eket szintetizáljuk: A címben szereplő RNS-E1

b) Leválás a szilárd fázisról (CPG) és a bázis védelmének megszüntetése: a szilárd fázist (1,5 pM szintézis) 800 pl ammóniával telített etanollal elegyítjük és szobahőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. Az ammóniával telített etanolt 1 rész etanolból és 3 rész 33%-os ammónium-hidroxidból állítjuk elő. Az inkubáció után az ammóniával telített etanolos oldatot aekantáljuk, a CPG-t ammóniás etanollal lemossuk és az egyesített oldac) ^A tercier-butil-dimetil-szilil-védőcsoport védelmének megszüntetése: A liofilizált próbát 800 pl 1 M tetrabutil-ammónium-fluorid/tetrahidrofurán (TBAF/THF) oldattal elegyítjük. A próbát 30 percig intenzíven elkeverjük. Az inkubációt 24 órán keresztül szobahőmérsékleten, fény kizárásával végezzük. Az RNSt 50 mM trietrl-amin-hidrogén-karbonát (TAHC) oldattal pH 7,0 (1

Q + 1) keverjük és közvetlenül 4 C-on dializáljuk. (A víz „Nanopure minőségű.)

d) Dialízis: 3-szor dializálunk 7,5 mM TAHC oldattal pH 7,0 szemben. (A.z oldatot „Nanopure minőségű vízzel állítjuk elő, szén-droxiddai pH 7,0-re állítjuk be és 4 C-ra előhűtjük.) A próbát liofilizáljtk és dieti1-plrokarbonattal kezelt [ Sambrook, • · • ·

Fritsch, Maniatis: Molecular Cloning, A Laboratory Manual,

Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] és autoklávozott vízben (DEPC-H₂O) vesszük fel. Egy részét 260 nm-en koncentráció meghatározásnak vetjük alá. A további RNS-sel végzete műveletekben mindig RNáz-tól és idegen ionoktól mentesen dolgozunk.

e) A szubsztrát RNS 5'végének markerezése [ P] γ-ΑΤΡ-vel:

Enzimes kináz reakcióhoz 100 pM RNS-t a fenti szintézis leírásból 20 pl térfogatban 37 °C-on, 20 percig inkubálunk. A reakcióelegy 0,5 pl T4-polinukleotid-kinázt (Promega, 10 egység/pl), 2 pl kináz puffért (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM 1,4ditio-D,L-treitol, 0,1 mM spermidm) és 0,5 pl ³²[ P] γ-ΑΤΡ-t (Amersham, >1000 Ci/mM, 10 pCi/pl) tartalmaz . Ehhez kapcsolódóan

138 pl Tris-HCl/EDTA (10 mM/Ι mM, pH 7,5) keverékét, 2 pl glikogént (35 mg/ml) és 40 pl ammónium-acetátot (10 mM) adunk hozzá.

Q

600 pl etanol hozzáadása után a próbát 30 percig -20 C-on hűtjuk, majd 20 percig 4 °C-on centrifugáljuk. A pelletet liofilizáljuk, 15 pl felvevő pufferrel (0,025% brómfenolkék, 0,025% xilol cylanol 1:1 keverékben 80% formamiddal és 7 M karbamiddal, 20 mM citromsav, 1 mM EDTA) egészítjük ki, 1 percig 95 C-on denaturáljuk, azonnal jégre tesszük és a gelelektroforézises elválasztáshoz egy 1, 0 cm x 1 mm zsebre visszük fel. A gélelektroforézises elválasztást egy 40 perces 55 watt-nál végzett előfutam után 2,5 órán át 55 watt mellett végezzük el.

f) A kmázzal kezelt szubsztrát RNS tisztítása és izolálása:

A kináz reakció gélelektroforézises felbontásához 12%-os poliaknlamid gélt (1 mm x 30 cm x 40 cm) készítünk elő. A polimeri• · · • ·· · · · · * • · · · · · · zációs reakciót 170 ml-ben végezzük. Itt 51 ml akrilamid oldatot (40% akrilamid/bisz-akrilamid 10:1), 17 ml TBE-puffert (0,89 M

Tris-(hidroxi-metil)-amino-metán, 0,89 M bórsav, 0,02 M EDTA) és

71,4 g karbamidot megfelelő mennyiségű vízzel keverünk össze. A polimer!zációt 170 pl ammónium-peroxi-diszulfát oldattal (25% tömeg/térfogat) és 170 pl TEMED-del (Ν,Ν,Ν' ,Ν' -tetrametil-etilén-diamm) indítjuk. A gél 1 óra múlva felhasználható. Futtató pufferként 10-szeresére hígított TBE-puffert alkalmazunk.

A gélelektroforézises felbontás után a kinázzal kezelt RNS-t ráfektetett röntgen film segítségével mutatjuk ki és kivágjuk a gélből. Egy elektroelúciós készülékben (Schleicher és Schuell) az RNS a géldarabból 100 V feszültségnél eluál (3,3 V/cm) . Elúciós pufferként 10-szeresére hígított TBE-puffert alkalmazunk.

Az izolált RNS-t 360 pl eluátumban 40 pl nátrium-acetáttal (3 M, o

pH 5,2) és 1 ml etanollal elegyítjük. A próbát 20 percig -20 Con hűtjük, majd 20 percig 4 °C-on centrifugáljuk. A pelletet liofilizáljuk, 30 pl vízben felvesszük. Az oldatot a Czerenkow-féle előírás szerint szcintillációs számlálóban megmérjük, és 12000 cpm/pl-re állítjuk be.

E2. példa:

Az El. példában leírtak szerint járunk el, és a következő szekvenciával rendelkező „RNS-E2 cél-RNS-t állítjuk elő:

5'd(CTA GCC GAC TG) r (CCC AUC UCA AG)d(CCA GTC TAC) .

E3-E31. példák:

Az El példához hasonlóan további E3-E30. cél-RNS molekulákat, valamint az E31 molekulát állítjuk elő, amelyeknek a szerkezetét az F)-ben, a 4., 6. és 8. táblázatokban mutatjuk be.

• · ·

F) Felhasználási példák (RNS hasítás)

Különböző, találmány szerinti antiszenz-oligonukleotid-konjugátum hasító tulajdonságát vizsgáljuk különböző cél-RNS-ekkel szemben. A komplexnek a mindenkori antiszenz-oligonukleotidszekvenciához való kötődése szerinti, illetve a hibridben a célRNS-ből és antiszenz-oligonukleotid-konjugátumból keletkező, pár nélküli nukleotidok (mismatch) helyzete szerinti vonatkozásban az 1., 2. és 3. ábrákon bemutatott esetekben különböznek.

Fi. példa:

Itt egy találmány szerinti antis zenz-oligonukleotid-konjugátum — ahogyan azt a 3. ábrán szemléltetjük — által előidézett cél-RNS hasításról van szó.

A hasítási reakciót követően, az RNS termék gélelktroforézises felbontásához és azonosításához 12%-os Long Ranger gélt (AT

Biochem, módosított poliakrilamid gél) (0,4 mm x 30 cm x 40 cm) készítünk elő. Ehhez 21 ml Long Ranger oldatot (50%) 11 ml TBEpuffert (0,89 M Tris-(hidroxi-metil)-amino-metán, 0,89 M bórsav,

0,02 M EDTA) és 37 g karbamidot megfelelő mennyiségű vízzel keverünk össze. A polimerizációt 450 pl ammónium-peroxi-diszulfét oldattal (10% tömeg/térfogat) és 45 pl TEMED-del indítjuk. A gél 1 óra múlva felhasználható. Futtató pufferként 16,66-szorosára hígított TBE-puffert alkalmazunk. Az eiváiaszrás 60 watt mellett percen belül megtörténik. A gélelektroforézises elválasztás után a markerezett hasítási termékeket (RNS oligomereket) ráhelyezett röntgen film segítségével, vagy Phosphonmager segítségével mutatjuk ki, illetve kiszámítjuk.

A hasítási reakciót IC pl térfogatban végezzük.

Példa egy koncentráció sorozatra:

pl szubsztrát RNS-hez (12000 cpm) 1 pl oligonukleotidkonjugátumot (10 pM) vagy megfelelő hígításokat (végső koncentráció 1 pM, 750 nM, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM és 0,5 nM) , 4 pl Tris-HCl puffért (50 mM pH 7,4 37 “C-on) és a megfelelő mennyiségű vizet hozzápipettázzuk. Ezt a keveréket 1 percig 85 °C-ra hevítjük, és ehhez kapcsolódóan 16 órán át 37 “’Con inkubáljuk. A reakciót 5 pi felvivő puffer (0,025% brómfenolkék, 0,025% xilol cylanol 1:1 keverékben 80% formamiddai és 7 M karbamiddal, 20 mM citromsav, 1 mM EDTA) hozzáadásával állítjuk meg. A gélelektroforézises elválasztáshoz a próba 7,5 pl-ét 1 percig 95 °C-on denaturáljuk, azonnal jégre helyezzük és gélzsebre visszük fel.

Példa egy idősorozatra:

pl szubsztrát RNS/DNS-hez (12000 cpm) 1 pl oligonukleotidkonjugátumot (10 pM) , 4 pl Tris-HCl puffért (50 mM pH 7,4 37 °Con) és a megfelelő mennyiségű vizet hozzápipettázzuk. Ezt a keveréket 1 percig 85 °C-ra hevítjük, és ehhez kapcsolódóan 2, 8,

16, 40 és 64 órán keresztül 37 °C-on inkubáljuk. A reakciót 5 pl felvivő puffer (0,025% brómfenolkék, 0,025% xilol cylanol 1:1 keverékben 80% formamiddai és 7 M karbamiddal, 20 mM citromsav, mM EDTA) hozzáadásával állítjuk meg. A gélelektroforézises elválasztáshoz a próba 7,5 pl-ét 1 percig 95 “C-on denaturáljuk, azonnal jégre helyezzük és gél-zsebre visszük fel.

A szubsztrát RNS koncentrációt 25-szörös feleslegben a következők szerint becsüljük meg: 100 pM RNS nyersterméknél és a

10%-os hozamánál az előírás szerint r- r·. o

U Ό' *7 ·* trát RNS végső koncentráció és 1 μΜ oiigonukleotid-konjugátum található a reakciókeverékben. Amennyiben a terpiridin-lantanidkomplexet visszük be összehasonlításként, úgy 400 μΜ komplexre van szükség körülbelül ugyanolyan hasítás eléréséhez, mint amelyet 40 nM oligonukleotid-komplexnél érünk el. Ebben az esetben 10000-szeres feleslegben van a komplex az oiigonukleotid-konjugátumhoz képest.

A koncentráció sorozatnál 40 μΜ szubsztrát RNS/DNS hasítását 40 nM oligonukleotid-konjugátummal 16 óra alatt 37 °C-on szemléltethető .

Hasítási termékek a 3. táblázat 3.2 vegyületével RNS-El-en végzett hasításnál:

az 5'd(CTA GCC GAC TGC)r(CGA UGA CUC GCC AC) kiindulási anyagnak kevesebb, mint 20%-a marad hasítatlan.

Fő hasítási termékek (Σ80%):

5' d (CTA GCC GAC TGC)r(CGA UGcp)

5'ö(CTA GCC GAC TGC)r(CGA Ucp)

5' d(CTA GCC GAC TGC)r(CGcp)

További hasítási termékek (Σ5%):

5' r (CUA GCC GAC UGC CGA UCU CGCcp)

5' r (CUA GCC GAC UGC CGA UCU Ccp) op 2' ,3' -ciklofoszfátot jelent

F2 . példa:

Itt egy találmány szerinti antiszenz-oligonukleotid-konjucátum - ahogyan azt az 1. ábrán szemléltetjük - által előidézett cél-RNS hasításról van sző.

Az El példához hasonlóan járunk el a 3. oablázatban találka• · tó 3.20 vegyület és az RNS-E2, mint cél-RNS felhasználásával.

Hasítási termékek:

az 5' d(CTA GCC GAC TG) r (CCG AUC UCA AG)d(CCA GTC TAC) kiindulási anyagnak kevesebb, mint 5%-a marad hasítatlan.

Fő hasítási termékek (Σ95%):

5'	d	(CTA	GCC	GAC	TG)	r	(CCG	AUC	UCA Acp
5'	d	(CTA	GCC	GAC	TG)	r	(CCG	AUC	UCAcp)
5'	d	(CTA	GCC	GAC	TG)	K	{ CCo	AUC	Uccp)

F3, példa:

Itt további, különböző cél-RNS-ek különböző antiszenzoligonukleotid-konjugátumokkal — ahogyan azt az 1. ábrán szemléltetjük — történő hasításának vizsgálatáról van szó.

A következő 4 . táblázatban az alkalmazandó cél-RNS-ek szerkezetét mutatjuk be. A vastagon szedett nukleotidok komplementerek az antiszenz-oligonukleotid-konjugátum azon nukleotidjával, amelyhez a komplex kötődik. Az aláhúzott nukleotidok a cél-RNSóől és konjugátumból álló hibridben pár nélkül állnak (mismatch). A cél-RNS-E-17 esetében a kettőzött aláhúzás azt jelenti, hogy a kiválasztott szekvencia környezetében mindenkor 2 szomszédos nukleotid az aláhúzott területen pár nélküli, anélkül hogy egyértelműen meg lehetne határozni, mely nukleotidokról van szó. Továbbá vázolja a konjugárum helyzetét, különösen a komplexét a cél-RNS-re vonatkozóan.

4. táblázat: Különböző cél-RNS-ek szerkezete

Antiszenz oligonukleotid konjugátum (vázlat)

Ln

ZZ cél-RNS

E3	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UCU	CUUG) d(C	CAG	TCT	AC)
E4	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	CUCU	CG) d(C	CAG	TCT	AC)
E5	5’d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UGCU	CG) d(C	CAG	ί C ι	AC)
E6	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UCGU	CG) d(C	CAG	TCT	AC)
E7	5'd	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UCU	GCG) d(C	CAG	TCT	AC)
E3	5’d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UCU	CUG) d(C	CAG	TCT	AC)
E9	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	CAG) d(C	CAG	TCT	AC)
E10	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	ACG) d(C	CAG	TCT	AC)
Eli	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	CG UC	C) d(AG	TCT	AC)
E12	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	CG CG	C) d(AG	TCT	AC)
E13	5' d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	GACG) d(C	CAG	TCT	AC)
E14	5' d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	GGCG) d(C CAG	TCT	AC)
E15	5' d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	AGCG) d(C	CAG	TCT	AC)
E16	5’d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	AACG) d(C	CAG	TCT	AC)
E17	5’d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	CUCG) d(C	CAG	TCT	AC)
E18	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	CGAG) d(C	CAG	TCT	AC)
E2 (s.o.)	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	CAAG) d(C	CAG	TCT	AC)
E19	5’ r	CUA	GCC	GAC	UGC	CGA	UCU	AACGC	CAG	UCU	AC
A 1	sasi	tásho	z az	FI . p	éldában lei	rtak s	zerlnt j	árunk	cr, ' — !	ahol
követ	keze	h 5.	tábi	ázatban bemutató	tt ant	.is zenz-olroont	ikle	C f· i Q _
aj ugá’	rumokat (	lásd	a 3 .	tábláz	a a o a	is) és cél-RNS-eket	- (V	ásd a
0 á2	á	ZOt)	h a s z r	i a i z a κ	fel.	Az í	i 79 2	dazatbar	i a m 2	_nde	n k orr
1 - RNS	-r uk	hasít	rási	termékeit 1'	j ra megadji	-k. Például a	C é 2	-RNS-
3.22	ko	nj u cs.	summa	tor	ténő h	. a s 2 a s a ώΑ ^ί	a „ +5 Ah	aaa	ί el·	e.ntr,
?y ^a -	r 5 A	és -ró	A rm-	tleotr	dók ko	zöot	a Q a n	m hasisé	i 3 .

• · · • ··

5. táblázat: Különböző cél-RNS-eknek különböző antiszenz-oligonukleotid-konjugátumokkal történő hasításával keletkező fő hasítási termékek

Konjugátum	3.18	i 3.21	3.19	3.20	3.22	3.23
cél-RNS (mismatch megadva)		i				\|
E3 ~5U,+6y	+5U, +6U	í +3U, i -r-6U	*	+3U	+3U	-1G
E4 + 1C	-1G	+2U	*	-1G	-1G	-1G
E5 +2G	-1G, OA	+2G	*	-1G	-1G	-1G
E6 +3G	-1G, +3G	+3G	★	+4U	★	*
E7 +4G	+5C	+5C	nincs hasítás	+5C	★	* I
E3 +5U	+5U	+5U		-1G	★	★
E9 +5 A	★	+5A +4C	★	+4C	*	« l
E10 +4A	★	+5C, +3U	+5C	+5C	*	* ί í I
E11 +6LJ	★	no	★	+6U	★	*
E12 +7G	★	no	★	+7G	*	★
E13 +4G, +5 A	+4G, +5A	+4G +3U	★	+3U, +4G,+5A, +6C	*	+4G, +5A +6C,

E14 +4G, +5G	-1G	+3U, +4G	+5G	+5G	+5G, -1G	+5G
E15 -MA, ±5G	+3U,+4 A+5G, +6C	+3U	+5G	+5G	+5G, +3U	-5G, +3U, -1G
E16	+4A,	+3U,	+3U,	+3U,	+3U,	-1G,
-4A, -5 A	+5A	+4A	+4 A, +5A	+4A, +5A	+4A	+3U,+4 At5A
E17 +1U — — +6C	-1G	+3U	★	-1G	nincs hasítás	-1G
E18 +5G, +6A	+5G, +6A	+5G	+5G	+5G	+5G	-1G, +4C, +5G
E2 -r^A, +6A	+5A, +6A	+5A	+4C, +5A	lásd az F2 példát	+oA	+4C,+5 A+6A,- 1G
E19 +4A,+5A	+4A, +3U	*	+3U, +4A, +5A	+3U, +4A, +5A I		-1G, +3U,+4 A-5A

* nem vizsgáltuk

F4 , példa:

Itt további, különböző cél-RNS-ek különböző antiszenzoiigonukleetid-konjugátumokkai - ahogyan azt a 2. ábrán szemléltetjük — történő hasításának vizsgálatáról van. szó.

A következő 6. táblázatban tüntetjük fel az alkalmazott célRNS-ek szerkezetét. A 4. táblázatnál megadott magyarázatok érvén' -sek.

6. táblázat: Különböző cél-P^NS-ek szerkezete

Antiszenz oligo-								[ Ln
nukleotid	3	J							\
konjugátum (vázlat)

cél-RNS
E4	5' d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	C'JCU	CG) d(C	CAG	TCT	AC)
E5	5' d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UGCU	CG) d(C	CAG	TCT	AC)
E6	5'd	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UCGU	CG) d(C	CAG	TCT	AC)
E7	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UCU	GCG) d(C	CAG	TCT	AC)
E8	5'd	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UCU	CUG) d(C	CAG	TCT	AC)
E9	5'd	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	CAG) d(C	CAG	TCT	AC)
E10	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	AGG) d(C	CAG	TCT	AC)
E20	5'd	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCAU	CG) d(C	CAG	TCT	AC)
E12	5’d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	CG CG	C) d(AG	TCT	AC)
E13	5' d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	GACG) d(C	CAG	TCT	AC)
E14	5'd	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	GGCG) d(C	CAG	TCT	AC)
E15	5’d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	AGCG) d(C	CAG	TCT	AC)
E16	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	AACG) d(C	CAG	TCT	AC)
E18	5'd	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	CGAG) d(C	CAG	TCT	AC)
E2	5'd	(CTA	GCC	GAC	TG) r(C	CGA	UCU	CAAG) d(C	CAG	TCT	AC)
E19	5’ r	CUA	GCC	GAC	UGC	CGA	UCU	AACGC	CAG	UCU	AC

A hasításhoz az FI. példában leírtak szerint járunk el, aho a következő, 7. táblázatban bemutatott antiszenz-oligonukleotid konjugátumot (lásd a 3. táblázatot is) és oel-RNS-eket (lásd zabhoz fűzött m.aovarázatot rs) .

séi-RNS lő hasítási termékeit újra megadjuk (lásd az 5. táblá

7. táblázat: Különböző cél-RNS-eknek egy antiszenz-oligonukleotiö-konjugátummal történő hasításával keletkező fő hasítási termékek

Konjugátum	3.25
cél-RNS
(mismatch megadva)
E4	-10G
-8C
E5	-10G
-7G
ES	-6G
-6G

E7 j -€U, ! -5G ί -7C, ! -8U

I tzo -4LJ	-ac, -6U, -7C
E9	-5C,
-4A	-4A
E10	-6U
-5A
E20	-7C
-6A

E12	-2G,
-2G	-3C
E13	-5A,
-5A, -6G	-6G
E14 -5G, -6G	-7U
E15	-5G,
-5G, -6A	-6A
E16	-5A,
-5A, -6A	-6A
E18	-3G,
-4A, -5G	-4A
E2	^A,
-4A, -5A	-5A
E19	-6A,
-5A, -6A	-7U

• ··

F5 . példa :

Itt további, különböző cél-RNS-ek különböző antiszenzoligonukleotid-kor. jogátumokkal — ahogyan azt a 3. áorán szemléltetjük — történő hasításának vizsgálatáról van szó.

A következő 8. táblázatban tüntetjük fel az alkalmazott célRNS-ek szerkezetét. Ezen kívül egy kor.troll-DNS-t (Ξ31) is alkalmazunk. A 4. táblázatnál megadott magyarázatok érvényesek.

8. táblázat: Különböző cél-RNS-ek szerkezete

Antiszenz oligonukleotid konjugátum g, / (vázlat) cél-RNS

E2:	5’d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGAC	UCU	CGC	CAC)
E22	5' d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UGCU	CGC	CAC)
E23	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGAG	UC'J	CGC	CAC)
E24	5' d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGACC	UCU	CGC	CAC)
E1 (s.o.)	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UGACU	CGC	CAC)
E14	5‘d	(CTA	GCC	GAC	TG)r(C	CGA	UCUGG	CG)	d(CCA	GTC	TAC)
E2	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TG)r(C	CGA	UCUCAA	G)d(C	CAG	TCT	AC)
E2S	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TGC	CGA)	r(UGACU	CGC	CAC)
E26	5’d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UGGCU	CGC	CAC)
E27	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UAGCU	CGC	CAC)
E2S	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	U-CWU	£GC	CAC)
E29	5' d	(CTA	GCC	GAC	TGC)	r(CGA	UACU	CGC	CAC)
E30	5’ r	CUA	GCC	GAC	UGC	CGA	UGACU	CGC	CAC	UCU	AC
kontroll DNS
E31	5’ d	(CTA	GCC	GAC	TGC	CGA	TGACT	CGC	CAC)

A hasításhoz az FI. példában leírtak szerint járunk el, ahol a következő, 9. táblázatban bemutatott antiszenz-cligonukleotidkonjugátumokat (lásd a 3. táblázatot is) és cél-RNS-eket (lásd a cél-RNS tő hasítási termékeit újra megaojuk zathoz fűzött magyarázatot is).

9. táblázat: Különböző cél-RNS-ekr.ek különbc nukleotrd-konjagátsmokkal történő hasításával ί1ásd az 5 tábla— ő antiszenz-oligoκ e r e t K e ζ ο t o sasi^- tiási termékek

Konjugátum	3.2	3.14
cél-RNS (mismatch megadva)
E21 -5C	-1C,	-1C
E22 -4G	-5U,	★
E23 -5G	-7G, +2C	+2C
E24 -5C, -6C	-1C	-21)
E1 -4A, -5G	lásd az FI példát	-5G
E14 -2G,-3G	*	0G,-1C, -2G
ι E2 l -1A,-2A	*	-1A, -2A

E25 -4A, -5G	-5G	-5G, -6U
E26	-6U	+2C,
-4G, -5G		-5G
E27	-6U	-6U
-4G, -5A
E28	-1C	-2U
-6U — - -1C
E29	-5U	-5U
-4A
E30	-5G, -6U, -	★
-4A, -5G	7A
E31 -4A, -5G	rímes hasítás	nincs hasítás

• · · ··

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

1. ábra

1/ • · · · · · · • · · ··· ··· ···>

-· .:. ·..* ·..* * .* '·.· +5

5’ 3’

1-6. és előnyösen a 2-4. gyűrűre nem-szubsztituált és szubsztituált -CH=CH-CH=CH- csoportok kötődnek 1,3 helyzetben, és a gyűrű N-atomjaival piridinocsoportot alkotnak.

37. A 33. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a konjugátumoknál a III. általános képletű vegyületekről van szó, * · · · ·· ·«« ··· ··* • * · 9 · · · • » ·· * ·· v m' n/m ahol· R? és R_? egymástól függetlenül H-, C₂-C₄-alkil-, C_x-C₄-alk oxi- C^-C₁₂-aralkil- vagy Cg-C^-arilcsopcrtct jelent,

R- és R₆ egymástól függetlenül H-, C₂-C₄-alkil-, C7-C_i2 ^_aralkil vagy Cg-C_2S-arilosoport,

R₄ H-, C₂-ü₂Q-aikil-, C₅-Cg-cikloalktl-, Cg-C₂₂ ^_^^rÍl^_ vagy C₇-C₁₂aralkilcsoport telvén áll,

Me lantén, iantanid fém, ittrium vagy szkandium helyén áll,

Y egy aniont helyettesít, n 2 vagy 3, és m 1,2 vagy 3, ahol az alkil-, cikloalkil-, aralkil- és anl-maradékok nem szubsztituáltak vagy Cy-C₄-alkoxi-, F-, Cl-, 3r-, -CN, C₂-C₄-al kil- vagy -NO₂ csoporttal szubsztituáltak,

R₅ a IV. általános képlet maradéka

-B-oligo (IV. ) es R_x H vagy egy szubsztituenst jelent, vagy

Rc K vagy egy. szubsztituens és R, a IV. általános képlet egy ma raoekat jelenti, ahol 3 es oligó a 33. luenvoontban megadott je ·· ··· ··· ··· • * · ·· · · · • · · · » ·» lentéssel rendelkezik.

38. A 37. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol az III. általános képletű vegyületekben R₂ és R₇ H- helyén áll, R₃ és R₆ C0C₄-alkiicsoportot jelent, R₄ H-, C₁-C₄-aikil-, fenil- vagy benzilcsoportot szemléltet, az -X,-X₂-X₃-(XJ_x-oligó csoport és R₅H-, metil- vagy metoxicsoport vagy R₅ az -X₂-X₂-X₃- (X J _x-oiigó csoport és R₂ H-, metil- vagy metoxicsoport, X₂ közvetlen kötés vagy C₂-C₆-alkilén-, X₂ -0-, -NK-, -0(0)-0-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH- vagy -NH-C (S) -NH-csoportot jelent, X₃ C₂-C₁₂-alkilén- vagy fenilén-csoportot szemléltet, X₄ nukleozid építőelem 0, N, vagy

C-atomjához való kötődést jelent, vagy X,-_; -0-P(0) (OM)-0-csoportot szemléltet, x 0 vagy 1 helyett áll, Me jelenthet La, Ce, Nd, Eu vagy Gd fémeket, n 2 vagy 3 és m 1 vagy 2 helyett áll, Y mutathat Cl-, Br-, CH₃C(O)O-, C10₄-, BF₄ , PF₆ , F₃C-SO₃- vagy tozilát aniont, M állhat H, Na vagy K helyett, és oligó egy olyan oligonukleotidot jelent, amelynek belső szekvenciája egy cél-RNS-sel csak részben komplementer, és amely természetes dezoxiribonukleotid építőelemekből vagy nem természetes szintetikus nukleotid építőelemekből épül fel, ahol a cél-RNS-re vonatkoztatva 1-4 építőelem hiányzik.

39. Eljárás olyan oligonukleotidok előállítására, amelyekhez átészterező vagy hidrolizáló katalizátor kötődik, és az oligonukleotid belső szekvenciái részben nem-komplementerek egy természetben előforduló cél-RNS-sel, és az oligonukleotid természetes dezoxiribonukleotid építőelemekből vagy nem természetes szintetikus nukleotid építőelemekből épül fel, azzal jellemezve, hogy az alapvázhoz kötve funkciós csoportot felmutató, átészte78 rező vagy hidrolizáló katalizátort egy nukleotid építőelem funkciós csoportjával vagy egy nukleotid építőelem funkcionálisan módosított csoportjával kicseréljük.

40. Eljárás ribonukleinsavak nukleotidfoszfát hídjainak — fiziológiai körülmények között és szintetikus átészterező és/vagy hidrolizáló katalizátor hatására történő — hasítására, azzal jellemezve, hogy (a) komplexbe visszük a cél-RNS-t egy olyan oligonukleotiddal, amelynek belső szekvenciája részben nem-komplementer a cél-RNS-sel, és amely átészterező és/vagy hidrolizáló katalizátorhoz kötődik, azzal az kikötéssel, hogy kiemeljük az olyan oligonukleotidokat, amelyeknek belső szekvenciája részben nem-komplementer egy természetben előforduló cél-RNS-sel és amelyhez átészterező vagy hidrolizáló katalizátorként texafirinfém-komplex kötődik, és (b) azután hagyjuk reagálni és hasadni.

41. Eljárás az 1. igénypont szerinti oligonukleotidok felhasználására egy terápiás eljárás során, melegvérűek — beleértve az embert — betegségeinek kezelésére nukleotid-szekvenciák inaktiválása révén a testben.

42. Vizes oldat vagy szuszpenzió alapú készítmény, amely az 1. igénypont szerinti oligonukleotid hatásos mennyiségét egymagában vagy egyéb hatóanyagokkal, gyógyszerészeti hordozóanyagként vízzel és adott esetben segédanyagokkal együtt tartalmazza.

43. Vizes oldat vagy szuszpenzió alapú gyógyszerészeti preparátum, amely az i. igénypont szerinti oligonukleotid hatásos menynyiségét egymagában vagy egyéb hatóanyagokkal, gyógyszerészeti hordozóanyagként jelentős mennyiségű vízzel és adott esetben segédanyagokkal együtt tartalmazza.

• · ·» ·· ·· • · · · · ·· ··· ··* ··· • · · · · · · · • «· ·· · ··

44. A 39. igénypont szerint előállított, 1. igénypont szerinti oligonukleotid felhasználása diagnosztikumként vírusfertőzések vagy genetikai eredetű betegségek kimutatására.

45. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid felhasználása melegvérűek — beleértve az embert — betegségeinek kezelésére nukleotid-szekvenciák inaktiválása révén a testben.

A meghatalmazott:

1. Dezoxinbonukleot időkből, nem természetes, szintetikus nukleotid építőelemekből, vagy peptidnukleinsavakból felépülő olyan oligonukleotid, amelynél az oligonukleotidhoz átészterező vagy hidrolizáló katalizátor kötődik, és az oligonukleotid belső szekvenciája részben nem-komplementer egy természetben előforduló cél-RNS-sel, azzal az kikötéssel, hogy kiemeljük az olyan oligonukleotidokat, amelyeknek belső szekvenciája részben nemkomplementer egy természetben előforduló cél-RNS-sel és amelyhez átészterező vagy hidrolizáló katalizátorként texafirin-fém-komplex kötődik.

2. ábra • ·« ··· · ·· · ·* , * ········<

ι

2/3

2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a részben nem-komplementer jelleget a szekvenciában szerkezeti zavarás okozza oly módon, hogy nem tud bekövetkezni bázispár képződés.

3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol az oligonukleotid szekvenciájában — a cél-RNS-sel összehasonlítva — egy vagy több egymás után következő nukleotid építőelem hiányzik.

4. A 3. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben az 1-10 nukleotid építőelem hiányzik.

5. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol az oligonukleotid egy vagy több olyan egymást követő nukleotid építőelemet tartalmaz, amelyek a cél-RNS megfelelő nukleotid építőelemeivel nem képeznek párt.

6. Az 5. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol az oligonukleotid 1—10 párt nem képző építőelemet tartalmaz.

7. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a cél-RNS• * · sel párt nem képző külső nukleotid építőelemek 10-ig a belső szekvenciához kötődnek.

8. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely párt nem képző épízőelemként természetes nukleotid építőelemeket tartalmaz.

9. Az 1. igénypont szerinti oligonukleorid, amely párt nem képző építőelemként nem természetes, szintetikus nukleotid építőeleme-

két tartalmaz. 10 . Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely 5-100 nukleotid építőelemet tartalmaz. 11 . A 10. igénypont szerinti oligonukleotid, amely 5-50 nukleotid építőelemet tartalmaz. 12 . A 10 . igénypont szerinti oligonukleotid, amely 8-30

nukleotid építőelemet tartalmaz.

13. Az 5. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a párt nem képző rész a szekvencia belső területén helyezkedik el.

14. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely a purin és pirimidin sorozat természetes dezoxinukleozidjaiból épül fel.

15. A 14. igénypont szerinti oligonukleotid, amely 2'-dezoxi-2amino-adenozinból, 2' -dezoxi-5-metil-citidinbői, 2' -dezoxiadenozinból, 2' -dezoxicitídmből, 2' -dezoxiguanozmból és 2' -dezoxitimidinből épül fel .

16. A 14. igénypont szerinti oligonukleotid, amely 2'-dezoxiadenozinból (A), 2' -dezoxicitidinből (C), 2'-dezoxiguanozinból (G) és 2' -dezoxitimidinből (T) épül fel.

17. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben a nem természetes, szintetikus építőelemek a purm és pirimidin sorozat természetes nukleozidjaiból vezethetők le.

• · ·

9 9 ·

18. A 17. igénypont szerinti oligonukleotid, amelyben az építőelem adenozinból, citidinből, guanozinból, 2-amino-adenozinból,

5-metil-citozinból, timidinből és az előzőekben megnevezett dezoxi-származékokból vezethető le.

19. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a cél-RNS-sel részben komplementer oligonukleotid (1) természetes dezoxinukleozidokból vagy nem természetes, szintetikus építőelemekből épül fel, és (2) a részben komplementer sajátságot az egyébként komplementer szekvencia 1-4 építőelemének hiánya okozza.

20. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol átészterező vagy hídrólizáló katalizátor az oligonukleotid-szekvencia 3’ vagy

5’ végcsoportjaiban N-, S- vagy O-atomokhoz; a szekvencia belsejében vagy végén nukleinbázisok C-, N- vagy O-atomjaihoz; furanóz-gyűrűk 2'-helyzetében a szekvencia belsejében vagy végén 0-, S- vagy N-atomokhoz; vagy a szekvenciában közvetlenül vagy hídképző csoporton keresztül, a nukleotid hídképző csoportjának 0-, S- vagy N-atomjaihoz kötődik.

21. A 20. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a hídképző csoport az I. általános képletnek felel meg,

-X₁-X₂-X₃-(XJ_x- (I.) amelyben X₂ közvetlen kötést vagy olyan kétértékű, 1-22 szénatomos nyíltláncú vagy ciklusos szénhidrogén csoportot, amely megszakítás nélküli vagy az -S-, -NR-, -C(0)-0-, -C(O)-NR- csoportok maradékaival megszakított, vagy 1-12 oxa-alkilén egyseget és az alkilénben 2 vagy 3 szénatomot tartalmazó polioxa-slkilénmaradékot jelent; X₂ -0-, -S-, -NR-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(S)-NH-,

-0-C (O) -0-,

-0-C (0) -NH-,

-NH-C(0)-0-,

-C (0) -0-,

-C (S)-0-, « * ···

-O-C(O)-, -O-C(S)-, -C(O)-NR-, -RN-C(O)-, -S (Ο ) -0-, -0-S (0 ) ₂~ ,

-S(O)₂~NR-, -NR-S(O)-, -P (0) - (OM) -0-, -0-P (0) - (OM)-, -P(O)-(OM)-NR-, -NR-P (0) - (OM)-, -PH(O)-O-, -O-PH(O)-, -PH(O)-NR- és

-NR-PH(O)- csoportokat szemléltet; X₃ függetlenül X₃ jelentésével bír és x 0-val azonos, ha Χς közvetlen kötést szemléltet; Xj egy nukleozid építőelem 0-, N- vagy C-atomjához való kötődést jelent, vagy X₄ -0-P (0 ) (OM)-0-, -NR-P (0 ) (OM)-0-, -0-P (0 ) (OM)-NR-, vagy -NR-P(O)(OM)-NR- csoportokat szemléltet, ha x 1-gyel azonos és X₃ nem közvetlen kötés; R H-, Ο₃-Ο₆-alkil-, fenil- vagy benzilcsoport; Μ H-, C₂-Cg-alkil-, fenil- vagy benzilcsoport, alkálifém kation vagy ammónium kation helyén áll; és x 0 vagy 1.

22. A 21. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol az I. általános képletben X₃ közvetlen kötés és előnyösen Cj-C₄-alkilén-, fenilén- vagy benzilénosoportot jelent, ahol az alkilén-csoportot -0(0)-0- vagy -C(0)NH-csoportok szakíthatják meg; X₂ 0(0)-0-, -C(O)-NH-, -NH-C(0)-NH- vagy -NH-C(S)-NH-; X₃ C₂-C₁₈-alkilén-, előnyösen C₂-C₁₂-alkilén-csoportot szemléltet; X₄ -0-P(0)(OM)-O-, -NR-P (0) (OM)-0-, -0-P (0) (OM)-NR- vagy -NR-P (0) - (OM)-NR- csoportokat jelent.

23. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol az oligonukleotidhoz kötődő katalizátorok esetében polipeptiöekről, fémsókról és fém-komplexekről van szó.

24. A 23. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a fémeket az elemek periódusos rendszerének mellékcsoportjaiból, valamint főcsoportjaiból, In, TI, Sn, Pb és Bi választjuk ki.

25. A 23. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a fémeket szkandium, ittrium, lantán, lantanidák, Ti, Zr, Hf, V, Nb, Ta, • r 9 ♦ · ··♦ · · *

Cr, Mo, W, Mn, Fe, Ru, Os, Co, Rh, ír, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au,

Zn, Cd és Hg közül választjuk ki.

26. A 23. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a fémeket szkandium, ittnum, lantán, lantanidák, Cu és ólom közül választjuk ki.

27. A 23. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol lantanida fémekként a Ce, Eu, Gd és Sm csoportját választjuk ki.

28. A 23. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a fémsókhoz és fémsó-komplexekhez megfelelő anionokat a következő csoportból választunk: halogenid, oxisavak anionja, BF₄ , PF₆ , SiF₆ és

AsF₆.

29. A 23. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a fémkomplex katalizátorok előnyösen hetero-organikus vegyületekkel, mint komplexképzőkkel képzett fémsó-komplexként állnak rendelkezésre, ahol a komplexképző az oligonukleotidhoz kapcsolódik.

30. A 29.. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a komplexképzőknél az 0, S, N és P csoportból kiválasztott hetero-atomokat tartalmazó nyiltláncú vagy ciklusos szerves vegyületekről van szó .

31. A 29. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a komplexképzőknél összesen 8-26 gyűrűtagot tartalmazó és 2-12 hetero-atommal rendelkező ciklusos vagy policiklusos szerves vegyületekről van szó.

32. A 29. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a komplexképzőknél koronaéter, cianin, ftálo-cianin, porfirin, fenantrolin, nyílt és ciklusos di- és terpiridin, etilén-diamin-tetraecetsav és dietilén-uriamin-pentaacetát jön szóba.

β« · * · « ·♦ # • · « * < ·· ·»

33. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a konjugátum a

II. általános képletnek felel meg,

A-B-oligó (II.) amelyben A a B-hez előnyösen szénatomon keresztül kötődő ciklusos vagy policiklusos fémsókomplex, amelyet olyan komplexképzővel állítunk elő, amely a gyűrűben legalább 12 gyűrűatomot és legalább 4 hetero-atomot — N és 0 csoportból — tartalmaz kétértékű vagy háromértékű fémionokhoz kötve, amelyeket a szkandiumot, ittnumot, lantánt és lantanida fémeket tartalmazó csoportból választottunk ki; B az I . általános képlet hídképző csoportjául szolgál és oligó olyan oligonukleotidot jelent, amelynek belső szekvenciája cél-RNS-sel részben nem-komplementer.

34. A 33. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a komplexképző összesen legfeljebb 22 gyűrűatomot tartalmaz, és a gyűrűatomok a hetero-atomokon kívül előnyösen C-atomok.

35. A 34. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a komplexképző 4-12 hetero-atomot tartalmaz az 0 és N csoportból.

36. A 33. igénypont szerinti oligonukleotid, ahol a komplexképző összesen 16-20 gyűrűatomot, valamint 6-10 N-atomot tartalmaz, ahol a fennmaradó gyűrűtagok esetében C-atomokról van szó, és az

3/3