HUP9901464A2

HUP9901464A2 - Eljárás baktériumtörzsek kiválasztására

Info

Publication number: HUP9901464A2
Application number: HU9901464A
Authority: HU
Inventors: Pascal Jean-Luc Butty; Marina Jeyasingham
Original assignee: Ceva Sante Animale
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-29
Publication date: 2004-12-28
Also published as: US6346422B1; NO992092L; FR2778187B1; NO992092D0; NZ335519A; FR2778187A1; JP2000023694A; AU2398899A; AU759293B2; CA2270754A1; EP0955545A1

Abstract

A találmány tárgyát képezi eljárás patogén baktériumtörzsek szövetiadhéziójának receptorhelyeire kötődni képes, nem patogénbaktériumtörzsek kiválasztására, amely során a) a receptorokat invitro érintkeztetik a tesztelendő baktériumtörzsekkel; b) a receptorokellen készült, adott esetben kimutatható módon megjelölt antitestetadnak az elegyhez; c) amennyiben az antitest maga nincs megjelölvekimutatható módon, az antitest kimutatására alkalmas vegyületet adnakhozzá; d) kimutatják az antitest és az izolált receptorok közöttkialakult komplex jelenlétét. A találmány tárgyát képezik továbbá atalálmány szerinti eljárással kiválasztott baktériumtörzsekettartalmazó terápiás készítmények és a baktériumtörzsek alkalmazásai. Atalálmány szerinti megoldás alkalmas szöveti adhéziót közvetítőreceptorokhoz kötődő patogén bakteriális törzsek, előnyösenenterotoxinogén E. coli törzsek, okozta fertőzésekkel kapcsolatospatológiás rendellenességek megelőzésére vagy kezelésére. Ó

Description

Képviselő:

Danubia

ΡΕΙ-ΓΆΝΥ

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

Budapest

Eljárás baktériumtörzsek kiválasztására

A találmány tárgyát eljárások képezik patogén baktériumtörzsek szöveti adhéziója által közvetített fertőzések megelőzésére vagy kezelésére alkalmas, nem patogén baktériumtörzsek kiválasztására.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható enterotoxinogén baktériumok okozta patológiás rendellenességek megelőzésére és kezelésére.

Számos bakteriális fertőzés során megfigyelhető egy korai fázis, amely során a patogén a gazdaszervezet adott pontjain kitapad.

Mindenekelőtt ez az adhézió teszi lehetővé a patogén baktériumok számára, hogy a fertőzés helyein - például a gazdaszervezet saját szekrétumai által folyamatosan mosott nyálkahártyamembránokon, amelyek perisztaltikus mozgásnak is ki lehetnek téve, megállapodottakká váljanak. Az adhézió segíthet a patogén baktériumnak abban is, hogy kompetícióba lépjen a gazdaszervezet mikroflórájával.

Aktaszámunk: 89756-2709/SG

Patogén baktériumoknak szövethez történő adhéziója gyakran sztereospecifikus, és csupán akkor képes végbemenni, ha a szövet egy nagyon specifikus típusú receptort hordoz. Bakteriális lektinek és szöveti cukrok kölcsönhatása a sztereospecifikus kölcsönhatás egy jellemző példája. Ezeket a 1ektinmolekulákat gyakran fimbriáknak nevezett rostszerű (filamentumszerű) függelékek hordozzák.

A fimbriák nagyon finom fehérjefilamentumok, amelyek főleg, nagy gyakorisággal, Gram-negatív baktériumokban fordulnak elő. Vagy a sejt teljes felszínén eloszolva vagy ennél lokalizáltabban találhatók. Egy fimbria ismétlődő lineáris fehérjealegységekből áll. Ezek az alegységek gyakran gazdagok nem poláris aminosavakban, így azok a sejtek felszíne, amelyek a fimbriát hordozzák, hidrofóbabb, mint azoké, amelyeken nem találhatók fimbriák. A Gram—negatív baktériumokban a fimbriák számos típusa játszik közre a sejtek egymáshoz, illetve bármilyen már felszínhez történő adhéziójában. Valójában a fimbriák mindegyik típusának megvan a lektinje, és csupán egy specifikus glikoprotein epitópokból álló receptorhoz tapad hozzá.

A specifikus típusú fimbriákon keresztül történő adhézió különösen lényeges az enterotoxinogén Esherlchia coll törzsek (ETEC törzsek) virulenciája szempontjából. Ezek a törzsek a duodénum nyálkahártyájához tapadnak hozzá, és például a hasmenésért felelős enterotoxinokat termelnek.

Kifejlesztettünk egy eljárást patogén baktériumok szövethez történő kötődésének megakadályozására, amely abban áll, hogy erre a célra olyan, nem patogén baktériumtör zseket választunk ki és alkalmazunk, amelyek képesek a patogén baktériumokkal azonos mértékű, vagy még erősebb kötődésre azok receptorhelyeihez.

A találmány tárgyát képezi közelebbről eljárás patogen baktériumtörzsek szöveti adhéziójának receptorhelyeire kötődni képes nem patogén baktériumtörzsek kiválasztására, amely során

a) a receptorokat in vitro érintkeztéljük a tesztelendő baktériumtörzsekkel;

b) a receptorok ellen készült, adott esetben kimutatható módon megjelölt antitestet adunk hozzá;

c) amennyiben az antitest maga nincs megjelölve kimutatható módon, az antitest kimutatására alkalmas vegyületet adunk hozzá;

d) kimutatjuk az antitest és az izolált receptorok között kialakult komplex jelenlétét.

Az antitest és a receptorok között kialakult komplex kimutatását tehát elvégezhetjük közvetlenül az antitest kimutatható módon történő - jelölésével, vagy közvetetten, az antitest kimutatására alkalmas vegyület alkalmazásával.

A kimutatható módon jelölt antitest kifejezés úgy ertendo, hogy az antitest jelölő csoporttal van konjugálva, vagy összekapcsolva.

A jelölő csoport többek között lehet például radioizotóp (pl. ¹²⁵I, ³h) , enzimmel kapcsolt (előnyösen alkálikus foszfatázzal, tormaperoxidázzal vagy β-galaktoszitázzal), fluoreszcens (előnyösen fluoreceinnen vagy rodaminon keresztül) vagy részecske formájú (előnyösen latex vagy kolloid arany). Ezek a jelölő csoportok (markerek) szakember számára jól ismertek.

A különböző markerek antitesttel történő konjugálását vagy kapcsolását ismert eljárással (glutáraldehiddel, karbodémiddel, maleinsav-anhidriddel, szubcinsav-anhidriddel, heterobifunkcionális vegyületekkel és hasonlókkal) végezhetjük.

Az antitest kimutatására szolgáló vegyület alatt bármely olyan eszközt értünk, amely lehetővé teszi az antitest indirekt kimutatását. A kimutatásra alkalmas vegyület lehet például előnyösen egy második antitest, amely a kimutatandó (vagy első) antitest ellen készült. A második antitest ebben az esetben kimutatható módon meg van jelölve.

A találmány szerinti megoldásban számos kimutatási eljárás alkalmazható: radioimmunológiai vizsgálati eljárás (RIA), immunénzimatikus vizsgálati eljárások (EIA, ELISA), fluoroimmunológiai vizsgálati eljárás (FIA), immunkemilumineszcens vizsgálati eljárás (CLIA), immunagglutinációs vizsgálati eljárás (IA), immunonefelometria és hasonlók.

Az első antitest és a receptor között kialakult komplex kimutatását Dávidotf-féle immuncitokémiás eljárással is elvégezhetjük, amely egyesíti a kettős peroxidáz-antiperoxidáz-módszert az avidin-biotinperoxidáz-komplexen alapuló módszerrel.

A találmány szerinti eljárás megvalósítási módja szerint a vizsgálandó baktériumtörzset csökkenő baktériumkoncentrációban érintkezhetjük a receptorral. Ennek célja az, hogy a különböző vizsgált baktériumtörzsek között megke5 ressük azt, amely legnagyobb mértékben gátolni képes az antitest receptorhoz történő kötődését, és megállapíthassuk a baktériumok lehető legnagyobb hígítását a negatív és a pozitív kontrollokhoz képest.

A patogén baktériumtörzsek szöveti adhéziójának receptorai ellen készült antitestek lehetnek mono- vagy poli— klonális antitestek vagy azok fragmensei, továbbá kiméra vagy immunkonjugált antitestek.

Poliklonális antitesteket előállíthatunk a receptorral immunizált állat szérumából, ismert eljárásokkal történő tisztítás útján.

Előnyösen azonban monoklonális antitesteket alkalmazunk, amelyeket hagyományos, Köhler és Milstein által leírt, hibridómatenyészeten alapuló eljárással állítunk elő szöveti adhézió tisztított receptorainak preparátumaiból.

Az antitestek lehetnek kiméra antitestek, humanizált antitestek, Fab és F(ab')2 fragmensek. Az antitestek előállíthatok immunkonjugátumok vagy jelölt antitestek formájában is.

A baktériumtörzsek között, amelynek patogén hatását a szöveti adhézió közvetíti, megemlíthetjük különösen az enterotoxinogén E. coli törzseket, amelyek közül az egyik legelterjedtebb, az amelyet ETEC/0147: K88ac-szerotípusként azonosítottak [Erickson és mtsai, Infection and Immunity, 60, 983-988 (1992) ] .

Az érzékeny malacok enterocitáinak bolyhos szélei egy olyan receptort expresszálnak, amely lehetővé teszi az említett patogéntörzs erős kötődését. A baktérium kötődését azonnal membránon belüli molekuláris reakciók sora követi az enterocitában, amely reakciók az ionáramlás megakadályozásával vízveszteséget okoznak. Ez általánosan kiterjed az egész bélrendszerre, és végül az irreverzibilis vízveszés a malac halálához vezet. Egy további példa az E. coli K99, amelyben a fimbriák az N-glikolil-neuraminil-laktozil-ceramidokhoz kötődnek, de a sziálsav N—acetilezett származékaihoz nem. Az N-glikolil-kötések különösen állatokban vannak jelen azok között is leginkább szarvasmarhában, amelyeket az E. coli K99 nagymértékben képes fertőzni.

A bakteriális törzsek között, amelyek patogén hatását a szöveti adhézió közvetíti, megemlíthetjük a Salmonellákat is.

Ezekben a baktériumokban a fimbriák alapvetően fontosak a kezdeti telepképződés szempontjából, különösen szárnyasok vakbelében. Ez a lépés megelőzi a fertőzést.

A priuszokon keresztül történő adhézió a Neisseria gonorrhoeae számára is lényeges annak érdekében, hogy virulens lehessen. Ilyen baktériumok a foglyukakban leggyakrabban előforduló baktériumok is, pl. a Streptococcus mutáns, S. sobrinus, S. critecus és S. rattus. Ezen baktériumok jellemző vonása, hogy glikozil-transzferázokat szekretálnak, és ezek segítségével átalakítják a szacharózt glikánokká. Ezek az enzimek nagyon fontosak az adhézió szempontjából, mivel az így keletkezett glikánok kötik hozzá a fogzománchoz és a fogínyhez a táplálékrészecskéket és nagyon hatékony receptornak bizonyulnak a Streptococcusok által hordozott lektinek számára. Amennyiben megkötődnek, a

Streptococcus-ok szaporodni kezdenek és fogsérüléseket okoznak. A Campylobacter jejuni patogén esetében a lipopoliszacharidok azok, amelyek az epitéliumsejtekhez és a nyálkahártyákhoz történő kötődést lehetővé tevő adhéziós anyag szerepét játsszák. Ez súlyos hasmenéses állapotot okoz emberben. A Clostridium difficile szintén kapcsolódik a bélnyálkahártyához és ez által válik viruensé. A Yersinia enerolytica, valamint a Pseudomonas aeruginosa azután fejtik ki patogén hatásukat, hogy külső membránjukban a kötőanyag (adhezin) szerepét játszó fehérjéken keresztül kötődnek. A Helicobacter pylori felelős a krónikus gyomor! gyulladásos betegségekért, továbbá a gyomor és a duodénum fekélyesedéséért. A Helicobacter adhéziója a gyomorsejtekhez - a gyomornyálkahártyán található receptorhoz kötődő, a patogén felszínén található addhezineken keresztül — alapvető fontosságú a fekélyesedési folyamat beindítása szempont j ából.

A találmány szerinti eljárás különösen előnyösen alkalmazható a belek falának - enerotoxinogén Escherichia coli törzseket kötő - specifikus receptoraihoz kötődni képes, nem patogén bakteriális törzsek kiválasztására.

Előnyösen elvégezhetjük a vizsgálandó bakteriális törzsek előzetes szelekcióját is. Az ETEC törzsek általi fertőzés esetében az előzetesen kiválasztandó törzseket, amelyeket előnyösen a laktobacilusok közül választunk ki, azon képességük szempontjából vizsgáljuk, hogy felismerik-e a kólibacilus-fertőzésekre érzékeny malacokból izolált duodénum fragmenseket és enterocitákat, és kötődnek-e azokhoz.

A madarakat fertőző Salmonellák okozta fertőzések esetében az anaerob baktériumokat előnyösen a vakbélből izolált enterociták szöveti frakcióit vizsgáljuk. Madarakat fertőző E. coli esetében a laktobacilus-okat előnyösen légcsősejtek (légzőszerv! kólibacilus-fertőzés esetében) vagy enterociták (emésztőszerve kólibacilus-fertőzés esetében) szöveti frakcióin teszteljük. Végül, a laktobacilusok és bifidobaktériumok előnyös jelöltek egyéb - fertőzött emberi, vagy állati gazdaszervezet emésztőrendszeréből, vagy húgyvezetékéből izolált — patogének esetében is.

A találmány szerinti megoldás megalkotása során tehát a Dl, 27S és a 30S jelzésű törzseket kiválasztottuk, amelyek - amint azt fent leírtuk - kompetícióba lépnek az enerotoxinogén E. coli törzsekkel a bélrendszer receptorainak fimbriáihoz való kötődés érdekében, és amelyek alkalmasak az ETEC-törzsek patogenecitása kifejlődésének megakadályozására. A 27S és a 30S jelű törzseket 6, ill. 16 hetes malacok vékonybeléből izoláltuk és megállapítottuk, hogy tejsavbaktériumok, amelyek a Lactobacillus nemzetséghez tartoznak, a szigorúan heterofermntatív laktobacilusok II. csoportjába, a Lactobacillus fermentum fajba. A Dl-törzs a Lactobacillus nemzetségbe, a szigorúan homofermentatív laktobacilusok I. csoportjába, a Lactobacillus salivarius fajba tartozó tej savbaktérium.

Gazdaszervezet alatt emberi vagy embertől eltérő állati szervezet értendő, amely hordozója a szóban forgó baktérium törzseknek. A gazdaszervezetnek tekintett állatok között megemlíthetjük különösen a sertést, előnyösen a ma * ' · lacokat, a teheneket, előnyösen a borjakat, továbbá juhot, baromfiakat, előnyösen csirkét és hasonlókat.

A malacok különösen érzékenyek enterotoxinogén kólibacilusok számos törzse által szekretált toxinra.

Leginkább az elválasztás után van ez így, abban az időszakban, amelyben már nem védettek az anyatej által biztosított antitestek révén, azonban a saját antitesteik termelődése még nem állt be.

A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás terápiás kezelésre, amely során a találmány szerinti eljárással kiválasztott nem patogén baktériumtörzsek hatásos mennyiségét adjuk be ilyen kezelésre szoruló embernek vagy állatnak.

A találmány tárgyát képezi ennek megfelelően a találmány szerinti eljárással kiválasztott baktériumtörzset tartalmazó terápiás készítmény is, gyógyászatilag elfogadható hordozóval kombinálva. A találmány szerinti gyógyászati készítményeket előnyösen orálisan adhatjuk be.

A készítmények beadásának optimális módjai, dózisai és a galenusi készítményformák meghatározhatók a páciensek terápiás kezelésének beállításakor általánosan figyelembe vett kritériumok alapján. Ilyen kritériumok pl. a páciens kora vagy testsúlya, általános állapotának súlyossága, a kezeléssel szembeni toleranciája, a megfigyelt mellékhatások és hasonlók.

A találmány szerinti eljárással kiválasztott baktériumtörzseket az innivalóba vagy a takarmányba - például előnyösen kényszerrel etetett takarmányba, tápfolyadékokba, vagy bármely más folyadékba vagy krémszerű takarmányba bejuttatva is beadhatjuk a állatoknak.

A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben feltárt eljárással kiválasztott, nem patogén baktériumtörzsek alkalmazása gazdaszervezet - a fent említett, szöveti adhéziót közvetítő receptorokhoz kötődő patogén bakteriális törzsekkel való — fertőzöttségével kapcsolatos patológiás rendellenességek megelőzésére, vagy kezelésére való terápiás készítmény előállítására.

Ilyen célzott patológiás rendellenességek előnyösen azok, amelyek enterotoxinogén Escherichia coli törzsekkel való fertőzéssel kapcsolatosak.

Az alábbi példákkal és ábrákkal szemléltetjük a találmány szerinti megoldást, anélkül, hogy bármilyen mértékben korlátozni szándékoznánk azt.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat.

Az 1. ábra egy, 10pg/ml-es koncentrációjú, bélből előállított receptoron végzett ELISA-vizsgálat eredményeit mutatja be. A vizsgálatot öt baktériumtörzzsel végeztük receptor elleni IgM monoklonális antitest (jelölése: 7E8aB4; koncentrációja 0,24 pg/ml) és peroxidázzal jelölt IgM elleni antitest jelenlétében.

A vizsgált törzsek a következők: 27S(·) , 30S () , 36S (Δ) LB14 (V) ÉS Dl (♦) . A 7E8aB4-antitest és peroxidázzal jelölt IgM elleni antitest jelenlétében egy pozitív kontrollt (O) állítottunk elő, amely nem tartalmazott baktériumtörzset. A negatív kontroll (□) 7E8aB4 antitestet peroxidáz jelölt IgM elleni antitestet és 3Atörzset tartalmazott.

A 2. ábra egy, 10 pg/ml koncentrációjú, bélből előállított receptoron végzett ELISA-vizsgálat eredményeit mutatja be. A vizsgálatot öt baktériumtörzzsel végeztük tisztított K88ac-fimbriák (12,5 gg/ml), K88ac elleni szérum, biotinilezett IgG-antiszérum és a sztreptavidin-tormaperoxidáz-komplex jelenlétében. A vizsgált törzsek a következők voltak: 27S(·), 30S (), 36S (Δ) LB14 (V) ÉS Dl(♦) . A pozitív kontroll (O) tisztított K88ac-fimbriákat (12,5 pg/ml), K88ac elleni szérumot, biotinilezett IgG-antiszérumot es sztreptavidin-tormaperoxidáz-komplexet tartalmazott, baktériumtörzset azonban nem. A negatív kontroll (□) tisztított K88ac-fimbriákat (12,5 pg/ml), K88ac elleni szérumot, biotmilezett IgG-antiszérumot és sztreptavidin-tormaperoxidáz-komplexet és 3A-törzset tartalmazott.

Példák

Enterotoxinogén kólibacilus receptorához kötődni képes nem patogén baktériumtörzsek szelekciója

I. Receptorok tisztítása

Számos vizsgálatot végeztek receptorok tisztítása érdekeben [Cohen és mtsai, Microecology and Therapy, 1985, (15 71-83) és Erickson és mtsai, Infection and Immunity, 1992, (60 983-988)].

A legnagyobb problémát az aktív receptoroknak monoklonalis antitestek termelése megkezdéséhez elegendő hozammal történő előállítása jelenti.

A kísérleti kólibacilus—fertőzéssel szemben érzékeny — és ezért kólibacilus elleni receptorokat expresszáló — malacokat kiválasztottuk, és elkülönítettük a receptorokat nem termelő, rezisztens állatoktól [Valpotic I és mtsai, Vaterinarski Arhiv, 1989 (59 161-175) és Valpotic I és mtsai, Periodicum Biologorum, 1990 (92 43-44)] . A vékonybél nyálkahártyamembránját gondosan eltávolítottuk és proteáz— inhibitorok jelenlétében homogenizáltuk. Az enterociták bolyhos szélének vezikulumait elválasztottuk a nyálka komponenseitől, majd a nagymértékben glikozilált receptorokat ultrahangos kezeléssel és alkoholos és fenolos kicsapások kombinációival kivontuk a vezikulumokból. A receptorokban feldúsult vizes fázist végül dializáltuk, majd liofilizáltuk. Minden egyes tisztítási lépés után a receptort Wes— tern-blottolással vizsgáltuk a K88ac-baktérium fimbriáit kötő képessége szempontjából.

A részletes tisztítási előirat a következő volt:

A receptor tisztítása a bolyhos szél vezikulumainak előállításával kezdődik.

Az első lépésben a bélnyálkahártyát gondosan eltávolítjuk egy 10 cm-es bélszegmensről és egy Pótter-edénybe helyezzük. A nyálkahártya mennyisége ötszörösének megfelelő térfogatú és 50 mM-os mannitolt, 2 mM-os Tris-HCl-t (pH 7,4) és proteáz inhibitorokat [PMSF (fenil-metil-szulfonilfluorid), tripszininhibitor, pepstatin-A, ill. leupeptin] tartalmazó puffért adunk a Potter-hez. A szuszpenziót ezután a dugattyú 15-szöri oda-vissza mozgatásával finomra aprítjuk. Az oldat 7,5 és 17,5 ml között becsült térfogatát percig, 0°C-on MgCl₂-vel érintkezhetjük annak érdekében, hogy 1%-os arányt érjünk el. Két centrifugálást hajtunk végre - az elsőt 3000 g-vel 15 percig, a másodikat 27000 gvel 30 percig — annak érdekében, hogy kinyerjük az üledéket, amely 10 μΐ pufferben szolubilizálunk. Ezután meghatározzuk a fehérjekoncentrációt.

Ezután kivonjuk a receptorokat a bolyhos szél vezikulumaiból, amivel azokat félig tisztított állapotban kapjuk meg.

Ebben a második lépésben CHAPS-t, 3—[(3-kolamido-propi1) dimetilammonió]—1—propanidszulfonátot, a fehérje meny— nyisége ötszörösének megfelelő detergenst adunk 100 μΐ szuszpenzióhoz. A fehérjéket egy Potter-ben szolubilizáltuk a dugattyú 15-szöri oda-vissza mozgatásával. A szolubilizálást 4 C-on 20 órán keresztül folytattuk. Az oldatot ezután 125 000 g-vel centrifugáltuk egy órán keresztül. A felülúszót eltávolítjuk majd 24 órán keresztül 4°C-on dialízáljuk. [molekulatömeg-határ(MWCO; Molecular Weight-CuttOff): 12000-14000], majd egy órán keresztül centrifugáltuk 125 000 g-vel. A felülúszót dializáltuk, majd újra centrifugáltuk, egymás után két alkalommal. Mindegyik centrifugá— lás után az üledéket desztillált vízben újra szolubilizáltuk. Az oldat végső térfogata nem haladta meg az 1 ml-t.

A félig tisztított receptorokat ezután - annak érdekében, hogy tisztított receptorokat kapjunk - kezeltük.

Ebben a harmadik lépésben a készítményt először ultrahangos kezelésnek (15 watt) vetettük alá, 3-szor 15 másodpercig olvadó jégben. Ezután 125000 g-vel centrifugáltuk percen keresztül. Az üledéket újra szolmizáljuk 1 ml desztillált vízben, majd megismételjük az ultrahangos kezelést. Ezt a műveletet 12-szer ismételjük. Minden egyes centrifugálási lépés után a felülúszót olvadó jéggel érintkező csőbe helyezzük. A teljes felülúszót dialíziscsőben töményítjük be.(MWC0: 10000) szilárd PEG ellenében, amíg a kezdeti térfogat egyharmadát nem érjük el. A töményített készítményt ezután etanollal meghígítjuk úgy, hogy a készítmény 11% alkoholt tartalmazzon, majd 20 percig olvadó jegben inkubáljuk. A készítményt ezután 125 000 g-vel 40 percig centrifugáljuk. Az üledék tisztaságát receptorokra nézve SDS-PAGE-elektroforézissel becsüljük meg. A receptorokat ezután a fent leírtakkal lépésről-lépésre azonos módon kezeljük, azonban az oldat koncentrációja etanolra nézve 20, 33, 43, 55 és 64%. A receptorokat a 43, 55 és 64%-os alkoholos kicsapások után gyűjtjük be. Ezeket desztillált vízben szolubizáljuk, majd liofilizáljuk.

——receptorokra specifikus monoklonális antitestek előállítása

A receptorokra specifikus monoklonális antitestek előállítását Köhler és Milstein eljárása szerint végeztük [Nature, 1975 (256 495-497)].

A fent leírt eljárással tisztított receptorokat Balb/c albínó egerekbe injektáltuk. Az, hogy a legjobb szérumantitest-titerekre nézve tesztet végeztünk, lehetővé tette, hogy három sejtfúzióhoz három egeret válasszunk ki. A fúzió abból állt, hogy az egerek lépőből antitestet szekretáló B-limfocitákat gyűjtöttünk, és ezeket a sejteket rákos limfoblasztos sejtekkel fuzionáltattuk. A hibridómák szelektív növekedését a tenyészetben DNS-szintézis inhibitorainak egy készletével idéztük elő, majd a tenyészet feluluszojaban megvizsgáltuk a receptor elleni antitestek aktivitását .

Az alábbi kísérletekben izoláltuk a sejteket úgy hogy egy hibrid sejt kerüljön egy lyukba. Az azonos sejteket tartalmazó lyukak mindegyikének felülúszóit ELISA-val vizsgáltuk annak érdekében, hogy megállapítsuk a legnagyobb, receptor elleni aktivitást. Azokat a kiónokat, amelyekről elképzelhető volt, hogy megfelelőek lesznek, prisztánnal (2,6,10,14-tetrametil-pentadekán) kezelve előkészített erekbe injektáltuk annak érdekében, hogy az aszcitesz folyadékban nagy mennyiségben képződjenek antitestek. Ezeket végül tisztítjuk és jellemezzük [J. H. Peters és mtsai, Monoclonal antibodies, 1992 (475) és L. Hudson és mtsai, Practical Immunology, 1998 (496)].

³³’ & ^mortoklonális antitestek kiértékelése

A kapott kiónokat alkalmazva 20 antitestet vizsgáltunk három módszerrel (immuncitokémiával, ELISA-val és BIAcore-ral) bélrendszeri receptort felismerő képességük szempontjából. Közülük hat antitestet választottunk ki. Ezeket az antitesteket ELISA-val és BIAcore-ral analizáltuk arra nézve, hogy képesek-e gátolni K88ac-ből származó fimbriák kötődését receptoraikhoz, molekuláris komppetíció útján. Két antitest 100%-ban gátolta a bakteriális antitestek kötődését. Ezeket választottuk ki immunológiai eszköz16 ként az alábbi kiválasztási tesztben. A termelt monoklonális antitestek egyikét 7E8aB4-nek jelöltük.

III. Bakteriális törzsek kiválasztása

A tesztelt törzseket vágóhidakon gyűjtöttük sertésekből. A törzsek a Lactobacillus fermentum, L. delbrueckii, L. acidophilus, L. salivarius, Leuconostoc lactis nemzetségekhez és fajokhoz tartoztak. Ez a lista nem teljes. A törzseket előzetes teszteknek vetettük alá, hogy igazoljuk, hogy képesek kötődni a bélnyálkahártyához és izolált enterocitákhoz.

a) Az élőárat ismertetése

Az MRS-tápközeg összetétele:

Proteose Bacto-peptone No.310 g

Bacto-yeast-kivonat10 g

Bacto-yeast-kivonat5 g

Bacto-dextrose20 g

Tween 80lg

Ammonium-nitrát 2g

Nátrium-acetát 5g

Magnézium-szulfát0.1 g

Mangán-szulfát 0.005g

Dikálium-foszfát 2g g port szuszpendáltunk fel 1 liter vízben, majd a pH-t 6.5 + 0.2-re állítottuk be 25°C-on.

Lényeges, hogy a teszt kivitelezése előtt a baktériumtörzsből egy előzetes tenyészetet teszteljünk le. A baktériumokat folyékony MRS-tápközegben tenyésztettük 37°C-on mikroaerofil körülmények között. Ezután centrifugálással elkülönítettük őket a felülúszótól és sós foszfátpufferben (PBS) újra felszuszpendáltuk (pH 7.3). Baktériumszuszpenzió sűrűségét (OD) 5-re állítottuk be (600 nm—en mérve az OD=0,5 3xl0⁸ baktérium/ml-nek felel meg), majd 24-szer kétszeresére hígítottuk. A tiszta felülúszót 12-szer hígítottuk a kétszeresére.

Ez a teszt abból áll, hogy a bélreceptort ELISAtálcák mikrolyukainak falához adszorbeáltatjuk egy éjszakán át 4°C-on, sós foszfátpufferben. A receptorok közötti területet telítőszerrel (1% BSA) töltjük ki. Ezt a műveletet 30 percig végezzük szobahőmérsékleten (burkolás). Három mosási lépés után a baktériumtörzsek (vagy tenyészet-felülúszó) mindegyik oldatából - a teljes koncentrációtartományban — 50 ml-t sorra 24 vagy 12 lyukba helyezzük. 12 órányi, 4°Con vagy kétórányi 37°C-on végzett inkubálás után 50 μΐ, 0,24 μg/ml állandó koncentrációjú 7E8aB4 monoklonális antitestet adunk a lyukak mindegyikéhez. Az antitest koncentrációt ezt megelőzően úgy állítottuk be, hogy ELISA-ban OD=1,2 nagyságrendbe eső, kellő nagyságú jelet kapjunk. Újra elvégezzük a három mosásból álló sorozatot, majd a teszt hátralévő szakaszában kimutatjuk 7E8aB4 jelenlétét a lyukakban olyan peroxidáz-konjugált antitestek alkalmazásával, amelyek képesek felismerni a 7E8aB4—et. Az enzim szub— sztrátját (O-feniléndiamin) szétosztjuk az ELISA-tálca lyukai között. így tehát, amennyiben egy antitest-receptorkonjugátum jelen van a lyukban, az enzim lebontja a szubsztrátot, ami helyi színreakciót eredményez. A színreakció intenzitása közvetlen módon függ a jelenlévő antitest menynyiségétől. Az optikai sűrűség értékeit minden lyukban pontosan meghatározzuk egy ELISA-tálca leolvasó segítségével.

b) Eredmények

Az optikai sűrűséggel kapott értékeket a pozitív kontrollokéval (ezekben csupán a 7E8aB4 antitest van jelen) hasonlítjuk össze. Amennyiben a monoklonális antitestek koncentrációja állandó, állandó színjelet adnak, így az OD érték közel van az 1,2-höz. Amennyiben a tesztelt baktériumok képesek megakadályozni az antitest kötődését, az OD érték jelentősen csökken a jelenlévő baktériumok számától függően. A kapott görbék különbözők a tesztelt törzsek függvényében. A görbék profilját analizáljuk és összehasonlítjuk egy referenciatörzs - amelyről tudjuk, hogy nem tapad ki (3A-törzs az 1. ábrán) - vége által képviselt negatív kontrollal. Ez a negatív kontroll lehetővé teszi azt is, hogy különbséget tegyünk az antitest kötődésének nem specifikus gátlása és specifikus gátlása között. Célunk az, hogy megkeressük a legnagyobb gátlást (ezt a legkisebb OD jelöli) kifejtésére képes baktériumokat. A legnagyobb lehetséges mikroorganizmus-hígítás mellett a negatív és pozitív kontrollok profiljára vonatkoztatva.

Amennyiben egy törzs esetében a kapott profil majdnem ráhelyezhető a negatív kontroll profiljára, továbbá amikor az OD érték nagyon gyorsan növekszik az első hígítás után, amíg el nem éri a maximális OD-értékű platót (OD=1,2) arra következtetünk, hogy ez a törzs nem gátolja az antitest receptorokhoz való kötődését (a 36S jelű törzs az 1. ábrán).

Másfelől, a kontrollal összehasonlítva, néhány törzs hoszszan tartó gátló aktivitást fejt ki alacsony baktériumkoncentrációknál (ilyen pl. a Dl, 27S és 30S jelű törzs az 1. ábrán). A kapott görbéket könnyen megkülönböztethetjük a nem kitapadó kontroll törzsétől, mivel jobbfelé el vannak tolódva az ábrán (alacsony baktériumkoncentrációk irányába) . Minél inkább jobbra van eltolódva egy adott görbe, a baktériumtörzs annál jobb jelölt, mivel annál hatásosabban lép komppetícióba az ETEC törzsekkel a fimbriák K88ac-hez való adhéziója helyén.

A 36S és az LB14 jelű törzsek

A 36S jelű törzset egy hathetes malac vastagbeléből izoláltuk, és megállapítottuk, hogy az az első komplexbe tartozó Lactobacillus nemzetséghez, a szigorúan homofermentatív laktobacilusok első csoportjába, a Lactobacillus delbrueckii fajba tartozó tej savbaktérium. Az alfajt PCRrel végzett finomanalízissel kell megállapítani.

Az LB14-es törzset frissen izoláltuk hathetes malacok duodénumából. Ez a második komplexbe tartozó Lactobacillus nemzetségbe, a fakultatív heterofermentatív laktobacilusok II. csoportjába a Lactobacillus casei fajba tartozó tejsavbaktérium. Az alfajt finomanalízissel kell megállapítani.

A 36S és az LB14 törzsek esetében amint nő a baktériumok hígítása, az optikai sűrűségértékek is nagyon gyorsan nőnek, követve a negatív kontroll profilját és elérik a nem patogén baktériumok alacsony hígítására jelelemző optikai sűrűségértéket. A megfigyelt gátlást lényegében az ELISAtálcák lyukaiban jelenlévő nagyon nagy számú baktérium okozza, ami gyakorlatilag megakadályozza az antitestek hozzáférését a lyukak falán és fenekén kötött receptorhoz. Az ilyen nem specifikus sejtek gátlás esetében az 50%—os gátlás (OD=0,4) kb. 12xl0⁶ baktérium/lyuk koncentráció közelében következik be. Úgy tekinthetjük, hogy a hasonló eredményeket mutató törzsek várhatóan nem alkalmasak in vivő teszt céljaira.

A 30S (L. fermnentum) és a 27S (L. fermentum) törzsek A 27S-és 30S-törzseket 6-16 hetes malacok vékonybeléből izoláltuk és megállapítottuk, hogy a Lactobacillus nemzetségbe, a szigorúan heterofermentatív laktobacilusok III. csoportjába, a Lactobacillus fermentum fajba tartozó tejsavbaktériumok.

Ezekben a példákban a fent leírt törzsek profiljához képest nagyon lényeges különbségeket figyeltünk meg. Valójában a nem patogén baktériumok többszöri kétszeres hígítása ellenére a gátlás megmarad, hiszen az optikai sűrűség értéke stabilan az alapvonal közelében marad. A gátlás első fázisait a baktériumok nem specifikus akadályozó hatása okozza. Az alacsonyabb koncentrációk felé azonban az alkalmazott immunológiai eszköz receptoron ható, specifikusabb gátlása tolja el. Annak érdekében, hogy a gátlás fokozatos megszűnését megfigyelhessük, a nem patogén baktériumoknak a negatív kontroliénál nagyobb hígítása szükséges. Az 50%-os gátlásnál (OD=0,02) a baktériumok koncentrációja 60xl0⁴nagyságrendű, amely 20-szor kisebb, mint a negatív kontrollok és a 36S, ill. LB14 jelű törzsek esetében. Ezeket a

- 21 - ...........

törzseket kiválasztottuk arra a célra, hogy velük további in vivo kísérleti teszteket folytassunk.

Dl-törzs

A Dl törzs egy, a Lactobacillus nemzetségbe, a szigorúan homofermentatív laktobacilusok I. csoportjába, a Lactobacillus salivarius fajba tartozó tejsavbaktérium.

Annak ellenére, hogy ennél a törzsnél a gátlás hamarabb kezd el megszűnni, mint a 27S-és a 36S-törzsek esetében, némileg hosszabban tart. Ennek következtében az 50%-os gátlás (OD=0,03) a nem patogén baktérium 90xl0⁴ nagyságrendű koncentrációjánál következik be, ami 1,5-ször nagyobb koncentráció, mint a 27S- és 30S-törzsek megfelelő koncentrációi, de 13-szor kisebb koncentrációnál éri el ezt az értéket, mint a negatív kontroll, illetve a 36S és LB14 törzsek. Ez a köztes gátlási profil tehát közel van a kiválasztott törzsekéhez. A Dl törzs tehát szintén megfelelő jelölt az in vivo kompetíciós tesztekhez.

A találmány szerinti megoldás tehát lehetővé teszi nem patogén, enterotoxinogén baktériumok kötődését, és így patogén hatásuk expresszióját, specifikusan megakadályozni kepes baktériumtörzsek kiválasztását. A kiválasztott nem patogén törzsek megelőző beadása lehetővé teszi enterotoxinogén baktériumokkal történt fertőzés okozta rendellenességek - pl. hasmenés - kifejlődésének elkerülését. Gyógyító célra történő alkalmazásuk lehetővé teszi ugyanezen rendellenességek csillapítását vagy kiküszöbölését.

IV· A kiválasztott törzsek in vitro gátlás! képességének ellenőrzése

a) Anyagok és módszerek

Annak érdekében, hogy kiértékelhessük a tenyészetek felülúszóinak és a mosással tisztított baktériumoknak az antitesttel szemben mért gátló kapacitásait, egy kontroll tesztet hajtottunk végre úgy, hogy az antitestet K88ac tisztított fimbriáival helyettesítettük. Ebben az esetben K88ac elleni poliklonális szérumot és antiszérummal konjugált antitesteket használtunk a fimbriák jelenlétének kimutatására .

Ebben a tesztben a bélből származó receptort ELISAtálcák mikrolyukaiba helyezzük, majd éjszaka 4°C-on sós foszfátpufferben állni hagyjuk. A receptorok közötti területet telítőszerrel (1% BSA, marhaszérum-albumin) töltöttük ki. Ezt 30 percen keresztül végeztük szobahőmérsékleten. Három mosási lépés után az előre kiválasztott törzsek (vagy tenyészetek felülúszói) minden koncentrációjú oldatából - a teljes koncentrációtartományban - 50 μΐ-t helyezünk 24, illetve 12 lyukba. 12 órás 4°C-on végzett vagy 2 órás 37°C-on végzett inkubálás után K88ac-fimbriák 50 μg—nyi preparátumát adtuk a lyukak mindegyikéhez, állandó, 12,5 μg/ml-es koncentrációban. A fimbriák koncentrációját ezt megelőzően úgy állítjuk be, hogy az ELISA során. OD =1,2 nagyságrendbe eső, megfelelő mértékű jelet kapjunk. A három mosásból álló sorozatot újra végrehajtjuk, és a teszt hátralevő része során kimutatjuk a K88ac-fimbriák jelenlétét a lyukakban nyúl eredetű antiszérumból nyert poliklonális antitestek alkal mazásával. Azokat a nyúleredetű antitesteket, amelyek felismerték a fimbriákat biotin-konjugált antitestekkel végzett mosás után mutatjuk ki. Az elegyhez egy, a biotin felismerésére képes enzimkomplexet (sztreptavidin/tormaperoxidáz) adunk. Végül az enzim szubsztrátját (O-feniléndiamin) szétosztjuk az ELISA-tálca lyukai között. Ezáltal színreakció kifejlődését idézzük elő. Szükség van ezekre a felismerési kaszkád-reakciókra, mivel a K88ac-fimbriák nagyon hidrofóbak, és a fimbriák különösen nagy koncentrációjának alkalmazása bakteriális lektinek nem specifikus kötődésének megjelenését eredményezi. Egy molekula sztreptavidin komplex több peroxidáz enzimet hordoz. így tehát ezen enzimkomplexek alkalmazása lehetővé teszi, hogy alacsony koncentrációjú fimbriával dolgozzunk, hiszen, a színreakció amplifikálás után jelentkezik.

b) Eredmények

Az optikai sűrűség értékeit a receptoron csupán K88ac—fimbriát tartalmazó kontrollok esetében kapott értékekkel hasonlítottuk össze (2. ábra). A fimbriák állandó koncentrációja állandó színreakciót eredményezett, ennek megfelelően az OD érték 1,2 közelében volt. Az eredmények alapján a fimbriák kötődését nehezebb gátolni, mint a 7E8aB4-antitestekét. Valóban, annak érdekében, hogy a fimbriáknak a monoklonális antitesteket alkalmazó tesztben mértekkel összehasonlítható gátlását figyelhessük meg, több baktériumra van szükség lyukanként. Ezt a különbséget értelmezhetjük az alkalmazott antitestek és a fimbriumok kötőhelyei száma közötti különbség alapján. Egy IgM-molekula _ 24 - ’ ” tíz felismerési helyet hordoz, míg egy fimbria bizonyosan sokkal többet. Mindazonáltal, ezen különbség ellenére, a gátló aktivitásuk szerint kiválasztott törzsek osztályozása nem változik.

V. A kiválasztott törzsek hatékonyságának in vivo kiértékelése

A fent leírt eljárás olyan, nem patogén baktériumtörzsek szelekciójához vezet, amelyek specifikusan kötődnek malacok bélnyálkahártyájából származó E. coli K88ac-törzs fimbriáival szembeni receptorokhoz. Szükség van arra, hogy in vivő is kiértékeljük ezt a kötődést. Az in vivo teszt során a kiválasztott baktériumtörzs szaporodhat a vékonybélben és hatékony védelmet biztosíthat E. coli K88ac kötődésével szemben.

Ennek megfelelően a malacokat születésük helyén tartjuk és mielőtt kolosztrumot kapnának, elkülönítő berendezésbe helyezzük őket. Hagyományos folyékony tápszert kapnak. Ennek eredményeképpen ezekből a malacokból nem hiányzik a mikrobiális flóra, de számukra a kolosztrum által biztosított immunológiai védelem nem áll rendelkezésre.

A malacok étrendjük során egy, a fentiek szerint kiválasztott baktériumtörzset kapnak három napon keresztül. Ezután 5xl0⁸ CFU-nak (kolóniaképző egység) megfelelő toxinogén E. coli K88ac törzset adunk be nekik. A malacokat 24 órával a beadás után humánusan megöljük, és megmérjük az összes mikroorganizmus-koncentrációt E coli-ra és a kiválasztott nem patogén baktériumtörzsre nézve a vékonybél különböző szegmenseiben, valamint a vakbélben. Ezen kívül meghatározzuk a malacok E. coli K88ac—vei szembeni genetikai érzékenységét.

Amennyiben azok az érzékeny (és ezért adhéziós helyeket hordozó) malacok szignifikánsan nagyobb koncentrációban tartalmazzák a kiválasztott nem patogén baktériumtörzset, mint a rezisztens malacok, ez azt jelenti, hogy ez a törzs képes kötődni az adhéziós helyekre, és ott szaporodni. Ez a baktériumtörzs tehát képes olyan irányba módosítani a vékonybél mikrobiális flóráját, amely kedvezőtlen az E. coli K88ac számára.

Claims

- *· *·:.. .%

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Eljárás patogén baktériumtörzsek szöveti adhéziójának receptorhelyeire kötődni képes nem patogén baktériumtörzsek kiválasztására, azzal jellemezve, hogy

a) a receptorokat in vitro érintkeztetjük a tesztelendő baktériumtörzsekkel;

b) a receptorok ellen készült, adott esetben kimutatható módon megjelölt antitestet adunk az elegyhez;

c) amennyiben az antitest maga nincs megjelölve kimutatható módon, az antitest kimutatására alkalmas vegyületet adunk hozzá;

d) kimutatjuk az antitest és az izolált receptorok között kialakult komplex jelenlétét.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy patogén baktériumtörzsre specifikus receptor elleni antitestként (első antitestként) kimutatható módon nem jelölt, de az 1. igénypont c) lépése szerinti kimutatásra alkalmas vegyület - egy kimutatható módon megjelölt és az első antitest ellen készült második antitest - hozzáadásával kimutatható antitestet alkalmazunk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy receptorként bélfal specifikus enterotoxinogén Escherichia coli törzseket kötni képes receptorait alkalmazzuk.
4. Terápiás készítmény, amely az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárással kiválasztott baktériumtörzset tartalmaz.
5. Az 1-3 igénypontok bármelyike szerinti eljárással kiválasztott, nem patogén baktériumtörzsek alkalmazása állati gazdaszervezet - a szöveti adhéziót közvetítő receptorokhoz kötődő patogén bakteriális törzsekkel való - fertőzöttségével kapcsolatos patológiás rendellenességek megelőzésére, vagy kezelésére való terápiás készítmény előállítására.
6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás enterotoxinogén Escherichia coli törzsek általi fertőzéssé kapcsolatos patológiás rendellenességek megelőzésére vagy kezelésére.
7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az állati gazdaszervezet sertés.

A meghatalmazott:

DANUBIA

Sz^bajdalmi és Védjegy Ιχ-oda Kft.