HUP0600905A2 - A method to produce succinic acid from raw hydrolysates - Google Patents

Description

-2korlátozódik.

Más kísérleteink eredménye egy olyan eljárás (6,159,738. számú USA-beli szabadalmi leírás), amely borostyánkősavat fokozott mértékben termelő baktériumtörzsek előállítására alkalmas. Az eljárás szerint átalakítjuk E. coli foszfotranszferáz-génjét, amely azt eredményezi, hogy a baktérium több borostyánkösavat termel. A módszer hátránya, hogy egyetlen módosításra korlátozódik.

A technika jelenlegi állása szerint van igény borostyánkősav fermentációs termeltetésére szolgáló eljárásra, ahol az eljárás nem épül egyetlen mutánsra vagy génre. Az eljárást bármilyen olyan organizmussal kell végezni, amelynek konkrét, és könnyen meghatározható genotípusa van. Az eljárást viszonylag inert körülmények között kell végezni robosztus organizmusok alkalmazásával (azaz olyanokkal, amelyeknek magas feedback gátlási küszöbértékük van), és úgy, hogy nyilvánvalóan szükségek finoman kidolgozott környezeti kontroli-mérések is. A eljárásnak kimagasló eredményeket kell hoznia olyan cukorkeverékek alkalmazásával, amelyek lignocellulóz anyagok hidrolíziséből származnak, mivel ezek a szubsztrátok olcsóbb cukorforrást biztosítanak, és így alkalmazásuk csökkentheti a borostyánkősav termelési költségeit.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célként tűztük ki eljárás kidolgozását borostyánkősav termeltetésére, amely a technika jelenlegi állása szerint alkalmazott eljárások sok hátrányát kiküszöböli.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során másik célként tűztük ki olyan fermentációs eljárás kidolgozását, amellyel nagy hozamokban lehet borostyánkősavat termeltetni. A találmány szerinti megoldás jellemzője olyan bakteriális genomok alkalmazása, amelyek az eljárást lehetővé tevő, több mutáns gént tartalmaznak. A találmány szerinti megoldás azért előnyös, mert baktériumok könnyen módosíthatók többszörös mutációk előállítása céljából. Ezzel alternatív módon, többszörös mutációt már tartalmazó baktériumokat további módosítás nélkül lehet alkalmazni.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során még egy másik célként tűztük ki eljárás kidolgozását baktériumok módosítására nagy mennyiségű borostyánkősav termeltetésére. A találmány szerinti megoldás jellemzője a baktériumokban működő cukormetabolizmus normál szabályzásának megszüntetése. A találmány szerinti megoldás előnye, hogy különféle baktériumokat lehet módosítani abból a célból, hogy elősegítsük a viszonylag magas termék/növekedési szubsztrát arányokat (azaz ami 1:1 vagy nagyobb) borostyánkősav termeltetésére szolgáló fermentációs eljárásokban. A találmány szerinti megoldás másik előnye, hogy olyan baktériumokat is lehet alkalmazni, amelyek glükóz-metabolizálókká és nem-glükóz-metabolizálókká váltak.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során még egy másik célként tűztük ki borostyánkősav fermentációs úton történő termeltetését. A találmány szerinti megoldás jellemzője olyan baktériumok alkalmazása, amelyek megváltoztatott foszfotranszferáz- (pts-) rendszert, piruvát-formiát-liáz- (pfl-) rendszert és tejsav-dehidrogenáz- (Idh-) rendszert tartalmaznak. A találmány szerinti megoldás előnye, hogy a baktériumokat sokféle nemzetségből lehet származtatni, amelyek ezeket az enzimrendszereket használják cukor-fermentációra.

Röviden összefoglalva, a találmány tárgyát képezi eljárás borostyánkősav termeltetésére ipari minőségű hidrolizátumokból, amelyben előállítunk ptsG-, pflB- és IdhA-génekre mutációkat tartalmazó organizmust; lehetővé tesszük, hogy az organizmus felhalmozzon biomasszát; és lehetővé tesszük, hogy az organizmus metabolizálja a hidrolizátumot.

Szintén a találmány tárgyát képezi baktérium-mutáns, amely borostyánkősavat termel ipari minőségű hidrolizátumot tartalmazó szubsztrátból 0,6:1 és 1,3:1 közötti borostyánkösav/szubsztrát-arányban (például 0,6 és 1,3 gramm közötti borostyánkősavat 1 gramm fogyasztott összes cukorra vonatkoztatva).

-3A találmány szerinti megoldást a fentebb ismertetett és más célkitűzéseivel és előnyeivel a legjobban a találmány előnyös megvalósítási módjának alábbi részletes leírása alapján lehet megérteni, az ábrákkal szemléltetve, amelyeken:

Az 1. ábrán bemutatjuk borostyánkősav fokozott mértékű termeltetését, miután egy baktériumot mutáns génnel transzformáltunk, a találmányi leírásban ismertetettek szerint;

A 2. ábrán bemutatjuk ipari hidrolizátum fermentációját háromszoros mutációt tartalmazó organizmussal, a találmányi leírásban ismertetettek szerint; és

A 3. ábrán bemutatjuk szintetikus cukor fermentációját háromszoros mutációt tartalmazó organizmussal, a találmányi leírásban ismertetettek szerint.

Kifejlesztettünk egy olyan eljárást, amelyben nagy hozamokkal lehet fermentációs úton termeltetni borostyánkősavat. Az eljárásban kiválasztott organizmusok megváltoztatott katabolit repressziós mechanizmusait használjuk ki úgy, hogy lehetővé váljon, hogy borostyánkősav termelésére az organizmusok glükóz és nem-glükóz tápanyagokból álló keveréket használjanak.

A találmány szerinti megoldás részletes ismertetése előtt definiáljuk a leírásban esetleg előforduló, alábbi kifejezéseket.

A „vektor” kifejezés jelentése replikon, például plazmid, fág vagy kozmid, amelyhez más DNS-szegmenst lehet kapcsolni, így az elvégzi a kapcsolt szegmens replikációját.

A „replikon lehet bármilyen genetikai elem (például plazmid, kromoszóma, vírus), amely DNS-replikáció autonóm egységeként képes funkcionálni in vivo, azaz replikációra képes saját kontrollja alatt.

A „kazetta’ kifejezés olyan DNS-szegmenst jelent, amelyet egy vektorba lehet inszertálni specifikus restrikciós helyeken. A DNS-szegmens egy kérdéses polipeptidet kódol, és a kazetta és a restrikciós helyek úgy vannak megtervezve, hogy biztosítsák a kazetta inszercióját a megfelelő leolvasási fázisba transzkripcióhoz és transzlációhoz.

Egy sejt akkor van „transzfektálva” exogén vagy heterológ DNS-el, ha ilyen DNS-t beviszünk a sejt belsejébe. Egy sejt akkor van „transzformálva” exogén vagy heterológ DNS-el, ha a transzfektált DNS fenotipikus változásokat hoz létre.

„Heterológ” DNS olyan DNS-t jelent, amely természetes körülmények között nem található meg a sejtben, vagy a sejt egy kromoszómális helyén. A heterológ DNS előnyösen a sejtre nézve idegen gént tartalmaz.

Egy „nukleinsavmolekula” ribonukleozidok (adenozin, guanozin, uridin vagy citidin; „RNS-molekulák”) vagy dezoxmbonukleozidok (dezoxiadenozin, dezoxiguanozin, dezoxitimidin vagy dezoxicitidin; „DNSmolekulák”) foszfát-észterének, vagy bármilyen foszfát-észter analógjaik, például foszforo-tioátok és tioészterek polimer formáját jelenti, akár egyszálú formában, akár dupla hélix formában. Előfordulhat dupla szálú DNSDNS-, DNS-RNS- és RNS-RNS-hélix. A „nukleinsavmolekula” kifejezés, és különösen DNS- vagy RNS-molekula csak a molekula primer és szekunder struktúrájára utal, és nem korlátozódik semmilyen tercier formára. Tehát ezen a kifejezésen értünk dupla szálú DNS-t, amely többek között lineáris vagy cirkuláris DNS-molekulák (például restrikciós fragmensek), plazmidok vagy kromoszómák formájában található. A leírásban adott dupla szálú DNS-molekulák struktúrájának tárgyalásakor a szekvenciát a normál konvenció szerint írjuk le, a szekvenciát csak az 5’-3’-irányban adjuk meg a nem-átíródó DNS-szál (azaz a mRNS-el szekvencia-homológiával rendelkező szála) mentén. Egy „rekombináns DNS-molekula” olyan DNS-molekula, amelyek molekuláris biológiai manipuláción ment át.

-4Egy nukleinsavmolekula „hibridizálódni képes” egy másik nukleinsavmolekulával, például cDNS-el, genomi DNS-el vagy RNS-el, ha a nukleinsavmolekula egyszálú formája megfelelő hőmérsékleti és az oldatban lévő ionerősség által meghatározott körülmények között képes hibridizálódni a másik nukleinsavmolekulával (lásd Sambrook és munkatársai, mint fent). A hőmérséklet és az oldat ionerősségének körülményei határozzák meg azt, hogy a hibridizáció milyen mértékben „sztringens”. Homológ nukleinsavak előzetes szkrínelésére kismértékben sztringens hibridizációs körülményeket lehet alkalmazni, amely megfelel 55°C T_m-nek, például 5X SSC, 0,1% SDS, 0,25% tej és formamid nélkül; vagy 30% formamid, 5X SSC, 0,5% SDS. Mérsékelten sztringens hibridizációs körülmények magasabb T_m-nek felelnek meg, például 40% formamid 5X vagy 6X SSC. Nagymértékben sztringens hibridizációs körülmények a legmagasabb T_m-nek felelnek meg, például 50% formamid, 5X vagy 6X SCC. Hibridizációhoz szükséges, hogy a két nukleinsav komplementer szekvenciákat tartalmazzon, bár a hibridizáció körülményeitől függően nem párosodó bázisok („mismatches”) lehetnek. A sztringens körülmények mértéke, amely megfelel nukleinsavak hibridizációjához, függ a nukleinsavak hosszától és a komplementeritás mértékétől, ezek variációi szakember által jól ismertek. Minél nagyobb a hasonlóság vagy homológia két nukleotidszekvencia között, annál nagyobb a T_ra-érték az adott szekvenciával rendelkező nukleinsavak hibridjeire. Nukleinsav-hibridizációk viszonylagos stabilitása (nagyobb T_ra-nek felel meg) az alábbi sorrendben csökken: RNS:RNS, DNS:RNS, DNS:DNS. Száz nukleotidnál hosszabb hibridekre leszármaztattak (lásd Sambrook és munkatársai, mint fent, 9.50-9.51) egyenleteket T_m számítására. Rövidebb nukleinsavakra, azaz oligonukleotidokra a nem párosodó bázisok („mismaches”) pozíciója jelentősebbé válik, és az oligonukleotid hossza határozza meg specifitását (lásd Sambrook és munkatársai, mint fent, 11.7-11.8). Egy hibridizálandó nukleinsav minimális hossza előnyösen legalább körülbelül 12 nukleotid; előnyösen legalább körülbelül 18 nukleotid, és előnyösebben a hossza legalább körülbelül 27 nukleotid; és legelőnyösebben körülbelül 36 nukleotid.

A „homológ rekombináció” egy vektorban lévő, idegen DNS-szekvencia inszercióját jelenti egy kromoszómába. A vektor előnyösen egy specifikus kromoszómális helyet céloz meg a homológ rekombinációhoz. Specifikus homológ rekombinációhoz a vektor elegendően hosszú homológ régiókat tartalmaz a kromoszóma szekvenciáival, lehetővé téve komplementer kötődést és a vektor beépülését a kromoszómába. Hosszabb homológ régiók és nagyobb mértékű szekvencia-hasonlóság növelheti a homológ rekombináció hatékonyságát.

Egy DNS „kódoló szekvenciája” egy dupla szálú DNS-szekvencia, amely átíródik és transzlálódik polipeptiddé egy sejtben in vitro vagy in vivo, ha alkalmas szabályzó szekvenciák kontrollja alá helyezzük. A kódoló szekvenciák határait az 5’- (amino-) terminálisnál egy start kódon és a 3’- (karboxil-) terminálisnál egy transzlációs stop kódon határozza meg. Kódoló szekvencia tartalmazhat például prokarióta szekvenciákat, eukarióta mRNS-ből származó cDNS-t, eukarióta (például emlősszervezetből származó) DNS-ből származó genomi DNS-szekvenciákat, sőt szintetikus DNS-szekvenciákat is. Ha a kódoló szekvenciát eukarióta sejtben történő expresszióra kívánjuk alkalmazni, poliadenilálási szignál- és transzkripciós terminációs szekvenciát rendszerint a kódoló szekvencia 3’-végénél helyezünk el.

Transzkripciós és transzlációs szabályzó szekvenciák olyan szabályzó DNS-szekvenciák, például promóterek, enhanszerek, terminátorok és hasonlók, amelyek biztosítják egy kódoló szekvencia expresszióját egy gazdasejtben. Eukarióta sejtekben poliadenilálási szignálok szabályzó szekvenciák.

Egy „promóterszekvencia” olyan szabályzó DNS-régió, amely RNS-polimerázt képes megkötni egy sejtben, és a kódoló szekvencián szintézisirányú (3’-irányú) transzkripciót képes iniciálni. A promóterszekvenciat például a transzkripciós iniciációs hely köti, és szintézisiránnyal szemben (5’-irányba) terjed, és minimális

-5számú bázist vagy olyan elemeket tartalmaz, amelyek szükségesek a transzkripció iniciálására a háttérhez képest detektálható mennyiségben. A promóterszekvenciában transzkripciós iniciációs hely található (célszerűen például Sl-nukleázos térképezéssel definiálva), valamint fehérjekötő domének (konszenzus szekvenciák), amelyek az RNS-polimeráz megkötéséért felelősek.

Egy kódoló szekvencia abban az esetben van egy sejtben transzkripciós és transzlációs szabályzó szekvenciák „kontrollja alatt”, ha RNS-polimeráz átírja a kódoló szekvenciát mRNS-é, amelyen azután trasz-RNS „splicing” történik és a kódoló szekvencia által kódolt fehérjévé transzlálódik.

A leírásban a „szekvencia-homológia” kifejezés valamennyi nyelvtani formájában két olyan fehérje szerkezeti rokonságára utal, amelyek „közös evolúciós eredetűek”, ide értve szupercsaládokból (például immunoglobulin szupercsaládból) származó fehérjéket és különböző fajokból származó, homológ fehérjéket (például miozin könnyű lánca, stb.) [Reeck és mtsai., Cell 50, 667 (1987)].

Ennek megfelelően, a „szekvencia-hasonlóság” kifejezés valamennyi nyelvtani formájában olyan fehérjékből származó két nukleinsav- vagy aminosav-szekvencia közötti azonosság vagy megfelelőség mértéke, amelyek nem közös evolúciós eredetűek (lásd Reeck és mtsai., mint fent). Azonban általános használatban és a leírásban a „homológ” kifejezés, ha határozószóval módosítva van (például „nagymértékben”), szekvencia-hasonlóságra utalhat és nem közös evolúciós eredetre.

Két DNS-szekvencia abban az esetben „lényegében homológ” vagy „lényegében hasonló”, ha a nukleotidok legalább körülbelül 50%-a (előnyösen legalább körülbelül 75%-a, és legelőnyösebben legalább körülbelül 90%-a, 95%-a vagy 99,9%-a) megegyezik a definiált hosszúságú DNS-szekvencián. Lényegében homológ szekvenciákat úgy lehet azonosítani, hogy a szekvenciákat összehasonlítjuk szekvencia-adatbankokban rendelkezésre álló, standard szoftverek alkalmazásával, vagy Southem-hibridizációs kísérletet végzünk például az adott rendszerre definiált, sztringens körülmények között. Megfelelő hibiridizációs körülmények meghatározása szakember számára ismert. Lásd például Maniatis és munkatársai, mint fent; „DNA Cloning”, I. és II. kötet (mint fent); „Nucleic Acid Hybridization” (mint fent).

Ehhez hasonlóan, két aminosav-szekvencia abban az esetben „lényegében homológ” vagy „lényegében hasonló”, ha az aminosavak több, mint 30%-ban azonosak, vagy körülbelül több, mint 60%-ban hasonlóak (funkcionálisán azonosak). Hasonló vagy homológ szekvenciákat egymás alá rendezéssel lehet azonosítani, például a GCG (Genetics Computer Group, „Program Manual for the GCG Package”, 7. verzió, Madison, Wis.) „pileup” program alkalmazásával.

A „megfelel kifejezés a leírásban hasonló vagy homológ szekvenciákat jelent, függetlenül attól, hogy konkrét pozíciók azonosak vagy különbözőek ahhoz a molekulához képest, amelyhez a hasonlóságot vagy homologiát mérjük. Tehát a „megfelel” kifejezés szekvencia-hasonlóságra utal, és nem az aminosavak vagy nukleinsav-bázisok számozására.

Az eredményül kapott mutánsok és eljárások akár 1,3:1, és tipikusan 0,9:1 szukcinát/tápanyag arányt eredményeznek. Eszerint 60 g/1 és 75 g/1 szukcinát-felhalmozódást értünk el. Az eljárás időtartama tipikusan több, mint 70 óra, és rendszerint 120 és 170 óra között van. Például 70 g/1 hozamot 160 óra után értünk el. Az eljárás működőképes körülbelül 25°C és 45°C között, előnyös hőmérséklet-tartomány körülbelül 30°C és 39C között van. A pH 5 és 9 között megfelelő, előnyösebb pH-tartomány körülbelül 6,1 és 7,2.

A találmány szerinti mutánsok különösen életképes komponensei a fermentációs eljárásnak, amennyiben fokozott mértekben toleránsak a fermentáció termékeivel szemben. Például 72 g/1 szukcinát, 22 g/1 acetát

-614 g/1 etanol és 8 g/1 laktát érhető el feedback gátlás nélkül.

Tápanyag részletes leírása

A találmány szerinti eljárás és mutáns kimagasló jelentősége abban áll, hogy közvetlenül használ fel ipari tápanyagokat. Rengeteg tápanyagot lehet használni, például közönséges vizet, különböző hidrolízis-eljárásokkal előállított lignocellulóz-hidrolizátumot, kukoricából származó cukor-oldatokat (például kukoricalekvárt), savóból származó laktózt és más, ipari minőségű cukrokat. Például lignocellulóz-hidrolizátumot tömény savas hidrolízissel vagy híg savas hidrolízissel, enzimes hidrolízissel állítanak elő vagy az említett eljárások kombinációjával előállított hidrolizátumok mind alkalmasak. Kukoricából származó cukor-oldatok is alkalmasak.

Ipari tápanyagok általában glükózból és más cukrokból álló keverékek, a legelterjedtebben alkalmazott nem-glükóz tápanyag a xilóz. A 2. ábrán bemutatjuk glükóz és xilóz alkalmazását az egyik találmány szerinti mutánssal.

A fentiek fényében bármilyen, glükózt és/vagy nem-glükóz cukrot tartalmazó tápanyag alkalmas. így glükózt, szorbitolt, xilózt, arabinózt, mannózt, laktózt, glükuronsavat, galaktózt, fruktózt, vagy kombinációikat tartalmazó tápanyagok alkalmasak.

Organizmus részletes leírása

A találmány szerinti eljárásban olyan organizmusokat alkalmazunk, amelyek módosításokat tartalmaznak az organizmusok katabolit repressziós rendszerében. Konkrétan azt találtuk, ha a baktériumok foszfotranszferáz- (pts) rendszerében, piruvát-formiát-liáz- (pfl) rendszerében és laktát-dehidrogenáz-(ldh) rendszerében módosítások vannak, ezek a baktériumok alkalmasak a találmány szerinti borostyánkősav-termelő eljárásban történő alkalmazásra. A pflAB és IdhA azokat a géneket jelenti, amelyek piruvát-formiát-liázt és fermentatív tejsav-dehidrogenázt kódolnak, sorrendben.

Tehát, a találmány szerinti fermentációs eljárásban alkalmazott organizmus-típus egyetlen korlátja az, hogy az organizmusnak eredetileg tartalmaznia kell ezeket a rendszereket. Olyan organizmust lehet alkalmazni, amelyben természetes körülmények között módosulások vannak ezekben a rendszerekben (azaz spontán mutánsok), vagy olyan organizmusokat, amelyek specifikusan meg vannak változtatva.

Azokban az esetekben, amelyekben a baktériumok meg vannak változtatva, borostyánkősav termelésére kis hozamokban (azaz 0,5 mólnál kevesebb borostyánkösavat képesek termelni egy mól növekedési szubsztrátra vonatkoztatva) vagy egyáltalán nem képes, fermentációra alkalmas baktériumokat átalakítunk olyan baktériumokká, amelyek magas hozamokban képesek borostyánkősavat termelni (azaz 1 mólnál több vagy 1 mól borostyánkősavat képesek termelni egy mól növekedési szubsztrátra vonatkoztatva).

Bármilyen olyan baktérium szóba jöhet alkalmas transzdukciós jelöltnek, amely bármilyen mennyiségű borostyánkősav fermentációs termelésére képes, például gram-negatív és gram-pozitív fermentációs baktériumok. Előnyösen alkalmas törzsek lehetnek például E. coli, Klebsiella, Erwinia és Lactobacillus törzsek.

A három knockout” kialakítása céljából megváltoztatott organizmusok sorozatos transzdukcióval vannak módosítva Pl-bakteriofág alkalmazásával. Standard P1-transzdukciós eljárásokat alkalmaztunk, például az alábbi hivatkozásban leírtak szerint: J. H. Miller (szerk.), „Experiments in Molecular Genetics” [Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972)], és amelyet a kitanítás részének tekintünk. A módszer alkalmazásával vad típusú és közel vad típusú baktérium-törzseket (például a C600-jelű E. coli törzset, ATCC nyilvántartási száma 23724.) lehet alkalmazni olyan mutáns altörzsek előállítására, amelyekből hiányzik egy, kettő vagy három funkcionális gén pfl, Idh és ptsG közül.

-7A “gén knockout” kifejezésen egy olyan eljárást értünk, amelyben egy sejtben lévő adott gén expresszióját némává alakítjuk. A némává alakítási eljárás lehet például gén-megcélzás vagy antiszensz blokkolás. A gén-megcélzás egy olyan eljárást jelent, amelyben egy nukleinsavkonstrukciót beviszünk egy sejtbe egy célgénnel való rekombináció céljából. A nukleinsavkonstrukció inaktiválja a megcélzott gént. Az inaktiválás történhet terminációs kódon bevitelével egy kódoló régióba, vagy repressziós hely bevitelével egy szabályzó szekvenciába. Antiszensz blokkolás azt jelenti, hogy egy sejtbe beviszünk olyan expressziós szekvenciákat, amelyek antiszensz RNS szintézisét vezérlik egy célgén expressziójának blokkolása céljából. Antiszensz RNS a célgén mRNS-éhez képes hibridizálódni, ezáltal expressziót blokkol.

Három mutációt tartalmazó, a találmány szerinti megoldásban alkalmazható egyik E. coli törzs jelölése például AFP 184 (ATCC nyilvántartási száma PTA 5132, 2003. április 9-én lett deponálva) (AFP jelentése “alternatív tápanyag program”). AFP 184 a pfl-deléciót, ldh-knockout-ot és ptsG eltérő mutáns formáját tartalmazza, ami tervszerűen inszertálva lett egy közel vad típusú E. coli törzsbe. Egy másik törzs jelölése AFP 415, amelyet szintén lehetett alkalmazni. AFP 184-hez hasonlóan működik.

Meglepő és váratlan módon azt találtuk, hogy AFP 184 és AFP 415 metabolizmus értéke és titere felülmúlta a W1485-származékokét, melyeket az 5,770,435. számú (jelenleg újravizsgált, No. 09/429,693. számú bejelentés) és 6,159,738. számú USA-beli szabadalmi leírásban közölnek.

Az 1. táblázatban összehasonlítjuk a borostyánkősav-termelés mértékét AFP 184 és egy W1485-származék (AFP 111) alkalmazásával. Figyelemre méltó, hogy míg a W1485-származék meglehetősen finomított tápanyagot használ, AFP 184-eI magasabb értékeket lehet elérni még ipari minőségű hidrolizátumokkal is.

Mindhárom „knockout”-ot tartalmazó mutációt a genetikai anomáliák közül már egyet vagy kettőt tartalmazó baktérium felhasználásával is elő lehet állítani, és azután indukálni lehet a fennmaradó, egy vagy két „knockout”-ot. Ebben az esetben életképes kiindulási organizmus a W1485, melynek ATCC nyilvántartási száma 12435. AFP 400 (ATCC nyilvántartási száma PTA 5583, 2003. október 10-én lett deponálva) egy tervszerűen előállított, hármas „knockout”. Tartalmazza a pfl-deléciót, amit August Bock végzett, és David Clark (University of Illinois) inszertálta W1485-be, így előállította az FMJ123-at. FMJ123-t P. K. Bunch és munkatársai [Microbiology 143, 187-195 (1997)] által leírt eljárás szerint állítottunk elő, amelyet a kitanítás részének tekintünk. AFP 400 „knockout” IdhA-t is tartalmaz, és FMJ123-ba inszertáltuk, előállítva DC1327-et. DC1327-et Chatterjee és munkatársai [Appl. Environ. Microbiol. 67, 148-154] által leírt eljárás szerint állítottunk elő, az eljárást a kitanítás részének tekintjük. AFP 400 tartalmazza a „knockout” ptsG-gént, Chatterjee és munkatársai (mint fent) által leírtak szerint.

1. táblázat: Borostyánkősav-termelés mértékének összehasonlítása különböző E. coli sejtvonalakra

Törzs	Max. koncentráció	Max. termelékenység	Hozam (g/g glükóz)
AFP 111	51g/l	0,87 g/lh	0,70
AFP 184	72 g/1	1,00 g/lh	1,00

Hármas „knockout” AFP404-törzset (ATCC nyilvántartási száma PTA 5133, 2003. április 9-én lett deponálva) elő lehet állítani úgy is, hogy három „knockout”-ot beviszünk C600-törzsbe. AFP404 hasonló AFP 184-hez, de inkább „knockout” ptsG-t tartalmaz, mint a gén pontmutációját. Szintén termel borostyánkősavat körülbelül 1 mól hozamban 1 mól glükózra vonatkoztatva.

-8A vad törzsből kiindulva, hármas mutáció kifejlesztésére szolgáló módszer leírtak R. Chatterjee és munkatársai is. Az egyes „knockout”-ok jelenlétét jelző, tipikus antibiotikum-markerek például Cam, Tét és Kan. így olyan új E. coli törzseket, AFP 400-at és AFP 404-et állítottunk elő, amelyek a „knockout”-okat és az antibiotikum-markereket tartalmazták. Az eljárás az alábbi:

Inszerciósan inaktivált ptsG-gén előállítása és bevitele

E. coliból származó natív ptsG-gént klónoztunk PCR-el, W1485-ből preparált genomi DNS-böl, a fehérje N- és C-terminálisát megcélzó láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, amelyben további genomi szekvenciákat nem amplifikáltunk. A gént a pFJl 18EH-vektorba klónoztuk, így jutottunk a pJFptsG-hez. A gént megszakítottuk pUC-4K-jelű, kanamicin-rezisztencia kazetta (Pharmacia) inszerciójával úgy, hogy EcoRI-enzimmel hasítottunk, és pJFptsG-ben lévő ptsG-gén Mfel-hasítóhelyébe inszertáltuk, így jutottunk a pTSGKplazmidhoz. Mivel NZY 111 már tartalmazott kanamicin-rezisztencia markert, előállítottunk egy ekvivalens törzset úgy, hogy SE1752-törzsből származó, TnlO-inaktivált IdhA-gént transzdukáltunk FMJ123-ba. Az eredményül kapott DC1327-törzs fiziológiájában nem volt megkülönböztethető NZN 111-től. A megszakított ptsGgent DC1327-be vittük úgy, hogy a sejteket pTSGK-val transzformáltuk, a sejteket körülbelül 30 generáción át növesztettük kanamicin jelenlétében és ampicillin nélkül, azután a tenyészetet glükózt tartalmazó LB-tálcákra szélesztettük, és anaerob körülmények között inkubáltuk. Azokat a telepeket, amelyek fermentációban képesek voltak növekedni, tisztítottuk, és szkríneltük érzékenységüket a két antibiotikumra, melyet részletesen ismertetünk lentebb, a példákban.

Az AFP400-törzset stabil kanamicin-rezisztens és ampicillin-érzékeny törzsként izoláltuk, amely glükózt fermentált szukcináttá, acetáttá és etanollá. A megszakított gén megfelelő integrációját PCR-el igazoltuk. A megszakított gént AFP400-DNS-ből amplifikáltuk olyan láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, amelyek a gén kódoló régióján kívül elhelyezkedő szegélyező szekvenciáknak feleltek meg, körülbelül 110 bázisbár hoszszan. Ezek a szekvenciák nem voltak jelen az integrációs vektorban. Az eredményül kapott termék 3,0 kb méretű volt, amely várható volt ptsG ismert szekvenciája, a szegélyező szekvenciái és a kanamicin-inszert alapján. A terméket Clal-enzimmel (hasítóhely a kanamicin-kazettában) és Agel-enzimmel (hasítóhely ptsG-ben) emésztettük, és olyan fragmenseket állítottunk elő (1,95 és 1,05 kb Clal-enzim esetén, és 2,3 és 0,7 kb Agel-enzim esetén), amelyek várhatóak voltak az alapján, hogy a kazetta ptsG Mfel-hasítóhelyébe lett inszertálva.

Még egy másik, a három „knockout”-ot tartalmazó törzset is (AFP 404) származtattunk egy közel vad típusú E. coli K12-törzsből, ugyancsak a fentebb leírt eljárást követve.

A „knockout”-ok helye már ismert volt előző kutatásunk alapján (6,159,738. számú USA-beli szabadalmi leírás, és Chatterjee és mtsai.), melyet fentebb tárgyaltunk. A „knockout”-_okat úgy vittük be, hogy sejtek transzformálására egy kópia „knockout” gént alkalmaztunk, amely rezisztencia-markerrel rendelkezett. Hagytuk, hogy végbemenjen homológ rekombináció, melyet a gazdaszervezet enzimei végeztek. Azután kiszelektáltuk a markert tartalmazó kromoszómát. A ptsG „knockout”-ot vittük be ezen a módon. Az inszerciót PCR-el igazoltuk, melynek részletes leírása megtalálható Chatterjee és munkatársai közleményében, melyet már a kitanítás részének tekintettünk.

A növesztés részletei

A találmány szerinti, háromszoros mutáns organizmusok nem obiigát anaerobok. Mint ilyenek, a biomassza kezdeti felhalmozása aerob körülmények között történik, azután fermentációs körülményeket hozunk létre. Az ilyen kétfázisú (azaz aerob, azután anaerob) eljárás előnyeit a 2. ábrán szemléltetjük, amelyen látható,

-9hogy a borostyánkösav termelésének mértéke sokkal nagyobb ahhoz képest, amit az 1. ábrán bemutatott, egyfázisú eljárás növekedési görbéje mutat.

Általában, ha a biomassza elér egy értéket, ami megfelel körülbelül 10⁸ és 10¹¹ sejt/milliliter közötti értéknek (vagy körülbelül 2-5 gramm száraz sejttömegnek literenként), a fermentort átváltjuk anaerobbá. A laboratóriumban ezt a koncentráció-értéket körülbelül hat óra után értük el.

Ipari eljárásokban a fermentort vízzel és lignocellulóz-hidrolizátummal töltöttük fel. Szükséges esetben hozzáadtunk antibiotikumokat az alábbi koncentrációkban: 100 pg/ml karbenicillin, 30 pg/ml kanamicin, 10 Mg/ml tetraciklin és 30 gg/ml klóramfenikol. Gazdag tápközeg 10 g triptont, 5 g nátrium-kloridot és 1 g élesztőkivonatot tartalmazott literenként. A szilárd táptalaj tenyésztötálcákon 1,5 tömeg% Difco Bacto-Agart tartalmazott. Minimális E-tápközeget Vogel HJ [J. Biol. Chem. 218, 97-103 (1956)] által leírtak szerint készítettünk, és a kitanítás részének tekintjük.

A fermentáció laboratóriumi körülményei az alábbiak voltak:

A fermentációs növesztést lezárt szérum-csövekben végeztük, amelyek 0,5 g magnézium-karbonáttal (a tápközeg pH-jának fenntartása céljából adagoltuk a fermentáció alatt), antibiotikumokkal és körülbelül 10 g/1 glükózzal kiegészített LB-tápközeget tartalmaztak. Igen sokféle növekedési szubsztrátot lehet alkalmazni, például cukrokat, cukor-alkoholokat, cukor-savakat és ezek kombinációit. Az alábbi cukrokat teszteltük glükóz helyett 5 g/1 koncentrációban anaerob növekedési körülmények között: trehalóz, mannóz, fruktóz, szorbitol és glükuronsav.

Az anaerob folyékony tenyészethez inokulumokat úgy készítettünk, hogy a törzseket aerob körülmények között növesztettük egy éjszakán át antibiotikumokkal kiegészített LB-tápközegben. Egy éjszakán át fenntartott tenyészetből vett mintát 100-szor hígítottunk friss tápközegben, és aerob körülmények között növesztettük, amíg a 600 nm-en mért abszorbancia elért körülbelül 1 -et; az anaerob növesztés! tápközeget 1 ml inokulummal oltottuk be.

Mintákat vettünk anoxiálisan a lezárt csövekből alkalmasan megválasztott időközönként a maradék glükóz (vagy alternatív cukor-szubsztrátok) és a képződött fermentációs termékek mennyiségének vizsgálatára. Szilárd táptalajon végzett, anaerob növesztés céljából agar-tálcákat 37°C-on inkubáltunk anaerob tartályban hidrogén/szén-dioxid-atmoszférában, melyet „Gas-Pak” berendezés alkalmazásával hoztunk létre.

A β-galaktozidáz-aktivitás vizsgálatára tenyésztötálcás vizsgálati eljárást alkalmaztunk annak tesztelése céljából, hogy jelen van-e a törzsekben normál katabolit represszió. Számos táptalaj közül kettőt, LB- vagy E-agar-táptalajt („Medium E agar”) lehet alkalmazni. Az E-agar-táptalaj egy általánosan alkalmazott minimáltáptalaj, Vogel, H. J. [J. Bioi. Chem. 218, 97-103 (1956)] által tárgyaltak szerint, melyet a kitanítás részének tekintünk. Egy példaként bemutatott eljárásban agarban LB- vagy E-táptalajt kiegészítettünk 4 g/1 glükózzal, 4 g/1 laktózzal, 3 mg/1 5-bróm-4-klór-3-indolil-P-D-galaktoziddal (X-gal) és antibiotikumokkal. Ezeket a táptalajokat a továbbiakban X-gal/glükóz-agamak jelöltük. Kék telepek képződése β-galaktozidáz expressziójára utalt glükóz jelenlétében, normál katabolit represszió hiánya miatt. Ezzel ellentétben, fehér telepek képződése normál katabolit represszió meglétére utalt, tehát nincs olyan enzim jelen, amely a diszacharid-laktózt hasítására képes.

Kifejlesztettünk egy eljárást a mutáns alkalmazására folyamatos üzemben is. Ebben a folyamatos üzemű eljárásban ismételt kísérleteket végeztünk, amelyekben ha a tenyészet körülbelül 50 g/1 borostyánkősavat termelt, egy milliliter keveréket adagoltunk egy frissen lezárt, LB-tápközeget, glükózt és magnézium-karbonátot tartalmazó edénybe. Ez az új inokulum ezután folyamatosan termelt hatékonyan borostyánkősavat. Ezt az

- 10eljárást 3-4-szer megismételtük, ez minden esetben hatékony borostyánkösav-termelést eredményezett.

1. példa

Borostyánkősav termeltetése ipari hidrolizátum felhasználásával

AFP 184 törzset adagoltunk egy fermentorba rizsszalmából származó, valódi hidrolizátummal. Egy példaként bemutatható hidrolizátumot tömény savas hidrolízis-eljárással állítanak elő ipari méretben, az Arkenol Inc. (Mission Viejo, Calif.) cég forgalmazza. A rizsszalma-tápközeg két fő cukor-komponensként körülbelül 600 g/1 glükózt és 169 g/1 xilózt tartalmaz, plusz kisebb mennyiségben más cukrokat. A kísérleti adatokat megtalálhatjuk a 2. táblázatban és a 2. ábrán.

Az AFP 184-re alapuló fermentációs eljárás az alábbi: A fermentációs tápközeg az alábbi komponenseket tartalmazta: Difco élesztőkivonat 5 g/1, tripton 10 g/1, ammónium-szulfát 2 g/1, magnézium-szulfát (MgSO₄x7H₂O) 0,2 g/1, nátrium-klorid 10 g/1, dikálium-hidrogén-foszfát 7 g/1, kálium-dihidrogén-foszfát 3 g/1, Arkenol-fele hidrolizátum 16,5 ml/1 és kanamicin 30 mg/1. Az ipari hidrolizátum két fő cukor-komponensként 607 g/1 glükózt és 169 g/1 xilózt tartalmazott, továbbá kisebb mennyiségekben más cukrokat. A tápközeget az antibiotikum kivételével minden komponensével 121°C-on, 20 percig autoklávoztuk. Majd a kanamicint lehűlés után adtuk hozzá. Ezt a fermentációs tápközeget alkalmaztuk az inokulum-lombikokban és az 1 literes fermentorokban is. Az inokulumhoz 50 ml tápközeget adagoltunk egy 250 ml-es lombikba, és beoltottuk 0,2 ml AFP 184 törzs-tenyészettel, amelyet 30% glicerinben és -70°C-on tartottunk. A lombikot inkubátor-rázógépen inkubáltuk 37°C-on és 250 rpm-en egy éjszakán át (körülbelül 16 óra hosszáig). Azután a lombik teljes tartalmával beoltottuk a fermentort, amelynek hőmérsékletét 37°C-on tartottuk. A fermentorban lévő tápközeget olyan mértékben levegőztettük, hogy lehetővé váljon az organizmus gyors növekedése. Hat óra elteltével, amikor elértük a kívánt sejttömeget, elvégeztük az alábbiakat: 1. A levegőt lekapcsoltuk anaerob körülmények kialakítása céljából, amely borostyánkösav-termelést iniciál; 2. szén-dioxid gázt vezettünk a tápközegbe 0,03 mg/perc sebesseggel; es 3. ratápláló oldatot adagoltunk a fermentorba, amely ioncserélt vízzel hígított, összesen 500 g/1 glükózt és xilóxt tartalmazó Arkenol-féle hidrolizátumot tartalmazott, így a fermentorban lévő tápközegben a össz-cukor koncentrációja elérte az 50 g/l-t. A kísérlet alatt, ha a cukor koncentrációja a fermentorban alacsony volt, több rátáplálást adtunk, hogy elegendő szubsztrát álljon rendelkezésre borostyánkősav termeléséhez. Amint a sejtek elkezdtek termelni borostyánkősavat, a pH leesett. Ezt 6,5 értéken tartottuk 1,5 M nátrium-karbonát-oldat hozzáadásával, melyet automata pH-szabályzóval végeztünk. Mintákat vettünk bizonyos időközönként, és vizsgáltuk azokat optikai sűrűségre, glükózra, xilózra, borostyánkösavra, ecetsavra, tejsavra és etanolra.

2. táblázat: Borostyánkősav, ecetsav és etanol termeltetése Arkenol-féle hidrolizátumból ptsG-, Idh- és pfl anomáliákat tartalmazó mutáns alkalmazásával

Idő	glükóz	xilóz	borostyánkösav	ecetsav	etanol
0	7,04	1,94	0	0	1,60
2	6,85	1,53	0	0,41	1,35
4,2	4,41	0	0	0,85	1,13
6	0	0	0	0,55	1,04
6,05	29,27	7,17	0	0	0,68
24	9,56	1,69	26,12	2,24	0,49
24,05	27,25	5,60	26,39	2,82	0,72
28,1	23,7	14,69	28,42	2,98	0,71
29,5	22,8	14,17	27,20	3,04	0,67
29,55	34,77	7,95	26,41	2,63	0,52
48	20,98	4,72	37,98	3,71	0,62
54	19,13	4,30	43,82	4,10	0,71
54,05	46,73	10,85	43,51	3,69	0,59
72	35,14	8,85	48,52	4,01	0,63
80	33,60	8,45	51,44	4,10	0,50
104,25	23,02	7,20	50,99	4,64	0
120	19,73	6,77	54,12	4,83	0
192	13,04	5,87	63,21	4,88	0

2. példa

Borostyánkősav-termelés szintetikus cukor-keverékből

Kifejlesztettünk egy fermentációs eljárást AFP 184 alkalmazásával, szintetikus cukor-tápanyag kombinációjával. A 3. ábrán bemutatottak szerint, a borostyánkősav-termelés mértéke gyorsan növekedett a 80. óráig, és plató jellegű lett, mielőtt elért 60 g/1 végkoncentrációt körülbelül 140 óra elteltével.

A fermentációs tápközeg az alábbi komponenseket tartalmazta: Difco élesztőkivonat 5 g/1, tripton 10 g/1, ammónium-szulfát 2 g/1, magnézium-szulfát (MgSO₄x7H₂O) 0,2 g/1, nátrium-klorid 10 g/1, dikálium-hidrogén-foszfát 7 g/1, kálium-dihidrogén-foszfát 3 g/1, glükóz 7,6 g/1, xilóz 1,85 g/1 és kanamicin 30 mg/1. A tápközeget az antibiotikum kivételével minden komponensével 121°C-on, 20 percig autoklávoztuk. Majd a kanamicint lehűlés után adtuk hozzá. Ezt a fermentációs tápközeget alkalmaztuk az inokulum-lombikokban és az 1 literes fermentorokban is. Az inokulumhoz 50 ml tápközeget adagoltunk egy 250 ml-es lombikba, és beoltottuk 0,2 ml AFP 184 törzs-tenyészettel, amelyet 30% glicerinben és -70°C-on tartottuk. A lombikot inkubátor-rázógépen inkubáltuk 37“C-on és 250 rpm-en egy éjszakán át (körülbelül 16 óra hosszáig). Azután a lombik teljes tartalmával beoltottuk a fermentort, amelynek hőmérsékletét 37°C-on tartottuk.

A fermentorban lévő tápközeget olyan mértékben levegőztettük, hogy lehetővé váljon az organizmus gyors növekedése. Hat óra elteltével, amikor elértük a kívánt sejttömeget, elvégeztük az alábbiakat:

1. A levegőt lekapcsoltuk anaerob körülmények kialakítása céljából, amely borostyánkősav-termelést iniciál;

2. Szén-dioxid gázt vezettünk a tápközegbe 0,03 mg/perc sebességgel; és

3. Rátápláló oldatot adagoltunk a fermentorba, amely 400 g/1 glükózt és 84 g/1 xilózt tartalmazott, így a fermentorban lévő tápközegben a össz-cukor koncentrációja elérte az 50 g/l-t.

A kísérlet alatt, ha a cukor koncentrációja a fermentorban alacsony volt, több rátáplálást adtunk, hogy elegendő szubsztrát álljon rendelkezésre borostyánkősav termeléséhez. Amint a sejtek elkezdtek termelni borostyánkősavat, a pH leesett. Ezt 6,5 értéken tartottuk 1,5 M nátrium-karbonát-oldat hozzáadásával, melyet automata pH-szabályzóval végeztünk. Mintákat vettünk bizonyos időközönként, és vizsgáltuk azokat optikai sűrűségre, glükózra, xilózra, borostyánkősavra, ecetsavra, tejsavra és etanolra.

A 3. táblázatban és a 3. ábrán szemléltetjük borostyánkősav termelését, amely a szintetikus cukor-keverék alkalmazásának eredménye.

Megjegyezhetjük az 1. példa és a 2. példa összehasonlítása alapján, hogy a mutáns borostyánkősav-termelése azonos mértékű volt ipari hidrolizátum alkalmazásával és szintetikus tápanyag alkalmazásával (lásd a 120. és 122. időpontot a 2. táblázatban és a 3. táblázatban, sorrendben). Az eredmények szemléltetik a találmány szerinti eljárás erőteljes jellegét annyiban, hogy bármilyen olyan toxikus anyag, amit ipari minőségű hidrolizátumok eleve tartalmaznak, nem rontja a hozamot.

3. táblázat: Borostyánkősav-termelés szintetikus cukrot alkalmazó fermentációs eljárásban

Idő	glükóz	xilóz	szukcinát	acetát
0	7,65	1,85	0	0
2	7,19	1,03	0	0,32
4,2	3,15	0	0	1,1
4,45	6,03	0,84	0	1,1
6	1,04	0	0	2,02
6,25	40,2	7,57	0	2,02
24	7,76	3,92	24,55	3,43
30	9,18	2,63	29,34	4,11
30,25	39,3	8,2	29,34	4,11
48	18,6	5,5	39,8	4,6
54	14,8	4,95	42,33	5,26
54,25	27,4	8,1	40,77	4,9
72	19,7	6,04	48,33	5,76
78	17,6	5,42	50,27	6
78,25	35,5	9,49	48,87	5,75
96,5	30,2	8,25	53,62	5,87
122	24,1	6,48	55,1	5,87
144	22,8 ...	5,67	59,35	5,43
A találmány szerinti megoldást	a találmány előnyös megvalósítási módjána	k szemléltetett részle	tes lei-

rasaval ismertettük, azonban anélkül, hogy a csatolt szabadalmi igénypontok által meghatározott oltalmi kört ezekre a részletekre korlátoznánk.

Claims (14)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás borostyánkősav előállítására ipari minőségű hidrolizátumokból, azzal jellemezve, hogy

   a) biztosítunk ptsG-, pflB- és IdhA-génekre mutációkat tartalmazó organizmust;

   b) lehetővé tesszük, hogy az organizmus felhalmozzon biomasszát; és

   c) lehetővé tesszük, hogy az organizmus metabolizálja a hidrolizátumot.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli-t, Klebsiella, Erwinia vagy Lactobacillus nemzetséghez tartozó organizmust alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintegy 10⁸ és 10 közötti sejt/milliliter biomassza felhalmozását tesszük lehetővé.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ipari minőségű hirdrolizátumként lignocellulóz-hidrolizátumot vagy kukoricából származó cukor-oldatokat alkalmazunk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintegy 25°C és 45°C közötti hőmérsékletet alkalmazunk.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biomassza felhalmozását aerob atmoszférában tesszük lehetővé.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintegy 5 és 9 közötti pH-t alkalmazunk.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrolizátumot az első részlet tápanyag tartalmazza, és az eljárást folyamatosan fenntartjuk a második részlet tápanyag adagolásával.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második részlet tápanyagot akkor adagoljuk, ha a borostyánkősav koncentrációja mintegy 50 g/1.
10. 10. Baktérium-mutáns, amely borostyánkősavat termel ipari minőségű hidrolizátumot tartalmazó szubsztrátból 0,6:1 és 1,3:1 borostyánkősav/szubsztrát-arányban.
11. 11. A 10 igénypont szerinti mutáns, amely szubsztrátként az alábbi cukrokból kiindulva termel borostyankosavat: glükóz, laktóz, szorbitol, xilóz, arabinóz, mannóz, glükuronsav, galaktóz, fruktóz vagy ezek kombinációja.
12. 12. A 10 igénypont szerinti mutáns, amely nem-működőképes foszfotranszferáz rendszert, nem-működőképes piruvát-formiát-liáz-rendszert és nem-működőképes tejsav-dehidrogenáz-rendszert tartalmaz.
13. 13. A 10 igénypont szerinti mutáns, amelyben a nem-működőképes foszfotranszferáz-rendszer egy pontmutáció eredménye.
14. 14. A 10 igénypont szerinti mutáns, amely egynél több szubsztrátot képes szimultán felhasználni borostyánkösav egyidejű termelésére.

    A meghatalmazott:

    DANUBIA

    Szabadalmi és Védjegy Iróda Kft.