HUP0402029A2 - Peptidalapú multimer célzott kontrasztanyagok - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya peptidalapú multimer célzott kontrasztanyagok,eljárás a kontrasztanyagok előállítására és alkalmazásuk. Ó

Description

alkalmazásuk.

Peptid-alapú multimer célzott kontrasztanyagok 7

A jelen találmány a 2001. július 30-án benyújtott, 60/308721 alapszámú USA provizórikus szabadalmi bejelentés elsőbbségét igényli.

A találmány tárgya diagnosztikus leképezésre alkalmas kontrasztanyagok, közelebbről peptid-célzott, multimer kontrasztanyagok, ahol a pepiid célzócsoportként működik, és a peptid amino- és karboxil-végén egy vagy több kelát kapcsolódási pontjaként játszik szerepet.

Több év óta használják az orvosi diagnózisban a diagnosztikai leképező módszereket, például a mágneses rezonancia leképezést (MRI), a röntgensugarat, a nukleáris radiogyógyászati leképezést, az ultraibolya-látható-infravörös fény leképezést és az ultrahangot. Ezenkívül a kontrasztanyagokat arra is használták, hogy javítsák vagy növeljék a képfelbontást, vagy speciális diagnosztikai információt nyújtsanak.

Ahhoz, hogy hatékonyságot érjünk el, a kontraszt médiumoknak interferálni kell a leképezési technikában használatos elektromágneses sugárzás hullámhosszával, meg kell változtatni a szövet fizikai tulajdonságait, hogy megváltozott jelet kapjunk, vagy ahogy a radiogyógyszerek esetében, magának a sugárzásnak a forrását kell előállítani. Az MRI és az optikai módszerek a leképezési módszerek szerint egyediek, amennyiben a kémiai környezetre érzékeny komplex jeleket szolgáltatnak. Míg a röntgensugárból vagy a radionuklid szerekből származó jel ugyanaz marad függetlenül attól, hogy a szerek a plazmában szabadok vagy fehérjékhez vagy egyéb célpontokhoz kötődnek, vagy a csonton belül fogva maradnak, bizonyos MRI kontrasztanyagok és az optikai leképezéshez szolgáló kontrasztanyagok a változó fiziológiai környezetben különböző jeleket mutatnak. Fontos, hogy a kontrasztanyag elég érzékeny legyen, és jelen legyen elég nagy koncentrációban ahhoz, hogy megfigyelhetők legyenek a jelváltozások.

Gadolinium vagy egyéb paramágneses ionok és szerves ligandumok komplexeit széles körben alkalmazzák az MRI kontraszt növelésére és javítására. A gadolinium komplexek azáltal növelik a kontrasztot, hogy megnövelik a vízmolekulákban található protonok nukleáris mágneses relaxációs sebességét, melyek a kontrasztanyagok számára hozzáférhetők az MRI alatt (Caravan, P. és tsai, ELET Chem. Rév. 99, 2293 (1999)). Ezekben a vízmolekulákban levő protonok relaxációs sebessége nő a kontrasztanyag számára nem hozzáférhető egyéb vízmolekuAktaszámunk: 100077-2444F KY/hzs

-2 Iákban levő protonokéhoz képest. A relaxációs sebességnek ez a változása vezet a képek jobb kontrasztjához. Ezenkívül a relaxációs képesség növelése a vízmolekula protonok speciális populációján belül olyan eredményhez vezethet, hogy megnő az a képesség, amellyel adott időn belül több leképezési adat gyűlhet össze. Ez viszont javítja szignál és zaj egymáshoz viszonyított arányát.

A leképezést végezhetjük fény segítségével is, ez esetben a szignál előállításához optikai festéket választunk. Különösen a 600-1300 nm tartományon belüli fény (láthatótól a közel infravörösig terjedő tartományon belül) viszonylag könnyen hatol keresztül a biológiai szöveteken, és leképezési célokra használható. Kimutatjuk az áthatoló, a szórt, a visszatükrözött vagy újra kibocsátott fényt (fluoreszcencia), és képet generálunk. A festék abszorbanciájában, reflektanciájában vagy fluoreszcenciás jellegzetességeiben változások, beleértve az abszorbancia csúcsok számának növekedését vagy csökkenését, vagy a hullámhossz maximumok változását, léphetnek fel biológiai célponthoz való kötődés hatására, és így további szövetkontrasztot kapunk. Bizonyos helyzetekben, például a test felületéhez közeli betegség diagnózisánál használhatunk UV vagy látható fényt is.

Szükség van olyan kontrasztanyagokra, amelyek elegendő leképezési csoport koncentrációt juttatnak a célhoz a leképezési eljárás érzékenységének javítására, és szükség van in vivo elegendő felezési idővel rendelkező kontrasztanyagokra is.

A találmány alapja peptidek vagy peptid-célzott, multimer kontrasztanyagok MR-hez, optikai és radionuklid leképezéshez, ahol egyetlen peptid működhet célzócsoportként is, és mind a nitrogén-, mind a szénvégen egy vagy több kelét kapcsolódási pontjaként is, közvetlenül vagy adott esetben beavatkozó linker útján. Meglepő módon a találmány szerinti kontrasztanyagok kötődési affinitást tartanak fenn biológiai célpontok iránt, például fibrin iránt, és nagyfokú relaxivitást mutatnak. A találmány szerinti szerek elegendő felezési idővel rendelkeznek in vivo adagolás után úgy, hogy hatékony leképezési vizsgálatokat lehet végrehajtani.

A találmány tisztított peptidekre vonatkozik, amelyek magukban foglalják a következő aminosav szekvenciát: P* - Y* X/ - L* (SEQ ID NO:1), ahol P* jelentése prolin vagy nem természetes származéka; Y* jelentése tirozin vagy nem természetes származéka; Xi* jelentése G vagy D vagy nem természetes G- vagy Dszármazék; L* jelentése leucin vagy nem természetes származéka; és ahol lega

-3lább P*, Y*, ΧΓ és L* közül az egyik a megfelelő aminosav nem természetes származéka. ΧΓ lehet G vagy D, és L* lehet leucin. Bizonyos változatok szerint P* prolin vagy 4-hidroxi-prolin, és Y* tirozin vagy nem természetes tirozinszármazék, amely a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált. A találmány szerinti vegyületekhez tartoznak például a trombolitikus szerhez kapcsolódó peptidek.

Egy további változat szerint a találmány az alábbi aminosav szekvenciát magában foglaló, tisztított peptidekre vonatkozik: Xi-X₂-C-P*-Y*-X3-L-C-X4X₅ - X₆ (SEQ ID NO:2), ahol P* jelentése prolin vagy nem természetes származéka; Y* jelentése tirozin vagy nem természetes származéka; X₁ jelentése W, Y, F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, F(3/4*) és Y(3*), ahol F(3/4*) jelentése a 3-as vagy a 4-es helyzetben metil-, trifluor-metil-, amino-, amino-metil-, cianocsoporttal, fluor-, bróm- vagy jódatommal, etil- vagy OMe csoporttal szubsztituált fenil-alanin, és ahol Y(3*) jelentése a 3-as helyzetben fluor-, bróm- vagy jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált tirozin; X₂ jelentése E, H, dE, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr vagy Th; X3 jelentése G vagy D; X4 jelentése H, F, Y vagy W; X₅ jelentése I, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nie, Tie, Nval, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4-Pal vagy F(3/4*), ahol F(3/4*) jelentése a 3-as vagy 4-es helyzetben trifluor-metil-, etil-, izopropil- vagy metoxicsoporttal szubsztituált fenil-alanin; X₆ jelentése N, W, I, L vagy V, vagy X₆ nincs jelen; és ahol X_1r X₂, X₅, P* és Y* közül legalább az egyik egy aminosav nem természetes származéka. P* lehet például prolin vagy 4-hidroxi-prolin, és Y* lehet tirozin vagy a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált tirozin nem természetes származéka. A tisztított peptidek képesek nem redukáló körülmények között diszulfid kötést képezni, és specifikus kötődési affinitásuk van a fibrinhez. Bizonyos esetekben a peptid diszulfid kötést is tartalmazhat. A találmány szerinti vegyületek egy trombolitikus szerhez kapcsolódó ilyen peptideket tartalmazhatnak.

A találmány olyan tisztított peptidekre is vonatkozik, amelyek az alábbi aminosav szekvenciát tartalmazzák: W-dE-C-P(4-OH)-Y-(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO:4), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-l-Q (SEQ ID NO:5), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:6), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-l-Q (SEQ ID NO:7), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO:8), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:9), Y-dE-C-P(4-0H)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 10), W-dE_C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-Y-l-Q (SEQ ID NO: 11),

-4ι ··; . ·. . ·.

·· · · ·· * ·«

F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-H-l-L (SEQ ID NO: 12), Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO: 13), W-dE-C-P-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 14), W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 15), és F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-H-I-L (SEQ ID NO: 16). A peptidek nem redukáló körülmények között diszulfid kötést képezhetnek, és bizonyos esetekben a peptid diszulfid kötést tartalmaznak. A peptidek speciális kötődést mutathatnak a fibrinhez. A találmány szerinti vegyületek trombolitikus szerhez kapcsolódó peptideket is tartalmazhatnak.

Bizonyos esetekben P* jelentése prolin; Y* jelentése tirozin; Xi jelentése W, Y, F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*) és X(3*), ahol F(3/4*) jelentése a 3-as vagy 4-es helyzetben metil-, trifluormetil-, amino-, amino-metil-, cianocsoporttal, fluor-, klór-, brómatommal, etil- vagy metoxicsoporttal szubsztituált fenil-alanin, és ahol Y3* jelentése a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált tirozin; X2 jelentése dE, H(Bzl), 2-Pal, Dpr vagy Th; X₃ jelentése G vagy D; X4 jelentése H, F, Y vagy W; X5 jelentése I, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nie, Tie, nVal, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4-Pal vagy F(3/4*), ahol F3/4* jelentése a 3-as vagy 4-es helyzetben trifluor-, etil-, izopropil- vagy metoxicsoporttal szubsztituált fenil-alanin; ahol Xi, X2 vagy X5 közül legalább az egyik nem természetes aminosav-származék; és Χβ jelentése N, Q, I, L vagy V, vagy X₆ nincs jelen. Az ilyen peptidek nem redukáló körülmények között diszulfid kötést képezhetnek, és néhány esetben a peptidek diszulfid kötést is tartalmaznak. A peptidek specifikus kötődési affinitással rendelkezhetnek a fibrin iránt.

Más változatok szerint a találmány az alábbi aminosav szekvenciát tartalmazó tisztított peptidekre vonatkozik: C - P* - Y* - X1 - L- C (SEQ ID NO.3), ahol X1 jelentése G vagy D; P* jelentése prolin vagy nem természetes 4-hidroxi-prolinszármazék; és Y* jelentése tirozin vagy a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált tirozin vagy nem természetes származéka; feltéve, hogy P* vagy Y* közül legalább az egyik a megfelelő aminosav nem természetes származéka. A tisztított peptidek nem reduktív körülmények között diszulfid kötés képzésére képesek, és a fibrinhez specifikus kötődési affinitással rendelkezhetnek. Néhány esetben a peptidek diszulfid kötést tartalmazhatnak. A találmány szerinti vegyületek ilyen, trombolitikus szerhez kapcsolódó peptideket is magukban foglalhatnak.

-5A találmány kiterjed tisztított peptidekre, amelyek a következő aminosav szekvenciát tartalmazzák: C-D-Y-Y-G-T-C-X10 (SEQ ID. NO: 17), ahol X10 jelentése n(decil)G, n(4-PhBu)G, MeL, Bpa, Bip, Me-Bip, F(4*), F(3-Me), F(3, 4-difluor), Amh, Hfe, Y(3, 5-dijód), Pff, 1 Nal, d1Nal vagy MeL, ahol F(4*) jelentése a 4-es helyzetben etil-, trifluor-metil-csoporttal, jódatommal vagy izopropilcsoporttal szubsztituált fenil-alanin. A tisztított peptidek tartalmazhatják a következő aminosav szekvenciát: C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11 (SEQ ID. NO:18), ahol Xn jelentése D, dP, βϋ, Inp, Nip, Me-D, dC, Cop vagy Cmp. így például egy peptid a következő aminosav szekvenciákat tartalmazhatja: L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(decil)G-dD (SEQ ID. NO: 19), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(decil)G-D (SEQ ID. NO:20), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D (SEQ ID. NO:21), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD (SEQ ID. NO:22), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-lnp (SEQ ID. NO:23), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp (SEQ ID. NO:24) vagy L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D (SEQ ID.NO:25). A tisztított peptidek diszulfid kötést képezhetnek nem reduktív körülmények között, és specifikus kötődési affinitást mutathatnak a fibrin iránt. Bizonyos esetekben diszulfid kötést tartalmazhatnak a peptidek. A találmány szerinti vegyületek olyan peptideket érinthetnek, amelyek egy trombolitikus szerhez kapcsolódnak.

Egy másik vonatkozás szerint a találmány kiterjed egy MR leképező szer előállítására. A módszer abból áll, hogy egy N-terminális amin funkciós csoportot tartalmazó peptidet egy linker alegység csoporttal reagáltatva egy olyan módosított pepiidet képezünk, amely C-terminális amin funkciós csoportot és N-terminális amin funkciós csoportot is tartalmaz; és amely kovalensen kapcsol egy linker csoportot a C-terminális amin funkciós csoporthoz és az N-terminális amin funkciós csoporthoz, ezáltal egy prekurzor MR leképező szert képezve; és a prekurzor MR leképező szert MR leképező szerré alakítjuk. A linker alegység csoport a következők közül kerülhet ki:

ahol n értéke 1-4 közötti egész szám; m értéke 1-12 közötti egész szám; és R jelentése alifás vagy aromás csoport. A linker csoport a következő csoportok valamelyike lehet:

ahol m értéke 1-4 közötti egész szám; n értéke 0-4 közötti egész szám, LG kilépöcsoport; és R' és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy kémiai védőcsoport.

A linkercsoport a következő csoportok valamelyike is lehet:

-7 R^N •ι

NR’R²

3—NR^R²

NR FT

-A

LG

O^: 'nr’r² r¹r²n Sjr'r² r’r²n nr¹r², ahol LG kilépőcsoport; és R¹ és R² egymástól függetlenül hidrogénatom vagy kémiai védőcsoport. Az LG lehet -OH, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid. Az aktivált észter lehet pentafluor-fenol (Pfp), N-hidroxi-szukcinimid (NHS), N-hidroxiszulfo-szukcinimid-nátriumsó (NHSS), 2-tioxo-tiazolidin-1 -il vagy hidroxibenzotriazol (OBT). A halogenid lehet fluor- klór-, bróm- vagy jódatom. A kémiai védőcsoport lehet Boc, Fmoc, CBZ, t-butil-, benzil- vagy allilcsoport.

Az MR leképező szer prekurzor MR leképező szerré alakítása abból állhat, hogy a prekurzor leképező szert egy prekurzor kelátcsoporttal reagáltatunk, és így kovalens kötést képezünk a prekurzor kelátcsoport és a prekurzor MR leképező szer linkercsoportja között, ahol a prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportot tartalmaz, ahol a karboxilát prekurzor csoportok karboxilátcsoportokká tudnak átalakulni; és ezáltal a megkötött prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportja több karboxilátcsoporttá transzformálódik, a karboxilátcsoportok, amelyek komplexálni képesek a paramágneses fémiont; a paramágneses fémion komplexálásával több karboxilátcsoport keletkezik, és így kapjuk az MR leképező szert. A prekurzor kelátcsoport az alábbiak közül kerülhet ki:

= 8 -

ahol Υ jelentése szintetikus csoport, amely kovalens kötés képzésére alkalmas a kapcsolódó linkercsoporttal, és ahol minden X egymástól függetlenül 0' vagy 0’ prekurzor, úgy, hogy az X O’-szá történő átalakítás hatására karboxilátcsoportot tud képezni a szomszédos karbonilcsoporttal, és R¹ töltés nélküli kémiai csoport, alifás alkil- vagy cikloalkilcsoport, vagy töltés nélküli szubsztituált változatai. A szintetikus csoport lehet karbonsav, aktivált észter, savhalogenid, anhidrid, alkil-halogenid, izocianát, izotiocianát, ahol O' prekurzor lehet -OH, -OMe, OEt, OtBu, O-benzil- vagy O-allil-csoport. A prekurzor kelátcsoportot az alábbi csoportok közül is választhatjuk:

ahol LG kilépőcsoport, amely lehet hidroxilcsoport, aktivált észter, halogenid, anhidrid, és ahol minden R egymástól függetlenül O- vagy O- prekurzor, amely lehet OH, -Ο-Me, O-Et, O-tBu, O-benzil- vagy O-allil-csoport úgy, hogy R O-szá alakításkor karboxilátcsoportot képezhet a szomszédos karbonilcsoporttal.

A prekurzor kelátcsoport az alábbi csoportok valamelyike is lehet:

ahol n értéke 1-4 közötti egész szám; R jelentése negatív töltés és egy negatív töltés prekurzor, amely képes átalakulni negatív töltéssé; és X jelentése kémiai kilépőcsoport, amely lehet klór-, bróm-, jódatom, -MsO, -TsO vagy -TfO csoport.

A prekurzor kelátcsoport az alábbi csoportok valamelyike lehet:

ahol R jelentése negatív töltés vagy negatív töltésű prekurzor, amely transzformálódhat negatív töltéssé; és X jelentése kémiai kilépőcsoport, amely lehet klór, bróm, jód, -MsO, -TsO vagy -TfO csoport. A negatív töltésű prekurzor lehet -H, -Me, -Et, -t-Bu, -benzil- vagy -allilcsoport.

Az egyes változatokban a linkercsoport kovalensen lehet konjugálva egy prekurzor kelátcsoporttal, a kovalens konjugátum több karboxilát prekurzor csoportot tartalmaz, és a karboxilát prekurzor csoportok transzformálódhatnak karboxilátcsoportokká. A prekurzor MRI leképező szer MR leképező szerré alaki tása magában foglalhatja a több kovalens konjugátum karboxilát prekurzor csoportjainak karboxilátcsoportokká történő transzformálódását, a karboxilátcsoportok képesek egy paramágneses fémion komplexálására; és a paramágneses fémion karboxilátcsoportokká történő komplexálása az MR leképező szerhez vezet. A paramágneses fémion a következő csoportok valamelyike lehet: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll és III), Cr(lll), Cu(ll), Dy(III), Tb(lll és IV), Ho(lll), Er(lll), Pr(lll), Eu(ll) és Eu(lll). A Gd(lll) különösen alkalmas paramágneses ion.

A kovalens konjugátum a következő csoportok valamelyike lehet:

ahol n értéke 1-4 közötti egész szám; LG jelentése kilépőcsoport, amely lehet -OH, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid; és R¹, R², R³, R⁴ és R⁵ jelentése 30 egymástól függetlenül lehet acetát, -Me, -Et vagy -t-Bu-védett acetátcsoport, acetamid- vagy acetoxicsoport.

A kovalens konjugátum a következő csoportok valamelyike is lehet:

ahol LG kilépőcsoport, amely lehet hidroxilcsoport, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid; és R¹, R², R³ és R⁴ lehet acetát, metil-, etil- vagy -t-butil-védett acetátcsoport, acetamid- vagy acetoxicsoport.

A kovalens konjugátum jelentése a következő csoportok közül kerülhet ki:

-es szinton:

2-es szinton:

A kovalens konjugátum a következő csoportok valamelyike is lehet:

ahol R jelentése -t-butil-csoport, LG jelentése kilépöcsoport, amely lehet hidroxilcsoport, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid.

A találmány szerinti módszerekhez tartozik továbbá, hogy mielőtt kovalensen összekapcsolnánk egy linkercsoportot a C- és N-terminális amin funkciós csoportokkal, egy linker alegységet reagáltatunk a pepiid N-terminális amin funkciós cső-14portjával a pepiid N-terminális amin funkciós csoportja származékának előállítására. A linker alegység a következő csoportok valamelyike lehet:

bázis

bázis

ahol a bázis lehet adenozin, guanozin, timin vagy citozin; LG jelentése kilépőcsoport, előnyösen hidroxilesöpört, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid; és R jelentése alifás vagy aromás csoport. A linker alegység a következő csoportok valamelyike is lehet:

o ahol n értéke egymástól függetlenül 0-3 közötti egész szám; R jelentése alifás vagy aromás csoport; és LG jelentése kilépöcsoport, előnyösen hidroxilcsoport, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid.

A linker alegység a következő csoportok valamelyike is lehet:

és

ahol n értéke 1 vagy 2; R jelentése alifás vagy aromás csoport, és LG jelentése kilépőcsoport, előnyösen hidroxilcsoport, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid.

Egy másik vonatkozás szerint a találmány kiterjed egy MR leképező szer előállításának eljárására is. A módszer szerint kovalensen kapcsolunk össze egy aminosav maradékot egy linkre alegység csoporttal egy pepiid C-terminális végének kialakítására, ahol a linker alegység csoport kovalensen kapcsolódik egy gyantához; a gyantán egy pepiidet szintetizálunk a kovalens kötésű C-terminális végből és a pepiid N-terminális maradékából, ahol az N-terminális maradék egy Nterminális amin funkciós csoportot tartalmaz; a pepiidet a gyantáról lehasítva Cterminális amin funkciós csoportot tartalmazó pepiidet kapunk; kovalensen kapcsolunk össze egy linker csoportot a peptid C-terminális amin funkciós csoportjával és egy N-terminális amin funkciós csoporttal, és így kapunk egy prekurzor MR leképező szert; és ezt a prekurzor MR leképező szert alakítjuk át MR leképező szerré. A módszer továbbá magában foglalhatja még azt a lépést is, hogy mielőtt lehasítjuk a pepiidet a gyantáról, kovalensen összekapcsolunk egy linker alegység csoportot az N-terminális amino funkciós csoporttal, és így az N-terminális amin funkciós csoport származékát kapjuk. A linker csoportot kovalensen konjugálhatjuk egy prekurzor kelátcsoporttal, ahol a kovalens konjugátum karboxilát prekurzor csoportok sokaságából és karboxilátcsoportokká transzformálható karboxilát prekurzor csoportokból áll.

A prekurzor MR leképező szer MR leképező szerré alakítása magában foglalhatja a prekurzor MR leképező szer prekurzor kelátcsoporttal való reakcióját, melynek során a prekurzor kelátcsoport és a prekurzor MR leképező szer linkercsoportja között kovalens kötés képződik, a prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportból és karboxilátcsoportokká transzformálódó

- 16 karboxilát prekurzor csoportokból áll; a megkötött prekurzor kelátcsoport karboxilát prekurzor csoportjait transzformáljuk karboxilátcsoportokká és a paramágneses fémionnal komplexálásra képes karboxilátcsoportokká; és a paramágneses fémionokat komplexáljuk több karboxilátcsoporttá, és így kapjuk az MR leképező szert.

A prekurzor MRI leképező szer MR leképező szerré alakítása magában foglalhatja a kovalens konjugátum karboxilát prekurzor csoportjainak átalakítását karboxilátcsoportokká, a karboxilátcsoportok alkalmasak egy paramágneses fémion komplexálására; és egy paramágneses fémiont komplexálunk karboxilátcsoportokká, és így kapjuk az MR leképező szert. A paramágneses fémion az alábbi csoportok valamelyikéből kerülhet ki: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll és III), Cr(lll), Cu(ll), DY(III), Tb(lll és IV), Ho(lll), Er(lll), Pr(lll), Eu(ll) és Eu(lll). Különösen előnyös paramágneses fémion a Gd(lll).

Egy másik változat szerint a találmány kiterjed egy MR leképező szer előállítására oly módon, hogy egy C-terminális karboxilát funkciós csoportot tartalmazó peptidet egy linker-alegység csoporttal reagáltatunk, és egy C-terminális karboxilát funkciós csoportot és egy N-terminális karboxilát funkciós csoportot tartalmazó módosított peptidet kapunk; kovalensen összekapcsolunk egy linkercsoportot a módosított pepiid mind N-terminális, mind C-terminális karboxilát funkciós csoportjaival, és így egy prekurzor MR leképező szert képezünk; amely prekurzor MR leképező szert MR leképező szerré alakítunk. A linker-alegység csoport az alábbi csoportok egyike lehet:

ahol LG jelentése kilépöcsoport, amely tartalmazhat hidroxilcsoportot, aktivált észtert, halogenidet vagy anhidridet; és R jelentése aromás vagy alifás csoport. A linkercsoport a következő csoport is lehet:

NH2 ^^^nr’r²

RO₂C COjR

ahol m értéke 1-4 közötti egész szám; n értéke 0-4 közötti egész szám; R jelentése egymástól függetlenül -H, -Me, -Et, -Bz vagy -tBu; és R¹ és R² jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy kémiai védőcsoport.

A linkercsoport az alábbi csoportok valamelyike lehet:

nr’r² ^NR¹R²

H _R’R²n“W nr’r² ahol R¹ és R² jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy kémiai védőcsoport, és a kémiai védőcsoport lehet Boc, Fmoc, CBZ, t-butil-, benzil- vagy allilcsoport.

A prekurzor MR leképező szer MR leképező szerré alakítása magában foglalhatja a prekurzor MR leképező szer és egy prekurzor kelátcsoport reakcióját a prekurzor MR leképező szer linkercsoportja és a prekurzor kelátcsoport közötti kovalens kötés kialakítására, ahol a prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportból és karboxilátcsoportokká transzformálható karboxilát prekurzor csoportokból áll; a megkötött prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportját átalakítjuk több karboxilátcsoporttá, a karboxilátcsoportok képesek komplexálni a paramágneses fémiont; és a paramágneses fémion több karboxilátcsoporttá történő komplexálásával MR leképező szert kapunk. A linkercsoport kovalensen lehet konjugálva egy prekurzor kelátcsoporttal, a kovalens konjugátum több karboxilát prekurzor csoportot és karboxilátcsoportokká transzformálható karboxilát prekurzor csoportot tartalmaz.

A prekurzor MR leképező szer átalakítása MR leképező szerré magában foglalhatja a kovalens konjugátum karboxilát prekurzor csoportjainak • * · · · · · · • · · ····« · • · · «· ·· ) · · karboxilátcsoportokká történő átalakítását, komplexálni egy paramágneses fémiont;

a karboxilátcsoportok képesek és egy paramágneses fémion karboxilátcsoportokká történő komplexálásával MR leképező szert kapunk.

A kovalens konjugátum az alábbi csoportok valamelyike lehet:

ahol n értéke 0-4 közötti egész szám; és R¹, R², R³, R⁴ és R⁵ jelentése egymástól függetlenül acetátcsoport, -Me-, -Et- vagy -t-Bu-védett acetátcsoport, acetamid- vagy acetoxicsoport. A kovalens konjugátum lehet:

-19 10 ···· ·· ·ί t ··; . ·. \

O₂C(CH₃)₃ /-^-0(¾ C(CH₃)₃ (CH₃)3CO₂C_x (CHACO-,

CO₂C(C H₃)3

NH

A prekurzor MR leképező szer átalakítása MR leképező szerré végbemehet úgy is, hogy a prekurzor leképező szert kelátcsoporttal reagáltatjuk, ahol a kelátcsoport egy paramágneses fémiont tartalmaz, a kelátcsoport és az MR leképező szer prekurzorának linkercsoportja közötti kovalens kötés képzésére, és ily módon MR leképező szer előállítására. A megfelelő paramágneses fémionok leírása fent található.

Egy további aspektus szerint a találmány egy kontrasztanyagra is kiterjed, amely egy biopolimer, pl. peptid -CO2R és NHR végén egy fém kelátkomplexet tartalmaz, ahol R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkil-, alifás vagy kilépöcsoport. A kontrasztanyag a biopolimer CO2R és NHR végén két fém kelátkomplexet tartalmazhat. A biopolimer speciális kötődési affinitást mutathat a fibrinhez. A peptid alkalmas lehet nem reduktív körülmények között diszulfid kötés kialakítására, és bizonyos esetekben tartalmazhat egy diszulfid kötést. A kontrasztanyag képlete a következő lehet:

('Kelét )_m—(Unker)_p---- (Linker-afegiségr ’

R¹

-(Linker-afegjségi_s----(Unker)_p------(Kelét )_m n

-20ahol a kelét jelentése fém kelátkomplex; linker jelentése linkercsoport; a linker-alegység jelentése linker-alegység csoport; m értéke egymástól függetlenül 1-10 közötti egész szám; p értéke egymástól függetlenül 0-5 közötti egész szám; s értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1; R¹ jelentése aminosav oldallánc vagy származéka; és R² jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy alifáscsoport. A kontrasztanyag a 4-55-ös szerkezetek bármelyike szerinti szerkezetű lehet.

Egy további vonatkozás szerint a találmány kiterjed egy N-terminális amin funkciós csoportot tartalmazó peptid stabilitásának megváltoztatására. A módszer abból áll, hogy a pepiidet egy linker-alegység csoporttal reagáltatjuk egy Cterminális amin funkciós csoportot tartalmazó peptid kialakítására; és kovalens összekapcsolunk egy linkercsoportot a peptid C-terminális amin funkciós csoportjával és N-terminális amin funkciós csoportjával, egy módosított peptid kialakítására. A módszer továbbá magában foglalhatja azt, hogy a módosított peptidet egy véghez kapcsolódó csoporttal (capping csoport) reagáltatjuk, és így kovalens kötést képezünk a módosított peptid capping csoportja és a linkercsoportja között. A módszer szerint a módosított peptidet egy prekurzor kelátcsoporttal reagáltatjuk, és egy kovalens kötést képezünk a prekurzor kelátcsoport és a módosított peptid linkercsoportja között, ahol a prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportból áll, amelyek karboxilátcsoportokká transzformálhatok. Miután a megkötött prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportját több karboxilátcsoporttá transzformáljuk, melyek paramágneses fémiont képesek komplexálni, a paramágneses fémiont több karboxilátcsoporttá komplexálhatjuk. A módszer továbbá magában foglalja a módosított peptid stabilitásának megbecsülését vagy a módosítatlan peptid stabilitásának felmérését, és a módosított stabilitásának összevetését a módosítatlan peptid stabilitásával. A módosított peptid stabilitását a módosított peptid stabilitásának viszonylatában javíthatjuk, pl. a módosítatlan peptid stabilitásához viszonyítva 10-szeresére, 20-szorosára vagy 30szorosára javíthatjuk a stabilitást. A stabilitás kiértékelését patkánymáj homogenizátum kísérlettel hajthatjuk végre.

Egy további vonatkozás szerint a találmány kiterjed az alábbi szerkezetű, módosított pepiidre:

-21 (Kelát —(Unker)_p----(Linker-alegység) prekurzor j_m

R'

N

(Linker-alegység),.-----(Linker)_p-------(Kelát ' prekurzor )m ahol a kelát prekurzor jelentése kelát prekurzor csoport; a linker jelentése linkercsoport; a linker-alegység jelentése linker-alegység csoport; m értéke egymástól függetlenül 1-10 közötti egész szám; p értéke egymástól függetlenül 0-5 közötti egész szám; s értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1; R¹ jelentése aminosav oldallánc vagy származéka; és R² jelentése hidrogénatom vagy alifás csoport.

Egy további változat szerint a találmány kiterjed az alábbi szerkezetű, módosított pepiidre:

(Linker)_p-----(Linker-alegység)

R N

(Linker-alegység )_s· (Linker)_p ahol a linker jelentése linkercsoport; a linker-alegység jelentése linkeralegység csoport; p értéke egymástól függetlenül 0-5 közötti egész szám; s értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1; R¹ jelentése aminosav oldallánc vagy származéka; és R² jelentése hidrogénatom vagy alifás csoport.

Az MR leképező szert előállíthatjuk úgy is, hogy egy N-terminális amin funkciós csoportot tartalmazó pepiidet egy linker-alegység csoporttal reagáltatva egy olyan módosított peptidet alakítunk ki, amely mind az N-terminális, mind a Cterminális végén egy amin funkciós csoportot tartalmaz, vagy egy C-terminális karboxilát funkciós csoportot tartalmazó peptidet egy linker-alegység csoporttal reagáltatunk, és így olyan módosított peptidet képezünk, amely mind a Cterminális, mind az N-terminális végén karboxilát funkciós csoportot tartalmaz; és a módosított peptidet MR leképező szerré alakítjuk. A módosított peptid MR leképező szerré alakítása magában foglalhatja egy kelátcsoport módosított pepiidhez való kovalens kapcsolását, ahol a kelátcsoport egy paramágneses fémiont tartalmaz, az MR leképező szer előállítására. A módosított peptid MR leképező szerré alakítása magában foglalhatja azt is, hogy kovalensen összekapcsolunk egy linkercsoportot egy kelátcsoporttal egy kovalens konjugátum előállítására, ahol a kelátcsoport egy paramágneses fémiont tartalmaz, és a kovalens konjugátumot a módosított pepiiddel reagáltatva képezzük az MR leképező szert. Paramágneses ionként a fent leírtakat használhatjuk.

Egy másik változat szerint a találmány kiterjed egy MR leképező szer előállítására oly módon, hogy egy aminosav maradékot kovalensen kapcsolunk össze egy linker-alegység csoporttal egy pepiid C-terminális végének kialakítására, ahol a linker-alegység csoportot kovalensen kapcsoljuk egy gyantához; egy peptidet szintetizálunk a gyantán a kovalens kötésű C-terminális végtől a peptid Nterminális maradékáig, ahol az N-terminális maradék egy N-terminális amin funkciós csoportot tartalmaz; a peptidet a gyantáról lehasítva a módosított peptid Cterminális amin funkciós csoportját kapjuk; és a módosított peptidet MR leképező szerré alakítjuk. A módosított peptid MR leképező szerré alakítása magában foglalhatja a kelátcsoport módosított pepiidhez történő kovalens kapcsolását, ahol a kelátcsoport egy paramágneses fémiont tartalmaz, és így MR leképező szert kapunk. A módosított peptid MR leképező szerré alakítása magában foglalhatja azt is, hogy kovalensen összekapcsolunk egy linkercsoportot egy kelátcsoporttal egy kovalens konjugátum előállítására, ahol a kelátcsoport paramágneses fémiont tartalmaz; és a kovalens konjugátum módosított pepiiddel való reagáltatásával MR leképező szert kapunk. A megfelelő paramágneses ionok leírása fent található.

Valamennyi technikai és tudományos kifejezés jelentése a szakember számára ismert. Bár az itt leírt eljárások és anyagok analógjait is használhatjuk a gyakorlatban, a megfelelő módszerek és anyagok leírása az alábbiakban következik. A publikációk, szabadalmi bejelentések, szabadalmak és egyéb irodalmak, amelyeket említettünk, a találmány részét képezik. Az anyagok, módszerek és példák csak illusztráció célját szolgálják, és nem korlátozó jellegűek.

Az alábbi részletes leírásból és az igénypontokból kitűnnek a találmány további részletei és előnyei.

Rajzok leírása

A 1. ábra a nem természetes aminosavak kémiai szerkezetét mutatja be.

A 2. ábra a relaxációs idő megváltoztatását ábrázolja Gd-ként 20 MHz-nél, 35 °C-on, trisz-szel pufferezett fiziológiás sóoldatban (TBS) vagy 10 mg/ml fibrint TBS-ben.

A 3. ábra a kontrasztanyag trombusban való felhalmozódását ábrázolja.

• ·· ··· · « ·* 4 ·

·.*· ··/· ·.*·

-23 A 4A. ábra egy trombus leképezése. A 4B. ábra fekete vérből álló trombus leképezése.

Definíciók

A leírásban használatos, de közelebbről nem meghatározott kémiai rövidítések megtalálhatók a The American Chemical Society Style Guide 2. kiadásában; American Chemical Society, Washington, DC (1997); 2001 Guidelines for Authors, J. Orq. Chern. 66(1), 24A (2001), A Short Guide to Abbreviations and Their Use in Peptide Science, J. Peptide. Sei. 5, 465-471 (1999).

A bejelentésben a kémiai védőcsoport vagy a védőcsoport bármilyen kémiai csoportot takar, amely időlegesen kovalensen kötődik a molekulához egy vagy több szintetikus kémiai lépés során egy reakciósorozatban, nem kívánatos reakciók megelőzésére. A szokásos védöcsoportok leírása megtalálható a következő irodalomban: Protecting Groups in Organic Synthesis, 3. kiadás, P. Wuts and T. Greene, 1999, John Wiley & Sons, Inc.

A bejelentésben a kilépöcsoport bármelyik csoportra vonatkozik, amelyet egy nukleofil kiszorít egy nukleofil szubsztitúciós reakcióban vagy addíciós-eliminációs reakciósorozatban. Egy kilépőcsoportból álló molekula izolálható vagy in situ kialakítható átmeneti intermedierként egy kémiai reakcióban.

Az alifás kifejezés bármilyen aciklusos vagy ciklusos, telített vagy telítetlen, elágazó vagy egyenes láncú szénvegyületre vonatkozik, az aromás vegyületeket kivéve.

Az alkil kifejezés magában foglalja a telített alifás csoportokat, ideértve az egyenes láncú alkilcsoportot, például metil-, etil-, propil-, butil-, pentil-, hexil-, heptiloktil-, nonil-, decilcsoportot stb.; az elágazó láncú alkilcsoportot, pl. izopropil-, tercbutil-, izobutilcsoportot stb.; a cikloalkil-, azaz aliciklusos csoportokat, pl. ciklopropil-, ciklopentil-, ciklohexil- cikloheptil- ciklooktilcsoportot; az alkilszubsztituált cikloalkilcsoportokat és a cikloalkil-szubsztituált alkilcsoportokat. Az alkil kifejezés magában foglalja továbbá az olyan alkilcsoportokat, amelyek még tartalmazhatnak oxigén-, nitrogén-, kén- vagy foszforatomokat a szénhidrogénlánc egy vagy több szénatomja helyett. Bizonyos esetekben az egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport 6 vagy kevesebb szénatomot tartalmazhat a vázban, pl. 1-6 szénatomos egyenes láncú és 3-6 szénatomos elágazó szénláncú), még előnyösen a szénatomszám 4 vagy ennél kevesebb. Hasonlóképpen, az előnyös cikloalkilcsoport 3-8 szénatomot tartalmazhat a gyűrúszerkezetben, még előnyö1 ’:?·.? η* ·.:*

-24 sebben 5 vagy 6 szénatomos lehet. Az 1-6 szénatomos kifejezés 1-6 szénatomos alkilcsoportot jelent.

Az alkil kifejezés magában foglalja továbbá mind a szubsztituálatlan alkilcsoportokat, mind a szubsztituált alkilcsoportokat, utóbbi olyan alkilcsoportokra vonatkozik, amelyek egy hidrogénatomot a szénhidrogénlánc egy vagy több szénatomján helyettesítenek. Ilyen szubsztituens lehet például az alkenil-, alkinilcsoport, halogénatom, hidroxil-, alkil-karbonil-oxi-, aril-karbonil-oxi-, alkoxikarbonil-oxi-, aril-oxi-karbonil-oxi-, karboxilát-, alkil-karbonil-, aril-karbonil-, alkoxikarbonil-, amino-karbonil-, alkil-amino-karbonil-, dialkil-amino-karbonil- alkil-tiokarbonil-, alkoxi-, foszfát-, foszfonáto-, foszfináto-, ciano-, aminocsoport, beleértve az alkil-amino-, dialkil-amino-, aril-amino-, diaril-amino- és alkil-aril-aminocsoportot, továbbá acil-amino-csoport, beleértve az alkil-karbonil-amino-, arilkarbonil-amino-, karbamoil- és ureidocsoportot, továbbá amidino-, iminoszulfhidril-, alkil-tio-, aril-tio- tio-karboxilát-, szulfát-, alkil-szulfinil-, szulfonáto-, szulfamoil-, szulfonamido-, nitro-, trifluor-metil-, ciano-, azido-, heterociklusos, alkil-aril- vagy aromás vagy heteroaromás csoport. A cikloalkilcsoport tovább szubsztituálva lehet, pl. a fenti szubsztituensekkel. Egy aril-alkil-csoport lehet arilszubsztituált alkilcsoport, pl. fenil-metil-, azaz benzilcsoport. Az alkil kifejezés magában foglalja a természetes vagy nem természetes aminosavak oldalláncait is. Az n-alkil kifejezés egyenes láncú, azaz el nem ágazó, szubsztituálatlan alkilcsoportot jelent.

Az alkenil magában foglalja az alifás csoportokat, amelyek adott esetben szubsztituáltak a fent leírt alkilcsoporthoz hasonlóan, és amelyek legalább egy kettős kötést és legalább két szénatomot tartalmaznak. így például az alkenil lehet egyenes láncú alkenilcsoport, pl. etilenil-, propenil-, butenil-, pentenil-, hexenil-, heptenil-, oktenil-, nonenil-, decenilcsoport stb., lehet továbbá elágazó láncú alkenilcsoport, cikloalkenil- (aliciklusos) csoport (ciklopropenil-, ciklopentenil-, ciklohexenil-, cikloheptenil-, ciklooktenilcsoport), továbbá alkil- vagy alkenilszubsztituált cikloalkenilcsoport, és cikloalkil- vagy cikloalkenil-szubsztituált alkenilcsoport. Az alkenil kiterjed továbbá az oxigén-, nitrogén-, kén- vagy foszforatomokat a szénhidrogénlánc egy vagy több szénatomja helyén tartalmazó alkenilcsoportokra. Bizonyos esetekben egy egyenes vagy elágazó láncú alkenilcsoport 6 vagy kevesebb szénatomot tartalmazhat a vázon, pl. 2-6 szénatomot az egyenes láncú csoportoknál, és 3-6 szénatomot az elágazó láncúaknái.

-25 A cikloalkenilcsoport 3-8 szénatomot tartalmazhat a gyűrúszerkezetben, még előnyösebben 5 vagy 6 szénatomos lehet. A 2-6 szénatomos magában foglalja a 2-6 szénatomos alkenilcsoportot.

Az alkenilcsoport ezenkívül magában foglalja a szubsztituálatlan és szubsztituált alkenilcsoportot. Utóbbi olyan alkenilcsoportra vonatkozik, amelyben a szénhidrogénváz egy vagy több szénatomján a hidrogénatomot szubsztituens helyettesíti. Ilyen lehet szubsztituens lehet például az alkil-, alkinilcsoport, halogénatom, hidroxil-, alkil-karbonil-oxi-, aril-karbonil-oxi-, alkoxi-karbonil-oxi-, aril-oxikarbonil-oxi-, karboxilát-, alkil-karbonil-, aril-karbonil- alkoxi-karbonil-, aminokarbonil-, alkil-amino-karbonil-, dialkil-amino-karbonil-, alkil-tio-karbonil-, alkoxi-, foszfát-, foszfonáto-, foszfináto-, ciano-, aminocsoport, beleértve az alkil-amino-, dialkil-amino-, aril-amino-, daril-amino- vagy alkil-aril-amino-csoportot, továbbá acil-amino-csoport, beleértve az alkil-karbonil-amino-, aril-karbonil-amino-, karbamoil- vagy ureidocsoportot, továbbá amidino-, imino-, szulfhidril-, alkil-tio-, aril-tio-, tio-karboxilát-, szulfát-, alkil-szulfinil-, szulfonáto-, szulfamoil-, szulfonamido-, nitro-, trifluor-metil-, ciano-, azido-, heterociklusos, alkil-aril- vagy aromás vagy heteroaromás csoport.

Az alkinil magában foglalja a telítetlen alifás, hosszúságot tekintve analóg csoportokat, és a fenti alkilcsoportok lehetséges szubsztituenseit, és amely csoportok legalább egy hármas kötést és két szénatomot tartalmaznak. így például az alkinilcsoport lehet egyenes láncú alkinilcsoport, például etinil-, butinil-, pentinil-, hexinil-, heptinil-, oktinil-, noninil- vagy decinilcsoport; vagy elágazó láncú alkinilcsoport, cikloalkil- vagy cikloalkenil-szubsztituált alkenilcsoport. Az alkinilhez tartozik továbbá az olyan alkinilcsoport, amely tartalmaz oxigén-, nitrogén-, kénvagy foszforatomokat a szénhidrogénváz egy vagy több szénatomját helyettesítve. Bizonyos esetekben egy egyenes vagy elágazó láncú alkinilcsoport 6 vagy kevesebb szénatomot tartalmaz a vázban, például 2-6 szénatomos az egyenes láncúaknái és 3-6 szénatomos az elágazó láncúaknái. A 2-6 szénatomos kifejezés 2-6 szénatomot tartalmazó alkinilcsoportokat takar.

Általában az aril kifejezés olyan csoportokra vonatkozik, amelyek 5- vagy 6tagú, egygyúrüs aromás csoportok, és 0-4 heteroatomot tartalmaznak, például benzol-, fenil-, pírról-, furán-, tiofén-, tiazol-, izotiazol-, imidazol-, triazol-, tetrazol-, pirazol- oxazol-, izoxazol-, piridin-, pirazin-, piridazin- vagy pirimidingyűrű stb. Ezenkívül az aril kifejezés magában foglalja a többciklusos arilcsoportokat, pél-26dául triciklusos, biciklusos csoportokat is, például naftalin-, benzoxazol-, benzodioxazol- benzotiazol- benzoimidazol-, benzotiofén-, metilén-dioxi-fenil-, kinolin-, izokinolin-, naftridin- indol-, benzofurán-, purin-, deazapurin- vagy indolizincsoport. A gyűrűszerkezetben heteroatomokat tartalmazó arilcsoportok 5 lehetnek az aril heterociklusok, heterociklusok, heteroarilcsoportok vagy heteroaromás csoportok. Egy arilcsoport helyettesítve lehet szubsztituensekkel egy vagy több gyűrűhelyzetben.

A jelen bejelentésben a DTPA olyan kémiai vegyületre utal, amelynek az alszerkezete dietilén-triaminból áll, ahol a két primer amin kovalensen kapcsolódik 10 két acetilcsoporthoz, és a szekunder aminban egy acetilcsoport kovalensen kapcsolódik az alábbi képlet szerint:

ahol X jelentése heteroatom elektron-donor csoport, amely egy fém kation koordinálására képes, előnyösen 0-, OH, NH₂, OPO₃ ²’ vagy NHR, vagy OR csoport, ahol R jelentése alifás csoport. Ha minden X csoport terc-butoxi-csoportot jelent, akkor a szerkezet DTPE, ahol az E az észtert jelenti.

A bejelentésben a DOTA kifejezés olyan vegyületre utal, amelynek alszerkezete 1,4,7,11-tetraazaciklododekánból áll, ahol az aminok mindegyike tartalmaz egy acetilcsoportot, amely kovalensen kapcsolódik a következő képlet szerint:

ahol X jelentése a fenti.

A bejelentésben a ΝΟΤΑ kifejezés olyan kémiai vegyület, amely 1,4,7triazaciklononán alszerkezetből áll, ahol az aminok mindegyike tartalmaz egy kovalensen kapcsolódó acetilcsoportot, az alábbi képletnek megfelelően:

o ahol X jelentése a fenti.

A bejelentésben a D03A olyan vegyületre utal, amely 1,4,7,11tetraazaciklododekán alszerkezetből áll, ahol a négy aminból három mindegyike tartalmaz egy kovalensen kapcsolódó acetilcsoportot, és a másik amin egy semleges töltésű szubsztituenssel van helyettesítve a következő képlet szerint:

ahol X jelentése a fenti, és R¹ jelentése töltés nélküli kémiai csoport, előnyösen hidrogénatom vagy alifás, alkil- vagy cikloalkilcsoport, és ezek töltés nélküli származékai. Az előnyös kelát HP-DO3A definíciójában R¹ jelentése

-CH₂(CHOH)CH₃.

A fenti négy szerkezet mindegyikében a megadott etilének szénatomjait váz szénatomoknak nevezhetjük. A bbDTPA megjelölés alkalmazása utal a kémiai kötés elhelyezkedésére a DTPA molekulában, ahol bb jelentése váz. Az itteni értelemben a bb(CO)DTPA-Gd jelentése a DTPA etilénváz szénatomjához kapcsolódó C=O csoport.

A kelátképző ligandum, kelátképző csoport és a kelátcsoport kifejezések bármilyen polidentát ligandummal kapcsolatban alkalmazhatók, amely képes egy fémion koordinálására, ideértve a DTPA (és DTPE), DOTA, DO3A vagy ΝΟΤΑ molekulákat, vagy bármilyen más megfelelő polidentát kelátképzö ligandum, ami vagy koordinál egy fémiont vagy képes rá, közvetlenül vagy a védöcsoportok eltávolítása után, vagy egy reagens megfelelő védöcsoportokkal vagy anélkül, amelyet a kontrasztanyag szintézisénél használunk, és amely lényegében az összes olyan anyagot tartalmazza, amely végül a végső fémkomplex fémionját koordinál-28 * · · ♦ · n « *

V.’ %.· ·..* ja. A kelét kifejezés az aktuális fém-ligandum komplexre vonatkozik, és magától értetődik, hogy a polidentát ligandum eventuálisan egy orvosilag hasznos fémionhoz van koordinálva.

A specifikus kötődési affinitás kifejezés egy kontrasztanyag kapacitására utal, amelyet egy meghatározott biológiai komponens az egyéb komponenseknél nagyobb mértékben vesz fel, tart vissza vagy köt meg. Ezzel a tulajdonsággal rendelkező kontrasztanyagok a célzott vagy cél komponensek. Azok a kontrasztszerek, amelyek nem rendelkeznek ezzel a tulajdonsággal, a nem specifikus vagy nem célzott szerek. Egy kötődő csoport specifikus kötődési affinitása célhoz egyensúlyi disszociációs állandóban, azaz Kd-ben van kifejezve.

A relaxivitás fogalom a paramágneses ion vagy kontrasztanyag MRI 1/T1 vagy 1/t2 mennyiségének per millimól koncentrációjának növekedésére utal, ahol ezek a mennyiségek különbözőek lehetnek, ha a kontrasztanyag többszörös paramágneses iont tartalmaz, ahol a T1 a longitudinális vagy spin rács, relaxációs idő, és a T2 a víz protonok vagy más leképező vagy spektroszkopikus magok, beleértve a molekulákban található protonokat, amelyek eltérnek a víztől, transzverze vagy spin-spin relaxációs ideje. A relaxivitást mMV egységekben fejezzük ki.

A nyílt koordinációs hely egy fémionon levő helyre utal, amelyet rendszerint víz vagy oldószer molekula foglal el.

A tisztított kifejezés egy pepiidre vonatkozik, amelyet vagy valamilyen természetes előfordulású szerves molekulától választottunk el, amellyel normálisan asszociál, vagy kémiailag szintetizált pepiid esetében bármilyen más, a kémiai szintézisben jelenlevő szerves molekulától választjuk külön. A polipeptidet rendszerint tisztítottnak tartjuk, ha legalább 70 száraztömeg%-os, pl. 70, 80, 90, 95 vagy 99 %-os, és mentes bármilyen más fehérjétől vagy szerves molekulától.

A peptid hosszban kb. 2-75 aminosavig terjedő aminosav-láncra vonatkozik, pl. 3-50 aminosav.

A biopolimer kifejezés olyan polimer anyag, amely természetesen jön létre egy biológiai rendszerben. Bizonyos biopolimereket definiált építő alegység szettből lehet felépíteni, amely az alegységeket összekapcsoló szokásos csoportokat tartalmaz, például egy peptid rendszerint egy aminosav sorozatból van konstruálva (természetes és nem természetes aminosavakból egyaránt), ahol az amidkötések összekapcsolják az alegységeket.

A multimer kifejezés egy kontrasztanyag vagy annak alegysége, amely legalább két kovalensen kötött kelátból vagy ezek szintetikus prekurzoraiból áll.

A természetes vagy természetes előfordulású aminosav a leggyakrabban előforduló 20 aminosav egyike. A kimutatási célokra jelzéssel ellátott, módosított természetes aminosavakat (pl. radioaktív jelzés, optikai jelzés vagy festék) természetes aminosavaknak tekintjük. A természetes aminosavakat standard 1-3-betűs rövidítésükkel jelöljük.

A nem természetes aminosav vagy nem természetes kifejezés egy természetes aminosav bármilyen származékára vonatkozik, ideértve a D formákat és a β és γ aminosav-származékokat. Megjegyezzük, hogy bizonyos aminosavak, például a hidroxi-prolin, amelyek nem természetes aminosavként ismeretesek, megtalálhatók a természetben a szervezeten belül vagy egy proteinben.

A stabil kifejezés olyan vegyületekre utal, amelyek elég stabilak ahhoz, hogy előállíthatok legyenek, és amelyek a vegyület integritását elég hosszú ideig fenntartják ahhoz, hogy az itt részletezett célokra használhatók és biztonságosak legyenek. Az ilyen vegyületek rendszerint 40 °C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten stabilak, nedvesség kizárása mellett, vagy más kémiai reakcióképes körülmények kizárásával, legalább 1 hétig. A találmány szerinti szubsztituens kombinációk és változók közül a találmány azokra vonatkozik, amelyek stabil vegyületeket eredményeznek.

A cél megkötés és kötődés egy kontrasztanyag célponttal történő nem kovalens kölcsönhatására vonatkozik. Ezek a nem kovalens kölcsönhatások függetlenek egymástól, és többek között lehetnek hidrofób, hidrofil, dipólus-dipólus, hidrogénkötés, elektrosztatikus asszociációk vagy Lewis-sav alapú vagy ún. pistacking kölcsönhatások.

A fedőmolekula egy kelát, szerves festék, kontrasztanyag, trombolitikus vagy stabilizáló csoport. A megfelelő stabilizáló csoportok biológiailag inertek, azaz nincs biológiai hatásuk.

Kontrasztanyagok

Általában a jelen találmány MRI, optikai és radionuklid kontrasztanyagokra vonatkozik, amelyek magukban foglalják a célzott polimert (pl. pepiidet), amelyben mind az N-, mind a C-terminális aminosavak konjugáltak, közvetlenül vagy egy adott esetben jelenlevő interveniáló linker-alegység és linker útján, legalább egy, paramágneses keláttal (mágneses rezonancia leképezésre), vagy radioaktív fém ionnal (radionuklid leképezésre) vagy egy optikai festékkel (optikai leképezésre). A továbbiakban példaszerűen kitűnik, hogy a linker vagy linker-alegység elágazó lehet, és ezért több kelát vagy festék kapcsolódhat a peptid mindegyik végére, azaz egy multimer. A találmány szerinti vegyületek egy vagy több aszimmetrikus szénatomot tartalmazhatnak, és előfordulhatnak ezért racemátok és racém elegyek egyetlen enantiomer, diasztereomer elegyek és egyéni diasztereomerek formájában. Az ilyen vegyületek valamennyi ilyen izomer formája a találmányhoz tartozik. Minden sztereogén szénatom R vagy S konfigurációjú lehet, hacsak speciálisan másképp nem nevezzük. Bár a bejelentésben példaszerűen megadott vegyületek egy konkrét sztereokémiái konfigurációban ábrázolhatok, idetartoznak egy adott királis centrumban ellenkező sztereokémiájú vegyületek vagy ezek elegyei is. Világos, hogy a találmány szerinti vegyületek különböző konformációs és ionos formát foglalhatnak el egy oldatban, gyógyászati készítményekben és in vivo egyaránt. Bár a speciális találmány szerinti előnyös vegyületek konkrét konformációjú és ionos formájúak, a leírásban erre nem korlátozódunk.

A jelen találmány szerinti új peptid-alapú multimerek különböző előnyöket nyújtanak, mint célzott kontrasztanyagok.

1. A vegyületek két vagy több fedőmolekulát (pl. kelátot, szerves festéket vagy trombolitikumot) szállíthatnak a célhoz, egyetlen célzott peptid felhasználásával úgy, hogy a szövet kontrasztban elegendő javulás észlelhető részben, mert a cél körüli leképező molekulának jelentős koncentrációja jelenik meg.

2. A találmány szerinti MRI kontrasztanyagok nagyfokú relaxivitást is mutatnak a célhoz való kötődés hatására a receptor által indukált mágneses fokozódás) hatás (RIME) és a peptid azon képességének kombinációjának hatására, hogy korlátozza az egyes kelátok helyi mozgását, ha a célhoz kötődnek.

3. A vegyületek egy vagy több cél iránt nagy affinitást mutatnak.

4. Minthogy a vegyületek viszonylag könnyen szintetizálhatok az itt leírt módszerekkel, és csak molekulánként egy pepiidre van szükség, a célhoz gazdaságosabban lehet szállítani több fémiont vagy szerves festéket.

5. A találmány szerinti vegyületek jobb in vivo stabilitást mutathatnak (azaz hosszabb a felezési idejük) a csökkent enzim anyagcsere következtében (például a peptidázok általi csökkent hasítás miatt).

A találmány szerinti peptid-alapú multimerek ezen kedvező vonásai következtében hasznos célzott kontrasztanyagokról van szó.

-31 A találmány szerinti MRI kémiai szerkezetét és a radionuklid kontrasztanyag kémiai szerkezetét a következő képlettel mutathatjuk be:

(Kelét int—-(Linkerjp——(Unker-alegységs

(Unker-ategységi;--<Linker)_p-----(, Kelét í_m ahol minden m egymástól függetlenül 1<m<10, a kelát jelentése fém kelátkomplex, p értéke egymástól függetlenül 0-5 közötti egész szám; s értéke egymástól függetlenül 1 vagy 0; R¹ jelentése bármilyen aminosav oldallánc, beleértve a nem természetes aminosavak oldalláncait; R² jelentése alifás csoport vagy hidrogénatom; n értéke 3-50 közötti egész szám. Egy másik változat szerint R¹ és R² együtt gyűrűszerkezetet képezhet, beleértve a prolint és szubsztituált változatát. Ha linkerek vannak jelen, akkor ezek különbözőek lehetnek.

Az MRI-hez előnyös fémionok atomszáma 21-29, 39-47 vagy 57-83 közötti, még előnyösebb egy fémion paramágneses formája, ha az atomszáma 21-29, 42, 44 vagy 57-83. Különösen előnyös paramágneses fémionok az alábbiak közül kerülnek ki: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll és III), Cr(lll), Cu(ll), Dy(lll), Tb(lll és IV), Ho(lll), Er(lll), Pr(lll) és Eu(ll és III). Különösen alkalmas a Gd(lll). Megjegyezzük, hogy a Gd kifejezés a fém gadolinium ionos formája; pl. az ionos forma lehet GD(III), GD3+, gado stb., miközben az ionos formák között nincs különbség.

A radionuklid leképezőszerek és radionuklidok közül különösen hasznosak a következők: ⁹⁰Y, ^99mTc, ¹¹¹ln, ⁴⁷Sc, ⁶⁷Ga, ⁵¹Cr, ^177mSn, ⁶⁷Cu, ¹⁶⁷Tm, ⁹⁷Ru, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹⁹Au, ²⁰³Pb és¹⁴¹Ce.

A hasznos optikai tulajdonságú fémkomplexeket is leírták: Murru és tsai, J. Chern. Soc. Chern. Comm. 1993, 1116-1118. Optikai leképezésre kelátokat, lantanid kelátokat, például La(lll), Ce(lll), Pr(lll), Nd(lll), Pn(lll), Sm(lll), Eu(lll), Gd(lll), Tb(lll), Dy(IH), Ho(lll), Er(lll), Tm(lll), Yb(lll) és Ln(lll) kelátot használhatunk előnyösen. Különösen alkalmasak az Eu(lII) és Tb(lll).

A fémkelátoknak nem szabad disszociálni jelentős mértékben, miközben a leképező szer áthalad a testen, beleértve azt is, amíg egy célszövethez kötődik. Szabad fémionok jelentős felszabadulása toxicitást eredményezhet, ami általában nem elfogadható.

Az egyik változat szerint a fenti kontrasztanyag szerkezetére utalva m értéke 2; n, s, R¹ és R² jelentése a fenti, és a linkercsoport az alábbi képlettel jellemezhető:

A kelát előnyösen bb(CO)DTPAeGd.

Egy másik változat szerint a fenti szerkezetű kontrasztanyag esetében m értéke 2; n, s, R¹ és R² jelentése a fenti, és a linkercsoport a következő képlettel jellemezhető:

A kelátcsoport lehet bb(CO)DTPA*Gd.

Illusztrációs célra az alábbi, különböző alegységekkel jellemezhető kont20 rasztanyagot állítjuk elő:

ahol R jelentése aminosav oldalláncok, ahol a peptid affinitást mutat a biológiai célra, és m jelentése fémion (paramágneses MRI-hez, radioaktív a radionuklid leképezéshez, és fluoreszcens, lumineszcens vagy abszorbens az optikai leképezéshez).

A találmány szerinti optikai kontrasztanyagok kémiai szerkezetét a kővetkező képlettel jellemezhetjük:

(Optikai színezék)_m—(Unker)_p----(Unker- alegység^

(Linker-ialegység n

)s-----(Linker)_p-------(Optika színezéken, ahol 1<m<10, p jelentése egymástól függetlenül 0-5 közötti egész szám, n értéke 3-50 közötti egész szám, R¹ jelentése aminosav oldallánc, beleértve a nem természetes aminosav oldalláncokat, és R² jelentése alifás csoport vagy hidrogénatom. Egy változatképpen R¹ és R² együtt gyűrűs szerkezetet képezhet, beleértve a Pro-t és származékait. A peptid N- és C-terminális aminosavai konjugálva lehetnek az optikai színezékkel közvetlenül vagy egy optikai linker útján (pl. p = 0 vagy 1). A linkercsoportok különbözőek lehetnek.

i ’···. .*'. Τ’ ..... ..· ··;· ·..·

-34Az optikai színezék lehet szerves színezék vagy megfelelő fémkelát. A szerves színezékeket, melyek alkalmasak az optikai leképezésre, leírták, és idetartoznak például a fluoreszcens porfirin és fluoreszcens ftalocianinok (5 641 878 sz. USA szabadalmi leírás), a szemcsés anyagok (WO 96/23524 sz. nemzetközi közzétételi irat) és a polimetin színezékek (WO 97/13490 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentést). A szokásosan alkalmazott optikai szerves festékek a fluoreszcein, rodamin (Kojima H. és tsai, Anal. Chern. 73, 1967-1973 (2001)), a tetrametilrodamin (Anal. Biochem. 223, 39 (1994)), és a Texas vörös (Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 85, 3546 (1988)). A fluoreszcein és lumineszcens lantanid kelátok különösen hasznosak.

Targetek és target megkötő peptidek

A találmány szerinti kontrasztanyagok peptidcsoportja speciális kötődést mutathat biológiai targethez, és kapcsolódási pontként működhet minden terminusnál egy vagy több kelát esetében. Általában a biológiai targetek alacsony, például mikromoláris vagy kisebb koncentrációban vannak jelen, és nem hatékonyan képezhetők le a létező monomer gadolinium komplex MRI kontrasztanyagokkal. A találmány szerinti peptid-alapú multimer MRI kontrasztanyagok azonban a targetnél sokkal nagyobb koncentrációban biztosítják a szert, valamint nagy relaxivitást is biztosítanak, és ezzel lehetővé teszik ezen célpontok leképezését. Hasonlóképpen, a találmány szerinti peptid-alapú multimer radionuklid kontrasztanyagok több radionuklidot tudnak eljuttatni a targetekhez, így tovább javítható a leképezés. Miközben nincsen egy különleges mechanizmushoz kötve, feltételezhető, hogy a célra irányítás megnöveli a leképező szer koncentrációját a leképezendő helyen, és megnöveli az MRI kontrasztanyagok relaxivitását a megkötött állapotban a RIME hatás révén, és korlátozza a helyi kelátmozgást is a megkötött peptid merevítésével.

A kontrasztanyagok célpontjai bármilyen testüregben, sejtben, szervben vagy szövetben vagy annak komponensében lehetnek. Előnyösek azok a célpontok, amelyek diagnosztikailag és gyógyászatilag relevánsak, azaz amelyek betegségekkel kapcsolatosak. Különösen előnyös targetek a testfolyadékokkal kapcsolatosak, különösen azok, amelyek vérrel, plazmával, nyirokkal vagy a központi idegrendszer folyadékaival vannak kapcsolatban. Más előnyös targetek a proteinek és receptorok, amelyek vagy nagy koncentrációban fordulnak elő, vagy nagy számú • · · * * kötődési hellyel bírnak bizonyos ligandumok szempontjából. Ilyen target proteinek közé tartoznak az enzimek és a glikoproteinek.

A humán szérum albumin (HSA) és a fibrin hasznos targetek az MRI kontrasztanyagokhoz. Vaszkuláris blood pool leképezésre előnyös target a szérum albumin. Mivel a HSA nagy koncentrációban van jelen a szérumban (kb. 0,6 mmól koncentrációban), és széles körben köti meg a molekulákat elég nagy affinitással, ezért előnyös target plazma protein a blood pool kontrasztanyagokhoz. A HSA különösen előnyös célpont a kardiovaszkuláris leképezésre; lásd a 08/875,365 sz., 1997. július 24-én benyújtott USA szabadalmi bejelentést és a WO 96/23526 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentést.

A trombusok leképezésére előnyös target a fibrin, mert az összes vérrögben jelen van, és úgy lehet targetelni, azaz célirányítani, hogy közben ne befolyásolja a normális trombolitikus folyamatot. A fibrin-megkötő peptideket is magában foglaló target megkötő csoportokra vonatkozóan további részletek találhatók a WO 01/09188 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentésben.

A további protein targetek lehetnek például az alfasav-glikoprotein, fibrinogén, kollagén, trombocita GPIIb/IIIA receptor, kemotaktikus peptid receptor, szomatosztatin receptorok, vazoaktív bél peptid (VIP) receptor, bombezin/gyomorsav felszabadító peptid receptor és integrin receptorok.

A találmány szerint alkalmazható peptidekhez tartoznak a fent azonosított targetekhez specifikusan kötődők. Az ilyen peptidekhez tartoznak az RGD-t tartalmazó, trombocita GPIIb/IIIA receptorra célrairányító peptidek trombus leképezésre, továbbá kemotaktikus peptidek, amelyek fehérvérsejteket irányítják célra fertőzés/gyulladás leképezésre, szomasztatin receptorokra célrairányító Oktreotid és P-829 peptidek tumor leképezésre, VIP receptorra célrairányító vazoaktív bélpeptidek (VIP) tumor leképezésre, bombezin/gyomorsav felszabadulás peptid receptorra célrairányító bombezin analógok tumor leképezésre, és integrin ανβ3 (vitronektin) receptorra célrairányító RGD-tartalmú peptidek tumor leképezésre.

Elvben egy biológiai célpont iránt affinitással rendelkező bármilyen peptid használható a találmány szerinti kontrasztanyagban. A peptid lehet lineáris vagy ciklusos. Rendszerint az oldhatatlan lipofil peptideket alkalmatlannak tekintjük farmakológiái felhasználásra, de a találmány szerint az ilyen peptidek is alkalmasak lehetnek, mert hidrofil fémkelátok hozzáadása a peptid két terminusához megnövelheti az oldékonyságot. A szintézis megkönnyítésére és költségkímélő megfon··· ..· ^:ν· ·..*·

-36tolásokból előnyös, ha a peptidek 3-50 aminosavat, pl. 3-30, 3-20, 3-15, 5-30, 5-20, 5-15, 10-12 aminosavat tartalmaznak hosszúságban.

A találmány szerinti célrairányító peptidekben nagy számú aminosavat használhatunk. Alkalmas aminosavakhoz tartoznak a természetes és nem természetes aminosavak. A közvetlen felhasználásra alkalmas különböző védőcsoportokat tartalmazó aminosavak szilárd fázisú peptid szintézishez a kereskedelemben kaphatók. A 20 leggyakoribb, természetes előfordulású aminosavon kívül a következő, nem természetes aminosavak vagy aminosav-származékok lehetnek a találmány szerinti peptid célrairányító csoport alkotórészei (a szokásos rövidítéseket a zárójelben találjuk, lásd 1. ábra): β-alanin (β-Ala), γ-aminovajsav (GABA), 2aminovajsav (2-Abu), a^-dehidro-2-aminovajsav (Δ-Abu), 1-amino-ciklopropán-1karbonsav (ACPC), amino-izovajsav (Aib), 2-amino-tiazolin-4-karbonsav, 5-aminovvaleriánsav (5-Ava), 6-amino-hexánsav (6-Ahx), 8-amino-oktánsav (8-Aoc), 11amino-undekánsav (11-Aun), 12-amino-dodekánsav (12-Ado), 2-amino-benzoesav (2-Abz), 3-amino-benzoesav (3-Abz), 4-amino-benzoesav (4-Abz), 4-amino-3hidroxi-6-metil-heptánsav (sztatin, Sta), amino-oxi-ecetsav (Aoa), 2-amino-tetralin2-karbonsav (Atc), 4-amino-5-ciklohexil-3-hidroxi-pentánsav (ACHPA), paraamino-fenil-alanin (4-NH2-Phe), bifenil-alanin (Bip), para-bróm-fenil-alanin (4-BrPhe), orto-klór-fenil-alanin (2-CI-Phe), meta-klór-fenil-alanin (3-CI-Phe), para-klórfenil-alanin (4-CI-Phe), meta-klór-tirozin (3-CI-Tir), para-benzoil-fenil-alanin (Bpa), terc-butil-glicin (Tie), ciklohexil-alanin (Cha), ciklohexil-glicin (Chg), 2,3-diaminopropionsav (Dpr), 2,4-diamino-vajsav (Dbu), 3,4-diklór-fenil-alanin (3,4-CI2-Phe), 3,4-difluor-fenil-alanin (3,4-F2-Phe), 3,5-dijód-tirozin (3,5-l2-Tir), orto-fluor-fenilalanin (2-F-Phe), meta-fluor-fenil-alanin (3-F-Phe), para-fluor-fenil-alanin (4-FPhe), meta-fluor-tirozin (3-F-Tir), homoszerin (Hse), homofenil-alanin (Hfe), homotirozin (Htir), 5-hidroxi-triptofán (5-OH-Trp), hidroxi-prolin (Hip), para-jódfenil-alanin (4-l-Phe), 3-jód-tirozin (3-l-Tir), indolin-2-karbonsav (Ide), izonipekotinsav (Inp), meta-metil-tirozin (3-Me-Tir), 1-naftil-alanin (1-Nal), 2-naftilalanin (2-Nal), para-nitro-fenil-alanin (4-NO₂-Phe), 3-nitro-tirozin (3-NO₂-Tir), norleucin (Nle), norvalin (Nva), ornitin (Orn), orto-foszfotirozin (H₂PO₃-Tir), oktahidroindol-2-karbonsav (Oic), penicillamin (Pen), pentafluor-fenil-alanin ((F5Phe), fenil-glicin (Phg), pipekolinsav (Pip), propargil-glicin (Pra), piroglutaminsav (pGlu), szarkozin (Sár), tetrahidroizokinolin-3-karbonsav (Tie) és tiazolidin-4karbonsav (tioprolin, Th). Az aminosavak sztereokémiáját a rövidítés előtti D

-37 vagy d vagy L vagy I megjelöléssel jelöljük. Ezenkívül alkalmazhatunk aN-alkilezett aminosavakat, valamint amintartalmú oldallánccal rendelkező aminosavakat, például Lys és Orn aminosavat, ahol az amin acilezett vagy alkilezett.

A találmány szerinti peptidekhez tartoznak a P*-Y*-Xi*-L* általános képletű peptidek (SEQ ID. NO:1), ahol P* prolin vagy a prolin nem természetes származéka; Y* jelentése tirozin vagy nem természetes származéka; Xi* jelentése glicin vagy aszpartinsav vagy ezek nem természetes származéka, L* jelentése leucin vagy nem természetes származéka. Rendszerint P*, Y*, ΧΓ vagy L* közül legalább az egyik lehet a megfelelő aminosav nem természetes származéka. így például ΧΓ lehet glicin vagy aszpartinsav, L* lehet leucin, és P* és Y* közül legalább az egyik lehet egy nem természetes származék, pl. hidroxi-prolin vagy tirozin, amely a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm-, jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált.

A találmány szerinti peptidhez tartozhat az alábbi általános képletű peptid: Xi - X₂ - C - P* - Y* - X₃ - L - C - X₄ - Xs - Xe (SEQ ID. NO:2), ahol P* prolin vagy nem természetes származéka; Y* tirozin vagy nem természetes származéka; X1 jelentése W, Y, F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*) vagy Y(3*). Az F(3/4*) lehet a 3-as vagy 4-es helyzetben metil-, trifluor-metil-, amin-, amino-metil-, cianocsoporttal, fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal, etil- vagy metoxicsoporttal szubsztituált fenil-alanin. Y(3*) lehet a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált tirozin. X₂ jelentése E, H, dE, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr vagy Th; X₃ jelentése G vagy D; X4 jelentése H, F, Y vagy W; X₅ jelentése I, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nie, Tie, Nval, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4-Pal vagy F(3/4*), ahol F(3/4*) jelentése a 3-as vagy 4es helyzetben trifluor-metil-, etil-, izopropil- vagy metoxicsoporttal szubsztituált fenil-alanin; X₆ lehet N, W, I, L vagy V vagy nincs jelen. Xi, X₂, X5, P* és Y* közül legalább az egyik rendszerint egy aminosav nem természetes származéka. Például P* lehet prolin, és Y* lehet a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált tirozin nem természetes származéka. Egy másik változat szerint P* lehet prolin, például 4-hidroxi-prolin nem természetes származéka, és Y* lehet tirozin. Az ilyen peptidek nem reduktív körülmények között diszulfid kötést képezhetnek.

A fibrin megkötni képes peptid másik példája a következő általános képlettel jellemezhető: C - P* - Y* - X1 - L - C (SEQ ID. NO:3), ahol Xí jelentése G vagy D;

-38 P* jelentése prolin vagy 4-hidroxi-prolin nem természetes származéka; Y* jelentése tirozin vagy a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált tirozin nem természetes származéka. Rendszerint P* vagy Y* közül legalább az egyik a megfelelő aminosav nem természetes szárma5 zéka. A peptid például a következő szekvenciákkal rendelkezhet: W-dE-C-P(4-0H)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID. NO:4), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-l-Q (SEQ ID. NO:5), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID. NO:6), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-I-Q (SEQ ID. NO:7), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID. NO:8), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-Y-l-Q (SEQ ID. NO.9), Y10 -dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID. NO: 10), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-Y-l-Q (SEQ ID. ΝΟ.Ί1), F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-H-l-L (SEQ ID. NO: 12), Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID. NO: 13), W-dE-C-P-Y(3-CI)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID. NO: 14), W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID. NO: 15), vagy F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-H-l-L (SEQ ID. NO: 16). Az ilyen 15 peptidek nem redukciós körülmények között diszulfid kötéseket képezhetnek.

A WO 01/09188 vagy WO 01/08712 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentésekben leírt standard eljárások szerint az 1. táblázatban megadott szekvenciájú peptideket szintetizáljuk (a szerkezetet tömegspektrometríásan igazoljuk), majd ciklizáljuk és megvizsgáljuk a fibrin DD(E) fragmense iránti 20 affinitásra. Minden peptid esetében Kd < 10 pmól (- csonkítást jelez).

1. táblázat

Κά(μΜ)	:C P(4-OH) Y*	X3	L C X4	Xs	Χσ
vs. DD(E)	X1	X2
<0fl	F(4-OMe)	H	C': Hyp Y(3-C1)	D	L C H	I	L
<ofl	F(4-OMe)	H	C Hyp Y(3-C1)	D	L G Ή	I
<0.1	F(4-OMe)	H	£7 Hyp Y(3-I)	D	L C H	Bpa
<0.1	F	H	Hyp Y(3-I)	D	L C H	Hfe
<0,1	F	H	Cj Hyp Y(3-D	D	L C H	Bpa
<0.1	Y(3-C1)	H	ÍCÍ Hyp Y(3-I)	D	L C [H	1
<0.1	Y	D-E	C Hyp Y(3-C1)	G	L G W	I	Q

Kd(uM) r Ί	P(4-OH) Y*	X3	, L C %	; X5 1
vs. DD(E	Xi )		re·:
<0,1	F(4-OMe)	H		Hyp Y(3-I)	D	L C H	I I
<0,1	F(4-OMe)	H(Bzl) G	Hyp Y(3G1) D	L C Ή	Bpa
<0,1	F	H	iC	Hyp Y(3G1) D	L ,C H	I
<0,1	F(4-OMe)	H	c	Hyp Y(3-D	D	L G H	I
<01	3Pal	H	c :	Hyp Y(3-I)	D	L G H	I
<0.1	4Pal	H		Hyp Y(3-I)	D	L ÍG H	I
<0-1	F(4-F)	H	£ .	Hyp Y(3-D	D	L :C H	I
<0,1	Y(3-D	H	C.	Hyp Y(3-I)	D	L C ,H	I
<0.1	F	H	C.:	Hyp Y(3-J)	D	L C H	I L
<0,1	F(4-OMe)	H	g·.	Hyp Y(3G1) D	L C H	Bpa L
<0.1	F(4-OMe)	H	ÍC	Hyp Y(3-I)	D	L C ,H	Bpa L
<0,1	F	H(Bzl	) C 5	Hyp Y(3G1) D	L G H	I L
<0,1	INal	H		Hyp Y(3-I)	D	L C H	I
<0.1	MTyr	H	•c	Hyp Y(3-D	D	L ^ ·Η	I
<0.1	F(4-OMe)	H(Bzl	) c	Hyp Y(3-I)	D	L B\1H	Bpa
<0.1	F(4-OMe)	H(Bzl) C	Hyp Y(3-Cf	► D	L G ;H	I
<0.1	F	H	c	Hyp Y(3-0	D	L C ;3Pal	! I
<0,1	F(4-I)	H	c	Hyp Y(3-D	D	L C Ή	I
<0,1	F(4-Br)	H	c	Hyp Y(3-I)	D	L C Ή	I
<0,1	F(4-Me)	H	c	Hyp Y(3-D	D	L C H	I
<0.1	F(4-CF3)	H	c	Hyp Y(3-D	D	L G H	I
<0,1	F(4-CN)	H	:C ;	Hyp Y(3-I)	D	l ;g -:h	I
<0,1	Y(3-NO2)	H	c-	Hyp Y(3-I)	D	L ÍC Η	I
<0.1	Y(2-F)	H	G	Hyp Y(3-D	D	L C H	I
<0.1	F(4-CH2NH2)	H	G ·	Hyp Y(3-I)	D	L G H	I
<0.1	F(4-NH2)	H	g .	•Hyp Y(3-I)	D	L C- H	I
<0,1	F(34-F2)	H	c	Hyp Y(3-I)	D	L G*' H	I
<0.1	DopaMe2	H	g	Hyp Y(3-I)	D	l :c H	I
<0.1	F(2OMe)	H	Q	Hyp Y(3-I)	D	L ^.JH	I
<0.1	F(3-Me)	H	C	Hyp Y(3-I)	D	L C H	I
<0.1	F	H	C	Hyp Y(3-I)	D	L C H	I
<0.1	F	H	:é	Hyp Y(3-I)	D	L >G H	F(3-CF3)
<0.1	F(3-CF3)	H	c	Hyp Y(3-D	D	L C JH	I
<0.1	F(3-OMe)	H	C	Hyp Y(3-I)	D	L G Ή	I
<0.1	Hfe	H	C i	Hyp Y(3-I)	D	L C Ή	I
<0.1	nTyr	H	g ;	Hyp Y(3-I)	D	L ,C Ή	I
<0.1	W	E	C	Hyp Y(3GI)	G	L G W	I Q
<0.1	F	H	G !	Hyp Y(3-I)	D	L C H	I L
<0.1	F	H	c	Hyp Y(3-C1)	D	L :G jH	I L
<0.1	F(4-OMe)	H(Bzl)	ic	Hyp Y(3-I)	D	L C H	I
<0.1	F	H	c ,	Hyp Y(3-I)	D	L :c H	Nle
<0.1	F	H	g:	Hyp Y(3-I)	D	L C H	Tie
<0.1	F	H	G	Hyp Y(3-I)	D	L C ΊΗ	F(4-CF3)

-. .. ..···;··..·

Κά(μΜ) VS. Xl	X2	C	P(4-OH) Y*	x3	L C X4	xs	x6
DD(E) <0,1
F	H	:c -	Hyp	Y(3-I)	D	L C H	Bip
<0.1	F	H	c	Hyp	Y(3-D	D	L C H	F(4-Et)
<0.1	F	H	C 1	Hyp	Y(3-I)	D	L C H	F(4-OMe)
<0.1	F	H	c	Hyp	Y(3-D	D	L C H	F(3-OMe)
<0.1 <0.1	F(F5) F	H H	:C : C '	Hyp Hyp	Y(3-I) Y(3-F)	D D	L C H L C H	I I	L
<0.1	W	E	- c ,	Hyp	Y(3-C1)	G	L C W	I	Q
<0.2	T	D-E	c	Hyp	Y(3-C1)	G	L C W	I	Q
<0,2	F	H	c	P	Y(3-C1)	D	L C H	I	L
<0.2	Y(26-Me)	H	;GA	Hyp	Y(3-D	D	L C H	I
<0.2	W	E		Hyp	Y(3-CI)	G	L G H	I	Q
<0.2	D-F	D-E	IC·:	Hyp	Y(3-C1)	G	L C W	I	Q
<0.2	Y	E	b?	Hyp	Y(3-C1)	G	L C .Y	I	Q
<0.2	W	E	c .	Hyp	Y(3-CI)	G	L C F	I	Q
<0.2	H	D-E	c·:	Hyp	Y(3-C1)	G	L b· w	I	Q
<0.2	F	H	;ca	Hyp	Y(3-I)	D	L C H	I	L
<0,2	W	E	c	P	Y	G	L C- W	I	Q
<0.2	F	H	C ·	Hyp	Y(3-I)	D	L C Ή	nVal
<0 2	F	H	be	Hyp	Y(3-I)	D	L C H	Phg
<0.2	F	H	b<	Hyp	Y(3-D	D	L CH	F(3-Me)
<0.2	F	H	:C	Hyp	Y(3-I)	D	L C 4Pal	I
<0.2	S	D-E	:c I	Hyp	Y(3-C1)	G	L .C W	I	Q
<0.3	W	E		Hyp	Y(3-C1)	G	L b Ύ	I	Q
<0.3	Y	E	b'	Hyp	Y(3-C1)	G	L C W	I	Q
<0.3	F	D-E	ic.	Hyp	Y(3-C1)	G	l c<w	I	Q
<0.3	F	H	c	P	Y	D	L G H	I	L
<0.3	F	H	c	Hyp	Y(3-I)	D	L C II	I	L
<0.3	F	H	c	Hyp	Y	D	L C H	Bpa
<0.4	F	H	C. i	Hyp	Y(3-C1)	G	L C H	I	L
<0.4 <0.4	S(Bzl) H	H E	c ci-	P Hyp	Y Y(3-C1)	D G	L CiJH L C H	I I	L Q
<0.4	F(4-OMe)	H	c	Hyp	Y	D	L C H	I	L
<0.4	F	H	c	Hyp	Y(3-I)	D	L iC Bpa	I
<0.4	Ad	H	ic	Hyp	Y(3-I)	D	L C H	I
<0.5	F	H	-c	Hyp	Y(3-C1)	F	L C H	I	L
<0.5	F	E	c	Hyp	Y(3-C1)	G	L C W	I	Q
<0.5	F	H	:C *	Hyp	Y(3-C1)	2-NalL C jH	I	L
<0.5	F	H	b	Hyp	Y	D	L C H	I	L
<0.5	Hfe	H	c '	Hyp	Y	D	L C H	I	L
<0.5	Bip	H	c :	Hyp	Y	D	L C H	I	L
<0.5	W	E	:c	P	Y	G	l c :w	I	Q
<0.5	F(4-OMe)	W	jC:	Hyp	Y(3-I)	D	L C H	I
<0.5	F	H		Hyp	Y(3-I)	D	L C_<2PaI	I

Kd(pM) vs. DD(E) <0.5	X	X2		P(4-OH) Y*	x3	L ;C ;Xí	X5 Xí
F	H	C	Hyp	Y(3-I)	D	L	C Taz	I
<0.5	F	H	c	Hyp	Y(3-D	D	L	C Dhí	I
<0.5	Gu	H	C :	Hyp	Y(3-I)	D	L	C Ή	I

Egy peptid a következő általános képeltű is lehet: C-D-Y-Y-G-T-C-X10 (SEQ ID. NO: 17), ahol X10 jelentése n(decil)G, n(4-PhBu)G, MeL, Bpa, Bip, Me-Bip, F(4*), F(3-Me), F(3, 4-difluor), Amh, Hfe, Y(3, 5-dijód), Pff, 1Nal, d1Nal vagy MeL, ahol F(4*) jelentése a 4-es helyzetben etil-, trifluor-metil-csoporttal, jódatommal vagy izopropilcsoporttal szubsztituált fenil-alanin. Bizonyos változatok szerint egy peptid további maradékokat is tartalmazhat, X^ P* és/vagy Xn csoportot, és így a következő általános képletet kapjuk: C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11 (SEQ ID. NO: 18), vagy X^PX-D-Y-Y-G-T-C-Xw-Xu (SEQ ID. NO:26), ahol Xí jelentése természetes vagy nem természetes aminosav, P* jelentése prolin vagy nem természetes származéka, és Xn jelentése D, dD, βϋ, Inp, Nip, Me-D, Cop vagy Cmp. így például egy peptid szekvenciája a következő lehet: L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(decil)G-dD (SEQ ID. NO:19), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(decil)G-D (SEQ ID. NO:20), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D (SEQ ID. NO:21), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD (SEQ ID. NO:22), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-lnp (SEQ ID. NO:23), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp (SEQ ID. NO:24) vagy L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D (SEQ ID. NO:25).

A SEQ ID. NO:26-os képletű peptideket állítottuk elő (a szerkezetet tömegspektrometriásan igazoltuk), a szintézist standard módszerekkel végeztük, például a WO 01/09188 vagy WO 01/08712 sz. nemzetközi közzétételi irat szerint, és megvizsgáltuk a fibrin DD(E) fragmensének affinitására. Minden peptid Kd értéke < 10 pmól (2. táblázat).

2. táblázat

Xoi	Χίο	Xn
L	n(decil)G	dD
L	n(decil)G	D
L	MeL	Inp
L	Bip	D
L	Bip	dD
L	Me-Bip	D
L	MeL	Cmp
L	Bip	D
L	L	D
Cha	Bip	0 I

A peptidek azon képessége, hogy megkössenek egy targetet, például HSA-t vagy fibrint, ismert módszerrel állapítható meg. így például a peptid fibrin iránti affinitását fibrin DD(E) fragmensének alkalmazásával lehet felbecsülni, mely fibrin 55 kD alegységet (E fragmenst) és 190 kD alegységet (DD fragmenst) tartalmaz. A DD(E) fragmens biotinilezhető és immobilizálható avidinen keresztül egy szilárd anyaggá (például többüregü lemezzé). A peptideket a rögzített DD(E) fragmenssel megfelelő pufferben lehet inkubálni, és a kötődést ismert módszerrel lehet kimutatni (lásd pl. a WO 01/09188 sz. nemzetközi közzétételi iratot).

N- és C-terminus linker-alegységek és linker

Ha jelen vannak, akkor a linker-alegységeket és a linkereket használjuk, hogy kovalensen kapcsoljuk össze a fedömolekulákat, például kelátokat, trombolitikumokat és egyéb csoportokat a peptid két végével. Egy linker-alegység csoport (i) átalakíthatja a C-terminus karboxilát funkciós csoportját egy amin funkciós csoporttá, vagy az N-terminus amint egy karboxilát funkciós csoporttá, vagy (ii) a peptid terminus és a linker közé, ha jelen van, egy spacer csoportot vagy egy fedőcsoportot vihetünk. Az egyik változat szerint egy peptidet reagáltathatunk egy linker-alegységgel C-terminális amin funkciós csoportot és N-terminális amin funkciós csoportot tartalmazó módosított peptid kialakítására. Egy másik változat szerint egy peptidet egy linker-alegységgel reagáltatva N-terminális karboxilát funkciós csoportot és C-terminális karboxilát funkciós csoportot tartalmazó módosított peptidet alakíthatunk ki. Egy további változat szerint egy peptidet egy gyantához kötött C-terminális linker-alegységböl szintetizálhatunk, miáltal a peptid gyantáról történő lehasítása következtében egy C-terminális amin funkciós csoportot tartalmazó peptidet állítunk elő. Egy további változat szerint egy linker-alegységet spacer csoportként használhatunk, és nem pedig a terminális funkciós csoport megváltoztatására. Egy linker-alegység többszörös funkciós csoportokkal rendelkezhet a linkercsoportok vagy fedömolekulák kapcsolására. Többféle reakciótípust használhatunk, beleértve az acilezést, redukciós aminálást, nukleofil helyettesítési reakciókat, karbamid képzést, tiokarbamid képzést, és kemoszelektiv ligálást végezhetünk, miközben kémiailag kondenzáljuk a linker-alegységet a pepiiddel, línkerrel és/vagy a véglezáró csoportokkal. A linker-alegység alkalmazásának egyik előnye, hogy a pepiiden hasonló funkciós csoportokat lehet kialakítani, es ezáltal meg lehet könnyíteni az ezt követő szintézist.

A linkercsoportot használhatjuk arra, hogy kovalensen kapcsoljunk össze egy vagy több fedőcsoportot a peptid terminusszal. A linker lehet elágazó vagy egyenes láncú, és többszörös funkciós csoportot tartalmazhat a prekurzor kelathoz es a kelát kapcsoláshoz. A linker kémiai szerkezete befolyásolhatja a kontrasztanyag fizikai és farmakológiai tulajdonságait, mint például az affinitást, stabilitást, ver felezési időt relaxivitást, plazma protein kötődést. A linkerek szubsztituálva lehetnek alkil-, aril-, alkenil- vagy alkinilcsoportokkal. A linkerek, ha jelen vannak, minden terminuszon viszonylag kicsik és merevek az MRI kontrasztanyagokhoz. így például egy linker molekulatömege kb. 350 alatt lehet (pl. kb. 200 alatti)......

Egy C-terminális linker-alegység csoport és egy C- és N-termmalis linker illusztrálását a következő szerkezet mutatja.

Linker

Linker

-44Egy peptid C-terminális karboxilátját átalakíthatjuk egy linker-alegységgel, például egy diamin színtannal amin funkciós csoporttá, és így a peptid mindegyik végén amin funkciós csoportot tartalmazó pepiidet kapunk, amelyhez kapcsolhatjuk a maradék linkercsoportot. Az ilyen módosított peptidek, amelyek C-terminális amin funkciós csoportot tartalmaznak, a következők:

ahol n értéke 1-4.

Sok C-terminális linker-alegységet előnyösen szilárd fázisú gyantából állít hatunk elő:

Az alábbi (R) gyanták szerezhetők be a Nova Biochem-től:

Bizonyos esetekben az alábbi linker-alegységeket használhatjuk spacer csoportként az N-terminális amin funkciós csoportoknál:

ahol a bázis purin vagy pirimidin bázis (Ad - adenozin, Gu - guanozin, Th = timin, Cy = citozin) és LG kilépőcsoport, például hidroxilcsoport, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid.

Ezen túlmenően alkalmazhatunk αΝ-alkilezett aminosavakat, valamint amintartalmú oldallánccal rendelkező aminosavakat (pl. Lys és Orn), ahol az amin az alábbi példák szerint acilezve vagy alkilezve van:

Ο ahol η értéke 0-3 közötti egész szám, R jelentése alifás vagy aromas csoport, és LG jelentése kilépőcsoport, pl. hidroxi lesöpört, aktivált észter, halogemd vagy anhidrid.

További linker-alegységek lehetnek a következők.

ahol n értéke egymástól függetlenül 1 vagy 2, R jelentése alifás vagy aromas csoport, és LG kilépőcsoport, pl. hidroxilcsoport, aktivált észter, halogemd vagy anhidrid.

A linkercsoportok, amelyek alkalmazhatók, ha amidkötés konstrukciós stratégiát követünk, amelyben a peptid molekulának két terminális amincsoportja van, a következők lehetnek:

ahol mindegyik m egymástól függetlenül 1-4 közötti egész szám, n egymástól függetlenül 0-4 közötti egész szám, beleértve a 4-et is, LG kilépöcsoport, és R' 15 vagy R egymástól függetlenül hidrogénatom vagy kémiai védöcsoport.

Egy linkercsoport is rendelkezhet elágazási pontokkal két vagy több kelat összekapcsolására. így például, ha egy amidkötés képzési stratégiát követünk, akkor egy karbonilcsoportot tartalmazó linkért, amely LG kilépöcsoportot tartalmaz (pl. karbonsav vagy aktivált észter), és 3 vagy több védett amint reagáltathatunk 20 egy peptid aminnal 3 vagy több terminális amint tartalmazó molekula előállítására. A 3 vagy több amin funkciós csoport bevezetésére az alábbi karbonil-alapú linker reagensek jöhetnek szóba:

NR^²

NR¹R²

-48ahol LG jelentése kilépöcsoport, pl. hidroxilcsoport, aktivált észter, pl. pentafluor-fenol (Pfp), N-hidroxi-szukcinimid (NHS), N-hidroxi-szulfo-szukcmimidnátriumsó (NHSS), 2-tioxo-tiazolidin-1-il vagy hidroxi-benzotriazol (HBT), és R és R² előnyösen egymástól függetlenül hidrogénatom vagy kémiai védőcsoport, pl.

Boc, Fmoc, CBZ, t-butil-, benzil- vagy allilcsoport.

További változatok szerint egy peptid N-terminuszán amin funkciós csoportot tartalmazó vegyületet átalakíthatunk egy N-terminális karboxilát funkciós csoporttá, ha ciklusos savanhidriddel (linker-alegység csoport) reagáltatjuk, es így módosított pepiidet kapunk, amely N-terminális karboxilát funkciós csoportot tartalmaz:

M-^-Ftepfid -CC^H +

terminális karboxilátok

Az N-terminális amin karboxilát funkciós csoporttá alakításához használható további linker-alegységek a következők:

ahol R jelentése bármilyen alifás vagy aromás csoport.

A fenti példában ezt követően mindkét terminális karboxilátot egyidejűleg reagáltathatunk egy aminocsoporttal egy linkercsoporton az alábbiak szerint, egy prekurzor MR leképező szer előállítására. Ebben a példában a prekurzor MR le-49képezö szer egy peptid molekula, amelyet mindkét végén linkerrel tovább alakítunk amid kötéseken keresztül:

A két karboxiláttal végződő prekurzor MR leképező szerek előállításához használatos további linkercsoportok a következők.

RO_!C^^'^'-^CO₂R ,

ahol mindegyik m egymástól függetlenül 1-4 közötti egész szám, beleértve a 25 4-et, n jelentése egymástól függetlenül 0-4 közötti egész szám, beleértve a 4-et (pl. n = 1 vagy 2), és R jelentése hidrogénatom vagy kémiai védöcsoport, például metil-, etil- benzil- vagy t-butil-csoport. Ezekben a példákban a linker-alegységek kapcsolódását követve a védőcsoportokat eltávolíthatjuk, és a kelátképző vagy prekurzor kelátképző csoportokat standard módszerekkel kapcsolhatjuk, pl. 30 amidkötést alakíthatunk ki.

Ha egy amidkötési konstrukciós stratégiát követünk, amelyben egy peptid molekula két karboxiláttal van lezárva, az alábbi linker reagensek alkalmasak 3 vagy több amin funkciós csoport bevezetésére:

ahol R¹ és R² egymástól függetlenül hidrogénatom vagy kémiai védőcsoport, pl. OS, Boc, Fmoc, CBZ, t-butil-, benzil-vagy allilcsoport.

Az amidkötések képzéséből álló linker stratégiák alkalmasak, mert rendszerint kompatibilisek a pepiiden levő védőcsoportokkal. Mint említettük, a peptid, a linker és a linker-alegységek kovalensen kapcsolódhatnak egymáshoz más kötéstípusok képzésével (nukleofil helyettesítés, reduktív aminálás és tio-karbamid kép zés stb.).

A linkerek hathatnak a kontrasztanyagok tulajdonságaira is, például az affinitásra, a farmakokinetikai tulajdonságokra, az in vivo stabilitásra és relaxivitásra.

Egy másik változat szerint egy linkercsoportot és egy kelátképző vagy kelátképző prekurzor csoportot tartalmazó kovalens konjugátumot közvetlenül is reagáltathatunk egy megfelelő terminális funkciós csoportot tartalmazó pepiiddel. Az egyik ilyen kovalens konjugátum, amely alkalmasa terminális karboxilátcsoportokkal való reagáltatásra, a következő.

_ah0| _n = 1-4 közötti egész szám, és R¹, R², R³, R⁴ és R⁵ jelentése egymástól függetlenül acetát-, acetamid- vagy acetoxicsoport.

Egy ilyen kovalens konjugátum például a következő szerkezetű lehet:

'Kelét prekurzor ahol R¹, R², R³, R⁴ és R⁵ jelentése egymástól függetlenül acetát-, acetamidvagy acetoxicsoport.

Egy kovalens konjugátum, amely alkalmas lehet egy két végén karboxilát 15 funkciós csoportokat tartalmazó módosított peptid prekurzor leképező szerré alakítására, a következő szerkezetű lehet.

(CH₃)₃CO₂C (CH₃)3CO₂

CO₂C(CH₃)3

NH (CH₃)₃CO₂C (CH₃)₃CO₂C

NH

CO₂C(CH₃)₃

CO₂C(CH₃)₃ '---CO₂C(CH₃)₃

Egy olyan kovalens konjugátum, amely alkalmas egy módosított pepiiden levő amin funkciós csoportokkal való reagáltatásra, a következő:

ahol LG kilépőcsoport, n értéke 1-4 közötti egész szám, és R¹, R², R³, R⁴ és R⁵ jelentése egymástól függetlenül acetát-, acetamid- vagy acetoxicsoport, és

ahol LG kilépöcsoport, ahol R¹, R², R³, R⁴ és R⁵ jelentése egymástól függetlenül acetát-, acetamid- vagy acetoxicsoport.

Különösen alkalmas kovalens konjugátum multimer kontrasztanyag szintetizálására a következő szerkezetű, amely az alábbiakban Synthon 1 néven szerepel:

További kovalens konjugátum, amely alkalmas egy multimer szmtetizalasara, az alábbiakban Synthon 2:

-54A következő példában egy találmány szerinti MR kontrasztanyag szerepel, amely magában foglalja a fent leírt peptidet, és az N-terminus linker hatása az MRI kontrasztanyag relaxivitására a következő:

Ebben a példában a kelát kifejezés bb-DTPA-Gd(lll) vegyületre utal.

A fenti linker-alegységet a következő eredményekkel változtatjuk (relaxivitás/Gd(lll) ion meghatározása 20 MHz-nél és 335 °C-nal, egysegek: mM'¹s¹):

Fibrin affinitás	N-terminális linkeralegység	Relaxivitás PBS	Relaxivitás Fibrin DD(E) (10 mg/ml)
15-ös szerkezet Ki = 4,0 μmól	o	11,7	18,7
16-os szerkezet Ki = 3,4 μmól		12,6	29,5
32-es szerkezet Ki = 4,7 μmól	(vegyértékvonal)	12,5	21,6

Mint fent kimutattuk, a 15-ös és 16-os szerkezet hasonlít a 32-eshez, azzal a különbséggel, hogy különböző N-terminális linker-alegységeket tartalmaz. A kísérleti eredmények azt mutatják, hogy egy linker hatással lehet a relaxivitásra, valamint a találmány szerinti kontrasztanyag más jellemzőire.

Kelátképző csoportok és reagensek

A kelátképző csoportok fémionokkal komplexált kelátképző ligandumok. Ezek a kelátképző csoportok egy szintetikus csoportot tartalmaznak, amely alkalmas egy linkerrel, linker-alegységgel és/vagy módosított pepiiddel való kapcsolódási pont kialakítására. Egy vagy több kelátképző csoportot kovalensen konjugálhatunk a funkciós csoporttal a módosított peptid mindegyik végén. Az egyik változat szerint a kelátot egy linker-alegységhez kapcsoljuk. Egy másik változat szerint a kelát a linkercsoporthoz kapcsolódik. Más megoldásokban a kelát konjugálva lehet egy linkercsoporttal, és így kovalens konjugátumot képez, mielőtt a kovalens konjugátum a módosított pepiidhez kapcsolódna.

A prekurzor kelátképző csoportok kelátképző ligandumok, amelyek nincsenek komplexálva fémionokkal. A kelátképző ligandumok tartalmazhatnak védőcsoportokat, vagy a kelátképző ligandumok prekurzorai lehetnek. A prekurzor kelátképző csoportok tartalmaznak egy olyan szintetikus csoportot, amely alkalmas linkerrel, linker-alegységgel és/vagy módosított peptiddel való kapcsolódási pont

-56képzésére. A prekurzor kelátképzö csoportokat kelátképzó csoportokká alakíthatjuk fémionnal történő komplexálással. Egy vagy több prekurzor kelátcsoportot kovalensen konjugálhatunk a módosított peptid minden végén a funkciós csoporttal. Az egyik változat szerint a prekurzor kelát kapcsolódhat egy linker-alegységhez. Egy másik változat szerint a prekurzor kelát egy linkercsoporthoz kapcsolódik. Más megoldások szerint a prekurzor kelát kondenzálva lehet egy linkercsoporttal, és így kovalens konjugátumot képez, mielőtt a kovalens konjugátum a módosított pepiidhez kapcsolódna.

A találmány szerinti prekurzor kelátcsoportok és kelátcsoportok a következő szerkezetűek lehetnek:

-57^{X N} ’S _ah0| X jelentése heteroatom elektron-donor csoport, amely alkalmas egy fémkation koordinálására, például O', OH, NH₂, OPO₃ ²', NHR vagy OR, ahol R jelentése alifás csoport; R¹ jelentése töltés nélküli kémiai csoport, például hidrogénatom, alifás, alkil- vagy cikloalkilcsoport, vagy töltés nélküli szubsztituált változatai, például alkoholok; és Y jelentése szintetikus csoport, például amely kapcsolódási pont képzésére alkalmas, vagy maga a kapcsolódási pont, a módosított peptid, linker és/vagy linker-alegység funkciós csoportjához történő kapcsolásra közvetlenül vagy közbeeső karbonil-, metilén-, metilén-oxigén-, tio-karbonilcsoporton keresztül. Használhatunk koordinált fémionnal rendelkező (kelátcsoport) vagy azzal nem rendelkező csoportokat (prekurzor kelátcsoport).

A találmány szerinti kontrasztanyagokban különböző kelátképző ligandumok alkalmazhatók. Az ilyen kelátképzö ligandumok lehetnek pl. DTPA, DOTA, ΝΟΤΑ vagy D03A származékok. Az MRI-hez különösen alkalmasak a fémkelátok, pl. gadolinium-dietilén-triamin-pentaacetát (DTPA.Gd), gadolinium-tetraamin_ 1 4 7₎io-tetraazaciklododekán-N,N',N,N'-tetraacetát (DOTA*Gd) és gadolinium-1,4,7,10-tetrazaciklododekán-1,4,7-triacetát (DO3A.Gd). Különösen alkalmas kelát a bb (CO)DTPA®Gd. Egyéb fémeket alkalmazhatunk az MRI alkalmazás során a Gd(lll) helyett.

A multimer kelátok előállításához szintetizált funkciós kelátok lehetnek pl. pNCS-Bz-DTPA (Martin, V. és tsai, Bioconjugate Chem. 6, 616-23, 1995) és Gd(4-NCS-fenil)-amino-karbonil-metil-DO3A (Ramachandran, R. és tsai, Invest. Rad, 1998 33(11) 779-797)· Egy targethez kötött optimális relaxivitáshoz gyakran kívánatos a kelátmozgás minimalizálása, ezáltal minimális számú kovalens kötés kívánatos, amely a targetet összekapcsolja a kelátképző ligandummal. Az alábbiakban található egy példa egy reagensre, amely karbonilcsoport vázu kelátképzö ligandumot tartalmaz, hogy összekapcsoljon egy amin funkciós csoportot vagy egy linker-alegységet vagy linkért, ahol LG jelentése kilépőcsoport, például aktivált észter, és R jelentése egy olyan csoport, amely könnyen lehasítható O képzésére (-OtBU, pl. karboxilát-észter), és ezáltal a szomszédos karbonilcsoporttal karboxilátcsoportot képez:

karbonilcsoport, amely kelátképző ligandumvázhoz kapcsolódik

ROC N

COR ROC o

Azt találtuk, hogy egy kelátképzö ligandummal közvetlenül szomszédos karbonil kémiai motívuma nagy relaxivitású MRI kontrasztanyag csoportját képezi.

A jelen találmány kiterjed az MRI kontrasztanyagok szintéziséhez hasznos intermedierekre is a következő képlet szerint.

LG. /0

R¹R²N ^N'^^^kNR⁴R⁵ és rí r2n'^>-'^N^^'NR⁴R⁵

LG O ahol R¹, R², R³ R⁴ és R⁵ lehet védve vagy egy nem védett acetil ligandum, amely egy paramágneses fémkelát képzésére alkalmas megfelelő képzési állandóval, ideértve a következőt:

o és ° ahol P bármilyen védőcsoport, pl. benzil- vagy terc-butil-csoport. LG kilépőcsoport és jelentése -OH és észterformája, amely lehet NHS észter, pentafluorfenol vagy más aktivált észterek.

-59··· · · · ***

j. .?^:·? ·.;·

Különösen előnyös, ha LG jelentése hidroxilcsoport, és R , R , R , R és R jelentése ΟΗ₂ΟΟ₂Ο*Βυ, ami az alábbiakban Synthon 3 néven szerepel, és szerkezete a következő:

Hí

O₂C(CH₃)₃ (H₃C)₃CO₂C^/^'N •N^CO₂C(CH₃)₃ (H₃C)3CO₂i ‘ΟΟ^ΟΗ^

A találmány szerinti kontrasztanyag szintéziséhez a következő reagenst is használhatjuk:

co₂h xco₂c(ch₃)₃ (Η₃Ο)₃ΟΟ₂€Κ^Ν^~^ ^^Ν^0Ο₂0(0Η3)3 (H₃c)₃co₂cr Όοχχ (vide Sva. Comm. 30, 3755 (2000).)

A találmány kiterjed vegyületek előállítási módszereire is. Különösen egy uj oxidációs reakció teszi lehetővé a Synthon 3 könnyű előállítását, egy kelátképző ligandum előnyös megvalósítási formáját. A Synthon 3 szintézisét két különböző szintetikus úton érhetjük el, mind a kettő hidroxi-metil-dietilén-triaminból indul ki. Az egyik út szerint egy kétlépéses szintézissel (alkilezéssel, majd oxidációval) járunk el, a másik egy hatlépéses eljárásból áll (védőcsoport kialakítása, oxidáció, észterezés, védőcsoport eltávolítása, alkilezés és hidrogenolízis). Mind a kettővel Synthon 3-at állíthatunk elő jó kémiai és optikai tisztasággal (lásd az alábbiakban a példákat).

Az 5 637 759 sz. USA szabadalmi leírásban a Synthon 1 szintézise szerepel 2,3-diamino-propionsavból és aza-lizinböl egy szelektív hidrolízissel, nátriumtiofenoxid felhasználásával. Az itt leírt módszer elkerüli ennek a toxikus reagensnek az alkalmazását.

A kontrasztanyagok szintézise

A peptid-alapú kontrasztanyagok szintézisét az alábbi lépésekkel hajthatjuk végre. Először egy célirányzott peptidet szintetizálhatunk egy C-terminális linker-60*· * · ·*♦ * ♦ j. <·^:·;· <· alegységgel vagy anélkül, rendszerint szilárd fázisú peptid szintézissel. Az itt leírt ciklusos peptidekhez egy védett lineáris pepiidet ciklizálhatunk oldatban vagy a gyantán. Egy nem védett peptidet ciklizálhatunk oldatban is vagy gyantán. Egy Cterminális linker-alegységet kaphatunk a szilárd fázisú szintézis gyantából, és egy N-terminális linkért vagy N-terminális linker-alegységet kondenzálhatunk a pepiidhez a szilárd fázisú szintézis folyamán. Rendszerint a ciklizálást követően a linker-alegység-kelát prekurzor csoportokat kapcsoljuk a pepiidhez. A védőcsoportokat eltávolítjuk, így kapjuk a ligandum prekurzorokat, majd kelátokat állítunk elő. A találmány szerinti radionuklid vegyületeket ligandum prekurzorokból állítjuk elő kereskedelemben hozzáférhető radionuklidekből (például ^99mTc-böl, Nycomed Amersham Boston, kát. RX-290195; ¹¹¹ln-ből, NEN Life Science Products, kát. NEZ304; vagy ¹⁵³Gd-ből, NEN Life Science Products, kát. NEZ142) vizes közegben való reagáltatással, rendszerint 4-6 pH mellett, 1 óra hosszat. Az optikailag aktív kontrasztanyagok esetében egy szerves festéket használhatunk kelát prekurzor helyett.

A kontrasztanyagok szerkezete:

(szintézis a 32 analógiájára)

J. <· Η· ·.>

-64 18

GcJ-DTPA-OO-NH

-66 28

Η

,ί ’··

-69 37

-72 45

Η

-73 J. ·.? i’ ·.?

-75 . ..j..

-76A kontrasztanyagok tulajdonságai

A találmány szerinti vegyületek stabilabbak, mint a kiindulási peptidek az endogén enzimekkel való lebontás szempontjából (azaz kapcsolódó kelát nélküli peptidekhez képest), mint az olyan peptid, amely egy vagy több keláttal kapcsolódik az N-terminuszhoz, vagy az olyan peptid, amely egy vagy több keláttal a Cterminuszhoz kapcsolódik. Az in vivo stabilitás megbecsülésére tesztvegyületeket inkubálhatunk patkánymáj homogenizátumokkal. Kiválasztott intervallumok után a reakciókat befagyaszthatjuk és az elegyet centrifugáljuk, és a felülúszót folyadékkromatográfiásán, illetve tömegspektrometriásan analizálva meghatározhatjuk a visszamaradó vegyület mennyiségét.

A találmány szerinti vegyületek egy targetet is megkötnek, pl. humán szérum albumint vagy fibrint. így például legalább 10 %, pl. legalább 50 %, 80 %, 90 %, 92 %, 94 % vagy 96 % kontrasztanyagot köthetünk a kívánt targethez a gyógyszer és a target fiziológiailag releváns koncentrációja mellett. A kontrasztanyag targethez való kötődésének mértékét, pl. HSA vagy fibrin esetében, különböző egyensúlyi kötődési módszerekkel határozhatjuk meg. Például a HSA-hoz való kötődést ultraszűréssel mérhetjük. A fibrinhez való kötődés mérésére egy fibrinrögöt képezhetünk egy miktrotiterű lemez üregében, és a cél irányzott csoporttal hozzuk érintkezésbe. Az egyensúly létrehozásához elegendő inkubáció idő után leszívatjuk a felülúszót, és az oldhatatlan fibrin az üreg alján gélesített rög formájában marad megkötve. A nem megkötött célirányzott csoport koncentrációját a felülúszóban ezután megmérjük. Mindkét módszer szerint a megkötött kontrasztanyag koncentrációját úgy határozzuk meg, hogy az a kezdetben jelenlevő ossz célirányzott csoport koncentrációja és a kötődési kísérletet követően a nem megkötött cél irányzott csoport koncentrációja közötti különbség. A megkötött frakció a megkötött célirányzott csoport koncentrációja, osztva az ossz cél irányzott csoport koncentrációjával.

A találmány szerinti vegyületek nagyfokú relaxivitást mutathatnak a target kötődés eredményeképpen (pl. fibrinhez), és ez jobb leképezési felbontáshoz vezethet. A kötődés hatására bekövetkező relaxivitás növekedés rendszerint 1,5szeres vagy ennél nagyobb (például legalább 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10-szeres) növekedés áll be a relaxivitásban. A 7-8-szoros, 9-10-szeres vagy még 10szeresnél is nagyobb növekedések a célzott kontrasztanyagok relaxivitásában különösen hasznosak. Rendszerint a relaxivitást NMR spektrométer segítségével

-77 mérjük. Egy MRI kontrasztanyag előnyös relaxivitása 20 MHz-nél és 37 °C-nál legalább 10 mM-1s-1 / paramágneses fémion (pl. legalább 15, 20, 25, 30, 35, 40 vagy 60 mM-1s-1 / paramágneses fémion). A 60 mM-1-s-1-nél nagyobb relaxivitású szerek 20 MHz-nél és 37 °C-nál különösen hasznosak.

Ahogy leírtuk, a célzott kontrasztanyagok a rögfelvétel növekedését mutathatják. A fibrin-célzott szerek felvételének specifikusságát meghatározhatjuk, ha összevetjük a szer vérrögök által történő felvételét a vér által történő felvétellel (lásd a 11. példában a részleteket). A fibrin-célzott kontrasztanyagok specifikusságát kimutathatjuk MRI-vel is, és a rög szignál fokozódásának megfigyelésével.

A találmány szerinti peptidek és kontrasztanyagok alkalmazása

A találmány szerinti peptideket arra használhatjuk, hogy a tromboembóhas betegségek kezelésének gyógymódjait javítsuk. A jelenleg használatos trombolitikus terápia korlátokkal rendelkezik, ideértve a vérzés jelentős rizikóját, a vérkeringés visszaállításának sikertelenségét, a terápia megszüntetése utáni trombotikus újraelzáródást és a terápia kezdete és rög felszívódása közötti időkülönbséget. Jobb terápiás indexet lehet elérni, ha a találmány szerinti fibrincélirányos peptidet konjugáljuk egy trombolitikus szerrel (pl. egy protein trombolitikummal, például amilyenek a humán vagy bakteriális eredetű plazminogén aktivátorok). Az ilyen konjugátumok aktiválhatják helyileg a plazminogént, vagy növelhetik a tPA endogén szintjeit. Például egy fibrincélirányított peptidet konjugálhatunk egy humán plazminogén aktivátorral, beleértve a rekombináns szövet típusú plazminogén aktivátort (tPA), a prourokinázt és urokinázt (mind az egy-, mind a kétláncú formát), valamint a baktérium-eredetű plazminogén aktivátort, például sztreptokinázt, sztaphylokinázt, és állati eredetű plazminogén aktivátorokat, például vámpír denevér plazminogén aktivátort. Ezenkívül a fibrin-célirányított peptidek konjugálhatók fibrinolitikumokkal is, például rezes fejű kígyó fibrolázzal, amely közvetlenül fibrinolitikus hatást fejt ki. Az ilyen enzimek és proteinek a kereskedelemben kaphatók, természetes forrásokból vagy szövetekből extrahálhatók, vagy rekombináns úton állíthatók elő.

A találmány szerinti készítményeket ismert módon kapcsolhatjuk össze vagy kondenzálhatjuk, hasonló típusú linkereket használhatunk, mint amelyeket a fentiekben az MRI kontrasztanyagok konstruálásával kapcsolatban említettünk. A proteinnel való konjugáció elérhető standard kémiai módszerekkel, például amid, észter, diszulfid és tioéter kötések képzésével. Például egy fibrin-kötő peptidet .:. ,.· ·..· ··/· ·..·

-78kovalensen kapcsolhatunk össze közvetlenül vagy egy linkeren keresztül egy proteinnel úgy, hogy a fibrint megkötő pepiid vagy a linker és a protein felületén levő lizin maradékok között amidkötést alakítunk ki. Ezek a felületi lizin maradékok rendszerint távol vannak az enzim katalitikus helyétől. Ezért a megkötött csoportok nem hatnak az enzim katalitikus aktivitására. A sokszoros ligálást egyetlen lépésben lehet elérni. A fibrin-célirányított peptid és a trombolitikum vagy fibrinolitikus szer aránya irányítható a ligációs kémiai sztöchiometriájának beállításával. A többszörös ligálás különösen hasznos a mérsékelten erős fibrin kötő ligandum esetében, mert nagyobb kötődési affinitást lehet elérni az úgynevezett aviditás (támadóerő) hatás révén. Különösen egy kondenzálószert vagy aktivált észtert használhatunk az amidkötés kialakítására a lizin- és a fibrinkötő csoport vagy a linker között. Az alábbi séma bemutat egy példát egy hibrid molekuláról, amely urokináz többszörös fibrin megkötő peptidekhez való kémiai ligálása révén képződik, linkercsoportokon keresztül. A felületi lizin maradékok száma és a fibrinkötő molekulák száma illusztrációs célokat szolgál. Egy alternatív megoldás szerint a fibrin célirányított pepiidet beépíthetjük a hibrid molekulába rekombináns DNS technológia alkalmazásával.

Bizonyos esetekben a találmány szerinti peptideket trombolitikus szerhez kapcsolhatjuk egy linkerrel, amely magában foglal egy enzimes hasítási helyet, például rendszerint a koagulációs kaszkádban enzimekkel hasított enzimes hasítási helyet, pl. Xa faktor, trombin vagy plazmin hasítási helyek stb. A trombolitikus szer addig nem aktiválódik, ameddig le nem hasad találmány szerinti, rögöt megkötő készítményekről a rög helyszínén, a nem kívánatos vérzési események rizi

-79.:. ,.· ·..· *τ ·..· kója minimalizálódik a rögtől távoli helyeken. Ezenkívül trombolitikus csoportokat peptid-célzott multimer kontrasztanyaghoz lehet kapcsolni úgy, hogy a rög azonosítható, leképezhető és feloldható legyen.

Az itt leírt módon előállított kontrasztanyagokat ugyanúgy lehet használni, mint a szokásos MRI kontrasztanyagokat, és alkalmasak mélyvénás trombózis, tüdőembólia, koszorúér trombózis, nyaki és koponyán belüli trombózis, pitvari és kamrai trombusok, aortás ív alakú trombusok és nagy rizikójú plakkok diagnózisára. Egy trombus leképezésénél bizonyos MR technikákat és pulzus szekvenciákat előnyösebb használni a háttér vérrel és szövettel összevetve a trombus kontrasztjának növelésére. Ez a technológia például magában foglalja a fekete vér angiográfia szekvenciákat, amelyek sötétté alakítják a vért, például fast spin echo szekvenciákat és flow-spoiled gradiens echo szekvenciákat. Idetartoznak az áramlástól független módszerek is, amelyek fokozzák a különbséget a kontrasztban a megnövelt kontrasztú trombus és vér és szövet közötti T1 differencia alapján, például az inverzió-visszanyeréssel előállított vagy telítés-visszanyeréssel előállított szekvenciák, melyek növelik a kontrasztot a trombus és a háttér szövetek között. Hasznosnak bizonyulhatnak a T2 előállítási módszerek is. Végül a találmány szerinti szerekkel javítani lehet kontrasztot a magnetizációs transzfer technológiák készítményeivel is.

A találmány szerinti készítményeket, ideértve a peptideket, a trombolitikumokkal konjugált peptideket és a peptid-célzott multimer kontrasztanyagokat is, szokásos módon gyógyszerkészítmények formájában lehet kiszerelni. A találmány szerinti vegyületek magukban foglalják a gyógyászatilag elfogadható származékaikat is. A gyógyászatilag elfogadható' azt jelenti, hogy a vegyüIgfgt vagy a készítmény elfogadhatatlan káros hatások nélkül lehet az állatnak adagolni. A gyógyászatilag elfogadható származék kifejezés bármilyen, gyógyászatilag elfogadható, találmány szerinti vegyületből kapott sót, észtert, észter-sót vagy más származékot jelent, amelyet a páciensnek adagolva közvetlenül vagy közvetve a találmány szerinti vegyületet vagy aktív metabolitját vagy maradékát kapjuk. Más származékok azok, amelyek növelik a találmány szerinti vegyületek biohozzáférhetöségét emlősöknek adagolva (például ha egy orálisan adagolt vegyületet hagyunk a vérben felszívódni), vagy amelyek jobban eljuttatják a kiindulási vegyületet a biológiai helyszínre (például az agyba vagy a nyirokrendszerbe), és ezáltal megnövelik a kiindulási vegyülethez képest a hatást. A találmány szerinti

-80·.? ^:·ί* ·«· vegyületek gyógyászatilag elfogadható sóihoz tartoznak a gyógyászatilag elfogadható szervetlen vagy szerves savakból és bázisokból kapott ellenionok.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket bármilyen módon, például orálisan és parenterálisan egyaránt adagolhatjuk. A parenterális adagolás lehet például szubkután, intravénás, intraarteriális, interstitiális, intratekális és üregen belüli adagolás. Intravénás adagoláskor a gyógyszerkészítmények adagolhatok bóluszként, időben 2 vagy több adagban egymástól elválasztva, vagy egy állandó vagy nem lineáris áramú infúzió formájában. A találmány szerinti készítményeket bármilyen adagolási módra kiszerelhetjük.

Az intravénás adagolásra szolgáló készítmények rendszerint steril izotóniás vizes pufferben készített oldatok. Szükség esetén a készítmény tartalmazhat még szolubilizáló, stabilizáló szert és helyi érzéstelenítőt, pl. lidokaint, hogy az injekció helyén a fájdalmat enyhítse. Általában a komponenseket vagy külön visszük be, pl. egy kitben, vagy egy egységdózis formában összekeverve, például száraz liofilizált por formájában vagy vízmentes koncentrátum formájában. A készítményeket hermetikusan lezárt konténerben, például ampullában vagy zacskóban tárolhatjuk, feltüntetve aktivitási egységekben a hatóanyag mennyiségét. Ha infúzió formájában adagoljuk a készítményt, akkor adagolhatjuk egy infúziós palackban, amely steril gyógyászati fokozatú injekciós vizet, fiziológiás sóoldatot vagy más, megfelelő intravénás folyadékot tartalmaz. Ha injekciós úton adagoljuk a készítményt, akkor injekciós célt szolgáló steril vizet vagy fiziológiás sóoldatot tartalmazó ampullát alkalmazunk úgy, hogy a komponensek az adagolás előtt össze legyenek keverve. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények a gyógyászatilag elfogadható vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóit, valamint gyógyászatilag elfogadható komponensként segédanyagok, hordozót, oldószert stb. tartalmazhatnak.

Egy kontrasztanyagot előnyösen injektálható készítmény formájában adagolunk a páciensnek. A kontrasztanyag adagolását előnyösen parenterálisan végezzük, ez lehet intravénás, intraarteriális, intratekális, interstitiális vagy üregen belüli adagolás. A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket adagolhatjuk emlősöknek, például embernek, más diagnosztikumokhoz vagy gyógyszerekhez hasonló módon. Az adagolandó dózis és az adagolás módja számos tényező függvénye, ilyenek például a beteg kora, testsúlya, neme, állapota, genetikai tényezők, és végül az orvosi személyzet határozza meg a különböző dózisok kísérleti meghatározása, majd az itt leírt módon történő leképezés után. Általában a diagnosztikai ér-81 -

zékenységhez szükséges dózist vagy gyógyászati hatékonysághoz szükséges dózist kb. 0,001 - 50.000 pk/kg, előnyösen 0,01 - 25,0 pg/kg testsúly között választjuk meg. Az optimális dózist empirikusan a következő leírás alapján határozhatjuk meg.

Trombolitikus körülmények kezelésére az adagolt mennyiség függ a tromboembóliás állapot súlyosságától és a rög helyzetétől és méretétől. Az alkalmazandó pontos dózis és az adagolás módja függ a körülményektől, és a kezelést irányító orvos határozza meg. Általában a kombinált készítmény/trombolitikus szer konjugátum dózisai megegyeznek azokkal a dózisokkal, amelyeket az önmagában használt trombolitikus szernél rendszerint használunk, bár a fibrin/rög kötődés megjavult affinitása a találmány szerinti készítmények révén lehetővé teszi, hogy a standard trombolitikus dózist csökkentsük. Különösen a következő trombolitikumokat használjuk ehhez a terápiához (a dózis és adagolásmód feltüntetésével): Sztreptokináz Anisztrepláz tPA (vad-típus) 2-láncú urokináz

-3 megaegység 30 perctől 3 óráig egység; 2-5 perc injekció

50-150 mg; infúzió legfeljebb 6 órán át (40-100 mg); infúzió legfeljebb 6 órán át egyláncú urokináz (scPA) 3-12 megaegység (30-100 mg; infúzió legfeljebb 5 órán keresztül) hibrid plazminogén aktivátorok és származékok 20-100 mg; injekció vagy infúzió plazminogén aktivátorok muteinjei 10-100 mg; injekció vagy infúzió

A találmány további részleteit az alábbi, nem korlátozó jellegű példákkal illusztráljuk.

PÉLDÁK

A szintézist, a jellemzést és több nagy relaxivitású kontrasztanyag készítmény alkalmazását az alábbi példákkal illusztráljuk. A specifikus paraméterek az alábbi példákban illusztratív jellegűek és nem korlátozóak. A szakember számára nyilvánvaló, hogy rutinkísérletet használva az itt leírt speciális megvalósítási módszerek ekvivalensét is alkalmazhatjuk. Ezek a kísérletek az igénypontokat tá masztják alá.

1. példa: Peptid-alapú MR leképező szerek szintézise

-82 C-terminuszhoz kötött linker-alegység csoportot tartalmazó peptid (P-[linker_: alegység csoporti)

A nem védett pepiidet standard Fmoc stratégia és egy diamino-tritil gyanta felhasználásával állítjuk elő. A pepiidet tallium-trifluor-acetát gyantán történő felhasználásával vagy oldatban ciklizáljuk. Miután a gyantáról lehasítottuk, a nem védett pepiidet RP-HPLC-vel (C-18 oszlopon, H₂O/acetonitril/TFA) tisztítjuk.

Linkercsoport ekvivalens Boc-Dpr(Boc)-OH.DCHA és 1,2 ekvivalens pentafluor-fenol diklór-metános oldatához 1,2 - 1,5 ekvivalens PS-karbodiimidet adunk. Az elegyet szobahőmérsékleten 3-5 órát rázzuk. Miután az LC-tömeg eredmények azt mutatják, hogy a reakció befejeződött, a gyantát leszűrjük, eltávolítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson lepárolva kapjuk a nyers linkercsoportot (BocDpr(Boc)-OPfi (N-a-Boc-N-p-Boc-L-diamino-propionsav-pentafluor-fenilészter, 356-128) fehér hab formájában.

Prekurzor MR leképező szer ekvivalens P-[linker-alegység csoport] és 2,2 ekvivalens linkercsoport {BocDpr(Boc)-Opft) DMF-fel képezett oldatához 4-6 ekvivalens DIPEA-t adunk. Az elegyet egész éjjel szobahőmérsékleten keverjük. Miután az LC-tömeg eredmények azt mutatják, hogy a reakció befejeződött, az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A nyers terméket TFA, víz és anizol 90/5/5 %-os elegyében szobahőmérsékleten 3 órát keverjük. Hozzáadunk dietil-étert, fehér csapadék képződik, amelyet RP-HPLC-vel tisztítunk (C-18 oszlop, H₂O/acetonitril/TFA elegyével eluálva), és így a prekurzor MR leképező szert kapjuk (tetrakisz-amino-peptid) fehér szilárd anyag formájában.

Prekurzor kelátcsoport: DOTAGA-Opft ekvivalens DOTAGA-OH és 1,2 ekvivalens pentafluor-fenol diklór-metános oldatához 1,2-1,5 ekvivalens PS-karbodiimidet adunk. Az elegyet 3-5 órát szobahőmérsékleten rázzuk. Miután az LC-tömeg eredmények azt mutatják, hogy a reakció befejeződött, a gyantát szűréssel eltávolítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson lepárolva nyers prekurzor kelátcsoportot kapunk fehér hab formájában.

MR leképező szer ekvivalens prekurzor MR leképező szer és 4,0 ekvivalens prekurzor kelátcsoport DMF-es oldatához 4,0 ekvivalens DIPEA-t adunk. Az elegyet szoba

-83hömérsékleten egész éjjel keverjük. Miután az LC-tömeg eredmények azt mutatják, hogy a reakció befejeződött, az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk.

A nyers terméket ezután TFA, fenol, metilszulfonsav, anizol és diklór-metán 90/2,5/2,5/2,5/2,5 % arányú elegyében 15 percig keverjük. Hozzáadunk dietil5 étert, és a fehér csapadék keletkezik, amelyet nyers termékként izolálunk.

A nyers terméket GdCh.HsO-val ionmentes vízben reagáltatjuk, így nyers MR leképező szert kapunk, melyet RP-HPLC-vel C-18 oszlopon tisztítunk, etanol és 50 mmól ammónium-acetát elegyével eluálunk. A megfelelő frakciókat egyesítjük, az etanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, majd az egyesített frakciókat 10 sócsere céljából nátrium-acetáttal kezeljük. Liofilizálás után a sók feleslegét reverz fázisú kromatográfiásan Waters Sep-Pak® C-18 betéten eltávolítjuk, eluáló szerként vizet és etanol/víz 50:50 arányú elegyét használjuk. A megfelelő frakciókat egyesítjük, az etanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, és az oldatot liofilizálva kapjuk a kívánt peptid MR leképező szert fehér szilárd anyag formájában.

Hasonló módszereket használunk a további MR leképező szerek szintetizálására.

-84ϋ ··»* * » « · ♦ · - ·.*♦>*· *- . példa: Kelát prekurzor csoport szintézise (Synthon 3)

Boc ^^^NHBoc

HO.

;O2C(CH₃)₃ (HaC^COsC^ N (HaCfeCOzC

CO₂C(CH₃)₃ •CO₂C(CH3)3

R = Boc, R·! = H

R = Boc, R₁ = Bn r = H, Rí =Bn

a) Boc₂O, NaOH-dioxán

b) NaOCI, NaOCI₂, TEMPO, foszfátpuffer, ACN

c) BnBr, CsCO₃, DMF

d) TFA, CH₂CI₂; majd 2 mól HCI, Et₂O

e) t-butil-bróm-acetát, DIPEA, DMF

f) H₂, Pd/C, EtOAc

Synthon 3 szintézisének A módszere.

a) lépés, aminok védőcsoporttal való ellátása

H-HC1

NH₂*HCI

BOC2O NaOH-Dioxán

Boc ^^^NHBoc

-8525,15 g megadott sztereokémiájú hidroxi-metil-dietilén-triamin-tríhidrokloridot (optikailag tiszta kiindulási anyag: Syn. Comm. 29(14), 2377-2391 (1999), racém kiindulási anyag: Coll. Czech. Chem. Comm. 34, 630-634 (1969)) feloldunk ionmentes víz és 1,4-dioxán elegyében, és az oldat pH-ját 8-9 közé állítjuk vizes nátrium-hidroxiddal. 3,5 ekvivalens di-terc-butil-dikarbonátot feloldunk dioxánban, és 10-20 °C között hozzáadjuk. A reakcióelegyet 12-20 óráig szobahőmérsékleten keverjük. Ezután vízzel hígítjuk és etil-acetáttal extraháljuk. A szerves extraktumot ezt követően vízzel, telített nátrium-hidrogén-karbonáttal és telített nátrium-klorid oldattal extraháljuk. A szerves extraktumot nátrium-szulfát felett szárítjuk, leszűrjük és vákuumban bepárolva olajat kapunk, amelyet szilikagélen kromatográfiásan tisztítjuk, etil-acetát és hexán elegyével eluáljuk. A tisztított termék össztermelése 30,11 g. ¹H-NMR (300 MHz): 5,18 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,76 (bs, 1H), 3,8-3,0 (m, 10H), 1,47-1,42 (2s, 27H). MS (m/z): 456,4 [M+Na]⁺.

b) lépés: Hidroxilcsoport oxidációja

Az alábbi irodalmi helyen leírt oxidációs eljárás alapján: Zhao és tsai, J. Org.

Chem. 64, 2564-2566 (1999)

NaOCI, NaOCI₂, TEMPO, --------------> foszfátpuffer , aceto nitrili

29, 94 g BOC-védett triamint acetonitrilben feloldunk. 21,6 g NaH₂PO4-böl és 21,6 g Na₂HPO4-böl és 500 ml térfogatot biztosító elegendő mennyiségű ionιγιθιη^θθ vízből álló foszfátpuffert adunk hozzá 300 ml mennyiségben, majd hozzáadunk 0,07 ekvivalens 2,2,6,6-tetrametil-piperidinil-1 -oxit (TEMPO). Az elegyet intenzíven keverjük és 35 °C-ra melegítjük. 2,0 ekvivalens nátrium-kloritot feloldunk 100 mg/ml ionmentes vízben. A nátrium-klorit oldatot és a fehérítőt (0,02 ekvivalens, kb. 0,25%-os vizes nátrium-hipoklorit) hozzáadjuk, miközben a hőmérsékletet állandó értéken tartjuk. Az oxidálószer hozzáadása után a reakcióelegyet 24 órát keverjük. További 0,07 ekvivalens TEMPO-t adunk hozzá, és még 24 órát keverjük. A reakcióelegyet lehűtjük szobahőmérsékleten. Vizet adunk hozzá, és a pH-t 2,0 N vizes nátrium-hidroxiddal 8-ra állítjuk. Hideg vizes nátrium-szulfit oldatot adunk hozzá 300 ml mennyiségben, miközben a pH-t állandó értéken tartjuk. Az oldatot kis térfogatú metil-terc-butil-éterrel extraháljuk és félretesszük. A vizes fá-

-86 zist 2,0 N vizes sósavval pH 3-4-re savanyítjuk, és két kis térfogatú metil-terc-butiléter adaggal extraháljuk. A szerves extraktumot az előzőleg félretettel egyesítjük és vákuumban bepároljuk, a terméket az alábbi 3. lépésben tisztítás nélkül használjuk fel. ¹H-NMR (300 MHz): 5,8 (bs, 1H), 5,3 (m, 1H), 4,4 (m, 1H), 3,6-3,2 (m, 6H), 1,47-1,43 (2s, 27H). MS (m/Z): 470,2 [M+Na]⁺.

c) lépés: Karbonsav benzilcsoporttal való megvédése

HO-^O BnBr, Cs₂CO₃, BnCk^Q j Boc -----------------I Bog ^DMF BocHN'^x^^^^-^z^NHBoc

178 g kiindulási karbonsavat feloldunk vízmentes DMF-ben. Hozzáadunk 2 ekvivalens cézium-karbonátot, és az oldatot 30 percig keverjük. Hozzácsepegtetünk szobahőmérsékleten 1,1 ekvivalens benzil-bromidot. Inert atmoszférában 18 órát keverjük. A reakcióelegyet vízzel hígítjuk és etil-acetáttal kétszer extraháljuk. A szerves fázisokat egyesítjük, és egymás után telített nátrium-hidrogénkarbonáttal és nátrium-klorid oldattal mossuk. A szerves fázist 270 g olajjá pároljuk be, melyet szilikagél kromatográfiásan tisztítunk, etil-acetát és hexán elegyével eluálunk. ¹H-NMR (300 MHz): 7,3 (s, 5H), 5,6 és 5,15 (2bs, 1H), 5,1 (s, 2H), 4,5 (bs, 1H), 4,0-4,1 (m, 1H), 3,5-3,2 (m, 6H), 1,45 és 1,4 (2s, 27H). MS (m/Z): 560,3 [M+Na]⁺.

d) és e) lépés: Az aminokról a védőcsoport eltávolítása és alkilezés

BocHN'^A^^N'^'NHBoc

4N vizes HCI/ACN __>Η₂Ν''^Λ'^^Νχχ^ΝΗ2 <XCH₃)3 dipea

DMF

-87 250 g BOC-védett triamint acetonitril és 4N vizes sósav 1:1 arányú oldatában keverünk és kb. 2,0 órát keverjük. Az acetonitrilt vákuumban eltávolítjuk, a visszamaradó oldatot liofilizálva egy maradékot kapunk, amelyet azonnal feloldunk DMF-ben és diizopropil-aminban (elegendő mennyiségben ahhoz, hogy a pH-t 85 ra emeljük) 12 ekvivalens terc-butil-bróm-acetátot adunk hozzá. Az adagolas befejezése után a reakcióelegyet felmelegítjük 50 ’C-ra, és 18 órát keverjük. A reakció befejezése uátn a reakcióelegy térfogatát víz hozzáadásával megketszerezzük majd etil-acetáttal kétszer extraháljuk. A szerves extraktumokat egyes.tjuk, vízzel, telített nátrium-hidrogén-karbonáttal és telített nátrium-klorid oldattal mos10 suk. A szerves oldatot vákuumban bepárolva olajat kapunk, melyet szihkagelen kromatográfiásan tisztítunk, etil-acetát és hexán elegyével eluáljuk. A tisztított térmék össztermelése 190 g. MS (m/Z): 809,5 [M+Na]⁺.

f) lépés: A karboxilát védőcsoportiának eltávolítása

H₂, Pd/c

_Egy rozsdamentes acélreaktort megtöltünk 157 g benzil-észterrel, 19,8 g 10 %-os palládium-csontszénnel és etil-acetáttal, majd 45 psi nyomáson 12 órát hidrogénezzük. Celiten keresztül leszűrjük, vákuumban bepárolva olajat kapunk. Az olajat feloldjuk etil-acetát és hexán elegyében, és szilikagélen kromatográfiásan 25 tisztítva 82 %-os termeléssel kapjuk a DTPA karbonsav-penta-terc-butil-esztert.

MS (m/Z): 719,5 [MHf. Amikor ezt a reagenst használjuk a kontrasztanyagok szintézisében más királis elemek alkalmazásával, nem figyelünk meg diasztereomereket, és ezért arra következtetünk, hogy ez az anyag lényegeben optikailag tiszta a kimutatás határáig, amelyet szokásos proton NMR-rel végzünk. 30 B módszer Svnthon 3 szintézisére

105,0 g alkohol kiindulási anyagot (Syn. Comm. 29(14), 2377-2391 (1999) hidroxi-metil-dietilén-triaminból kiinduló szintézis), 1,0 liter acetonitrilt, 1,0 liter foszfátpuffert, melyet úgy kapunk, hogy 100 mg NaH₂PO₄-et és 10 mg Na₂HPO₄et 1,0 ml vízben feloldunk, majd a pH-t H₃PO₄-gyel 4,5-re állítjuk, és 7,0 g TEMPO-t egyesítünk, és 45-50 °C-ra melegítünk. 298 ml vízben oldott 29,8 g natrium-kloritból és 744 μΙ nátrium-hipokloritból álló oldatot adunk az oldathoz, miközben a hőmérsékletet 45-50 °C-on tartjuk. A reakcióelegyet 4-10 órát intenzíven keverjük. Lehűtjük szobahőmérsékletre, és a két réteget szétválasztjuk. A szerves réteget izoláljuk, és telített vizes nátrium-kloriddal egyesítjük, 15 percig keverjük. A szerves fázist izoláljuk, vákuumban bepárolva 171 g olajat kapunk, melyet oszlopkromatográfiásan tisztítunk, hexán és izopropanol elegyével eluáljuk, amely meg 0,1 % trietil-amint is tartalmaz, és így 81 g dúsított terméket kapunk olaj formájában MS (m/Z): 719,5 [MH]⁺. Az ezzel a módszerrel kapott anyag optikai tisztasága nem különbözik a fentitől.

3. példa: Gyanták C-terminális amin funkciós csoportokat tartalmazó módosított peptidek szilárd fázisú szintéziséhez

A peptideket szilárd fázisú szintézissel állították elő. A szilárd fázisú szintézisben a linkereket és gyantákat a szintetizálandó peptidek típusától függően választják ki (pl. a C-terminuszon megkívánt funkciós csoport, a védett vagy nem védett peptid függvényében), és függ az alkalmazandó szintetikus módszertől (pl. Fmoc vagy BOC kémia, manuális vagy automatizált szintézis, folyamatos áramlású vagy batch reaktor). így például a C-terminuszon karbonsav-csoportot tartalmazó peptid szintézisénél egy védett aminosavat különböző gyantákhoz kapcso_{]unk p| HMPB} gyantákhoz, 2-klór-tritil-klorid gyantákhoz és SUSRIN gyantához. Másrészt, a C-terminuszon aminocsoportot tartalmazó peptid szintézisénél egy diamin egy tritil gyantához kapcsolódhat. A polisztirol (PS) gyantákat batch, azaz szakaszos szintézishez használhatjuk, míg a polietilén-glikol (PEG) módosított gyanták a folyamatos áramlású és szakaszos szintézishez is alkalmasak. A kereskedelemben sokféle tritil PS gyantát lehet kapni, ideértve az 1,3-bisz-(aminometil)-benzol-tritil PS gyantát. Ha nem hozzáférhető a kívánt tritil PS gyanta, akkor a PEG gyantáknál leírt eljáráshoz hasonlót lehet használni egy diamin tritil PS gyantához való kapcsolásához.

Az 1,3-bisz(amino-metil)-benzol-tritil gyanta szintézisét példaként tárgyaljuk.

Más diaminokat is kapcsolhatunk hasonlóképpen a tritil gyantához.

1,3-bisz(Amino-metil)-benzol-tritil PEG gyanta előállítása

PS-PEG^ N

Π

PS~PEG N

AcCI ^H g NovaSyn TGT gyanta (NovaBiochem) tritil alkoholgyantát helyezünk 15 először egy tölcsérre, és egymást követően dimetil-formamiddal, diklór-metánnal és toluollal mossuk. Az összes oldószer eltávolítása után az anyagot egy reflux kondenzálóval felszerelt lombikba helyezzük át. Hozzáadunk 250 ml toluolt es 25 ml acetil-kloridot, és a szuszpenziót 70 C-on keverés közben 1 órát melegítjük. További 25 ml acetil-kloridot adunk hozzá, és a szuszpenziót 70 ”C-on 2 órát ke20 verjük. A szuszpenziót leszűrjük, és a gyantát egymást követően toluollal és diklórmetánnal mossuk.

PS-PEG N' rí

Második lépésként frissen előállított tritil-klorid gyantát és 250 ml THF-et helyezünk el egy lombikban. A szuszpenzióhoz hozzáadunk 10 ekvivalens 1,3bisz(amino-metil)-benzolt (0,23 mmól/g gyanta helyettesítésre vonatkoztatva), es az elegyet szobahőmérsékleten 18 óráig keverjük. A szuszpenziót leszűrjük, a gyantát egymás után vízzel, DMF-fel, diklór-metánnal, metanollal és diklór- 90 -

metánnal mossuk. A gyantát szobahőmérsékleten, 1-5 Hgmm nyomáson vákuumban szárítjuk 25,4 g állandó tömegig. A szubsztitúciós sztöchiometriát kvantitatív ninhidnn eljárással hajtjuk végre.

4. példa: Kovalens konjugátumok szintézise (Synton 1, 2, 4 és 5)

A Svnthon 1 szintézisének módszere

2,3- di-terc-butoxi-karbonilamino-propionsav

‘BuO₂C--

1. DIG, HOBT

2. H₂,Pd/C

2,3-Bisz-terc-butoxi-karbonil-amino-propionsav-benzilészter

6,5 g cézium-karbonát és víz oldatát hozzáadjuk 3,04 g 2,3-bisz-terc-butoxikarbonil-amino-propionsav 25 ml acetonitriles elegyéhez. Az elegyet 40 percig szobahőmérsékleten keverjük. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A szilárd maradékhoz 50 ml DMF-et adunk. 1,43 ml benzil-bromid és 5,0 ml DMF oldatát adjuk 30 hozzá 15 perc alatt szobahőmérsékleten. Az elegyet 18 órát keverjük, majd 100 ml etil-acetáttal és 50 ml vízzel hígítjuk, és 15 percig keverjük. A fázisokat szétválasztjuk, és a szerves fázist nátrium-szulfát felett szárítjuk. Az elegyet leszűrjük, a szűrletet vákuumban bepárolva 3,6 g olajat kapunk. Az olajat oszlopkromatográfiásan tisztítjuk, etil-acetát és hexán elegyével eluálva 1,8 g olajat kapunk. MS • ··· ··· · ·· ······ ·

-91 (m/Z): [M+Na]⁺ = 417. ¹H-NMR (300 MHz): 1,4 (s, 9H), 2,4 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 4,8 (m, 1H), 6,5 (m, 1H), 7,3 (m, 5H).

2,3-Diamino-propionsav-trihidroklorid

1,8 g 2,3-bisz-terc-butoxi-karbonil-amino-propionsav-benzilészter, 40 ml 4N vizes sósav és 50 ml acetonitril oldatát 18 órát szobahőmérsékleten keverjük. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, az elegyet 100 ml etil-acetáttal és 50 ml vízzel hígítjuk, és 15 percig keverjük. A fázisokat szétválasztjuk, a vizes fázist szárazra pároljuk (1,23 g hab/szirup). ¹H-NMR (300 MHz): 3,2-3,5 (m, 2H), 4,2-4,35 (m, 1H), 5,13-5,25 (q, 2H, J = 11,8, 3,1 Hz).

2,3-Bisz-karboix-DTPA-propionsav-benzilészter

6,65 g 2,3-diamino-propionsav-trihidroklorid, 40,0 g bb(CO)DTPE (Synthon 3), 8,5 g HOBt, 9,0 ml DIC, 15,0 ml diizopropil-etil-amin, 400 ml diklór-metán és 200 ml DMF oldatát 48 órát keverjük. Az elegyet 500 ml metilén-kloriddal és 250 ml vízzel hígítjuk, majd 15 percig keverjük. A fázisokat szétválasztjuk, a szerves fázist 250 ml telített nátrium-karbonáttal, 250 ml telített nátrium-kloriddal mossuk, nátrium-szulfáttal szárítjuk. Az elegyet leszűrjük, és a szürletet vákuumban bepárolva olajat kapunk. Az olajat szilikagélen kromatográfiásan tisztítjuk, etil-acetát és hexán elegyével eluálva 28,0 g anyagot kapunk. MS (m/Z): [M+2]⁺ = 798; [M+1f = 1595.

2,3-Bisz-karboxil-DTPA-propionsav

17,0 2,3-bisz-karboxi-DTPA-propionsav-benzilésztert hidrogénezünk etilacetát és trietil-amin 10:3 arányú elegyében 6,0 g 10 %-os palládiumcsontszénen, mint katalizátoron, 24 óra hosszat 50 psi nyomáson. Az edényt nitrogénnel öblítjük, és az elegyet celiten keresztül leszűrjük, csökkentett nyomáson bepárolva 16 g olajat kapunk.

MS (m/Z): [M+2]⁺ = 753; [M+1]⁺ = 1504.

Svnthon 2 szintézisének módszere

DIC.HOBt,

H₂N >2

CO₂C(CH3)3 (Η₃Ο)3ΟΟ₂Ο^_ν^ H N.

(H₃C)₃CO₂C

CO₂C(CH3)₃ hn

CO₂C(CH₃)3 (H₃C)₃CO₂C^N (H₃C)₃CO₂C^ (H₃C)3CC^C

BrCH₂CO₂CH₂Ph *-► R =

N CO₂C(CH₃)₃ •OCH₂Ph

CO₂C(CH₃)3 (H₃C)₃CO₂C (H₃C)₃CO2C (H₃C)₃CO₂

H N.

.OH

CQzCfCHah ΗΝ^/θ ,CO₂C(CH₃)₃ (HsC^COzC^ n

CO₂C(CH₃)3 (H₃C)3CO₂C (H₃C)₃CO₂C

N¹,N³-Bisz[2-(bisz-terc-butoxi-karbonil-metil-amino)-3-{[2-(bisz-terc-butoxi-karbonil-metil-aminol-etiO-fterc-butoxi-karbonil-metiD-amino}-propion-amid]-dietilén-triamin

3,16 ml dietilén-triamin, 700 ml acetonitril és 10,4 ml diizopropil-etil-amin oldatához 30 percig előreagáltatott 42,0 g bb(CO)DTPE-t (Synthon 3), 7,9 g HOBt-t, 30 11 2 g EDC-t és 10 ml diizopropil-etil-amint adunk acetonitrilben szobahőmérsékleten a reakcióelegyet 16 órát keverjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. Az olajat etil-acetáttal egyesítjük, vízzel és telített vizes nátrium-klonddal extraháljuk, majd bepároljuk. Az olajat szilikagél oszlopkromatográfiásan tisztítjuk, > ·· ····· · ♦· · • i · · · · · : ··: . ·. . ·.

·«· ·« ·· · · ♦

- 93 hexán, izopropanol és trietil-amin elegyét használjuk eluáló szerként, és így 22,5 g terméket kapunk. MS (m/Z): [M+H] = 1503.

N\N³-Bisz[2-(bisz-terc-butoxi-karbonil-metil-amino)-3-{[2-(bisz-terc-butoxi-karbonil-metil-aminol-etilJ-lterc-butoxi-karbonil-metiD-amino}5 .p_ropion-amid]-N²-(benzil-oxi-karbonil-metil)-dietilén-triamin

54 g benzil-2-bróm-acetátot hozzáadunk 13,5 g előző aminvegyület, 200 ml _acetonitri| és 1,18 g nátrium-karbonát oldatához. Az elegyet 60 “C-ra felmelegítjük és 15 órát keverjük. Szobahőmérsékletre lehűtjük és csökkentett nyomáson beparoljuk. Hozzáadunk etil-acetátot és vizet, és a fázisokat szétválasztjuk. A szentes 10 fázist telített vizes nátrium-kloriddal mossuk, majd csökkentett nyomáson beparolva 14,5 g olajat kapunk. MS (m/Z): [M]⁺ = 1651.

N¹,N³-Bisz[2-(bisz-terc-butoxi-karbonil-metil-amino)-3-{[2-(bisz-terc-butoxi-karbonil-metil-aminoj-etilHterc-butoxi-karbonil-metiD-amino}-propion-amid]-N²-(ecetsav)-dietilén-triamin ₁5 _{14 g} fenti benzílésztert 50 psí nyomáson 16 órát hidrogénezünk etil-acetat es trietil-amin 49:1 arányú elegyében, 3,5 g 10 %-os palládium-csontszén jelenlétében. A kapott elegyet celiten keresztül leszűrjük, vákuumban bepárolva 12,08 g olajat kapunk. MS (m/Z): [M+H] = 1561.

Svnthon 4 szintézise

-94.t :

N\N³-bisz-Butoxi-karbonil-dietilén-triamin

2,12 g, 20,6 mmól dietilén-triamin és 30,0 g, 41,3 mmól trietil-amin 100 ml THF-es oldatához szobahőmérsékleten 10,65 g, 43,3 mmól Boc-ON-t adunk. Az elegyet egész éjjel keverjük. Hozzáadunk 700 ml étert, majd foszfátpufferrel extraháljuk (pH = 3,1 mmól). A vizes oldatot pH = 11-re lúgosítjuk, és diklórmetánnal extraháljuk. A szerves fázist elválasztjuk és vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk. A sókat leszűrjük, az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítva a kívánt vegyületet színtelen olaj formájában kapjuk, 5,55 g mennyiségben. MS (m/Z): [M+H]⁺= 304,1.

N¹,N³-bisz-Butoxi-karbonil-N2-(benzil-oxi-karbonil-etil)-dietilén-triamin

1,0 g, 3,30 mmól fenti vegyület 40 ml metanolos oldatához szobahőmérsékleten hozzáadunk 1,07 g, 6,59 mmól benzil-akrilátot. Az elegyet 3 napig reflux alatt melegítjük. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítva sárga folyadékot kapunk, amely a jelzett vegyületet és benzil-akrilátot tartalmaz. MS (m/Z): [M+H]⁺ = 466,1.

N²-(Benzil-oxi-karbonil-etil)-dietilén-triamin

1,0 g fenti vegyület és benzil-akrilát 25 ml diklór-metános elegyéhez szobahőmérsékleten 13,8 ml TFA-t adunk. Az elegyet 3 órát szobahőmérsékleten keverjük, majd hozzáadunk 1N sósavat és vizet. A vizes fázist elválasztjuk, liofilizáljuk, így 420 mg fenti vegyületet kapunk ragadós szilárd anyag formájában. MS [m/Z]: [M+H]⁺ = 266,2.

N\N³-bisz[2-(bisz-Terc-butoxi-karbonil-metil-amino)-3-{[2-(bisz-terc-butoxi-karbonil-metil-amino)-etil]-(terc-butoxi-karbonil-metil)-amino}-propion-amid]-N²-(benzil-oxi-karbonil-etil)-dietilén-triamin

A fenti Synthon 3 vegyület, HOBt és diizopropil-etil-amin diklór-metános és DMF-es oldatához DIC-t adunk. Az elegyet 48 órát keverjük szobahőmérsékleten. Diklór-metánnal és vízzel hígítjuk, majd 15 percig keverjük. A fázisokat szétválasztjuk, a szerves fázist telített nátrium-karbonáttal, telített nátrium-kloriddal mossuk, nátrium-szulfát felett szárítjuk. Az elegyet leszűrjük, a szűrletet vákuumban bepárolva olajat kapunk. Az olajat szilikagélen kromatográfiásan tisztítjuk, etilacetát és hexán elegyével eluálva a cím szerinti vegyületet kapjuk.

N¹,N³-bisz[2-(bisz-Terc-butoxi-karbonil-metil-amino)-3-{[2-(bisz-terc-butoxi-karbonil-metil-aminoi-etilHterc-butoxi-karbonil-metilj-amino}-propion-amid]-N²-(propionsav)-dietilén-triamin

-95Egy hidrogénező edénybe a fenti vegyületet, 10 %-os palládium-csontszenet, etil-acetátot és trietil-amint töltünk. Az elegyet nitrogénnel, majd hidrogénnel öblítjük. Az elegyet 24 órát 50 psi hidrogénatmoszférában rázzuk. Az edényt nitrogénnel öblítjük és celiten keresztül leszűrjük, a szűrletet csökkentett nyomáson bepárolva termékként olajat kapunk.

Synthon 5 előállítása

1.4MHCI, C0₂Me dioxán .i

---► J |

2. H₂/Pd/C Nht NH₂

1BOC2O, 2. LiOH

3. BnBr, 4. HCI

CO₂Bn bbDTPE-CQ>H

Metil-3-(benzil-amino)-2-((benzil-amino)-metil)-propionát

00 g, 5,6 mmól, 1,0 ekvivalens metil-2-(bróm-metil)-akrilátot feloldunk 20 ml acetonitrilben,' majd hozzácsepegtetjük keverés közben szobahőmérsékleten 1,83 ml. 16,8 mmól, 1,5 ekvivalens benzil-amin 10 ml vízmentes acetonitriles oldatához. 16 óra múlva hozzáadunk 100 ml étert, és a fehér szilárd benzil-aminhidrobromidot leszűrjük. A szűrletet csökkentett nyomáson bepárolva 1,90 g nyers olajat kapunk. Az olajat 150 ml etil-acetátban feloldjuk, vízzel és nátrium-klond sóoldattal mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfát felett szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk A kapott tiszta olajat gyorskromatográfiásan tisztítjuk, hexán és etil-acetát elegyével eluálva 1,39 g, 79 % terméket kapunk.

-96^-NMR (300 MHz, CDCI₃): δ 1,68 (s, 2H), 2,79-2,90 (m, 5H), 3,68 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 7,21-7,32 (m, 10H).

Metil-3-(amino)-2-(amino-metil)-propionát

2,27 g, 7,3 mmól, 1,0 ekvivalens metil-3-(benzil-amino)-metil)-propionátot feloldunk 20 ml metilén-kloridban, és hozzáadjuk 4,0 ml 4 mólos sósav dioxános oldatát. Az oldatot szobahőmérsékleten 20 percig keverjük, az oldószereket ezután csökkentett nyomáson lepárolva fehér port kapunk, amelyet feloldunk 50 ml metanolban. 0 °C-on argonáramban hozzáadunk 750 mg 10 %-os palládiumcsontszén katalizátort, és az elegyet 45 psi hidrogénnyomáson 18 órát rázzuk, majd celiten keresztül leszűrjük. Metanollal mossuk, csökkentett nyomáson lepároljuk, és így 1,47 g terméket izolálunk. ¹H-NMR (300 MHz, D2O): δ 3,25-3,43 (m, 5H), 3,82 (s, 3H).

Metil-3-(BOC-amino)-2-(BOC-amino-metil)-propionát

1,44 g diamint reagáltatunk 3,22 g, 14,8 mmól, 1,05 ekvivalens di-terc-butildikarbonáttal dioxán és vizes nátrium-karbonát oldatában 0 °C-on 1 óra hosszat, majd szobahőmérsékleten 18 óra hosszat. Az elegyet pH = 4-re savanyítjuk 0,5N KHSO4-gyel, és a dioxánt csökkentett nyomáson lepároljuk. A vizes részt etilacetáttal extraháljuk, magnézium-szulfáttal szárítjuk, csökkentett nyomáson bepárolva nyers olajat kapunk, melyet gyorskromatográfiásan tisztítunk, hexán és etilacetát elegyével eluálva 1,86 g, 80 % kívánt terméket kapunk. ¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 1,41 (s, 18H), 2,66-2,78 (m, 1H), 3,10-3,27 (m, 2H), 3,50-3,62 (m, 2H), 3,68 (s, 3H), 5,17-5,27 (bt, 2H).

3-(BOC-Amino)-2-(BOC-amino-metil)-propánsav

1,50 g metilésztert feloldunk 15 ml THF/víz 2:1 arányú elegyében. 0 °C-on hozzáadunk 0,95 g lítium-hidroxid-hidrátot. Az elegyet 0 °C és szobahőmérséklet között 44 órát keverjük. A THF-t csökkentett nyomáson lepároljuk, a vizes oldatot etil-acetáttal extraháljuk. A vizes fázist pH = 3-ra savanyítjuk 0,5 mólos vizes KHSO₄-gyel, és etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves frakciókat 30 ml vízzel mossuk, magnézium-szulfáttal szárítjuk. Az oldószereket csökkentett nyomáson lepárolva 1,32 g, 92 % terméket kapunk. ¹H-NMR (300 MHz, CDCI3): δ 1,40 (s, 18H), 2,66 (s, 1H), 3,27-3,47 (m, 4H), 5,42 (s, 1H).

Benzil-3-(BOC-amino)-2-(BOC-amino-metil)-propionát

-971,01 g savat szobahőmérsékleten 0,45 ml benzil-bromiddal reagáltatunk 2,07 g cézium-karbonátot tartalmazó vízmentes dimetil-formamidban. A dimetilformamidot csökkentett nyomáson lepároljuk, és a maradékot vízzel és etilacetáttal kirázzuk. A szerves fázist telített konyhasóoldattal mossuk, magnéziumszulfáttal szárítjuk. Az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk, a maradékot szilikagélen gyorskromatográfiásan tisztítjuk, hexán és etil-acetát 95:5 - 9:1 85:15 arányú elegyével eluáljuk. 1,16 g, 90 % terméket kapunk. ¹H-NMR (300 MHz, CDCI₃): δ 1,42 (s, 18H), 2,79 (kvintett, 1H, 5,6 Hz), 3,1-3,3 (m, 2H), 3,5-3,65 (m, 2H), 5,13 (s, 2H), 5,15-5,28 (m, 1H), 7,30-7,40 (m, 5H). MS: 431,15 (M+1).

Benzil-3-amino-2-amino-metil-propionát-dihidroklorid-só

1,15 g benzil-3-(BOC-amino)-2-(BOC-amino-metil)-propionátot feloldunk 5 ml 4 moláros sósavoldatban dioxánban. Az elegyet 0 °C-on 6 órát keverjük, majd csökkentett nyomáson a dioxánt lepároljuk. A maradékot éterrel eldörzsöljük, leszűrjük, 0,81 g tisztítatlan diamin-dihidroklorid-sót kapunk. ¹H-NMR (300 MHz, MeOD): δ 3,1-3,3 (m, 5H + CHD₂OD), 3,55 (s, dioxán), 5,19 (s, 2H), 5,15-5,28 (m, 1H), 7,20-7,40 (m, 5H). MS: 209,00 (M+1).

Benzil-3-(N-bb(CO)DTPE-karboxamid)-2-(N-bb(CO)DTPE-karboxamid)-metil-propionát

2,00 g, 2,8 mmól, 1,5 ekvivalens savat feloldunk 5 ml vízmentes diklórmetánban. 0,26 g diamint, 0,32 g HOAt-t és 0,65 ml diizopropil-etil-amint reagáltatunk 0 °C-on 0,88 g HATU-val 2 óra hosszat. 0,5 g trisz-amin gyantát, 0,5 g izocianát gyantát és 0,42 g HATU-t adunk hozzá, és a reakcióelegyet 16 órát szobahőmérsékleten keverjük. A gyantákat leszűrjük és a szűrletet lepároljuk. A maradékot vízzel és etil-acetáttal kirázzuk. A szerves fázist vízzel, telített nátriumhidrogén-karbonáttal és 20 ml telített konyhasóoldattal mossuk, magnéziumszulfáttal szárítjuk. Az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk. Az olajat szilikagélen gyorskromatográfiásan tisztítjuk, hexán, aceton és trietil-amin elegyével eluálva 1,13 g terméket kapunk. MS: 1607,95 (M+1) és 1629,95 (M+Na).

3-(N-bb(CO)DTPE-karboxamid)-2-(N-bb(CO)DTPE-karboxamid)-metil-propionsav

0,90 g, 0,56 mmól benzil-észtert feloldunk 30 ml etil-acetátban, és hozzáadunk 1 ml trietil-amint. Hozzáadunk 0,50 g 10 %-os palládium-csontszén katali

- 98 zátort, és az elegyet 15 órát 45 psi hidrogénnyomáson rázzuk. A katalizátort leszűrjük, az oldószert lepárolva 0,82 g terméket kapunk. MS: 759,55 (M+2H/2).

5. példa: Fibrin-megkötő MR leképező szerek szintézise

Ciklizálás Tl(tfa)3

V

- 100 -

Peptid szerkesztés: 3,39 g 1,3-bisz(amino-metil)-benzil-tritil NovaSyn TGT gyantát (mért szubsztitúció = 0,59 mmól) standard peptid oszlopba helyezünk, és felvisszük egy peptid szintetizátorra. A szintézist standard Fmoc stratégiával hajtjuk végre. A véghez kapcsolást az első aminosav kondenzálása után hajtjuk végre, ecetsavanhidrid és 6 %-os diizopropil-etil-amin DMF-ben történő alkalmazásával. Amikor a szintézis befejeződött, a gyantát az oszlopról eltávolítjuk, és reakcióedénybe helyezzük. A gyantát diklór-metánnal egyszer öblítjük és leszűrjük. A gyantát ezután 1 %-os trifluor-ecetsav diklór-metános elegyével kezeljük, es mechanikus rázókészülékre helyezzük 10 percre. Az elegyet a reakcióedényen keresztül leszűrjük, a szúrletet összegyűjtjük. Az egyesített szurlet pH-jat tnetilaminnal kb. 8-ra állítjuk, az oldatot vákuumban bepárolva olajat kapunk. Vízzel kicsapjuk, majd a fehér szilárd anyagot leszűrjük és vízzel és dietil-éterrel öblítjük. A szilárd anyagot leszívatva szűrjük, DMF-ben felvesszük és acetonitrillel hígítjuk. Az oldatot jeges fürdőn hűtjük, 1,5 g tallium-trifluor-acetáttal kezeljük 2 órán keresztül. Az oldat pH-ját trietil-aminnal pH = 8-ra állítjuk, majd vákuumban beparoljuk. Az olajhoz vizet adunk, a kapott csapadékot leszívatva szűrjük. A szilárd anyagot vízzel és dietil-éterrel mossuk, 2,7 g nyers, módosított, C-termmáhs amin funkciós csoportot tartalmazó pepiidet kapunk. A H₂N-Leu-Pro-Cys-Asp-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Cys-Bip-Asp-CO-NHCH₂C₆H₄CH₂NH₂ szintézisét (SEQ ID. NO:21) igazoltuk 1792,8 megfigyelt m/Z-vel [M+Na]⁺. A módosított pepiidet preparatív HPLCvel tisztítjuk. A hasonló, 98-100 %-os tisztaságú frakciókat egyesítjük és semlegesítés nélkül liofilizáljuk.

3,2 g módosított pepiidet és 3,95 g fenti Synthon 2 kovalens konjugátumoí diklór-metánban feloldunk. Hozzácsepegtetünk diizopropil-etil-amint, ameddig a

-101 p_H 9 nem lesz, és az elegyhez egyidejűleg 2 ekvivalens diizopropil-karbodiimidet és 2 ekvivalens HOBt-t adagolunk. 2 perc keverés után hozzácsepegtetünk diizpropil-etil-amin, ameddig a mért pH 9 nem lesz. Az elegyet szobahőmérsékleten 2 órát keverjük. Egy részletben hozzáadunk további előaktivált Synthon 2-t (diizopropil-karbodiimiddel, diizopropil-etil-aminnal és HOBt-vel együtt). Az oldószereket vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot etil-acetátban felvesszük, amelyet egymást követően 0,1N sósavval, telített nátrium-hidrogén-karbonáttal, amjd telített vizes nátrium-kloriddal mosunk. A szerves fázist nátrium-szulfát felett szárítjuk, leszűrjük és csökkentett nyomáson bepárolva 7,8 g világossárga habot kapunk. A habot feloldjuk diklór-metánban, és gyorskromatográfiásan tisztítjuk, diklór-metán és metanol eluálószerrel 5,6 g fehér szilárd anyagot kapunk. A fehér szilárd anyagot TFA, víz és trietil-szilán 90%/5%/5% arányú, 30 ml elegyében szobahőmérsékleten keverjük. Az elegyet 40 °C-on melegítjük és 2 órát keverjük. Az oldatott 3-5 ml térfogatra bepároljuk, majd szobahőmérsékletre lehűtjük. Hozzáadunk dietil-étert, és fehér csapadék keletkezik. Az elegyet 10 percig keverjük, majd a szilárd anyagot leszűrjük és dietil-éterrel mossuk. A szilárd anyagot vákuumban szárítva 4,0 g fehér szilárd anyagot kapunk. A szilárd anyagot víz és acetonitril 4:1 arányú, 20 ml-es elegyében feloldjuk, és preparatív HPLC-vel tisztítva fehér, szilárd prekurzor MR leképező szert kapunk 1,6 g mennyiségben.

g prekurzor MR leképező szert reagáltatunk 1 ekvivalens GdCh^BHzO-val ionmentes desztillált vízben, miközben a pH-t 1 moláros nátrium-hidroxid hozzáadásával kb. 6-ra állítjuk. A gadolinium komplexet reverz fázisú kromatográfiásan tisztítjuk (Waters Sep-Pak® C-18), desztillált ionmentes vizet és metanol és víz 50:50 térfogatarányú elegyét használjuk eluáló szerként. A megfelelő frakciókat egyesítjük, és a metanolt csökkentett nyomáson 50 °C-on eltávolítjuk. Liofilizálva 811 mg MR leképező szert kapunk.

A 32-es fenti szintézis alternatívájaként a peptidet gyantán is ciklizálhatjuk az alábbi reakcióvázlat szerint:

- 102 -

Ciklizálás n(tfa)₃ / DMF

Hasítás 1%TFA/DCM

- 103-

6. példa: Analóg módon előállított MR leképező szerek

Az alábbi MR leképező szereket szintetizáljuk a fent leírt módszerek analógiájára. Standard Fmoc módszerrel előállított és tallium-trifluor-acetáttal ciklizált pepiidet HPLC-vel tisztítunk, és Synthon 2-vel, diizpropil-etil-aminnal, 2 ekvivalens diizpropil-karbodiimiddel és 2 ekvivalens HOBt-vel reagáltatunk diklór-metánban. Az oldószereket vákuumban eltávolítjuk, a maradékot feloldjuk etil-acetátban, amelyet egymás után 0,1N sósavval, telített nátrium-hidrogén-karbonáttal és telített vizes nátrium-kloriddal mosunk. A szerves fázist nátrium-szulfát felett szárítjuk, leszűrjük és csökkentett nyomáson bepárolva habot kapunk, melyet szükség esetén gyorskromatográfiásan vagy HPLC-vel tisztítunk. A kapott fehér szilárd anyagot TFA, víz és trietil-szilán 90%/5%/5% arányú, 30 ml elegyében szobahőmérsékleten 2-6 órát keverjük. Hozzáadunk dietil-étert, és fehér csapadékot kapunk, amelyet preparatív HPLC-vel tisztítunk, acetonitril, víz és ammónium-acetát elegyével eluálva fehér, szilárd prekurzor MR leképező szert kapunk.

A prekurzor MR leképező szert 1 ekvivalens GdCh^OHsO-val reagáltatjuk ionmentes vízben (pH 6, nátrium-hidroxid). A gadolinium-kelátot reverz fázisú kromatográfiásan tisztítjuk Waters Sep-Pak® C-18 betéten, vízzel, metanol és víz 50:50 arányú elegyével eluálva. A megfelelő frakciókat egyesítjük, a metanolt csökkentett nyomáson 50 °C-on eltávolítjuk, és liofilizálva a kívánt MR leképező szert kapjuk. A 3. táblázat a vegyületeket igazoló tömegspektrometriás adatokat tartalmazza. Lásd az egyes vegyületek szerkezeténél a részletes leírást.

3. táblázat: Fibrin-megkötő vegyületek MS adatai

Vegyület	Molekulasúly	MS (M+SHj^/S
számított	megfigyelt
4	4016,884	1256,49467	1255,66
5	4025,96	1259,52	1259,9
6	4108,014	1286,87133	1284,53
7	4307,336	1353,312	1369,34
8	4076,064	1276,22133	1298,48
9	4233,208	1328,60267	1327,94
10	4221,199	1324,59967	1324,57

- 104- • · · · · · · ··· <· · · · * * ·

Vegyület	Molekulasúly	MS (M+3H)J73
számított	megfigyelt
11	4142,146	1298,24867	1321,13
12	4123,378	1291,99267	1289,80
13	4325,675	1359,425	1333,3
14	4470,833	1407,811	1407,44
15	4363,362	1371,98733	1393,99
16	4511,483	1421,361	1444,57
17	4169,128	1307,24267	1329,85
18	4503,826	1418,80867	1419,25
19	4387,428	1380,00933	1379,12
20	4305,369	1352,65633	1351,6
21	4419,473	1390,691	1380,53
22	4277,356	1343,31867	1341,04
23	4357,829	1370,143	1370,63
24	4443,644	1398,748	1398,9
25	4448,209	1400,26967	1400,11
26	4326,731	1359,777	1359,9
27	4423,505	1392,035	1392,79
28	4343,375	1365,325	1364,7
29	4342,387	1364,99567	1364,7
30	4313,366	1355,322	1354,9
31	4342,387	1364,99567	1364,8
32	4319,303	1357,301	1357,6

7. példa: Fibrin-megkötő optikai kontrasztanyagok szintézise

Az alábbi optikai kontrasztanyagok mindegyikét a fenti módszerek analógiá- jára szintetizáljuk. A X. reakcióvázlat egy általános példát mutat be, ahol két azonos optikai festéket adunk ugyanahhoz a peptidhez.

j ··: . ·. . ·.

-1055-Karboxi-tetrametil-rodamin-tartalmú vegyület (3A)

177 mg, 0,10 mmól 1-es pepiidet és 111 mg, 0,21 mmól 5-karboxi-tetrametilrodamin-szukcinimidil-észter A-t feloldunk 20 ml diklór-metánban és 20 ml DMFben. Hozzácsepegtetünk diizopropil-etil-amint, ameddig a pH 9 nem lesz. Az ele5 gyet egész éjjel keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk. A maradékot szilikagélen gyorskromatográfiásan tisztítjuk, eluáló szerként diklórmetán és metanol elegyét használjuk, így a 2A vegyületet kapjuk.

A 2A vegyülethez TFA, H₂O és trietil-szilán 90:5:5 arányú, 5 ml oldatát adjuk. Az elegyet szobahőmérsékleten 3 óra hosszat rázzuk, majd az oldatot 50 ml éter10 be öntjük, és a nyers terméket kicsapjuk. Az oldószereket centrifugálással elválasztjuk, a nyers terméket összegyűjtjük, majd reverz fázisú HPLC-vel tisztítva kapjuk a 3A vegyületet.

- 106 a ··· »·· · * ·· ···!·· « • · · ·· ·· * ♦·

• · · ····· ··»I • · · · · · λ ::^: -.:-+ ·.:·

- 1075-karboxí-fluoreszcein-tartalmú vegyület (3B)

A 3A vegyület szintézisénél leírt módszerrel szintetizáljuk a 3B vegyületet 177 mg, 0,10 mmól 1-es peptid és 99,4 mg, 0,21 mmól B 5-karboxi-fluoreszceinszukcinimidil-észter alkalmazásával.

Texas Red®-X-tartalmú vegyület (3C)

A 3A vegyület szintézisének megfelelően a 3C vegyületet 177 mg, 0,10 mmól 1-es peptid és 172 mg, 0,21 mmól Texas Red®-X-szukcinimidil-észter felhasználásával szintetizáljuk.

8. példa - Kontrasztanyagok targetekhez való kötődésének mérése

A találmány szerinti kontrasztanyag kötődésének mértéke egy targethez, például HSA-hoz vagy fibrinhez, könnyen felmérhető különböző egyensúly megkötési módszerekkel. így például a HSA-hoz való kötődést ultraszűréssel mérhetjük. Ultraszűrést felhasználó, tipikus kötődési mérésben a kontrasztanyagot összekeverjük 4,5 tömeg/térfogat % HSA-val egy 7,4 pH-jú pufferben. A mintát ezután kereskedelmi forgalomban levő centrifuga készülékre töltjük, amely el van látva egy 30 kDa-os molekulatömegű MWC szűrővel (Millipore Ultrafree MC Low Binding Regenerated Cellulose 30 KDA móltömegű MWC katalógus UFC3LTK00), amely áthatolható a célirányos csoport számára, de a HSA számára nem. A minta térfogatának egy kis részét, azaz 5-10 %-át 2000 x g mellett 20 perc alatt az MWC szűrőn keresztül centrifugálva leszűrjük, és a meg nem kötött célirányzott csoport koncentrációját a mintában megmérjük a szűrletben.

A fibrinhez való kötődés mérésére egy mikrotiterű lemez üregében egy fibrinrögöt képezhetünk, és ezt hozhatjuk érintkezésbe a célirányos csoporttal. Az egyensúly megteremtéséhez elegendő inkubációs idő után a felülúszót leszívatva eltávolítjuk, a fel nem oldható fibrin megkötve marad gélesített rög formájában az üreg alján. A meg nem kötött célzott csoport koncentrációját a felülúszóban ezután megmérjük.

Mindkét módszer szerint a megkötött kontrasztanyag koncentrációját a kezdetben jelenlevő összes célirányos csoport koncentrációja és a megkötési kísérletet követően a nem megkötött célzott csoport koncentrációjának különbségeként határozzuk meg. A megkötött frakció a megkötött célirányos csoport koncentrációja osztva az összes célirányos csoport koncentrációjával.

Vizsgáltuk a kontrasztanyagok oldódó fibrin DD(E) fragmenshez való affinitását a fent leírt módon, és a 4. táblázatban mutatjuk be. A 4. táblázatban levő ve

j. ^: r ·.:·

-108gyületszámok az alábbi leírásban részletezett szerkezetekre utalnak. Ezek az adatok többszörös meghatározásban ebben a biológiai kísérletben maximum 20 % hibagyakoriságot tartalmaznak.

4. táblázat - Vegyületek affinitása fibrin iránt

Vegyület	Kd, DD(E), μηηόΙ
4	33
5	12
6	13
7	12
12	5,0
13	5,1
14	4,9
32	4,7
15	4,0
16	3,5
17	6,2
18	5,9
8	8,6
9	6,1
10	9,6
11	13
27	0,7
28	5,3
29	0,8
30	3,7
19	10
20	1,2
21	9,1
22	3,5
31	0,8
23	0,25

-109- • ·· ··· * x · · »····· · • · · ·· «· « *·

24	0,7
25	5,6
42	0,07
43	0,08
44	0,09
45	0,1
33	0,1
35	0,11
46	0,15
47	0,18
48	0,199
49	0,22
50	0,3
34	0,39

9. példa - Kontrasztanyagok stabilitása

A stabilitást patkánymáj homogenizátum alkalmazásával mérjük, mely mind intra-, mind extracelluláris enzimeket tartalmaz, és a peptidkötések számára külö5 nősen kemény kémiai környezetet jelent. 630 pl frissen előállított patkánymáj homogenizátumot egy üveg kémcsőbe helyezünk, és 37 °C-on vizes fürdőn 4 percig inkubáljuk. A patkánymáj homogenizátumhoz 37 °C-on hozzáadunk 70 μΙ 1 mmólos tesztvegyület oldatot. A 0, 5, 15, 30 és 60 perces időpontokban eltávolítunk egy 100 μΙ reakcióelegy alikvótot, és összekeverjük egy mikrofúgázó kém10 csőben 100 μΙ metanollal a reakció befagyasztása céljából. A befagyasztott reakcióelegyet 3 percig 10.000 rpm mellett centrifugálva a kicsapódott proteinből egy pelletet kapunk. A felülúszót LC-MS-sel analizáljuk a tesztvegyület mennyiségének meghatározására oly módon, hogy egyetlen ion MS csúcsát összevetjük egy standard sorozatéval. A T1/2 felezési időt úgy határozzuk meg, hogy az idő függ15 vényében ábrázoljuk a logaritmus százalékos szignált. Az adatok az exponenciális görbe felhasználásával megfelelőek, ahol T1/2 = 1n2/meredekség.

Az alábbi vegyületek stabilitási adatait vizsgáltuk. Az 5-ös vegyület, amely a peptid C- és N-terminális végén egyaránt kelátokat tartalmaz, drámaian megnövelt felezési idővel rendelkezik az exopeptidáz hidrolízissel szemben mutatott rezisz- 110-

tencia következtében. A felezési idő összevethető megnövekedését nem az egyik terminusz kelátokkal történő módosítása révén érjük el, még ha a másik végét be is fedjük egy nem természetes szerves csoporttal, mint pl. a 3-as vegyülettel, amely bifenilcsoportot tartalmaz az N-terminális végén.

OH

1-es szerkezet: felezési idő = < 2 perc, szabad N- és amidéit C-terminusz

2~es szerkezet' felezési idő — 10 perc, kelátokkal konjugált N-terminusz es amidéit C-terminusz.

3-as szerkezet: felezési idő — 9 perc, kelátokkal konjugált C-terminusz és para-(fenil)-benzoesavval acilezett N-terminusz.

5-ös szerkezet: felezési idő = 65 perc, mind az N-, mind a C-terminusz kelátokkal konjugált.

Meglepő módon a fenti adatok azt mutatják, hogy a peptid felezési ideje leginkább azzal nő, hogy hozzáadunk a peptid mind a C-, mind az N-vegehez gadolinium kelátot.

10. példa - Kontrasztanyagok relaxivitása

A jelen találmány szerinti MRI kontrasztanyagokat relaxivitásra értékeljük Bruker NMS-120 Minispec NMR spektrométer alkalmazásával, amely 0,47 Teslánál működik (20 MHz, H-1 Larmor frekvencia), és 37 °C-on, vagy Komg-Brown relaxométer alkalmazásával, amely 35 °C-on működi (20 MHz, H-1 Larmor frekvencia). A víz protonok T1 értékét egy inverziós visszanyerő pulzusfrekvenciával határozzuk meg a műszer szoftver felhasználásával. A relaxivitást a target többszörös oldatai T1 értékének mérésével határozzuk meg (például a frissen polimerizált fibrinogén homodiszperz géljei, 10 mg/ml), amely 0, 20, 30 és 40 pmól Gd(lll)-at tartalmaz. A mintákat legalább 15 percig inkubáljuk 37 °C-on, hogy a T1 mérés előtt biztosítsuk a hőmérsékleti egyensúlyt. A minták Gd(lll) tartalmát indukciósán kondenzált plazma - tömegspektrometriásan (ICP-MS) határozzuk meg. A relaxivitás/gd(lll) ion meghatározása úgy történik, hogy a relaxációs sebességet (1 /T1) s^-ben kifejezve ábrázoljuk a mmól-ban kifejezett Gd(lll) koncentráció függvényében. Egy lineáris fit meredeksége az adatokhoz viszonyítva adja meg a relaxivitást. A vegyületek relaxivitását target hiányában szintén analóg módon határozzuk meg, azzal a különbséggel, hogy nincs jelen target.

A találmány szerinti vegyületek fokozott relaxivitást mutatnak a fibrinhez való kötődés hatására (2. ábra), a biológiai target hiányában mért relaxivitással összevetve.

-112-

11. példa - Kontrasztanyagok rögfelvétele

Egy kontrasztanyag felvételét a vérrögbe az alábbi módon határozzuk meg: egy 600 g-os tengerimalac (Hartley hímnemű) érzéstelenítünk. Az alhasba egy bemetszést végzünk, az alsó gyűjtőeret (IVC) izoláljuk, és az eret hagyjuk 10 percig visszaállni. Az IVC 1cm-es részét összecsípjük, és a véredénybe a trombusképződés elősegítésére humán trombint injektálunk 50 μΙ mennyiségben, 4 egység formájában. Az alsó csipeszt kinyitjuk és lezárjuk, ezzel lehetővé téve a részleges véráramlást a szegmenshez irányítva. 2-3 perc múlva a csipeszeket eltávolítjuk. A vérrögöt az állatban kb. 30 percig hagyjuk állni. Ennél a pontnál a kontrasztanyagot, a 32-es vegyületet 2 μmól/kg dózisban és 70 μΰ ¹¹¹IN-nel radiojelzett nyomot beinjektáljuk a nyaki vénába. A 32-es vegyület befecskendezése után azonnal egy 2 μmól/kg dózisban Gd(DTPA) és 70 pCi TcDTPA elegyéből álló nem specifikus kontrollt fecskendezünk be a nyakéren keresztül. 30 perc múlva vért veszünk, az állatot leöljük és a trombust eltávolítjuk. A vérmintát lemérjük és Packard Cobra II gamma számlálóval számláljuk. A trombust is lemérjük és számláljuk. A ^99mTc-ből eredő számokat 128-165 keV-ből detektáljuk, miközben a ¹¹¹ IN lebomlásából kapott számokat 390-500 keV között mutatjuk ki. A csak ^99mTc-vel vagy ¹¹¹ln-nel végzett kontroll kísérletek azt mutatják, hogy a ^99mTc-ből eredő radioaktivitás elhanyagolható a ¹¹¹ln-re használt detektálási energiák mellett, és fordítva. A radioaktív lebomlási adatokat átalakítottuk a kezdeti dózis%/szövet g, %ID/g értékké, és három kísérlet átlagát grafikusan ábrázoltuk. Előre elvégeztük a ¹¹¹ln-nel a radiocímkézést: a fibrinnel célzott kontrasztanyaghoz megfelelő radiokémiái mennyiségű ¹¹¹lnCI₃-at (New England Nuclear) adagolunk. A pH-t 1 moláros sósav hozzáadásával 4-re állítjuk be. A mintát 45 °C-on 1 órát melegítjük. A pH-t 1 moláros nátrium-hidroxid hozzáadásával semlegesítjük. A jelzett 32-es vegyület tisztasága több mint 95 % γ-detektált HPLC-vel kimutatva.

A fibrin-specifikus szerek jelentős növekedést mutatnak a vérrög felvételben. A 3. ábra azt mutatja, hogy a 32-es vegyület akkumulálódik a trombusban. Speciális vérrög felvétel van a ^99mTcDTPA-val összevetve, és a trombusban nagyobb a szer koncentrációja, mint a környező vérben.

A vérrög felvétel specifikusságát is lehet MRI-vel kimutatni. Egy trombus in vivo leképezési módszere egy szerrel a következő: egy 600 g-os Hartley hímnemű tengerimalacot érzéstelenítünk. A torokba egy bemetszést végzünk, és az egyik

I Λ * ♦· · « · ·♦ · ·

-113nyakeret izoláljuk. A nyakér 1 cm-es metszetét ércsipeszekkel izoláljuk. Az állatból frissen vett 50 pl vért összekeverjük 50 μΙ, 4 egység humán trombinnal, és a véna elcsipeszelt szegmensébe fecskendezzük. Az injekció után 4 perccel a csipeszeket eltávolítjuk, és a trombust 30 percig hagyjuk öregedni. A 32-es vegyületet 6 pmól/kg dózisban befecskendezzük, és a tengerimalac torokterületét 1,5 T mellett leképezzük spoiled gradiens módszerrel, TR=36, TE=5, flip szög=30°. A trombus a vérhez viszonyítva világosnak tűnik.

12. példa - egy trombus MR képének előállítása célzott kontrasztanyaggal, fekete vérrel és anélkül

Egy 2,5 kg-os nőstény New Zealand fehér nyulat 50 mg/kg ketaminból, 2,5 mg/kg aceapromazinból és 5 mg/kg romponból álló koktéllal érzéstelenítünk, és az érzéstelenítést szükség szerint kb. 35 mg/kg nátrium-pentobarbital hozzáadásával fenntartjuk. Egy 24 g-os i.v. katétert helyezünk a fülvénába és a fülartériába. A nyakeret és a nyaki verőeret izoláljuk. A nyaki verőérben sztenózist hozunk létre úgy, hogy a véredény tetejére egy 18 g-os tűt helyezünk, és ezután ezt 3-0 varrattal odavarrjuk. Ezután a tűt eltávolítjuk. Az artéria 5 mm-es részét a sztenózistól távol szeletekre osztjuk mikrovaszkuláris csipeszekkel. Az artériát ezután kétszer feldaraboljuk egy 5 mm-es szekció mentén. A proximális vaszkuláris csipeszt kiengedve hagyjuk, hogy vér áramoljon a szekcióba kb. 3 mp-ig. A csipeszt újra alkalmazzuk, és az artériát kétszer újra feldaraboljuk az 5 mm-es szekció mentén. 4 perc múlva a csipeszeket eltávolítjuk. A nyakér 5 mm-es szegmensét mikrovaszkuláris csipeszekkel izoláljuk. Trombust kapunk, ha 100 μΙ, 3,7 egység trombint, 0,06 mól kalcium-kloridot és nyúl egész vér elegyet befecskendezünk. 4 perc múlva a csipeszeket eltávolítjuk.

A trombusokat 50 percig hagyjuk kialakulni. Trombussal célzott szer (5 mmól, 2 pmól/kg, lll-as szerkezet) 1, ml-es oldatát beadagolunk a füli vénán keresztül. 10 perc múlva az állatot egy General Electric Signa LxCVi 1,5 tesla szkennelö belsejébe helyezzük, és egy első MRI adatszetet kapunk 3D RF spoiled gradiens echo szekvencia alkalmazásával (SPGR: TR = 39 mp, TE = 3,1 mp, flip szög = 40°, látótér = 8 cm, akvizíciós sávszélesség = 31,25 kH. Kémiai zsírtelítést alkalmazunk, valamint 40 mm-es tér inferior és szuperior telítési sávot. A scan után azonnal, azaz 8 perccel később egy második MRI adatszetet veszünk

-114.t ”·::

Λ ::^: %:··;· ·.:· fel ugyanilyen paraméterek alkalmazásával, 40 mmól tér inferior és szuperior telítési sáv hozzáadásával, és fekete vér kép generálására.

A 4A. ábra az első adatszet maximális intenzitású kivetítését (MIP) mutatja. A véredények a TOF hatástól (time of flight) részben kiemelkednek. A 4B. ábra mutatja a második adatszet MIP értékét, ahol a beáramló vérből kapott szignál el van nyomva (fekete vér) a szuperior és inferior telítési sávok alkalmazása révén. A 4A. és 4B. ábra mutatja, hogy stationárius target, azaz trombus azonosítása könnyebbé válik a célirányos kontrasztanyag alkalmazásával.

13. példa - Optikai kontrasztanyag előállítása

0,20 mmól/g, 100 mg, 20 pmól NovaSyn TGR gyantát NMP/éter/NMP eleggyel mosunk. A pepiidet standard szilárd fázisú módszerrel összegyűjtjük, PyBOP/HOBt/DIEA aktiválás alkalmazásával. A végső aminosav-csoport kondenzálása után a gyantához kötött pepiidet piperidin DMF-fel képezett, 2,0 ml, 20 térfogat%-os oldatával kezeljük 10 percig az Fmoc védőcsoport eltávolítására. A gyantát NMP/éter/NMP eleggyel alaposan mossuk, és 23,4 mg, 60 pmól fluoraszcein-5-izotiocianáttal és 11,6 mg, 15,7 μΙ, 90 pmól diizopropil-etil-amin 1,5 ml DMF-es oldatával kezeljük 12 óra hosszat. A gyantát NMP/éter/NMP elegyével alaposan mossuk, 18,7 mg, 34,5 pmól TI(TFA)₃ 1,5 ml DMF-es oldatával 3 órát kezeljük 4 °C-on. A gyantát a kezelés után mossuk, és TFA/TIS/víz 95,2:2,5:2,5 arányú, 2 ml-es koktéljával kezeljük 2 órát. A nyers peptidet úgy csapjuk ki, hogy a hasító koktélhoz étert adagolunk, és preparatív HPLC-vel tisztítjuk Vydac C-18 oszlopon. Az A-N szerkezeteket így képezzük, és ezek fibrin DD(E) fragmens affinitásait meghatározzuk (5. táblázat).

Trt o o íN ° 0 =·^0 0 \ac 3eptidet standard módszerrel NovaSyn TGR gyantán összegyűjtünk AXQYa ] j L^o i 1 Xqh o

1 <·’’·/· · *· -115- ^NTrt | 3uOt I J ΐΐΗ§Ηδ/ θζ^ 0 Wr O / \^O í m | ten*' | 001 NovaSyn TGR gyanta -k/ \ 020 mmol/g s II c 1 illő ’ Τήθ^ν^01’06' Xqh o Z WFAWDMF, 3h 3. TFAH1SAvízt 95/2.5/2.5, 2h Ó HO 1 r> 1 H ? \ Η ϊά Sí Λ A ΧααΧ^^νΧτΙ2 HOZ \ 1

Szerkezetek

-118 -

5. táblázat - Optikai célzott kontrasztanyag affinitása fibrinhez

ID Kd (μιτιόΙ)

D

Vs. DD(E 0 061

) Fluor Fluor

_ Ahx

X2 x3 W F

X4 XS , „ H 'C;\ ·

Hyp

_ Y(3-D

Λ8 D

L

[C

ÍH I

o

J

0,055

Fluor

Q

W E

•c p

Y

G

L

c

. w

I Q

K

0,06

Fluor

w

F H

C P

Y

D

L

c

,H

I L

E

0,09

Fluor

Ahx

G G

F H .

c

Hyp

Y(3-I)

D

L b. ’

C Η I

C

0.097

Fluor

Ahx

G F

H

jHyp

Y(3-I)

D

L

;C

Ή I

B

0.099

Fluor

Ahx

F H

C Hyp -

Y(3-I)

D

L

G.

H

I

H

0.119

Fluor

K

W F

H G ; '

Hyp

Y(3-I)

D

L

G

Η I

10

G

0.124

Fluor

K

G F

H fc..

iHyp__

Y(3-I)

D

L

C _

Η I

I

0.127

Fluor

K

G G

F_ H

£

íHyp

Y(3-I)

D

L

,C .: <H I

A

0.136

Fluor

beta-A

F H

c:Hyp

Y(3-I)

D

L

G

:H

I

F

0.212

Fluor

K

F H

C Hyp

Y(3-D

D

L

c

,H

I

Peptidek N-terminális jelzése optikai mintákkal modulálhatja az optikai kontrasztanyagokhoz való kötődési affinitást. így például, ha összevetjük a fluoreszceint, a 4-metoxi-kumarint és a tetrametil-rodamin peptidszármazékokat 20 (QWECPYGLCWIQ (SEQ ID. NO:27); Kd=3 gmól), akkor a következő Kd-ket kapjuk (6. táblázat).

6. táblázat

Vegyület	Fluorfor	Kd
J	fluoreszcein	0,06
L	tetrametil-rodamin	2,0
N	4-metoxi-kumarin	0,2

14. példa - Fibrin-célzott urokináz

A fibrin-célzott urokinázt az alábbi módon állítjuk elő. Egy fibrin-kötő peptidet egy Gly-Gly dipeptid iinkerrel állítunk elő a szilárd fázisú eljárások alapján. A peptid N-terminuszát acetilcsoporttal védjük, és a C-terminális karbonsavat

-119* · · · ·· · ·· szukcinamidális aktív észterré alakítjuk. Közvetlen kémiai ligálást kapunk, ha összekeverjük az urokinázt és az aktivált pepiidet megfelelő arányban vizes pufferban, és az oldatot mérsékelten keverjük 30 percig.

A fibrin-célzott urokinázt HPLC-vel tisztíthatjuk. A fibrinhez való kötődést megbecsülhetjük. Az 1-es vegyület szelektíven köti meg a fibrint a fibnnogennel szemben.

A nyúl nyakér modellt (Collen és tsai, J. Clin. Invest. 1983, 71, 368-376) használjuk trombolízis kísérletekhez. 2 mg/kg vegyületet adagolunk bólusz infúzióval, azaz az összdózis 20 %-ával 1 perc alatt, 300 egység/kg heparin bolusszal együtt 1 perc alatt. A dózis maradékát folyamatosan juttatjuk be infúziósán a következő 60 percen keresztül, és 60 egység/kg/óra heparint folyamatosan juttatunk be infúziósán a következő 180 percen át. Az állatokat 3 óra múlva leöljük, és a vérrögöket analizáljuk. Az 1-es vegyület hatásosabb a vérrög lízisben, mint az scuPA önmagában. 3 óra múlva 2 mg/kg 1-es vegyületet adagolunk, és kevesebb a fibrinogén és az a2-antiplazmin fogyasztás ekvivalens dózisú scuPA dózisokhoz viszonyítva önmagában, azt mutatva, hogy az 1-es vegyület fibrin-specifikusabb, mint az scuPA önmagában.

-120 A fenti eljárás csak illusztrációs célokat szolgál, nem pedig korlátozó jellegű.

A találmányhoz tartoznak egyéb szempontok, előnyök és módosulatok is.

A szekvencialistában található kötetlen szövegek fordításai

1. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése az 1. pozícióban: Pro vagy nem természetes származéka

Xaa jelentése a 2. pozícióban: Tyr vagy nem természetes származéka

Xaa jelentése a 3. pozícióban: Gly vagy Asp, vagy a Gly vagy Asp nem természetes származéka

Xaa jelentése a 4. pozícióban: Leu vagy nem természetes származéka

2. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése az 1. pozícióban: Trp, Tyr, Phe, Ser, nTyr, dW, dF, F(3/4*), Y(3*) vagy nem természetes származékuk

Xaa jelentése a 2. pozícióban: Glu, His, dGlu, Ser vagy nem természetes származékuk

Xaa jelentése a 4. pozícióban: Pro vagy nem természetes származéka

Xaa jelentése az 5. pozícióban: Tyr vagy nem természetes származéka

Xaa jelentése a 6. pozícióban: Gly vagy Asp

Xaa jelentése a 9. pozícióban: His, Phe, Tyr vagy Trp

Xaa jelentése a 10. pozícióban: lie, Leu, Val, Asn, F(3/4*) vagy nem természetes származékuk

Xaa jelentése a 11. pozícióban: Asn, Gin, He, Leu, Val vagy hiányzik

3. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 2. pozícióban: Pro vagy 4-hidroxi-prolin

Xaa jelentése a 3. pozícióban: Tyr vagy a tirozin nem természetes származéka

Xaa jelentése a 4. pozícióban: Gly vagy Asp

4. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 4. pozícióban: 4-hidroxi-prolin

-121 Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

5. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 4. pozícióban: 4-hidroxi-prolin

Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

6. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 4. pozícióban: 4-hidroxi-prolin

Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

7. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 4. pozícióban: 4-hidroxi-prolin

Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

8. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 4. pozícióban: 4-hidroxi-prolin

Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

9. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 4. pozícióban: 4-hidroxi-prolin

Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

10. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 4. pozícióban: 4-hidroxi-prolin

Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

11. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 4. pozícióban: 4-hidroxi-prolin

Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

12. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése az 1. pozícióban: 4-metoxi-fenil-alanin

Xaa jelentése a 4. pozícióban: 4-hidroxi-prolin

Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

-122-

13. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 4. pozícióban: 4-hidroxi-prolin

Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

14. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

15. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 4. pozícióban: 4-hidroxi-prolin

16. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 4. pozícióban. 4-hidroxi-prolin

Xaa jelentése az 5. pozícióban: meta-klór-tirozin

17. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 8. pozícióban: n(decil)Gly, n(4-PhBu)Gly, MeLeu, Phe(4*), Phe(3-Me), Phe(3,4-difluor), Tyr(3,5-di-jód) vagy MeLeu

18. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 8. pozícióban: n(decil)Gly, n(4-PhBu)Gly, MeLeu, Phe(4*), Phe(3-Me), Phe(3,4-difluor), Tyr(3,5-di-jód) vagy MeLeu

Xaa jelentése a 9. pozícióban: Asp, dAsp, béta-Asp, Me-Asp vagy dCys

19. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 10. pozícióban: n(decil)Gly 20. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 10. pozícióban: n(decil)Gly

21. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 10. pozícióban: bifenil-alanin

22. szekvencia szintetikusan előállított peptid

-123 Xaa jelentése a 10. pozícióban, bifenil-alanin

23. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 10. pozícióban: metil-leucin

24. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 10. pozícióban: metil-leucin

25. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése a 10. pozícióban: metil-bifenil-alanin

26. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Xaa jelentése az 1. pozícióban: bármilyen természetes vagy nem természetes aminosav

Xaa jelentése a 2. pozícióban: Pro vagy nem természetes származéka

Xaa jelentése a 10. pozícióban: n(decil)Gly, n(4-PhBu)Gly, MeLeu, Phe(4*), Phe(3-Me), Phe(3,4-difluor), Tyr(3,5-di-jód) vagy MeLeu

Xaa jelentése a 11. pozícióban: Asp, dAsp, béta-Asp vagy Me-Asp

27. szekvencia szintetikusan előállított peptid

Claims (106)

-124SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás MR leképező szer előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy N-terminális amin funkciós csoportot tartalmazó peptidet reagáltatunk egy linker-alegység csoporttal C-terminális amin funkciós csoportot és N-terminális amin funkciós csoportot tartalmazó módosított peptid előállítására;

b) kovalensen kapcsolunk egy linkercsoportot a C-terminális amin funkciós csoporthoz és az N-terminális amin funkciós csoporthoz egy prekurzor MR leképező szerelőállítására; és

c) a prekurzor MR leképező szert átalakítjuk MR leképező szerré.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linkeralegység az alábbi csoportokból kerül ki:

ahol n értéke 1-4 közötti egész szám;

m értéke 1 -12 közötti egész szám; és

R jelentése alifás vagy aromás csoport.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linkercsoport az alábbi csoportokból kerül ki:

-121-

y—LG

R'N NR' 'TL

ahol m értéke 1-4 közötti egész szám;

n értéke 0-4 közötti egész szám;

LG kilépöcsoport; és

R' és R egymástól függetlenül hidrogénatom vagy kémiai védőcsoport.

• · ·«·»·· »» ♦· 4 *·*

- 130-

bázis

és

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linkercsoport az alábbi csoportok valamelyike:

NR’R² . S-Cz-nr’r²

LG xs—r nr'r²

ahol

LG kilépőcsoport; és

R¹ és R² jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy kémiai védőcsoport.

5-ös szerkezet:

5 A 3 vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy LG hidroxilcsoport, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid, és ahol a kémiai vedocsoport lehet Boc, Fmoc, CBZ, t-butil-, benzil- vagy allilcsoport.

• ··· · · · · χ ·· ······ · •» · ·· ·· * ··

6-os szerkezet:

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aktivált észter lehet pentafluor-fenol (Pfp), N-hidroxi-szukcinimid (NHS), N-hidroxi-szulfoszukcinimid-nátriumsó (NHSS), 2-tioxo-tiazolidin-1 -il vagy hidroxi-benzotriazol (OBT).

7-es szerkezet:

7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a halogenid lehet fluor-, klór-, bróm- vagy jódatom.

8-as szerkezet:

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor MR leképező szert MR leképező szerré alakítjuk oly módon, hogy:

a) a prekurzor leképező szert prekurzor kelátcsoporttal reagáltatjuk kovalens kötés képzésére a prekurzor kelátcsoport és a prekurzor MR leképező szer linkercsoportja között, ahol a prekurzor kelátcsoport többféle karboxilát prekurzor csoportból áll, és a karboxilát prekurzor csoport alkalmas karboxilátcsoporttá tör ténő alakításra;

b) a megkötött prekurzor kelátcsoport számos karboxilát prekurzor csoportját átalakítjuk karboxilátcsoportokká, ahol a karboxilátcsoport alkalmas paramágneses fémion komplexálására; és

c) a paramágneses fémiont sokféle karboxilátcsoporttá komplexálva MR leképező szert kapunk.

9-es szerkezet:

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor kelátcsoport az alábbi csoportok valamelyike lehet:

10-es szerkezet:

10 ahol a bázis jelentése adenozin, guanozin, timin vagy citozin;

LG jelentése kilépőcsoport, előnyösen hidroxi lesöpört, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid; és

R jelentése alifás vagy aromás csoport.

15

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szintetikus csoport lehet karbonsav, aktivált észter, savhalogenid, anhidrid, alkil-halogenid, izocianát vagy izotiocianát, és ahol az 0’ prekurzor lehet -OH, -OMe, OEt, OtBu, 25 0-benzil- vagy O-allil-csoport.

11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor kelátcsoport az alábbi csoportok valamelyike lehet:

’.j. J ·.> Η- ·-’·

- 124-

és

ahol LG kilépőcsoport, és lehet hidroxilcsoport, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid, és ahol mindegyik R egymástól függetlenül lehet O vagy O prekurzor, amely lehet OH, -Ο-Me, O-Et, O-tBu, O-benzil- vagy O-allil-csoport, úgy hogy az R az O -szá történő átalakítás után alkalmas arra, hogy a szomszédos karbonilcsoportjával karboxilátcsoportot képezzen.

12. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor kelátcsoport az alábbi képletű lehet:

o

A Η· ·.<

ahol n értéke 1-4 közötti egész szám;

R jelentése negatív töltés vagy negatív töltéssé átalakítható negatív töltésű prekurzor; és

X jelentése kémiai kilépőcsoport, előnyösen -Cl, -Br, -I, -MsO, -TsO vagy -TfO.

13. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor kelátcsoport az alábbi képletű lehet:

ahol

R jelentése negatív töltés vagy negatív töltéssé átalakítható negatív töltésű prekurzor; és

X jelentése kilépőcsoport, előnyösen -Cl, -Br, -I, -MsO, -TsO vagy -TfO.

-426^-

14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a negatív töltésű prekurzor lehet -H, -Me, -Et, -t-Bu, -benzil- vagy -allilcsoport.

15-ös szerkezet:

15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linkercsoport kovalensen konjugált egy prekurzor kelátcsoporttal, és a kovalens konjugátum több karboxilát prekurzor csoportból áll, ahol a karboxilát prekurzor csoportok átalakíthatok karboxilátcsoportokká.

¹⁵ ahol Y a kapcsolódó linkercsoporttal kovalens kötés képzésére alkalmas szintetikus csoport, és ahol X egymástól függetlenül 0' vagy O' prekurzor, úgy hogy X az O-szá történő átalakulás után alkalmas a szomszédos karbonilcsoporttal karboxilátcsoport kialakítására, és R¹ jelentése töltés nélküli 20 kémiai csoport, alifás, alkil- vagy cikloalkilcsoport, vagy töltés nélküli szubsztituált verziói.

16-os szerkezet:

OH

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kovalens konjugátum az alábbi csoport lehet:

LG

(If

j. ^: ί· ·>

ahol η értéke 1-4 közötti egész szám;

LG jelentése kilépőcsoport, előnyösen -OH, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid; és _Ri R², R³, R⁴ és R⁵ jelentése egymástól függetlenül acetátcsoport, -Me, -Et vagy -t-Bu-védett acetátcsoport, acetamid- vagy acetoxicsoport.

17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kovalens konjugátum az alábbi képletű csoport lehet.

ahol

LG kilépőcsoport, előnyösen -OH, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid; és _Ri _R2 _r3 _{és R}4 j_e|_entése acetátcsoport, -Me, -Et vagy -t-butil-csoporttal védett acetátcsoport, acetamid- vagy acetoxicsoport.

18-as szerkezet:

GdOTPACONH ___/ \------------ 0=¾ a C OH

18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kovalens konjugátum az alábbi képletű lehet:

Synthon 1: (CH₃)₃CO₂C. (CH₃)3CO₂C. y \--N Hr/ HO NH ^o=\ (CH₃)₃co₂c 2 (CH₃)₃CO₂C Synthon 2: (CH₃)₃CO₂C (CH₃)₃CO₂G y \---N °\ 0 /Nb HO—/ /--⁷ \--N O=/ /---N (CH₃)₃CO₂C (CH₃)₃co₂c CO₂C(CH₃)_3//---CO2C(CH₃)₃ \ /Ά N--/ >---CO₂C(CH₃)3 =O 1 N -V y---CO₂C(CH ₃)₃ / \-N GO₂C(CH₃)₃ --CO₂C(CH₃)_{3 3} g_S CO₂C(CH₃)₃y--CO₂C(CH₃)₃ / /--N |sj---/ ---CO₂C(CH₃)₃ 1 H N--y y--CO₂C(CH₃)₃ / \--_N CO₂C(CH₃)₃\---CO₂C(CH₃)₃

19-es szerkezet:

19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kovalens konjugátum az alábbi képletű lehet:

ahol

R jelentése t-butil-csoport;

LG kilépőcsoport, előnyösen -OH, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid.

20-as szerkezet:

20. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor MRI leképező szert az alábbi módon alakítjuk MR leképező szerré:

a) a kovalens konjugátum több karboxilát prekurzor csoportját átalakítjuk karboxilátcsoporttá, ahol a karboxilátcsoportok alkalmasak egy paramágneses fémion komplexálására; és

b) egy paramágneses fémiont több karboxilátcsoporttá alakítunk MR leképező szer előállítására.

21. A 8. vagy 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a paramágneses fémion az alábbi csoportok közül kerülhet ki: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll és III), Cr(lll), Cu(ll), Dy(lll), Tb(lll és IV), Ho(lll), Er(lll), Pr(lll), Eu(ll) és Eu(lll).

22-es szerkezet:

Gd-DTPA-OO-NH

22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a paramágneses fémion Gd(lII).

23. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépés előtt egy linker-alegységet reagáltatunk a peptid N-terminális amin funkciós csoportjával a peptid N-terminális amin funkciós csoport származékának előállítására.

24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linker alegység az alábbi képletű lehet:

25. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linkeralegység az alábbi képletű csoport:

ahol n értéke egymástól függetlenül 0-3 közötti egész szám;

26-os szerkezet:

26. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linkeralegység a következő képletű lehet:

Ί . < ίψ · ? »·α ** ♦· ·

R ahol n értéke egymástól függetlenül 1 vagy 2;

R jelentése alifás vagy aromás csoport; és

LG jelentése kilépőcsoport, előnyösen hidroxilesöpört, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid.

27-es szerkezet:

27. Eljárás MR leképező szer előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy aminosav-maradékot kovalensen kapcsolunk egy linker-alegység csoporthoz egy peptid C-terminális végének kialakítására, ahol a linker-alegység csoport kovalensen kapcsolódik egy gyantához;

b) egy peptidet szintetizálunk a gyantán a kovalensen megkötött C-terminális végből a peptid N-terminális maradékával, ahol az N-terminális maradék Nterminális amin funkciós csoportot tartalmaz;

c) a gyantáról a peptidet lehasítjuk C-terminális amin funkciós csoportot tartalmazó peptid előállítására

d) egy linkercsoportot kapcsolunk kovalensen a peptid C-terminális amin funkciós csoportjához és N-terminális amin funkciós csoportjához, prekurzor MR leképező szer előállítására; és

e) a prekurzor MR leképező szert az MR leképező szerré alakítjuk.

28-as szerkezet:

28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés előtt kovalensen kapcsolunk egy linker-alegység csoportot az N-terminális amin funkciós csoporthoz, hogy N-terminalis amin funkciós csoport származékot kapjunk.

29. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor MR leképező szer MR leképező szerré alakítását a következőképpen végezzük.

- i3r-

a) a prekurzor MR leképező szert prekurzor kelátcsoporttal reagáltatunk, és így a prekurzor kelátcsoport és a prekurzor MR leképező szer linkercsoportja között kovalens kötést képezünk, ahol a prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportból áll, amelyek karboxilátcsoportokká alakíthatók;

b) a megkötött prekurzor kelátcsoport többszörös karboxilát prekurzor csoportjait átalakítjuk több karboxilátcsoporttá, ahol a karboxilátcsoport alkalmas egy paramágneses fémion komplexálására; és

c) egy paramágneses fémiont több karboxilátcsoporttá komplexálunk MR leképező szer előállítására.

30-as szerkezet:

30. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linkercsoport kovalensen van konjugálva egy prekurzor kelátcsoporttal, ahol a kovalens konjugátum több karboxilát prekurzor csoportból áll, amelyek átalakíthatok karboxilátcsoportokká.

30 R jelentése alifás vagy aromás csoport; és

LG jelentése kilépőcsoport, előnyösen hidroxilesöpört, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid.

31-es szerkezet:

és

31. A30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor MRI leképező szer MR leképező szerré alakítása a következő lépésekből áll:

a) a kovalens konjugátum több karboxilát prekurzor csoportját átalakítjuk karboxilátcsoporttá, ahol a karboxilátcsoportok alkalmasak egy paramágneses fémion komplexálására; és

b) egy paramágneses fémiont komplexálunk több karboxilátcsoporttá MR leképező szer előállítására.

32-es szerkezet:

ahol Gd jelentése paramágneses fémion Gd(lll), ahol a Gd(lll) a DTPA csoporthoz igazított; és ahol a DTPA csoport kovalensen kapcsolódik a DTPA csoport etilén- vagy acetát szénatomjánál levő C(=O) csoporthoz.

32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a paramágneses fémion az alábbi csoport lehet: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll és III), Cr(lll), Cu(ll), Dy(lll), Tb(lll és IV), Ho(lll), Er(lll), Pr(lll), Eu(ll) és Eu(lll).

33-as szerkezet:

33. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a paramágneses fémion Gd(lll).

34. Eljárás MR leképező szer előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy C-terminális karboxilát funkciós csoportot tartalmazó peptidcsoportot linker-alegység csoporttal reagáltatva C-terminális karboxilát funkciós csoportot és N-terminális karboxilát funkciós csoportot tartalmazó módosított peptidet állítunk elő;

b) kovalensen kapcsolunk egy linkercsoportot a módosított pepiid Nterminális és C-terminális karboxilát funkciós csoportjaihoz prekurzor MR leképező szer előállítására; és

c) a prekurzor MR leképező szert MR leképező szerré alakítjuk.

35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linkeralegység csoport az alábbi képletű lehet:

ahol

LG jelentése kilépőcsoport, előnyösen OH, aktivált észter, halogenid vagy anhidrid; és

R jelentése aromás vagy alifás csoport.

36 A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linkercsoport az alábbi képletű lehet:

nh₂

R’^fT^^^-^NR’R²

RO_Z

CCiR^X^'’^<^CO2^R

ahol m értéke 1-4 közötti egész szám;

n értéke 0-4 közötti egész szám;

R jelentése egymástól függetlenül -H, -Me, -Et, -Bz vagy -tBu; és

R¹ és R² jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy kémiai védőcsoport.

37-es szerkezet:

j. I? <· Η· ·*.·

37 a 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linkercsoport az alábbi csoportok közül kerülhet ki:

--MR'S^{2 H}z^N—r² ^,nr’r²

NR’R²

R^n^m-A^-nr’r² nh₂

-J··; . ·. :.:. . ·.

··· · * · · · · · ahol R¹ és R² jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy kémiai védöcsoport, ahol a kémiai védöcsoport lehet Boc, Fmoc, CBZ, t-butil-, benzil- vagy allilcsoport.

38-as szerkezet:

38. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor MR leképező szert MR leképező szerré alakítjuk:

a) a prekurzor MR leképező szert prekurzor kelátcsoporttal reagáltatjuk, és így kovalens kötést alakítunk ki a prekurzor MR leképező szer linkercsoportja és a prekurzor kelátcsoport között, ahol a prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportból áll, melyek átalakíthatok karboxilátcsoportokká;

b) a megkötött prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportját több karboxilátcsoporttá alakítjuk, ahol a karboxilátcsoportok alkalmasak egy paramágneses fémion komplexálására; és

c) egy paramágneses fémiont komplexálunk több karboxilátcsoporttá MR leképező szer előállítására.

39-es szerkezet:

39. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a linkercsoport kovalensen konjugált egy prekurzor kelátcsoporttal, ahol a kovalens konjugátum több karboxilát prekurzor csoportból áll, melyek átalakíthatok karboxilátcsoportokká.

40-es szerkezet:

40. A 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor MR leképező szert a következő lépésekkel alakítjuk MR leképező szerré:

a) több kovalens konjugátum karboxilát prekurzor csoportot alakítunk át karboxilátcsoporttá, ahol a karboxilátcsoport alkalmas egy paramágneses fémion komplexálására; és

b) egy paramágneses fémiont több karboxilátcsoporttá komplexáljuk, és így az MR leképező szert kapjuk.

41. A 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kovalens konjugátum az alábbi csoportokból kerül ki:

A - 135^··: . ·. :.:. . ·.

··· ·♦ ·· · ··

ahol n értéke 1-4 közötti egész szám; és

R¹, R², R³, R⁴ és R⁵ jelentése egymástól függetlenül acetátcsoport, -Me, -Et vagy -t-Bu-csoporttal védett acetátcsoport, acetamidcsoport vagy acetoxicsoport.

42-es szerkezet:

42. A 39. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kovalens konjugátum a következő:

43-as szerkezet:

43 Az 1., 27. vagy 34. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor MR leképező szert az alábbi módon alakítjuk MR leképező szerré:

a) a prekurzor leképező szert kelátcsoporttal reagáltatjuk, ahol a kelátcsoport paramágneses fémiont tartalmaz, és így kovalens kötést képezünk a kelátcsoport és a prekurzor MR leképező szer linkercsoportja között, MR leképező szer előállítására.

44-es szerkezet:

44. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a paramágneses fémion az alábbi csoportok valamelyike: Gd(lll), Mn(ll és III), Cr(lll), Cu(ll), Dy(lll), Tb(lll és IV), Ho(lll), Er(lll), Pr(lll), Eu(ll) és Eu(lll).

45-ös szerkezet:

45 a 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a paramágneses fémion Gd(lll).

46-os szerkezet:

H

46 Kontrasztanyag, amely fémkelát komplexet tartalmaz egy biopolimer -C0₂R és NHR végén, ahol R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, alkilcsoport, alifás vagy kilépőcsoport.

47 a 46. igénypont szerinti kontrasztanyag, amely a biopolimer CO₂R és NHR végén két fémkelát komplexből áll.

48 a 46. igénypont szerinti kontrasztanyag, ahol a biopolimer specifikus kötődési affinitást mutat a fibrin irányában.

49-es szerkezet:

és

49. A 46. igénypont szerinti kontrasztanyag, ahol a biopolimer egy peptid.

-437-

50-es szerkezet:

50. A 49. igénypont szerinti kontrasztanyag, ahol a peptid nem reduktív körülmények között diszulfid kötést képez.

51. Az 50. igénypont szerinti kontrasztanyag, ahol a peptid diszulfid kötésből áll.

52. A 46. igénypont szerinti kontrasztanyag, ahol a kontrasztanyag képlete a következő:

(Kelát Om---(Linker)p--(Unker-óteaEégi_s

(Linker-alegység.;-—(Linker)_p-----(Kelát Dm ahol a kelát jelentése fémkelát komplex;

a linker jelentése linkercsoport;

a linker-alegység jelentése linker-alegység csoport;

m értéke egymástól függetlenül 1-10 közötti egész szám;

p értéke egymástól függetlenül 0-5 közötti egész szám;

s értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1;

R¹ jelentése aminosav oldallánc vagy származéka; és

R² jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy alifás csoport.

53. Az 52. igénypont szerinti kontrasztanyag, amelynek a szerkezete az alábbiak közül kerül ki:

54. Az 52. igénypont szerinti kontrasztanyag, amelynek a szerkezete a következő:

55. Az 52. igénypont szerinti kontrasztanyag, amelynek a szerkezete az alábbi:

56. Eljárás egy N-terminális amin funkciós csoportot tartalmazó peptid stabilitásának megváltoztatására, azzal jellemezve, hogy

a) a peptidet egy linker-alegység csoporttal reagáltatva C-terminális amin funkciós csoportot tartalmazó peptidet kapunk; és

b) egy linkercsoportot kovalensen kapcsolunk össze a peptid C-terminális amin funkciós csoportjával és N-terminális amin funkciós csoportjával módosított peptid előállítására.

57. Az 56. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított peptidet egy prekurzor kelátcsoporttal reagáltatva kovalens kötést képezünk a prekurzor kelátcsoport és a módosított peptid linkercsoportja között, ahol a prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportból áll, amelyek átalakíthatok karboxilátcsoportokká.

58. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

a) a megkötött prekurzor kelátcsoport több karboxilát prekurzor csoportját átalakítjuk több karboxilátcsoporttá, ahol a karboxilátcsoport egy paramágneses fémion komplexálására képes; és

b) egy paramágneses fémiont több karboxilátcsoporttá komplexálunk.

59. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy megvizsgáljuk a módosított peptid stabilitását.

60. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

a) egy nem módosított peptid stabilitását vizsgáljuk; és

b) összevetjük a módosított peptid stabiiitását a nem módosított peptid stabilitásával.

61. A 60. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított peptid stabilitása a nem módosított peptid stabilitásához viszonyítva javul.

62. A 61. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított peptid stabilitása tízszeresen javul a nem módosított peptid stabilitásához viszonyítva.

63. A 61. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított peptid stabilitása a húszszorosára javul a nem módosított peptid stabilitásához képest.

64. A 61. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított peptid stabilitása harmincszorosára javul a nem módosított peptid stabilitásához képest.

65. Az 59. vagy 60. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stabilitást patkánymáj homogenizátum kísérlettel vizsgáljuk.

66. Egy módosított peptid, amelynek a szerkezete a következő:

-('Kelát prekurzor)™

R² O N

(Linker-alegység)_s-----(Línker)_pR n

(Kelát —(Linkerk----(Unker-alegységig prekurzor)™ ahol a kelát prekurzor jelentése kelát prekurzor csoport;

a linker jelentése linkercsoport;

_a ünker-alegység jelentése linker-alegység csoport;

m értéke egymástól függetlenül 1-10 közötti egész szám;

p értéke egymástól függetlenül 0-5 közötti egész szám;

s értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1;

R¹ jelentése aminosav oldallánc vagy származéka; és

R² jelentése hidrogénatom vagy alifás csoport.

67. Módosított peptid, melynek szerkezete a következő:

-.451 R

N

(Linker-alegység_s----(Linker)_p p-----(Linker-alegység)_s (Linker) ahol a linker jelentése linkercsoport; a linker-alegység jelentése linker-alegység csoport; p értéke egymástól függetlenül 0-5 közötti egész szám; s értéke egymástól függetlenül 0 vagy 1;

R¹ jelentése aminosav oldallánc vagy származéka; és R² jelentése hidrogénatom vagy alifás csoport.

68. Eljárás MR leképező szer előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy N-terminális amin funkciós csoportot tartalmazó peptidet linkeralegység csoporttal reagáltatunk mind az N-terminuszon, mind a C-terminuszon amin funkciós csoportot tartalmazó módosított peptid előállítására; és

b) a módosított peptidet MR leképező szerré alakítjuk.

69. Eljárás MR leképező szerelőállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy C-terminális karboxilát funkciós csoportot tartalmazó peptidet linkeralegység csoporttal reagáltatva mind a C-terminuszon, mind az N-terminuszon karboxilát funkciós csoportot tartalmazó módosított peptidet állítunk elő; és

b) a módosított peptidet MR leképező szerré alakítjuk.

70. Eljárás MR leképező szer előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy aminosav-maradékot linker-alegység csoporttal kovalensen összekapcsolunk egy peptid C-terminális végének kialakítására, ahol a linker-alegység csoport kovalensen kapcsolódik egy gyantához;

b) a gyantán egy peptidet szintetizálunk, ahol a peptid C-terminális vége és N-terminális maradéka kovalensen kapcsolódik egymáshoz, ahol az N-terminális maradék N-terminális amin funkciós csoportból áll;

c) a peptidet a gyantáról lehasítva a módosított peptid C-terminális amin funkciós csoportját kapjuk;

d) a módosított peptidet MR leképező szerré alakítjuk.

/<Z ^:*r

71. A 68., 69. vagy 70. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított peptidet MR leképező szerré alakítjuk oly módon, hogy kovalensen kapcsoljuk össze a kelátcsoportot a módosított pepiiddel, ahol a kelátcsoport egy paramágneses fémiont tartalmaz, MR leképező szer előállítására.

72. A 71. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a paramágneses fémion az alábbi csoportok valamelyike lehet: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll és III), Cr(lll), Cu(ll), Dy(lll), Tb(lll és IV), Ho(lll), Er(lll), Pr(lll), Eu(ll) és Eu(lll).

73. A 71. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a paramágneses fémion Gd(lll).

74. A 68., 69. vagy 70. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított peptidet MR leképező szerré alakítjuk oly módon, hogy

a) kovalensen kapcsolunk egy linkercsoportot egy kelátcsoporthoz kovalens konjugátum előállítására, ahol a kelátcsoport egy paramágneses fémiont tartalmaz; és

b) a kovalens konjugátumot módosított pepiiddel reagáltatva MR leképező szert kapunk.

75 a 74. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a paramágneses fémion az alábbi lehet: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll és III), Cr(lll), Cu(ll), Dy(lll), Tb(lll és IV), Ho(lll), Er(lll), Pr(lll), Eu(ll) és Eu(lll).

76. a 74. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a paramágneses fémion Gd(lll).

77. Az 56. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a módosított peptidet egy véghez kapcsolódó (capping) csoporttal reagáltatjuk, és így a véghez kapcsolódó csoport és módosított peptid linkercsoportja között kovalens kötést képezünk.

78. Tisztított peptid, amely az alábbi aminosav szekvenciából áll:

p* - Y* - XT - L* (SEQ ID. NO:1), ahol

P* jelentése prolin vagy nem természetes származéka;

Y* jelentése tirozin vagy nem természetes származéka;

XT jelentése G vagy D vagy nem természetes G vagy D származék;

L* jelentése leucin vagy nem természetes származéka; és ahol legalább P*, Y*, XT és L* egyike a megfelelő aminosav nem természetes származéka.

• · · · · ♦ · /< J. λ’^: ·.> ··}·

79. A 78. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol Kijelentése G vagy D, és ahol L* jelentése leucin.

80. A 79. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol P* prolin vagy 4-hidroxiprolin, és ahol Y* tirozin vagy a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm-, jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált, nem természetes tirozinszármazék.

81. Tisztított peptid, amely az alábbi aminosav szekvenciából áll:

_X1 - X₂-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X₅-X₆(SEQ ID. NO:2), ahol p* jelentése prolin vagy nem természetes származéka;

Y* jelentése tirozin vagy nem természetes származéka;

X! jelentése W, Y, F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*) vagy Y(3*), ahol F(3/4*) a 3-as vagy 4-es helyzetben az alábbi csoportok valamelyikével szubsztituált fenil-alanin: metil-, trifluor-metil-, amino-, metil-amino-, cianocsoport, fluor-, klór-, bróm-, jódatom, etil- vagy metoxicsoport, és ahol Y(3*) jelentése a 3-as helyzetben fluor-, klór-, brómvagy jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált tirozin;

x₂ jelentése E, H, dE, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr vagy Th;

X₃ jelentése G vagy D;

X₄ jelentése H, F, Y vagy W;

X₅ jelentése I, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nie, Tie, Nval, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4Pal vagy F(3/4*), ahol F(3/4*) jelentése a 3- vagy 4-es helyzetben trifluormetil-, etil-, izopropil- vagy metoxicsoporttal szubsztituált fenil-alanin;

χ₆ jelentése N, Q, I, L vagy V, vagy X₆ nincs jelen;

és ahol Xi, X2, X5, P* vagy Y* közül legalább az egyik egy nem természetes aminosav-származék.

82. A 81. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol P* prolin vagy 4-hidroxiprolin, és Y* tirozin vagy a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm-, jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált tirozin nem természetes származéka.

83. A 80. vagy 81. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid nem redukciós körülmények között diszulfid kötés képzésére alkalmas.

84. A 83. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid diszulfid kötést tar- talmaz.

85. A 84. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid a fibrinhez specifikus kötődési affinitást mutat.

_{e e} ♦· ·«··· ··«· /r^e . J. J

86. A 82. igénypont szerinti tisztított peptid, amely az alábbi aminosav szekvenciával rendelkezik:

W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO:4);

Y-dE-C-P(4-OH)-Y-(3-CI)-G-L-C-Y-l-Q (SEQ ID NO:5);

Y-dE-C-(P(4-0H)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO:6);

W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-l-Q (SEQ ID NO:7);

W-dE-C-P(4-0H)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO:8);

Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-Y-l-Q (SEQ ID N0:9);

Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 10);

W-dE-C-P(4-OH)-Y-(3-CI)-D-L-C-Y-l-Q (SEQ ID NO: 11);

F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-H-l-L (SEQ ID NO: 12);

Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO: 13);

W-dE-C-P-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO:14);

W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 15), és F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-H-l-L (SEQ ID NO: 16).

87. A 86. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid nem redukciós körülmények között diszulfid kötés képzésére alkalmas.

88. A 87. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid diszulfid kötésből áll.

89. A 86. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid a fibrinhez specifikus kötődési affinitást mutat.

90. A 81. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol

P* jelentése prolin;

Y* jelentése tirozin;

Xi jelentése W, Y,F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, DF, F(3/4*) és Y(3*), ahol F(3/4*) jelentése a 3-as vagy 4-es helyzetben az alábbi csoportok valamelyikével szubsztituált fenil-alanin: metil-, trifluor-metil-, amino-, metil-amino-, cianocsoport, fluor-, klór-, bróm-, jódatom, etil- vagy metoxicsoport, és ahol Y3* jelentése a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm-, jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált tirozin,

X₂ jelentése dE, H(Bzl), 2-Pal, Dpr vagy Th;

X₃ jelentése G vagy D;

X₄ jelentése H, F, Y vagy W;

/TO : \.''Ί \l· χ₅ jelentése I, L, V, Ν, Bpa, Bal, Hfe, Nie, Tie, nVal, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4Pal vagy F(3/4*), ahol F(3/4*) jelentése a 3-as vagy 4-es helyzetben trifluor_meti|_ etj|_ ízopropil- vagy metoxicsoporttal szubsztituált fenil-alanin, ahol Xi, X₂ vagy X₅ közül legalább az egyik nem természetes aminosav-származék;

és

X₆ jelentése N, Q, I, L vagy V, vagy X₆ nincs jelen.

91. A 90. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid nem redukciós körülmények között diszulfid kötés képzésére alkalmas.

92. A 90. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid diszulfid kötésből áll.

93. A 91. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid a fibrinhez specifikus kötődési affinitást mutat.

94. A 78. igénypont szerinti peptidből álló vegyület, amely trombolitikus szerhez kapcsolódik.

95. Tisztított peptid, amely a következő aminosav szekvenciából áll:

C - P* - Y* - Xi - L - C (SEQ ID NO:3), ahol

X₁ jelentése G vagy D;

P* jelentése prolin vagy nem természetes 4-hidroxi-prolin-származék,

Y* jelentése tirozin vagy a 3-as helyzetben fluor-, klór-, bróm- vagy jódatommal vagy nitrocsoporttal szubsztituált nem természetes tirozinszármazék;

és feltéve, hogy P* vagy Y* közül legalább az egyik a megfelelő aminosav nem természetes származéka.

96. A 95. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid nem reduktív körülmények között diszulfid kötés képzésére alkalmas.

97. A 95. igénypont szerinti tisztított peptid, amely diszulfid kötésből áll.

98. A 96. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid specifikus kötődési affinitást mutat a fibrinhez.

99. A 95. igénypont szerinti peptidet tartalmazó vegyület, amely trombolitikus szerrel kapcsolódik.

100. Tisztított peptid, amely az alábbi aminosav szekvenciából áll:

C-D-Y-Y-G-T-C-X10 (SEQ ID NO:17), ahol

X₁₀ jelentése n-(decil)G, n(4-PhBu)G, MeL, Bpa, Bip, Me-Bip, F(4*), F(3-Me), F(3, 4-difluor), Amh, Hfe, Y(3, 5-di-jód), Pff, 1 Nal, d1Nal vagy MeL, ahol F(4*) je-456lentése a 4-es helyzetben etil-, trifluor-metil-csoporttal, jódatommal vagy izopropilcsoporttal szubsztituált fenil-alanin.

101. A 100. igénypont szerinti tisztított peptid, amely az alábbi aminosav szekvenciából áll: C-D-Y-Y-G-T-C-Xw-Xn (SEQ ID. NO: 18), ahol

Xn jelentése D, dD, pD, Inp, Nip, Me-D, dC, Cop vagy Cmp.

102. A 101. igénypont szerinti tisztított peptid, amelynek aminosav szekvenciája a következő csoportból áll:

L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(decil)G-dD (SEQ ID. NO: 19);

L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(decil)-G-D (SEQ ID. N0:20);

L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D (SEQ ID. NO:21);

L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD (SEQ ID. NO:22);

L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-lnp (SEQ ID. NO:23);

L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp (SEQ ID. NO:24); és

L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D (SEQ ID. NO:25).

103. A 101. vagy 102. igénypont bármelyike szerinti tisztított peptid, ahol a peptid nem reduktív körülmények között diszulfid kötés képzésére alkalmas.

104. A 103. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid diszulfid kötést tartalmaz.

105. A 101. igénypont szerinti tisztított peptid, ahol a peptid a fibrinhez specifikus kötődési affinitást mutat.

106. A 101. igénypont szerinti pepiidből álló vegyület, amely trombolitikus szerhez kapcsolódik.

Epix Medical, Inc. helyett a meghatalmazott:

DANUBIA

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

KerényyHádit szabadalmi ügyvivő