HUP0303309A2 - Csökkentett immunogenitású módosított interferon-alfa - Google Patents
Csökkentett immunogenitású módosított interferon-alfa Download PDFInfo
- Publication number
- HUP0303309A2 HUP0303309A2 HU0303309A HUP0303309A HUP0303309A2 HU P0303309 A2 HUP0303309 A2 HU P0303309A2 HU 0303309 A HU0303309 A HU 0303309A HU P0303309 A HUP0303309 A HU P0303309A HU P0303309 A2 HUP0303309 A2 HU P0303309A2
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- molecule
- amino acid
- peptide
- sequence
- modified
- Prior art date
Links
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 title claims description 24
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 title abstract description 4
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 title abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 328
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 119
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 30
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 102100039350 Interferon alpha-7 Human genes 0.000 claims abstract 23
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 128
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 99
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 80
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 66
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 59
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims description 53
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 50
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 39
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 30
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 30
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 24
- 101000959794 Homo sapiens Interferon alpha-2 Proteins 0.000 claims description 22
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 claims description 20
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 claims description 19
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 17
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 12
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 claims description 12
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims description 10
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 claims description 10
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 10
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 8
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 6
- 102220560681 ATP-binding cassette sub-family C member 8_F27S_mutation Human genes 0.000 claims description 5
- 102220503597 FYVE, RhoGEF and PH domain-containing protein 1_F38E_mutation Human genes 0.000 claims description 5
- 102220553419 Ral guanine nucleotide dissociation stimulator-like 2_Y89E_mutation Human genes 0.000 claims description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 102220074246 rs180177268 Human genes 0.000 claims description 5
- 102200109205 rs200857997 Human genes 0.000 claims description 5
- 102220029460 rs398123552 Human genes 0.000 claims description 5
- 102220057632 rs730882042 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 claims description 3
- 102220602361 DAZ-associated protein 1_F84D_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 102220519967 Protein DEK_L66A_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims description 2
- 102200051510 rs121913152 Human genes 0.000 claims description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 15
- 241000282412 Homo Species 0.000 abstract description 11
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 80
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 77
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 66
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 56
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 43
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 43
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 29
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 28
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 26
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 22
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 19
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 19
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 12
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 11
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 11
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 10
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 8
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 7
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 7
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 6
- 239000000386 donor Substances 0.000 description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 4
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 4
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 3
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 3
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 3
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 3
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 101000738180 Euglena gracilis Chaperonin CPN60, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 238000002884 conformational search Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 2
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000012571 GlutaMAX medium Substances 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 102100029966 HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Human genes 0.000 description 1
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101000864089 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000930802 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000968032 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 3 chain Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000007438 Interferon alpha-beta Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010086140 Interferon alpha-beta Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 101100117565 Oryza sativa subsp. japonica DRB4 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001754 blood buffy coat Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000000852 hydrogen donor Substances 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 238000000324 molecular mechanic Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000012956 testing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát különösen embereknek beadandó, és különösenterápiás alkalmazású polipeptidek képezik. A polipeptidek módosítottpolipeptidek, amelyekben a módosítás a polipeptid csökkentett hajlamáteredményezi immunválasz kiváltására emberi személynek történő beadásesetén. A találmány tárgya különösen humán interferon-alfa, ésspecifikusan interferon-alfa-2 (INFa2) módosítása, olyan fehérjéketeredményezve, amelyek lényegében nem immunogének, vagy kevésbéimmunogének, mint bármilyen módosítatlan társuk, amikor in vivo vanalkalmazva. Ó
Description
P03 03309
Csökkent immunogenitású módosított interferon-alfa
A találmány tárgyát különösen embereknek beadandó, és különösen terápiás alkalmazású polipeptidek képezik. A polipeptidek módosított polipeptidek, amelyekben a módosítás a 5 polipeptid csökkentett hajlamát eredményezi immunválasz kiváltására emberi személynek történő beadás esetén. A találmány tárgya különösen humán interferon, és specifikusan humán interferon-alfa-2 (INFa2) módosítása, olyan INFa2 fehérjevariánsokat eredményezve, amelyek lényegében nem immunogének, vagy kevésbé immunogének, mint bármilyen módosítatlan társuk, amikor in vivo beadjuk azokat. A találmány tárgyát képezik továbbá T-sejt-epitóp pepti10 dek, amelyek a nem módosított fehérjéből származnak, amelyek révén lehetséges csökkentett immunogenitású módosított INFa2-variánsok létrehozása.
Számos olyan eset van, amelyben a terápiás fehérje hatásossága korlátozott a terápiás fehérjére adott nemkívánatos immunválasz miatt. Több egér monoklonális ellenanyag ígéretes terápiának mutatkozott számos humán betegség esetében, de bizonyos esetekben nem váltak 15 be a szignifikáns mértékű humán anti-egér ellenanyag (HAMA) válasz kiváltása miatt [Schroff, R.W. és mtsai. Cancer Res. 45, 879-885. old. (1985); Shawler, D. L. és mtsai., J. Immunol. 135, 1530-1535. old. (1985)]. Monoklonális ellenanyagok esetében többféle módszert kidolgoztak a HAMA-válasz csökkentésének megkísérlésére (WO 89/09622. számú nemzetközi közzétételi irat; EP 0 239 400. számú európai szabadalmi irat; EP 0 438 310. számú európai 20 szabadalmi irat; WO 91/06667. számú nemzetközi közzétételi irat). Ezek a rekombináns megközelítési módok általában csökkentették az egér-eredetű genetikai információt a végső ellenanyag-szerkezetben, miközben növelték a humán-eredetű genetikai információt a végső ellenanyag-szerkezetben. Mindazonáltal a kapott „humanizált” ellenanyagok számos esetben még mindig immunválaszt váltottak ki páciensekben [Issacs, J. D., Sem. Immunoi. 2, 449-456. old.
(1990); Rebello, P. R. és mtsai., Transplantation 68, 1417-1420. old. (1999)].
Az ellenanyagok nem a terápiás ágensként beadott polipeptid-molekulák egyetlen olyan osztálya, amely ellen immunválasz jöhet létre. Még a humán eredetű fehérjék és az emberekben előfordulókkal azonos aminosav-szekvenciájú fehérjék is képesek immunválasz kiváltására emberekben. A figyelemreméltó példák közé tartozik többek között a granulocita-makrofág koló30 niastimuláló faktor [Wadhwa, M. és mtsai. Clin. Cancer Res. 5, 1353-1361. old. (1999)] és INFa2 [Russo, D. és mtsai. Bri. J. Haem. 94, 300-305. old. (1996); Stein, R. és mtsai., New Engl. J. Med. 318, 1409-1413. old. (1988)].
-2r
Egy fő faktor az immunválasz indukálásában olyan peptidek jelenléte a fehérjében, amelyek képesek stimulálni T-sejtek aktivitását II. osztályba tartozó MHC molekulákon történő prezentálódás útján, ezek az úgynevezett „T-sejt-epitópok”. Az ilyen potenciális T-sejtepitópokat általában olyan aminosav-szekvenciaként definiáljuk, amely képes kötődni II. osz5 tályba tartozó MHC molekulákhoz. Az ilyen T-sejt-epitópok mérhetők az MHC-kötés megállapítására. A „T-sejt-epitóp” kifejezés alatt implicite olyan epitópot értünk, amely amikor kötődik MHC-molekulához, akkor felismerhető a T-sejt-receptor (TCR) által, és amely — legalábbis elvileg — ezeknek a T-sejteknek az aktiválódását okozhatja a TCR-hez való kötődéssel elősegítve a T-sejtes választ. Azonban többnyire nyilvánvaló, hogy bizonyos peptidek, ame10 lyekről azt találjuk, hogy kötődnek II. osztályba tartozó MHC molekulákhoz, benne maradhatnak egy fehérjeszekvenciában, mivel az ilyen peptideket „sajátnak” ismeri fel azon organizmusnak az immunrendszere, amelybe a végső fehérjét beadjuk.
Ismert, hogy ezen T-sejt-epitópok némelyike felszabadulhatnak a peptidek, polipeptidek vagy fehérjék degradációja folyamán a sejteken belül, és azt követően prezentálódhatnak a 15 fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) molekulái által, és ily módon a T-sejtek aktiválódását válthatják ki. A II. osztályba tartozó MHC molekulák által prezentált peptidek esetében a Tsejtek ilyen aktiválódása például ellenanyag-választ eredményezhet az ilyen ellenanyagokat termelő Β-sejtek közvetlen stimulációja miatt.
A II. osztályba tartozó MHC molekulák erősen polimorf fehérjék csoportját alkotják, 20 amelyek központi szerepet játszanak a segítő T-sejtek szelekciójában és aktiválásában. A humán leukocita antigén DR csoportja (HLA-DR) a fehérjék ezen csoportjának az uralkodó izotípusa, és a találmány fő célpontja. Azonban a HLA-DQ és HLA-DP izotípusok hasonló funkciót látnak el, ekképpen a találmány ugyanolyan módon alkalmazható ezek vonatkozásában is. A II. osztályba tartozó MHC DR molekulák egy alfa és béta láncból állnak, amelyek a 25 C-terminálisaikon keresztül a membránba inzertálódnak. Mindegyik heterodimer tartalmaz egy ligandumkötő domént, amely 9 és 20 közötti hosszúságú peptideket köt meg, habár a kötőárokban maximálisan 11 aminosav fér el. A ligandumkötő dómén az a lánc 1-85. aminosavaiból és a β lánc 1-94. aminosavaiból áll. A DQ molekulákról napjainkban kimutatták, hogy homológ a szerkezetük, és a DP családba tartózó fehérjék esetében is nagyon hasonló várható. Az embe30 rekben a DR izotípusnak megközelítőleg 70 különböző ismert allotípusa van, a DQ esetében 30 különböző allotípus van, és a DP esetében 47 különböző allotípus ismert. Minden egyénben 2-4 DR alléi, kettő DQ és kettő DP alléi található. Számos DR-molekula szerkezetét meghatározták, és ezek a szerkezetek arra mutatnak, hogy egy nyitott végű peptidkötő árok van jelen
-3 több hidrofób zsebbel, amelyek kölcsönhatásba lépnek a peptid hidrofób oldalláncaival (zsebbe illő oldalláncok) [Brown és mtsai., Nature 364, 33. old. (1993); Stern és mtsai., Nature 368, 215. old. (1994)].
A II. osztályba tartozó molekulák allotípusait jellemző polimorfizmusok hozzájárulnak a peptidkötő árokban a peptidkötő felszínek széleskörű változatosságához, és populációs szinten biztosítják a maximális flexibilitást az idegen fehérjék felismerésére való képesség és patogén organizmusok elleni immunválasz kialakításának tekintetében. Jelentős mértékű polimorfizmus van különböző „családokkal” a ligandumkötő doménen belül a különböző geográfiai populációkban és etnikai csoportokban. Ez a polimorfizmus befolyásolja a peptidkötő dómén kötési tulajdonságait, ily módon a DR-molekulák különböző „családjai” különböző szekvenciájú peptidekre lehetnek specifikusak, habár ezek bizonyos mértékben átfedhetnek. Ez a specifitás meghatározza a Th-sejt-epitópok felismerését (II. osztályú T-sejtes válasz), amely végső soron felelős az ugyanazon a fehérjén jelenlévő B-sejt-epitópok elleni ellenanyag-válasz irányításáért, amelyből a Th-sejt-epitóp származik. Ily módon egy adott egyénben a fehérje elleni immunválaszt erősen befolyásolja a T-sejt-epitóp felismerése, amely ezen egyén HLA-DR allotípusa peptidkötő specifitásának a függvénye. Tehát annak érdekében, hogy T-sejtepitópokat azonosítsunk egy pepiidben vagy fehérjében a globális populációt figyelembe véve, kívánatos figyelembe venni HLA-DR allotípusok annyira szerteágazó készletének a kötési tulajdonságait, amennyire csak lehetséges, ily módon lefedve a világ populációjának a lehető legnagyobb részét.
Egy terápiás fehérje, mint például a találmány célját képező fehérje elleni immunválasz a II. osztályba tartozó MHC molekulák általi prezentációs útvonalon keresztül zajlik. Ebben az esetben az exogén fehérjék beburkolódnak és feldolgozódnak a DR, DQ vagy DP típusú, II. osztályba tartozó MHC molekulákon való prezentálás végett. A II. osztályba tartozó MHC molekulákat professzionális antigénprezentáló sejtek (APC) expresszálják, mint például többek között makrofágok és dendrikus sejtek. A II. osztályba tartozó MHC molekula és a peptid komplexének a kötődése a T-sejt felszínén hozzá tartozó T-sejt-receptorhoz — együtt bizonyos koreceptorok, mint például a CD4-molekula keresztkötésével — a T-sejt aktivált állapotát válthatja ki. Az aktiválódás citokinek felszabadulását eredményezi, ami tovább aktivál más limfocitákat, mint például B-sejteket, amelyek ellenanyagokat termelnek, vagy ölő T-sejtekeket aktiválnak a teljes sejtes immunválaszhoz. Egy peptid képessége egy adott II. osztályba tartozó MHC molekulához való kötődésre prezentálás végett az APC felszínén számos tényezőtől függ, legfontosabb ezek közül az elsődleges szerkezete. Ez befolyásolhatja a hajlamosságát
-4proteolitikus hesítás iránt, és az affinitását is a II. osztályba tartozó MHC molekula peptidkötő hasadékában való megkötődésre. A II. osztályba tartozó MHC molekula/peptid komplex az APC felszínén kötési felületet alkot egy adott T-sejt-receptor (TCR) számára, amely képes determinánsokat felismerni, amelyeket a pepiid oldalláncai és a II. osztályba tartozó MHC molekula biztosítanak.
A szakterületen vannak eljárások II. osztályba tartozó MHC molekulákhoz kötődni képes szintetikus peptidek azonosítására (például WO 98/52976. és WO 00/34317. számú nemzetközi közzétételi iratok). Ilyen peptidek nem feltétlenül szolgálnak T-sejt-epitópként minden helyzetben, különösen in vivo, a feldolgozási útvonalak és egyéb jelenségek miatt. A T-sejtepitópok azonosítása az első lépés az epitópok megszűntetésében. Potenciális T-sejt-epitópok azonosítására és fehérjékből történő eltávolítására szolgáló eljárásokat korábban feltártak. A szakterületen feltártak eljárásokat T-sejt-epitópok detektálásának lehetővé tételére, általában számítástechnikai módszerekkel, felismert szekvencia-motívumok jelenlétére történő vizsgálattal kísérletesen meghatározott T-sejt-epitópokban, vagy más megoldásképpen számítástechnikai módszerek alkalmazásával a II. osztályba tartozó MHC molekulákhoz kötődő peptidek, és különösen DR-hez kötődő peptidek megjóslására.
A WO 98/52976. és WO 00/34317. számú nemzetközi közzétételi iratok számítástechnikai felfuzési megközelítési módokról adnak kitanítást olyan polipeptid-szekvenciák azonosítására, amelyek potenciálisan kötődhetnek humán II. osztályba tartozó MHC molekulák DR allotípusainak egy alhalmazához. Ezekben a kitanításokban a megjósolt T-sejt-epitópokat megfontolt aminosav-szubsztitúciók alkalmazásával távolítják el a nem-humán vagy humán eredetű terápiás ellenanyag vagy nem-ellenanyag fehérje elsődleges szekvenciájából.
Rekombináns MHC molekulák és emberből vagy kísérleti állatból származó perifériás vérmintákból előállított T-sejt-klónokhoz kötődni képes szintetikus peptidek oldható komplexeit alkalmazó más módszereket is alkalmaztak a szakterületen [Kern, F. és mtsai., Nature Medicine 4, 975-978. old. (1998); Kwok, W. W. és mtsai., TRENDS in Immunology 22, 583588. old. (2001)], és ezek alkalmazhatók epitópok azonosítására szolgáló stratégiában.
Amint fent ismertettük — és annak következtében — kívánatos lenne azonosítani, és eltávolítani vagy legalább csökkenteni a T-sejt-epitópokat egy adott alapvető, terápiásán értékes, de eredetileg immunogén peptidből, polipeptidből vagy fehérjéből.
Ezen terápiásán értékes molekulák egyike az INFa2. A molekula egy fontos glikoprotein citokin, amelyet aktivált makrofágok expresszálnak. A fehérjének vírusellenes aktivitása van, és stimulálja legalább két enzim termelését, egy proteinkinázét és egy oligoadenilát-szintetázét,
- 5 az expresszáló sejteken található interferon-alfa-receptorhoz való kötődés hatására. Az érett INFa2 fehérje egyetlen, 165 aminosav hosszúságú polipeptid, amely egy 188 aminosav hosszúságú prekurzor fehéije poszttranszlációs feldolgozásával keletkezik, egy 23 aminosav hosszúságú szignálszekvenciának az amino-terminálisról történő lehasításával. A humán INFa2-nek számos különböző altípusa ismert, amelyek kisebb eltéréseket mutatnak az elsődleges aminosav-szekvenciájuk között. Ily módon az INFa2a és INFa2b csak egyetlen oldalláncban különbözik az érett fehérjelánc 23. pozícióban, amely lizin az INFa2a-ban és arginin az INFa2b-ben. Míg a találmány szerinti kitanítás az INFa2b szekvenciájára vonatkozik, nyilvánvaló, hogy minden gyakorlati célra az INFa2a szekvenciáját is felcserélhető módon figyelembe vehetjük a találmány szerinti INFa2b altípus helyett. Az INFa2(a,b) aminosav-szekvenciája (egybetűs kóddal ábrázolva) a következő:
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMR(R,K)ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAE TIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPL MKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE
A fehérje számottevő klinikai fontosságú, mint széles spektrumú antivirális, antiproliferatív és immunmodulációs ágens. Az INFa2 rekombináns és másféle készítményeit terápiásán alkalmazták különféle rákos és virális indikációk esetén emberben [összefoglalva: Sen, G. G. és Lengyel P,J. Biol. Chem. 267, 5017-5020. old. (1992)]. Azonban — a sok páciens esetében nagyon jelentős terápiás hatások ellenére — bizonyos páciensekben a terápia elleni rezisztenciáról számoltak be, és kimutatták, hogy a rezisztencia egyik mechanizmusa a kezelt páciensek szérumában detektálható semlegesítő ellenanyagok termelődése [Quesada, J. R. és mtsai., J. Clin. Oncology 3, 1522-1528. old. (1985); Stein, R. G. és mtsai. (1988), mint fent; Russo, D. és mtsai. (1996), mint fent; Brooks, M. G. és mtsai., Gut 30, 1116-1122. old. (1989)]. Ezekben a páciensekben immunválasz alakul ki a terápiás interferon ellen, annak a ténynek az ellenére, hogy egy, legalábbis az elsődleges szekvenciájában azonos molekula termelődik endogén módon az emberben.
Mások feltártak módosított INFa2a-t és eljárásokat annak alkalmazására (4 496 537. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; 5 972 331. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; 5 480 640. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; 5 190751. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; 4959210. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat), de ezek a megközelítési módok az INFa2a kereskedelmi
-6előállításának a javítására irányultak. Az ilyen kitanítások nem ismerik fel a T-sejt-epitópok fontosságát a fehérje immunogén tulajdonságai szempontjából, és nem úgy lettek megalkotva, hogy közvetlenül befolyásolják ezeket a tulajdonságokat specifikus és szabályozott módon a találmány szerinti séma alapján.
Azonban továbbra is szükség van javított tulajdonságú INFa2a analógokra. A kívánatos javítások közé tartoznak alternatív sémák és módozatok a terápiás szer expresszáltatására és tisztítására, de — és különösen — a fehérje biológiai tulajdonságainak a javítására. Különösen igény van az in vivo tulajdonságok javítására, amikor humán alanynak beadjuk. Ebben a vonatkozásban nagyon kívánatos olyan INFa2a biztosítása, amelyeknek csökkentett, vagy hi10 ányzik a képessége immunválasz kiváltására humán alanyban.
A találmány tárgyát humán interferon-α, specifikusan az interferon-a2 altípus — amelyet a leírásban „INFa2”-nek nevezünk — módosított formái képezik, amelyekben az immunológiai tulajdonságok módosítottak, a potenciális T-sejt-epitópok csökkentett vagy megszűntetett száma révén.
A találmány tárgyát az INFa2 elsődleges szekvenciájában azonosított olyan szekvenciák képezik, amelyek potenciális T-sejt-epitópok a II. osztályba tartozó MHC molekulákhoz való kötődésük miatt. Ez a kitanítás specifikusan a 165 aminosav-oldallánc hosszúságú humán INFa2 fehérjére vonatkozik.
A találmány tárgyát képezik specifikus pozíciók is a molekula elsődleges szekvenciájá20 ban, amelyek a találmány szerint módosíthatók specifikus aminosav szubsztitúciók, addíciók vagy deléciók útján anélkül, hogy lényegesen befolyásolnánk a biológiai aktivitást. Olyan esetekben, amikor az immunogenitás elvesztését csak a biológiai aktivitás egyidejű elvesztésével érhetjük el, az aktivitást helyre lehet állítani a fehérje szekvenciájának további változtatásaival.
A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások ilyen módosított molekulák előállítására, 25 és mindenekfelett eljárások az olyan T-sejt-epitópok azonosítására, amelyek megváltoztatandók az immunogén helyek csökkentése vagy eltávolítása érdekében.
A találmány szerinti fehérjétől azt várnánk, hogy fokozott keringési időt mutat a humán alanyban, és különösen hasznos lenne krónikus és ismétlődő betegségek esetében, mint például ami a helyzet az INFa2 számos indikációja esetében. A találmány tárgyát INFa2 fehérjék mó30 dosított formái képezik, amelyek várhatóan javított in vivo tulajdonságokat mutatnak. Ezek a módosított INFa2 molekulák alkalmazhatók gyógyászati készítményekben.
Összefoglalva, a találmány tárgyát képezik az alábbiak:
• humán interferon-alfa-2 (INFa2) biológiai aktivitásával rendelkező módosított molekula, amely lényegében nem immunogén, vagy kevésbé immunogén, mint bármilyen más módosítatlan molekula, amelynek lényegében ugyanolyan az aktivitása, amikor in vivo van alkalmazva;
• egy megfelelő molekula, amelyben az immunogenitás elvesztését az eredeti módosítatlan molekulából származó egy vagy több T-sejt-epitóp, előnyösen egy T-sejtepitóp eltávolításával és/vagy azon MHC allotípusok számának a csökkentésével érjük el, amelyek képesek kötődni a molekulából származó peptidekhez;
• egy megfelelő molekula, amelyben az eredetileg jelen lévő T-sejt-epitópok II. osztályba tartozó MHC molekula ligandumjai, vagy olyan peptidszekvenciák, amelyek képesek stimulálni vagy kötni T-sejteket II. osztályba tartozó molekulákon keresztül;
• egy megfelelő molekula, amelyben a ligandumok vagy peptidszekvenciák 13tagú vagy 15- tagú peptidek;
• egy megfelelő molekula, amelynek a peptidszekvenciái az 1. ábrán bemutatottak közül vannak kiválasztva;
• egy megfelelő molekula, amelyben 1-9 aminosav-oldallánc, előnyösen egy oldallánc van módosítva bármelyik eredetileg jelen lévő T-sejt-epitópban;
• egy megfelelő molekula, amelyben az aminosav-oldalláncok megváltoztatását az eredetileg jelen lévő aminosav-oldalláncoknak a megfelelő pozícióban található más aminosav-oldalláncokkal történő szubsztitúciójával, deléciójával vagy addíciójával, előnyösen szubsztitúciójával végezzük;
• egy megfelelő molekula, amelyben egy vagy több aminosav-oldallánc szubsztitúcióját a 2. ábrán bemutatott módon végezzük el, és ezenfelül adott esetben egy vagy több aminosav-oldallánc szubsztitúcióját a 3. ábrán bemutatott módon végezzük el azon MHC allotípusok számának a csökkentésére, amelyek képesek kötődni a molekulából származó peptidekhez;
• egy megfelelő molekula, amelyben további, szubsztitúcióval, delécióval vagy addícióval végrehajtott módosításokat is végzünk a molekula biológiai aktivitásának a helyreállítására;
• egy megfelelő módosított molekula, amelyben az aminosav-megváltoztatást homológ fehérjeszekvenciára és/vagy in silico modellezési módszerekre vonatkoztatva végezzük;
• humán interferon-alfa-2 (INFa2) biológiai aktivitásával rendelkező módosított molekula, amely lényegében nem immunogén, vagy kevésbé immunogén, mint bármilyen más módosítatlan molekula, amelynek lényegében ugyanolyan az aktivitása, amikor in vivo alkalmazzuk, amely az elsődleges szekvencia egy vagy több aminosavának a megváltoztatásával állítható elő az alábbiak szerint: (i) eltávolítunk egy vagy több, az eredeti módosítatlan molekulából származó T-sejt-epitópot, amely II. osztályba tartozó MHC molekula ligandumja, vagy olyan peptidszekvencia, amely képes T-sejtek stímulálására és kötésére II. osztályba tartozó MHC molekulán történő prezentáción keresztül, és/vagy (ii) csökkentjük azon MHC allotípusok számát, amelyek képesek kötődni a molekulából származó peptidekhez, ahol a módosított molekula olyan változtatásokat tartalmaz, amelyek a vad típusú INFa2 elsődleges szekvenciájának alábbi, összefüggő aminosav-oldallánc-szakaszain belüli egy vagy több pozícióban vannak:
(a) ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLH (RÍ), (b) FNLFSTKDSSAAWDE (R2), (c) KEDSILAVRKYFQRITLY (R3);
• egy megfelelő molekula, amelyben a változtatás 1-9 amino sav-oldallánc szubsztitúciója;
• egy megfelelő molekula, amelyben a szubsztitúció az RI, R2 és R3, előnyösen az R2 és R3, legelőnyösebben az R3 szakaszok egy vagy több aminosavoldalláncánál van végrehajtva;
• egy megfelelő molekula, amelyben további egy vagy több, az RI, R2 vagy R3 szakaszokon kívül eső aminosav-oldallánc szubsztitúciója is végre van hajtva;
• egy megfelelő molekula, amely a vad típusú molekula egy vagy több alábbi pozíciójában végzett aminosav-oldallánc szubsztitúciót tartalmaz: 24., 26., 27., 38., 55., 63., 64., 66., 67., 76., 84., 85., 89., 103., 110., 111., 116., 117., 119., 122., 123., 126., 128., 129., 130., 153., előnyösen egy vagy több alábbi pozícióban: 26., 27., 38., 63., 85., 89., 103., 110., 111., 116., 117., 122., 123., 126., 128., 153., előnyösebben: 103., 110., 111., 116., 117., 122., 123., 126., 128., 153.;
• egy előnyös megvalósítási mód szerint az elvégzett szubsztitúció az alábbiak bármelyike: 26., 27., 38., és ezenfelül egy vagy több pozíció az alábbiak közül: 103., 110., 111., 116., 117., 122., 123., 126., 128., 153., vagy más megoldásképpen egy vagy több az alábbiak közül: 63., 85., 89. és 103., 110., 111., 116., 117., 122., 123., 126., 128., 153.;
• egy megfelelő molekula, amelyben a szubsztitúció a 4. ábrán bemutatott egy vagy több pozícióban van végrehajtva;
• egy megfelelő molekula, amelyben a szubsztitúció az alábbi pozíciókban van: L26P, F27S, F38E és/vagy I63T, Y85S, Y89D, Y89E, Y89N és/vagy V103E, L110G, M111T, M111S, M111E, I116S, I116Q, L117G, L117A, Y122E, Y122Q, F123H, I126A, L128A, L153S;
• egy megfelelő előnyös molekula, amelyben a szubsztitúció az alábbi pozíciókban van: L26P, F27S, F38E és/vagy I63T, Y85S, Y89D, Y89E, Y89N és/vagy V103E, L110G, M111T, Ml 1 IS, Ml 1 IE, Il 16S, I116Q,L117G, L117A;
• humán interferon-alfa-2 (INFa2) biológiai aktivitásával rendelkező módosított molekula, amely lényegében nem immunogén, vagy kevésbé immunogén, mint bármilyen más módosítatlan molekula, amelynek lényegében ugyanolyan az aktivitása, amikor in vivo alkalmazzuk, amely az elsődleges szekvencia egy vagy több aminosavának a szubsztitúciójával állítható elő az alábbiak szerint: (i) eltávolítunk egy vagy több, az eredeti módosítatlan molekulából származó T-sejt-epitópot, amely II. osztályba tartozó MHC molekula ligandumja, vagy olyan peptidszekvencia, amely képes T-sejtek stimulálására és kötésére II. osztályba tartozó MHC molekulán történő prezentáción keresztül, és/vagy (ii) csökkentjük azon MHC allotípusok számát, amelyek képesek kötődni a molekulából származó peptidekhez, ahol a szubsztitúció a vad típusú INFa2a vagy INFa2b molekula alábbi egy vagy több pozíciójában van:
(i) I24P, L26P, F27S, F38E, V55A, (ii) I63T, L66A, F67D, F67E, W76H, F84D, F84E, Y85S, Y89D, Y89E, Y89N, (iii) bármely pozíció az R3 szekvenciában;
• egy megfelelő molekula, amelyben egy vagy több alábbi szubsztitúció van az R3 szekvenciában: V103E, L110G, LUOS, M111T, M111S, M11IE, II16S, I116Q, L117G, L117A, V119A, Y122Q, Y122E, Y122H, F123H, I126A, L128A, Y129N, L130G, L130, L153S, előnyösen Y122E, Y122Q, F123H, I126A, L128A, és amely adott
- 10esetben további aminosav-oldalláncok megváltoztatását, előnyösen szubsztitúcióját tartalmazza, amelyek tovább csökkentett immunogenitáshoz vezetnek;
• Egy csökkentett immunogenitású módosított humán intereferon-alfa-2 (INFa2) szekvenciája a következő:
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX°ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQ KAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQG VGVTETPLMKEDS1LAVRKX!X2QRX3TX4YLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFS LSTNLQESLRSKE, ahol
X° jelentése R, K ;
X1 jelentése Y, E, Q;
X2 jelentése F, H;
X3 jelentése I, A; és
X4 jelentése L, A;
és az az eset ki van zárva, amikor egyidejűleg X1 = Y, X2 = F, X3 = I és X4 = L (ez a szekvencia megfelel a vad típusú INFa2 szekvenciájának);
• Egy csökkentett immunogenitású módosított humán intereferon-alfa-2 (INFa2) szekvenciája a következő:
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX°ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETI PVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPX1 x2kedsx3x4avrkx5x6qrx7tx8ylkekkyspcawewraeimrsfsx9stnlqeslrs KE, ahol
X° jelentése R, K ;
X1 jelentése L, S, G,
X2 jelentése Μ, T, S, E,
X3 jelentése I, S, Q,
X4 jelentése L, G,
Xs jelentése Y, E, Q;
X6 jelentése F, H;
X7 jelentése I, A;
X8 jelentése L, A; és
- 11 X9 jelentése L, S és az az eset kivan zárva, amikor egyidejűleg X1 = L, X2 = Μ, X3 = I, X4 = L, X5 = Y, X6 = F, X7 = I, X8 = L és X9 = L;
• Egy csökkentett immunogenitású módosított humán intereferon-aífa-2 (INFa2) szekvenciája a következő:
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX°ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETI PVLHEMIQQX1X2NX3X4STKDSSAAX5DETLLDKX6X7TELX8QQLNDLEACVIQGVGVT ETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE 3 ahol
X° jelentése R, K ;
X1 jelentése I, T;
X2 jelentése F, D, A;
X3 jelentése L, A;
X4 jelentése F, D, E;
Xs jelentése W, H;
X6 jelentése F, D, E;
X7 jelentése Y, S; és
X8 jelentése Y, D, E, N;
és az az eset ki van zárva, amikor egyidejűleg X1 = I, X2 = F, X3 = L, X4 = F, X5 = W, X6 = F, X7 = YésX8=Y;
• Egy csökkentett immunogenitású módosított humán intereferon-alfa-2 (INFa2) szekvenciája a következő:
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX°ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETI PVLHEMIQQX1FNLFSTKDSSAAWDETLLDKFX2TELX3QQLNDLEACVIQGVGVTETP LMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE, ahol
X° jelentése R, K;
X1 jelentése I, T;
X2 jelentése Y, S; és
X3 jelentése Y, D, E, N;
és az az eset ki van zárva, amikor egyidejűleg X1 = I, X2 = Y és X3 = Y;
• Egy csökkentett immunogemtású módosított humán intereferon-alfa-2 (INFa2) szekvenciája a következő:
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX°ISX1X2SCLKDRHDFGX3PQEEFGNQFQKAE TIPX4LHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETP LMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE, ahol
X° jelentése R, K;
X1 jelentése L, P,
X2 jelentése F, S;
X3 jelentése F, E; és
X4 jelentése V, A;
és az az eset ki van zárva, amikor egyidejűleg X1 = L, X2 = F, X3 = F és X4 = V; meg kell jegyeznünk, hogy a fenti képletekben megadott mindegyik kizárás vonatkozik — és magában foglalja — az INFa2 összes deimmunizált változatára, amely ismert a szakterületen;
• megfelelő módosított INFa2 szekvenciák, amelyekben további szubsztitúciók vannak, különösen az igénypontokban ismertetett kombinációkban;
• egy megfelelően módosított INFa2 szekvencia, amelyben további szubsztitúciók vannak, előnyösen az RÍ és/vagy R2 és/vagy R3 részleges szekvenciák egy vagy több pozíciójában (ahol RÍ, R2, R3 jelentése a fent definiált);
• DNS-szekvencia, amely fent és lent definiált módosított INFa2-t kódol;
• gyógyászati készítmény, amely INFa2 biológiai aktivitásával rendelkező, fent definiált módosított molekulát tartalmaz, adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóval, oldószerrel vagy kötőszerrel együtt;
• eljárás INFa2 biológiai aktivitásával rendelkező, fent definiált módosított molekula gyártására, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: (i) meghatározzuk a polipeptid aminosav-szekvenciáját vagy annak egy részét, (ii) azonosítunk egy vagy több potenciális T-sejt-epitópot a fehérje aminosav-szekvenciájában bármilyen módszer alkalmazásával, beleértve az MHC-molekulákhoz kötődő peptidek meghatározását in vitro vagy in silico módszerek vagy biológiai vizsgálati eljárások alkalmazásával (iii) új szekvenciavariánsokat tervezünk, amelyekben egy vagy több aminosav az azonosított potenciális Tsejt-epitópokban módosítva van oly módon, hogy lényegesen csökkentjük vagy megszűntetjük a T-sejt-epitóp aktivitását, amit a peptideknek MHC-molekulákhoz való kötő
- 13 désével határozunk meg in vitro vagy in silico módszerekkel vagy biológiai vizsgálati eljárásokkal, vagy peptid-MHC komplexek T-sejtekhez történő kötődésével;iv) ilyen szekvencia-variánsokat állítunk elő rekombináns DNS módszerekkel, és teszteljük a variánsokat annak érdekében, hogy egy vagy több kívánt tulajdonságú variánst azonosítsunk, és (v) adott esetben megismételjük a (ii)- (iv) lépéseket;
• egy megfelelő eljárás, amely szerint a (iii) lépést 1-9 aminosav-oldallánc szubsztitúciójával, addíciójával vagy deléciójával hajtjuk végre az eredetileg jelen lévő Tsejt-epitópok bármelyikében egy homológ fehérjeszekvenciára vagy in silico modellezési módszerekre vonatkoztatva;
• egy megfelelő eljárás, amely szerint a (ii) lépést az alábbi lépések szerint hajtjuk végre: (a) kiválasztjuk a peptid egy ismert aminosav-szekvenciájú régióját; (b) egymás után megvizsgálunk a kiválasztott régióból származó, előre meghatározott egyforma méretű és legalább három aminosav-oldalláncból álló átfedő aminosav-szegmenseket; (c) kiszámítjuk minden egyes vizsgált szegmens esetében a II. osztályba tartozó MHC molekula kötési pontszámát a vizsgált aminosav-oldallánc szegmensben található mindegyik hidrofób aminosav-oldallánchoz hozzárendelt értékének összeadásával; és (d) azonosítjuk a szegmensek legalább egyikét, mint módosításra megfelelőt, az adott szegmensre kiszámított, II. osztályba tartozó MHC molekula kötési pontszám alapján, hogy megváltoztassuk a peptid általános II. osztályba tartozó MHC molekula kötési pontszámát, anélkül, hogy lényegesen csökkentenénk a peptid terápiás alkalmazhatóságát;
• egy megfelelő eljárás, amelyben a (c) lépést olyan módosított Böhm féle pontszám-előállító függvény alkalmazásával hajtjuk végre, amelyet úgy módosítottunk, hogy tartalmazzon 12-6 van dér Waals ligandum-fehérje taszító energia kifejezést és ligandum konformációs energia kifejezést az alábbiak szerint: (1) biztosítjuk II. osztályba tartozó MHC molekulamodellek egy első adatbázisát; (2) biztosítunk egy második adatbázist, a II. osztályba tartozó MHC molekulamodellek megengedett peptidvázaira; (3) kiválasztunk egy modellt az első adatbázisból; (4) kiválasztunk egy megengedett peptidvázat a második adatbázisból; (5) azonosítunk olyan aminosav-oldalláncokat, amelyek mindegyik vizsgált szegmensben megtalálhatók; (6) meghatározzuk az egyes vizsgált szegmensekben megtalálható összes oldallánc kötési affinitás! pontszámát; és megismételjük az (1)-(5) lépéseket mindegyik modellre és mindegyik peptidvázra;
• peptidmolekula, amely egy T-sejt-epitóp, 13 összefüggő aminosav-oldalláncból áll és potenciálisan II. osztályba tartozó MHC molekulát kötő aktivitása van, és amely nem módosított INFa2 elsődleges szekvenciájából van létrehozva, és amely peptidmolekula az 1. és a 6a-6c. ábrák bármelyikén bemutatottak bármelyike;
• 15, előnyösen legalább 9 összefüggő aminosav-oldalláncból álló peptidmole- kula, amely potenciálisan II. osztályba tartozó MHC molekulát kötő aktivitással rendelkezik, és amely nem módosított INFa2 elsődleges szekvenciájából van létrehozva, és amely peptidmolekula az RÍ, R2, R3 részleges szekvenciák vagy a 7. ábrán bemutatottak bármelyike;
• peptidmolekula, amely 9-15 összefüggő aminosav-oldalláncból áll, potenciálisan II. osztályba tartozó MHC molekulát kötő aktivitással rendelkezik és nem módosított INFa2 elsődleges szekvenciájából van létrehozva, és a molekula stimulációs indexe legalább 1,8, előnyösen 1,8-2, előnyösebben >2 sejtproliferáció biológiai vizsgálati eljárásában, ahol az indexet a sejtproliferáció értékelésével állapítjuk meg pepiiddel történő stimuláció után, és elosztjuk a peptidet nem kapott kontroll sejtek sejtroliferációjának az értékével, és a sejtproliferációt bármilyen, szokásos eljárásokkal végrehajtott módon méljük, amelyeket részletesebben is ismertetünk a példákban;
• egy megfelelő peptidmolekula, amely ilyen stimulációs indexszel rendelkezik, és amely a 6. vagy 7. ábrán bemutatott szekvenciák bármelyikét tartalmazza;
• egy megfelelő peptidmolekula, amely ilyen stimulációs indexszel rendelkezik, és amely legalább 9 összefüggő aminosav-oldalláncot tartalmaz a fent definiált RI, R2 vagy R3 részleges INFa2 szekvenciák bármelyikéből;
• egy megfelelő pepiid alkalmazása olyan INFa2 gyártására, amelynek lényegében nincs, vagy kisebb az immunogenitása, mint bármilyen nem módosított molekulának, amelynek ugyanakkora vagy elfogadhatóan csökkentett a biológiai aktivitása, amikor ín vivo van alkalmazva;
• gyógyászati készítmény, amely fent és lent és az ábrákon definiált szintetikus peptidszekvenciát tartalmaz, amely az INFa2 biológiai aktivitásával rendelkezik, adott esetben együtt gyógyászatilag elfogadható hordozóval, oldószerrel vagy kötőszerrel;
A „T-sejt-epitóp” kifejezés alatt a leírás szerinti értelemben olyan aminosav-szekvenciát értünk, amely elfogadható hatékonysággal képes kötődni II. osztályba tartozó MHC molekulákhoz, képes T-sejteket stimulálni és/vagy képes kötődni is II. osztályba tartozó MHC mole
- 15 kulakkal komplexben lévő T-sejtekhez (anélkül, hogy szükségszerűen mérhető módon aktiválná azokat).
A „peptid” kifejezés alatt a leírás és a mellékelt igénypontok szerinti értelemben olyan vegyületet értünk, amely két vagy több aminosavat tartalmaz. Az aminosavak peptidkötésen (amint az alább definiáljuk) keresztül kapcsolódnak egymáshoz. 20 különböző, természetben előforduló aminosav vesz részt a peptidek biológiai előállításában, és közülük bármennyi összekapcsolható bármilyen sorrendben peptidlánc vagy gyűrű előállítására. A peptidek előállítására alkalmazott természetben előforduló aminosavak mindegyike L-konfigurációjú. Szintetikus peptideket előállíthatunk hagyományos szintetikus eljárások alkalmazásával, L-aminosavak, D-aminosavak vagy a két különböző konfigurációjú aminosavak különféle kombinációinak az alkalmazásával. Bizonyos peptidek csak néhány aminosav-egységet tartalmaznak. A rövid peptideket, például a kevesebb, mint tíz aminosav-egységet tartalmazókat néha „oligopeptideknek” nevezzük. Más peptidek nagy számú aminosav-oldalláncot tartalmaznak, például akár 100-at vagy többet, és ezeket „polipeptideknek” nevezzük. Megállapodás szerint „polipeptidnek” tekinthetünk bármilyen peptidláncot, amely három vagy több aminosavat tartalmaz, míg egy „oligopeptidet” általában adott típusú rövid polipeptidnek tekintünk. Ily módon a leírás szerinti értelemben „polipeptidre” vonatkozó bármilyen utalás vonatkozik oligopeptidre is. Ezenfelül bármilyen utalás „pepiidre” magában foglalja a polipeptideket, oligopeptideket és fehérjéket. Aminosavak minden különböző elrendezése különböző polipeptideket vagy fehérjéket hoz létre. A létrehozható polipeptidek — és ily módon a különböző fehérjék — száma gyakorlatilag korlátlan.
Az „alfa-szénatom (Ca)” kifejezés alatt azon szén-hidrogén (CH) komponens szénatomját értjük, amely a peptidláncban található. Egy „oldallánc” egy Ca-hoz kapcsolódó csoport, amely egyszerű vagy bonyolult csoportot vagy molekularészt tartalmazhat, amelynek a fizikai méretei szignifikánsan változhatnak a peptid méretéhez viszonyítva.
A találmány alkalmazható bármilyen olyan INFa2 fajta molekulára, amelynek lényegében azonos az elsődleges aminosav-szekvenciája, mint a találmány szerint feltártnak, és ily módon vonatkozik olyan INFa2 molekulákra, amelyek génsebészeti úton vagy bármely más módon módosítottak, és több vagy kevesebb, mint 165 aminosav-oldalláncot tartalmazhatnak.
Az INFa2 fehérjék, mint például a más emlős forrásokból azonosítottak, tartalmaznak a leírásban ismertetett peptidszekvenciákkal sok közös szekvenciát, és van sok közös peptidszekvenciájuk, amelyek lényegében azonosak a leírásban felsoroltakkal. Tehát az ilyen fehérjeszekvenciák egyformán a találmány oltalmi körébe tartoznak.
- 16 • ··
A találmány felülkerekedik azon a gyakorlati problémán, hogy az autológ organizmusokba beadott oldható fehérjék immunválaszt válthatnak ki, amely az oldható fehérjéhez kötődő gazda-ellenanyagok kialakulását eredményezi. Ennek a jelenségnek a prominens példája — többek között — az INFa2 klinikai alkalmazása. Az INFa2-vel kezelt humán páciensek jelentős része ellenanyagokat termel, annak a ténynek ellenére, hogy ez a fehéije endogén módon termelődik [Russo, D. és mtsai. (1996), mint fent; Stein, R. és mtsai. (1988), mint fent], A találmány célja ennek a problémának a megoldása, olyan INFa2 fehéijék biztosításával, amelyeknek megváltoztatott hajlama van immunválasz kiváltására humán gazdának történő beadás hatására. A találmány szerinti eljárások esetében felismertük — és ezúton feltáljuk —, hogy az INFa2 molekula kritikus T-sejt-epitópokat tartalmazó régiói irányítják az erre az autológ fehérjére adott immunválaszokat.
A találmány szerinti, módosított INFa2-höz vezető általános eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza:
(a) meghatározzuk a polipeptid aminosav-szekvenciáját vagy annak egy részét;
(b) azonosítunk egy vagy több potenciális T-sejt-epitópot a fehérje aminosav-szekvenciájában bármilyen módszer alkalmazásával, beleértve az MHC-molekulákhoz kötődő peptidek meghatározását in vitro vagy in silico módszerek vagy biológiai vizsgálati eljárások alkalmazásával;
(c) új szekvencia-variánsokat tervezünk, amelyekben egy vagy több aminosav az azonosított potenciális T-sejt-epitópokban módosítva van oly módon, hogy lényegesen csökkentjük vagy megszűntetjük a T-sejt-epitóp aktivitását, amit a peptideknek MHC-molekulákhoz való kötődésével határozunk meg in vitro vagy in silico módszerekkel vagy biológiai vizsgálati eljárásokkal. Az ilyen szekvencia-variánsokat oly módon állítjuk elő, hogy elkerüljük új potenciális T-sejt-epitópok keletkezését a szekvencia-variánsokban, hacsak nem az ilyen új potenciális T-sejt-epitópok oly módon vannak módosítva, hogy lényegében csökkentik vagy megszűntetik a T-sejt-epitóp aktivitását; és (d) ilyen szekvencia-variánsokat állítunk elő rekombináns DNS módszerekkel, és teszteljük a variánsokat annak érdekében, hogy egy vagy több kívánt tulajdonságú variánst azonosítsunk, jól ismert rekombináns módszerekkel.
Potenciális T-sejt-epitópok (b) pont szerinti azonosítását a technika állásához tartozó korábban leírt eljárások alkalmazásával hajthatjuk végre. Alkalmas eljárásokat tárnak fel a WO 98/59244.; WO 98/52976.; és WO 00/34317. számú nemzetközi közzétételi iratokban, és
- 17ezek előnyösen alkalmazhatók INFa2-eredetű peptideknek II. osztályba tartozó MHC molekulákhoz való kötődési hajlamának azonosítására.
Egy másik, T-sejt-epitópok azonosítására szolgáló nagyon hatásos számításos eljárást mutatunk be az 1. példában, amely a találmány előnyös megvalósítási módját képezi.
A gyakorlatban számos variáns INFa2 fehérjét állíthatunk elő és tesztelhetünk a kívánt immunológiai és funkcionális tulajdonságokra. A variáns fehérjék legelőnyösebben rekombináns DNS módszerekkel állíthatók elő, habár más eljárások, mint például INFa2 fragmensek kémiai szintézise is elképzelhető.
A fenti séma (b) lépése szerinti elemzés eredményét — amely a 165 aminosav-oldallánc hosszúságú INFa2 fehérjeszekvenciára vonatkozik — az 1. ábrán mutatjuk be. A fenti séma (c) és (d) lépése szerinti tervezés és konstrukció eredményét — amely a találmány szerinti módosított molekulára vonatkozik — a 2. és 3. ábrán mutatjuk be.
A találmány tárgyát képezik INFa2 analógjai, amelyekben legalább egy aminosavoldallánc szubsztituálva van olyan pozícióban, amely a fehérje egy vagy több potenciális T-sejtepitópja aktivitásának a lényeges csökkentését vagy megszűntetését eredményezi. A potenciális II. osztályba tartozó MHC ligandumok bármelyikének az 1. táblázatban azonosított, meghatározott pontokon történő egy vagy több aminosav-szubsztitúciója olyan INFa.2 molekulát eredményezhet, amelynek csökkentett az immunogenikus potenciálja, amikor terápiás szerként humán gazdának beadjuk.
A legelőnyösebb olyan INFa2 molekula biztosítása, amelyben az aminosav-módosítás (például szubsztitúció) a szülői molekula legimmunogénebb régióiban van végrehajtva. Felismertük azt, hogy az INFa2 molekula legimmunogénebb régiói emberben az RI, R2 és R3 régiókra korlátozódnak, amelyek sorrendben az alábbi aminosav-szekvenciákat tartalmazzákISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLH ; FNLFSTKDSSAAWDE és KEDSILAVRKYFQRITLY. A találmány fő előnyös megvalósítási módjai olyan INFa2 molekulákat tartalmaznak, amelyeknek az 1. ábrán láthatók a II. osztályba tartozó MHC ligandumjai, és amelyek vagy teljes hosszúságukban, vagy legalább 9 aminosav-oldallánc hosszúságban megfelelnek a fenti RI, R2 vagy R3 szekvenciáknak, és oly módon vannak megváltoztatva, hogy megszűnjön vagy másképpen csökkenjen azon MHC allotípusok száma, amelyeket a peptidek képesek megkötni.
A találmány előnyös megvalósítási módjai közé tartoznak a 4. ábra szerinti specifikus szubsztitúciók. Különösen előnyös olyan módosított INFa2 molekulák biztosítása, amelyek a 4. ábra szerinti szubsztitúciók kombinációit tartalmazzák. Az olyan kombinációk, amelyek az w ··
- 18 egyes RI, R2 és R3 immunogenikus régiók módosításait, és az R2 és R3 módosításainak a kombinációit tartalmazzák, különösen előnyösek, habár az ilyen preferenciát nem tekintjük a kívánatos szubsztitúciók kombinációinak korlátozásaként.
A T-sejt-epitópok megszűntetése esetén az aminosav-szubsztitúciókat megfelelő pontokon végezzük a T-sejt-epitóp aktivitásának lényeges csökkenésére vagy megszűntetésére megjósolt peptidszekvenciában. A gyakorlatban egy megfelelő pont előnyösen az II. osztályba tartozó MHC molekula kötőbarázdájában található zsebek egyikébe kötődő aminosavoldalláncnak felel meg.
A legelőnyösebb, ha a barázda első zsebébe történő kötődést változtatjuk meg a peptid úgynevezett Pl vagy Pl-horgony pozíciójában. A kötési kölcsönhatás minőségét a peptid Pl horgony-oldallánca és a II. osztályba tartozó MHC molekula kötőbarázdájának az első zsebe között az egész peptid általános kötési affinitásának a fő meghatározójának tartják. Egy megfelelő szubsztitúció a peptid ezen pozícióban olyan oldalláncra történő szubsztitúció, amely kevésbé jól illik a zsebbe, például egy hidrofilabb oldalláncra történő szubsztitúció. AII. osztályba tartozó MHC molekula kötőbarázdájában található más zsebrégiókba kötődő aminosavoldalláncnak megfelelő peptidpozíciókban található aminosav-oldalláncok is a találmány oltalmi körébe tartoznak.
Nyilvánvaló, hogy egy adott potenciális T-sejt-epitópban végzett egyedi aminosavszubsztitúciók az epitóp megszűntetésének a legelőnyösebb módjai. A szubsztitúciók kombinációi egyetlen epitópon belül figyelembe vehetők, és különösen megfelelők akkor, amikor az egyedi epitópok átfednek egymással. Ezenfelül akár az egy adott epitóp egyedi aminosavszubsztitúciói, akár kombinálva egy egyedi epitópon belül elvégezhetők olyan pozíciókban, amelyek nem „zseb-oldalláncoknak” felelnek meg a II. osztályba tartozó MHC molekula kötőbarázdájában, hanem a peptidszekvencia bármelyik pontjában találhatók. A szubsztitúciókat homológ szerkezetre vagy szakterületen ismert in silico módszerek alkalmazásával előállított szerkezeti eljárásra vonatkoztatva végezhetjük el, amely a találmány szerinti molekula ismert szerkezetei jellegzetességein alapszik. Az összes ilyen szubsztitúció a találmány oltalmi körébe tartozik.
A fent azonosított peptideken kívüli aminosav-szubsztitúciók is a találmány tárgyát képezhetik, különösen akkor, amikor azokat a felsorolt peptideken belüli szubsztitúcióval(kkal) kombinálva hajtjuk végre. Például a variáns molekula szerkezetét vagy biológiai aktivitását helyreállító változtatás a találmány tárgyát képezheti. Az ilyen kompenzációs cserék és változtatások, amelyek a INFa2 polipeptid adott aminosav-oldalláncainak a deléciói vagy addíciói,
- 19amelyek kívánt aktivitású variánst eredményeznek, együtt a leírásban feltárt peptidek bármelyikének a változtatásaival, a találmány oltalmi körébe tartoznak.
Minthogy a találmány tárgya módosított INFa2, az ilyen módosított INFa2 fehérjéket vagy módosított INEa2 fehérjék fragmenseit tartalmazó készítmények a találmány oltalmi körébe tartoznak. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát módosított INFa2 entitásokat kódoló nukleinsavak képezik. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát eljárások képezik emberek terápiás kezelésére a módosított INFa2 fehérjék alkalmazásával.
A találmányt az alábbi nem korlátozó példákkal illusztráljuk. A példákban az alábbi ábrákra hivatkozunk. Az aminosav-oldalláncokat következetesen egybetüs kódokkal jelöljük.
Az 1. ábrán humán INFa2 potenciálisan II. osztályba tartozó MHC molekula iránti kötőaktivitású peptidszekvenciáit mutatjuk be.
A 2. ábrán humán INFa2 T-sejt-epitópjainak a megszűntetéséhez vezető szubsztitúciókat mutatunk be (WT = vad típusú oldallánc).
A 3. ábrán további szubsztitúciókat mutatunk be, amelyek egy vagy több MHC allotípus számára potenciális T-sejt-epitóp eltávolításához vezetnek.
A 4. ábrán előnyös szubsztitúcióikat mutatunk be humán INEa2-ben (WT = vad típusú oldallánc, MŰT = kívánt oldallánc).
Az 5. ábrán a 13-tagú INFa2 szintetikus peptidszekvenciák táblázatát mutatjuk be, a 2. példában bemutatott II. osztályba tartozó MHC molekula in vitro kötési vizsgálati eljárás alkalmazásával elemezve.
A 6. ábrán az MHC allotípusok in vitro MHC-peptid-kötési vizsgálati eljárás eredményét mutatjuk be. a) jelöli a magas affinitással kötődő peptideket (0% gátlás versengő referenciapeptid által) az összes tesztelt MHC allotípus esetében; b) jelöli a közepes affinitású peptideket (0-50% gátlás versengő peptid által) az összes tesztelt MHC allotípus esetében; c) jelöli az alacsony affinitású peptideket (50-100% gátlás versengő peptid által) az összes tesztelt MHC allotípus esetében és d) jelöli a tesztelt MHC allotipusokhoz detektálhatatlan kötődésű peptideket.
A 7. ábrán a 15-tagú INFa2 peptidszekvenciák táblázatát mutatjuk be, a 3. példában bemutatott in vitro naiv humán T-sejtes vizsgálati eljárás alkalmazásával elemezve. Jelezzük a peptid sorszámát és az N-terminális peptid-oldallánc pozícióját az INFa2 szekvenciában.
-20A 8. ábrán 6 olyan egyén összesített stimulációs indexét mutatjuk be, amelyek reagálnak INFa2 peptidekkel történő stimulálására. 20 szkrínelt donor közül 6 reagált az 51, INFa2 szekvenciájából származó 15-tagú peptid legalább egyikével történő stimulálásra Az egyes peptidekre adott válaszokat három különálló régióba csoportosítottuk, ahol a harmadik régió 5 tartalmazza a legimmunogénebb peptideket, #38 és #39 (nyilak). A C32 (DRB1 -korlátozott) és C49 (DP-korlátozott) kontroll peptideket is bemutatjuk az összehasonlítás végett. A vonalkázás az egyes oszlopokban az egyedi donorok hozzájárulását jelöli.
A 9. ábrán az INFa2 immunogén régióit mutatjuk be, és az ezen régiókból származó, naiv humán T-sejteket stimulálni képes peptidszekvenciákat.
A 10. ábrán a naiv humán T-sejtek proliferációját in vitro stimulálni képes INFa2 peptideket tartalmazó táblázatot mutatunk be. A donorok közül 5 esetében a válaszokat az RÍ, R2 és R3 fö epitóprégiókból származó több átfedő pepiiddel mértük. A donorok közül 3 esetében a válaszokat az RI, R2 vagy R3 régiókból származó egyedi szintetikus peptidekkel mértük.
All. ábrán az INFa2 peptidekkel reagáló és nem reagáló donorok II. osztályba tartozó
MHC alléjainak a gyakoriságát ismertető táblázatot mutatunk be. a = a számláló a DR allét hordozó donorok száma, a nevező az ezzel a pepiiddel in vitro T-sejt-proliferációt mutató donorok száma (a reagáló donorok száma = 6). b = az alléi gyakorisága a donorpopulációban. A kettő vagy annál kevesebb választ mutató peptideket nem értékeltük. Az összes reagáló donor 20 negatívnak bizonyult DRBl*14-re. A DRB1*14 allotípus gyakorisága 1,5% a 20 tesztelt donorban. Egy adott peptid allélkorlátozottságát az alléinak a donorpopulációban mért gyakorisága és az ugyanazt az alléit expresszáló reagáló donorok száma alapján határozzuk meg. Ha egy peptid egy adott allélhez kapcsolódik (allélkorlátozott), akkor a mutatott százalék várhatóan nagyobb, mint az alléi gyakorisága a populációban.
A 12. ábrán 15-tagú szintetikus peptidek IC5o-értékeinek a táblázatait mutatjuk be adott
II. osztályba tartozó MHC allotípusok kötési vizsgálati eljárásában, (a) Kompetitív II. osztályba tartozó MHC-peptid-kötési vizsgálati eljárás, naiv humán T-sejtek in vitro DRBl*0101-ra mutatott proliferációjának elősegítésére képes INFa2 peptidek meghatározására. Az INFa2 peptideket rögzített HOM-2 sejtekkel inkubáltuk 10 μΜ biotinilált influenza hemagglutinin
307-319 jelenlétében. A versengő peptid esetében a biotinilált peptid maximális kötődésének
50%-át eredményező koncentrációját vettük az IC5o-értéknek. Influenza 103-115 peptidet alkalmaztunk magas affinitású kontrollként. IC50 < 20 μΜ = magas affinitás, IC50 = 20-100 μΜ = közepes affinitás, IC50 >100 μΜ =alacsony affinitás, (b) Kompetitív II. osztályba tartozó
-21 MHC-peptid-kötési vizsgálati eljárás, naiv humán T-sejtek in vitro DRBl*0701-ra mutatott proliferációjának elősegítésére képes INFa2 peptidek meghatározására. Az INFa2 peptideket rögzített MOU (MANN) sejtekkel inkubáltuk 10 μΜ biotinilált tetanusztoxin 828-840 jelenlétében. A versengő peptid esetében a biotinilált pepiid maximális kötődésének 50%-át eredmé5 nyező koncentrációját vettük az IC50-értéknek. Tetanusz toxin 828-840 pepiidet alkalmaztunk magas affinitású kontrollként. IC5o < 20 μΜ = magas affinitás, IC5o = 20-100 μΜ = közepes affinitás, IC50 >100 μΜ ^alacsony affinitás, (c) Kompetitív II. osztályba tartozó MHC-peptidkötési vizsgálati eljárás, naiv humán T-sejtek in vitro DRBl*0401-ra mutatott proliferációjának elősegítésére képes INFa2 peptidek meghatározására. Az INFa2 peptideket rögzített WT10 51 sejtekkel inkubáltuk 50 μΜ biotinilált influenza hemagglutinin 307-319 jelenlétében. A versengő peptid esetében a biotinilált peptid maximális kötődésének 50%-át eredményező koncentrációját vettük az IC5o-értéknek. Influenza 103-115 peptidet alkalmaztunk magas affinitású kontrollként. IC50 < 20 μΜ = magas affinitás, IC50 = 20-100 μΜ = közepes affinitás, IC50 > 100 μΜ =alacsony affinitás.
A 13. ábrán INFa2 olyan szubsztitúcióit részletező táblázatot mutatunk be, amelyek a
7. példa szerinti anti-proliferációs vizsgálati eljárásban megtartott aktivitású molekulát eredményeznek. WT = vad típusú oldallánc; # = oldallánc száma; Műt = a végrehajtott mutáció. Az Epitóprégió jelöli a szubsztitúció helyét az RI, R2 vagy R3 immunogenikus epitóprégiókhoz viszonyítva.
A 14. ábrán kiválasztott mutáns INFa2 molekulák anti-proliferatív hatásának a reprezentatív adatait mutatjuk be. A vizsgálati eljárásokat a 7. példa eljárásai szerint hajtottuk végre. Az a) részben az RÍ immunogenikus régióban szubsztitúciót tartalmazó molekulák aktivitását mutatjuk be. A b) részben az R2 immunogenikus régióban szubsztitúciót tartalmazó molekulák aktivitását mutatjuk be. A c) részben az R3 immunogenikus régióban szubsztitúciót tartalmazó 25 molekulák aktivitását mutatjuk be.
A 15. ábrán az egyedi donorok szintetikus INFa2 peptidekre adott válaszait mutatjuk be. A C32 (DRB1 -korlátozott) és C49 (DP-korlátozott) kontroll peptidek adatait is bemutatjuk az összehasonlítás végett. Az RÍ, R2, R3 immunogenikus régiókat jelöljük a releváns részeken. A pozitív stimulációs index küszöbértéke 2.
Az alábbi példákban a találmány részletesebben is bemutatjuk, de nem kívánjuk azt a bemutatott megvalósítási módokra korlátozni.
-221. példa
A proteinek vagy polipeptidek teljes szerkezetének meghatározásában több faktor is fontos szerepet játszik. Először is, a peptidkötés (amely a peptidláncban az aminosavakat egymáshoz kapcsolja) kovalens kötés. Ez a kötés planáris szerkezetű; lényegében egy szubsztituált 5 amid. Az „amid” —CONH— atomcsoportot tartalmazó szerves vegyület.
A szomszédos aminosavak alfa-szénatomjait egymáshoz kapcsoló, planáris peptidkötés az alábbiak szerint ábrázolható.
Mivel az O=C és a C-N atomok viszonylag merev síkban helyezkednek el, e tengelyek 10 körül szabad rotáció nem lehetséges. Ennek megfelelően, a szaggatott vonallal jelölt síkot, amelyben a peptidváz oxigénatomja, szénatomja, nitrogénatomja és hidrogénatomja fekszik, „amidsíknak” vagy „peptidsíknak” is nevezik. Az amidsík egymással szemben fekvő sarkaiban helyezkednek el az alfa-szénatomok. Mivel a peptid- vagy amidsíkban elhelyezkedő O=C és CN atompárok tengelyei körül lényegében nincs rotáció, a polipeptid-lánc az alfa-szénatomokat 15 összekötő planáris peptidkötések sorozatából áll.
A polipeptidek vagy proteinek teljes szerkezetének vagy konformációjának meghatározásában fontos szerepet játszó második faktor az egyes amidsíkok közös aC-kötés körüli elfordulásának szöge. Az „elfordulási szög” vagy „torziós szög” kifejezéseket egymás szinonimáinak tekintjük. Ha feltételezzük, hogy az oxigén-, szén-, nitrogén- és hidrogénatomok az 20 amidsíkban maradnak (ami rendszerint valós feltételezés, bár bizonyos konformációkban ezen atomok némileg kitérhetnek a síkból), ezek az elfordulási szögek határozzák meg az N és R polipeptidváz-konformációt, azaz a szomszédos aminosavak közötti struktúrát. Ez a két szög a φ és ψ. Ilyenformán, a φι, ψι szögek sorozata (ahol az „i” index a polipeptid-lánc i-edik aminosavát reprezentálja) megfelelően definiálja a polipeptid másodlagos szerkezetét. A φ és ψ szö25 gek meghatározására alkalmazott konvenciók, vagyis azon vonatkoztatási pontok, amelyeknél az amidsíkok 0°-os szöget alkotnak, és annak definíciója, hogy egy adott polipeptidben melyik szög a φ és melyik a ψ, szakirodalmi forrásokban találhatók [Id. pl. Ramachandran és mtsai.: Adv. Prot. Chem. 23, 283 (1968), amely cikk 285-294. oldalait a kitanítás részének kell tekin-23 teni], A találmány szerinti eljárás bármely proteinre alkalmazható, és, részben, azon a felismerésen alapul, hogy emberekben az MHC II. osztályú molekula kötőbarázdájának elsődleges 1. zseb horgonypozíciója meghatározott aminosav-oldalláncokra vonatkozó specifítással bír. E zseb specifitását az MHC II. osztályú molekula béta-lánca 86. pozíciójában lévő aminosav ha5 tározza meg. Ez a pozíció a 1. zseb alján található, és meghatározza az e zsebben elférő oldallánc méretét [Marshall: J. Immunoi. 152, 4946 (1994)]. Ha ez az aminosav glicin, úgy a zsebben valamennyi hidrofób alifás és aromás oldalláncú aminosav elhelyezhető (hidrofób alifás oldalláncú a valin, leucin, izoleucin és metionin; aromás oldalláncú a fenilalanin, tirozin és triptofán), de előnyösebbek az aromás oldalláncúnk. Ha a zseb alján lévő aminosav valin, annak 10 oldallánca benyúlik a zsebbe, és korlátozza a zsebben elhelyezhető aminosav-oldallánc méretét, ezáltal a zsebben csak hidrofób alifás oldalláncok helyezhetők el. Ennek megfelelően, egy aminosav-szekvenciában akár hidrofób alifás, akár aromás oldalláncú aminosav található, megvan a lehetősége egy MHC II. osztályú korlátozott T-sejt-epitóp jelenlétének. Mindazonáltal, ha az oldallánc hidrofób alifás, hozzávetőleg kétszer nagyobb a T-sejt-epitóp jelenlétének valószínű15 sége, mint egy aromás oldallánc esetén (az egész populációra az „1. zseb” típusok körülbelül egyenletes eloszlását feltételezve).
A találmány szerinti számítógépes eljárással a következők szerint határozható meg annak valószínűsége, hogy egy adott peptidrégió T-sejt-epitópot tartalmazzon:
(1) Átvizsgáljuk egy előre mghatározott hosszúságú peptidszegmens elsődleges szek20 venciáját, és azonosítjuk valamennyi jelenlévő hidrofób alifás és aromás oldalláncot. (2) A hidrofób alifás oldalláncokhoz nagyobb értéket rendelünk, mint az aromás oldalláncokhoz (előnyösen az aromás oldalláncokhoz rendelt érték körülbelül kétszeresét; például, egy hidrofób alifás oldallánchoz 2-est, míg egy aromás oldallánchoz 1-est). (3) A pepiiden belül minden egyes -előre meghatározott, egyforma hosszúságú - átfedő peptidszegmensere (ablakra) össze25 gezzük a kapott értékeket, és az adott szegmensre (ablakra) meghatározott összértéket a szegmens (ablak) egy közbülső pozíciójában - előnyösen a vizsgált szegmens (ablak) kb. közepén - elhelyezkedő egyetlen aminosavhoz rendeljük. Ezt mindegyik vizsgált átfedő peptidszegmensre (ablakra) megismételjük, így a pepiid minden egyes aminosavához hozzárendelünk egy értéket, amely annak valószínűségét tükrözi, hogy az adott szegmensben (ablakban) T-sejt30 epitóp helyezkedik el. (4) A 3. lépésben leírtak szerint kiszámított és hozzárendelt értékeket a vizsgált teljes aminosav-szekvencia aminosav-koordinátáinak függvényében ábrázolhatjuk. (5) A szekvencia valamennyi olyan részletét, amely egy előre meghatározott (pl. 1-es) pontértékkel bír, potenciálisan T-sejt-epitópot tartalmazónak tekintünk, és ez a részlet, kívánt esetben, mó
-24dosítható. A találmány e megvalósítási módja egy olyan általános eljárás, amellyel leírhatók a potenciálisan T-sejt-epitópot tartalmazó peptidrégiók. A peptidek e régiókban végzett módosításai lehetőséget nyújtanak az MHC II. osztályú molekulák kötődésére vonatkozó tulajdonságok módosítására.
A találmány egy további megvalósítási módja értelmében a T-sejt-epitópok egy kifinomultabb - a peptidek MHC II. osztályú allélok modelljeivel bekövetkező kölcsönahatásait figyelembe vevő - számítógépes eljárás alkalmazásával nagyobb pontossággal jósolhatok meg. Egy pepiiden belül elhelyezkedő T-sejt-epitópok számítógépes meghatározásának e speciális megvalósítási módja szerinti az összes ismert MHC II. osztályú molekula szerkezete alapján elkészítjük legalább 42 MHC II. osztályú alléi modelljét és e modelleket T-sejt-epitópok számítógépes azonosítására alkalmazzuk; a peptidváz relatív alfa-szénatom (Coc) pozícióinak ismert variabilitásának figyelembe vétele érdekében a egyes modellekhez elkészítjük a peptidvázak könyvtárait; az egyes peptidvázakra elkészítjük az aminosav-oldallánc-konformációk könyvtárait, melyeket összekapcsolunk a - peptid és az MHC Π. osztályú molekula közötti interakció szempontjából kulcsfontosságú - pozíciókra lehetséges 20 aminosav-alternatíva mindegyikének modelljével; és a peptidvázak és az oldallánc-konformációk e könyvtárait - pontszám-előállító függvény felhasználásával - egy bizonyos MHC II. osztályú molekulával összekapcsolt, adott pepiidre optimális peptidváz- és oldallánc-konformáció kiválasztására alkalmazzuk, és a kölcsönhatás alapján kötési pontszámot származtatunk le.
Az MHC II. osztályú molekulák modelljei a Brookhaven Protein Adatbankban (PDB) található hasonló struktúrák alapján, homológia-modellezéssel származtathatók le. Az ilyen modellezések félautomata homológia-modellező szoftver [„Modeller”, Id. Sáli és Blundell: J. Mól. Bioi. 234, 779 (1993)] alkalmazásával hajthatók végre, amely - a „CHARMm” erőtérrel együtt - magában foglal egy szimulációs illesztő {„annealing”) függvényt (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA). Ezen túlmenően, egyéb modellezési eljárások is alkalmazhatók.
A találmány szerinti eljárás jelentős mértékben eltér az egyéb számítógépes eljárásoktól, amelyekben az MHC II. osztályú molekulák kis részhalmazához való kötőbarázda egyes pozícióiban lévő minden egyes aminosav-alternatíva kísérletileg meghatározott kötési adatainak könyvtárát alkalmazzák [Id. Marshall és mtsai.: Biomed. Pept. proteins Nucleic Acids 1(3), 157 (1995)], továbbá azoktól a számítógépes eljárásoktól, amelyek a kötőbarázdán belüli kötőzsebek adott típusai kötési tulajdonságainak meghatározására hasonló kísérleti kötési adatokat alkalmaznak (ismét csak az MHC II. osztályú molekulák viszonylag kis részhalmazának >
-25 felhasználásával), majd e kötőzseb-könyvtárból a kötőzseb-típusokat - további virtuális MHC II. osztályú molekulák mesterséges létrehozása céljából - „összekeverik és párosítják”. [Id. Sturniolo és mtsai.: Nat. Biotech. 17(6), 555 (1999)]. E két különböző eljárás fő hátránya, hogy - a vizsgálati eljárások bonyolultsága és nagyszámú peptidváltozat szintézisének szükségessége miatt - csak kevés MHC II. osztályú molekula kísérleti átvizsgálására van lehetőség. Ilyenformán, az elsőként említett korábbi módszer csak kisszámú MHC II. osztályú molekulára vonatkozó jóslásokat eredményez, míg a másodikként említett eljárásra szintén jellemző az a feltételezés, hogy egy molekulában a hasonló aminosavakkal „kibélelt” zseb egy eltérő MHC II. osztályú alléi vonatkozásában hasonló kötési tulajdonságú, további hátrányként pedig az említhető, hogy csak olyan MHC II. osztályú molekulák „virtuális” létrehozására ad lehetőséget, amelyek a kötőzseb-könyvtárban lévő kötőzsebeket tartalmaznak. A találmány szerinti modellezési eljárással bármilyen számú és típusú MHC II. osztályú molekula szerkezete megjósolható, miáltal az allélok specifikusan úgy szelektálhatok, hogy a teljes populációra reprezentatívak legyenek. Ezen túlmenően, az átvizsgált MHC II. osztályú molekulák száma további modellek létrehozásával növelhető, anélkül, hogy bonyolult kísérletezéssel további adatokat kellene produkálni.
A peptidváz-könyvtár alkalmazásával figyelembe vehetők az átvizsgálás alatt álló, különböző (adott MHC II. osztályú molekulákkal összekapcsolódott) peptidek a-szénatomjai pozícióinak variációi. Ez ismét ellentétes a fentebb említett, korábbi számítógépes eljárásokkal, melyek - az adott kötőzsebekben létrejövő aminosav-kötődés átvizsgálására - egyszerűsített peptidvázak alkalmazásán alapulnak. Az ilyen egyszerűsített peptidvázak kevéssé reprezentatívak a „valódi” peptidekben megfigyelhető peptidváz-konformációkra, ami a peptidkötés megjóslásának pontatlanságát eredményezi. A találmány szerinti peptidváz-könyvtár létrehozása érdekében szuperponáljuk a Protein Adatbankban található MHC II. osztályú molekulákhoz kötődő valamennyi pepiid molekulavázát, és feljegyezzük a kötőbarázdán belül elhelyezkedő 11 aminosav alfa-szénatomjai közötti négyzetes középérték- (RMS-) eltérést. Bár ez a könyvtár viszonylag kevés (jelenleg 13) rendelkezésre álló egéreredetű és humán struktúrából származtatható, a még nagyobb variabilitás figyelembe vétele érdekében minden egyes a-szénatom RMS-értékét 50 %-kal növeljük. Ezután meghatározzuk az egyes aminosavak átlagos Capozícióját, és e pont körül egy gömböt rajzolunk, amelynek sugara egyenlő az adott pozícióban meghatározott RMS-eltérés 150 %-ával. Ez a gömb reprezentálja az összes megengedett Cocpozíciót. A legkisebb RMS-eltérést mutató α-szénatomból kiindulva (a fentebb említett 1.
*
-26•J zsebben elhelyezkedő aminosav, amely ekvivalens a kötőbarázdában lévő 11 aminosav 2. pozíciójával) a gömböt háromdimenziós rácsozattal látjuk el, és a rácsozat valamennyi szögpontját az adott aminosav alfa-szénatomjának lehetséges pozíciójaként használjuk. A következő amidsíkot (amely a következő aminosavhoz történő kapcsolódást lehetővé tevő peptidkötésnek felel meg) átültetjük ezen lehetséges alfa-szénatomok mindegyikére, és a φ és ψ szögeket - a következő alfa-szénatom pozíciójának meghatározása céljából - előírt intervallumokban, lépésenként elforgatjuk. Ha a következő alfa-szénatom az ezen alfa-szénatomra megengedett pozíciók gömbjébe esik, úgy a dipeptid orientációját elfogadjuk, ellenkező esetben a dipeptidet nem fogadjuk el. Ezt az eljárást a következő Cot-pozíciók mindegyikére megismételjük (miáltal a peptid az 1. zseb alfa-szénatom „magjából” nő ki), egészen addig, míg az előző alfa-szénatomok valamennyi lehetséges permutációja alapján mind a kilenc maradék alfa-szénatom pozícióját meg nem határozzuk.
Az eljárást ezután az 1. zseb előtt elhelyezkedő alfa-szénatomra még egyszer megismételve a kötőbarázdán belül elhelyezkedő peptidváz-alkotó Ca-pozíciók könyvtárát hozzuk létre. Az így kapott peptidvázak száma több tényezőtől függ; ilyenek a „megengedett pozíciók gömbjei”; az 1. zseb pozícióban megrajzolt „első gömb” rácsozatának finomsága; és a φ és ψ szögek - következő alfa-szénatomok pozíciójának meghatározására alkalmazott - lépésenként! elforgatásának finomsága. Ezzel a módszerrel nagyméretű peptidváz-könyvátrak állíthatók el. Minél nagyobb a peptidváz-könyvtár, annál nagyobb a valószínűsége annak, hogy egy MHC II. osztályú molekula kötőbarázdáján belül megtaláljuk egy konkrét peptid optimális illeszkedését. Minthogy valamennyi peptidváz - a kötődőmének aminosavaihoz történő ütközések miatt nem lesz alkalmas az MHC II. osztályú molekulák valamennyi modelljével történő összekapcsolásra, minden egyes alléira egy olyan könyvtár-részhalmazt hozunk létre, amely olyan peptidvázakból áll, amelyekhez az alléi hozzáilleszthető. A peptidváz-könyvtár - MHC II. osztályú molekulák modelljeivel együttes - alkalmazása olyan részletes adatbázis létrejöttét eredményezi, amely - az egyes megengedett peptidvázakkal összekapcsolt - minden egyes MHC II. osztályú molekulához való kötőbarázda valamennyi pozíciójában lehetséges minden egyes aminosavra megengedett oldallánc-konformációkból áll. Ezt az adathalmazt egyszerű térbeli átfedési függvény alkalmazásával hozzuk létre, ahol is egy MHC II. osztályú molekula egy peptidvázzal van összekapcsolva, és a peptidvázra - a kívánt pozícióban - egy aminosavoldallánc van ráültetve. Az oldalláncok valamennyi elforgatható kötését előírt intervallumokban, lépésenként elforgatjuk, és az így kapott, adott kötéstől függő atompozíciókat feljegyez♦.? :*J· .:.
-27zük. Az atom és a kötőbarázdában elhelyezkedő oldalláncok atomjai közötti kölcsönhatást feljegyezzük, és a pozíciókat - a következő kritériumok alapján - elfogadjuk vagy elvetjük. Az adott pontig pozícionált valamennyi atom átfedésének összege nem haladhat meg egy előre meghatározott értéket. Ennek megfelelően, a konformációkeresés szigorúsága a kötés lépésenként! elforgatása során alkalmazott intervallum és a teljes átfedésre előre meghatározott határérték függvénye. Ez az utóbbi érték kicsi lehet, ha tudjuk, hogy az adott kötőzseb merev, azonban a szigorúság enyhíthető, ha a kötőzseb-oldalláncok pozícióiról ismert, hogy viszonylag flexibilisek. Ilyenformán, a kötőbarázda zsebein belüli flexibilitási változékonyság imitálása érdekében engedmények vehetők figyelembe. Ezt a konformációs keresést az egyes peptidvázak valamennyi pozíciójában lévő aminosavra megismételjük (amikor azok az egyes MHC II. osztályú molekulákkal vannak összekapcsolva).
Az MHC II. osztályú molekulák modelljei és a peptidligandum-konformációk (melyeket a peptidváz/oldallánc-konformációk fentebb ismertetett, nagyméretű adatbázisának átvizsgálása révén, kísérleti úton kell leszármaztatni) közötti kötődés energiájának becslésére megfelelő matematikai kifejezést alkalmazunk. Ennek megfelelően, egy protein lehetséges T-sejt-epitópok jelenlétére történő átvizsgálása céljából az összes lehetséges, 9 és 20 aminosav között változó hosszúságú pepiidet (bár a peptidhosszúságot az egyes átvizsgálások során állandóként tartjuk) az alábbi számításoknak vetjük alá: Kiválasztunk egy MHC II. osztályú molekulát (az adott molekulára megengedett peptidvázzal együtt, és erre ráültetjük a kívánt peptidszekvenciának megfelelő oldalláncokat. A peptidváz egy bizonyos pozíciójában elhelyezkedő konkrét oldalláncra vonatkozó atomazonossági és atomközi távolsági adatokat az adott aminosav minden egyes (fentebb leírt adatbázisból származó) megengedett konformációjára összegyűjtjük; ezt a peptidváz mentén minden egyes oldalláncra megismételjük, és pontszám-előállító függvény alkalmazásával peptidpontszámokat származtatunk le. Az adott peptidvázra kapott legjobb pontszámot megtartjuk, és az eljárást a kiválasztott modell valamennyi megengedett peptidvázára megismételjük. A megengedett peptidvázakra kapott pontszámokat összehasonlítjuk, és a legnagyobb pontszámot tekintjük a szóban forgó MHC II. osztályú modellben a kívánt peptid peptidpontszámának. Ezt az eljárást mindegyik modell esetében - az átvizsgálás alatt álló proteinből származó - minden egyes lehetséges pepiidre megismételjük, és a modellek függvényében megjelenítjük a peptidpontszámokat.
A találmány szerinti megoldás értelmében a kötési affinitási számításra prezentált minden egyes ligandum egy pepiidből vagy proteinből fentebb leírtak szerint kiválasztott aminosav-szegmens. Ennek megfelelően, a ligandum egy ismert szekvenciájú pepiidből, polipeptidből *· ·*· *· ** · *
-28vagy proteinből származó, kb. 9-20 aminosav hosszúságú, kiválasztott szakasz. A ligandumot a peptidváz-könyvtárból származó peptidvázra ráültetett, vizsgálni kívánt peptid egymás utáni aminosavai formájában - az MHC II. osztályú molekulák modellkönyvtárából származó MHC II. osztályú molekula kötőbarázdájában a peptidváz alfa-szénatomjainak koordinátái, és az egyes oldalláncokra megengedett - a megengedett konformációk adatbázisából kiválasztott konformáció alapján helyezzük el. Ebből az adatbázisból visszakeressük a releváns atomazonosságokat és atomközi távolságokat is, és ezeket felhasználjuk a peptidkötődési pontszám kiszámítására. Az MHC II. osztályú kötőzsebhez nagy kötődési affinitást mutató ligandumokat helyspecifíkus mutagenezisre kiszemelt célpontokként megjelöljük. A megjelölt („flagged”') ligandumokban (s így a vizsgált proteinben) aminosav-szubsztitúciókat hajtunk végre, melyeket a pontszám-előállító függvény alkalmazásával ismételt tesztelésnek vetünk alá, hogy meghatározzuk azokat a változásokat, amelyek a kötési affinitást egy előre meghatározott küszöbérték alá csökkentik. Ezeket a változásokat azután - a T-sejt-epitópok eltávolítása érdekében - beiktathatjuk a kérdéses proteinbe. A peptidligandum és az MHC II. osztályú molekulák kötőbarázdája közötti kötődés nem kovalens kölcsönhatásokkal valósul meg, ideértve, többek között, a hidrogénkötéseket, elektrosztatikus kölcsönhatásokat, hidrofób (lipofil) kölcsönhatásokat és Van dér Waals-féle kölcsönhatásokat. Ezeket az alábbiakban leírtak szerint foglalhatjuk a peptidpontszám-előállító függvénybe. A hidrogénkötést nem kovalens kötésnek kell tekinteni, amely poláros vagy töltéssel bíró csoportok között alakul ki, és két másik atom által közösen birtokolt hidrogénatomból áll.
A hidrogéndonor hidrogénatomja pozitív töltésű, míg a hidrogénakceptor részlegesen negatív töltéssel bír. A peptid/protein kölcsönhatásokat illetően a hidrogénkötés-donorok nitrogénatomok, amelyekhez hidrogénatom kapcsolódik, vagy olyan hidrogénatomok, amelyek oxigénatomhoz vagy nitrogénatomhoz kapcsolódnak. A hidrogénkötés akceptoratomja hidrogénatomhoz nem kapcsolt oxigénatom, kapcsolt hidrogénatomot nem tartalmazó nitrogénatom (egy vagy két kapcsolódással) vagy kénatom, csak egy kapcsolódással. Bizonyos atomok, mint pl. a hidrogénatomokhoz kapcsolt oxigénatomok vagy az imin-nitrogének (pl. C=NH) egyaránt lehetnek hidrogénakceptorok vagy -donorok. A hidrogénkötés energiája 3-7 Kcal/mol, vagyis sokkal erősebb, mint a Van dér Waals-féle kölcsönhatás, de gyengébb, mint a kovalens kötés. Ezen túlmenően, a hidrogénkötések nagymértékben irányfüggők, és akkor a legerősebbek, ha a donoratom, a hidrogénatom és az akceptoratom egy egyenesbe esik. Az elektrosztatikus kötések ellentétes töltésű ionok között jönnek létre, és a kölcsönhatás erőssége fordítottan arányos az atomok közötti távolság négyzetével (a Coulomb-törvénynek megfelelően). Az ionpárok
-29közötti optimális távolság körülbelül 2,8 A. A protein/peptid kölcsönhatásokban elektrosztatikus kötések az arginin, hisztidin vagy lizin és aszparaginsav vagy glutaminsav között alakulhatnak ki. A kötés erőssége az ionizáló csoport pKa-értékétől és a közeg dielektromos állandójától függ, bár hozzávetőlegesen hasonló erősségűek a hidrogénkötéssel. A lipofil kölcsön5 hatások kedvező hidrofób-hidrofób kölcsönhatások, amelyek a protein és a peptidligandum között alakulnak ki. Az ilyen kölcsönhatások rendszerint a pepiid - kötőbarázda zsebeibe besüllyedt - hidrofób aminosav-oldalláncai között alakulnak ki, amelyek nem érintkeznek az oldószerrel. A hidrofób aminosavak oldószerrel történő érintkeztetése nagyon kedvezőtlen, mivel a környező oldószermolekulák egymással hidrogénkötések kialakítására vannak kényszerülő ve, miáltal ketrecszerű klatrát-struktúrákat alkotnak. Az ebből eredő entrópiacsökkenés igen kedvezőtlen. A lipofil atomok kénatomok (amelyek sem nem polárosak, sem nem hidrogénakceptor tulajdonságúak) vagy szénatomok lehetnek, amelyek nem polárosak. A Van dér Waals-féle kölcsönhatások az egymástól 3-4 A távolságra elhelyezkedő atomok között kialakuló, nem specifikus kötőerők - gyengébbek és kevésbé specifikusak, mint a hidrogénkötések 15 és az elektrosztatikus kötések. Az elektronok töltéseloszlása az atomok körül időbeni változást mutat és - bármely pillanatban - nem szimmetrikus. Az elektrontöltés ezen átmeneti aszimmetriája a szomszédos atomokban hasonló aszimmetriát indukál, és az atomok között kialakuló vonzóerők a Van dér Waals-féle kötőtávolságban érik el maximális értéküket, de körülbelül 12 A atomtávolságnál ugrásszerűen lecsökkennek. Ezzel szemben, minthogy az atomokat az 20 érintkezési távolságnál kisebb távolság választja el, az atomok külső elektronfelhőinek átfedésével egyre nagyobb taszítóerők válnak dominánssá. Bár a vonzóerők az elektrosztatikus kötéshez és hidrogénkötéshez viszonyítva viszonylag gyengék (kb. 0,6 Kcal/mol), a taszítóerők különösen fontosak lehetnek annak megállapításában, hogy egy peptidligandum sikeresen kötődik-e egy proteinhez.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a kötési állandó megbecslésére a
Böhm-féle pontszám-előállító függvényt („SCORE1” módszer) alkalmazzuk [Id. Böhm, H.J.: J. Comput. Aided Mol. Des. 8(3), 243 (1994), melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk], A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a pontszám-előállító függvényt („SCORE2” módszer) - T-sejt-epitópot tartalmazó ligandum indikátoraként - a kötési affinitás megbecslésére alkalmazzuk [Böhm, H.J.. J. Comput. Aided Mol. Des. 12(4). 309 (1998), melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk]. Mindazonáltal, a fenti cikkekben leírt Böhm-féle pontszám-előállító függvényeket egy protein liganduma kötési affinitásának olyan esetekben történő megbecslésére alkalmazzák, amikor ismert, hogy a ligandum sikeresen kötő-30dik a proteinhez, és a protein/ligandum komplex szerkezete megoldott, mely megoldott szerkezet megtalálhatóa Protein Adatbankban. Ilyenformán, a pontszám-előállító függvényt ismert pozitív kötési adatok alapján fejlesztették ki. A pozitív és negatív kötőmolekulák megkülönböztetése érdekében az egyenletbe egy taszítási tagot kell foglalni. Ezenfelül, a lipofíl kölcsönhatások páronkénti kiszámításával a kötési energia kielégítőbb pontosságú megbecslése érhető el, mint a fenti Böhm-függvények területalapú energia-kifejezéseinek alkalmazásával. Ennek megfelelően, az egyik előnyös megvalósítási mód értelmében a kötési energiát módosított Böhm-féle pontszám-előállító függvény alkalmazásával becsüljük meg. A módosított Böhmféle pontszám-előállító függvénnyel a protein és ligandum közötti kötési energiát (AGkötés) a következő paraméterek figyelembe vételével határozzuk meg: a ligandum összes transzlációs és rotációs entrópia-veszteségének betudható kötési energiacsökkenés (AG0); hozzájárulások az ideális hidrogénkötésekből (AGhk), ahol legalább egy partner semleges; hozzájárulások a zavartalan ionos kölcsönhatásokból (AGionos); lipofíl ligandumatomok és lipofíl akceptoratomok közötti lipofíl kölcsönhatások (AGiipo); a kötési energia vesztesége a ligandum belső szabadságfokainak befagyasztása miatt, vagyis az egyes C-C kötések körüli elfordulás szabadságának csökkenése (AGrot); a protein és a ligandum közötti kölcsönhatás energiája (Ev<iw). E tagok megfelelő elrendezésével az 1. egyenlethez jutunk:
(AGketés)-(AG0)+(AGhkxNllk)+(AGionosxNionos)+(AGiip0xNiipo)+(AGrotxNrot)+(EvdW) amelyben „N” egy adott tagra a kvalifikáló kölcsönhatások száma; és - az egyik megvalósítási módban - AGo, AGhk, AGionos, AGiipo és AGrot állandók, melyek értéke, sorrendben, a következő: 5,4; -4,7; -4,7; -0,17; 1,4.
Az „Nhk” tag a 2. egyenlettel számítható ki:
Nhk ^h-kötésekf(AR, Δα) X f(NSZOmsz) X fpcs ahol „f(AR, Δα)” egy büntetési függvény, amely számot ad a hidrogénkötések ideálistól való nagy eltéréseire, és amely a következő, 3. egyenlettel számítható ki:
f(AR, Δα) = fl(AR) x £2(Δα) ahol fi(AR) = 1; ha AR < TOL vagy = 1-(AR-TOL)/0,4; ha ΔΚ < 0,4+TOL vagy = 0; ha AR > 0,4+TOL;
és β(ΔΚ) = 1; ha Δα < 30° TOL vagy = 1-(Δα-30)/50; ha Δα < 80° vagy - 0; ha Δα > 80°
-31 „TOL” jelentése: a hidrogénkötés hosszúságának tolerált eltérése = 0,25 A;
„AR” jelentése: a H-O/N hidrogénkötés hosszúságának ideális értéktől való eltérése = 1,9 A;
„Δα” jelentése: Az N/O-H... OZN hidrogénkötés szögének ideális 180°-tól való eltérése;
az „f(NszomsZéd)” tag megkülönbözteti egy protein felületének konkáv és konvex részeit, s ezáltal nagyobb súlyt rendel a zsebekben található poláros kölcsönhatásokhoz, mint a protein felületén találhatókhoz (ezt a függvényt az alábbi, 4. egyenlet szerint számítjuk ki):
f(NSZOmszéd) (Nszomszéd/Nszomszéd,o) , ahol a 0,5, „Nszomszéd” jelentése: a protein azon nem hidrogén atomjainak száma, amelyek a protein bármely adott atomjához 5 A-nél közelebb helyezkednek el;
„NszomsZéd,o” egy állandó, értéke; 25;
„fpcs” jelentése: olyan függvény, amely számításba veszi a poláris érintkezési felület hidrogénkötésenkénti területét, s ezáltal különbséget tesz az erős és gyenge hidrogénkötések között - értékét a következő kritériumok alapján határozzuk meg:
fpcs β, ha Apoiáros/Νκκ < 10 A2; vagy fpcs 1, ha Apoiáros/Νπκ > 10 A , „Apouros” jelentése: a poláros protein-ligandum érintkezési felület mérete;
„Nhk” jelentése: a hidrogénkötések száma;
β jelentése: állandó, amelynek értéke: 1,2.
A Böhm-féle módosított pontszám-előállító függvény teljesítése érdekében az ionos kölcsönhatásokból származó hozzájárulást a hidrogénkötésekre fentebb leírtak szerint számítjuk ki (mivel hasonló geometria-függőséget feltételezünk).
Az „Niipo” tagot a következő, 5. egyenlet szerint számítjuk ki:
Niipo = Lilául);
amelyben az f(riL) tagot az összes lipofil ligandumatomra (1) és az összes lipofil proteinatomra (L) a következő kritériumok alapján számítjuk ki:
f(r1L) = 1, ha r1L < Rlf(r1L)=(r1L-Rl)/(R2-Rl), ha R2 <r1L>Rl;
f(riL) = 0, ha r]L > R2;
ahol RI =^ + ^+0,5; és
R2 =R1 +3,0; és „nvdw” jelentése: az „1” atom Van dér Waals rádiusza;
„rtvdw” jelentése: az „L” atom Van dér Waals rádiusza;
-32„Nrot” jelentése: az aminosav-oldallánc elforgatható kötéseinek száma, melyet a nem ciklusos sp3-sp3 és sp3-sp2 kötések számának veszünk (a terminális -CH3 vagy -NH3 csoportok elforgatását nem vesszük figyelembe).
A pontszám-előállító függvény utolsó tagja, az „EVdW”, a 6. egyenlet szerint számítható ki:
Vdw - ειε2((π +r2 ) /r — (η +r2 ) /r ;
ahol Ei éss2: az adott atomtól függő állandók;
rivdw+r2 vdw: Van dér Waals atomrádiuszok;
r = egy atompár közötti távolság.
A 6. egyenletben, az egyik megvalósítási mód szerint, az Sí és ε2 állandók a következő atomi értékek: szén (C): 0,245; nitrogén (N): 0,283; oxigén (O): 0,316; kén (S): 0,316. Az 5. és 6. egyenlet vonatkozásában, a Van dér Waals atomrádiuszok a következő atomi értékek: C: 1,85; N: 1,75; O: 1,60; S: 2,00 A.
Megjegyezzük, hogy a fenti egyenletekben megadott valamennyi előre meghatározott érték és állandó a protein-ligandum kölcsönhatások ismeretének jelenlegi állásának megfelelően van meghatározva (különös tekintettel a általunk végzett számítás típusára). Ennek megfelelően, lehetséges, hogy e pontszám-előállító függvény további finomítása során ezek az értékek és állandók változhatnak, így bármely - a protein-ligandum kölcsönhatás kötési energiájának meghatározását illetően kívánatos eredményeket adó - numerikus érték alkalmazható, s ezek alkalmazása szintén a találmány igényelt oltalmi körébe tartozik.
Ahogy fentebb említettük, a pontszám-előállító függvényt az oldallánc-konformációk, atomazonosságok és atomközi távolságok adatbázisából kivont adatokra alkalmazzuk. A találmány céljaira az ezen adatbázisban található MHC II. osztályú molekulák száma: 42 modell + négy megoldott struktúra. Az eddigiek alapján érthető, hogy a találmány szerinti számítógépes eljárás konstrukciójának moduláris természete azt jelenti, hogy - a fentiekben ismertetett peptidpontszám-előállító függvénnyel feldolgozható újabb adathalmazok létrehozása céljából új modellek egyszerűen hozzáadhatok és a peptidváz-könyvtárral és oldallánc-konformációs keresőfüggvénnyel átvizsgálhatok. Ez lehetővé teszi az átvizsgált MHC II. osztályú molekulák repertoárjának egyszerű növelését, illetve szerkezetek és azokhoz kapcsolódó adatok helyettesítését (ha adatok állnak rendelkezésre a létező allélok pontosabb modelljeinek létrehozására).
A találmány szerinti prediktív eljárás nagyszámú pepiidből álló adathalmazzal szemben kalibrálható, mely peptidek különböző MHC II. osztályú molekulákra vonatkozó affinitása ko
-33 rábban kísérleti úton meghatározásra került. A számított és a kísérletileg meghatározott adatok összehasonlításával olyan határérték állapítható meg, amely felett tudjuk, hogy valamennyi kísérletileg meghatározott T-sejt-epitóp pontosan van megjósolva.
Megjegyezzük, hogy - bár a fenti pontszám-előállító függvény a néhány hozzáférhető, kifinomult módszerhez képest viszonylag egyszerű - a számítások rendkívül gyorsan hajthatók végre. Tudni kell továbbá, hogy célunk nem a kiválasztott MHC II. osztályú protein kötőbarázdájába bekapcsolódott minden egyes pepiid valós kötési energiájának önmagában történő meghatározása, hanem az, hogy a T-sejt-epitópok elhelyezkedésének - kiválasztott protein elsődleges szerkezete (vagyis aminosav-szekvenciája) alapján történő - megjóslásának segédeszközeként összehasonlító kötési energia adatokat nyerjünk. Egy viszonylag nagy kötési energia (vagy egy kiválasztott küszöbérték feletti kötési energia) a ligandumban a T-sejt-epitóp jelenlétére utalhat. A ligandumot ezután legalább egy aminosav-szubsztitúciónak vethetjük alá, és ismét kiszámíthatjuk a kötési energiát. A számítások gyorsaságának köszönhetően a pepiid szekvenciájában végrehajtott manipulációk olcsó hardver felhasználásával, a program felhasználói interfészén belül interaktív módon hajthatók végre. Ilyenformán, a programhoz nincs szükség hardver-szintű beruházásokra.
Szakember számára kézenfekvő, hogy e célokra egyéb szoftverek is alkalmazhatók. Közelebbről, az energia-minimalizálással összefüggésben olyan, kifinomultabb szoftverek alkalmazhatók, amelyek alkalmasak a ligandumok protein kötőhelyekre történő beillesztésére. A beillesztő {„dokkoló”) szoftverek példái a következők: „DOCK” [Kuntz és mtsai.: J. Mól. Bioi. 161. 269 (1982); „LUDI” [Böhm: J. Comput. Aided Mol. Des. 8, 623 (1994)] és „FLEXX” [Rarey és mtsai.: ISME 3, 300 (1995)]. A molekuláris modellező és manipulációs szoftverek példáiként az „AMBER” (Tripos) és a „CHARMm” (Molecular Simulations, Inc.) említhető. E számítástechnikai eljárások alkalmazása - a megfelelő számítások elvégzéséhez szükséges adatfeldolgozási idő hosszúsága miatt - jelentős mértékben korlátozhatja a találmány szerinti eljárás teljesítményét, azonban e módszereket ésszerűen „másodlagos szűrőként” alkalmazhatjuk azon peptidek kötési energiájának még pontosabb kiszámítására, amelyeket a találmány szerinti eljárással „pozitív kötöképességűnek” találtunk. A kifinomult molekuláris mechanikai vagy molekuláris dinamikai számítások feldolgozási idejének korlátját az e számítások elvégzésére használt szoftver típusa, illetve a hardver jelenlegi technológiai korlátjai határozzák meg. A jövőt illetően az várható, hogy az ilyen számítások - hatékonyabb számítógépes kód kifejlesztése és a számítógép-processzorok sebességének folyamatos növekedése révén kezelhetőbb időkeretben lesznek végrehajthatók.
-34A makromolekulákra alkalmazott energiafuggvényeket, valamint az összehajtogatódott proteinszerkezeten belül potenciálisan bekövetkező, különféle kölcsönhatásokra vonatkozó megfontolásokat illetően Id. Brooks és mtsai.: J. Comput. Chem. 4, 187 (1983), míg az általános protein-ligandum kölcsönhatásokkal kapcsolatos további információkat illetően Id. Dauber-Osguthorpe és mtsai.: Proteins 4(1), 31 (1988), mely forrásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni. További hasznos alapvető információk találhatók, például, a „Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation” című kiadványban (szerk.: Fasman, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9).
Az alábbi példákban a találmány részletesebben is bemutatjuk.
2. példa
A 165 aminosav hosszúságú INFa2 szekvenciát in silico elemeztük, nagyjából az 1. példában bemutatott eljárás alkalmazásával. 57 darab 13-tagú pepiid panelját állítottuk elő, és elemeztük azokat humán II. osztályba tartozó MHC molekulákhoz való in vitro kötőképességükre. A peptidek szekvenciáját az 5. ábrán mutatjuk be.
Az II. MHC osztályba tartozó szintetikus peptidek kötési vizsgálati eljárását hajtottuk végre ismert HLA-DR allotípusú humán limfoblasztoid B-sejtek alkalmazásával. A sejteket paraformaldehiddel rögzítettük, és inkubáltuk vagy egyedül biotinilált peptidekkel, vagy nem biotinilált versengő pepiiddel az IC5o-értékek meghatározására. A peptidekkel történő inkubálást követően a sejteket lizáltuk, és az II. osztályba tartozó MHC molekulákat befogtuk az LB3.1 jelű anti-HLA-DR a-láncú monoklonális ellenanyaggal. A megkötődött biotinilált peptidet sztreptavidin-peroxidázzal detektáltuk, és a kötött peptid mennyiségét luminiszcenciás leolvasással határoztuk meg.
Kompetitív kötési vizsgálati eljárásokat végeztünk, amelyekben nem biotinilált tesztpeptideket inkubáltunk a rögzített sejtekkel a biotinilált versengő peptid jelenlétében. A versengő peptideknek korábban meghatározott IC5o-értékük volt az adott jelentőséggel bíró allotípus iránt, amelyet egyszerű nem kompetitív vizsgálati eljárás alkalmazásával határoztunk meg. Az IC50-érték a nem jelzett pepiidnek az a koncentrációja, amely megakadályozza a jelzett peptid 50%-ának a kötődését. A biotinilált peptid koncentrációját kísérletesen határoztuk meg, hogy legalább egyhatoda legyen a mért ED50-értéknek (a peptid azon koncentrációja, amely a maximális válasz felét adja) az egyes allélek esetében, így biztosítva, hogy a gátlás elsősorban a versengő peptid kötési tulajdonságait méri.
Az EBV-vel transzformált humán B-limfoblasztoid sejtvonalakat az ECACC-tól (Salisbury, UK) szereztük be. HOM-2 sejteket alkalmaztunk a DRB 1*0101-kötés mérésére;
-35 WT51 sejteket alkalmaztunk a DRB 1*0401-kötés mérésére és MOU (MANN) sejteket alkalmaztunk a DRB1 *0701-kötés mérésére. Az LB3.1 egér hibridómát az „American Tissue Culture Collection”-tól (ATCC, Virginia, USA) szereztük be. Az Enhanced Chemiluminescent (ECL) reagenst az Amersham Pharmacia cégtől (Amersham, UK) vásároltuk. Az RPMI 1640 tápközeget, L-glutamint és penicillin/sztreptomicint a Life Technologies cégtől (Paisley, UK) szereztük be. Az Optiplate™ mikrotiterlemezeket a Packard cégtől (Pangboume, England) szereztük be. A biotinilált peptideket a Babraham Tech cégtől (Cambridge, England), és a nem biotinilált peptideket a Pepscan Systems cégtől (Lelystad, The Netherlands) szereztük be. A Prosep A-t a Millipore cégtől (Watford, UK) szereztük be. A DAB, PMSF, jódacetamid, benzamidin, leupeptin, pepsztatin, PBS-tabletta, DMSO, BSA, sztreptavidin-peroxidáz konjugátum és más vegyszerek a The Sigma Chemical Company cégtől (Poole, UK) származtak.
A limfoblasztoid sejteket RPMI-1640 tápközegben tenyésztettük, kiegészítve 10% magzati marhaszérummal (FBS), L-glutaminnal és penicillin/sztreptomicinnel párásított atmoszférában 37 °C-on 5% CO2-ben. Az LB3.1 hibridóma sejteket RPMI-1640 tápközegben tenyésztettük, kiegészítve 10% magzati marhaszérummal (FBS), L-glutaminnal és penicillin/sztreptomicinnel párásított atmoszférában 37 °C-on 5% CO2-ben, és LB3.1 ellenanyagot tisztítottunk a tenyészet felülúszójából. A felülúszót átszűrtük 0,22, pm-es szűrők alkalma zásával, majd azután 50 ml IM Tris pH 8,0 puffért adtunk 450 ml-enként, 0,1 M puffereit oldatot előállítva. A puffereit felülúszót azután átengedtük 3 ml-es PROSEP-A oszlopon éjszakán keresztül 4 °C-on, és megmostuk 25 ml PBS-sel. Az LB3.1 ellenanyagot 8 ml 0,1 M pH 3,0 citrát-puffer alkalmazásával eluáltuk, és 0,5 ml-es frakciókat gyűjtöttünk 500 pl 1 M Tris-HCl pH 8,0 pufferbe. Az egyes frakciók fehérjetartalmát spektrofotométer alkalmazásával határoztuk meg (A280nm). A frakciókat összeöntöttük, és dializáltuk 800 ml PBS-sel szemben, SlideA-Lyser 3.5K (Pierce) alkalmazásával. Az LB3.1 tisztaságát redukáló SDS-PAGE-vel és Coomassie festéssel ellenőriztük.
Az egyes peptid/allotípus kombinációk kötési vizsgálati eljárását három párhuzamosban hajtottuk végre 96-mérőhelyes lapos fenekű Optiplates™ és 2 x 106 sejt/mérőhely alkalmazásával. A sejteket kétszer megmostuk RPMI-1640 tápközeggel, majd azután rögzítettük 0,5% paraformaldehid/PBS oldattal 30 percen keresztül jégen. RPMI-1640 tápközeggel történő két mosást követően a sejteket inkubáltuk vagy biotinilált peptiddel, vagy biotinilált peptiddel és nem biotinilált versengő peptiddel, vagy peptid nélkül. Az inkubálást peptidkötő pufferrel (100 mM citrát/foszfát puffer, pH 4,5, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 100 pM leupeptin, 1 mM i
*- * ··#'* t-** -t'-* · ·>*
-36jódacetamid, 100 μΜ pepsztatin-A, 1 mM benzamidin) végeztük 37 °C-on 24 órán keresztül. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, majd azután 80 μΐ felülúszót eltávolítottunk, és helyettesítettük 80 μΐ/mérőhely NP40 lízispufferrel (0,5% NP40, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 100 μΜ leupeptin, 1 mM jódacetamid, 100 μΜ pepsztatin-A, 1 mM benzamidin, 50 mM TrisHC1, pH 8,0). A sejteket 4 °C-on inkubáltuk 45 percen keresztül, és feltisztított lizátumot állítottunk elő centrifugálással. 50 μΐ (három párhuzamos mintánként) lizátumot adtunk az 50 μΐ PBS/5% BSA puffért tartalmazó, előre bevont 96-mérőhelyes mikrotiterlemezek mindegyik mérőhelyéhez. Az összes kísérletben az előre történő bevonást a megelőző éjjel végeztük, amikor a mikrotiterlemezeket előkezeltük 4 °C-on 100 μΐ/mérőhely LB3.1 anti-II. osztályú ellenanyaggal, 20 pg/ml-re hígítva PBS-ben. A felesleges ellenanyagot eltávolítottuk a lemezről, és blokkoltuk azt 250 μΐ/mérőhely PBS/5% BSA pufferrel 2 órán keresztül szobahőmérsékleten. Mindegyik lemezt 7-szer megmostuk PBS/1% Tween pufferrel, és 50 μΐ PBS/5% BSA/0,5% NP40 puffért adtunk az egyes mérőhelyekhez a sejtlizátumok hozzáadását megelőzően. A lizátumok hozzáadását követően a lemezeket 4 °C-on inkubáltuk 2 órán keresztül, majd 7-szer megmostuk azokat PBS/0.1% Tween pufferrel. 100 μΐ, PBS/5% BSA/0,1% Tween pufferben 1:1000 arányban hígított sztreptavidin-peroxidáz konjugátumot adtunk az egyes mérőhelyekhez, és a lemezeket 4 °C-on inkubáltuk 1 órán keresztül. A lemezeket 7-szer megmostuk PBS/0,1% Tween pufferrel, és 100 pl kemilumineszcens szubsztrátot (Amersham Pharmacia) adtunk az egyes mérőhelyekhez. A lemezeket Perkin Elmer MicroBeta® TriLux mikrotiterlemez-leolvasó alkalmazásával olvastuk le, és az eredményeket CPS-ben adtuk meg.
A kompetitív elemzésben a biotinilált pepiid maximális kötődését a versengő peptid nélkül mért kötődéssel (CPS) definiáltuk, és a gátlást pedig az alábbi képlettel:
% gátlás = 100 x [(CPS versengő peptid nélkül) - (CPS versengő pepiiddel)] / [CPS versengő peptid nélkül]
A versengő pepiidnek a biotinilált peptid maximális kötődésének 50%-át eredményező koncentrációját vettük az ICso-ertéknek.
A 13-tagú peptidek 5. ábrán bemutatott panelján végzett kötési vizsgálati eljárás eredményét a 6a-6d. ábrákon mutatjuk be. A 6d. ábrán bemutatott peptidek kivételével az összes peptid kötési kölcsönhatást mutat a tesztelt II. osztályba tartozó MHC allotípusok közül eggyel vagy többel.
3. példa
Az MHC, pepiid és T-sejt-receptor (TCR) közötti kölcsönhatás a szerkezeti alapja a Tsejtes felismerés antigén-specifitásának. A T-sejt-proliferációs vizsgálati eljárások a peptidek MHC-hez történő kötődését tesztelik, valamint az MHC/peptid komplexek TCR általi felismerését. Az ezen példa szerinti T-sejt-proliferációs vizsgálati eljárások antigénprezentáló sejteket (APC) és T-sejteket tartalmazó perifériás mononukleáris sejtek (PBMC) stimulációját foglalják magukban. A stimulálást in vitro hajtjuk végre szintetikus peptid-antigének alkalmazásával, és bizonyos kísérletekben egész fehérje-antigénnel. A stimulált T-sejtek proliferációját 3H-timidin (3H-Thy) alkalmazásával mérjük, és a beépült 3H-Thy jelenlétét mosott rögzített sejtek szcintillációs számlálásával határozzuk meg.
Kevesebb, mint 12 órán keresztül tárolt humán vérből származó „bufíy coat”-okat szereztünk be a National Blood Service-tői (Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK). A „Ficollpaque”-ot az Amersham Pharmacia Biotech cégtől (Amersham, UK) szereztük be. Az elsődleges humán limfociták tenyésztésére szolgáló szérummentes AIM V tápközeget — amely Lglutamint, 50 pg/ml sztreptomicint, 10, pg/ml gentomicint és 0,1% humán szérumalbumint tartalmaz — a Gibco-BRL cégtől (Paisley, UK) szereztük meg. A szintetikus peptideket az Eurosequence (Groningen, The Netherlands) és a Babraham Technix cégtől (Cambridge, UK) szereztük be.
Eritrocitákat, leukocitákat és vérlemezkéket választottunk el plazmából a „buffy coat” óvatos centrifugálásával. A felső fázist — amely plazmát és vérlemezkéket tartalmaz — eltávolítottak és eldobtuk. Az eritrocitákat és leukocitákat 1:1 arányban meghígítottuk foszfátpufferelt sóoldatban (PBS), mielőtt 15 ml „ficoll-paque”-ra (Amersham Pharmacia, Amersham UK) rétegeztük azokat. A centritagálását a gyártók által ajánlott körülmények között végeztük. A PBMC-ket a szérum+PBS/”ficoll paque” határfelületről gyűjtöttük be. A PBMC-ket összekevertük PBS-sel (1:1), és centrifugálással összegyűjtöttük. A felülúszót eltávolítottak és eldobtuk, és a PBMC csapadékot újra felszuszpendáltuk 50 ml PBS-ben. A sejteket újból lecentrifugáltuk, és a PBS felülúszót eldobtuk. A sejteket újra felszuszpendáltuk 50 ml AIM V tápközeg alkalmazásával, és ennél a pontnál megszámláltuk, és az életképességüket tripánkékfestékkizárási vizsgálati eljárással meghatároztuk. A sejteket újból lecentrifugáltuk, és a felülúszót eldobtuk. A sejteket 3 x 107/ml sűrűségben újra felszuszpendáltuk a fagyasztva tárolás céljából. A tárolási közeg 90% (v/v) hővel inaktivált AB humán szérum (Sigma, Poole, UK) és 10% (v/v) DMSO (Sigma, Poole, UK) volt. A sejteket átvittük egy szokásos szabályozott fagyasztóba (Sigma), és éjszakán keresztül -70 °C-ra tettük. Amikor felhasználásra kerültek, a
-38 sejteket gyorsan felolvasztottuk 37 °C-os vízfürdőben, mielőtt 10 ml előmelegített AIM V tápközegbe tettük azokat.
A PBMC-t fehérjével és peptid-antigénekkel stimuláltuk 96-mérőhelyes lapos fenekű mikrotiterlemezen 2 x 105 PBMC/mérőhely sűrűség mellett. A PBMC-t 7 napon keresztül 5 ínkubáltuk 37 °C-on, mielőtt 3H-Thy-vel (Amersham-Phamacia, Amersham, UK) pulzáltuk. A jelen vizsgálathoz 3 aminosavnyi lépésekben átfedő (15-tagú) szintetikus peptideket állítottunk elő, amelyek lefedték az INFa2 teljes szekvenciáját. A peptidek sorszámát és szekvenciáját a 7. ábrán mutatjuk be. Az összes pepiidet egyedileg szkríneltük 20 naiv donorból izolált PBMCvel szemben. Két kontroll pepiidet, amelyekről korábban kimutattuk, hogy immunogének, és 10 egy hatásos, emlékezetet nem kiváltó antigént (KLH) alkalmaztunk mindegyik donor vizsgálati eljárásban.
Az ebben a vizsgálatban alkalmazott kontroll antigének az alábbiak voltak.
| Pepiid | Szekvencia |
| C-32 | Biotin-PKYVKQNTLKLAT Flu hemagglutinin 307-319 |
| C-49 | KWDQIKKISKPVQH Chlamydia HSP 60 peptid |
| KLH | Kürtőscsiga hemocianin teljes fehérje |
A peptideket DMSO-ban oldottuk fel 10 mM végkoncentrációban, és azután ezeket a törzsoldatokat 1/500 arányban hígítottuk AIM V tápközegben (20 μΜ végkoncentráció). A peptideket lapos fenekű 96-mérőhelyes mikrotiterlemezekbe adtuk 2 és 20 μΜ végkoncentrációban 100 μΐ térfogatban. A felolvasztott PBMC életképességét tripánkék-festékkizárási vizsgálati eljárással állapítottuk meg, és azután a sejteket újra felszuszpendáltuk 2 x 106 sejt/ml sű20 rűségben, majd 100 μΐ-t (2 x 105 PBMC/mérőhely) átvittünk a peptideket tartalmazó mérőhelyekbe. Három párhuzamosban készített tenyészeteket alkalmaztunk minden egyes peptidkoncentrációnál. A mikrotiterlemezeket 7 napon keresztül ínkubáltuk 5% CO2-t tartalmazó párásított atmoszférában 37 °C-on. A sejteket 18-21 órán keresztül pulzáltuk 1 pCi 3H-Thy/mérőhely jelenlétében, majd azután szűrőpadokon begyűjtöttük azokat. A CPM-értékeket Wallac microplate beta top plate counter számláló (Perkin Elmer) alkalmazásával határoztuk meg. Az eredményt stimulációs indexként fejeztük ki, amelyet az alábbi képlettel határoztunk meg:
-39 Proliferáció tesztpeptid hatására, CPM Proliferáció kezeletlen mérőhelyeken, CPM
A 2 vagy annál nagyobb értékű stimuláció s indexet tekintettük pozitív stimulációnak ebben a vizsgálati eljárásban. Az INFa2 szekvenciában lévő T-sejt-epitópok térképezése a Tsejt-proliferációs vizsgálati eljárás alkalmazásával három immunogenikus régió — RÍ, R2, R3 — azonosítását eredményezte. Ezt a T-sejt-proliferáció mérésével határoztuk meg 6 olyan donorban, amelyek reagáltak egy vagy több, ezekből a régiókból származó pepiiddel. A 3-as régió egy potenciális immundomináns T-sejt-epitópot tartalmaz, amint a proliferációt meghatároztuk a 6 közül 4 donorban, amelyek reagáltak az INFa2 peptidekkel. Az 1-es és 2-es régió T-sejt-proliferációt indukál bizonyos személyekben. A reagáló személyek összesített válaszreakcióit a 8. ábrán mutatjuk be, és az egyedi válaszadók adatait a 9. ábrán foglaljuk össze. Az egyedi donorok stimulációs indexeit a 15. ábrán mutatjuk be. Az INFo2 epitópadatait, és az RI, R2 és R3 régiókat az egyedi peptid/donor válaszokkal együtt a 10. ábrán mutatjuk be.
4. példa
A 3. példában alkalmazott PBMC-minták szövettípusait kereskedelmi forgalomban kapható reagenssel (Dynal, Wirral, UK) határoztuk meg. A vizsgálati eljárásokat a szállító által ajánlott protokollok szerint hajtottuk végre, és szokásos segédreagenseket és elektroforézisrendszereket alkalmaztunk. A DRB1 allélek allotípusos lefedettsége 70% volt a 20 tesztelt donorban. A szövettipizálás eredményét alkalmaztuk a specifikus II. osztályba tartozó MHC alléleket hordozó INFa2 peptidekkel reagáló donorok elemzésére. Egy adott peptid allotípusos korlátozottságát az alléinak a donorpopulációban mért gyakorisága és az ugyanazt az alléit expresszáló reagáló donorok száma alapján határozzuk meg. Ha egy peptid kapcsolódik egy adott allélhez, akkor a gyakorisága (amit százalékban adunk meg) várhatóan nagyobb, mint az alléi gyakorisága a populációban. Egy ilyen elemzés eredményét all. ábrán mutatjuk be. Általában a kis számok kizárják a precíz statisztikai elemzést, azonban az adatok az R3-ként definiált epitóprégióból származó peptidek lehetséges kapcsolódását jelzik a DRB4*01 allotípussal.
5. példa
Az MHC-peptid kötési vizsgálati eljárásokat olyan szintetikus peptidekkel hajtottuk végre, amelyek a 3. példában bemutatott biológiai vizsgálati eljárással azonosított fő immunogén régiókból származtak. Ezekben a vizsgálati eljárásokban szintetikus 15-tagú peptideket teszteltünk a három MHC allotípus kötésének a képességére, kompetícióban biotinilált versen
-40gő pepiiddel. A vizsgálati eljárásokat nagyjából a 2. példában részletezett módon hajtottuk végre, és az IC5o-értékeket versengő peptid és tesztpeptid hat különböző koncentrációarányánál felvett kötési görbékből számítottuk ki. Az egyes tesztelt peptid/allotípus kombinációk ICso-értékeit a 12a-12c. ábrákon mutatjuk be. Ezek az adatok azt jelzik, hogy a T-sejtek in vitro biológiai vizsgálati eljárásban történő proliferációjának stimulálására képes peptidek alacsony vagy magas affinitású II. osztályba tartozó MHC ligandumok lehetnek.
6. példa
Számos módosított INFa2 molekulát állítottunk elő hagyományos rekombináns DNS módszerek alkalmazásával. A vad típusú INFa2b gént humán méhlepény DNS-ből klónoztuk meg, és a gént kontroll reagensként és templátként alkalmaztuk, amely templátból módosított INFa2b géneket állítottunk elő helyspecifikus mutagenezissel. A vad típusú és módosított géneket eukarióta expressziós vektorba inzertáltuk, és a rekombináns INFa2 fehérjéket fúziós fehérjeként expresszáltattuk humán immunglobulin állandó régió doménnel. A rekombináns fehéréket tranziensen transzfektált humán embrionális vesesejtekből állítottuk el, és a 7. példában részletezett módon vizsgáltuk.
Röviden, a vad típusú INFa2b gént humán méhlepény DNS-ből (Sigma, Poole, UK) amplifikáltuk polimeráz-láncreakció (PCR) alkalmazásával. A gén nem tartalmaz intront, és könnyen amplifikálható az alább bemutatott OL177 és OL178 jelű elülső és hátulsó láncindítók alkalmazásával, amelyek restrikciós helyeket tartalmaznak a klónozás elősegítésére:
OL177 (EcoRI)
5’-CCGGAATTCGCTAGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCTGTGATCTGCCTCAA ACCC AC AGCC-3 ’
OL178 (XhoI/BamHI) ’-CCGGGATCCCTCGAGCTATTATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAG-3 ’
Az 550 bp hosszúságú PCR-terméket EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztettük, és a pLITMUS28 vektorba (NEB, UK Ltd.) klónoztuk. Számos pozitív klón elemzésével igazoltuk, hogy a szekvencia az interferon-alfa-2b szekvenciája. Annak érdekében, hogy, humán embrionális vesesejtekben expresszáltassuk, a vad típusú gént újraklónoztuk a pd-Cs vektorba [Lo és mtsai., Protein Engineering 11, 495. old. (1998)]. A pd-Cs vektor humán immunglobulin állandó régió domént tartalmazó fúziós fehérje expresszióját irányítja. Az ebbe a vektorba történő beklónozást PCR-rel és az OL232 és OL178 láncindítók alkalmazásával hajtottuk végre. Ezek a láncindítók az Xmal és BamHI enzimek révén klónozó helyeket tartalmaznak, amint alább bemutatjuk:
-41 OL232 (Xmal)
5’-CTGTCCCCGGGTAAATGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCC-3’
OLI78 (XhoI/BamHI) rtCCGGGATCCCTCGAGCT ATT ATTCCTT ACTTCTT AAACTTTCTTGC AAG-3 ’
Az 530 bp hosszúságú PCR-terméket Xmal és BamHI restrikciós enzimekkel emésztettük, és Qiagen gélextrakciós reagenskészlet alkalmazásával megtisztítottuk, és átvittük előre elkészített pd-Cs vektorba, amelyből az IFN(L) szekvenciát eltávolítottuk Xmal és BamHI enzim alkalmazásával. Kiválasztottunk egy pozitív kiónt, és szekvenálással igazoltuk az INFa2b szekvenciáját. A vad típusú INFa2b gént tartalmazó pd-Cs vektort pCIFN5-nek neveztük.
Módosított INF0.2 gének létrehozására szolgáló egyedi és többszörös mutációkat hajtottunk végre mutagenikus PCR-rel, a pCIFN5-öt alkalmazva templátként. Átfedő PCR-t alkalmaztunk az interferon-szekvencia két mutáltatott felének a kombinálására. Ezt a fragmenst azután beklónoztuk egy köztes vektorba (pGEM-T EASY vektor; Promega, UK) a szekvencia elemzéséhez, mielőtt átvittük a pd-Cs-ből származó expressziós vektorba az Xmal és BamHI enzimek alkalmazásával, amint azt fent leírtuk.
A mutagenezist az OL235 és OL234 jelű szegélyező láncindítókkal hajtottuk végre különálló reakciókban, együtt specifikus mutagenizáló (nem illeszkedő) láncindítókkal és a pCIFN5 templát DNS-sel.
OL234: 5’-CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC
OL23 5: 5’ -CACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC
A reakciókat az Expand HI Fidelity PCR reagens (Roche, GmbH) és az alábbi ciklussal megadott reakciókörülmények alkalmazásával hajtottuk végre:
°C/2’+ 25 ciklus @ 94 °C/30”, 60 °C/30”, 72 °C/30”+ 72 °C/10’
A különálló reakciók termékeit PCR-rel kapcsoltuk össze az OL235 és OL234 jelű láncindítók alkalmazásával, a fenti PCR 15 ciklusát alkalmazva.
A PCR-termékeket gélben tisztítottuk kereskedelmi forgalomban kapható reagenskészlet (Qiagen gél-extrakciós reagenskészlet) alkalmazásával. A termékeket T/A cloning system alkalmazásával a pGEM-T EASY vektorba (Promega, UK) klónoztuk be, és több kiónt megszekvenáltunk mindegyik esetben, hogy igazoljuk a kívánt mutáció sikeres beépítését.
-42A kívánt kiónokat BamHI és Xmal enzimekkel megemésztettük, és a megtisztított terméket az előkészített pd-Cs vektorba ligáltuk. A klónozást E. coli XLl-Blue sejtek (Strategene Europe) alkalmazásával hajtottuk végre, és azokat a szállító által ajánlott körülmények között tenyésztettük. A szekvencia igazolását elvégeztük az összes végső vektor-készítményen az OL261 és OL234 jelű láncindítók szekvenáló-láncindítóként történő alkalmazásával.
OL 261: 5’-GGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAG-3’
OL234: 5 ’-CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC-3 ’
A módosított INFa2-humán-IgFc fúziós fehérjék expresszáltatását HEK293 jelű humán embrionális vesesejtvonal expressziós gazdaként történő alkalmazásával végeztük. A transzfekcióra szolgáló összes DNS-t a nagy tisztaságú CONCERT midiprep system alkalmazásával állítottuk elő, a szállító (Invitrogen, Paisley, UK) által adott utasítások szerint. A DNSt szűrővel sterilizáltuk az alkalmazást megelőzően, és a mennyiségét az A26o érték mérésével határoztuk meg. A koncentrációkat 0,5-1,0 pg/μΙ értékűre állítottuk be.
A tranziens expresszió céljából a HEK293 sejteket D-MEM glutamax tápközeg (Invitrogen, Paisley, UK) alkalmazásával tenyésztettük, amely ki volt egészítve 10% FCS-sel és 250 pg/ml geneticinnel. A transzfektálást megelőzően a sejteket tripszines kezeléssel összegyűjtöttük, és megmostuk PBS alkalmazásával. Két mosási ciklus után a sejteket friss tápközegbe vittük át 4 x 105 sejt/ml sűrűség mellett, és szélesztettük mikrotiterlemezekre, amelyeket előkezeltünk poli-L-lizinnel, hogy biztosítsuk a jó sejttapadást. Tipikusan 2 x 105 sejtet adunk 48-mérőhelyes lemez mindegyik mérőhelyéhez, és a lemezeket éjszakán keresztül inkubáljuk 37 °C-on 5% CO2-ben.
A transzfektálást megelőzően a tápközeget lecseréljük mindegyik mérőhelyen, és hozzáadjuk a transzfekciós keveréket. A transzfektálást lipofektamin reagens és a szállító (Invitrogen, Paisley, UK) által adott utasítások alkalmazásával hajtjuk végre. Röviden, lipofektamint, OPTI-MEM tápközeget (Invitrogen, Paisley, UK) és mérőhelyenként 0,8 pg DN-t tartalmazó transzfekciós keverékeket állítunk elő mindegyik expressziós vektor konstrukció esetében. A transzfekciós keverékeket hozzáadjuk a sejtekhez, és a sejteket 4-6 órán keresztül inkubáljuk. A tápközeget helyettesítjük 0,5 ml friss tápközeggel, és a sejteket 37 °Con inkubáljuk 5% CO2-ben. Mintákat veszünk 48 óra elteltével anti-Fc ELISA és Daudi sejtproliferációs vizsgálati eljárások céljából. A tápközegeket 7 nap elteltével gyűjtjük be, és 4 °C-on tároljuk a további elemzésig.
-43 A tápközeget INFa2 jelenlétére vizsgáljuk, kereskedelmi forgalomban kapható ELISArendszer és a szállító (R & D systems, UK) által adott utasítások alkalmazásával. Bizonyos esetekben az INFa2 fúziós fehérje humán immunglobulin állandó régió doménjét detektáló ELISA-t alkalmaztunk. Ehhez a vizsgálati eljáráshoz egér anti-humán-IgG-Fc készítményt 5 (Sigma, Poole, UK) alkalmazunk befogó reagensként. Az INFa2-HuFc fúzió mennyiségét referencia humán IgG-készítmény (Sigma) hígítási sorozatának az alkalmazásával készített standard görbére vonatkoztatva határozzuk meg. A megkötődött INFa-Fc fúzió vagy a referenciafehérje mennyiségét anti-humán IgG-peroxidáz konjugátum (Sigma) és Sigma OPD kolorimetriás szubsztrát alkalmazásával detektáljuk.
A kondicionált HEK293 tápközegben lévő INFa2 mennyiségének a meghatározását követően a kondicionált tápközeget alkalmazzuk közvetlenül a módosított INFa2 funkcionális aktivitásának a tesztelésére, a 7. példában részletezett anti-proliferációs vizsgálati eljárás alkalmazásával.
7. példa
Teszteltük a találmány szerinti módosított interferon-molekulákat a képességükre a
Daudi humán B-sejtes limfóma-sejtvonal növekedésének gátlására. Az eljárás nagyjából azonos a korábban leírttal [Mark, D. F. és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666. old. (1984)], és a Daudi sejteknek a tesztelt interferonnal történő inkubálását foglalja magában. A tesztmolekula antiproliferatív hatását oldékony festékanyag alkalmazásával méljük, amely szín20 változáson megy keresztül proliferálódó sejtek jelenlétében. Az indukált színváltozást spektrofotométerben méijük, és az antiproliferatív hatást a nem kezelt kontroll sejtek és standard interferon-készítménnyel kezelt sejtek alkalmazásával mért színváltozásra vonatkoztatva számítjuk ki.
Röviden, Daudi sejteket (ATCC # CCL-213) tenyésztettünk RPMI 1640 tápközegben, 25 amely ki volt egészítve 100 egység/ml penicillinnel, 100 pg/ml sztreptomicinnel, 2 mM Lglutaminnal és 20% magzati borjúszérummal (FBS). Az összes tápközeget és kiegészítőt a Gibco cégtől (Paisley, UK) szereztük be. A vizsgálati eljárás elvégzését megelőző napon a sejteket friss tápközegbe helyeztük 0,9 x 106/ml sűrűségben, és a következő napon friss tápközegbe helyeztük, mint fent, azzal a kivétellel, hogy az 10% (v/v) FBS-t is tartalmazott. A sejt30 sűrűséget 2 x 105 sejt/ml-re állítottuk be.
A teszt és kontroll interferon-készítményeket 10% FBS-t tartalmazó RPMI tápközegbe hígítjuk. Hígításokat készítünk 96-mérőhelyes lapos fenekű mikrotiterlemezekbe, mérőhelyenként 100 μΐ/mérőhely mennyiségben, három párhuzamos mintával. Tipikusan felező hígításokat
-44készítünk az egyes lemezeken. A pozitív kontroll mérőhelyeket is három párhuzamosban készítjük, az interferon standard (NIBSC, South Mimms, UK) 10000 pg/ml kezdőkoncentrációjával. 100 μΐ tápközeget (interferon nélkül) tartalmazó kontroll mérőhelyeket is alkalmazunk. 100 μΐ sejtet adunk az egyes mérőhelyekhez, és a lemezeket 72 órán keresztül inkubáljuk 37 5 °C-on, 5% CO2-ben. A proliferációt az Aqueous One reagens-rendszer és a szállító (Promega,
Southampton, UK) által javasolt protokoll alkalmazásával állapítottuk meg. Röviden, 40 μΐ Aqueous One reagenst adunk az összes mérőhelyhez, és a szubsztrátot elkeveijük. A lemezeket 37 °C-on inkubáljuk egy órán keresztül, és azután átvisszük a lemezleolvasó készülékbe a fényelnyelés meghatározására. A leolvasást 490 nm-en végezzük. Az 490 nm-en mért átlagos 10 abszorbanciát ábrázoljuk az Y-tengelyen az X-tengelyen ábrázolt interferon-standard koncentráció függvényében.
Az interferon koncentrációját a 6. példában részletezett ELISA módszerek alkalmazásával határozzuk meg. A kapott kalibrációs görbét alkalmazzuk az egyes tesztminták ED5oértékének meghatározására.
A fenti eljárás szerinti ilyen elemzés eredményét több módosít ott INFa2 molekula esetében a 14. ábrán mutatjuk be. Az eredmények megtartott antiproliferatív tulajdonságokat mutatnak az INFa2 szekvenciájában végrehajtott aminosav-szubsztitúciók jelenlétében.
, ··· · * · ·♦· · ·»♦* ··<* *··* ·* ♦**
-45 A szekvencialistában található kötetlen szövegek fordításai
1. szekvencia: <223> INFa2 aminosav-szekvenciája <223> Xaa jelentése a 23. helyen Arg vagy Lys
2. szekvencia: <223> Az INFa2-ből származó elsődleges szekvencia összefüggő aminosavoldallánc-szakasza
3. szekvencia: <223> Az INFa2-ből származó elsődleges szekvencia összefüggő aminosavoldallánc-szakasza
4. szekvencia: <223> Az INFa2-ből származó elsődleges szekvencia összefüggő aminosavoldallánc-szakasza
5. szekvencia: <223> Csökkentett immunogenitású humán interferon-alfa-2 (INFa2) <223> Xaa jelentése a 23. helyen Arg vagy Lys <223> Xaa jelentése a 122. helyen Tyr vagy Glu vagy Gin <223> Xaa jelentése a 123. helyen Phe vagy His <223> Xaa jelentése a 126. helyen Ile vagy Ala <223> Xaa jelentése a 128. helyen Leu vagy Ala
6. szekvencia: <223> Csökkentett immunogenitású humán interferon-alfa-2 (INFa2) <223> Xaa jelentése a 23. helyen Arg vagy Lys <223> Xaa jelentése a 110. helyen Leu vagy Ser vagy Gly <223> Xaa jelentése a 111. helyen Met vagy Thr vagy Ser vagy Glu <223> Xaa jelentése a 116. helyen Ile vagy Ser vagy Gin <223> Xaa jelentése a 117. helyen Leu vagy Gly <223> Xaa jelentése a 122. helyen Tyr vagy Glu vagy Gin <223> Xaa jelentése a 123. helyen Phe vagy His <223> Xaa jelentése a 126. helyen Ile vagy Ala <223> Xaa jelentése a 128. helyen Leu vagy Ala <223> Xaa jelentése a 153. helyen Leu vagy Ser
7. szekvencia: <223> Csökkentett immunogenitású humán interferon-alfa-2 (INFa2) < 223> Xaa jelentése a 23. helyen Arg vagy Lys < 223> Xaa jelentése a 63. helyen Ile vagy Thr < 223> Xaa jelentése a 64. helyen Phe vagy Asp vagy Ala < 223> Xaa jelentése a 66. helyen Leu vagy Ala < 223> Xaa jelentése a 67. helyen Phe vagy Asp vagy Glu < 223> Xaa jelentése a 76. helyen Trp vagy His < 223> Xaa jelentése a 84. helyen Phe vagy Asp vagy Glu < 223> Xaa jelentése a 85. helyen Tyr vagy Ser < 223> Xaa jelentése a 89. helyen Tyr vagy Asp vagy Glu vagy Asn
8. szekvencia: <223> Csökkentett immunogenitású humán interferon-alfa-2 (INFa2) < 223> Xaa jelentése a 23. helyen Arg vagy Lys < 223> Xaa jelentése a 63. helyen He vagy Thr < 223> Xaa jelentése a 85. helyen Tyr vagy Ser < 223> Xaa jelentése a 89. helyen Tyr vagy Asp vagy Glu vagy Asn
9. szekvencia: <223> Csökkentett immunogenitású humán interferon-alfa-2 (INFo.2) <223>
<223>
<223>
<223>
<223>
Xaa jelentése a 23. helyen Arg vagy Lys
Xaa jelentése a 26. helyen Leu vagy Pro
Xaa jelentése a 27. helyen Phe vagy Ser
Xaa jelentése a 38. helyen Phe vagy Glu
Xaa jelentése a 55. helyen Vai vagy Ala
10. szekvencia: <223> Flu hemagglutinin 307-319. peptidből származó °C-32 kontroll anti- gén.
<223> P jelentése az 1. helyen biotinilált prolin
11. szekvencia: <223> Chlamydia HSP 60 pepiidből származó C-49 kontroll antigén
12. szekvencia: <223> OL177 (EcoRI) jelű láncindító
13. szekvencia: <223> OL178 (XhoI/BamHI) jelű láncindító
14. szekvencia: <223> OL232 (Xmal) jelű láncindító
15. szekvencia: <223> OL234 jelű láncindító
16. szekvencia: <223> OL235 jelű láncindító
17. szekvencia: <223> OL261 jelű láncindító
Claims (70)
- -47Szabadalmi igénypontok1. Humán interferon-alfa-2 (ΙΝΈα2) biológiai aktivitásával rendelkező módosított molekula, amely lényegében nem immunogén, vagy kevésbé immunogén, mint bármilyen más módosítatlan molekula, amelynek lényegében ugyanolyan az aktivitása, amikor in vivo van alkalmazva.
- 2. Az 1. igénypont szerinti molekula, amelyben az immunogenitás elvesztését az eredeti módosítatlan molekulából származó egy vagy több T-sejt-epitóp eltávolításával és/vagy azon MHC allotípusok számának a csökkentésével érjük el, amelyek képesek kötődni a molekulából származó peptidekhez.
- 3. A 2. igénypont szerinti molekula, amelyben egy T-sejt-epitóp van eltávolítva.
- 4. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti molekula, amelyben az eredetileg jelen lévő T-sejt-epitópok II. osztályba tartozó MHC molekula ligandumjai, vagy olyan peptidszekvenciák, amelyek képesek stimulálni vagy kötni T-sejteket II. osztályba tartozó molekulákon keresztül.
- 5. A 4. igénypont szerinti molekula, amelyben a ligandumok vagy peptidszekvenciák 13-tagú vagy 15-tagú peptidek.
- 6. Az 5. igénypont szerinti molekula, amelynek a peptidszekvenciái az 1. ábrán bemutatottak közül vannak kiválasztva.
- 7. A 2-6. igénypontok bármelyike szerinti molekula, amelyben bármelyik eredetileg jelen lévő T-sejt-epitóp 1-9 aminosav-oldallánca van megváltoztatva.
- 8. A 7. igénypont szerinti molekula, amelyben egy aminosav-oldallánc van megváltoztatva.
- 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti molekula, amelyben az aminosav-oldalláncok megváltoztatása az eredetileg jelen lévő aminosav-oldalláncoknak a megfelelő pozícióban található más aminosav-oldalláncokkal történő szubsztitúciójával van végrehajtva.
- 10. A 9. igénypont szerinti molekula, amelyben egy vagy több aminosav-oldallánc szubsztitúciója a 2. ábrán bemutatott módon van végrehajtva.
- 11. A 10. igénypont szerinti molekula, amelyben továbbá egy vagy több aminosavoldallánc szubsztitúciója a 3. ábrán bemutatott módon van végrehajtva azon MHC allotípusok számának a csökkentésére, amelyek képesek kötődni a molekulából származó peptidekhez.
- 12. A 9. igénypont szerinti molekula, amelyben egy vagy több aminosav-oldallánc szubsztitúciója a 3. ábrán bemutatott módon van végrehajtva.
- 13. A 7. vagy 8. igénypont szerinti molekula, amelyben az aminosav-oldalláncok megváltoztatása az eredetileg jelen lévő megfelelő pozícióban található aminosav-oldalláncoknak a deléciójával van végrehajtva..
- 14. A 7. vagy 8. igénypont szerinti molekula, amelyben az aminosav-oldalláncok megváltoztatása az eredetileg jelen lévőkhöz aminosav-oldalláncoknak megfelelő pozícióban történő addíciójával van végrehajtva.
- 15. A 7-14. igénypontok bármelyike szerinti molekula, amelyben további változtatások vannak végrehajtva a molekula biológiai aktivitásának a helyreállítására.
- 16. A 15. igénypont szerinti molekula, amelyben a további változtatás specifikus aminosav(ak) szubsztitúciójával, addíciójával vagy deléciójával van végrehajtva.
- 17. A 7-16. igénypontok bármelyike szerinti módosított molekula, amelyben az aminosav-változtatás homológ fehérjeszekvenciára vonatkoztatva van végrehajtva.
- 18. A 7-16. igénypontok bármelyike szerinti módosított molekula, amelyben az aminosav-változtatás in silico modellezési módszerre vonatkoztatva van végrehajtva.
- 19. A 7-16. igénypontok bármelyike szerinti módosított molekula, amelyben az aminosav-változtatás INFa2-eredetű peptidek vagy INFa2 fehérje T-sejtek általi stimulációjára vagy kötésére vonatkoztatva van végrehajtva.
- 20. Humán interferon-alfa-2 (ΙΝΈα2) biológiai aktivitásával rendelkező módosított molekula, amely lényegében nem immunogén, vagy kevésbé immunogén, mint bármilyen más módosítatlan molekula, amelynek lényegében ugyanolyan az aktivitása, amikor in vivo van alkalmazva, amely az elsődleges szekvencia egy vagy több aminosavának a megváltoztatásával állítható elő az alábbiak szerint: (i) eltávolítunk egy vagy több, az eredeti módosítatlan molekulából származó T-sejt-epitópot, amely II. osztályba tartozó MHC molekula ligandumja, vagy olyan peptidszekvencia, amely képes T-sejtek stimulálására és kötésére II. osztályba tartozó MHC molekulán történő prezentáción keresztül, és/vagy (ii) azon MHC allotípusok számának a csökkentésével, amelyek képesek kötődni a molekulából származó peptidekhez, ahol a módosított molekula olyan változtatásokat tartalmaz, amelyek a vad típusú INFa2 elsődleges szekvenciájának alábbi, összefüggő aminosav-oldallánc-szakaszain belüli egy vagy több pozícióban vannak:(a) ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLH (RÍ), (b) FNLFSTKDSSAAWDE (R2), (c) KEDSILAVRKYFQRITLY (R3).S·-.’’ »·*.· * <. * -> * A*.··
- 21. A 20. igénypont szerinti molekula, amelyben a változtatás 1-9 aminosav-oldallánc szubsztitúciója.
- 22. A 21. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció az RI, R2 és R3 szakaszokból származó egy vagy több aminosav-oldalláncnál van végrehajtva.
- 23. A 21. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció az R2 és R3 szakaszokból származó egy vagy több aminosav-oldalláncnál van végrehajtva.
- 24. A 21. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció az R3 szakaszból származó egy vagy több aminosav-oldalláncnál van végrehajtva.
- 25. A 19-24. igénypontok bármelyike szerinti molekula, amelyben további egy vagy több, az RI, R2 vagy R3 szakaszokon kívül eső aminosav-oldallánc szubsztitúciója is végre van hajtva.
- 26. A 19-25. igénypontok bármelyike szerinti molekula, amely a vad típusú molekula egy vagy több alábbi pozíciójában végzett aminosav-oldallánc szubsztitúciót tartalmaz:24., 26., 27., 38., 55., 63., 64., 66., 67., 76., 84., 85., 89., 103., 110., 111., 116., 117., 119., 122., 123., 126., 128., 129., 130., 153.
- 27. A 25. igénypont szerinti molekula, amely a vad típusú molekula egy vagy több alábbi pozíciójában végzett aminosav-oldallánc szubsztitúciót tartalmaz:26., 27., 38., 63., 85., 89., 103., 110., 111., 116., 117., 122., 123., 126., 128., 153.
- 28. A 27. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció a 26., 27., 38. közül egy vagy több pozícióban van végrehajtva.
- 29. A 27. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció a 26., 27. vagy 38. pozícióban van végrehajtva.
- 30. A 27. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció a 103., 110., 111., 116., 117., 122., 123., 126., 128., 153. közül egy vagy több pozícióban van végrehajtva.
- 31. A 27. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció a 26., 27., 38. közül egy vagy több, és ezenkívül a 63., 85. vagy 89. pozícióban van végrehajtva.
- 32. A 27. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció a 26., 27., 38. közül egy vagy több, vagy másképpen a 63., 85., 89. közül egy vagy több, és ezenkívül a 103., 110., 111., 116., 117., 122., 123., 126., 128., 153. közül egy vagy több pozícióban van végrehajtva.
- 33. A 26. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció a 4. ábrán bemutatott közül egy vagy több pozícióban van végrehajtva.
- 34. A 28. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció L26P, F27S, F38E bármelyike.
- 35. A 29. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció I63T, Y85S, Y89D, Y89E, Y89N bármelyike.
- 36. A 30. igénypont szerinti molekula, amelyben a szubsztitúció V103E, L110G, M111T, M111S, M111E, I116S, I116Q, L117G, L117A, Y122E, Y122Q, F123H, I126A, L128A, L153S bármelyike.
- 37. Humán interferon-alfa-2 (INFa2) biológiai aktivitásával rendelkező módosított molekula, amely lényegében nem immunogén, vagy kevésbé immunogén, mint bármilyen más módosítatlan molekula, amelynek lényegében ugyanolyan az aktivitása, amikor in vivo van alkalmazva, amely az elsődleges szekvencia egy vagy több aminosavának a szubsztitúciójával állítható elő az alábbiak szerint: (i) eltávolítunk egy vagy több, az eredeti módosítatlan molekulából származó T-sejt-epitópot, amely II. osztályba tartozó MHC molekula ligandumja, vagy olyan peptidszekvencia, amely képes T-sejtek stimulálására és kötésére II. osztályba tartozó MHC molekulán történő prezentáción keresztül, és/vagy (ii) csökkentjük azon MHC allotípusok számát, amelyek képesek kötődni a molekulából származó peptidekhez, ahol a szubsztitúció a vad típusú INFa2a vagy INFa2b molekula alábbi egy vagy több pozíciójában van:(i) I24P, L26P, F27S, F38E, V55A, (ii) I63T, L66A, F67D, F67E, W76H, F84D, F84E, Y85S, Y89D, Y89E, Y89N, (iii) bármely pozíció az R3 szekvenciában, beleértve az L153S-t.
- 38. A 37. igénypont szerinti molekula, amelyben egy vagy több alábbi szubsztitúció van az R3 szekvenciában:V103E, L110G, LUOS, M111T, Mil IS, M111E, I116S, IH6Q, L117G, L117A, V119A, Y122Q, Y122E, Y122H, F123H, I126A, L128A, Y129N, L130G, L130, L153S.
- 39. A 38. igénypont szerinti molekula, amelyben egy vagy több alábbi szubsztitúció van: Y122E, Y122Q, F123H, I126A, L128A.
- 40. A 36-39. igénypontok bármelyike szerinti molekula, amelyben további szubsztitúciók is vannak.
- 41. Csökkentett immunogenitású módosított humán intereferon-alfa-2 (INFa2), amely az alábbi szekvenciát tartalmazza:CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX°ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETI PVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLM KEDSILAVRKX^QRX’TX^YLKEKKYSPCAWEWRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE, ahol X° jelentése R, K ;X1 jelentése Y, E, Q;-51 X2 jelentése F, H;X3 jelentése I, A; ésX4 jelentése L, A;és az az eset ki van zárva, amikor egyidejűleg X1 = Y, X2 = F, X3 = I és X4 = L.
- 42. Csökkentett immunogenitású módosított humán intereferon-alfa-2 (INFa2), amely az alábbi szekvenciát tartalmazza:CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX°ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETI PVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPX1 X2KEDSX3X4AVRKX5X6QRX7TX8YLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSX9STNLQESLRS KE, ahol X° jelentése R, K ;X1 jelentése L, S, G,X2 jelentése Μ, T, S, E,X3 jelentése I, S, Q,X4 jelentése L, G,Xs jelentése Y, E, Q;X6 jelentése F, H;X7 jelentése I, A;X8 jelentése L, A; ésX9 jelentése L, S és az az eset ki van zárva, amikor egyidejűleg X1 - L, X2 = Μ, X3 = I, X4 = L, X5 = Y, X6 = F, X7 = I, X8 = L és X9 = L.
- 43. Csökkentett immunogenitású módosított humán intereferon-alfa-2 (INFa2), amely az alábbi szekvenciát tartalmazza:CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX°ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETI PVLHEMIQQX1X2NX3X4STKDSSAAX5DETLLDKX6X7TELX8QQLNDLEACVIQGVGVT etplmkedsilavrkyfqritlylkekkyspcawevvraeimrsfslstnlqeslrske ahol X* jelentése R, K ;X1 jelentése I, T;X2 jelentése F, D, A;X3 jelentése L, A;-52X4 jelentése F, D, E;X5 jelentése W, H;X6 jelentése F, D, E;X7 jelentése Y, S; ésX8 jelentése Y, D, E, N;és az az eset ki van zárva, amikor egyidejűleg X1 = I, X2 = F, X3 = L, X4 = F, X5 = W, X6 = F, X7 = Y és X8 =Y.
- 44. Csökkentett immunogenitású módosított humán intereferon-alfa-2 (INFa2), amely az alábbi szekvenciát tartalmazza:CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX°ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETI PVLHEMIQQX1FNLFSTKDSSAAWDETLLDKFX2TELX3QQLNDLEACVIQGVGVTETP lmkedsilavrkyfqritlylkekkyspcawevvraeimrsfslstnlqeslrske, ahol X° jelentése R, K ;X1 jelentése I, T;X2 jelentése Y, S; ésX3 jelentése Y, D, E, N;és az az eset ki van zárva, amikor egyidejűleg X1 = I, X2 = Y és X3 = Y.
- 45. Csökkentett immunogenitású módosított humán intereferon-alfa-2 (INFa2), amely az alábbi szekvenciát tartalmazza:CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX°ISX1X2SCLKDRHDFGX3PQEEFGNQFQKAE TIPX4LHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETP LMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE, ahol X° jelentése R, K ;X1 jelentése L, P,X2 jelentése F, S;X3 jelentése F, E; ésX4 jelentése V, A;és az az eset ki van zárva, amikor egyidejűleg X1 = L, X2 = F, X3 = F és X4 = V.
- 46. A 41. igénypont szerinti módosított INFa2 szekvencia, amely további szubsztitúciókat is tartalmaz.
- 47. A 46. igénypont szerinti módosított INFa2 szekvencia, amely 43. igénypont szerinti további szubsztitúciókat is tartalmaz.
- 48. A 46. igénypont szerinti módosított INFa2 szekvencia, amely 44. igénypont szerinti további szubsztitúciókat is tartalmaz.
- 49. A 47. vagy 48. igénypont szerinti módosított INFa2 szekvencia, amely 45. igénypont szerinti további szubsztitúciókat is tartalmaz.
- 50. A 42. igénypont szerinti módosított INFa2 szekvencia, amely további szubsztitúciókat is tartalmaz.
- 51. Az 50. igénypont szerinti módosított INFa2 szekvencia, amely 43. igénypont szerinti további szubsztitúciókat is tartalmaz.
- 52. Az 50. igénypont szerinti módosított INFa2 szekvencia, amely 44. igénypont szerinti további szubsztitúciókat is tartalmaz.
- 53. Az 51. vagy 52. igénypont szerinti módosított INFa2 szekvencia, amely 45. igénypont szerinti további szubsztitúciókat is tartalmaz.
- 54. Az 1. igénypont szerinti módosított INFa2 szekvencia, amely további szubsztitúciókat is tartalmaz az RÍ és/vagy R2 és/vagy R3 részleges szekvenciák egy vagy több pozíciójában, ahol RÍ, R2, R3 definíciója a 19. igénypont szerinti.
- 55. DNS-szekvencia, amely az 1-54. igénypontok bármelyike szerinti módosított INFa2-t kódol.
- 56. Gyógyászati készítmény, amely INFa2 biológiai aktivitásával rendelkező, 1-54. igénypontok bármelyike szerint definiált módosított molekulát tartalmaz, adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozóval, oldószerrel vagy kötőszerrel együtt.
- 57. Eljárás INFa2 biológiai aktivitásával rendelkező, az 1-54. igénypontok bármelyike szerinti igénypontok bármelyikében definiált módosított molekula gyártására, azzal jellemezve, hogy az eljárás alábbi lépéseket tartalmazza:(i) meghatározzuk a polipeptid aminosav-szekvenciáját vagy annak egy részét;(ii) azonosítunk egy vagy több potenciális T-sejt-epitópot a fehérje aminosav-szekvenciájában bármilyen módszer alkalmazásával, beleértve az MHC-molekulákhoz kötődő peptidek meghatározását in vitro vagy in silico módszerek vagy biológiai vizsgálati eljárások alkalmazásával;(iii) új szekvencia-variánsokat tervezünk, amelyekben egy vagy több aminosav az azonosított potenciális T-sejt-epitópokban módosítva van oly módon, hogy lényegesen csökkentjük vagy megszűntetjük a T-sejt-epitóp aktivitását, amit a peptideknek MHC-molekulákhoz való kötődésével határozunk meg in vitro vagy in silico módszerekkel vagy biológiai vizsgálati eljárásokkal, vagy peptid-MHC komplexek T-sejtekhez történő kötődésével;(iv) ilyen szekvencia-variánsokat állítunk elő rekombináns DNS módszerekkel, és teszteljük a variánsokat annak érdekében, hogy egy vagy több kívánt tulajdonságú variánst azonosítsunk; és (v) adott esetben megismételjük a (ii)- (iv) lépéseket.
- 58. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (iii) lépést az eredetileg jelen lévő T-sejt-epitópok bármelyikében 1-9 aminosav-oldallánc szubsztitúciójával, addíciójával vagy deléciójával hajtjuk végre.
- 59. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a változtatást homológ fehérjeszekvenciára és/vagy in silico modellezési módszerekre vonatkoztatva végezzük el.
- 60. Az 57-59. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (ii) lépést az alábbi lépésekkel hajtjuk végre: (a) kiválasztjuk a peptid egy ismert aminosav-szekvenciájú régióját; (b) egymás után megvizsgálunk a kiválasztott régióból származó, előre meghatározott egyforma méretű és legalább három aminosav-oldalláncból álló átfedő aminosav-szegmenseket; (c) kiszámítjuk minden egyes vizsgált szegmens esetében a II. osztályba tartozó MHC molekula kötési pontszámát a vizsgált aminosav-oldallánc szegmensben található mindegyik hidrofób aminosav-oldallánchoz hozzárendelt értékének összeadásával; és (d) azonosítjuk a szegmensek legalább egyikét, mint módosításra megfelelőt, az adott szegmensre kiszámított, II. osztályba tartozó MHC molekula kötési pontszám alapján, hogy megváltoztassuk a peptid általános II. osztályba tartozó MHC molekula kötési pontszámát, anélkül, hogy lényegesen csökkentenénk a peptid terápiás alkalmazhatóságát.
- 61. A 60. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (c) lépést olyan módosított Böhm féle pontszám-előállító függvény alkalmazásával hajtjuk végre, amelyet úgy módosítottunk, hogy tartalmazzon 12-6 van dér Waals ligandum-fehéije taszító energia kifejezést és ligandum konformációs energia kifejezést az alábbiak szerint: (1) biztosítjuk II. osztályba tartozó MHC molekulamodellek egy első adatbázisát; (2) biztosítunk egy második adatbázist, a II. osztályba tartozó MHC molekulamodellek megengedett peptidvázaira; (3) kiválasztunk egy modellt az első adatbázisból; (4) kiválasztunk egy megengedett peptidvázat a második adatbázisból; (5) azonosítunk olyan aminosav-oldalláncokat, amelyek mindegyik vizsgált szegmensben megtalálhatók; (6) meghatározzuk az egyes vizsgált szegmensekben megtalálható összes oldallánc kötési affinitási pontszámát; és megismételjük az (1)-(5) lépéseket mindegyik modellre és mindegyik peptidvázra.
- 62. Peptidmolekula, amely 13 összefüggő aminosav-oldalláncból áll és potenciálisan II. osztályba tartozó MHC molekulát kötő aktivitása van, és amely nem módosított INFa2 elsőd-55 leges szekvenciájából van létrehozva, és amely peptidmolekula az 1. és a 6a., 6b. 6c. ábrák bármelyikén bemutatottak bármelyike.
- 63. Peptidmolekula, amely 15 összefüggő aminosav-oldalláncból áll, és amely potenciálisan II. osztályba tartozó MHC molekulát kötő aktivitással rendelkezik, és amely nem módo-5 sított INFa2 elsődleges szekvenciájából van létrehozva, és amely peptidmolekula a 19. igénypont szerinti RÍ, R2, R3 részleges szekvenciák bármelyike.
- 64. A 63. igénypont szerinti peptidmolekula, amely a 7. ábrán bemutatottak bármelyike.
- 65. Peptidszekvencia, amely 62-64. igénypontok bármelyike szerinti 13-tagú T-sejtepitóp peptidek legalább 9 összefüggő aminosav-oldalláncát tartalmazza.10
- 66. Peptidmolekula, amely 9-15 összefüggő aminosav-oldalláncból áll, potenciálisan II.osztályba tartozó MHC molekulát kötő aktivitással rendelkezik és nem módosított INFa2 elsődleges szekvenciájából van létrehozva, és a molekula stimulációs indexe legalább 1,8 sejtproliferáció biológiai vizsgálati eljárásában, ahol az indexet a sejtproliferáció értékelésével állapítjuk meg pepiiddel történő stimuláció után, és elosztjuk a pepiidet nem kapott kontroll sejtek15 sejtroliferációjának az értékével, és a sejtproliferációt bármilyen, szokásos eljárásokkal végrehajtott módon mérjük.
- 67. A 66. igénypont szerinti peptidmolekula, amely 6. vagy 7. ábrán bemutatott szekvenciát tartalmaz.
- 68. A 66. igénypont szerinti peptidmolekula, amely a 19. igénypont szerinti RÍ, R2, R3 20 részleges INFa2 szekvenciák bármelyikének legalább 9 összefüggő aminosav-oldalláncát tartalmazza.
- 69. A 62-68. igénypontok bármelyike szerinti pepiid alkalmazása olyan módosított INFa2 molekula gyártására, amelynek lényegében nincs, vagy kisebb az immunogenitása, mint bármilyen nem módosított, ugyanolyan, vagy elfogadhatóan csökkent mértékű biológiai akti25 vitású molekulának, amikor in vivo van alkalmazva.
- 70. Gyógyászati készítmény, amely a 62-68. igénypontok bármelyike szerinti szintetikus peptidszekvenciát tartalmaz, adott esetben együtt gyógyászatilag elfogadható hordozóval, oldószerrel vagy kötőszerrel.A meghatalmazott:30 DANUBIASzabadalmi és Védjegy Iroda Kft.Lengyel Zsolt35 AAúJÍ LnWi szabadalmi ügyvivőjelölt lc) te....................1/19 p03 05309PCT/EP02/02218KÖZZÉ T
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01105088 | 2001-03-02 | ||
| PCT/EP2002/002218 WO2002085941A2 (en) | 2001-03-02 | 2002-03-01 | Modified interferon alpha with reduced immunogenicity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0303309A2 true HUP0303309A2 (hu) | 2003-12-29 |
Family
ID=8176646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0303309A HUP0303309A2 (hu) | 2001-03-02 | 2002-03-01 | Csökkentett immunogenitású módosított interferon-alfa |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060062761A1 (hu) |
| EP (1) | EP1379555A2 (hu) |
| JP (1) | JP2004535173A (hu) |
| KR (1) | KR20030081479A (hu) |
| CN (1) | CN1529714A (hu) |
| BR (1) | BR0207704A (hu) |
| CA (1) | CA2439690A1 (hu) |
| HU (1) | HUP0303309A2 (hu) |
| MX (1) | MXPA03007838A (hu) |
| PL (1) | PL363181A1 (hu) |
| RU (1) | RU2003129056A (hu) |
| WO (1) | WO2002085941A2 (hu) |
| ZA (1) | ZA200307677B (hu) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2498319A1 (en) | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Nautilus Biotech | Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules |
| CA2500626A1 (en) * | 2002-10-01 | 2004-04-15 | Xencor, Inc. | Interferon variants with improved properties |
| AU2004213565A1 (en) * | 2003-02-18 | 2004-09-02 | Merck Patent Gmbh | Fusion proteins of interferon alpha muteins with improved properties |
| US20080260820A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-23 | Gilles Borrelly | Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides |
| US20090010966A1 (en) * | 2007-06-21 | 2009-01-08 | Angelica Therapeutics, Inc. | Modified diphtheria toxins |
| US8470314B2 (en) * | 2008-02-29 | 2013-06-25 | Angelica Therapeutics, Inc. | Modified toxins |
| US20110224407A1 (en) * | 2008-09-09 | 2011-09-15 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Type I Interferon Antagonists |
| WO2014150600A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Angelica Therapeutics, Inc. | Modified toxins |
| CN105255840A (zh) * | 2015-10-16 | 2016-01-20 | 西安医学院 | 通过去除显性表位b8r重组痘苗病毒的方法及其病毒 |
| CN105200017A (zh) * | 2015-10-16 | 2015-12-30 | 西安医学院 | 一种去除a47l降低痘苗病毒免疫优势的方法及病毒 |
| WO2018200635A1 (en) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods of treating rheumatoid arthritis using rna-guided genome editing of hla gene |
| AR117715A1 (es) * | 2019-12-17 | 2021-08-25 | Univ Nacional Del Litoral Unl | Interferón hiperglicosilado con inmunogenicidad reducida |
| WO2022240916A1 (en) | 2021-05-10 | 2022-11-17 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Engineered hla alleles for treating autoimmunity |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997033998A1 (en) * | 1996-03-14 | 1997-09-18 | The Immune Response Corporation | Targeted delivery of genes encoding interferon |
-
2002
- 2002-03-01 EP EP02727340A patent/EP1379555A2/en not_active Withdrawn
- 2002-03-01 CN CNA028058658A patent/CN1529714A/zh active Pending
- 2002-03-01 RU RU2003129056/13A patent/RU2003129056A/ru not_active Application Discontinuation
- 2002-03-01 BR BR0207704-3A patent/BR0207704A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-03-01 PL PL02363181A patent/PL363181A1/xx unknown
- 2002-03-01 WO PCT/EP2002/002218 patent/WO2002085941A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-03-01 US US10/469,679 patent/US20060062761A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-01 KR KR10-2003-7011451A patent/KR20030081479A/ko not_active Withdrawn
- 2002-03-01 HU HU0303309A patent/HUP0303309A2/hu unknown
- 2002-03-01 JP JP2002583467A patent/JP2004535173A/ja active Pending
- 2002-03-01 MX MXPA03007838A patent/MXPA03007838A/es unknown
- 2002-03-01 CA CA002439690A patent/CA2439690A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-10-01 ZA ZA200307677A patent/ZA200307677B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR0207704A (pt) | 2004-07-06 |
| KR20030081479A (ko) | 2003-10-17 |
| WO2002085941A2 (en) | 2002-10-31 |
| US20060062761A1 (en) | 2006-03-23 |
| PL363181A1 (en) | 2004-11-15 |
| RU2003129056A (ru) | 2005-04-20 |
| CA2439690A1 (en) | 2002-10-31 |
| EP1379555A2 (en) | 2004-01-14 |
| MXPA03007838A (es) | 2003-12-08 |
| ZA200307677B (en) | 2004-07-13 |
| JP2004535173A (ja) | 2004-11-25 |
| CN1529714A (zh) | 2004-09-15 |
| WO2002085941A3 (en) | 2003-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7615615B2 (en) | Modified interferon beta with reduced immunogenicity | |
| US20040254106A1 (en) | Modified factor ix | |
| HUP0303309A2 (hu) | Csökkentett immunogenitású módosított interferon-alfa | |
| JP2004532617A (ja) | 低減された免疫原性を有する修飾されたヒト脳由来の好中性因子（ｂｄｎｆ） | |
| US20040076991A1 (en) | Modified interleukin-1 receptor antagonist(il-1ra) with reduced immunogenicity | |
| US20040072219A1 (en) | Modified leptin with reduced immunogenicity | |
| HUP0303429A2 (hu) | Csökkent immunogenitású módosított granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktor (GM-CSF) | |
| HUP0303430A2 (hu) | Csökkentett immunogenitású, módosított protamin | |
| HUP0402334A2 (hu) | Módosított humán növekedési hormon | |
| JP2005535304A (ja) | 低減された免疫原性を有する修飾されたｂｒｙｏｄｉｎ１ | |
| US20040063634A1 (en) | Modified kertinocyte growth factor (kgf) with reduced immunogenicity | |
| HUP0401121A2 (hu) | Csökkentett immunogenitású, módosított trombopoietin (TPO) | |
| CA2437287A1 (en) | Modified granulocyte colony stimulating factor (g-csf) with reduced immunogenicity | |
| AU2002257596A1 (en) | Modified interferon alpha with reduced immunogenicity | |
| JP2005529170A (ja) | Ｔ細胞エピトープをマッピングおよび除去する方法 | |
| HUP0303523A2 (hu) | Csökkentett immunogenitású, módosított inzulin | |
| AU2002256681A1 (en) | Modified interferon beta with reduced immunogenicity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FD9A | Lapse of provisional protection due to non-payment of fees |