HUP0300689A2 - Eljárás és kompozíciók gyulladásos betegségek kezelésére - Google Patents

Abstract

A találmány gyulladásos betegségek kezelésére szolgáló kompozíciókra,illetve eljárásokra vonatkozik, ahol foszfodiészteráz-4 (PDE4)inhibitorokat, például cisz-4-ciano-4-[3-(ciklopentil-oxi)-4-metoxi-fenil]-1-ciklohexánkarbonsavat prosztaglandinszintézis-inhibitorokkal,például nemszteroid gyulladásellenes hatóanyagokkal (NSAID-kel) együttalkalmaznak. Ó

Description

P03 006 89 ....... _:

75.216/DE S.B.G.&K. / :..: :.:.;·*

Szabadalmi Ügyvivői Iroda /1 ' )

Η-1062 Budapest, Andrássy út 113. ///

Telefon: 461-1000, Fax: 461-1099/ l

ELJÁRÁS ÉS KOMPOZÍCIÓK GYULLADÁSOS BETEGSÉGEK KEZELÉSÉRE

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

A találmány gyulladásos betegségek kezelésére szolgáló kompozíciókra, illetve eljárásokra vonatkozik, ahol foszfodiészteráz-4 (PDE4) inhibitorokat prosztaglandinszintézis-inhibitorokkal, például nemszteroid gyulladásellenes hatóanyagokkal (NSAID-kel) együtt alkalmazunk.

A pulmonalis betegségek kezelésére alkalmas új gyógyszerek azonosítását megnehezíti, hogy a betegség kialakulásáért számos mediátor felelős. így valószínűtlennek tűnik, hogy egy egyedi mediátor hatásainak a kiküszöbölése lényegi hatást gyakorolna a krónikus asztma mindhárom komponensére. A mediátor megközelítés egyik alternatíváját a betegség patofiziológiájáért felelős sejtek aktivitásának a szabályozása jelenti.

Ennek egyik módját a cAMP (ciklikus adenozin-3',5'-monofoszfát) koncentrációinak a növelése jelenti. A korábbiakban már kimutatták, hogy a ciklikus AMP egy, a hormonok, neurotranszmitterek és hatóanyagok széles körére adott biológiai válaszokat mediáló második messenger [Krebs Endocrinology .Proceedings of the 4th International Congress Excerpta Medica, 17-29 (1973)]. Amikor a megfelelő agonista hozzákötődik a specifikus sejtfelületi receptorokhoz, adenilát-cikláz aktiváló2 + dik, ami fokozott sebességgel alakítja át a Mg -ATP-t cAMP-vé.

A ciklikus AMP modulálja a legtöbb, ha nem az összes olyan sejtet, amely hozzájárul az extrinszik (allergiás) asztma patofiziológiáj ához . Ily módon a cAMP növelése olyan előnyös hatásokat gyakorolhatna, amilyenek — egyebek mellett — például a következők: 1) légúti simaizom relaxáció, 2) mast-sejt mediátor felszabadulás gátlása, 3) neutrofil degranuláció szuppresszálása, 4) bazofil degranuláció gátlása, és 5) monocita és makrofág aktiváció gátlása. Ebből következően azok a vegyületek, amelyek aktiválják az adenilát-ciklázt vagy gátolják a foszfodiészterázt, hatásosan szuppresszálhatnák a légúti simaizom sejtek és különféle gyulladásos sejtek helytelen aktivációját. A cAMP inaktivációja esetén az alapvető sejtmechanizmust a 3'-foszfodiészter kötésnek az a hidrolízise képezi, amelyet a ciklikus nukleotid foszfodiészterázoknak (PDE-k) nevezett izozim család egy vagy több tagja vált ki.

A korábbiakban már kimutatták, hogy a légúti simaizomsejtekben és a gyulladásos sejtekben a cAMP lebontásáért egy megkülönböztetett ciklikus nukleotid foszfodiészteráz (PDE) izozim, nevezetesen a PDE IV. felelős [Torphy, Phosphodiesterase Isozymes: Potential Targets for Novel Anti-asthmatic Agents in New Drugs for Asthma, Barnes, ed. IBC Technical Services Ltd. (1989)]. A kutatások azt jelzik, hogy ennek az enzimnek a gátlása nemcsak légúti simaizom relaxációt eredményez, hanem a monociták és neutrofilek gátlása mellett a mast-sejtek, bazofilek és neutrofilek degranulációját is szuppresszálja. Ezenkívül a PDE IV. inhibitorok előnyös hatásai jelentős mértekben fokozhatok, ha a target sejtek adenilát-cikláz aktivitását megfelelő hormonok vagy autokoidok fokozzák, annak megfelelően, ahogyan az in vivo történik. így a PDE IV. inhibitorok hatásosak lehetnének a tüdőben, ahol a prosztaglandin-E2 és a prosztaciklin (adenilát-cikláz aktivátorok) szintje fokozott. Az ilyen vegyü letek egyedi megoldást kínálnának a bronchialis asztma farmakoterápiájára, a jelenleg forgalmazott hatóanyaghoz képest szignifikáns terápiás előnyökkel rendelkeznének.

Az előbbieken kívül az ilyen vegyületeket kombinált terápiákban is fel lehetne használni, különös tekintettel arra tényre, hogy számos pulmonalis betegség etiológiája sokféle mediátort foglal magában. A jelen találmány PDE4-szelektív inhibitorokkal kezelhető, a prosztaglandinok szintézisével összefüggésben álló gyulladási komponensekkel kapcsolatos gyulladásos betegségek vagy állapotok kezelésére szolgáló, PDE4 inhibitorból és nemszteroid gyulladásellenes hatóanyagból álló kombinációkra vonatkozik.

A találmány első tárgya eljárás gyulladásos betegségek kezelésére emlősökben, amelynek során egy ilyen kezelést igénylő betegnek beadjuk egy PDE4-specifikus inhibitor hatásos mennyiségét és egy nemszteroid gyulladásellenes hatóanyag hatásos mennyiségét, ahol a hatóanyagokat egyidejűleg együtt vagy szeparáltan és egymást követően adjuk be, ahol az egymást követő beadások időben közel vagy távol történnek.

A találmány szerinti kombinációs terápia során gyulladásos betegségek kezelésére egy gyulladásellenes szteroid hatóanyaggal együtt adunk be egy PDE4 inhibitort. A vegyületeket beadhatjuk együtt egyetlen dózisformában, vagy beadhatjuk két különböző készítményként, amely két készítmény lehet azonos vagy egymástól eltérő. Például a két hatóanyag lehet szeparált orális készítmények formájában, vagy az egyik hatóanyag egy orális készítmény, míg a másik egy kúp, injekció vagy intravénás csepp. A hatóanyagok beadása történhet egyidejűleg, vagy beadhatók egymáshoz képest időben közel vagy bizonyos idő elteltével, például az egyik hatóanyagot reggel adjuk be, a másikat pedig este.

A találmány szerinti megoldásban felhasználható PDE4-specifikus inhibitor bármely olyan vegyület lehet, amelyről ismert, hogy gátolja a PDE4 enzimet, vagy amelyről kiderült, hogy PDE4 inhibitorként fejt ki hatást, valamint amely csak PDE4 inhibitor, de nem lehet olyan vegyület, amely a PDE4 mellett a PDE család más tagjait is gátolja. Általában előnyös az olyan PDE4 antagonisták alkalmazása, amelyek körülbelül 0,1 vagy nagyobb IC₅o aránnyal rendelkeznek, ahol az arány (a rolipramot nagy affinitással kötő PDE4 katalitikus forma IC₅₀ értéke)/(a rolipramot kis affinitással kötő forma IC5Q értéke) hányadosnak felel meg.

A teofillinhez és pentoxifillinhez hasonló hatóanyagokként alkalmazott PDE inhibitorok megkülönböztetés nélkül minden szövetben gátolják a PDE izozimeket. Ezeknek a vegyületeknek mellékhatásaik vannak, feltehetően azért, mert az ilyen vegyületek valamennyi szövetben válogatás nélkül gátolják valamennyi PDE izozim osztályt. A megcélzott betegállapot hatásosan kezelhető az ilyen vegyületekkel, de a vegyületek nemvárt másodlagos hatásokat mutathatnak, amelyek ha elkerülhetők vagy minimalizálhatók lennének, a vegyületek bizonyos betegségek kezelése esetén növelhetnék a találmány szerinti megoldás teljes terápiás hatását. Például a szelektív PDE4 inhibitor roliprammal végzett klinikai vizsgálatok azt mutatják, hogy a vegyület pszichotrop hatással rendelkezik, ami mellett olyan gastrointestinalis hatásokat is mutat, amilyen például a pyrosis, a nausea és az emesis.

A találmány szerinti megoldásokkal kapcsolatban azt a cAMP katalitikus helyet, amely az R- és S-rolipramot kis affinitással köti, kis affinitású kötőhelynek (LPDE4) nevezzük, míg a katalitikus másik formáját, amely a rolipramot nagy affinitással köti, nagy affinitású kötőhelynek (HPDE4) nevezzük. Hangsúlyozni kívánjuk, hogy a HPDE4 jelölés nem keverendő össze a szakterületen alkalmazott hPDE4 jelöléssel, amely a humán PDE4 jelzésére szolgál.

Az első kísérletekben a [³H]-rolipram kötés megállapítása és értékelése érdekében végeztünk vizsgálatokat. Ennek részleteit az alábbi 1. példában ismertetjük.

Annak érdekében, hogy eldönthessük, a nagy affinitású kötési aktivitás és a kis affinitású kötési aktivitás ugyanahhoz a géntermékhez kapcsolódik-e, ismert eljárásokkal élesztőt transzformáltunk, majd a rekombináns PDE4 expresszálását követően hatórás fermentációs periódust alkalmaztunk. Egy PDE4 ellen irányuló antitest alkalmazásával végzett Western-blot analízis azt jelezte, hogy az expresszált PDE4 mennyisége az idő előrehaladásával növekszik, és maximális értékét háromórás tenyésztés után éri el. Ezenkívül az immunoreaktív termék több mint 90 %-a az élesztő lizátumok nagy sebességű (100 000 χ g) felülúszójában volt. A protein expresszió folymata során mind, 3 végig nyomon követtük a [ H] R-(-)-rolipram kötést és a PDE aktivitást. A PDE4 aktivitás a rolipram kötési aktivitással együttesen expresszálódott, ami azt jelzi, hogy mindkét aktivitás ugyanahhoz a géntermékhez kapcsolódik. Hasonló eredményeket nyertünk a Western-blot analízissel is, ahol a roliprammal gá, 3 tolható PDE aktivitás és a [ H]-rolipram kötési aktivitás több mint 85 %-a volt megtalálható az élesztő felülúszó frakcióban.

Összeségében a fenti rendszerben expresszálódott rekombináns PDE4 legnagyobb része LPDE4, és csak egy kis töredéke HPDE4. Ebből következően a rekombináns PDE4 katalitikus aktivitás gátlása elsődlegesen a vegyületeknek az LPDE4-nél kifejtett hatását tükrözi vissza. A PDE4 katalitikus aktivitás gátlását ily módon a vegyületek LPDE4-nél kifejtett hatékonyságának az mérőszámaként (indexeként) alkalmazhatjuk. A vegyületeknek a HPDE4-nél kifejtett hatékonyságát úgy értékelhetjük, hogy megvizsgáljuk, milyen mértékben képesek a vegyületek versengeni a 3

[ H]R-(-)-rolipramért. Annak érdekében, hogy mind a kis affinitású, mind pedig a nagy affinitású rolipram kötőhelyek esetén szerkezet/aktivitás összefüggést (SÁR) találjunk, két vizsgálati rendszerben meghatároztuk a kiválasztott vegyületek hatékonyságát. A standard vegyületek alkalmazásával végzett kísérletek eredményeit táblázatban foglaltuk össze. Amint az várható volt, bizonyos vegyületek egyértelműen hatásosabbak voltak a 3

[ H]-roliprammal folytatott versengésben azon a helyen, amelynél a rolipram bizonyítottan nagy affinitással kötődik, mint azon a helyen, amelynél a rolipram kis affinitással kötődik. A nagy affinitású kötés és a kis affinitású kötés közötti szerkezet/aktivitás összefüggés csak igen kevés közös jellemzőt mu tat, amiből azt a következtetést vontuk le, hogy a nagy affini tású [ H]-rolipram kötés gátlásának szerkezet/aktivitás összefüggése eltér a kis affinitású rolipram kötőhelynél történő kötés szerkezet/aktivitás összefüggésétől.

Ismert, hogy a humán monocita rekombináns PDE4-en (hPDE4) legalább két olyan kötőforma van, amelyen az inhibitorok megkötődnek. Ezeknek a megfigyeléseinek az egyik magyarázata az, hogy a hPDE4 két eltérő formában létezik. Az egyik nagy affinitással köti meg a rolipram- és a denbufylline-szerű anyagokat, míg a másik ezeket a vegyületeket kis affinitással köti meg. A találmány szerinti megoldásban történő felhasználás szempontjából előnyösek azok a PDE4 inhibitorok, amelyek hasznos terápiás aránnyal rendelkeznek, azaz az olyan vegyületek, amelyek elsődlegesen a cAMP katalitikus aktivitást gátolják, ahol az enzim abban a formában van, amely a rolipramot kis affinitással köti, miáltal csökkennek azok a mellékhatások, amelyek megjelenése annak a formának a gátlásához kapcsolódik, amely nagy affinitással köti a rolipramot. Másképpen kifejezve, előnyösek azok a vegyületek, amelyek a PDE4 katalitikus formája esetén körülbelül 0,1 vagy nagyobb IC50 aránnyal rendelkeznek, ahol az arány (a rolipramot nagy affinitással kötő PDE4 katalitikus forma IC50 értéke)/(a rolipramot kis affinitással kötő forma IC50 értéke) hányadosnak felel meg.

Az előbbi standard egyik finomított változatában a PDE4 inhibitor legalább körülbelül 0,1 értékű IC50 aránnyal rendelkezik; ahol az arány egyik tagja az 1 nM [ H] R-rolipramnak a rolipramot nagy affinitással kötő PDE4 formához történő kötésének az IC50 értéke, míg másik tagja a rolipramot kis affinitás8 - —· ·..* ··:· —· :

sal kötő forma PDE4 katalitikus aktivitásának 1 μΜ [ H]-cAMP mint szubsztráttal történő gátlásának az IC50 értéke. A teszt további magyarázata az 5 998 428. számú amerikai egyesült államokbeli függő szabadalmi leírásban található.

Legelőnyösebbek azok a PDE4 inhibitorok, amelyek 0,5-nél nagyobb IC50 aránnyal rendelkeznek, különösen azok a vegyületek, amelyekben ez az arány 1,0-nél nagyobb. Előnyös vegyület például a císz-4-ciano-4-[3-(ciklopentil-oxi)-4-metoxi-fenil]-1-ciklohexánkarbonsav (Ariflo ) . A találmány szerinti megoldásban történő felhasználásra alkalmas további PDE4 inhibitorok — egyebek mellett — a következők: AWD-12-281 (Astra) [Hofgen, N. et al., 15th EFMC Int. Symp. Med. Chern. (Sept. 6-10, Edinburg, 1998), Abst. P.98]; az NCS-613 jelzéssel ellátott 9-benzil-adenin-származék (INSERM); D-4418 (Chiroscience és

Schering-Plough); a CI-1018 jelzéssel ellátott benzodiazepin PDE4 inhibitor (PD-168787; Parke-Davis/Warner-Lambert); egy, a WO 99/16766. számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett benzodioxol-származék (Kyowa Hakko); V-11294A (Napp) {Landells, L. J. et al., Eur. Resp. J. [Annu. Gong. Eur. Resp. Soc. (Sept. 19-23, Geneva, 1998), 1998, 12 (Suppl. 28); Abst P2393}; roflumilast (Byk-Gulden; CAS hivatkozási szám: 162401-32-3) és pthalazinone (Byk-Gulden; WO 99/47505. számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés); valamint a T-440 jelzéssel ellátott vegyület (Tanabe Seiyaku) [Fujii, K. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 284 (1), 162 (1998)].

A találmány szerinti megoldásban történő felhasználásra alkalmas nemszteroid gyulladásellenes hatóanyagok (NSAID-k) kö9

V · rébe azok az említett típusú hatóanyagok tartoznak, amelyek gátolják a prosztaglandinszintézist. Feltételezhető, hogy az NSAID-k a ciklooxigenáz-1 (COX-1) és a (COX-2) gátlásán keresztül fejtik ki a hatásukat. Számos hatóanyag tartozik ebbe a kategóriába. A találmány szerinti megoldásban egy vagy több következő NSAID-t alkalmazhatunk: aszpirin, karprofen, kolin-szalicilát, ketoprofen, magnézium-szalicilát, szalicilamind, szalszalat, nátrium-szalicilát, nátrium-tioszalicilát, meklofenamát-nátrium, oxifenbutazon, fenilbutazon, imdometacin, piroxikam, szulindak, tolmetin és tolmetin-nátrium, mefenaminsav, zomerpirak, ibuprofen, fenoprofen, naproxen és naproxen-nátrium, diklofenak, flurbiprofen, ketoprofen, ketorolak, trometamol, celekoxib, diflunizal és nabumeton. Az előbbi hatóanyagok mindegyike beszerezhető kereskedelmi forrásokból, illetve az orvosi és más tudományos szakirodalomban részletesen ismertetett hatóanyag .

Az NSAID-k és a PDE4-sepcifikus inhibitorok kombinált fájdalomcsillató és gyulladásellenes hatásai a találmány szerinti kombinációkat különösen alkalmassá teszik az olyan, fájdalmas és/vagy gyulladásos állapotok szimptomatikus enyhítésére, amilyenek — egyebek mellett — például a reumás rendellenességek, köztük a rheumatoid arthritis, az osteoarthritis és a spondyloarthropathiák, valamint a periarticularis rendellenességek és a lágyszöveti reumatizmus. A találmány szerinti kombinációt felhasználhatjuk pulmonalis betegségek, köztük gyulladásos pulmonalis betegségek kezelésére is.

Az egyik találmány szerinti megoldás értelmében mindkét hatóanyagot egyidejűleg vagy nagyon közeli időben adjuk be. Egy alternatív megoldás értelmében az egyik hatóanyagot reggel adjuk be, a másikat pedig a nap folyamán később. Egy további lehetőség szerint az egyik hatóanyagot naponta kétszer, a másikat pedig napont egyszer adjuk be, vagy a naponta kétszer beadott hatóanyaggal egyidejűleg, vagy szeparáltan. Előnyösen mindkét hatóanyagot együtt adjuk ugyanazon időpontban.

Az orális beadáskor aktív találmány szerinti vegyületeket gyógyászatilag elfogadható sókat szirupokká, tablettákká, kapszulákká, szabályozott hatóanyag-leadású készítményekké vagy gyógycukorkákká formálhatjuk. A szirupkészítmények általában a vegyületnek vagy sójának egy folyékony hordozóval, például etanollal, mogyoróolajjal, glicerinnel vagy vízzel készített szuszpenziójából vagy oldatából, valamint ízesítő- vagy színezőszerekből állnak. Ahol a kompozíció tablettaformában van, a szilárd készítmények előállítására szokásosan alkalmazott bármilyen gyógyszerészeti hordozót felhasználhatunk. Az ilyen hordozók körébe — egyebek mellett — például a következők tartoznak: magnézium-sztearát, gipsz, talkum, zselatin, akácmézga, sztearinsav, keményítő, laktóz és szacharóz. Ahol a kompozíció kapszulaformában van, bármely szokásos kapszulázási módszert felhasználhatjuk, például az előbbi hordozók alkalmazásával előállított kompozíciót kemény zselatin kapszulahéjba tölthetjük. Ahol a kompozíció lágy zselatin kapszula formájában van, a diszperziók vagy szuszpenziók előállítására szokásosan alkalmazott gyógyszerészeti hordozókat használhatunk, amilyenek — egyebek mellett — például a vizes gumik, cellulózok, sziliká*··· ·*«·

- «tok vagy olajok, majd az így előállított kompozíciókat lágy zselatin kapszulákba építjük be.

A jellegzetes parenteralis kompozíciók egy vegyületnek vagy sójának steril vizes vagy nemvizes hordozóval készített, adott esetben parenteralisan elfogdható olajokat, például polietilénglikolt, poli(vinil-pirrolidon)-t, lecitint, arachiszolajat vagy szezámolajat tartalmazó oldatából vagy szuszpenziójából állnak.

A tipikus inhalációs kompozíciók oldatok, szuszpenziók vagy emulziók formájában vannak, amelyeket száraz porként vagy hagyományos propellánsok, például diklór-difluor-metán vagy triklór-fluor-metán alkalmazásával aeroszol formájában adhatunk be.

A PDE4 inhibitorok kompozíciói előnyösen egységdózisformában vannak, amilyenek például a tabletták vagy a kapszulák, illetve a szabályozott hatóanyag-leadású készítmények. Bár az nemszteroid gyulladásellenes hatóanyagokat szokásosan szájon keresztül adjuk be, az NSAID-k közül néhányat, amilyen például a diklofenak, a ketoprofen, a ketorolak, a piroxikam és a tenoxikam, intramuszkuláris injekcióval is beadhatunk. A ketorolakot és a tenoxikamot ezenkívül intravénás injekcióval is beadhatjuk.

A hatóanyagot a kívánt aktivitás eléréséhez elegendő gyakorisággal, például naponta 1-6 alkalommal adhatjuk be. A hatóanyagot előnyösen naponta 1-2 alkalommal, még előnyösebben naponta kétszer adjuk be.

Felnőtt embereknek naponta 1 μg és 200 pg közötti mennyi12 ségben adjuk be a PDE4 inhibitorokat. A nemszteroid gyulladásellenes hatóanyagokat az engedélyezett mennyiségeknek megfelelően adhatjuk be.

1. példa

Foszfodiészteráz és rolipram kötési vizsgálatok

1A. példa

Meghatároztuk, hogy az izolált humán monocita PDE4 és a hrPDE (humán rekombináns PDE4) elsődlegesen a kis affinitású , 3 formában van. így a szubsztrátként 1 μΜ [ H]cAMP alkalmazásával végzett standard PDE4 katalitikus aktivitás vizsgálatok alkalmazásával értékelhetjük a tesztvegyületeknek a PDE4 kis affinitású formájával szembeni aktivitását [Torphy et al., J. of Biol.

Chem., 267 (3), 1798-1804 (1992)].

Proteinforrásként patkányagy nagy sebességű felülúszókat használtunk. 25,6 Ci/mmol fajlagos aktivitású [ H]-rolipram enantiomereket állítottunk elő. Az ismert eljárás [Torphy et al., J. of Biol. Chem., 267 (3), 1798-1804 (1992)] standard vizsgálati körülményeit úgy módosítottuk, hogy azonosak legyenek a PDE vizsgálati körülményeivel, kivéve a cAMP utolsó esetében: 50 mM 3

Tris HC1 (pH 7,5), 5 mM MgC12, és 1 nM [ H]-rolipram. A vizsgálatot egy órán át 30 °C-on végeztük. A reakciót leállítottuk, majd egy Brandel sejtleválasztó alkalmazásával elválasztottuk a kötött ligandot a szabad ligandtól. A nagy affinitású kötőhely esetén a versengést ugyanolyan körülmények között értékeltük, mint amilyeneket a kis affinitású PDE aktivitás mérésére alkal3 máztunk, kiveve, hogy [ H]-cAMP es 5'-AMP nem volt jelen.

IB. példa

A foszfordiészteráz aktivitás mérése 3

A PDE aktivitást [ H]cAMP szcintillációs közelségi vizsga3 lattal (scintillation proximity assay, SPA) vagy [ H]cGMP SPA enzim vizsgálattal, a gyártó (flmersham Life Sciences) használati utasításának megfelelően vizsgáltuk. A reakciókat 96-vájatú lemezeken, szobahőmérsékleten, 0,1 ml reakciópufferben hajtottuk végre, ahol a puffer összetétele a következő volt (végkoncentrációk) : 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8,3 mM MgC12, 1,7 mM EGTA, 3 3

[ H]cAMP vagy [ H]cGMP (hozzávetőleg 2000 dpm/pmol), enzim és az inhibitorok változó koncentrációi. A vizsgálatot egy órán keresztül folytattuk, majd 50 μΐ SPA ittrium-szilikát-gyöngy cink-szulfát jelenlétében végzett hozzáadásával leállítottuk a reakciót. A lemezeket összeráztuk, majd 20 percen keresztül szobahőmérsékleten állni hagytuk. A radioizotóppal jelzett termék képződését szcintillációs spektrometriával értékeltük. A 3

PDE3 és a PDE7 aktivitását 0,05 μΜ [ H]cAMP alkalmazásával ér3 tekeltük, míg a PDE4-et szubsztratkent [ H]cAMP-vel mertük. A

PDE1B, a PDE1C, a PDE2 és a PDE5 aktivitását szubsztrátként 1 3 μΜ [ H]cGMP alkalmazasaval határoztuk meg. 3

[ H]R-rolipram kötési vizsgálat 3

A [ H]R-rolipram kötési vizsgálatot a Schneider és munkatársai által kidolgozott vizsgálatnak egy módosított változatával [lásd: Nicholson et al., Trends Pharmacol. Sci., 12, 19-27 (1991); és McHale et al., Mol. Pharmacol., 39, 109-113 (1991)] hajtottuk végre. Az R-rolipram hozzákötődik a PDE4 katalitikus helyéhez [lásd: Torphy et al., Mol. Pharmacol., 39, 376-384 (1991)]. Ebből következően a [ H]R-rolipram kötésért történő versengés a jelzetlen versenytársak PDE4 inhibitor erősségének egy független megerősítését biztosítja. A vizsgálatot 30 °C-on egy órán át, 0,5 μΐ pufferben hajtottuk végre, ahol a puffer összetétele a következő volt (végkoncentrációk): 50 mM TrisHC1, pH 7,5, 5 mM MgC12, 0,05 % bovin-szérumalbumin, 2 nM 3

[ H]R-rolipram (5,7 χ 104 dpm/pmol), és a radioizotóppal nem jelzett inhibitorok változó koncentrációi. A reakciót 2,5 ml 3 jéghideg {[ H]R-rolipramot nem tartalmazó} reakciópuffér hozzáadásával állítottuk le, majd előzetesen 0,3 % poli(etilénimin)-be mártott Whatman GF/B filtereken gyors vákuumszűrést végeztünk (Brandel Cell Harvester). A filtereket további 7,5 ml hideg pufferrel mostuk, szárítottuk, majd folyadékszcintillációs spektrometriával számlálást végeztünk.

2. példa

Szabályozott hatóanyag-leadású tabletta

Az alábbi 1. táblázatban megadott komponensekkel szabályo zott hatóanyag-leadású tablettákat állítottunk elő.

1. táblázat

Tablettakomponensek

Komponens	Tömeg%
Ariflo®	3,3
dibázikus kalcium-foszfát (vízmentes)	88,5
Carbomer 934P	3, 3
Carbomer 94IP	1, 6
magnézium-sztearát	1,0
Opadry White OY-S-9603	2,4
desztillált víz	q.s.

Keverési és préselési módszerek Keverés

A vivőanyagokat és a hatóanyagot egy keverőbe helyeztük és összekevertük. Ezt követően a keverékhez hozzáadtuk a magnézium-sztearátot, majd további 3 percen keresztül folytattuk a keverést. A keverési eljárás során a vivőanyagokat és a hatóanyagot összekevertük, szitáltuk, majd ismét összekevertük. Préselés

A keverékekből körülbelül 350 mg-os részletekben tablettákat préseltünk. Ennek során 10 kP értékű target tablettaszilárdságot alkalmaztunk.

Az Opadry White-ot a desztillált vízben szuszpendáltuk, majd az így nyert szuszpenziót használtuk a tabletták bevonására. A bevonási eljárás során eltávolítottuk a vizet, így az a végtermékben nem volt jelen.

3. példa

Azonnali hatóanyag-leadású tabletta

Standard eszközökkel és a 2. táblázatban felsorolt összetevőkkel azonnali hatóanyag-leadású tablettákat készítettünk.

2. táblázat

Azonnali hatóanyag-leadású tabletták

Komponensek	Mennyiség (mg/tabletta)	Mennyiség (mg/tabletta)	Mennyiség (mg/ tabletta)
Ariflo	5,0	10,0	15,0
laktóz-monohidrát	113, 0	108	103
mikrokristályos cellulóz	70,0	70,0	70,0
nátrium-kemény!tő-glikolát	10,0	10,0	10,0
magnézium-sztearát	2,0	2,0	2,0
Opadry White OY-S-9603	5, 0	5,0	5, 0
Teljes tablettatömeg (mg)	205,	205, 0	205, 0

4. példa Arthritis kezelése

Egy arthritisszel diagnosztizált és ízületi gyulladásból származó fájdalmat érző betegnek naponta kétszer beadunk egy, a 2. példa szerint előállított, 30 mg Ariflo -t tartalmazó szabályozott hatóanyag-leadású tablettát és egy 500 mg-os Repafen (nabumeton) tablettát. A kezelést addig folytatjuk, amíg a gyulladás enyhülni kezd.

Claims (2)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás gyulladásos betegségek kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy ilyen kezelést igénylő betegnek beadjuk egy PDE4 inhibitor és egy nemszteroid gyulladásellenes hatóanyag hatásos mennyiségét egy kombinált formában, szeparáltan, vagy szeparáltan és egymást követően, ahol az egymást követő beadások közeli vagy távoli időpontokban történnek.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a PDE4 inhibitor cisz-4-ciano-4-[3-(ciklopentil-oxi)-4-metoxi-fenil]-1-ciklohexánkarbonsav, és a nemszteroid gyulladásellenes hatóanyag a következő csoportból kerül kiválasztásra: aszpirin, karprofen, kolin-szalicilát, ketoprofen, magnézium-szalicilát, szalicilamind, szalszalat, nátrium-szalicilát, nátrium-tioszalicilát, meklofenamát-nátrium, oxifenbutazon, fenilbutazon, imdometacin, piroxikam, szulindak, tolmetin és tolmetin-nátrium, mefenaminsav, zomerpirak, ibuprofen, fenoprofen, naproxen és naproxen-nátrium, diklofenak, flurbiprofen, ketoprofen, ketorolak, trometamol, celekoxib, diflunizal és nabumeton.

A meghatalmazott: