HUP0204216A2 - A new use of antibodies as vaccines - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát olyan antitestek alkalmazása képezi, amelyektumor-asszociált antigének elleni antitestekhez kötődnek, és aamelyeket antitesteket tartalmazó individuális testfolyadékokbólizolálnak specifikus ligandumokon végzett immunaffinitás tisztítással.Az említett antitesteket olyan készítmény előállítására használják,amely rákbetegségek elleni individuális, autológ, profilaktikus vagyterápiás vakcinálásához alkalmas. Az immunaffinitás tisztításhozhasznált ligandumok olyan antitestek vagy ezek származékai, amelyektumorasszociált antigének ellen irányulnak. A találmány ezenfelülolyan gyógyszerkészítményekre vonatkozik, amelyek immunaffinitás-tisztítással kapott antitesteket tartalmaznak, vagy az ezenantitestekkel in vitro pulzált dendritikus sejteket tartalmazzák. Ó

Description

K.

Szabadalmi Ügyvivői Iroda H-1062 Budapest, Andrássy út 113. Telefon: 461-1000, Fax: 461-1099

KÖZZÉTÉTELI ··> PÉLDÁNY .·’; 7jfvü8 ü/be • ·· ··· ···

Antitestek új alkalmazása vakcinaként

A találmány olyan antitestek alkalmazására vonatkozik, amelyek tumor-asszociált antigének elleni antitestekhez kötődnek, és amelyeknek az izolálása antitesteket tartalmazó individuális testnedvekből történik specifikus ligandumokon végzett immunaffinitás tisztítással, rákbetegségek elleni individuális, autológ profilaktikus vagy terápiás vakcinálásra alkalmas készítmény előállítása céljából. Az immunaffinitás tisztításnál használt ligandumok olyan antitestek vagy ezek származékai, amelyek egy vagy több tumor-asszociált antigén ellen irányulnak. A találmány ezenkívül ímmunaffinitás tisztítással kapott antitesteket tartalmazó gyógyszerkészítményekre vonatkozik vagy az ezen antitestekkel in vitro pulzált dendritikus sejtekre.

Az emberek adaptív immunrendszere két lényeges komponensből áll, éspedig a humorális és celluláris immunitásból. Az adaptív immunválasz a B és T limfociták klonális szelekcióján alapul és elvben lehetővé teszi minden antigén felismerhetőségét és egy immunológiai memória kialakulását. Vakcinációk esetében az adaptív immunrendszer e tulajdonságaiból általános előny származik.

Minden B sejt termel egy antitestet bizonyos kötő specificitással. Ez az antitest szintén jelen van mint specifikus receptor azoknak a B sejteknek a membránjában, amelyek ezt termelik.

Az idegen antigénként felismert antigének elleni humorális immunválasz azoknak a B sejteknek a szelektív aktiválásán alapul, amelyek az illető antigén epitópjaihoz való kötődésre képes antitesteket termelik. A B sejtek differenciálódása folyamán a > 2 .-1.-: : ···. :

•· · ·· ··· ···

DNS újbóli átrendeződése lényeges az antitest diverzitás szempontjából .

A humán szérum nagy számú, legkülönbözőbb specificitású, izotipusú és alcsoportú antitestet tartalmaz. Az összes immunglobulin teljes koncentrációja a szérumban 15-20 mg/ml, azaz körülbelül 100 g legkülönbözőbb specificitású immunglobulin kering állandóan a vérben. Lehetetlen megbecsülni az összes, különböző specificitasu antitest pontos mennyiségét. Az elméletileg lehetséges repertoár körülbelül 10¹¹. Általánosságban egynémely antitest különböző olyan antigéneket köthet meg, amelyek egymáshoz hasonlóak, jóllehet különböző affinitással és aviditással.

A immunrendszernek fenn kell tartania egy homeosztázist a különböző specificitások megoszlását és fontosságát illetően, endogén szabályozó mechanizmusok segítségével. Egy lényeges mechanizmus az „idiotípus hálózat, amelyet Niels Jerne körülbelül 25 évvel ezelőtt már felvett [Jerne, Ann.Immunol., 125C, 373-389 (1974)]. Vannak anti-idiotípus antitestek, amelyek egy antitest minden idiotípusa ellen irányulnak, meghatározva kötő specificitasat, és amelyek ennélfogva az első antitest idiotípusahoz kötődnek abban az értelemben, hogy egy antigén felismerése történt meg. Jerne feltételezte, hogy a limfocitákon az idiotípus-specifikus receptorok közötti kölcsönhatások lehetnek felelősek az immunrendszer szabályozásáért. Ezek a kölcsönhatások valószínűleg valóban megtörténnek, minthogy kimutatták, hogy egy immunválasz folyamán olyan anti-idiotípus antitestek is képződnek, amelyek elsődlegesen az immunválasz által indukált antitestek ellen irányulnak. Minthogy minden antitest ellen léteznek

74.581/BE *

anti-idiotipus antitestek, elsősorban a _{linlfoclták nem tolerán}. sak, ami az antitestek idiotípusait illeti.

Immunológiai értelemben néhány anti-idiotipus antitest egy antigén „belső képét- képviselheti. Ennélfogva az ilyen antitesteket fel lehet használni immunizálásra a tulajdonképpeni antigén helyettesítője gyanánt, mivel az immunizálás által antitestek részben a tulajdonképpeni antigénhez tudnak Több, mint 10 év óta számtalan preklinikal és klinikai (project) fut annak ellen immunválaszokat indukált kötődni. tervezet érdekében, hogy tumor-asszociált antigének indukáljanak monoklonális anti-idiotipus antitestekkel végzett vakcinálással (lásd Eoon Bhattacharya-Chatterjee összefoglaló munkáját: Anti-idiotype antibody vaccine therapies of cancer; Cancer Treat.Res., 94, 51-68 (1998)(. _A i_{egtöbb llyen} monoklonális anti-idiotipus antitest egér eredető. Vannak azonban vizsgálatok humán monoklonális anti-idiotipus antitestekkel is [például: Fagerberg et al., PNAS, 92, 4773-4777 (1995)).

A B sejt sára irányuló tegség esetén limfómában szenvedő paciensek terápiás immunizálá kísérletek speciális esetnek számítanak. Ilyen be eqy bizonyos B sejt klón olyan specifikus immunglobulint termel, amelynek egy amely az említett immunglobulint -membránjában. Ez a B sejt klón rá jellemző idiotípusa van és receptorként is hordozza sejtdegenerált. Az antitest monoklonális és tumor-specifikus antigénnek tekinthető az individuális B sejt llmfománál. Kimutatták, hogy az _ilyen paciens-specifikus autológ antitestek, amennyiben sejt tenyészetben termelik, és mint vakcinát alkalmazzák megfelelő lamunogén formában, a vakcina immunválaszt indukálhat ezen antitest idiotípusa ellen, és az 74.581/BE > 4 . : i ί •· · «· ··· · · · említett immunválasz képes hatást gyakorolni a B sejt limfómára [Reichardt et al., Blood, 93, 2411-2419 (1999)].

Összefoglalva azt mondhatjuk, hogy olyan humán monoklonális anti-idiotipus antitestek, amelyek tumor-asszociált antigént utánoznak, vakcinaként immunválaszt tudnak indukálni rák betegekben, minthogy az említett immunválasz feltehetően az említett tumor-asszociált antigén ellen irányul. Hibridóma technológia segítségével vagy humán B sejtek halhatatlanná tételével ilyen humán monoklonális antitesteket kaptak olyan paciensektől, akik anti-tumor antitestet (leginkább egér) kaptak passzív immunterápia gyanánt, és akik ez ellen immunválaszt adtak. Más pacienseket ilyen módon termelt humán monoklonális anti-idiotipus antitestekkel immunizáltak.

olyan humán antitestek, amelyeket B sejt limfóma termel, és ennélfogva meghatározott idiotípusuk van, mint individuális vakcinák, immunválaszt képesek indukálni paciens-specifikus módón, és az említett immunválasz valószínűleg a B sejt limfóma ellen irányul. Az ilyen paciens-specifikus antitesteket individuálisan kell előállítani hibridóma technológia segítségével, vagy a B sejt limfóma sejtjeinek halhatatlanná tételével. Az említett antitesteknek a használata természetesen B sejt limfómák kezelésére korlátozódik.

Tehat jóllehet tudjuk, hogy egy bizonyos fajból származó monoklonális anti-idiotipus antitestek az ugyanehhez a fajhoz tartozó - ahonnan az antitest származik - egyének immunizálására is felhasználhatók, mégis minden esetben szükséges a sejteket .581/BE manipulálni és tenyészteni. Ez a megoldás így időtrabló, és csak monoklonális antitestekre korlátozódik.

Bgy közleményükben Losman és munkatársai [Proc.Natl.Acad. SCI., 88, 3421-3425 (1991)] leírják egy rákos betegtől származó ab2 antitest tisztítását. Előzőleg ezt a beteget egy CEA elleni egér monoklonális antitesttel (NP-4) kezelték. (CEA - karcinoembrionális antigén)

Nyilvánvaló tehát, hogy még mindig igény van olyan eszközökre és eljárásokra, amelyek lehetővé teszik a tumorok hatásos, széles körben alkalmazható és adott esetben individuális kezelését, valamint a rák elleni védelmet.

A találmány alapját tehát egy olyan technikai probléma megoldása képezi, miszerint olyan hatásos eszközöket és eljárásokat kell biztosítania, amelyeket a különböző fajta tumorok körén belül individuálisan lehet használni rák kezelésére és a rák elleni védelemre.

Ezt a technikai problémát az tási alakok ismertetésével oldjuk igénypontokban leírt megvalósímeg.

A találmány tehát olyan készítmény előállítására szolgáló antitestek alkalmazására vonatkozik, amely vakcinaként alkalmazható rák elleni terápiás és profilaktlkus vakcinálásra, amely azzal jellemezhető, hogy az antitesteket tartalmazó testfolyadékból izoláljuk Immunaffinitás tisztítással, és egy vagy több tumorasszociált antigént vagy azonos idiotípusú fragmentumait felismerő antitesteket használunk ligandumként az immunaffinitás tisztításhoz.

A technika mai állása szerint leírt módszerekkel összehason74.581/BE litva a találmány szerinti alkalmazásnak az az előnye, hogy nem használ sejt tenyészeteket anti-idiotípus antitestek előállításához, és ez lehetővé teszi a találmány szerinti elgondolás eredményes, széles körű alkalmazását, továbbá, hogy nem korlátozódik monoklonális antitestekre.

Az antitest állomány, amely például nagy mennyiséget tesz ki minden ember vérében, minden lehető kötő-speelticitással rendelkező antitestekből áll. Tehát ez az antitest állomány elvben olyan antitesteket is (Ab2) tartalmaz, amelyek például bármelyik tumor-asszoclált antigén (TAA) elleni (már ismert vagy új is) egér monoklonális antitest (Abl) idiotipusa ellen irányulnak. Az immunológiai hálózatnak megfelelően ugyanez az antitest állomány minden emberben bizonyos mennyiségű olyan antitestet is tartalmaz, amelyek az autológ Ab2 idiotipusok ellen irányulnak, ezek az úgynevezett Ab3 antitestek. A hálózat teória szerint az Ab3 kötődni tud a tumor-asszociált antigénhez, amelyet a külső Abl határoz meg. Az Ab2/Ab3 egyensúly eltolódása az Ab3 javára azt kell eredményezze, hogy az Immunrendszer képes lesz arra, hogy jobban felismerje és megtámadja az említett antigént hordozó tumór sejteket.

A találmány tehát azon alapul, hogy az immunológiai egyensúly ilyen irányú eltolódása egy individuális autológ Ab2 frakció immunogén vakcina formájában való alkalmazásával elérhető. Ilyen autológ vakcinálással azokat a B sejteket, amelyek az Ab3-at termelik, szeletiven lehet stimulálni. Ehhez a vakcináláshoz az Ab2 frakciónak csak kis mennyiségeire van szükség, amelyet ismert módszerekkel formulázhatunk, alkalmas vakcina adjuvánsok

74.581/BE felhasználásával.

A találmány szerint alkalmazott antitestek tehát antitest tartalmú testfolyadékokból származó Ab2 antitestek, amelyek az immunaffinitas tisztításhoz használt anti-TAA antitest ellen irányulnák. Antitesteket tartalmazó testfolyadék például a vér, plazma, szérum, nyirok, malignus effúziók, stb. Előnyös, ha a testfolyadék szérum. A testfolyadék bármilyen olyan állati szervezetből származhat, amelyeknek antitesteket tartalmazó testfolyadekaik vannak. Előnyös, ha ezek gerincesek, még előnyösebb, ha emlősök és a legelőnyösebb, ha a testfolyadék emberi eredetű.

Minthogy az autológ antitestekkel való vakcinálással indukált immunválaszt ezen antitestek kötési régiója, azaz idiotípusa határozza meg, elvben ezen antitestek fragmentumai vagy származékai is használhatók az eredményes vakcináláshoz az intakt antitest frakciók helyett, amennyiben ezek a fragmentumok vagy származékok még tartalmazzák az illető kiindulási antitest idiotípusat. Tehat az „antitest kifejezés magába foglalja az ilyen antitestek azonos kötő-specificitású fragmentumait vagy származékait is. Példaként, de nem korlátozó szándékkal említjük a következőket: F(ab)'₂ fragmentumok és F(ab)' fragmentumok, amelyek például ismert biokémiai módszerekkel (például enzimes hasítással) állíthatók elő. A „származék kifejezés magába foglalja például az olyan antitest származékokat, amelyek ismert kémiai vagy biokémiai módszerekkel állíthatók elő, például az antitesteket zsírsavakkal amidokká alakítjuk szabad aminocsoportjaikon, hogy növeljük lipofil tulajdonságukat liposzómákba való beépíthetőségük végett. Pontosabban, a „származék kifejezés olyan 74.581/BE termékekre is vonatkozik, amelyeknek az előállításánál antitesteket vagy antitest fragmentumokat kémiai úton olyan molekulákkal kapcsolunk össze, amelyek fokozhatják az immunválaszt. Ilyenek például a tetanusz toxoid, Pseudomonas exotoxin, a lipid A származékai, GM-CSF, IL-2 vagy pedig az antitesteket vagy antitest fragmentumokat olyan polipeptidekkel kapcsoljuk össze kémiailag, amelyek fokozzák az immunválaszt, mint például a GM-CSF, IL-2, IL-12, C3d, stb. Az antitestek tisztítását antitesteket tartalmazó testfolyadékokból, például humán szérumból, immunaffinitas tisztítás segítségével végezhetjük. Ezeket a módszereket a szakterületen járatos személyek ismerik [Clin.Chem., 45,593 (1999); J.Chem.Technoi.Biotechnoi. , 48, 105 (1990)]. A TAA-specifikus antitestet vagy az antitestek egy keverékét szilárd fázison immobilizáljuk. A szilárd fázis lehet egy membrán, egy gél vagy hasonló anyag, amelyhez az antitestek kötő tulajdonságuk lényeges elvesztése nélkül kötődni tudnak. Az immobilizált antitesthez az Ab2-t vagy batch technikával vagy átfolyásos módszerrel köthetjük. Az immunaffinitás tisztítást automatizáltan, kromatografáló készüléken vagy kézi módszerrel végezzük. Azonban az is elképzelhető, hogy az eljárást manuális automatikus vagy fel-automatikus módon végezzük, egyszerű készülék segítségével, amely az immobilizált antitesteke tartalmazza. Egy immunaffinitas kromatografálásnál, amelyet az 1. példában írunk le, 1 ml szérumból (ha szérumot használunk) rendszerint 3-10 pg immunglobulint kapunk. Az ilyen módon kapott antitest frakció általában IgM-ből és IgG-ből áll. Tehát 0,08 - 0,25 mg Ab2-t nyerhetünk egy olyan mennyiségből, amely vérvétel szempontjából elfogadha74.581/BE to, ez 50 ml-t tesz ki, amiből körülbelül 25 ml szérum lesz. Ez a mennyiség alapjában véve elégséges a vakclnáláshoz. Ha nagyobb mennyiségű Ab-t kívánunk Izolálni, ismert technikákat használhatunk - ilyen a plazmaferézls - az Immunaffinitás tisztítással kombinálva. Ha sokféle különböző specificltású antitestet használunk, az immobilizált antitesteket szimultán vagy külön használhatjuk, az immunaffinitás tisztítást parallel vagy sorozatban végezhetjük.

A jelen leírásban a „tumor-asszociált antigén egy olyan struktúra, amely leginkább tumor sejteken jelenik meg, és amely ennélfogva lehetővé teszi, hogy ezeket a sejteket a nem-rosszindulatú sejtektől megkülönböztethessük. A tumor-asszociált antigén leginkább a tumorsejt sejt-membránján vagy sejtmembránjában helyezkedik el. Nem kizárt azonban, hogy il_yen antigének nemdegenerált sejteken is jelen vannak. A tumor-asszociált antigének lehetnek például polipeptidek, nevezetesen glikozilezett proteinek vagy polipeptidek glikozilációs mintázatai. Egyéb struktúrák, amelyek tumor-asszociált antigénként játszhatnak szerepet, például a glikolipidek. Ezek közé tartoznak például a gangliozidok, mint például a GM2. Tumor-asszociált antigénekként jelentkezhetnek a sejt-membrán lipid összetételében bekövetkező változások, amelyek jellemzőek lehetnek a ráksejtekre.

Hosszú idő óta ismertek a különböző tumor-asszociált antigének elleni legkülönbözőbb antitestek. Ezek ismert eljárások alkalmazásával előállíthatok (például: hibridóma technológia, fág display technológia).

Egy előnyös kiviteli alakban az inununaffinitás tisztítással 74.581/BE kapott antitesteket autológ, lodlviduális vakcina gyanánt alkalmazzuk annál az egyénnél, akinek a testfolyadékából izoláltuk.

Ezért a találmány lényeges részét képezi, hogy egy egyén testfolyadékából, például vérből, egy Ab2 frakció izolálása a testfolyadékban jelenlévő antitestek immunaff inltás tisztításával valósítható meg. Llgandumként egy vagy több, tumor-asszocialt antigének elleni antitestet használunk.

Ebben az összefüggésben az egyén bármilyen állati szervezet lehet, főként gerinces, előnyösebb, ha emlős és a legelőnyösebb, ha az egyén ember.

Egy másik előnyös megvalósítási alakban az immunafflnltás tisztításhoz egyidejűleg több olyan antitest használható, amelyek különböző tumor-asszociált antigének és/vagy egy vagy több tumor-asszociált entlgén különböző epitópjai ellen irányulnak. Amennyiben több - különböző tumor-asszociált antigén vagy különböző epitópok elleni — antitestet, főként monoklonális antitestet használunk egyidejűleg a testfolyadékban jelenlévő Ab2 frakció immunaffinitás tisztításához, különböző Ab2-ből álló frakciót kapunk, amelynek tumor-asszociált antigének szelektált sorozata képezi az alapját, és ezek szimultán alkalmazása vakcinaként immunválaszt vált ki mindezen tumor-asszociált antigén vagy epitóp ellen. Így az Immunológiai egyensúly egy lépésben tolódik el a (gyakran együtt kifejeződött) tumor-asszociált antigének vagy epitópok sorozata felé. Egy il_yen eljárás természetesen megnöveli az indukált immunválasz hatásosságát, és lényegesen csökkenti a tumorantlgén-negatív variánsok képződését („tumor menekülés » „tumor escape), minthogy rendkívül valószínűtlen

74.581/BE hogy egy tumorsejt meg tudja szüntetni egyidejűleg több antigén expresszióját.

A fent leírt eljárás elvben minden ismert vagy újonnan felfedezett tumor-asszociált antigénre alkalmazható. Az egyetlen előfeltétel az, hogy egy ilyen antigén ellen egy vagy több olyan antitest - előnyösen monoklonális antitest - álljon rendelkezésre, amelyek ligandumként használhatók immunaffinitás tisztításhoz. Elvben minden lehetséges fajta antitest, nevezetesen poliklonális vagy monoklonális antitest alkalmas, de előnyben részesítjük a monoklonális antitesteket. Poliklonális és monoklonális antitestekből álló keverék is használható. Ezenkívül használhatunk például egér monoklonális antitesteket és más fajból (például patkányból) származó antitesteket is. Ezenfelül használhatunk tumor-asszociált antigén elleni egér-humán kiméra humanizált vagy humán monoklonális antitesteket is. Az immunaffinitás tisztításhoz használt antitestek tulajdonságát kötő régiójuk, azaz idiotípusuk határozza meg. Tehát elvben ezen antitestek fragmentumai is használhatók egy sikeres immunaffinitás tisztításhoz az intakt antitest helyett, amennyiben ezek a fragmentumok még megtartották az illető kiindulási antitest idiotípusát. Ilyenek például - de nem kizárólag - a következők: F(ab)'₂ fragmentumok, F(ab)' fragmentumok és Fv fragmentumok, amelyeket ismert biokémiai módszerek szerint (enzimes hasítás) állíthatunk elő vagy pedig ismert molekuláris biológiai módszerek szerint. Tulajdonképpen a megfelelő típusú antitestek vagy fragmentumok keverékeinek használata szintén lehetséges.

A tumor-asszociált antigének kiválasztása és ennélfogva az

74.581/BE immunaffinitas tisztításhoz használt antitestek, amelyek ezen antigének ellen irányulnak, a tumor indikáció antigén jellemzőitől függ, amelyek ellen a vakcinálást el kell végezni.

A következőkben példaként felsoroljuk azokat a tumor-asszocialt antigéneket, amelyek már ismertek, és amelyek gyakran fejeződnek ki különféle, főképpen epiteliális tumorokon. Az autolog vakcinálási eljárás — amelyet itt leírunk — alkalmazása egyáltalán nem korlátozódik ezekre az antigénekre:

epiteliális sejt adhéziós molekula (Ep-CAM) karcinoembrionális antigén (CEA)

Lewis Y szénhidrát szialil Tn szénhidrát globo H szénhidrát gangliozidok, például GD2/GD3/GM2 prosztata specifikus antigén (PSA)

CA 125

CA 19-9

CA 15-3

TAG-72

EGE receptor idegsejt adhéziós molekula (N-CAM)

Her2/Neu receptor

D 97

CD 20

CD 21.

Az említett (jórészt különféle antigének ellen főképpen monoklonális antitesteket írtak le, amelyek igen jól megfelelnek

74.581/BE ligandumként való alkalmazásra az előzőekben említett Ab2 izolá lasara szolgáló immunaffinitás tisztításhoz.

További tumor-asszociált antigének leírása található például DeVlta és munkatársai szerkesztésében: „Biologlacal Therapy of Cancer, 2. kiadás, 3. fejezet: Biology of Tumour Antigens; Lippincott Company, ISBN 0-397-5144116-6 (1995).

Egy előnyös kiviteli alakban a tumor-asszociált antigén egy membránon elhelyezkedő molekula, amely gyakran fejeződik ki vagy együtt fejeződik ki epltellális eredetű ráksejteken, neuro-endokrin eredetű ráksejteken vagy a vérképző rendszer ráksejtjein.

Egy másik előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti ké szítmény megfelel a készítményben lévő antitestek többszöri alkalmazásához. Az itt leirt eljárás, amely egy egyén testfolyadékából autológ vakcina Izolálására szolgál, természetesen ne, korlátozódik egyetlen bevitelre.

Az immunológiai repertoár eltolódása anti-tumor hatásosság felé, amelyet az első vakcinálás vált ki, az említett eljárás ismétlésével fokozható, például néhány héttel azután, hogy lmmunaffinitás kromatográfiával izoláltuk ez első autológ vakci— nát, testfolyadékot, például vért újra vehetünk és egy új autológ vakcinát készíthetünk és ezt adhatjuk be. Ilyen módon biztosítjuk, hogy az individuális vakcinában az immunológiai egyensúly megfelelő státusa mindig figyelembe van véve. Ezt az eljárást újra és újra kivitelezhetjük megfelelő időközönként (példán! először mindig 4 8 hetenként, azután mindig 6 hónaponként).

Az autológ antitestekkel végzett vakclnálásához szolgáló új készítmény és eljárás - amelyet itt leírunk - elvben mind terá74.581/BE pias, mind prof Hektikus célra alkalmas. A rákos betegek ismételt terápiás vakcmálása vissza tudja szorítani új metasztázisok képződését, és végül lelassíthatja a betegség szóródását. A terápiás autológ vakcináció különösen a betegség következő stádiumaiban lehet hasznos:

A betegség korai stádiumaiban, például egy primer tumor sikeres operációja után (adjuváns stádium) a visszamaradt szétszóródott tumorsejteket az itt leírt autológ vakcináció elpusztítja es meggátolja abban, hogy új metasztázisokat képezzenek. Ennek következtében az ilyen paciensek visszaesés mentes élettartama es így túlélési ideje meghosszabbítható. Ilyen autológ vakcinációk segítségével, a megfelelő időközönként alkalmazott emlékeztető oltásokkal, adott esetben el lehet érni egy élethosszig tartó védelmet a metasztázisok képződése ellen.

Amennyiben már képződtek metasztázisok, a további metasztázisok terjedése és képződése megfékezhető az itt leírt készítmény, vagyis az autológ vakcináció segítségével. A betegség stádium stabilizálódik, ennek eredményeképpen pedig az élet minősége fenntartható és az élettartam meghosszabbítható.

Az itt leírt autológ vakcinációs stratégia olyan pacienseknél is alkalmazható, akik előzőleg monoklonális antitestet kaptak egy tumor-asszociált antigén ellen, diagnosztikus vagy terápiás indokok alapján, és akikben immunválasz fejlődött ki ez ellen. Következésképpen egy immunaffinitás tisztításban, amelyben ez az antitest kerül felhasználásra ligandum gyanánt, nagyobb mennyiségű antitestet kapunk ez ellen (ab2), mint a nem kezelt egyenek eseteben. Ezzel az Ab2-vel végzett vakcinálás fokozza az 74.581/BE

Ab3 képződését, amely valószínűleg már intrinsic képződött. Az Ab3 potenciális anti-tumor eszközökkel megvalósított indukcióját, amely Ab2 indukciója útján, tumor-asszociált antigének elleni egér antitestekkel (Abl) - amelyet i.v. adnak be rákos pacienseknek — végzett passzív immunterápia segítségével érhető el, sok éve lehetségesnek tartották és analizálták [például: Koprowski et al., PNAS, 81, 216-219 (1984)].

Az itt leírt készítmény és autológ vakcináció elvben felhasználható egészséges emberekben profilaktikusan a rákos betegségek kialakulása elleni védelem növelésére. Egy ilyen lépésnek különösen erősen veszélyeztetett csoportoknál van értelme (ide tartoznak például azok az egyének, akiknél genetikai hajlam áll fenn bizonyos rákbetegségek kifejlődésére, amelyek növekvő számban mutathatók ki megfelelő tesztek segítségével)

Az a tény, hogy az illető egyén immunológiai állapotát az idiotípus hálózatra tekintettel figyelembe vesszük azzal, hogy a megfelelő vakcinát előnyösen az egyén testfolyadékából, például szérumából állítjuk elő, az itt leírt individuális autológ vakcinaciós stratégiának fő előnye. Ezenkívül az immunizált egyén következésképpen nem kerül érintkezésbe idegen antigénekkel, hanem csak endogén komponensekkel olyan alkalmas formában, amely megvalósítja az immunológiai egyensúly modulálását.

Egy találmány szerinti előnyös kiviteli alakban az immunaffimtas tisztítással kapott antitestet megfelelő vakcina adjuvánssal formulázzuk.

Mint általában a vakcinákat, az autológ antitest frakciókat vagy fragmentumaikat és származékaikat vakcina adjuvánsokkal 74.581/BE együtt formulázhatjuk. Ezekkel az adjuvánsokkal az immunválaszt fokozzuk. Ilyen adjuvánsok például - de nem kizárólag - az alumínium tartalmú adjuvánsok, nevezetesen az alumínium-hidroxid (például: Alu-gel), lipopoliszacharid származékok, Bacillus Calmette Guerin (BCG), QS-21, liposzóma készítmények, valamint további olyan antigénekkel való formulázás, amelyek ellen az immunrendszer már erős immunválaszt fejlesztett ki, ilyen például a tetanusz toxoid, vagy az influenza vírusok komponensei, adott esetben egy liposzóma készítményben.

Az immunválasz fokozására a vakcina készítményt megfelelő, előnyösen olyan humán citokinekkel együtt is alkalmazhatjuk, amelyek fenntartják az immunválasz képződését. Főképpen - de nem kizárólag - a granulocita-makrofág stimuláló faktor (GM-CSF) említendő. Ez a citokin hatásos immunválaszt stimulál az antigén-feldolgozó sejtek (például dendritikus sejtek) aktiválásával.

Adott esetben ismert és közölt eljárások alkalmazásával az autológ antitest frakciók ex vivo tenyésztett autológ dendritikus sejtekkel is inkubálhatók. Az ilyen módon pulzált dendritikus sejteket ezután beadhatjuk az illető egyénnek. Ilyen módon egy különösen hatásos immunválaszt lehet elérni.

A találmány szerinti alkalmazás egy előnyös alakjában a készítményben lévő antitesteket adjuvánssal keverjük össze és ezután hőkezelést végzünk, előnyösen 70 és 121°C közötti hőmérsékleten. Az adjuváns előnyösen alumínium tartalmú adjuváns. Jóllehet egy ilyen hőkezelés denaturálja ugyan a protein antigént, lehetséges azonban, hogy a protein immunogén részei korrekt formában mégis bemutathatok az immunrendszernek az adjuvánshoz való

74.581/BE kötődésnek köszönhetően. Nem abszolút szükséges denaturálni a proteineket azért, hogy a hőkezelés előnyeit megvalósítsuk. Ismert, hogy a proteinek hődenaturációja nemcsak a hőmérséklettől függ, hanem attól is, hogy a protein meddig van kitéve e hőmérséklet hatasanak. Ezenfelül egyéb fizikokémiai paraméterek is szerepet játszanak, ilyen például az ion-erő, az ionok összetétele, pH érték, az aktív felület típusa és mennyisége a keverékben, amelyek a protein denaturálódásáért felelősek. Lehetnek olyan körülmények, amelyek között az antitestek nem vagy nem teljesen denaturálódnak és/vagy lehetnek egyéb hatások, például: kevesebb deszorpciót lehetséges használni az adjuváns felületén.

Egy adjuvánssal és egy ezt követő hőkezeléssel termelt vakcina további előnye, hogy a fertőző patogének meggyengülnek vagy rnaktiválódnak a teljes készítményben. Ez az előny fontos lehet a vakcina készítmény termelése, tárolása és forgalmazása szempontjából. így nagyobb a biztonság az átvihető betegségek ismert és ismeretlen kórokozói tekintetében. Ezenfelül konzerválószerek nélkül is letölthetők, ha megfelelő csomagolást alkalmazunk, mivel a vakcina mikroba ellenes konzerválását hőkezeléssel végeztük.

Az ilyen formulálás másik előnye az antitestek potenciálisan megnövelt írrmunogenitása, minthogy a hevítés, legalább részben, az antitestek denaturálódását eredményezi. A megnövekedett antigenitas megnövelheti az immunogenitást különösen proteinek esetében, amelyek egyébként mint a szervezet saját proteinjei lennének felismerhetők.

További előny, hogy az antitest - adjuváns komplex potenciálisan tovább stabilizálódik a hőinaktiválás révén, azaz a prote74.581/BE in-antigén deszorpciója nem megy végbe olyan gyorsan, mint azokban az antigén-adjuváns készítményekben, amelyeket nem kezeltek hovel. Ez az előny valószínűleg szélesebb intervallumot enged meg az individuális immunizáló oltások között.

A találmány szerit előállított készítményt általánosan ismert módszereknek megfelelően alkalmazhatjuk, például mint egy vakomat, szubkután vagy intramuszkuláris injekcióban.

A találmány továbbá olyan antitesteket tartalmazó gyógyszerkeszitmenyekre vonatkozik, amelyeket antitest tartalmú testfolyadekokbol izoláltunk immunaffinitás tisztítással, ahol egy vagy több tumor-asszociált antigént vagy ezek azonos idiotípusú fragmentumait felismerő antitesteket használtunk ligandumként az immunaffinitás tisztításhoz.

Mint fent leírtuk, ezek a készítmények, mint vakcinák, terápiás vagy profilaktikus vakcinálásra alkalmasak rák ellen.

A gyógyszerkészítmény előállításának előnyös kiviteli alakjaira, az alkotórészekre, a formulálásra, az alkalmazás módozataira, stb. ugyanaz vonatkozik, mint amit korábban, a találmány szerinti alkalmazással kapcsolatban kifejtettünk.

Végül de nem utolsó sorban, a találmány olyan gyógyszerkészítményre vonatkozik, amely egy egyénből izolált ex vivo tenyésztett dendritikus sejteket tartalmaz. A dendritikus sejteket in vitro olyan antitestekkel inkubáltuk, amelyeket ugyanezen egyéb egy antitest tartalmú testfolyadékából nyertünk immunaffinitás tisztítással.

A találmány ezenkívül rák elleni terápiás vagy profilaktikus vakcinalásra alkalmas eljárásokra is vonatkozik, amelyekben egy

74.581/BE egyénnek olyan antitesteket adunk be, amelyeket antitesteket tartalmazó testfolyadékból - előnyösen ugyanezen egyén testfolyadékából - kaptunk immunaffinitás tisztítással, amelyben egy vagy több tumor-asszociált antigént vagy ezek azonos idiotípusú fragmentumait felismerő antitesteket használtunk ligandumként az immunaffinitás tisztításhoz.

A találmány ezenfelül egy rák elleni terápiás vagy profilaktikus vakcinálásra alkalmas eljárásra vonatkozik, amelyben az egyénnek olyan autológ, izolált dendritikus sejteket adunk be, amelyeket ex vivo tenyésztettünk és amelyeket előzőleg in vitro olyan antitestekkel inkubáltunk, amelyeket antitesteket tartalmazó testfolyadékokból kaptunk immunaffinitás tisztítással, amelyben egy vagy több tumor-asszociált antigént vagy ezek azonos idiotípusú fragmentumait felismerő antitesteket használtunk ligandumként az immunaffinitás tisztításhoz.

Az előnyős kiviteli alakokra ugyanaz vonatkozik, mint amit a találmány alkalmazásával kapcsolatban korábban elmondtunk.

A találmány egy antitest készítmény előállítását szolgáló olyan eljárásra is vonatkozik, amely azzal jellemezhető, hogy az antitesteket antitest tartalmú testfolyadékból izoláljuk immunaffimtas tisztítással, amelyben egy vagy több tumor asszociált antigént, vagy azonos idiotípusú fragmentumait felismerő antitesteket használunk ligandumként az immunaffinitás tisztításhoz.

A találmány szerinti alkalmazással kapcsolatban korábban elmondottak vonatkoznak a testiolyadékokra, a ligandumként hasznait antitestekre, valamint a tumor-asszociált antigénekre is.

Az immunaffinitás tisztítás a szakterületen gyakorlott sze74.581/BE mélyek által ismert módszerek szerint végezhető. Erre az esetre is ugyanaz vonatkozik, mint amit a találmány szerinti alkalmazással kapcsolatban korábban említettünk.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös alakjában több, különböző tumor-asszociált antigének és/vagy ilyen antigének epitopjai elleni antitesteket használunk egyidejűleg az affinitás tisztításhoz. Abban a megoldásban, amelyben több antitestet használunk az affinitás tisztításhoz, ezeket vagy szimultán vagy elkülönítve használhatjuk, az immunaffinitás tisztításokat elvégezhetjük párhuzamosan vagy sorjában, azaz a különböző epitóp és/vagy antigén specificitásokat úgy kombinálhatjuk, ahogy szükséges. Ezeket a kívánalmakat a különböző antigéneknek a különböző individuális tumorokon való kifejeződése szabja meg.

Egy különösen előnyös kiviteli alakban monoklonális antitesteket használunk ligandumokként az immunaffinitás tisztításhoz és egy különösen előnyös kiviteli alakban szérumot használunk testfolyadék gyanánt.

A találmány szerinti eljárás egy antitest előállítására szolgáló eljárás, amelyet rák elleni terápiás vagy profilaktikus vakcmalasra alkalmas gyógyszerkészítmény termelésére alkalmazunk.

A találmány ezenkívül egy olyan gyógyszerkészítmény előállítására szolgaló eljárásra vonatkozik, amelyben egy előbb említett találmány szerinti eljárást alkalmazunk egy antitest készítmény előállítására és az ilyen módon kapott antitest készítményt ezt követően gyógyszerészetileg elfogadott vivőanyaggal es/vagy egy alkalmas vakcina adjuvánssal formulázzuk.

74.581/BE

Ez előnyöse megvalósítási formában az antitest készítményt egy adjuvánssal, előnyösen alumínium-tartalmú adjuvánssal keverjük, majd hőkezelést alkalmazunk 70 és 121°C közötti hőmérsékleten.

A találmány szerinti alkalmazással kapcsolatban korábban említettek vonatkoznak egy ilyen gyógyszer vagy vakcina formulálás előnyös kiviteli formáira is.

A paciensekről közölt adatokat, a bejelentésben hivatkozott közleményeket és adatbanki belépéseket teljes egészükben referenciaként építettük be a bejelentés tartalmába.

Az ábrák rövid magyarázata:

1. ábra: Egy Rhesus majom szérumából származó antitest frakció immunaffinitás tisztításának kromatogrammja (az immobilizált 17-1A antitest használatával).

2. ábra: Immunaffinitás tisztítással tisztított antitest frakció kromatogrammja (méret-kizárásos kromatográfia).

3. ábra: A 17-1A antitesten affinitás tisztítással kapott szérum antitestek kötődése; 17-1A ELISA.

4. ábra: Egy Rhesus majom autológ vakcinálásának eredménye: szérum-Ig kötődése Kato III tumor sejtekhez (sejt ELISA) .

5. ábra: Immunaffinitás tisztítással (kevert ágy: anti-Ep-CAM/Lewis Y) tisztított antitest frakció kromatogrammja (méret kizárásos kromatográfia).

6. ábra: Méret standard kromatogrammja (méret kizárásos kromatográfiás elválasztással).

Az alábbi példákban, amelyek részletesebben szemléltetik a találmányt, de nem korlátozó értelemben, a következő anyagokat használtuk.

74,581/BE

Mikrotitráló lemezek	Immuno Plate F96 MaxiSorp (NUNC) ELISÁhoz Cell Culture Cluster (Costar; Kat. szám: 3598) sejt ELISÁ-hoz
Sejtvonal	KATO III: humán gyomorrák sejtvonal (ATCC HTB 103)
Kapcsoláshoz való puffer	0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát, 0,5 M nátrium-klórid; pH 8,0
A tisztítási puffer	PBS def 0,2 M nátrium-klorid
B tisztítási puffer	0,1 M glicin/HCl, 0,2 M nátrium-klorid; pH 2,9
A táptalaj	RPMI 1640 + 2 g/1 nátrium-hidrogén- -karbonát, 100 E/ml penticillin G, 100 pg/ml sztreptomicin-szulfát, 4 mM glutamin, 10 % fetális borjú szérum (hő-inaktivált)
Kötési puffer	15 mM nátrium-karbonát, 35 mM nátrium-hidrogén-karbonát, 3 mM nátrium-azid; pH 9,6
PBS def (hiányos = deficient)	138 mM nátrium-klorid, 1,5 mM kálium-dihidrogén-foszfát, 2,7 mM kálium-klorid, 6,5 mM dinátrium-hidrogén-foszfát; PH 7,2
Fixáló oldat	0,1% glutáraldehid fiziológiás nátrium- -kloríd-oldatban

74.581/BE

A mosó puffer	2 % nátrium-klorid, 0,2 % Triton X-100, hiányos PBS-ben
B mosó puffer	0,05 %-os Tween 20 hiányos PBS-ben
A blokkoló puffer	5 %-os fetális borjú szérum (hőinaktivált), hiányos PBS-ben
B blokkoló puffer	1 % bovin szérum albumin, 0,1 % nátrium-azid, hiányos PBS-ben
A hígító puffer	2 % fetális borjú szérum (hőinaktivált), hiányos PBS-ben
B hígító puffer	hiányos PBS
Festéshez való puffer	24,3 mM citromsav, 51,4 mM dinátrium-hidrogén-foszfát; pH 5,0
Szubsztrátum	40 mg o-fenilén-diamin-hidroklorid, 100 mM festési puffer, 20 μΐ hidrogén-peroxid (30 §)
Stop oldat	2 M kénsav
Formuláláshoz való puffer	10 % PBS def; pH = 6,0 90 % fiziológiás nátrium-klorid-oldat

1. példa:

Immunaffinitás oszlop készítése TAA-specifikus antitesttel

7,5 g CH-Sepharose 4B-t (Pharmacia) szuszpendáltunk 15 percig 10 ml 1 mM sósavban. A gélt ezután 1 liter 1 mM sósavval

74.581/BE mostuk, majd 200 ml kapcsoláshoz való pufferrel egy AG3 zsugorított üvegszűrőn. A 17-1A egér antitestből (Panorex; törzsoldat 10 mg/ml; Ep-CAM tumor-asszociált antigén elleni antitest) 100 mg-ot 5 liter kapcsoláshoz való pufferrel szemben dializáltunk, ezután 5 mg/ml-re állítottuk be kapcsoláshoz való pufferrel. Ezt az oldatot zárt tartályban kevertük a gél-szuszpenzióhoz. Kapcsoláshoz alkalmas szuszpenziót úgy kapunk, ha a gél:puffer arány 1:2. Ezt a szuszpenziót 24 órán át 4 °C-on forgatással kevertettük (rotated) . Ezután a ligandum feleslegét 3 x 30 ml kapcsoláshoz való pufferrel kimostuk. A visszamaradt reaktív csoportokat 1 órán át tartó inkubálással 1 M etanolamin-nal blokkoltuk 4 °C-on. A gélt ezután 1 órán át szobahőmérsékleten 0,1 M trisz-HCl pufferben forgatással kevertettük. Végül a gélt három ciklusban váltakozó pH értékű pufferekkel mostuk. Minden ciklus a következőkből állt: 0,1 M nátrium-acetát puffer, pH 4, 0,5 M nátrium-kloriddal és ezután 0,1 M trisz-HCl puffer, pH 8, 0,5 M nátrium-kloriddal. A gélt 4 °C-on tároljuk.

2. példa:

Szérumból származó antitest frakció immunaffinitás tisztítása immunaffinitás kromatográfiával

Rhesus majmoktól 10 ml perifériás vért vettünk és ebből nyertük a szérumot. Az egész műveletet steril körülmények között végeztük.

Az immunaffinitás tisztítást FPLC rendszerben (Pharmacia) végeztük. Az 1. példa szerint kapott gél 1 ml-ével megtöltöttünk egy HR5/5 oszlopot (Pharmacia). 5 ml szérumot l:10-re hígítottunk A tisztítási pufferrel. Ezt az oldatot 1 ml/perc sebesség

74.581/BE mellett átnyomattuk az oszlopon, majd az A tisztítási pufferrel addig mostuk, amíg a detektor UV alapvonalát újból elértük (280 nm) . A megkötött immunglobulinokat B tisztítási pufferrel elváltuk, és a frakciót 1 M dinátrium-hidrogén-foszfát oldattal semlegesítettük közvetlenül a deszorpció után. Az 1. ábra ennek a tisztításnak egy kromatogrammját mutatja (UV 280 nm).

Az ilyen módon tisztított antitest frakció 50 μΐ-ét méret kizárásos oszlopon (SEC = size exclusion chromatography: Zorbax 250 GF) analizáltuk. Futtató szerként 220 mM foszfát puffer (pH 7) + 10 % acetonitril tartalmú oldatot használtunk. Az analízis kromatogrammjából (2. ábra) látható, hogy az antitest frakció IgM-et és IgG-t tartalmaz körülbelül 3:2 arányban. Az antitest frakció teljes mennyisége körülbelül 40 pg volt [méret kizárásos kromatográfiával (SEC) határoztuk meg, standardhoz hasonlítva]. Az így kapott antitest frakciót ELISÁ-val teszteltük a 17-1A antitesthez (amelyet ligandumként használtunk az affinitás tisztításnál) való kötődésre nézve: a tumor-asszociált antigén elleni antitest - amelyet a tisztításhoz használtunk - 100 μΐ-es részleteit (17-1A antitest; 10 μg/ml-es oldat kötési pufferben) egy mikrotitráló lemez tartályaiban 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Miután a lemezt hatszor mostuk A mosó pufferrel, 200 μΐ A blokkoló puffért mértünk be és 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. Miután a lemezt hatszor mostuk A mosó pufferrel, 200 μΐ A blokkoló puffért mértünk be és 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. Miután a lemezt, mint fent leírtuk, mostuk, a vizsgálandó affinitás tisztított antitest frakció, valamint az ezzel azonos koncentrációjú normál humán immunglobulin, mint negatív kontroll 100 μΐ-es

74.581/BE részleteit A hígító pufferben 1:4 - 1:65000 hígításban 1 órán át 37 °C-on mkubáltuk. Ekkor a lemezt, mint fent leírtuk, mostuk, majd 100 pl peroxidázzal konjugált kecske anti-humán lg antitestet (Zymed) mértünk be A hígító pufferrel l:1000-re hígítva, és 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. A lemezt négyszer mostuk A mosó pufferrel és kétszer festéshez való pufferrel. Az antitest kötődését úgy határoztuk meg, hogy 100 μΐ specifikus szubsztrátumot adtunk hozzá és a színreakciót körülbelül 3 perc múlva állítottuk le 50 μΐ stop oldat hozzáadásával. A kiértékelést úgy végeztük, hogy az optikai sűrűséget (OD) 490 nm hullámhosszon mértük (a referencia mérés hullámhossza 620 nm).

A 2. ábrából látható, hogy az affinitás-tisztított antitest frakció szignifikánsan a 17-1A antitesthez kötődik, míg a normál human immunglobulin láthatólag nem kötődik.

3. példa:

Vakcina formulálása tisztított antitestekkel

Az affinitás tisztítással kapott antitest frakciót alumínium-hidroxid adjuvánssal formuláltuk a következő előírásoknak megfelelően: 1 mg alumínium-hidroxidot (vizes szuszpenzió) Alhydrogel, Superfos) adtunk az affinitás kromatográfia után kapott antitest oldat (körülbelül 40 pg antitestet tartalmaz) 3 miéhez és a szuszpenziót „FILTRON centrifuga fiolában centrifugáltuk (Microsep, cut-off 10 kD) 30 percig 4000 g mellett. Ezután az oldatot kétszer 1 ml formuláláshoz való pufferben szuszpendáltuk és 30 percig 4000 g mellett centrifugáltuk. A szuszpenziót 0,5 ml-re töltöttük fel a formuláláshoz való pufferrel és az ilyen módon kapott szuszpenziót sterilen töltöttük le.

74.581/BE

4. példa:

Rhesus majmok immunizálása autológ, immunaffinitás-tisztí tott antitestekkel

Annak a Rhesus majomnak, amelynek a szérumából a 2. és 3. példában leírtak szerint készült a vakcina, a hátába szubkután adtuk be ezt a vakcinát. Ezen első vakcina oltás előtt 5 ml vért vettünk, szérum (pre-szérum) nyerése végett (a kezdeti értékek meghatározására, az immunválasz vizsgálata céljából). Két héttel ezután 10 ml vért vettünk újból szérum nyerése végett. Ennek a szérumnak 4 ml-éből újból elkészítettünk - ahogy fent leírtuk egy autológ vakcinát. A Rhesus majmot az újonnan kapott vakQinával szubkután oltottuk be, újból a hátán. Ezután a vakcinálás u tán 4 héttel újból 5 ml vért vettünk szérum nyerése végett (a két vakcina oltás hatásának a meghatározására).

A Rhesus majom pre-szérumát és a második oltás után 4 héttel kapott immunszérumot sejt ELISA rendszerben analizáltuk, hogy vajon az antitestek megkötődnek-e a KATO III sejtvonalon. Erre a célra a következő lépéseket végeztük el:

Egy mikrotitráló lemez tartályait KATO III sejtvonalból készített 100 μΐ sejt-szuszpenzióval - 2 x 10⁶ sejt/ml A táptalaj koncentrációval - inkubáltuk egy éjszakán át 37 °C-on. A felülúszó leszívása után minden tartályhoz 200 μΐ B blokkoló puffért adtunk és a lemezt 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezután kétszer mostuk 200 μΐ B mosó pufferrel, majd a vizsgálandó majom szérum 100 μΐ-es részleteit B hígító pufferben készített 1:4 - 1:56000 hígításokban 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáltuk. Miután a lemezeket 2 x 100 μΐ jéghideg B mosó pufferrel mostuk, 100

74.581/BE μΐ peroxidázzal konjugált kecske anti-humán lg antitestet (Zymed) mértünk be A hígító pufferben készített 1:1000 hígításban, majd 45 percig 37 C-on inkubáltuk. A lemezt háromszor mostuk 100 μΐ jéghideg B mosó pufferrel. Az antitestek kötődését úgy mutattuk ki, hogy hozzáadtunk 100 μΐ specifikus szubsztrátumot és a színreakciót 5 perc múlva 50 μΐ stop oldattal állítottuk le. A kiértékelést az optikai sűrűség (OD) mérésével 490 nm-en végeztük (a referencia mérés hullámhossza 620 nm) .

Mint a 4. ábrából látható, az autológ módon vakcináit Rhesus majom immunszéruma immunglobulinokat tartalmaz. Ezek az immunglobulinok képesek kötődni KATO III tumor sejtekhez, míg ilyen antitesteket alig lehet detektálni ugyanezen állat pre-szérumában.

A fent leírt kísérletek eredményeinek köszönhetően be tudtuk mutatni példaképpen, hogy tumor—asszociált antigén elleni mono— klonális antitesteken végzett immunaffinitás tisztítással kapott individuális autológ antitest frakciókkal megvalósított vakciná— lás humorális immunválaszt váltott ki, amely az említett tumorasszociált antigént kifejező humán tumor sejteken kötődik.

5. példa:

Immunaffinitás oszlop készítése két különböző TAA-specifikus antitesttel

Ep-CAM-mel reagáló monoklonális egér antitestet és Lewis Ynal reagáló monoklonális egér antitestet kapcsoltunk aktivált CH Sepharose 4B-hez (Pharmacia Biotech, Svédország) , standard technikák szerint.

7,5 g CH Sepharose 4B-t szuszpendáltunk 20 ml 1 mM sósavban 15 percig, majd áztattuk. A gélt 1 liter 1 mM sósavban mostuk, 74.581/BE es ezután 200 ml kapcsoláshoz való pufferben egy AG3 zsugorított üvegszűrőn. 100 mg egér antitestet (10 mg/ml-es törzsoldat) dializaltunk 5 1 kapcsoláshoz való pufferrel szemben, majd 5 mg/mlre állítottuk be kapcsoláshoz való pufferrel. Ezt az oldatot a gel-szuszpenzióval kevertük össze egy zárt tartályban. Kapcsoláshoz alkalmas szuszpenzió 1:2 gél .-puffer aránynál érhető el. Ezt a szuszpenziót 24 órán át 4 °C-on forgatással kevertettük. Ezután a ligandum felesleget 3 x 30 ml kapcsoláshoz való pufferrel kimostuk. A visszamaradt reaktív csoportokat 1 M etanol-aminnal 1 órán át 4 °C-on való inkubálással blokkoltuk. Ezután a gélt forgatással kevertettük 1 órán át szobahőmérsékleten 0,1 m trisz.HCl pufferben. Végül a gélt három ciklusban mostuk pufferrel változtatva a pH értékeket. Minden ciklus a következőkből állt: 0,1 M nátrium-acetát puffer, pH 4, 0,5 M nátrium-klorid-oldattal. A gélt 4 °C-on tároltuk.

A két affinitás mátrixból két azonos mennyiséget kevertünk össze és egy immunaffinitás kromatografáló oszlopba (System Akta, Pharmacia, Svédország) töltöttük.

6. példa:

Majom szérumból izolált antitestek tisztítása két különböző TAA-specifikus antitesttel szimultán végzett immunaffinitás tisztítással

Immunologiailag szűz Rhesus majmokból 20-20 ml vért vettünk, majd 9 ml szérumokat tisztítottunk az 5. példában leírt immunaffinitas kromatografáló oszlop (System Akta, Pharmacia, Svédország) alkalmazásával.

Puffer a felvitelhez: A tisztítási puffer

74.581/BE

Elucios puffer: B tisztítási puffer.

Az eluátumot 0,5 M nátrium-hidrogén-foszfát oldattal semlegesítettük.

Az eluátumokat úgy frakcionáltuk, hogy a tisztított proteineket magas koncentrációban kapjuk meg.

A tisztított antitest frakció 50 μΙ-ét méret kizárásos oszlopon (SEC; Zorbax 250 GF) analizáltuk. Futtató szerként 220 mM foszfát puffért, pH 7 ₊ 10 % acetonitrilt használtunk (átfolyási sebesség: 1000 ml/perc; hullámhossz: 214 nm) . Az analízis kromatogrammjából látható (5. ábra), hogy az antitest frakció _IgM-et (retenclós idő 6,963 perc9 és IgG-t (retenciós idő: 8,745 perc) tartalmaz körülbelül 3:2 arányban.

Az antitest frakció teljes mennyisége körülbelül 50 pg volt (a meghatározás SEC módszerrel történt, standarddal összehasonlítva; 6. ábra).

7. példa:

A vakcina különbözőképpen végzett formulálása tisztított antitestekből

A vakcinát centrifugáláshoz alkalmas ultraszúró egységekben (Centricon 10; Amlcon, USA) formuláltuk. Erre a célra az ultraszűrő egységeket 0,86 * nátrlum-kloridot tartalmazó 1 mM nátrium-foszfát pufferrel pH 6,0 (NBK) mostuk centrifugálással.

Ezután 1 ml puffért (NBK) töltöttünk az egységbe és 37 μΐ Alhydrogel 2 i (Superfos Biosector, Dánia) készítményt adtunk hozzá.

Miután hozzáadtuk a 6. példa szerinti semlegesített eluátumot, a centrifugálást és mosást a Centricon utasításai szerint

74.581/BE végeztük el.

Ezután a vakcinát reszuszpendáltuk, 550 μΙ-re töltöttük fel pufferrel, és sterilen letöltöttük.

Másképpen úgy járunk el, hogy reszuszpendálás után a vakcinát 545 μΙ-re töltjük fel pufferrel, és 5,5 μΐ Thymerosal törzsoldatot (10 mg/ml, Sigma, USA) adunk hozzá.

A formulálás harmadik variánsa szerint a vakcinát autoklávban hőkezeljük (121°C, 20 perc) miután sterilen üveg fiolákba töltöttük.

74.581/BE

Claims (23)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Antitestek alkalmazása olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amely vakcinaként alkalmazható rák elleni terápiás ^va<jy profilaktikus vakcinálásra, azzal jellemezve, hogy az antitesteket tartalmazó testfolyadékból izoláljuk immunaffinitás tisztítással, amikoris egy vagy több tumor-asszociált antigént vagy ezek azonos idiotípusú fragmentumait felismerő antitesteket használunk ligandumként az immunaffinitás tisztításhoz és hogy a testfolyadékok egy olyan egyéntől származnak, aki előzőleg nem kapott olyan monoklonális antitestet, amely valamely tumor-aszszociált antigén ellen irányul.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszerkészítményt autológ, individuális vakcina gyanánt kívánjuk alkalmazni annál az egyénnél, akinek a testfolyadékából az antitesteket izoláltuk.
3. 3. Antitestek alkalmazása olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amely vakcinaként alkalmazható rák elleni terápiás ^vagy profilaktikus vakcinálásra, azzal jellemezve, hogy az antitesteket tartalmazó testfolyadékokból izoláljuk immunaffinitás tisztítással, továbbá, hogy egy vagy több tumor-asszociált antigént vagy ezek azonos idiotípusú fragmentumait felismerő antitesteket használunk ligandumként az immunaffinitás tisztításhoz és hogy a gyógyszerkészítményt autológ, individuális vakcina gyanánt kívánjuk alkalmazni annál az egyénnél, akinek a testfolyadékából az antitesteket izoláltuk.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás,

   74.581/BE ahol a testfolyadék szérum.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az egyén egy ember.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol több, különböző tumor-asszociált antigének és/vagy az ilyen antigének különböző epitópjai elleni antitesteket használunk egyidejűleg az immunaffinitás tisztításhoz.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az immunaffinitás tisztításhoz ligandumként használt antitestek monoklonális antitestek.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszerkészítményt ismételten előállítjuk és ezeket mint individuális vakcinákat egymás utáni beadásra szánjuk, megfelelő időközönként ismételve.
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a tumor-asszociált antigének membrán-helyzetű molekulák, amelyek gyakran fejeződnek ki és/vagy együtt fejeződnek ki epiteliális eredetű ráksejteken vagy neuroendokrin eredetű ráksejteken vagy a vérképző rendszer ráksejtjein.
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az immunaffinitás tisztítással tisztított antitesteket vagy származékaikat alkalmas vakcina adjuvánssal együtt formuláljuk.
11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény még egy proteint is tartalmaz, amely fokozza az immunválaszt és amelyet az antitesttel egyszerre alkalmazunk.
12. 12. A 11. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a protein egy humán protein.

    74.581/BE
13. 13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a humán protein a granulocita-makrofág stimuláló faktor (GM-CSF).
14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítmény az immunaffinitás tisztítással tisztított antitestek vakcinaként való beadására alkalmas szubkután, vagy intramuszkuláris injekcióban.
15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a készítményben jelenlévő antitesteket adjuvánssal keverjük és hőkezelésnek vetjük alá.
16. 16. Egy egyénből izolált, ex vivo tenyésztett dendritikus sejtek alkalmazása olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amely mint vakcina rák elleni terápiás vagy profilaktikus vakcinálásra alkalmas, amelyben a dendritikus sejteket előzőleg in vitro olyan antitestekkel inkubáltuk, amelyeket ugyanezen egyén antitest tartalmú testfolyadékából kaptunk immunaffinitás tiszítás révén, amikoris egy vagy több tumor-asszociált antigént vagy ezek azonos idiotípusú fragmentumait felismerő antitesteket használtunk ligandumként az immunaffinitás tisztításhoz és ahol a testfolyadék egy olyan egyéntől származik, aki előzőleg nem kapott egy vagy több tumor-asszociált antigén elleni monoklonális antitestet.
17. 17. Gyógyszerkészítmény, amely antitesteket tartalmazó testfolyadékokból immunaffinitás tisztítással kapott antitesteket tartalmaz, ahol egy vagy több tumor-asszociált antigént vagy ezek azonos idiotípusú fragmentumait felismerő antitesteket használtunk ligandumként az immunaffinitás tisztításhoz és ahol a testfolyadék egy olyan egyéntől származik, aki előzőleg nem 74.581/BE kapott egy vagy több tumor-asszociált antigén elleni monoklonális antitestet.
18. 18. Gyógyszerkészítmény, amely egy egyénből izolált, ex vivo tenyésztett dendritikus sejteket tartalmaz, ahol a dendritikus sejteket előzőleg in vitro olyan antitestekkel inkubáltuk, amelyeket ugyanezen egyéntől származó antitest tartalmú testfolyadékból kaptunk immunaffinitás tisztítással, amikoris egy vagy több tumorasszociált antigént, vagy ezek azonos idiotípusú fragmentumait felismerő antitesteket használunk ligandumként az immunaffinitás tisztításhoz és ahol a testfolyadék egy olyan egyéntől származik, aki előzőleg nem kapott egy vagy több tumorasszociált antigén elleni monoklonális antitestet.
19. 19. Eljárás antitest készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az antitesteket antitesteket tartalmazó testfolyadékból izoláljuk immunaffinitás tisztítással, ahol egy vagy több tumor-asszociált antigént vagy ezek azonos idiotípusú fragmentumait felismerő antitesteket használunk ligandumként az immunaffinitás tisztításhoz és ahol a testfolyadék olyan egyéntől származik, aki előzőleg nem kapott egy vagy több tumor-asszociált antigén elleni monoklonális antitestet.
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelyben több, különböző tumor-asszociált antigének és/vagy az ilyen antigének epitópjai elleni antitestet használunk egyidejűleg az affinitás tisztításhoz.
21. 21. A 19. vagy a 20. igénypont szerinti eljárás, amelyben az affinitástisztításhoz használt antitestek monoklonális antitestek.

    74.581/BE

    A 19-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a testfolyadék szérum.
22. 23. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy antitest készítményt állítunk elő a 19-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárásnak megfelelően, és az ilyen módon kapott antitest készítményt egy gyógyszerészetileg elfogadott vivőanyaggal és/vagy egy alkalmas vakcina adjuvánssal formuláijuk.
23. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, amelyben az antitest készítményt adjuvánssal keverjük, és hőkezelésnek vetjük alá.

    A meghatalmazott:

    β G t—ε_<'(Ά^ι4

    74.5B1/BE