ES2218272T3

ES2218272T3 - Uso anticuerpos anti-idiotipicos en calidad de vacunas contra el cancer.

Info

Publication number: ES2218272T3
Application number: ES00987250T
Authority: ES
Inventors: Hans Loibner; Helmut Eckert; Gottfried Himmler
Original assignee: Igeneon Krebs-Immuntherapie Forschungs- und Entwicklungs-GmbH
Current assignee: Igeneon Krebs-Immuntherapie Forschungs- und Entwicklungs-GmbH
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 2000-11-15
Publication date: 2004-11-16
Anticipated expiration: 2020-11-15
Also published as: NO20022333L; DK1229936T3; CA2391927A1; ATA192799A; MXPA02004942A; HUP0204216A2; WO2001035989A3; PL356770A1; DE50006526D1; WO2001035989A2; AU780853B2; JP2003514028A; IL149614A0; NZ518669A; IS6381A; PT1229936E; BR0015597A; SK6542002A3; EP1229936A2; AT409086B

Abstract

Uso de anticuerpos para la preparación de una composición farmacéutica adecuada como vacuna para la vacunación terapéutica o profiláctica contra el cáncer, caracterizado porque los anticuerpos se obtienen a partir de fluidos corporales que contienen anticuerpos por purificación de inmunoafinidad, en la que se utilizan como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, y en el que los fluidos corporales proceden de un individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.

Description

Uso de anticuerpos anti-idiotípicos en calidad de vacunas contra el cáncer.

La presente invención describe el uso de anticuerpos que se fijan a anticuerpos contra antígenos asociados a tumores, y que se obtienen por purificación de inmunoafinidad a partir de fluidos corporales que contienen anticuerpos individuales, en ligandos específicos, para la preparación de una composición para la vacunación autóloga, profiláctica o terapéutica, e individual contra enfermedades oncológicas. Los ligandos de la purificación de inmunoafinidad son anticuerpos o sus derivados dirigidos contra uno o múltiples antígenos asociados a tumores. Adicionalmente, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos obtenidos por purificación de inmunoafinidad o células dendríticas pulsadas in-vitro con éstos.

El sistema inmunológico adaptativo del ser humano está formado por dos componentes fundamentales, la inmunidad humoral y la inmunidad celular. La inmunorrespuesta adaptativa se basa en la selección clonal de linfocitos B y T y permite, en principio, el reconocimiento de cualquier antígeno, así como la construcción de una memoria inmunológica. Estas características del sistema inmunológico adaptativo se utilizan, en general, de manera provechosa en la vacunación.

Cada célula B produce un anticuerpo con una determinada especificidad de fijación. Este anticuerpo se encuentra como receptor específico también en la membrana de las células B que lo producen. La inmunorrespuesta humoral contra antígenos reconocidos como extraños se basa en la activación selectiva de aquellas células B que producen estos anticuerpos capaces de fijarse al epitopo del correspondiente antígeno. En la multiplicidad de anticuerpos, los reordenamientos del ADN en el trascurso de la diferenciación de las células B juegan un papel decisivo.

En el suero humano se encuentran en elevada cantidad anticuerpos de las más diversas especificidades, isotipos y subclases. La concentración total de todas las inmunoglobulinas en suero asciende a 15-20 mg/ml; es decir, en la sangre circulan permanentemente aprox. 100 g de inmunoglobulinas de las más diversas especificidades. No resulta posible establecer el número exacto de todos los anticuerpos con diversa especificidad. El repertorio teóricamente posible podría estar en torno a 10^{11}. Un determinado anticuerpo puede fijarse, en general, a diversos antígenos similares entre sí, si bien con distinta afinidad y avidez.

El sistema inmunológico debe mantener en equilibrio, con la ayuda de mecanismos de regulación endógena, una homeostasis relativa a la distribución y valoración de estas diferentes especificidades. Un mecanismo importante, en este sentido, es la "red idiotípica", postulada hace unos 25 años por Niels Jerne (Jerne, Ann. Immunol. 125C (1974), 373-389): contra cada idiotipo de un anticuerpo, que determina su especificidad de fijación, existen anticuerpos anti-idiotípicos, que también se fijan al idiotipo del primer anticuerpo en el sentido de un reconocimiento de antígeno. Jerne propuso que las interacciones entre los receptores específicos para el idiotipo en los linfocitos podrían ser responsables de la regulación del sistema inmunológico. Aparentemente, estas interacciones existen en la realidad, puesto que se ha demostrado que en el trascurso de una inmunorrespuesta se forman también anticuerpos anti-idiotípicos contra los anticuerpos inducidos de forma primaria por la inmunorrespuesta. Dado que existen anticuerpos anti-idiotípicos contra cada anticuerpo, los linfocitos no toleran básicamente los idiotipos de los anticuerpos.

En sentido inmunológico, algunos anticuerpos anti-idiotípicos pueden representar la "imagen interna" de un antígeno. Estos anticuerpos se pueden utilizar, por lo tanto, como sustitutos del antígeno nominal para la inmunización, puesto que pueden unirse en parte al antígeno nominal a través de anticuerpos inducidos durante una inmunización. Esta teoría se utiliza desde hace tiempo, especialmente en la inmunoterapia del cáncer. Desde hace más de 10 años existe una serie de proyectos preclínicos y clínicos para generar inmunorrespuestas contra antígenos asociados a tumores mediante la vacunación con anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales (véase, por ejemplo: Bhattacharya-Chatterjee, Foon; Anti-idiotype antibody vaccine therapies of cancer; Cancer Treat. Res. 94 (1998), 51-68). La mayor parte de estos anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales tiene su origen en el ratón, si bien existen también ensayos con anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales humanos (por ejemplo, Fagerberg et al., PNAS 92 (1995), 4773-4777).

Los ensayos de inmunización terapéutica de pacientes con linfomas de células B representan un caso especial. En estas enfermedades, degenera un determinado clon de células B que produce una determinada inmunoglobulina con un idiotipo característico para ella, presente también como receptor en la membrana celular. Este anticuerpo es monoclonal y se puede considerar como antígeno específico para el tumor en el linfoma de células B. Se ha demostrado que estos anticuerpos autólogos, específicos para los pacientes, preparados en cultivos celulares y administrados como vacuna en una forma inmunogénica adecuada, pueden generar una inmunorrespuesta contra el idiotipo de este anticuerpo, capaz de evidenciar una acción contra el linfoma de células B (Reichardt et al., Blood 93 (1999), 2411-2419).

En resumen, se puede afirmar que:

\bullet: los anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales humanos que imitan a un antígeno asociado a un tumor, pueden desencadenar, como vacuna en pacientes de cáncer, una inmunorrespuesta que puede estar dirigida contra este antígeno asociado al tumor. Estos anticuerpos monoclonales humanos se han obtenido por tecnología de hibridación o inmortalización a partir de células B humanas de pacientes que habían recibido un anticuerpo antitumoral (a menudo, de ratón) como inmunoterapia pasiva y que habían generado una inmunorrespuesta contra el mismo. Con los anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales humanos preparados de esta forma se ha inmunizado a otros pacientes.

\bullet: Los anticuerpos humanos, producidos por un linfoma de células B y que, por lo tanto, poseen un idiotipo definido, pueden desencadenar, como vacuna individual, una inmunorrespuesta específica para el paciente que puede estar dirigida contra el linfoma de células B. Estos anticuerpos específicos de pacientes se deben obtener por tecnología de hibridación o inmortalización de las células del linfoma de células B de manera individual. Su uso está limitado, evidentemente, al tratamiento de linfomas de células B.

De esta forma, se sabe que se pueden utilizar anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales de una determinada especie para inmunizar también a individuos de la misma especie de la que proceden los anticuerpos. Con este objetivo es preciso, sin embargo, manipular y cultivar células para cada caso. Por lo tanto, esta técnica resulta costosa y está limitada a anticuerpos monoclonales.

En Losman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 3421-3425, se describe la purificación de anticuerpos Ab2 a partir de un paciente de cáncer. Este paciente había sido tratado previamente con un anticuerpo monoclonal de ratón (NP-4) contra CEA.

Es evidente que existe, al igual que antes, la demanda de poner a disposición métodos y medios que permitan llevar a cabo un tratamiento eficaz, ampliamente aplicable y, eventualmente, individualizado de tumores, así como una protección contra enfermedades oncológicas.

La presente invención tiene, en consecuencia, la misión de poner a punto medios y procedimientos eficaces y aplicables individualmente en el marco de diversos tipos de tumores, para el tratamiento del cáncer, así como para la protección contra enfermedades oncológicas.

Esta tarea se resuelve por la puesta a disposición de las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones.

Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de anticuerpos para la preparación de una composición adecuada como vacuna para la vacunación terapéutica o profiláctica contra el cáncer, caracterizado porque el anticuerpo se obtiene de fluidos corporales que contienen anticuerpos por purificación de inmunoafinidad, en los que se utilizan como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, y en los que los fluidos corporales proceden de un individuo al que no se ha administrado previamente un anticuerpo monoclonal dirigido contra alguno de los antígenos asociados a tumores.

El uso según la invención tiene, con respecto a los métodos descritos en el estado de la técnica, la ventaja de que para la preparación de los anticuerpos anti-idiotípicos no se utilizan cultivos celulares. De este modo, el concepto según la invención permite una amplia y eficaz aplicación y no está limitada a anticuerpos monoclonales.

El conjunto de anticuerpos presente, por ejemplo, en grandes cantidades en la sangre de cada persona, contiene anticuerpos de cualquier especificidad de fijación posible. En consecuencia, este conjunto de anticuerpos contiene fundamentalmente también anticuerpos (Ab2) contra el idiotipo de anticuerpos monoclonales (ya conocidos, pero también nuevos), por ejemplo, de ratón (Ab1) contra cualquier antígeno asociado a tumores (TAA). De acuerdo con la red inmunológica, el mismo conjunto de anticuerpos contiene, en cada persona y en cantidades determinadas, también anticuerpos contra los idiotipos de los Ab2 autólogos, los llamados anticuerpos Ab3. Según la teoría de la red, los Ab2 se pueden fijar al antígeno asociado a un tumor definido por los Ab1 externos. Un desplazamiento del equilibrio de Ab2/Ab3 a favor de Ab3 deberá tener como consecuencia que las células tumorales del sistema inmunológico, portadoras de este antígeno, puedan ser mejor reconocidas y atacadas.

La base de la presente invención consiste en que sea posible lograr dicho desplazamiento del equilibrio inmunológico mediante la administración de una fracción de Ab2 autólogos en forma de una vacuna inmunogénica. Por medio de la vacunación autóloga de este tipo es posible estimular de manera selectiva aquellas células B que producen Ab3. Para esta vacunación se requieren sólo pequeñas cantidades de la fracción de Ab2 que se puedan formular de forma inmunogénica, mediante métodos en sí conocidos, con un coadyuvante de vacuna adecuado.

Los anticuerpos utilizados según la invención son, por lo tanto, anticuerpos Ab2 obtenidos de fluidos corporales que contienen anticuerpos, dirigidos contra los anticuerpos anti-TAA empleados para la purificación de inmunoafinidad. Fluidos corporales que contienen anticuerpos son, por ejemplo, sangre, plasma, suero, linfa, efusiones malignas, etc. Se prefiere el suero como fluido corporal. El fluido corporal puede proceder también de un organismo animal que posea fluidos corporales portadores de anticuerpos. Se trata especialmente de vertebrados, de forma muy preferida, de mamíferos y, de forma especialmente preferida, el fluido corporal es de origen humano.

Dado que la inmunorrespuesta inducida por la vacunación con anticuerpos autólogos está determinada por las regiones de unión de estos anticuerpos, es decir, por su idiotipo, en principio es posible utilizar con éxito, en lugar de fracciones de anticuerpos intactos, fragmentos o derivados de estos anticuerpos para la vacunación, siempre que éstos conserven el idiotipo de los correspondientes anticuerpos de partida. El concepto de "anticuerpo" abarca, por tanto, también fragmentos o derivados de estos anticuerpos, con la misma especificidad de fijación. Como ejemplos, aunque no limitado a ellos, se pueden citar: fragmentos de F(ab)'_{2} y fragmentos de F(ab)', que se pueden preparar, por ejemplo, mediante métodos bioquímicos en sí conocidos (por ejemplo, por separación enzimática). El concepto de "derivado" comprende, en este sentido, por ejemplo, derivados de anticuerpos que se pueden preparar según métodos químicos o bioquímicos en sí conocidos tales como, por ejemplo, con ácidos grasos en anticuerpos amidados en funciones amino libres, para elevar la lipofilia en su incorporación de liposomas. En especial, el concepto comprende también productos que se pueden generar por acoplamiento químico de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con moléculas capaces de potenciar la inmunorrespuesta tales como, por ejemplo, el toxoide del tétanos, la exotoxina de Pseudomonas, derivados del Lípido A, GM-CSF, IL-2, o mediante acoplamiento químico de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con polipéptidos que refuerzan la inmunorrespuesta tales como, por ejemplo, GM-CSF, IL-2, IL-12, C3d, etc. La purificación de los anticuerpos procedentes de fluidos corporales que contienen anticuerpos, por ejemplo, del suero humano, por purificación de inmunoafinidad puede tener lugar según métodos conocidos por el especialista (Clin. Chem. 45 (1999), 593; J. Chem. Technol. Biotechnol. 48 (1990), 105). Para ello, se inmoviliza un anticuerpo específico de TAA, o una mezcla de anticuerpos, sobre una fase sólida. La fase sólida puede ser, en este caso, una membrana, un gel o un material semejante, al que se puede unir el anticuerpo sin una pérdida importante de las propiedades de fijación. La unión de los Ab2 a los anticuerpos inmovilizados se puede llevar a cabo de manera discontinua o en un procedimiento continuo. La purificación de inmunoafinidad se puede realizar automáticamente en un dispositivo de cromatografía, o por medio de un procedimiento manual. No obstante, también es posible llevar a cabo el procedimiento mediante un dispositivo sencillo, que contiene los anticuerpos inmovilizados, de forma manual, automática o semiautomática. En una cromatografía de inmunoafinidad, descrita en el Ejemplo 1, se obtienen, por lo general, 3-10 \mug de inmunoglobulina por ml de suero utilizado. En general, la fracción de anticuerpos obtenida de esta manera está formada por IgM e IgG. También es posible obtener a partir de una cantidad aceptable para una extracción de sangre de, por ejemplo, 50 ml, que proporciona aprox. 25 ml de suero, alrededor de 0,08-0,25 mg de Ab2. Esta cantidad es suficiente ya para la vacunación. En caso que se deseen obtener cantidades mayores de Ab2, se puede utilizar la técnica en sí conocida de plasmaféresis, combinada con purificación de inmunoafinidad. Cuando se utilicen múltiples anticuerpos de diversa especificidad, se pueden usar simultáneamente estos anticuerpos inmovilizados, o se pueden llevar a cabo purificaciones individuales de inmunoafinidad de forma paralela o seriada.

Bajo el concepto de "antígeno asociado a tumores" se entiende, en el marco de la presente solicitud, una estructura que presentan preferentemente las células tumorales y que permite una diferenciación de los tejidos no malignos. Preferentemente, un antígeno asociado a tumores de este tipo se encuentra localizado sobre o en la membrana celular de una célula tumoral. No se puede excluir, sin embargo, que dichos antígenos estén presentes en células que no hayan degenerado. Los antígenos asociados a tumores pueden ser, por ejemplo, polipéptidos, en especial proteínas glicosiladas, o patrones de glicosilación de polipéptidos. Otras estructuras que pueden representar un antígeno asociado a tumores son, por ejemplo, glicolípidos. A los mismos pertenecen, por ejemplo, gangliósidos tales como, por ejemplo, GM2. Adicionalmente, los antígenos asociados a tumores pueden estar producidos por modificaciones de la composición de lípidos de la membrana celular, que pueden ser características para las células cancerosas.

Los más diversos anticuerpos contra diferentes antígenos asociados a tumores se conocen desde hace tiempo, o se pueden preparar mediante métodos conocidos (por ejemplo, tecnología del hibridoma, técnica de presentación de fagos).

En una forma de realización preferida, los anticuerpos obtenidos por purificación de inmunoafinidad se administran en forma de una vacuna individual y autóloga al individuo a partir de cuyos fluidos corporales han sido obtenidos.

Un componente integral adicional de la presente invención es, por lo tanto, que pueda tener lugar la obtención de una fracción de Ab2 a partir de un fluido corporal, por ejemplo, sangre, de un individuo por la purificación de inmunoafinidad de los anticuerpos presentes en el fluido corporal. Como ligando se utiliza uno o múltiples anticuerpos contra antígenos asociados a tumores.

En este sentido, el individuo puede ser cualquier organismo animal, preferentemente, un vertebrado, de forma especialmente preferida un mamífero y, de manera muy especialmente preferida, un ser humano al que no se haya administrado previamente un anticuerpo monoclonal dirigido contra algún antígeno asociado a tumores.

En una forma de realización preferida adicional, se utilizan simultáneamente para la purificación de inmunoafinidad múltiples anticuerpos contra diferentes antígenos asociados a tumores y/o contra distintos epítopos de uno o varios antígenos asociados a tumores.

Si para la purificación de inmunoafinidad de los Ab2 presentes en los fluidos corporales, se utilizan simultáneamente múltiples anticuerpos, especialmente monoclonales, contra diversos antígenos asociados a tumores o contra distintos epítopos, se obtiene una fracción de diferentes Ab2 basada sobre un conjunto seleccionado de antígenos asociados a tumores y cuya utilización simultánea como vacuna genera una inmunorrespuesta contra todos estos antígenos asociados a tumores o epítopos. De esta forma, se desplaza en un solo paso el equilibrio inmunológico hacia el reconocimiento de un conjunto de antígenos asociados a tumores o epítopos (a menudo, co-expresados). Esta forma de proceder eleva, naturalmente, la eficacia de la inmunorrespuesta inducida y reduce, de manera esencial, la formación de variantes antígeno-negativas del tumor ("tumor escape"), dado que es extremadamente improbable que una célula tumoral sea capaz de desactivar simultáneamente la expresión de múltiples antígenos.

El método anteriormente descrito se puede llevar a cabo, básicamente, con todos los antígenos asociados a tumores, tanto conocidos como recién descubiertos. Únicamente, se debe dar la condición de que haya disponible uno o múltiples anticuerpos, preferentemente, anticuerpos monoclonales, contra un antígeno de estas características, que se pueda utilizar como ligando para una purificación de inmunoafinidad. Resultan adecuadas, fundamentalmente, todas las clases concebibles de anticuerpos, en especial policlonales o monoclonales, prefiriéndose los anticuerpos monoclonales. Asimismo, sería posible emplear mezclas de anticuerpos policlonales y monoclonales. También se pueden utilizar tanto anticuerpos monoclonales de ratón como anticuerpos de otras especies (por ejemplo, de rata). Adicionalmente, se pueden emplear anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón-humano, humanizados o humanos contra los antígenos asociados a tumores. La capacidad de utilización de anticuerpos para la purificación de inmunoafinidad está determinada por su región de fijación, es decir, su idiotipo. Por consiguiente, y en principio, se pueden utilizar con éxito, en lugar de anticuerpos intactos, fragmentos de dichos anticuerpos para la purificación de inmunoafinidad, siempre que estos fragmentos sigan conservando el idiotipo del correspondiente anticuerpo de partida. Como ejemplos no limitantes cabe citar: fragmentos de F(ab)'_{2}, fragmentos de F(ab)' y fragmentos de Fv, que se pueden preparar según métodos bioquímicos en sí conocidos (separación enzimática), o según métodos de biología molecular también en sí conocidos. Evidentemente, se pueden usar mezclas de las correspondientes clases de anticuerpos o sus fragmentos.

La elección de los antígenos asociados a tumores y, por lo tanto, de los anticuerpos contra estos antígenos utilizados para la purificación de inmunoafinidad, está relacionada con las características antigénicas de la indicación tumoral contra la que se debe vacunar. Se mencionan, a modo de ejemplo, los siguientes antígenos asociados a tumores ya conocidos, que se expresan a menudo sobre diversos tumores, especialmente epiteliales, pero el uso del método descrito en este documento para la vacunación autóloga no está limitado de forma alguna a estos antígenos:

Molécula de Adhesión a Células Epiteliales (Ep-CAM)

Antígeno carcino-embrionario (CEA)

Carbohidrato Y de Lewis

Carbohidrato Tn de Sialilo

Carbohidrato H de Globo

Gangliósidos tales como GD2 / GD3 / GM2

Antígeno Específico de la Próstata (PSA)

CA 125

CA 19-9

CA 15-3

TAG-72

Receptor EGF

Molécula de Adhesión a Células Neuronales (N-CAM)

Receptor de Her2/Neu

D 97

CD 20

CD 21

Contra todos los antígenos mencionados se han descrito (a menudo, múltiples) anticuerpos, especialmente monoclonales, que son adecuados, en principio, como ligandos para la purificación de inmunoafinidad en la obtención de Ab2.

Se describen otros antígenos asociados a tumores adicionales, por ejemplo, en DeVita et al. (Compiladores, "Biological Therapy of Cancer", 2ª edición, Capítulo 3: Biology of Tumor Antigenes, Lippincott Company, ISBN 0-397-5144116-6 (1995)).

En una forma de realización preferida, el antígeno asociado a tumores es una molécula que se fija a la membrana, que a menudo se expresa o co-expresa en células cancerosas de origen epitelial, sobre células cancerosas de origen neuro-endocrinológico o sobre células cancerosas del sistema hematopoyético.

En una forma de realización preferida adicional, la composición preparada según la invención es adecuada para la administración múltiple de los anticuerpos que contiene.

El método descrito en este documento para la obtención de una vacuna autóloga a partir de fluidos corporales de un individuo no está limitado, lógicamente, a una sola utilización.

El desplazamiento del repertorio inmunológico desencadenado por una primera vacunación hacia la eficacia antitumoral se puede seguir potenciando mediante la repetición de este procedimiento; así, por ejemplo, tras algunas semanas después de la obtención de la primera vacuna autóloga por purificación de inmunoafinidad, se puede extraer nuevamente un fluido corporal, por ejemplo, sangre, preparando y administrando nuevamente una vacuna autóloga. De esta forma, se garantiza que se tenga siempre en consideración la respectiva situación del equilibrio inmunológico en la vacuna individual. Este procedimiento se puede llevar a cabo a intervalos adecuados (por ejemplo, inicialmente cada 4-8 semanas y, durante el seguimiento, cada 6 meses).

La nueva composición y el método de vacunación con anticuerpos autólogos, descritos en este documento, resultan adecuados tanto para fines terapéuticos como para fines profilácticos. Una vacunación terapéutica repetida de pacientes oncológicos puede inhibir la formación de nuevas metástasis y, al menos, retrasar la diseminación de la enfermedad. Las vacunaciones autólogas terapéuticas pueden ser beneficiosas en especial en los siguientes estadios de la enfermedad:

En estadios precoces de la enfermedad, por ejemplo, tras la intervención con éxito de un tumor primario (estadio adyuvante), las vacunaciones autólogas descritas en este documento destruyen las células tumorales residuales diseminadas, impidiendo, de este modo, el establecimiento de nuevas metástasis. De esta forma, es posible prolongar el período de vida libre de recurrencias y, por consiguiente, el tiempo total de supervivencia de estos pacientes. Por medio de estas vacunaciones autólogas y de las revacunaciones de recuerdo llevadas a cabo a intervalos adecuados resulta posible, eventualmente, proporcionar una protección durante toda la vida contra la formación de metástasis.

Cuando se han producido ya metástasis, mediante la composición o las vacunas autólogas descritas en este documento es posible inhibir la extensión y formación de nuevas metástasis. De esta forma, se estabiliza el cuadro clínico, consiguiendo una prolongación de la esperanza de vida con el mantenimiento de la calidad de vida.

La inducción intrínseca de Ab3 con potenciales propiedades antitumorales, a través de la inducción de Ab2 por inmunoterapia pasiva con anticuerpos de ratón contra antígenos asociados a tumores (Ab1), que se administran por vía i.v. a pacientes oncológicos, se viene postulando e investigando desde hace varios años (por ejemplo, Korpowski et al., PNAS 81 (1984), 216-19).

La composición y las vacunaciones autólogas descritas en este documento se pueden utilizar, en principio, también de modo profiláctico, proporcionando una protección aumentada contra la aparición de enfermedades oncológicas en individuos sanos. Medidas de este tipo pueden resultar provechosas especialmente en grupos de riesgo (por ejemplo, pertenecen a estos grupos individuos con predisposición genética al desarrollo de determinadas enfermedades oncológicas, lo que se puede determinar con creciente frecuencia mediante los correspondientes ensayos).

Un antecedente general de la estrategia de la vacunación autóloga individual descrita en este documento se basa en el hecho de que es posible analizar la situación inmunológica del individuo en relación con la red idiotípica, puesto que la correspondiente vacuna se prepara, preferentemente, a partir del fluido corporal del propio individuo, por ejemplo, suero.

Adicionalmente, el individuo inmunizado no entra en contacto con antígenos ajenos, sino que se le trata de forma adecuada sólo con componentes de su propio organismo, capaces de producir una modulación del equilibrio inmunológico.

En una forma de realización preferida, los anticuerpos obtenidos por purificación de inmunoafinidad se formulan con un coadyuvante adecuado para vacunas.

Como es habitual en las vacunas, las fracciones de anticuerpos autólogos, o sus fragmentos y derivados, se pueden formular junto con coadyuvantes de vacunas. Por medio de estos coadyuvantes se potencia la inmunorrespuesta. Como ejemplos de coadyuvantes, pero sin estar limitados a los mismos, se pueden mencionar; coadyuvantes que contienen aluminio, en especial, hidróxido de aluminio (por ejemplo, Alu-Gel), derivados de liposacáridos, Bacilo Calmette Guerin (BCG), QS-21, preparaciones de liposomas, formulaciones con antígenos adicionales, contra los cuales el sistema inmunológico haya desarrollado ya una potente inmunorrespuesta, tales como, por ejemplo, el toxoide del tétanos o componentes de virus de la gripe, eventualmente en una preparación de liposomas.

La preparación de la vacuna se puede administrar también para reforzar la inmunorrespuesta con correspondientes citoquinas, preferentemente humanas, que potencian el desarrollo de una inmunorrespuesta. Cabe mencionar en este contexto, aunque de forma no excluyente, el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF). Esta citoquina estimula una eficaz inmunorrespuesta por la activación de células que procesan antígenos (por ejemplo, células dendríticas).

Eventualmente, las fracciones de anticuerpos autólogos se pueden incubar con células dendríticas autólogas, cultivadas ex-vivo, según métodos en sí conocidos y publicados. Las células dendríticas pulsadas de esta forma se vuelven a administrar finalmente al individuo. De este modo, se puede alcanzar una inmunorrespuesta especialmente eficaz.

En una forma de realización preferida del uso según la invención, los anticuerpos que contiene la composición se mezclan con un coadyuvante y se someten, seguidamente, a un tratamiento térmico, preferentemente, a una temperatura entre 70 y 121ºC. El coadyuvante utilizado contiene, preferentemente, aluminio. Es posible que el tratamiento térmico de este tipo desnaturalice el antígeno de proteína, es decir, la parte inmunogénica de la proteína, pero a través de la unión del coadyuvante, se puede presentar al sistema inmunológico de forma correcta. Sin embargo, no es imprescindible desnaturalizar las proteínas para obtener las ventajas de un tratamiento térmico. Se sabe que la desnaturalización térmica de proteínas no depende sólo de la temperatura, sino también del espacio de tiempo durante el que la proteína está expuesta a esta temperatura. Adicionalmente, la combinación de otros parámetros físico-químicos tales como, por ejemplo, potencia iónica, composición iónica, valor de pH, tipo y cantidad de la superficie activa, es responsable de la desnaturalización de una proteína. Es posible la aplicación de condiciones bajo las cuales los anticuerpos no se desnaturalizan o lo hagan de forma incompleta y/o se pueden aprovechar otros efectos tales como, por ejemplo, una débil desorción de la superficie del coadyuvante.

Una ventaja adicional de la presente forma de preparación de una formulación de vacuna con un coadyuvante y el tratamiento térmico consecutivo es que resultaría posible debilitar o inactivar patógenos infecciosos en toda la formulación. Esta ventaja puede ser de importancia tanto en la preparación como también en el almacenamiento y distribución de la formulación de vacuna. De esta forma, se proporciona una mayor seguridad en relación con patógenos conocidos y desconocidos de enfermedades trasmisibles. Adicionalmente, en el correspondiente acondicionamiento de una vacuna exenta de conservantes, es posible llevar a cabo la conservación antimicrobiana de la vacuna por calor.

Una ventaja adicional de una formulación de este tipo es la posible inmunogenicidad aumentada de los anticuerpos, puesto que el calentamiento puede producir al menos una desnaturalización parcial de los anticuerpos. Esta antigenicidad aumentada puede potenciar la inmunogenicidad especialmente en proteínas que el sistema inmunológico reconoce como propias.

Una ventaja ulterior es la posible estabilización adicional del complejo de anticuerpos-coadyuvante por la inactivación térmica, es decir, la desorción del antígeno de proteína no se produce de manera tan rápida como en las formulaciones de antígeno-coadyuvante que no han sido tratadas con calor. Esta ventaja permite, bajo ciertas circunstancias, establecer intervalos de tiempo más prolongados entre las distintas inmunizaciones.

La composición preparada según la invención se puede administrar por métodos habituales, por ejemplo, como vacuna por inyección subcutánea o intramuscular.

La presente invención se refiere, igualmente, a composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos IgM e IgG, obtenidos a partir de fluidos corporales que contienen anticuerpos por purificación de inmunoafinidad, utilizándose como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, y en los que el fluido corporal procede de un individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.

Estas composiciones son adecuadas, como se ha descrito anteriormente, como vacunas para la vacunación terapéutica o profiláctica contra enfermedades oncológicas.

Para las formas de realización preferidas de la preparación, de los componentes, de la formulación, de las formas de administración, etc. de la composición farmacéutica es válido lo que se ha mencionado ya anteriormente en relación con el uso según la invención.

Por último, la presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que contiene células dendríticas aisladas, cultivadas ex-vivo, de un individuo, en la cual las células dendríticas han sido incubadas previamente in-vitro con anticuerpos obtenidos, como se ha descrito anteriormente, a partir de un fluido corporal que contiene anticuerpos del mismo individuo por purificación de inmunoafinidad.

Las preparaciones de anticuerpos anteriormente descritas se pueden utilizar, según la invención, en un procedimiento para la vacunación terapéutica o profiláctica contra el cáncer, en el que se administran a un individuo anticuerpos que se han obtenido por purificación de inmunoafinidad de fluidos corporales que contienen anticuerpos, preferentemente, de fluidos corporales del mismo individuo, utilizándose como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo y, en el que el fluido corporal procede de un individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.

Las células dendríticas anteriormente descritas se pueden utilizar, según la invención, en un procedimiento para la vacunación terapéutica o profiláctica contra el cáncer, en el cual se administran a un individuo células dendríticas autólogas y aisladas, cultivadas ex-vivo, que se han incubado previamente in-vitro con anticuerpos, obtenidos por purificación de inmunoafinidad a partir de fluidos corporales que contienen anticuerpos, en el que se utilizan como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, procediendo el fluido corporal de un individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.

Para las formas de realización preferidas es válido lo que se ha mencionado anteriormente en relación con el uso según la invención.

La presente invención se refiere también a un procedimiento para la elaboración de una preparación de anticuerpos que se distingue porque se obtienen por purificación de inmunoafinidad anticuerpos a partir de un fluido corporal que contiene anticuerpos, utilizándose como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, en el cual el fluido corporal procede de un individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.

Para los fluidos corporales, los anticuerpos utilizados como ligandos, así como para los antígenos asociados a tumores, es válido lo mismo que se ha mencionado anteriormente en relación con el uso según la invención.

En una forma de realización preferida del procedimiento según la invención, se utilizan para la purificación de afinidad simultáneamente múltiples anticuerpos contra diversos antígenos asociados a tumores y/o epítopos de dichos antígenos. En este caso, cuando se usan múltiples anticuerpos para la purificación de afinidad, éstos se utilizan simultáneamente o se pueden llevar a cabo purificaciones de inmunoafinidad aisladas en paralelo o en serie. Es decir, se pueden combinar diversas especificidades frente a epítopos y/o antígenos de acuerdo con los requisitos. Estos requisitos provienen de la expresión de diferentes antígenos tumorales en distintos tumores individuales.

En una forma de realización especialmente preferida, se utilizan como ligandos en la purificación de afinidad anticuerpos monoclonales y, en una forma de realización muy especialmente preferida, se utiliza suero como fluido corporal.

Por procedimiento según la invención se entiende un procedimiento para la elaboración de una preparación de anticuerpos que se usa para preparar una composición farmacéutica adecuada como vacuna para la vacunación terapéutica o profiláctica contra el cáncer.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica en el que se lleva a cabo un procedimiento anteriormente descrito para la elaboración de una preparación de anticuerpos, y en el cual la preparación de anticuerpos obtenida de esta forma se formula, seguidamente, con un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un coadyuvante de vacuna adecuado.

En una forma de realización preferida, la preparación de anticuerpos se mezcla con un coadyuvante, preferentemente, un coadyuvante que contiene aluminio y, a continuación, se somete a un tratamiento térmico, preferentemente a una temperatura entre 70 y 121ºC.

Para las formas de realización preferidas de una formulación farmacéutica o de vacunación es válido lo anteriormente expuesto en relación con el uso según la invención.

En la descripción de la presente solicitud se incorpora la totalidad de los contenidos de las patentes, publicaciones e informes de bancos de datos citados en esta solicitud.

Figura 1 muestra un cromatograma de una purificación de inmunoafinidad (mediante el anticuerpo 17-1A inmovilizado) de la fracción de anticuerpos de un mono Rhesus.

Figura 2 muestra un cromatograma (cromatografía de separación de tamaños) de una fracción de anticuerpos purificada por inmunoafinidad.

Figura 3 muestra la unión de anticuerpos séricos, obtenidos por purificación de afinidad, al anticuerpo 17-1A: ELISA de 17-1A.

Figura 4 muestra el resultado de una vacunación autóloga de un mono Rhesus: fijación de Ig sérica a células tumorales KatoIII (ELISA celular).

Figura 5 muestra un cromatograma (cromatografía de separación de tamaños) de una fracción de anticuerpos purificada por inmunoafinidad (lecho mixto anti-EpCAM/anti-Y de Lewis).

Figura 6 muestra un cromatograma de un estándar de tamaño (separado por cromatografía de separación de tamaños).

En los Ejemplos siguientes, que explican de manera más detallada la invención sin limitarla, se utilizaron los siguientes materiales:

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Placas de microtitulación:	Immuno Plate F96 MaxiSorp (Nunc) para ELISA
	Cell Culture Cluster (Costar; Nº de Cat. 3598) para ELISA Celular

Línea celular:	KATO III: línea celular de cáncer de estómago humano (ATCC HTB 103)

Tampón de acoplamiento:	NaHCO_{3} 0,1 M
	NaCl 0,5 M
	Valor de pH 8,0

Tampón de purificación A:	PBS def
	NaCl 0,2 M

Tampón de purificación B:	Glicina / HCl 0,1 M
	NaCl 0,2 M
	Valor de pH 2,9

Medio A:	RPMI 1640 + 2 g/l de NaHCO_{3}
	100 U/ml de penicilina G
	100 \mug/ml de sulfato de estreptomicina
	Glutamina 4 mM
	Suero de ternero fetal al 10% (inactivado térmicamente)

Tampón de fijación:	Na_{2}CO_{3} 15 mM
	NaHCO_{3} 35 mM
	NaN_{3} 3 mM
	Valor de pH: 9,6

PBS deficiente (def):	NaCl 138 mM
	KH_{2}PO_{4} 1,5 mM
	KCl 2,7 mM
	Na_{2}HPO_{4} 6,5 mM
	Valor de pH: 7,2

Solución de fijación:	Dialdehído glutárico al 0,1% en solución fisiológica de NaCl

Tampón de lavado A:	NaCl al 2%
	Triton X-100 al 0,2% en PBS deficiente

Tampón de lavado B:	Tween 20 al 0,05% en PBS deficiente

Tampón de bloqueo A:	Suero de ternero fetal al 5% (inactivado térmicamente) en PBS deficiente

Tampón de bloqueo B:	Albúmina de suero bovino al 1%
	NaN_{3} al 0,1% en PBS deficiente

Tampón de dilución A:	Suero de ternero fetal al 2% (inactivado térmicamente) en PBS deficiente

Tampón de dilución B:	PBS deficiente

Tampón colorante:	Ácido cítrico 24,3 mM
	Na_{2}HPO_{4} 51,4 mM
	Valor de pH: 5,0

Sustrato:	40 mg de dihidrocloruro de o-fenilendiamina
	100 ml de tampón colorante
	20 \mul de H_{2}O_{2} (al 30%)

Solución de detención:	H_{2}SO_{4} 4N

Tampón de formulación:	PBS def. al 10%, pH = 6,0
	Solución fisiológica de NaCl al 90%

Ejemplo 1 Preparación de una columna de inmunoafinidad con un anticuerpo TAA-específico

Se suspendieron 7,5 g de CH-Sepharose 4B (Pharmacia) durante 15 minutos en 20 ml de HCl 1 mM. A continuación, el gel se lavó con 1 litro de HCl 1 mM y, seguidamente, con 200 ml de tampón de acoplamiento sobre un filtro de vidrio sinterizado AG3. Se dializaron 100 mg de anticuerpo 17-1A de ratón (Panorex, solución madre 10 mg/ml; dirigido contra el antígeno asociado a tumor Ep-CAM) contra 5 litros de tampón de acoplamiento y se ajustó con tampón de acoplamiento a 5 mg/ml. Esta solución se mezcló con la suspensión de gel en un recipiente cerrado. Una relación de gel:tampón de 1:2 proporciona una suspensión adecuada para el acoplamiento. Esta suspensión se hizo rotar durante 24 horas a 4ºC. A continuación, el exceso de ligando se separó por lavado con 3 x 30 ml de tampón de acoplamiento. Los grupos reactivos remanentes se bloquearon por incubación durante una hora a 4ºC con etanolamina 1M. Seguidamente, se hizo rotar el gel durante una hora a temperatura ambiente con un tampón de Tris-HCl 0,1 M. Cada ciclo está formado por tampón de acetato sódico 0,1 M, pH 4, con NaCl 0,5 M y, a continuación, tampón Tris-HCl 0,1 M, pH 8, con NaCl 0,5 M. El gel se conservó a 4ºC.

Ejemplo 2 Purificación de inmunoafinidad de una fracción de anticuerpos séricos por cromatografía de inmunoafinidad

Se extrajeron 10 ml de sangre periférica de monos Rhesus, recuperando el suero. Todo el procedimiento se llevó a cabo bajo condiciones estériles:

La purificación de inmunoafinidad se efectuó sobre un sistema FPLC (Pharmacia). Se incorporó 1 ml del gel obtenido según el Ejemplo 1 en una columna HR5/5 de Pharmacia. Se diluyeron 5 ml de suero a 1:10 con tampón de purificación A. Esta solución se bombeó a un ritmo de 1 ml/minuto en la columna y se lavó posteriormente con tampón de purificación A, hasta alcanzar nuevamente la línea base UV del detector (280 nm). Las inmunoglobulinas fijadas se eluyeron, entonces, con tampón de purificación B y la fracción se neutralizó inmediatamente con Na_{2}HPO_{4} 1 M después de la desorción. En la Figura 1 aparece el cromatograma de esta purificación (UV 280 nm).

50 \mul de la fracción de anticuerpos purificada de esta forma se analizaron en una columna de separación por tamaños (SEC, Zorbax 250 GF). Como eluyente se utilizaron tampón fosfato 220 mM, pH 7, + acetonitrilo al 10%. Como se puede apreciar en el cromatograma de este análisis (Figura 2), la fracción de anticuerpos contiene IgM e IgG en una relación de aprox. 3:2. La cantidad total de la fracción de anticuerpos ascendió a aprox. 40 \mug (determinada por SEC en comparación con un patrón estándar).

La fracción de anticuerpos obtenida de esta manera se analizó con un ensayo ELISA en relación con la fijación al anticuerpo 17-1A (utilizado como ligando para la purificación de afinidad).

Se incubaron partes alícuotas de 100 \mul del anticuerpo contra un antígeno asociado a tumor (anticuerpo 17-1A; solución con 10 \mug/ml en tampón de fijación), utilizado para la purificación de afinidad, en el pocillo de una placa de microtitulación a 37ºC durante 1 hora. Después de lavar seis veces la placa con tampón de lavado A, se agregaron sendos 200 \mul del tampón de bloqueo A y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Después de lavar la placa de la forma anteriormente descrita, se incubaron sendas partes alícuotas de 100 \mul de la fracción de anticuerpos purificada por afinidad a analizar, así como inmunoglobulina humana normal en la misma concentración, como controles negativos, en diluciones de 1:4 hasta 1:65.000 en tampón de dilución A durante 1 hora a 37ºC. Después de lavar la placa de la forma anteriormente descrita, se agregaron sendos 100 \mul del anticuerpo anti-Ig humana de cabra, conjugado con peroxidasa (Zymed), en una dilución de 1:1000 en tampón de dilución A, y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. La placa se lavó cuatro veces con tampón de lavado A y dos veces con tampón colorante. La fijación del anticuerpo se determinó por la adición de sendos 100 \mul del sustrato específico, y la reacción de tinción se interrumpió por la adición de sendos 50 \mul de solución de detención después de aprox. 3 minutos. La evaluación se realizó midiendo la densidad óptica (DO) a 490 nm (la longitud de onda de la medición de referencia es 620 nm).

Como se ve en la Figura 3, la fracción de anticuerpos purificada por afinidad muestra una evidente fijación al anticuerpo 17-1A, en tanto que la inmunoglobulina humana normal prácticamente no se fija.

Ejemplo 3 Formulación de una vacuna de anticuerpos purificados

La fracción de anticuerpos purificada por afinidad se formuló con hidróxido de aluminio como coadyuvante según el siguiente procedimiento:

3 ml de la solución de anticuerpos obtenida por cromatografía de afinidad (que contiene aprox. 40 \mug de anticuerpos) se mezclaron con 1 mg de hidróxido de aluminio (suspensión acuosa; Alhydrogel, Superfos) y la suspensión se centrifugó en un tubo de centrifugación "FILTRON" (Microsep®, corte 10 kD) a 4000 x g durante 30 minutos. A continuación, se separó 2 veces por gravedad con sendos 1 ml del tampón de formulación, y se centrifugó a 4000 x g durante 30 minutos. La suspensión se enrasó hasta 0,5 ml con tampón de formulación y la suspensión obtenida de esta forma se envasó bajo condiciones estériles.

Ejemplo 4 Inmunización de monos Rhesus con anticuerpos autólogos, purificados por inmunoafinidad

El correspondiente mono Rhesus, a partir de cuyo suero se obtuvo y preparó la vacuna como se ha descrito en los Ejemplo 2 y 3, se vacunó por vía subcutánea en el lomo. Antes de esta primera vacunación, se extrajeron 5 ml de sangre para recuperación de suero (para la determinación del valor inicial para la caracterización de la inmunorrespuesta). Dos semanas después, se extrajeron nuevamente 10 ml de sangre para la recuperación de suero. Con 4 ml de este suero se repitió la obtención de una vacuna autóloga, de la forma anteriormente descrita. La vacuna obtenida de nuevo se volvió a inyectar por vía subcutánea en el lomo del mono Rhesus. 4 semanas después de esta vacunación, se volvieron a extraer 5 ml de sangre para la recuperación de suero (para determinar el efecto de ambas vacunaciones).

Se analizaron el suero previo de este mono Rhesus y el inmunosuero obtenido 4 semanas después de la 2ª vacunación en un ELISA celular en relación con la fijación de anticuerpos a la línea celular Kato III. Con este fin, se procedió del modo siguiente:

Los pocillos de una placa de microtitulación se incubaron con sendos 100 \mul de una suspensión celular de la línea celular Kato III, a una concentración de 2x10^{6} células/ml en Medio A, durante la noche, a 37ºC. Tras aspirar con succión el sobrenadante, se incubó la placa con sendos 50 \mul de solución de fijación por pocillo, durante 5 minutos, a temperatura ambiente. Después de aspirar con succión el sobrenadante, se agregaron mediante una pipeta sendos 200 \mul de tampón de bloqueo B y se incubó la placa durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar dos veces con sendos 200 \mul de tampón de lavado B, se incubaron sendas partes alícuotas de 100 \mul de los sueros de mono a analizar en diluciones de 1:4 hasta 1:56.000 en tampón de dilución B durante 1 hora a 37ºC. Después de lavar dos veces la placa con sendos 100 \mul de tampón de lavado B helado, se agregaron sendos 100 \mul de un anticuerpo anti-Ig humana de cabra, conjugado con peroxidasa (Zymed), en una dilución de 1:1000 en tampón de dilución A, incubando durante 45 minutos a 37ºC. La placa se lavó tres veces con sendos 100 \mul de tampón de lavado B helado. La fijación de anticuerpos se determinó por la adición de sendos 100 \mul del sustrato específico, y la reacción de tinción se interrumpió mediante la adición de sendos 50 \mul de solución de detención tras aprox. 5 minutos. La evaluación se realizó por medición de la densidad óptica (DO) a 490 nm (la longitud de onda de la medición de referencia es 620 nm).

Como se ve en la Figura 4, en el inmunosuero del mono Rhesus sometido a vacunación autóloga se encuentran inmunoglobulinas capaces de fijarse a las células tumorales Kato III, en tanto que en el suero previo del mismo animal apenas pueden detectarse estos anticuerpos.

Basándose en los resultados de los ensayos anteriormente descritos se demuestra, por ejemplo, que la vacunación con fracciones de anticuerpos autólogos individuales, obtenidos por purificación de inmunoafinidad en un anticuerpo contra un antígeno asociado a tumores, se desencadenó una inmunorrespuesta humoral que se fija a células tumorales humanas que expresan este antígeno asociado a tumores.

Ejemplo 5 Preparación de una columna de inmunoafinidad con dos distintos anticuerpos TAA-específicos

Se acoplaron por procedimientos estándares un anticuerpo monoclonal de ratón, que reacciona con Ep-CAM, y un anticuerpo monoclonal de ratón, que reacciona con Y de Lewis, a CH-Sepharose activada 4B (Pharmacia Biotech, Suecia): se suspendieron e hincharon 7,5 g de CH-Sepharose 4B durante 15 minutos en 20 ml de HCl 1 mM. Entonces, el gel se lavó con 1 litro de HCl 1 mM y, a continuación, con 200 ml de tampón de acoplamiento, sobre un filtro de vidrio sinterizado AG3. Se dializaron 100 mg de anticuerpo de ratón (solución madre 10 mg/ml) contra 5 litros de tampón de acoplamiento y se ajustaron con tampón de acoplamiento a 5 mg/ml. Esta solución se mezcló con la suspensión de gel en un recipiente cerrado. Una relación de gel:tampón de 1:2 proporciona una suspensión adecuada para el acoplamiento. Esta suspensión se hizo rotar durante 24 horas a 4ºC. Seguidamente, se separó el exceso de ligando lavando con 3x30 ml de tampón de acoplamiento. Los grupos reactivos remanentes se bloquearon mediante incubación durante una hora a 4ºC con etanolamina 1M. A continuación, el gel se hizo rotar durante una hora a temperatura ambiente con un tampón de Tris-HCl 0,1 M. Por último, se lavó el gel con 3 ciclos de tampones con pH alternante. Cada ciclo está compuesto por tampón de acetato sódico 0,1 M, pH 4, con NaCl 0,5 M y, a continuación, tampón de Tris-HCl 0,1 M, pH 8, con NaCl 0,5 M. El gel se conservó a 4ºC.

Se mezclaron volúmenes iguales de ambas matrices de afinidad y se empacaron como columna de cromatografía de inmunoafinidad (System Äkta, Pharmacia, Suecia).

Ejemplo 6 Purificación de anticuerpos de suero de mono por purificación de inmunoafinidad simultánea con dos distintos anticuerpos TAA-específicos

Se extrajeron aproximadamente 20 ml de sangre de monos Rhesus no sometidos previamente a ensayos inmunológicos, purificando sendos 9 ml de suero por medio de la columna de cromatografía de inmunoafinidad descrita en el Ejemplo 5 (System Äkta, Pharmacia, Suecia).

Tampón de trabajo: tampón de purificación A

Tampón de elución: tampón de purificación B

El eluato se neutralizó con solución 0,5 M de hidrógeno-fosfato sódico.

Los eluatos se fraccionaron de manera que las proteínas purificadas se encontraron presentes en elevadas concentraciones.

50 \mul de la fracción de anticuerpos purificada se analizaron en una columna de separación por tamaños (SEC, Zorbax 250 GF). Como eluyente se utilizaron tampón fosfato 220 mM, pH 7, + acetonitrilo al 10% (caudal: 1.000 ml/min; longitud de onda 214 nm). Como se aprecia en el cromatograma de este análisis (Figura 5), la fracción de anticuerpos contiene IgM (tiempo de retención 6,963 min) e IgG (tiempo de retención 8,745 min) en una relación de aprox. 3:2. La cantidad total de la fracción de anticuerpos ascendió a aprox. 50 \mug (determinada por SEC en comparación con un patrón estándar, Figura 6).

Ejemplo 7 Diferentes formulaciones de una vacuna de anticuerpos purificados

La vacuna se formuló en unidades de ultrafiltración para centrifugar (Centricon 10; Arnicon, EE.UU.). Adicionalmente, las unidades de ultrafiltración se lavaron por centrifugación mediante tampón de Na-fosfato 1 mM, NaCl al 0,86%, pH 6,0, (NBK).

A continuación, se depositó 1 ml de tampón (NBK) y se agregaron 37 \mul de Alhydrogel al 2% (Superfos Biosector, Dinamarca).

Tras la adición del eluato neutralizado del Ejemplo 6, se centrifugó de acuerdo con las instrucciones de Centricon y se lavó (con 5 ml de tampón).

Seguidamente, se resuspendió la vacuna, se enrasó hasta 550 \mul con tampón y se envasó bajo condiciones estériles.

De forma alternativa, la vacuna se enrasó, después de la resuspensión, con tampón hasta 545 \mul y se mezcló con 5,5 \mul de solución madre de timerosal (10 mg/ml, Sigma, EE.UU.).

Una tercera variante de la formulación de la vacuna se desnaturalizó por calor (121ºC; 20 min) en un autoclave tras su envasado estéril en viales de vidrio.

Claims

1. Uso de anticuerpos para la preparación de una composición farmacéutica adecuada como vacuna para la vacunación terapéutica o profiláctica contra el cáncer, caracterizado porque los anticuerpos se obtienen a partir de fluidos corporales que contienen anticuerpos por purificación de inmunoafinidad, en la que se utilizan como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, y en el que los fluidos corporales proceden de un individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la composición farmacéutica está destinada a la administración al individuo a partir de cuyos fluidos corporales se han obtenido los anticuerpos, en forma de una vacuna autóloga individual.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el fluido corporal es suero.

4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el individuo es un ser humano.

5. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que para la purificación de inmunoafinidad se utilizan, simultáneamente, múltiples anticuerpos contra diferentes antígenos asociados a tumores, y/o diferentes epítopos de estos antígenos.

6. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los anticuerpos utilizados con ligandos para la purificación de inmunoafinidad son anticuerpos monoclonales.

7. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la composición farmacéutica se prepara repetidamente y está destinada a la administración repetida y consecutiva, a intervalos adecuados, como vacuna individual.

8. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los antígenos asociados a tumores son moléculas expresadas y/o co-expresadas frecuentemente, situadas sobre la membrana de células cancerosas de origen epitelial, o sobre células cancerosas de origen neuro-endocrino, o sobre células cancerosas del sistema hematopoyético.

9. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que los anticuerpos purificados por inmunoafinidad, o sus derivados, se formulan junto con un coadyuvante de vacuna adecuado.

10. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la composición contiene, adicionalmente, una proteína que potencia la inmunorrespuesta y que se administra simultáneamente con los anticuerpos.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que la proteína es una proteína humana.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que la proteína humana es el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).

13. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la composición es adecuada para la administración de los anticuerpos purificados por inmunoafinidad como vacuna por inyección subcutánea o intramuscular.

14. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 13, en el que los anticuerpos contenidos en la composición se mezclan con un coadyuvante y se someten a un tratamiento térmico.

15. Uso de células dendríticas aisladas de un individuo, cultivadas ex-vivo, para la preparación de una composición farmacéutica adecuada como vacuna para la vacunación terapéutica o profiláctica contra el cáncer, en el que las células dendríticas se han incubado previamente in-vitro con anticuerpos, obtenidos a partir de un fluido corporal que contiene anticuerpos del mismo individuo, por purificación de inmunoafinidad, utilizándose como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, y en el que el fluido corporal procede de un individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.

16. Preparación farmacéutica que contiene anticuerpos IgM e IgG, obtenidos por purificación de inmunoafinidad a partir de fluidos que contienen anticuerpos, en la que se utilizan como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, y en la que los fluidos corporales proceden de un individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.

17. Composición farmacéutica que contiene células dendríticas aisladas de un individuo, cultivadas ex-vivo, en la que las células dendríticas han sido incubadas previamente in-vitro con anticuerpos procedentes de un fluido corporal que contiene anticuerpos del mismo individuo, obtenidos por purificación de inmunoafinidad, utilizándose como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, y en la que el fluido corporal procede de un individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.

18. Procedimiento para la elaboración de una preparación de anticuerpos, caracterizado porque a partir de un fluido corporal que contiene anticuerpos se obtienen anticuerpos por purificación de inmunoafinidad, utilizándose como ligandos para la purificación de inmunoafinidad anticuerpos capaces de reconocer uno o múltiples antígenos asociados a tumores, o sus fragmentos con idéntico idiotipo, y en el cual el fluido corporal procede de un individuo al que no se han administrado previamente anticuerpos monoclonales dirigidos contra alguno de los antígenos asociados a tumores.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que se utilizan simultáneamente para la purificación de inmunoafinidad múltiples anticuerpos contra diferentes antígenos asociados a tumores y/o epítopos de estos antígenos.

20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, en el que los anticuerpos utilizados en la purificación de inmunoafinidad son anticuerpos monoclonales.

21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 18 a 20, en el que el fluido corporal es suero.

22. Procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica, caracterizado porque se elabora una preparación de anticuerpos según un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 18 a 21, y porque la preparación de anticuerpos obtenida de esta forma se formula seguidamente con un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un coadyuvante de vacuna adecuado.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que la preparación de anticuerpos se mezcla con un coadyuvante y, a continuación, se somete a un tratamiento térmico.

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 18 a 21, en el que la purificación de inmunoafinidad es la única etapa de purificación.