[go: up one dir, main page]

HUP0200400A2 - Fehérjék izolálása és elemzése - Google Patents

Fehérjék izolálása és elemzése Download PDF

Info

Publication number
HUP0200400A2
HUP0200400A2 HU0200400A HUP0200400A HUP0200400A2 HU P0200400 A2 HUP0200400 A2 HU P0200400A2 HU 0200400 A HU0200400 A HU 0200400A HU P0200400 A HUP0200400 A HU P0200400A HU P0200400 A2 HUP0200400 A2 HU P0200400A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
proteins
protein
library
binding
peptides
Prior art date
Application number
HU0200400A
Other languages
English (en)
Inventor
Francis J. Carr
Original Assignee
Biovation Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9906551.8A external-priority patent/GB9906551D0/en
Priority claimed from GBGB9907057.5A external-priority patent/GB9907057D0/en
Priority claimed from GBGB9907641.6A external-priority patent/GB9907641D0/en
Priority claimed from GBGB9914874.4A external-priority patent/GB9914874D0/en
Priority claimed from GBGB9915363.7A external-priority patent/GB9915363D0/en
Priority claimed from GBGB9915677.0A external-priority patent/GB9915677D0/en
Priority claimed from GBGB9916511.0A external-priority patent/GB9916511D0/en
Priority claimed from GBGB9920503.1A external-priority patent/GB9920503D0/en
Priority claimed from GBGB9922285.3A external-priority patent/GB9922285D0/en
Application filed by Biovation Limited filed Critical Biovation Limited
Publication of HUP0200400A2 publication Critical patent/HUP0200400A2/hu
Publication of HUP0200400A3 publication Critical patent/HUP0200400A3/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát eljárások képezik fehérjék azonosítására és/vagyszekvenálására. Ezen eljárások különösen alkalmasak ellenanyag-könyvtárak szkrínelésére, és előnyös megvalósítási módok szerinttömegspektrometriás módszereket alkalmaznak közvetlen vagy közvetettszekvenálásra. Ó

Description

Fehérjék izolálása és elemzése
A találmány tárgya fehérjék izolálása és elemzése, különösen tömeg szerinti elemzés révén. A találmány különösen alkalmas kötőfehérjék, mint például ellenanyagok izolálására. A találmány tárgya továbbá fehérjék vagy fehérjefragmensek módosítása annak érdekében, hogy génkönyvtárak tagjai által kódolt specifikus fehérjék tömeg szerinti elemzését és/vagy izolálását megkönnyítsük.
A találmány tárgyát eljárások képezik specifikus fehérjék izolálására ilyen fehérjék komplex keverékeiből specifikus célanyaghoz való kötődés révén. Előnyösen a találmány tárgyát eljárások képezik specifikus ellenanyagdomének izolálására ilyen domének génkönyvtár-eredetű keverékéből, specifikus célantigénhez való kötődés révén. Fehérjék elemzésére a találmány tárgyát eljárások képezik fehérjék komplex keverékeinek elemzésére, különösen fehérjék összehasonlítására két vagy több különböző minta között.
Komplex keverékekből specifikus célanyaghoz való kötődés révén történő fehérje-izolálás esetén, ahol a fehérje identitása vagy aminosav-szekvenciája előzetesen nem ismert, általában nagyon nehéz volt elegendő, célanyaghoz kötődő fehérjét izolálni a fehérje közvetlen jellemzése céljára. Az érdeklődés tárgyát képező fehérjék természetes, szintetikus vagy félszintetikus fehérjék nagy könyvtárából történő kiválasztása érdekében „fehérje prezentációs
Aktaszámunk: 95151-903/LT • · · · · ··«· ·· ··· ·· („protein display7') eljárásokat fejlesztettek ki, ahol rekombináns fehérjéket a génjeikhez fizikailag kapcsolva állítaják elő oly módon, hogy a fehérjék kinyerése lehetővé teszi az azt követő gyors génkinyerést. Ilye eljárások közé tartoznak in vivo prezentálás! eljárások, mint például bakteriofágon való prezentáció (fág prezentáció, „phage display), baktériumokon és élesztőn való prezentáció, és in vitro eljárások, mint például riboszómákon való prezentáció (riboszóma prezentáció, „ribosome display). A kinyert géneket szekvenálhatjuk a kapott fehérje azonosítására, vagy a kapott fehérje regenerálására alkalmazhatjuk. Ha a gének könyvtárát fehérjék prezentációjára alkalmazzuk, oly módon, hogy a fehérjéket egy bizonyos tulajdonságra szelektáljuk, mint például egy antigénhez való kötődésre (ellenanyagok variábilis régiója esetén), akkor minden szelekciós menetben a kinyert gének dúsulnak azokra a fehérjékre nézve, amelyek ilyen tulajdonságokat mutatnak. A jelenlegi in vivo prezentációs eljárások hátrányai közé tartozik a prezentált működőképes fehérje mennyiségének korlátozottsága (a fágprezentáció általában 40 kDa vagy kisebb polipeptidekre korlátozódik), a rekombináns fehérjék gazdafehérjéhez való fúziójának általános szükségessége (ami zavarhatja a rekombináns fehérje funkcióját vagy kötődését), és a prezentáló részecskén prezentálható fehérjék számának változtatásának lehetetlensége; ez utóbbi az in vitro prezentálás! eljárásokkal, mint például a riboszóma prezentálással is probléma. Ezenfelül az adott tulajdonságú fehérjék szelektálása szolgáló eljárások, mint például antigénhez való kötődés .t. ..· korlátozott a prezentáló részecskék kis mérete miatt, ezáltal olyan eljárások, mint például a fluoreszcensen aktivált sejtválogatás („fluorescence activated cell sorting, FACS) nem alkalmazható. Ily módon igény van új eljárásokra fehérjék komplex keverékekből történő izolálásának, különösen ellenanyagok variábilis régiójának (Fv-domén) Fv-domének komplex keverékekből történő izolálásának javítására. A találmány tárgyát tehát javított eljárások képezik fehérjék izolálásra komplex keverékek. A találmány előnyösen kombinálja a gémkönyvtárakból előállított fehérjekönyvtárakat a tömegspektrometria, különösen a „matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight (MALDI-ToF) spektrometria tökéletesedésével, és a MALDI-ToF-fal elválasztott peptidek közvetlen szekvenálásának képességével tandem tömegspektrometria (MS-MS) révén, és újabban a MALDI-ToF és MSMS egy eszközbe történő kombinálásának (Q-ToF) képességével, és a HPLC és elektronpermet („electron spray, ES) tandem tömegspektrometria kombinálásának képességével. Szintén a találmány tárgyát képezik továbbá eljárások egyedi fehérjékre történő szkrínelésre komplex fehérjekeverékekben, ahol a fehérjék nincsenek „prezentálva, azaz a génjeikhez kapcsolva a célanyaghoz való kötődés alatt vagy után. Szintén a találmány tárgyát képezik továbbá eljárások egyedi fehérjékre történő szkrínelésre komplex fehérjekeverékekben, ahol sem a fehérje, sem a célanyag nincs „prezentálva, azaz bármilyen más molekulához vagy szerkezethez kapcsolva. Szintén a találmány tárgyát képezik eljárások egyedi fehérjékre történő szkrínelésre komplex fehérjekeve
Λ rékekben, ahol a fehérjék és génjeik egy „kapcsoló molekularész („associating moiety) hozzáadásával vannak összekapcsolva, ahol a fehérjék akár a „kapcsoló molekularész hozzáadása előtt, akár azután kötődnek a célanyaghoz.
Ezáltal egy első megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás fehérje azonosítására, szkrínelésére és/vagy szekvenálására, amely szerint adott egyedi fehérjék könyvtára, amelyek közül egy vagy több kötődhet a érdeklődés tárgyát képező célanyaghoz, és minden egyes fehérje egy „vonalkód szekvenciát tartalmaz a szekvenciájában, amit a könyvtár minden egyes egyedi fehérjéjének azonosítására alkalmazhatunk .
A találmány ezen megvalósítási módja fehérjék, különösen rekombináns ellenanyag-domének, mint például Fv-domének könyvtárait biztosítja, ahol a könyvtár egyedi fehérjéi tartalmaznak az aminosav-szekvenciájukban egy szekvenciaszakaszt („vonalkódot), amely később megszekvenálható annak érdekében, hogy azonosítsuk, melyik fehérje (fehérjék) kötődött (kötődtek) a specifikus célanyaghoz (vagy az Fvdomének esetében az antigénhez). Ezen megvalósítási mód különösen alkalmas lehet amikor az Fv-domének emberi génekből származnak, miáltal a kiválasztott Fv-domén alkalmas lehet emberi terápiás vagy diagnosztikai alkalmazásra. Ebben az előnyös alkalmazásban Fv-domének átfogó könyvtárát állítjuk elő immonglobulin cDNS készletekből („pool), mint például emberi perifériás vér B-sejtjeiből származó készletekből, vagy például emberi variábilis régiók alkalmazásával szintetikusan készített készletekből, amelyek félig véletlen szerű („kombinatorikus) CDR-eket („complimentarity-determining regions) tartalmaznak egy vagy több helyen. Ha ezt a génkönyvtárat oly módon készítjük el, hogy egy véletlen (vagy félig véletlen) génszekvenciát is beépítünk az Fvdomén kódoló régiójába vagy a régió végére, akkor az ilyen véletlen/félig véletlen génszekvencia véletlen/félig véletlen peptidszekvenciát állít elő, ami az egyedi Fv-doménhez kapcsolódik. Az ilyen véletlen/félig véletlen génszekvenciát szokásos eljárásokkal, mint például oligonukleotid láncindító alkalmazásával és DNS-polimeráz kitérjesztéssel vagy PCR-rel állítunk elő, ahol véletlen/félig véletlen szintetikus oligonukleotid-szekvenciát alkalmazunk a láncindítópár egyik láncinditójaként az immunglobulin génfragmentumok amplifikálására az Fv-domén génkönyvtár készítése során. Ha az Fv-domén könyvtár tagjai két láncból állnak (azaz nehéz és könnyű láncból származó láncokból - VH és VL) és nem egyből (VH és VL kapcsolópeptiddel összekötve), akkor egyedi vonalkódokat rendelhetünk minden egyes lánchoz (vagy csak az egyik lánchoz). A könyvtár elkészülte után a kapott Fv-domének mindegyike tartalmaz egy vagy több „peptid vonalkódot, ami arra az egy bizonyos Fv-doménre, vagy az Fvdomének egy kis részhalmazára („subset) nézve egyedi a komplex könyvtáron belül. Előnyösen a peptid vonalkód Cterminális helyzetű az egyláncú Fv-régióhoz képest, vagy Cterminális helyzetű a VH-hoz vagy VL-hez, vagy mindkettőhöz képest, és maga és az Fv-régió között egy vagy több, proteázra érzékeny helyet tartalmaz, mint például enterokináz helyet (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys után hasít) vagy Faktor-Xa he • · · f · ···· · · ·· · ·· lyet (Ile-Glu/Asp-Gly-Arg után hasit), vagy más endopeptidáz helyet. Ha ilyen Fv-domének keverékét állítjuk elő egy megfelelő génkönyvtárból, akkor ezt a keveréket összekeverjük a célantigénnel (vagy célantigénekkel, például sejteken lévőkkel), ahol általában az antigén immobilizálva van. Ez az Fv-domének specifikus kötődését eredményezi a célantigénhez, míg a nem kötődők (vagy gyengén kötődők a sztringensség erősségétől függően) elmosódnak. A felesleges ellenanyagok elmosása után a megmaradó antigén/Fv-domén komplexet az Fv-doménről általában a beépített proteáz-érzékeny hely hasítására alkalmazott endoproteázzal történő emésztéssel szabadítjuk fel. Ezután a felszabadított vonalkód peptidet tömeg szerinti elemzésnek (tömegspektrometriának) vetjük alá vagy közvetlenül, vagy adott esetben befogást követően, amely befogás olyan specifikus aminosavak vagy aminosav-szekvenciák révén történik, amelyek lehetővé teszik a peptid szilárd fázisra történő befogását, mint például cisztein oldalláncokkal, amelyek biotinilálhatók az azt követő, immoilizált avidinon vagy sztreptavidinon történő befogáshoz. Más megoldásképpen bármilyen egyéb eljárást alkalmazhatunk a peptid vonalkód szekvenciájának meghatározására akár az Fv-doménen belül, akár felszabadítás után, beleértve specifikus ligandumok alkalmazását, amelyek szekvencia-specifikus módon kötődnek a vonalkódhoz. A kötött Fv-doménekből származó vonalkódok szekvenciájának (vagy részleges szekvenciájának) meghatározása után előállítjuk a megfelelő szintetikus oligonukleotidokat, és a specifikus Fv-gének könyvtárból történő specifikus amplifi7 .t. ..·
Rációjára és feldúsítására alkalmazzuk azokat. Ezen specifikus vagy dúsított Fv- (vagy VH és VL) géneket azután tovább alkalmazhatjuk megfelelő Fv-domének előállítására, amelyeket újra tesztelhetünk antigénkötésre, akár egyenként, akár izolált Fv-domének kis készletének részeként. Végső soron ezzel az eljárással specifikus Fv-doméneket állíthatunk elő, amelyek kívánt antigénkötő tulajdonsággal, és ha emberi eredetűek, potenciális klinikai hasznossággal rendelkeznek. Ez a megvalósítási mód szintén magában foglalja egyedi fehérjékkel vagy Fv-doménekkel kapcsolt több vonalkód alkalmazását, például két egymás melletti vonalkód alkalmazását az Fv-domén C-terminálisán, miáltal két peptid szabadul fel minden Fv-doménből proteázos emésztéssel, akár egyidejűleg a célanyagohoz kötődött Fv-domén azonosításnak fokozására, akár egymás után, ahol különböző proteázokat alkalmazunk egymást követő emésztési menetekben, azért, hogy különböző lehetőséget biztosítsunk a célanyaghoz kötődött Fv-doménnek megfelelő Fv-gének azt követő amplifikálásához. Ez a megvalósítási mód tartalmazza több vonalkód alkalmazását is, amelyeket egyidejűleg elemzünk annak érdekében, hogy növeljük a vonalkód-szekvenciák általános diverzitását, az egyedi fehérjék specifikus kódolását biztosítva. Ez a megvalósítási mód tartalmazza vonalkód alkalmazását egyedi fehérjékben is, például egy Fv-domén egy vagy több CDR-ében. Ez a megvalósítási mód tartalmazza proteázok alkalmazását is, amelyek a fehérje:célanyag komplex fehérje komponensét is emészthetik, vagy ezenkívül a célanyag immobilizálására alkalmazott bármilyen fehérjetermészetű anya8 .:.. ·..· .:. ..· got, azzal a kikötéssel, hogy a kötött tesztfehérjé(k)ről felszabaduló vonalkód peptidek még mindig detektálhatok és szekvenálhatók a többi peptid háttere mellett. Ezen megvalósítási mód előnyös formátuma szerint egyetlen vonalkód régió található a könnyű láncok C-terminálisán, oldható Fab-fragmenst alkotva, ahol a VH és VL régiókat ugyanaz az expressziós kazetta vagy cisztron kódolja, ily módon a vonalkód-szekvencia alkalmazható mind VH, mind VL gének elérésére. Egy ilyen Fab-fragmens kényelmesen előállítható többféle expressziós rendszerben, például M13 bakteriofág rendszerben, ahol a szekréciós vezető-szekvenciák beépítésével az Fab könnyű és nehéz láncai szekretálódnak a gazdabaktérium periplazmatikus terébe, és összegyűjthetők onnan. A vektorrendszert először fázisban lévő vonalkódokkal készítjük el, szintetikus oligonukleotidok keverékének beklónozásával. Két egymás melletti vonalkód kialakításához egymás utáni klónozást vagy oligonukleotid mutagenezist végzünk, ahol az első kevert vonalkódot tartalmazó összeöntött M13 rekombinánsokat készítünk templátként a második, fázisban lévő vonalkód klónozásához. Előnyösen a vonalkódozást úgy tervezzük meg, hogy a kódolt fehérje endoproteáz helyeket tartalmaz mind a két vonalkód körül, mind közöttük, és egy „távtartó régió az egyik vonalkód mellett egy olyan peptidet hoz létre ezzel a vonalkóddal együtt, amelynek a molekulatömege nagyobb, mint a másik vonalkódé. A vonalkódok hozzáértő megtervezésével és több vonalkód ilyen alkalmazásával lehetőség adódik az endoproteázzal felszabadított peptidek egyszerű elemzésére, például MALDI-ToF alkalmazá sával, ahol a peptidek szekvenciája kikövetkeztethető (vagy majdnem kikövetkeztethető), ily módon szintetikus oligonukleotidokat tervezhetünk a MALDI-ToF elemzéssel detektált vonalkódokkal rendelkező specifikus fehérjék izolálására (dúsítására). A szekvenciák ilyen kikövetkeztetését a szekvenciák tervezésével érhetjük el, ahol specifikus aminosavak csak egy vagy két helyen fordulnak elő a pepiidben. Például ha a peptideket a 20 természetes aminosav közül 17 alkalmazásával tervezzük meg (ezeket itt A-Q val jelöljük), akkor a szekvenciákat három aminosav előfordulási lehetőségével tervezhetjük meg peptid szekvencia bármely helyen, az alábbiak szerint;
aminosav-hely: 1 2 3 4 5 6 7 8
aminosav
lehetőség: A C E G I K M 0
B D F H J L N P
C E G I K M 0 Q
Ez a minta elméletileg 6561 különböző vonalkód peptidszekvenciát adna. He egy vonalkód melletti távtartó-régiót ugyanilyen alapon terveznénk meg, akkor az még 6561 további vonalkódot adna. Kombinációban ez 4xl07 vonalkód-szekvenciát hozna létre, ami megfelelő lenne egy fehérje könyvtár legtöbb tagjának egyedi címkézésére. További egymás melletti vagy hosszabb vonalkódok, például a szekvencia bármely helyén két specifikus aminosav alkalmazásán alapuló vonalkódok (így 262144 különböző vonalkód-szekvencia hozható létre 19 aminosav alkalmazásával) alkalmazása növelné a vonalkódok diverzitását. A gyakorlatban a kodon-ismétlődés csökken az egyes helyeken a kodonok hozzáértő választása által a kevert szintetikus oligonukleotidok tervezése során. Egy 8 aminosavat tartalmazó, MS/MS szekvenálásra való peptidvonalkód egy terve az alábbi;
kodon NAC NCC NGG NTG TKC VÁG GNV CNT
aminosav N T R L F Q D H
D P G M C E V L
H A W V K A P
Y S G R
ahol N jelentése A, C, G vagy T
K jelentése G vagy T
V jelentése A, C vagy G
4x4x 3x3x2x3x4x4 = 13 82 4 vonalkódszekvencia
Specifikus kodonok beépíthetők nem folyamatos oligonukleotid-szintézissel is, ahol specifikus kodonokat adunk egymás után korábban szintetizált oligonukleotidok elválasztott keverékeihez („kodon mutagenezis). Ha egyszer a vonalkód-szekvenciát kikövetkeztettük MALDI-ToF vagy MS/MS alkalmazásával, és ahol az egyedi vonalkódok diverzitása kisebb, mint a könyvtáré, a megfelelő specifikus oligonukleotidot (vagy oligonukleotidok keverékét, ha ismétlődés van a kodon-használatban) alkalmazhatjuk PCR-láncindítóként egy másik, a fehérje vagy vektor rendszer alapján tervezett láncindítóval együtt, azon fehérjét kódoló génben való dú · · · · · ·
- 11 - j. λ”· sitásra, amelyből a vonalkódot detektáltuk. Ahol egymás melletti vonalkódokat alkalmazunk, az első láncindítóval létrehozott génfragmensen belüli második láncindítót alkalmazhatunk a detektált fehérje génjében való dúsításra. Adott esetben a fenti eljárás három vagy több vonalkódot is tartalmazhat annak érdekében, hogy növeljük a kívánt fehérjét kódoló specifikus gének oligonukleotidok által irányított dúsítását. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány ezen első megvalósítási módja számos eljárásváltozatot takarhat azzal az alapelvvel, hogy egy specifikus fehérjét kinyerünk ilyen fehérjék könyvtárából, a specifikus fehérje által kódolt vagy azzal kapcsolódó egy vagy több peptid tömeg- vagy szekvencia-analízise útján, és ily módon ennek a megvalósítási módnak széles körű alkalmazhatósága van kíván fehérjéket kódoló gének izolálására, ahol csak a peptid szekvenciáját határozzuk meg vagy következtetjük ki.
A szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány oltalmi körén belül az első megvalósítási módnak számos változata van. Például nyilvánvaló, hogy a peptid vonalkódokat beépíthetjük fehérjék párjaiba vagy csoportjaiba, amelyeket azután engedünk kötődni annak érdekében, hogy meghatározzuk mely fehérjék kötődnek egymáshoz, oly módon, hogy a kötésben résztvevő fehérjék mindegyikében detektáljuk a vonalkódot. Fehérjék komplex keverékeiből történő izolálás alternatívájaként ezen komplex keverékekben található fehérjéket - amelyek bizonyos kötődési tulajdonságokat mutatnak, mint például kötődnek makromolekulákhoz, mint például DNS-hez detektálhatunk a találmány szerinti eljárás alkalmazásával.
Az eljárás része számos mód peptid vonalkód hozzáadása fehérjékhez, beleértve olyan eljárásokat, amely szerint a vonalkódot a fehérjét kódoló génfragmens kódolja. Azonban a vonalkódok hozzáadhatok a fehérjékhez vagy molekulák bármilyen más megfelelő keverékéhez a peptidek közvetlen kapcsolásával is. Például specifikus peptideket hozzáadhatunk specifikus ellenanyagokhoz vagy fehérjékhez különböző kémiai vagy fotokémiai eljárással. Ilyen eljárás egy alkalmazása fehérjék egyik komplex keverékének jelölése az egyik vonalkóddal (vagy kiválasztott vonalkódokkal, például különböző fehérje-specifitással) , és a másik vonalkódot pedig fehérjék egy másik komplex keverékéhez adjuk, például két különböző minta fehérjéinek differenciális jelölésére, amelyeket azután összekeverünk. A szakember számára nyilvánvaló, hogy peptid-vonalkódok fehérjékhez vagy más molekulákhoz történő hozzáadásának elve nem peptidtermészetű vonalkódokra is alkalmazható, ahol az ilyen vonalkódokat közvetlenül azonosíthatjuk (vagy közel azonosíthatjuk) tömeg szerinti vagy szekvenálási eljárások alkalmazásával. Ily módon a vonalkódok lehetnek fehérjékhez vagy más molekulákhoz, köztük nukleinsavakhoz kapcsolt nukleinsav-vonalkódok is. Mint ahogyan a peptid-vonalkódokat, a nukleinsav-vonalkódat is elemezhetjük tömegspektrometriával a tömeg pontos becslésének megadására. Az ilyen vonalkódokat restrikciós enzimekkel szabadíthatjuk fel proteázok helyett.
A szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány oltalmi körén belül az első megvalósítási módnak vannak fehérjék izolálásától eltérő alkalmazásai is. Például olyan
- 13 - J.
fehérjék vagy más ligandumok eloszlását elemezhetjük az élő szervezeten belül a vonalkódok tömeg szerinti vagy szekvencia-elemzésével, amelyek a szervezeten belül specifikus szervekkel kapcsolatosak. Peptidek vagy fehérjék vagy más molekulákhoz való kötőspecifitásának elemzésében a vonalkódokat a peptid vagy fehérje kötőrégiójának részeként konstruálhatjuk meg annak érdekében, hogy a specifitást a vonalkódok tömeg szerinti vagy szekvencia-elemzésével elemezzük. Például kevert vonalkód-szekvenciákat konstruálhatunk MHCmolekulák ismert horgonyzó-oldalláncai körül, és a specifikus MHC-molekulákhoz kötődő peptideket a vonalkódok elúciójával és tömeg szerinti vagy szekvencia-elemzésével határozzuk meg.
Egy második megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás fehérje-könyvtár szkrínelésére, amely szerint a könyvtárat egy vagy több kívánt tulajdonságra szkríneljük, amelyet dereplikáció követ a könyvtár egy vagy több, a kívánt tulajdonsággal bíró egyedi fehérjéjének azonosítására.
A találmány ezen megvalósítási módjának tárgyát fehérjék, különösen rekombináns ellenanyagok, mint például Fvdomének könyvtárai képezik, ahol a könyvtárak egyedi tagjait specifikus célanyaghoz való kötődés szerint izoláljuk, ahol a könyvtárból való fehérjék készleteit egyedileg szkríneljük, majd a pozitív készleteket dereplikáció egy vagy több menetének vetjük alá, amíg a könyvtárban lévő, célanyaghoz kötődő egyedi fehérjéket azonosítjuk. Közelebbről ezen megvalósítási mód tárgya fehérjék könyvtárainak szkrínelése prezentálás! rendszer alkalmazása nélkül, azaz nincs fizikai kapcsolata a fehérjéknek a megfelelő génekkel. Ezen megvalósítási mód szerint a fehérjék készleteit a célanyaghoz való kötődésre szkríneljük, ahol akár a célanyag van megjelölve, hogy jelezze, melyik készlet(ek) tartalmazzá(k) a kötődő fehérjéket, akár a célanyagot detektáljuk jelölés nélkül. Különösen előnyös eljárás fehérjék készleteinek szkrínelése oldatban bármilyen fúzió vagy más molekularészekhez (amelyek befolyásolhatják a fehérjék kötődését a célanyagaikhoz) történő kapcsolás nélkül, és azután a teljes fehérje-készlet kicsapása (bármilyen kapcsolódott célanyaggal együtt) a tömeg szerinti elemzés, különösen MALDI-ToF előtt, annak érdekében, hogy ionizált csúcsok ujjlenyomatára („fingerprint) szkríneljünk, amelyek célanyagra jellemzőek, és ezáltal jelzik, ha a célanyag kötődött. Ha egyszer egy vagy több pozitiven kötődő készletet azonosítottunk, ezeket azután dereplikálhatjuk akár a készlet komplexitásának csökkentése, akár a célanyag kötőinek szkrínelésére szolgáló egyedi fehérjék kiválasztása érdekében. A gyakorlatban különösen előnyös mód fehérjék készleteinek összeállítására először az ezen fehérjéket kódoló gének készleteinek az összeállítása. Ha például a géneket fág vagy plazmid vektorokba klónoztuk, akkor ezeket kényelmesen csoportosíthatjuk az egyedi baktériumkolóniák vagy fágtarfoltok összekeverésével, vagy még kényelmesebben a kolóniák/tarfoltok készleteinek szétválasztásával különálló agar csészékre történő kiöntéssel (például 1000 kolónia/tarfolt csészénként), és a csészékről kolóniák/tarfoltok egy keverékbe történő levakarásával/eluálásával, ame lyet azután a fehérjék szintézisére alkalmazunk akár baktérium/fág expresszió, akár in vitro transzkripció/transzláció révén. Hasonló módon más mikroorganizmusok vagy in vitro szintézis-rendszerek is alkalmazhatók fehérjék szintézisére. Ezen megvalósítási mód tartalmazza komplex célanyagok, mint például molekulák, egész sejtek vagy sejtmembránok keverékeinek alkalmazását is, ahol molekuláris célanyag tömegelemzési „ujjlenyomatot szolgáltat, amely jellemző a komplex célanyagon belüli molekuláris célanyag kötődésére. Ezen megvalósítási mód tartalmazza (ahol a célanyag fehérje) proteázok alkalmazását is a célanyag(ok) emésztésére annak érdekében, hogy egy célanyagra jellemző, tömeg szerinti peptid-ujjlenyomatot hozzunk létre, és amely - ahol a proteáz emészti a könyvtárból való fehérjé(ke)t is - detektálható még a könyvtárból származó egyéb peptidek hátterében is. Ezen megvalósítási mód tartalmaz számos különböző típusú célanyagot és kritériumot a fehérjék készleteinek vagy egyedi fehérjéknek a kiválasztására is, amelyek mások, mint a kötődés a célanyaghoz. Például a megvalósítási mód tartalmazza biológia vizsgálati rendszerek alkalmazását, mint fehérjék kiválasztásának kritériumát, például ahol a fehérjéket biológiai aktivitás stimulálására vagy gátlására szelektáljuk ki. A kötődési vizsgálati eljárások más formái közé tartozhat egy ligandum kötődésének gátlása a receptorához, és olyan fehérjék kiválasztása, amelyek kötődnek a célanyag egyes részeihez, ahol a célanyag lehet agy molekula, sejt vagy szöveti metszet.
Egy harmadik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás fehérjék azonosítására és/vagy szekvenálására, amely szerint egyedi fehérjék könyvtárát biztosítjuk, amelyek közül egy vagy több kötődhet az érdeklődés tárgyát képező célanyaghoz, ahol minden egyes egyedi fehérje, együtt a génjével egy „kapcsoló molekularészhez kapcsolódik.
A találmány ezen megvalósítási módjának a tárgya fehérjék könyvtárai, különösen rekombináns ellenanyagok, mint például Fv-domének könyvtárai, ahol a fehérjéket és a megfelelő génjeiket összekapcsoljuk egy „kapcsoló molekularész hozzáadásával vagy beépítésével, ahol a fehérjék vagy Fv-domének kötődnek a célanyaghoz, akár a „kapcsoló molekularész hozzáadása előtt, akár azután. A kapcsoló molekularész a fehérjék vagy Fv-domének regenerálásának a lehetővé tételét szolgálja a kapcsolódó megfelelő gén révén, például PCR amplifikációval (vagy más amplifikáció útján, mint például bakteriális transzformáció, vagy közvetlen szekvenálás és azt követő regeneráció ezen szekvencia alapján). Ahol a fehérjéket vagy Fv-doméneket készletként állítjuk elő a megfelelő gének készletével, a célanyaghoz kötődő (vagy adott esetben önmagában nem kötődő) fehérjékhez vagy Fvdoménekhez kapcsolódó géneket alkalmazzuk az egyedi vagy kisebb készletet alkotó fehérjék vagy Fv-domének regenerálására annak érdekében, hogy megismételjük a szkrínelést a célanyaghoz kötődő specifikus fehérjék vagy Fv-domének azonosítására (a megfelelő gének révén).
• · · * • · · · ·· ··· ·*
Ezen harmadik megvalósítási mód előnyös formátuma az, ahol a kapcsoló molekularész egy részecske, és ahol rekombináns fehérjéket és a megfelelő génjeiket ko-immobiIzáljuk részecskéken, minélfogva az egyedi részecske visszanyerése biztosítja a rekombináns fehérjét kódoló gén vagy gének azonosítását. Ezen formátum tárgyát előnyösen olyan eljárások képezik, ahol a rekombináns fehérjéket kódoló géneket ko-immobilizájuk ugyanazon a részecskén, ahol a megfelelő fehérjéiket, ily módon a rekombináns fehérje kiválasztásával a megfelelő gént is kiválasztjuk, ily módon a kiválasztott fehérjét azonosíthatjuk (a gén szekvenálásával) , vagy ily módon további rekombináns fehérjét állíthatunk elő a génről. A találmány szerinti eljárás biztosítja a prezentált fehérje mennyiségének szabályozását a részecskén, általában a részecskén lévő olyan molekularészek számának szabályozásával, amelyekhez rekombináns fehérjék kötődnek. A találmány biztosítja más molekulák ko-prezentációját a részecskén a rekombináns fehérjével együtt, beleértve más fehérjéket vagy fehérjeláncokat, és olyan molekulákat, amelyekhez a rekombináns fehérje kötődik, például antigéneket.
A találmány szerinti harmadik megvalósítási mód alapműködése szerint adott gének rendezett csoportja („array) vagy gének keveréke, amelyből rekombináns fehérjéket szintetizálunk, olyan módszerekkel, mint például in vitro transzkripció és transzláció vagy fág-prezentáció, amely fehérjéknek a példái az ellenanyagok variábilis régiói (Fvdomének) . Ezt követően a géneket és rekombináns fehérjéket ko-immobilizáljuk részecskéken, egy vagy több ligandum kapcsolódik a génnel, akár DNS, akár mRNS, minélfogva a ligandumok kötődnek egy „receptorhoz a részecske felszínén, vagy a ligandumok reagálnak a részecske felszínével, kovalens vagy ionos kapcsolást létrehozva. Más megoldásként a gént közvetlenül immobilizáljuk a részecskére egy vagy több, természetes DNS-sel vagy RNS-sel reaktív csoportokkal való kovalens vagy ionos kötés kialakításával. A kapott, gének által kódolt rekombináns fehérjék egy vagy több ligandummal lehetnek kapcsolva (amely ligandumok fehérjemolekularészek lehetnek, ami által a kapcsolást elérjük), mint például fehérje-szekvencia-címkék (amiket a gének kódolnak) vagy biotin-csoportok (in vitro transzkripcióval és transzlációval beépítve biotin-lizin alkalmazásával), oly módon, hogy azok is hozzákapcsolódnak a „receptorhoz a részecske felszínén, vagy ahol a ligandumok reagálnak a részecske felszínével kovalens vagy ionos kötést kialakítva. A géneken vagy fehérjéken lévő ligandumok akár ugyanazon, akár különböző ligandumok lehetnek, ugyanazon vagy különböző receptoron immobilizálva. A találmány szerinti megvalósítási mód hasznos működésének érdekében a géneket vagy gének készleteit akár DNS-ként, mRNS-ként, akár egy élő mikroorganizmuson belül, mint például fágként rendezett csoportokba osztjuk szét (vagy több reakcióedénybe, stb.), és rekombináns fehérjéket állítunk elő a rendezett csoportokban (például in vitro transzkripcióval és transzlációval, vagy fágok tenyésztésével). A géneket tartalmazó eredeti rendezett csoportokat („master array) a rekombináns fehér jék előállítására szolgáló anyagok forrásaként alkalmazhatjuk, ahol gének vagy fehérjék mintáit utód rendezett csoportokba („server array) osztjuk szét, oly módon, hogy minden gén- vagy fehérje-készlet rendezett csoportbeli helyét megőrizzük. Akár a folyamat előtt, alatt vagy után egy vagy több részecskét adunk minden helyhez a rendezett csoportban, receptorokat biztosítva, amelyekhez a gének vagy fehérjék kötődhetnek. A találmány egy változata szerint a gének már kezdetben a részecskékhez kapcsolódnak, és a fehérjéket közvetlenül ezen génekről állítjuk elő, ily módon a rekombináns fehérjék azt követően ugyanarra a részecskére immobilizálódnak. Akár a rekombináns fehérjék részecskékhez történő kapcsolása előtt, akár utána, a fehérjéket opcionálisan módosíthatjuk, például más kinázokkal történő foszforiláció, vagy más fehérjék általi kötés révén. A harmadik megvalósítási mód egy változatában a rendezett csoportok cseppeket, mint például olaj-emulziókat vagy liposzómákat tartalmaznak, amelyekbe a gének vagy az élő mikroorganizmusok különválnak (általában a cseppeket a fehérjeszintézis előtt állítjuk elő, így a géneket a cseppeken belül rendezzük rendezett csoportokba). A fehérjéket a cseppeken belül állítjuk elő, és ezek azután együtt kapcsoljuk a géneket tartalmazó részecskékhez. A cseppek esetében a részecskéket - amelyekhez a gének és a fehérjék együtt kapcsolódnak vagy bejuttatjuk a cseppekbe, vagy a cseppek maguk lehetnek a részecskék. Például liposzómák esetén a fehérjéket lipofil címkékkel állíthatjuk elő, amelyek összeolvadnak a liposzómák membránjával, különösen ahol ez a fehérjék pre20 • · · · · · • · < · · • · · · ·· ·· · ·* zentációjához vezet a liposzómák külső felszínén. Egy kapcsolódó példa az, ahol mRNS in vitro transzlációját alkalmazzuk, és mikroszómális membránokat juttatunk be a reakcióelegybe, miáltal a liposzómás címkékkel rendelkező fehérjék integrálódnak az ilyen membránokba, amit azt követően apró részecskékké diszpergálhatunk.
Ha kívánatos, hogy azután csoportosítsuk a részecskéket a szelekciós folyamathoz, akkor a részecskéket visszanyerjük a rendezett csoportokból és összekeverjük; a részecskéken lévő rekombináns fehérjéket szelektáljuk, tipikusan a célanyagnak való kitétel révén, amely célanyag a részecskéken lévő kiválasztott fehérjékhez kötődik. Bizonyos rekombináns fehérjéket módosíthatunk is ebben a stádiumban. A kiválasztott vagy módosított fehérjéket hordozó részecskéket azután számos módszerrel visszanyerhetjük; például, ha a részecske fluoreszcens jellel van jelölve, akkor FACS-ot alkalmazhatunk a célanyagot tartalmazó (vagy nem tartalmazó) részecskék elkülönítésére. A találmány első fő megvalósítási módja szerint az ilyen kiválasztott részecskéken lévő rekombináns fehérjéket kódoló géneket azután visszanyerhetjük, például a ko-immobilizált DNS vagy mRNS PCR amplifikációjával.
„Kapcsoló molekularészeknek számos típusa létezik fehérjék és megfelelő génjeik összekötésére, amelyek alkalmazhatók a találmány harmadik megvalósítási módja szerint. Az alkalmazott részecskék közé tartoznak latex és mágneses részecskék, és olyan részecskék, amelyekre közvetlenül szintetikus oligonukleotidokat szintetizáltunk. Az ilyen • · · · · · • · · · · ·· · · ·· ·· · ·· részecskéket rendszerint „receptorral készíthetjük, amelyhez a szintetizált polipeptidek kötődhetnek. Más kapcsoló molekularészek egyszerű molekulák vagy molekuláris komplexek lehetnek, amelyek hídként működhetnek a gén molekulák és a szintetizált fehérjék összekapcsolására. Például mind a gén molekulák, mind a szintetizált fehérjék tartalmazhatnak biotin csoportokat, amelyeket azután keresztköthetünk sztreptavidin hozzáadásával, ahol a sztreptavidin működik kapcsoló molekularészként. Hasonló módon, fehérjéken lévő szekvencia-címkét és génmolekulákon lévő ligandumot is keresztköthetünk, például bispecifikus kötőreagens, mint például bispecifikus ellenanyag alkalmazásával (ami mind a szekvencia-címkéhez, mind a ligandumhoz kötődik), vagy ellenanyag-sztreptavidin konjugátum alkalmazásával (ahol az ellenanyag vagy a fehérjén vagy génen lévő ligandumhoz kötődik és a sztreptavidin a biotinhoz kötődik a fehérjén vagy a génen, amelyiken nincs ligandum). Más kapcsoló molekularészek baktériumok vagy bakteriofágok lehetnek, ahol a szintetizált polipeptid a baktériumon vagy bakteriofágon lévő specifikus ligandumhoz kötődik. Például M13 expreszsziós rendszert alkalmazhatunk egy specifikus ellenanyag Fv-doménjeinek az előállítására E. coli-ban, amely azután kötődhet egy specifikus fehérjeantigénhez magán az M13-on, különösen ahol ez a fág fején van prezentálva kapszidfehérjéhez fúzionálva. Azon M13 fágra történő teszteléssel, amelyhez az Fv-domén kötődött, a specifikus Fv-domént kódoló gént meghatározhatjuk, az M13 által kódolt Fv-domén szekvenálásával. Hasonlóképpen, az M13 expressziós rend22
·.? J. λ’· szert alkalmazhatjuk olyan fehérje előállítására is, amely egy, magán az M13 felszínén prezentált specifikus fehérjéhez kötődik. Minden esetben a harmadik megvalósítási mód egyedi tulajdonsága az, hogy a rekombináns fehérjemolekulák a szintézis után kötődnek a megfelelő génekhez a kapcsoló molekularész révén. Ilyen szintézis utáni kapcsolás különösen lehetővé teszi a fehérjemolekulák zavartalan szintézisét, például anélkül, hogy azokat fúzióként kellene megszintetizálni más fehérjemolekulákkal, ami megváltoztathatja a fehérje konformációját vagy zavarhatja a felismerését vagy funkcióját.
A találmány tárgya számos eljárás a rekombináns fehérjék előállítására a kapcsoló molekularésszel történő összekötést megelőzően. Ezen eljárások közé tartozik különösen a fehérjeszintézis in vitro transzkripcióval és transzlációval, és plazmidokkal vagy fággal irányított fehérjeszintézis baktériumokban. Az utóbbi esetben a találmány előnye az, hogy a termelt fehérjét nem kell fuzionálnunk egy fág fehérjével, mivel a találmány szerint termelt fehérjét azt követően immobilizáljuk egy különálló részecskére. Fehérjék jelenlegi fág-prezentációs eljárásaival ellentétben - ahol a fehérjéket felszíni fágfehérjéhez fuzionálják vagy olyan fehérjékhez, amelyek képesek elérni a felszínt - a találmány harmadik megvalósítási módja megkövetelné a fág lízisét vagy a rekombináns fehérje kieresztését vagy szekrécióját a fág fejéből annak érdekében, hogy biztosítsuk azok azt követő immobilizálását a részecskére. Más, fehérjék előállítására szolgáló in vivo eljárások, mint például • · < ·>· expresszió baktériumokban, élesztőben, vagy akár emlőssejtekben tehát szintén alkalmazhatók a harmadik megvalósítási mód szerint, amelynek tehát megvan az az előnye, hogy rugalmasabb, mint az egyedi prezentálás! eljárások. Ezáltal a rekombináns fehérjét módosíthatjuk egy bizonyos gazdával, például glikozilálható emlőssejttel az immobilizálását megelőzően. A találmány egy különösen hasznos megvalósítási módja a rekombináns fehérjék számának szabályozási képessége a kapcsoló molekularészen - különösen amikor az részecske - a részecskén lévő „receptor molekulák számának szabályozásával. Az ellenanyag variábilis régiók esetében tehát az egyedi vagy készletben lévő ellenanyagok valenciája változhat a szelekciós kritériumok függvényében. Egy további alternatív kapcsoló molekularész lehet egy élő sejt maga, ahol a rekombináns fehérje az élő sejt felszínén vagy ahhoz közel lévő ligandumhoz kapcsolódik, mint például a plazmidot hordozó baktérium- vagy emlőssejt sejtfelszíni markerhez, vagy ahol szekréció nyomán a fehérje kötődik a sejthez, amelyből expresszálódott. Azután a fehérjét reagáltathatjuk a célanyaggal, és a célanyagot kötő specifikus Fvdomén expressziós kazettáját hordozó sejtek izolálhatok.
A találmány szerinti harmadik megvalósítási mód tárgya egy különösen hasznos mód olyan rekombináns fehérjék szelekciójára, amelyek kötődnek a célanyaghoz, vagy olyan rekombináns fehérjék szelekciójára, amelyek módosulnak egy specifikus kezelés, például sejt vagy szövet lizátumokkal történő kezelés hatására. Az eljárás ennek megfelelően különösen hasznos lehet rekombináns fehérjék molekuláris evő lúciójára, ahol szelekció egymást követő menetei csak sztringens tulajdonságú, mint például célanyagokhoz magas kötési affinitással rendelkező fehérjék szelekcióját biztosítják. Az eljárás tárgyát képezhetik kiválasztott gének mutációjának egymást követő menetei is, az evolúciós szelekció diverzitásának maximalizálására. A szakember számára nyilvánvaló, hogy számos olyan változat létezik, amely a harmadik megvalósítási mód alapján alkalmazható, de a találmány oltalmi körébe esik. Például gének és rekombináns fehérjék befogására alkalmazott kapcsoló molekularészek, különösen részecskék maguk is kötődhetnek más polipeptidláncokhoz, minélfogva - amikor fehérje-fehérje kötődés jön létre - a rekombináns fehérjét nem közvetlenül részecske fogja be, hanem a már a részecskén lévő polipeptid-lánc. A rekombináns fehérjén lévő megfelelő címke vagy ligandum alkalmazható azután a fehérje-fehérje kötődési esemény detektálásának biztosítására. Ugyanilyen módon a részecskék szintetikus oligonukleotidokat is köthetnek, amelyeket azt követően a gének anneálására alkalmazunk, mint azok részecskére történő befogásának eszközét.
Egy negyedik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás fehérjék azonosítására és/vagy szekvenálására, amely szerint egyedi fehérjék könyvtárát biztosítjuk, amelyek közül egy vagy több kötődhet az érdeklődés tárgyát képező célanyaghoz, ahol minden egyes egyedi fehérje egy egyedi „kódoló molekularészhez („coding moiety) kapcsoló dik.
A találmány ezen megvalósítási módja szerint a génkönyvtárból szintetizált rekombináns fehérjéket „kódoló molekularészekhez, mint például részecskékhez kapcsoljuk, amelyek megkülönböztethetők egy vagy más kódoló mechanizmuson keresztül, oly módon, hogy a kódolás kapcsolatos annak a génnek az azonosításával, amely a részecskéhez kapcsolódó rekombináns fehérjét kódolja. Ahol a rekombináns fehérjéket immobilizáljuk a kódoló részecskékre, a rekombináns fehérjékhez egy vagy több ligandum kapcsolódhat, mint például fehérje szekvencia-címkék vagy biotin-csoportok oly módon, hogy azok egy „receptorhoz kötődhetnek a kódolt részecske felszínén, vagy ahol az ilyen ligandumok reagálnak a részecske felszínével, kovalens vagy ionos kapcsolatot kialakítva. A találmány ezen megvalósítási módjának működése közben rekombináns fehérjéket vagy azok készleteit szintetizáljuk vagy különítjük el nagy rendezett csoportokban. Azután az egyedi kóddal bíró részecskéket adunk a rendezett csoport egyes helyeihez. Az ilyen kódok közé tartoznak például mérhető jelzőmolekulák - mint például fluoreszcens, kemilumineszcens vagy radioaktív jelzők, vagy különböző fizikai tulajdonságok, amelyek megkülönböztetik a részecskéket, mint például különböző alakok és mintázatok, például kód vagy egyedi jelzés a részecskébe maratva - különböző arányai. Minden esetben az egyedi kódolt részecskék megkülönböztethetők egymástól. A találmány szerinti alkalmazott részecskék közé tartozik bármilyen ilyen részecske, komplex vagy molekula azzal a tulajdonsággal, hogy fehérje kapcsolható hozzá. A részecskék összeöntését és kódolt részecské ken lévő fehérjék keverékeinek specifikus célanyaghoz történő kötését követően a kiválasztott részecskék kódolását meghatározhatjuk annak érdekében, hogy meghatározzuk az eredeti rendezett csoportbeli helyüket, és ily módon a kiválasztott rekombináns fehérjéket kódoló gének rendezett csoportbeli helyét is. A találmány ezen megvalósítási módjainak egy változataként a részecskéken kiválasztott fehérjéket közvetlenül azonosíthatjuk például MALDI-ToF (tömegspektrometria) vagy jelölt ellenanyag alkalmazásával ismert fehérjék azonosításra. A találmány ezen negyedik megvalósítási módjának működése és oltalmi körének számos vonatkozása közös a fenti harmadik megvalósítási mód megvalósítási módjával és oltalmi körével.
Egy ötödik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás fehérjék elemzésére, amely szerint:
(i) a fehérjekeveréket emésztjük vagy hasítjuk;
(ii) a kapott peptideket frakcionáljuk; és (iii) a kapott peptideket elemezzük azok tömege és/vagy szekvenciája szerint.
A találmány ezen megvalósítási módjának tárgya fehérjék keverékeinek elemzése. Közelebbről a találmány tárgyát eljárások képezik különböző sejtek és szövetek fehérjéinek összehasonlítására. A találmány tárgya fehérjekeverékek emésztésének vagy hasításának, a peptidek fehérjekötő reagensek könyvtárának alkalmazásával történő frakcionálásának, és a peptid-frakciók azt követő tömeg vagy szekvencia szerinti elemzésének a kombinációja. A találmány tárgya fehérjék vagy peptid-fragmensek további opcionális fizikai frakcionálása a fehérjekötő reagensekkel történő frakcionálás mellett. Fehérjék komplex keverékeinek - például sejtekben vagy szövetekben - nagy tömegben történő elemzésére szolgáló jelenlegi eljárások megkövetelik, hogy elválasszuk a fehérjéket, olyan technológiákkal, mint például kétdimenziós (2D) gélelektroforézis. Ehhez a technológiához a sejtbeli fehérjéket általában töltés alapján választjuk szét az egyik dimenzióban, és méret alapján a másik dimenzióban. A fehérjéket vagy egy ismert fehérje elektroforetikus vándorlási mintázatára vonatkozóan azonosíthatjuk, vagy a fehérje elúciójával az elektroforetikusan elválasztott foltból olyan eljárások szerinti elemzéssel, mint például tömegspektrometria vagy nukleáris mágneses rezonancia. Azonban a 2D-fehérjegéles eljárások korlátái közé tartozik az egy sejtből való fehérjék korlátozott felbontása és detekciója (tipikusan csak 5000 sejtfehérje detektálható tisztán), az elválasztott fehérjék azonosításának korlátozottsága (például a tömegspektrometria általában 100 fmol vagy több fehérjét igényel az azonosításhoz), a módszer specialista jellege, és a módszer automatizálásának nehézsége annak érdekében, hogy nagyon magas fehérje-elemzési teljesítményt érjünk el. Tehát igény van jobb eljárásokra fehérjék komplex keverékeinek tömeges elemzésére, különösen olyan eljárások alkalmazásával, amelyek gélelektroforézis nélküliek, és amelyeket könnyű automatizálni.
Az ötödik megvalósítási mód lényege az, hogy a fehérjéket kisebb peptid-fragmensekre emésztjük vagy hasítjuk, és azután frakciónáljuk fehérje-affinitási reagensek könyv
- 28 - ·:
····* * · · tárának alkalmazásával, és azután tömeg szerint, előnyösen tömegspektrometriával elemezzük. Opcionálisan a fehérjéket vagy peptid-fragmenseket fizikailag is frakcionálhatjuk a fehérje-affinitási reagensekkel történő frakcionálás mellett, és egy vagy több „kémiai címkével is konjugálhatjuk azokat a frakcionálás segítésére.
Az ötödik megvalósítási mód fő megvalósítási módjának a tárgya a fehérjék hasítása proteázokkal vagy kémia eljárásokkal, az így előállított peptidkeverék frakcionálása, és az azt követő tömeg szerinti elemzés. A peptidek frakcionálását fehérje-affinitási reagensekkel érjük el, különösen rekombináns ellenanyag-fragmensek könyvtáraival. Opcionálisan az eljárások a fehérjék vagy peptidek további frakcionálását is tartalmazzák, fizikai eljárások vagy specifikus affinitási reagensek, mint például ellenanyagok vagy szilárd fázisok vagy reaktív kémiai csoportok alkalmazásával, a peptidek vagy peptidek keverékeinek izolálására az azt követő tömeg szerinti elemzés céljára. A fehérjeaffinitási reagenseket az egyedi peptidek vagy peptidek csoportjainak visszanyerésére alkalmazzuk a peptid keverékekből a későbbi tömeg szerint elemzés céljára. Más megoldásként vagy ráadásként a fehérje-affinitási reagensek alkalmazhatók peptidek eliminálására a keverékből, ahol a keveréket vetjük alá a későbbi tömeg szerinti elemzésnek. A fehérje-affinitási reagensek akár specifikus szekvenciák, akár a peptidek szerkezetei, akár specifikus kémiai csoportok révén köthetnek, akár mint a peptidek természetes összetevői, akár kémia címkék, amelyeket akár a hasítás előtt, akár utána adunk a peptidekhez.
A peptidek nagyobb keverékeinek elemzésére fehérjeaffinitási reagensek sorozatait („panel) - mint például ellenanyag Fv-fragmensek (köztük egyláncú Fv-domének) rekombináns könyvtárai által biztosítottakat - alkalmazhatjuk annak érdekében, hogy a peptidek részhalmazait izoláljuk a későbbi elemzéshez. Fv-domének ilyen sorozatai peptid-specifitások széles tartományát tartalmazhatják, amelyet például ellenanyag-könyvtáraknak az érdeklődés tárgyát képező peptid mintákra történő előzetes adszorpciójával érhetünk el, vagy állatoknak az érdeklődés tárgyát képező peptidekkel történő immunizációjával, és az állatok B-sejtjeiből készített rekombináns Fv-domén-könyvtárak előállításával. Más megoldásként poliklonális antiszérumot vagy monoklonális ellenanyagok-sorozatokat készíthetünk immunizált állatokból, és alkalmazhatunk peptidek frakcionálására. A kiválasztott ellenanyagokat vagy azok keverékeit alkalmazzuk azután a peptidek specifikus részhalmazának a teszt mintából történő izolálására (vagy eliminálására). A peptidek azt követő tömeg szerint elemzése megkönnyítheti a teszt minták közötti specifikus fehérjék közti különbségek detektálását .
Rekombináns Fv-domének vagy ellenanyagok előállítása egy keverékben lévő összes pepiidre nehéz, és nagyban függ a keverékben lévő peptidek számától és az egyedi peptidek ellenanyagokhoz való, elfogadható affinitású kötődésének képességétől („antigenitás). Egy nagyon nagy peptid-keve rék esetén korlátozó a redundancia, ahol ugyanazon peptidspecifitású ellenanyagok ismételten képviselve vannak, míg más peptid-specifitású ellenanyagok kevéssé vannak képviselve, vagy hiányzanak. Ez azt okozhatja, hogy egy adott fehérje nem elemződik tömeg szerint, ha az adott fehérje egyik peptidjét sem köti meg ellenanyag. Tehát különösen hasznos eljárás N- vagy C-terminális (vagy mindkettő) peptidek izolálása a fehérjének szilárd fázisra történő előzetes adszorpciója révén az N- és/vagy C-terminálisán keresztül a hasítást megelőzően, vagy az N- és/vagy C-terminális kémiai címkézése a hasítás utáni későbbi izolálás céljára. Elvben ennek a mintában lévő összes fehérjét képviselő összes N- és/vagy C-terminális peptid visszanyeréséhez kell vezetnie. Az N- és/vagy C-terminális peptidek ilyen izolálását nagymértékben megkönnyíti a fehérjében lévő N-terminális amino-csoport és a C-terminális karboxil-csoport megkülönböztető reaktív természete a közbenső amino- és karboxil-csoportokhoz képest. Az ilyen izolált N- és/vagy Cterminális peptideket tovább frakcionálhatjuk más affinitási reagensek alkalmazásával, amelyek akár specifikus peptidszekvenciákat ismernek fel, akár a peptideken lévő kémiai címkéket ismernek fel, vagy fizikai eszközökkel, mint például HPLC alkalmazásával frakcionálhatók tovább. Az ilyen izolált N- és/vagy C-terminális peptideket azután fehér j e-affinitási reagensekkel frakcionáljuk tovább a tömeg szerinti elemzést megelőzően. A találmány számításba veszi különböző kémiai címkék sorozatos konjugálását a fehérje/peptidkeverékekhez, különösen ahol a fehérjék/peptidek N31 vagy C-terminálisait sorozatosan specifikus hasítással felfedjük, és ahol az N- vagy C-terminálist (vagy mindkettőt) specifikus kémiai címkével konjugáljuk a terminális felfedésekor. A találmány ezen megvalósítási módja tehát egy sorozat fehérjefrakciót biztosít beépített kémiai címkékkel a terminálisokon, amely frakciókat a címkéhez kötődő affinitás! reagensek alkalmazásával izolálunk. A terminálison lévő kémiai címke különösen hasznos alternatív eljárásaként kémiai címkéket specifikusan kapcsolhatunk nem-terminális aminosavakhoz is, ily módon belső peptidek is izolálhatok a belső címke révén. Egyedi reakciók állnak rendelkezésre ligandumok számos specifikus aminosavhoz történő kapcsolására, például a lizinek ε-amino-csoportjaihoz, ciszteinek tiol-csoportjaihoz és aszparaginsavak és glutaminsavak karboxíl-csoportjaihoz. Peptidek nem-terminális címkék általi izolálásának egy előnye az, hogy nagyobb peptideket szelektálhatunk, amelyek valószínűbb módon tartalmaznak olyan aminosavakat, amelyekhez címke kapcsolódik, ily módon olyan peptidek izolálhatok, amelyeknek a tömege nagyobb, mint a tömeg szerinti elemzés során nagy háttérzajjal bíró kisebb molekulatömegűeké. Egy másik előny a már jelenleg is elérhető reagensek sokasága, amelyek képesek kémiai címkéket beépíteni specifikus aminosavakra a fehérjéken vagy peptideken belül, különösen olyan reagensek, amelyek biotin-címkét biztosítanak.
Az ötödik megvalósítási mód egy másik formájának a tárgya fehérjehasítás sorozatos ciklusai proteázok vagy kémiai eljárások alkalmazásával, frakcionálás fehérje-affini tási reagensekkel, akár az egymást követő fehérjehasitási lépések során vagy azokat követően, és a későbbi tömeg szerinti elemzés. Ebben az esetben a fehérjekeverékek elemzését sorozatos hasítási ciklusok segítik, ahol a fehérjék és peptidek spektrumát minden ciklus után a fehérje-affinitási reagensekkel frakciónáljuk és elemezzük. Ezen eljárás tartalmazhat kémiai címkézési ciklusokat a hasítási ciklusok között a tömeg növelésére, vagy lépéseket oldal-csoportok, mint például szénhidrát-csoportok eltávolítására, a tömeg csökkentésére. Ha a fehérjefragmensek tömegét azután meghatározzuk minden ciklus végén (akár kémiai címkézéssel, hasítással vagy más módosítással, akár azok nélkül) , akkor egy tömegeloszlást kapunk minden egyes ciklusra. A tömegmódosítási ciklusok megfelelő sorozatával az eredmény egy egyedi fehérje vagy fehérjék keveréke esetén fehérje/peptidefragmensek tömegspektruma lesz, amely egymást követő ciklusok során változik; ezen változások mintázata biztosíthatja a keverékben lévő specifikus fehérje/peptid „ujjlenyomatát. Bizonyos molekulatömegű fehérje/peptidfragmensek megjelenése és eltűnése specifikus hasítási ciklusokat követően - kémiai címkézéssel, hasítással vagy más módosítással vagy azok nélkül - biztosíthatja a fragmens-szekvenciának azonosítására szolgáló ujjlenyomatot, különösen ilyen ujjlenyomatok adatbázisára vonatkoztatva. Különböző rokon mintákból származó fehérje/peptidfragmensek spektrumának az összehasonlítása azután lehetővé teszi az ezen minták közti fehérje/peptidfragmens-különbségek azonosítását. A találmány ezen megvalósítási módja szerint különösen hasznosak az olyan proteázok, amelyek két aminosavat ismernek fel, és ennek eredményeként elhasítják a fehérjét. Ilyen proteázok példái a prohormon-konvertázok, amelyek dibázikus aminosav-párok között hasítanak. Ezáltal a találmány ötödik megvalósítási módjának a tárgyát új módszerek képezik fehérjekeverékek elemzésére, fehérjék emésztésének vagy hasításának, fehérjekötő reagensekkel történő frakcionálásnak, és tömeg szerinti elemzés kombinációjának az alkalmazásával .
Az ötödik megvalósítási móddal összefüggő megvalósítási mód szerint a fehérjéket frakcionáljuk a hasítást megelőzően. Nagy fehérjekeverékek esetén - különösen amelyeket közvetlenül egész sejtekből vagy szövetekből izoláltunk - a fehérjék előzetes frakcionálása kívánatos lehet annak érdekében, hogy csökkentsük a későbbi hasításnak, peptid-frakcionálásnak és tömeg szerinti elemzésnek alávetett keverékek komplexitását. Míg a fehérjék/peptidek szekvenciáihoz vagy szerkezeteihez közvetlenül kötődő fehérje-affinitási reagensek elsősorban hasznosak, alternatívaként vagy ráadásként kémiai címkék könyvtárát is alkalmazhatjuk a fehér j e-af f initási reagensek egy halmazához kötődő molekularészek biztosítására. Az előzetes frakcionálás hagyományosabb eszközei közé tartozik a gélelektroforézis akár egy, akár két dimenzióban, ahol a gél részleteit izoláljuk és az abban lévő fehérjéket vetjük alá azután hasításnak és tömeg szerinti elemzésnek. Más előzetes frakcionálási eljárások közé tartozik a fehérjék izolálása természetes módosítások, mint például foszforiláció, glikoziláció, fehérje-fehérje
- 34 - ·» (vagy peptid) kölcsönhatás révén; más megoldásként előzetesen frakcionálhatunk membránfehérjéket vagy a sejt bizonyos kompartmentjeiből való fehérjéket. Más fontos előzetes frakcionálási eljárás a nagyon nagy mennyiségben előforduló fehérjék eltávolítása a keverékből affinitási reagensek, mint például az ilyen fehérjéket kötő és eltávolító ellenanyagok alkalmazásával. Az előzetes frakcionálás alternatívájaként a hasítás után keletkezett peptideket is frakcionálhatjuk ezen eszközök közül sokkal, és méret/töltés szerinti frakcionálási eljárásokkal HPLC alkalmazásával. Az ilyen eljárások különösen hasznosak olyan peptidek frakcionálására, amelyeket már kiszelektáltunk a keverékből fehérje-affinitási reagensek alkalmazásával. Közelebbről, a HPLC-t összekapcsolhatjuk tömeg szerinti elemzéssel, oly módon, hogy a HPLC elválasztásból származó peptideket közvetlenül tömeg szerinti elemzésnek vetjük alá. A hasítás után keletkezett peptideket természetes módosítások alkalmazásával is frakcionálhatjuk, például ellenanyagokkal, amelyek a peptidekben lévő foszforilált aminosavakhoz kötődnek. A fehérjék előzetes frakcionálását fehérje-affinitási reagensek, mint például monoklonális/poliklonális ellenanyag alkalmazásával is elérhetjük, specifikus fehérjék izolálására későbbi hasítás és tömeg szerinti elemzés céljára. Fehérjék nagy keverékeinek, ellenanyagok könyvtárainak - mint például Fv-domének rekombináns könyvtárainak ilyen elemzése előnyös annak érdekében, hogy fehérjék részhalmazait vagy hasított peptidek részhalmazait izoláljuk későbbi tömeg szerinti elemzés céljára. Ellenanyagok ilyen .!
a.
könyvtárai fehérje- vagy peptid-specifitások széles körét tartalmazhatják, de előzetesen dúsíthatok is az érdeklődés tárgyát képező fehérjék/peptidek kötésére az érdeklődés tárgyát képező mintában. Peptidek esetén ezt előnyösen az egyedi Fv-doméneknek a mintában lévő egyetlen vagy kisszámú peptid szelektív kötésére történő tesztelésével érjük el. Más megoldásként az előzetes dúsítást az érdeklődés tárgyát képező kevert fehérje/peptid minta ellenanyag-könyvtárakon történő előzetes adszorpciójával is elérhetjük, és azután az egyedi vagy keverék szelektált ellenanyagok alkalmazásával, annak érdekében, hogy a fehérjék vagy peptidek részhalmazait izoláljuk. A fehérje-affinitási reagensekkel történő frakcionálás különböző fehérje/peptid frakciók körére biztosít tömegspektrumot, ily módon megkönnyíti a minták közötti specifikus fehérjék különbségének detektálását.
A kémiai címkék alkalmazásának egy további előnye az, hogy a peptidek későbbi frakcionálása affinitás! reagensekkel nagyban csökkentheti a kiválasztott peptidek számát egy fehérje-molekulából, a molekula maradékának ezáltali eliminációjával a tömeg szerinti elemzésből. Egy különösen kényelmes eljárás a szelektív kémiai címkézésre a fehérjemolekulák N- vagy C-terminálisának (vagy mindkettőnek) a címkézése a keverékben, azután a fehérjemolekulák emésztése vagy hasítása egy meglehetősen szelektív reagenssel, mint például aminosav- vagy szekvencia-specifikus proteázzal (mint például endopeptidáz Arg-C) vagy hasító reagenssel (mint például savas pH Asp-Pro-nál való hasításra). Affinitás! reagens alkalmazásával az eredeti fehérje N- vagy C .1
J.
terminális peptidjeit (vagy mindkettőt) azután izolálhatjuk, és az összes belső pepiidet eldobhatjuk. A komplexitás ilyen csökkentése azután elegendő tömeg szerinti elemzéshez, különösen HPLC-nek tandem tömegspektrométerrel összekapcsolt alkalmazásával a peptidek tömeges elemzésre, annak érdekében, hogy a keverékből származó egyedi peptideket azonosítsuk.
Más megoldásként a kémiai címkézést csak az emésztés/hasítás után hajthatjuk végre, például a dibázikus hasitokkal, a prohormon-konvertázokkal. Ez biztosítaná az eredeti fehérjéknek csak egy vagy több belső helyén történő címkézését. Ha a fehérjekeveréket azután egy második emésztés/hasítási lépésnek vetjük alá egy másik enzimmel vagy hasítási reagenssel, akkor a címkézett peptidek mérete kisebb lenne, ahol hasítási hely volt jelen az eredeti fehérjében. A címkézett peptideket azután frakcionálhatnánk fehér je-affinitási reagensek alkalmazásával, és tömeg szerinti elemzésnek vethetnénk alá.
Az ötödik megvalósítási mód egy másik formájában egy fehérjekeveréket címkézés, emésztés/hasítás és tömeg szerinti elemzés ciklusoknak vetünk alá, ahol a fehérje-affinitási reagensekkel történő frakcionálási és tömeg szerinti elemzést csak a specifikus kémiai címkéhez kötődő affinitást reagens alkalmazásával kapott keverék egy alikvotján hajtjuk végre, és ahol az eredeti keveréket azután egy eltérő kémia címkével történő címkézésnek és emésztés/hasításnak vetjük alá. Ez sorozatban különböző fragmeseket biztosít. Az eljárás egy másik változata a fentivel megegyező kezdeti lépéseket tartalmazza, de a hasítás után új N- és C-terminálisok kerülnek felszínre, és ezen új terminálisokat azután opcionálisan különböző kémiai címkékkel címkézzük, amely ezáltal belső helyeket címkéznek meg az eredeti fehérjében. Adott esetben az eljárást megismételhetjük egy vagy több alkalommal különböző proteázzal vagy hasító reagenssel, minden alkalommal egy különböző kémiai címkét adva az új N- vagy C-terminálishoz. Az eljárás egy formátumában a fehérjék teljes keverékét először két különböző kémiai csoporttal címkéznénk az N- és C-terminálisok mindegyikén, és azután egy proteázzal hasítanánk, például egy olyannal, amelyik egy specifikus aminosav mellett specifikusan vág, és újra címkéznénk az új N- és C-terminálisokat két további különböző kémiai címkével. Ez olyan peptidek keverékét eredményezné, amelyeknek mindkét terminálisán kémiai címkék vannak. Mivel az N- és C-terminális peptideknek specifikus címkéi lennének, ezeket azután izolálhatnánk a keverékből megfelelő affinitási reagensek alkalmazásával. A belső peptideket a kezdeti N- vagy C-terminális címke nélkül azok specifikus címkéinek alkalmazásával izolálhatnánk. Az emésztés és címkézés folyamatát megismételhetnénk további címkés peptidek készítésére. A specifikus címkék affinitási reagenseinek specifikus kombinációinak alkalmazásával az eredeti fehérje N- és C-terminális vagy belső peptidjeit izolálhatnánk, és kiválasztott peptideket eldobhatnánk a komplexitás csökkentésének elérésére. Ahol a peptid két vagy több aminosav-oldalláncához kapcsolódik kémiai címke, az affinitási címkék egymás utáni alkalmazásával aminosavak . a · · ··· ·····..· _· specifikus kombinációit tartalmazó peptidek frakcióit izolálhatjuk. Például ha átlagosan 20 aminosav hosszúságú peptidek keverékét külön-külön címkézzük lizinen és fenilalaninon, és a keverék 25% olyan peptidet tartalmaz, amely sem lizint, sem fenialalnint nem tartalmaz, 25% csak lizint tartalmaz, 25% csak fenilalanint tartalmaz, és 25% mindkettőt tartalmazza, akkor lizinre vagy fenilalaninra specifikus affinitási reagensek különálló vagy egymás utáni alkalmazása a peptidek négy egyenlő frakcióra történő frakcionálását eredményezheti. A gyakorlatban az ilyen frakcionálási séma kedvezhet a nagyobb peptidek affinitási reagensekhez történő kötődésének, mivel ezek a peptidek valószínűbb, hogy tartalmaznak egy vagy több specifikusan címkézett aminosavat. Ez elfogulttá tesz a kis peptidekkel szemben, mint például amelyeknek a molekulatömege kisebb, mint 1000 Da, amelyek tömegspektrometriás elemzésnek kitéve valószínűbb, hogy egybeesnek a háttérzajjal, ami a fragmentált peptidek és kismolekulák következménye.
Ahol komplex fehérjekeverékek elemzése szükséges, mint például emlőssejtek vagy szövetek esetén, a találmány tárgyát egy fő eljárás képezi, amely szerint a fehérjéket fehér j e-affinitási reagensekkel frakciónáljuk akár hasítás előtt vagy utána, és a peptideket azután tömeg szerint elemezzük. A fehérjék vagy peptidek komplex keverékének frakcionálásához fehérje-affinitási reagensek hasonlóképpen komplex keveréke szükséges, és azt egy vagy több további affinitási reagens segítheti, amely a fehérjék/peptidek olyan tulajdonságait ismeri fel, ami a frakcionálás alapja.
Λ Λ · ···
Ahol a hasítást a frakcionálás előtt hajtjuk végre, a találmány szerinti leggyakrabban alkalmazott eljárás szerint a teljes fehérjekeverék hasítjuk egy proteázzal, mint például tripszinnel vagy V8 (Glu-C) proteázzal, és azután szelektíven izolálunk és tömeg szerint elemzünk bizonyos peptideket. Rendszerint N- vagy C-terminális peptideket (vagy mindkettőt) izolálunk a peptidkeverékből, tipikusan kémiai címkének a fehérjék N- vagy C-terminálishoz történő hozzáadásával a hasítást megelőzően, és olyan affinitási reagens alkalmazásával, amely a kémiai címkével rendelkező peptideket izolálja. Más megoldásként specifikus peptideket (N/Cterminális, vagy másmilyen) izolálhatunk olyan affinitási reagensek alkalmazásával, amelyeket specifikus fehérjéken belüli specifikus peptidek kötésére szelektáltunk; ezek azután kiszelektálják a peptideket a keverékből. Fehérjék komplexebb keverékei esetén egy további frakcionálási lépés, mint például méret, tömeg vagy hidrofóbitás alapján történő HPLC frakcionálás előnyös a tömeg szerinti elemzést megelőzően, különösen mivel ezt összekapcsolhatjuk a tömeg szerinti elemzéssel. Ezután a peptidek szelektív izolálása lehetővé teszi más fehérjekeverékekből származó specifikus peptidek összehasonlító elemzését azok viszonylagos mennyisége tekintetében (a megfelelő keverékekben lévő fehérjék viszonylagos szintjéhez történő hasonlítással), és bizonyos esetekben a peptidek módosítása tekintetében.
N- vagy C-terminális peptidek frakcionálása esetén a fehérje-affinitási reagensek előállítása és alkalmazása a találmány fontos megvalósítási módja, és az N- vagy C40 ά, terminális jelölése egy másik fontos megvalósítási mód. Emlős sejtekből vagy szövetekből és sok élő szervezetből való fehérjék tipikus keverékénél ezen fehérjék N-terminálisai közül számos (és néhány C-terminális is) módosított lehet (például metilációval) , ily módon a kémiai címke terminálishoz történő hozzáadása gátolt lehet. Ezenfelül emlős sejtekből vagy szövetekből, vagy sok élő szervezetből származó fehérjék tipikus keverékében a fehérjék különböző viszonylagos koncentrációban fordulnak elő, köztük bizonyos nagyon nagy koncentrációban lévő fehérjékkel. Ahol az emlős sejtekből vagy szövetekből, vagy más élő szervezetből származó fehérjekeverékeket alkalmazunk a fehérje-affinitási reagensek kezdeti szelekciójára, az ilyen nagyon nagy koncentrációban lévő fehérjék uralhatják az affinitás! reagensek szelekcióját, és túlsúlyban lehetnek a tömeg szerinti elemzést szolgáló végső peptidkeverékben. Mindezen problémákra megoldás kevert fehérjék mesterséges forrásának alkalmazása az affinitási reagensek izolálására. Tipikusan ez egy génexpressziós rendszer lehet, ahol egy génkönyvtárat (általában cDNS-könyvtárat) alkalmazunk az N- vagy Cterminális módosítás nélküli fehérjék előállítására. Ezenfelül a génexpressziós rendszer alkalmazása lehetővé teszi a könyvtár „normalizálását a nagyon nagy koncentrációban előforduló gének csökkentésére vagy eltávolítására. Ezt tipikusan a DNS (vagy RNS) ön-anneálásával érjük el a könyvtár konstrukcióját megelőzően. Tehát a találmány szerinti szokásos eljárás fehérjék előállítására (általában normalizált) génkönyvtárakkal történő expresszió, ami szignifikáns
·..*· J.
N- vagy C-terminális módosítások nélküli fehérjéket eredményez, és - ahol normalizált - specifikus fehérjék dominanciája nélküli fehérjekeveréket eredményez. Génkönyvtárakkal alkalmazott tipikus expressziós rendszer az in vitro transzkripció és transzláció eukarióta riboszóma-preparátum alkalmazásával; ez biztosítja annak lehetőségét is, hogy módosított aminosavakat építsünk be az expresszált fehérjékbe. Az expresszált fehérjekeveréket azután közvetlenül alkalmazhatjuk N- vagy C-terminális jelölésre. Más expreszsziós rendszereket is alkalmazhatunk, ahol az N-terminális amino-csoportok vagy C-terminális karboxil-csoportok nem módosítottak, vagy nincs megakadályozva a későbbi kémiai címkézésük. Ahol módosítás fordul elő, bizonyos esetekben az N-terminális módosítást eltávolíthatjuk akár enzimek alkalmazásával, mint például hiszton-deacetilázzal, akár kémiai eljárásokkal, mint például limitált brómciános hasítással az N-terminális metioninok eltávolítására. Az N/Cterminális módosításoktól mentes fehérjék keverékének előállítása után a kémiai címkéket hozzáadhatjuk az N/Cterminális amino-csoport(ok)hoz. Az N-terminális esetén a lizinek ε-amino-csoportjalt kezdetben blokkolhatjuk olyan reagensek alkalmazásával, mint például citrakonit-anhidrid vagy metil-acetimidát, annak érdekében, hogy azután csak az N-terminális amino-csoportok reagáljanak. Más megoldásként a lizinek ε-amino-csoportjait blokkolhatjuk módosított lizinek beépítésével az expressziós rendszerben, mint például in vitro transzkripció és transzláció esetén, ahol például közvetlenül biotinnal módosított lizineket építhe42
4.
tünk be a lizinek helyett. Azután kémiai címkéket adhatunk szelektíven a fehérjék N-terminálisához, például specifikus molekulák izotiocianát származékainak alkalmazásával, amelyekre affinitási reagens rendelkezésre áll. Egy ilyen példa a fluoreszcein, amelyet a fehérjék fluoreszcein-izotiocianáttal történő reakciójával építünk be, lehetővé téve a későbbi tisztítást anti-fluoreszcein ellenanyagokkal. Más megoldásként polikarboxil kelátor reagenseket is beépíthetünk izocianát származékokként, lehetővé téve a későbbi tisztítást specifikus fémekkel. Ha egyszer a fehérjék Nés/vagy C-terminálisa meg van címkézve a keverékben, a fehérjéket átfogóan és specifikusan hasíthatjuk akár kémiailag, akár enzimatikusan, proteázok, mint például tripszin, vagy más hasítási reagensek alkalmazásával. Az ilyen hasítás tehát egy egyedi címkézett terminális pepiidet szabadít fel minden egyes fehérjéről, és a fragmensek ilyen gyűjteményét azután tisztíthatjuk a címkézetlen peptidek keverékéből egy megfelelő affinitási reagens, mint például a kémiai címkére specifikus ellenanyag alkalmazásával. Adott esetben a kémiai címke méretét növelhetjük annak érdekében, hogy nagyobb tömeget állítsunk elő az elemzéshez; ez hasznos lehet olyan peptidfragmensek esetében, amelyek a kémiai címkéhez nagyon közeli hasítás eredményei, minélfogva a keletkezett fragmens olyan kicsi lehet, hogy az alacsonyabb molekulatömegű „zajba esik a tömeg szerinti elemzésnél. A kémiai címke tartalmazhat például a pepiidhez kapcsolódó nukleinsav-darabot, a nukleinsav szintézise során beépített reaktív csoporton keresztül. Az ilyen nukleinsav-molekula a ·ί·· *·* ·/* ««* címkézett peptid izolálására is alkalmas lehet, a nukleinsavnak egy komplementer szekvenciához történő anneálása révén .
A kémiai címkézést és izolálást követően a visszanyert N/C-terminális peptidek keverékét azután „csaliként alkalmazzuk olyan fehérje-affinitási reagensek izolálásra, amelyek ugyanezen, közvetlenül emlős sejtekből vagy szövetekből, vagy más élő szervezetekből származó peptidekhez kötődnek. Az ilyen affinitási reagensek tipikusan rekombináns Fv-domének könyvtárából származhatnak, az ellenanyagot kódoló megfelelő gént tartalmazó részecske részeként. Ilyen részecskék példái riboszóma prezentálás! részecskék vagy fág-prezentálási részecskék, ahol minden esetben a szelektált ellenanyagok génjei kimenthetők annak érdekében, hogy szaporítsuk a specifikus ellenanyagokat. Más megoldásként ellenanyagok (mint például rekombináns egyedi láncok vagy Fab-domének vagy Fv-domének) nagy rendezett csoportjait szkrínelhetjük az N/C-terminális peptidkeverék alkalmazásával, és azokat az ellenanyagokat, amelyek a peptidekhez kötődnek, visszanyerhetjük a megfelelő gének révén. Egy további alternatív megoldásként N- és/vagy C-terminális peptideket alkalmazhatunk poliklonális vagy monoklonális ellenanyagok közvetlen előállítására egy állat megfelelő immunizálásával. Ezen eszközökkel a fehérje-affinitási reagensek könyvtárát szelektáljuk ki, amit azután fehérjék keverékeinek elemzésére alkalmazhatunk, mint például amelyek emlős sejtekből vagy szövetekből, vagy más élő szervezetekből származnak. Az ilyen elemzéshez tartozik akár az affi
J. l’: nitási reagensek könyvtárának az alkalmazása emlős sejtekből vagy szövetekből, vagy más élő szervezetekből származó fehérjék N/C-terminális peptidjeinek kiszelektálására, akár egyedi affinitási reagensek alkalmazása egyedi peptidek kiszelektálására. A kiszelektált peptideket azután tömeg szerint elemzhetjük tipikusan MALDI-ToF („matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight) alkalmazásával, ahol az egyedi peptidek egyedi töltés:tömeg arányt adnak, amelyet a peptidek aminosav összetevőinek azonosítására alkalmazhatunk. MS-MS (kettős tömegspektrometria) peptid-szekvenálást alkalmazhatunk azt követően a peptid azonosítására, ha az izolálható. Más megoldásként a „Quadrupole-ToF LC-MS-MS („Q-ToF) készülékek új generációja biztosíthatja az egymást követő MALDI-ToF és MS-MS meghatározásokat ugyanazon készüléken belül, valóban, fehérjeaffinitási reagenseket - akár egyedileg, akár keverékekben immobilizálhatunk akár közvetve, akár közvetlenül a
MALDI-ToF készülékbe helyezhető deszorpciós chip-re, és a peptideket azt követően köthetjük a chip-re affinitási reagenseken keresztül. Ily módon különböző helyeken lévő több affinitási reagens által abszorbeált több peptid-frakciót elemezhetünk egyetlen chip-en. A rekombináns fehérjék fehér je-affinitási reagensek izolálására szolgáló „csaliként történő alkalmazása biztosítja annak lehetőséget, hogy más címkéket is kapcsoljunk a fehérjékhez, ahol a címkéket a gén szekvenciája kódolja; például C-terminális polihisztidin címkét építhetünk be (lehetővé téve a címkézett freagmentumok későbbi nikkel-kelátokkal történő tisztítását),
J. :·:
például a génekbe történő PCR-rel közvetített beépítés révén.
A rekombináns fehérjék fehérje-affinitási reagensek izolálására szolgáló „csaliként történő alkalmazása biztosít egy másik általános eljárást is a találmány szerinti ötödik megvalósítási módra, peptidek specifikus izolálására a rekombináns fehérjék által kódolt címkék alkalmazásával. Az ilyen címkéket kényelmesen beépíthetjük a génkönyvtár (általában cDNS-könyvtár) tagjaiba annak konstrukciója során, vagy annak egyedi kiónjaiba vagy kiónok csoportjaiba specifikus PCR-láncindítók alkalmazásával, amelyek ilyen címkéket kódolnak, és úgy vannak tervezve, hogy ilyen címkéket építsenek be a kapott expresszált fehérjékbe. Előnyösen az ilyen címkéket az expresszált fehérjékben az összes leolvasási fázisba beépíthetünk annak érdekében, hogy produktíven címkézett fehérjét állítsunk elő. Az ilyen címkéket előnyösen a PCR-reakció leolvasással megegyező irányban lévő láncindítójába építjük be, azzal az általános eredménnyel, hogy a címke az expresszált fehérje C-terminális vége irányában keletkezik (habár az leolvasással ellentétes irányban lévő terminációs kodonok megakadályozhatják ezt néhány kiónban). Azonban a címkéket az N-terminálisra is beépíthetjük, vagy mind az N-, mind a C-terminálisra.
Specifikus peptidek peptidkeverékből történő izolálása esetén a peptidszekvenciákat szintetikusan (vagy rekombináns DNS útján) is előállíthatjuk, és azután - mint fent „csaliként alkalmazhatjuk specifikus fehérje-affinitási reagensek befogására. Ezen affinitási reagenseket azután alkalmazhatjuk ugyanezen peptidek izolálására, amelyek például emlős sejtekből vagy szövetekből, vagy más élő szervezetekből származó hasított fehérjekeverékből származnak.
N- vagy C-terminális peptidek vagy specifikus belső peptidek szelektív frakcionálásának alternatívájaként módosított peptideket, mint például foszforilált aminosavakat tartalmazó peptideket izolálhatunk, amelyek a foszforilált aminosavakhoz (tirozin, treonin vagy szerin, vagy ezek kombinációja) szelektíven kötődő ellenanyagok vagy a negatívan töltött peptideket megfogó immobilizált Fe3+ alkalmazásával. Hasonlóképpen glikolizálással vagy más módosítással módosított peptideket izolálhatunk bizonyos esetekben, ahol a peptid módosítása tovább van származtatva annak érdekében, hogy megkönnyítse az izolálást. Például szénhidrátokat könnyen módosíthatunk perjodát reakciókkal közbenső lépésként kémiai címkék, mint például fluoreszcein hozzáadására. A találmány egy különösen fontos megvalósítási módja a szelektíven módosított peptidek frakcionálása, ahol az ilyen peptideket szelektíven címkézzük azok differenciális címkézhetősége alapján az eredeti fehérjekörnyezetükben a hasítást megelőzően. Például az élő sejteken lévő felszíni kitettségű fehérjéket szelektíven címkézhetjük, például biotinnal, a sejtek címkéző reagensekkel történő kezelésével, amely elsősorban specifikus aminosav-csoportokkal reagál. Ilyen címkézés elérésére szolgáló közvetett eljárás a sejtekben más stimulusok hatására természetesen is címkézett fehérjékben az ilyen stimulusok alkalmazása annak érdekében, hogy a fehérje címkézését kiváltsuk. Például a sejtkben lévő receptorhoz kapcsolódó tirozin-kináz molekulák potenciálisan címkézhetek (például foszforilálhatók) a receptor ligandumának hozzáadásával a sejtekhez. A módosítást követően a peptideket hasítással felszabadítjuk a fehérjékről, és azután közvetlenül tömeg szerint elemzzük, vagy fehérje-affinitási reagensekkel történő frakcionálásnak vetjük alá a tömeg szerinti elemzést megelőzően.
A fehérjék és peptidek találmány szerinti tömeg szerinti elemzését előnyösen tömegspektrometriával végezzük. Közelebbről, a MALDI-ToF elemzés képes nagyon pontosan mérni a specifikus tömeg:töltés arányt egyedi peptidekre. Ezen eljárás képes egyidejű elemzésre peptidek ezreivel. 4 kDa molekulatömeg felett az egyedi peptidek (és fehérjék) felbontása gyengébbé válik, ily módon a fehérjék peptidfragmensekké történő hasítása szükséges annak érdekében, hogy finom felbontást biztosítsunk. A folyadékkromatográfiás elválasztási eljárások (mint például HPLC) jelenlegi összekapcsolása tandem tömegspektrometriával már lehetővé tette akár 200 fehérjét tartalmazó fehérjekeverékek tömegspektrumának az elemzését. Ily módon a fehérjéket proteázos emésztést követően elemzzük, és ha átlagosan tíz pepiidet tételezünk fel fehérjénként, akkor az eljárás akár 2000 pepiidet is képes elemezni. A találmány szerinti eljárások alkalmazása, ahol például csak címkézett N-terminális peptideket elemzünk, akár 2000 fehérjéből származó 2000 Nterminális pepiidet lehet elemezni egyszerre. Mivel ez nem elég érzékeny emlős sejtekből származó fehérjék tömeges elemzésére (tipikusan 50000 sejtenként), a peptideket lega48 lább 25 frakcióba kell szétválasztani annak érdekében, hogy ezen frakciók mindegyikét elemezzük. Az ilyen további frakcionálási akár előzetesen szelektált fehérje-affinitási reagensek könyvtárának alkalmazásával érhetjük el, akár a belső végeket jelölő reagensek alkalmazásával, az egymást követő fehérje emésztési/hasitási lépések után, amit specifikus fehérje-affinitási reagensek alkalmazása követ a peptidek címkék szerinti szétválasztására. A szokásos tömegspektrometria alternatívájaként MALDI-ToF-ot alkalmazhatunk fehérje-tömegprofilok előállítására, amelyeket összehasonlíthatunk különböző sejtekből származó fehérjekeverékekre.
A kémiai címkék tipikusan olyan molekularészek, amplyeket kovalensen kapcsolhatunk fehérjékhez, általában az N- vagy C-terminálison. Az N-terminális kémiai címkézését általánosan a terminális amino-csoporton végezzük. Ha szükséges a elkerülni lizinek ε-amino-csoportjainak címkézését, akkor azokat kezdetben blokkolhatjuk olyan reagensek alkalmazásával, mint például citrakonit-anhidrid vagy metilacetimidát. Azután a terminális amino-csoportok reaktívak kémiai reagensek széles körével, különösen izotiocianátokkal. Ezáltal közönséges, ellenanyagok által felismert ligandumok, mint például dinitrofenol vagy fluoreszcein kapcsolható az N-terminálishoz a későbbi, fehérje-affinitási reagens alkalmazásával történő frakcionálás céljára. Például az általánosan alkalmazott Edman-reagens fenilizotiocianátot alkalmazhatjuk fehérjék N-terminálisához történő specifikus kapcsolásra, és azt származtathatjuk adott esetben olyan molekularésszel, amely a affinitási re ágens későbbi kötésére szolgál. A C-terminális kémiai címkézésére a karbodiimid aktiváláson alapuló eljárásokat alkalmazzuk általában olyan ligandumok beépítésére, amelyek affinitási reagensekhez kötődnek. Más megoldásként leírták molekularészek hozzáadását fehérjék C-terminálisához reverz proteolízis alkalmazásával, ahol bizonyos proteázok, mint például karbozipeptidáz-Y és lizil-endopeptidáz fordítva működhet kémiai címke hozzáadására, általánosan aminosavakon keresztül, akár affinitási reagens kötését szolgáló címkével származtatott aminosavakkal, akár aminosavak természetes szekvenciáival, amelyek azután specifikusan kötődnek affinitási reagenshez. Nyilvánvaló, hogy belső aminosavak széles köre is címkézhető, például Lys az s-aminocsoporton keresztül, Glu/Asp a karboxil-csoporton keresztül, Cys a tiol-csoporton keresztül, Ser/Thr a hidroxilcsoporton keresztül és Tyr a hidroxifenil-csoporton keresztül. A többi aminosav legtöbbjének is leírták specifikus módosításait. Az is nyilvánvaló, hogy poszttranszlációs fehér j emódosítások szintén alkalmazhatók kémiai címkék hozzáadására, különösen a glikozilálás, ahol a cukor-oldalláncokat általánosan oxidálhatjuk perjodáttal formaldehid-csoportokká, amely azután amin-tartalmú molekulákkal reagálhat. Egyéb, kémiai címkék hozzáadására alkalmazható módosítások közé tartozik a lipidáció, foszforiláció és fémionaddíció. Nyilvánvaló, hogy nagyszámú eljárás létezik a szakirodalomban egy vagy több kémiai címke beépítésére specifikus helyeken fehérjemolekulákba vagy peptidekbe.
Az ötödik megvalósítási mód szerint alkalmazott fehérje-affinitás! reagensek általánosan monoklonális ellenanyagok. A fehérjék vagy peptidek specifikus szekvenciái vagy szerkezeteire rekombináns ellenanyag-kötő helyeket általában Fab-domének, Fv-domének vagy egyedi láncok formájában - alkalmazunk, ahol általánosan „prezentáljuk az ellenanyag-kötő helyeket, például bakteriofág- vagy riboszóma-komplexek alkalmazásával oly módon, hogy az egyedi ellenanyag-kötőhelyeket kódoló gén visszanyerhető. A találmány szerinti alkalmazásra az ellenanyag-kötőhelyek könyvtárait csoportokra bonthatjuk, például fág-tarfoltok kiszedésével és elrendezésével, vagy riboszóma prezentálás céljára gének kiszedésével és elrendezésével. Az ilyen készletek általában számos fehérje vagy peptid ellenanyagkötőhelyét tartalmazhatják, oly módon, hogy a készleteket alkalmazhatjuk frakcionálásra. Más megoldásként a fehérjevagy peptidkeveréket - amelyhez az ellenanyag affinitási reagensek könyvtárai szükségesek - immobilizálhatjuk, és célanyagként alkalmazhatjuk megfelelő affinitási reagens előzetes szelekciójára, amelyeket azután készletekbe osztunk szét vagy egyedi reagensekként alkalmazunk. Kémiai címkék esetén egyedi monoklonális ellenanyagokat alkalmazunk az egyedi címkék kötésére annak érdekében, hogy az azt követő frakcionálást elérjük.
A találmány ötödik megvalósítási módjához tartozik monoklonális ellenanyagoktól eltérő fehérje-affinitási reagensek alkalmazása, ahol az ilyen reagensek megkönnyíthetik a peptidek vagy fehérjék frakcionálását a tömeg szerinti elemzést megelőzően. Az ilyen affinitási reagensek közé tartoznak az immunrendszer molekulái, amelyek szelektíven kötnek bizonyos peptideket, mint például fő hisztokompatibilitási fehérjék vagy T-sejt-receptorok. Egyéb fehérjeaffinitási reagensek közé tartoznak a fehérje-fehérje kölcsönhatásban általánosan részt vevő fehérjedomének, mint például SHl-domének. A találmány tárgya a keverékekben lévő, és különösen a szilárd fázishoz kötött peptidek ciklizálásának az elve, például cisztein-oldalláncok kapcsolása redukáló körülmények között. Ennek egy eljárása lehet cisztein-oldallánc hozzáadása immobilizált peptid felfedett Nvagy C-terminálisához, például C-terminálisukon immobilizált peptidek esetén peptidszintézis szokásos körülményei között, vagy reverz proteolizis alkalmazásával, bizonyos proteázokkal, mint például karboxipeptidáz-Y vagy lizilendopeptidáz. Az ötödik megvalósítási mód tárgya továbbá eljárás fehérjék vagy peptidek további frakcionálására, olyan aminosavak hozzáadásával - általában az N-terminálishoz -, amelyek egy proteáz felismerési szekvenciájának részét képezik, amely specifikusan hasít egy, két vagy több aminosavból álló felismerési szekvenciát, ahol a proteáz felismerési szekvenciájának egy vagy több terminális aminosavát a kiindulási fehérje vagy peptid biztosítja. Ily módon a fehérjék vagy peptidek azon része hasítódik azután a terminális proteázzal az újonnan keletkezett szekvencia következtében, amelyhez új aminosavak lettek hozzáadva. Ily módon fehérjék vagy peptidek címkézhetők további aminosavakkal, általában az N-terminálison, az így címkézett keve52 rék egy részében specifikus proteáz hasítási helyet létrehozva. Azután a fehérjéket vagy peptideket például immobilizálhatjuk az új terminálison keresztül, például a címkézett terminális aminosav alkalmazásával vagy kémiai címkének a terminálishoz történő hozzáadásával, ahol azután affinitási reagenst alkalmazunk a címkézett molekularészek immobilizálására. A nem immobilizált címkézetlen molekulák eltávolítása után a fehérjéket vagy peptideket azután hasíthatjuk a specifikus proteázzal, amely csak ott hasít, ahol létrejött a hasítási hely a szintézisből származó és az eredeti fehérjéből vagy peptidből származó kombinációjával. A lehasított peptideket azután frakcionálhatjuk fehérje-affinitási reagensek alkalmazásával, és tömeg szerint elemezhetjük (vagy tovább feldolgozhatok a tömeg szerinti elemzést megelőzően), a peptidkeverék egy részhalmazát reprezentálva. Specifikus aminosavak kitett terminálisokra történő paralel szintézisét követő immobilizálást és hasítást alkalmazva fehérjék vagy peptidek nagy keverékeit frakcionálhatjuk a terminális aminosav(ak) alapján. Proteáz felismerési hely egy példája Ile-Glu-Gly-Arg, amit a Faktor-Xa hasít az Gly és Arg között. Proteáz hasítási helyek egyéb példái Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, amit az enterokináz hasít az Asp és Lys között; Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr, amit a geneáz-I hasít a His és Tyr között; Leu-Val-Pro-Arg-GlySer, amit a trombin hasít az Arg és Gly között. Az Asp-AspAsp-Asp részleges szekvencia N-terminálishoz történő hozzáadását N-terminális Lys-t tartalmazó fehérjék vagy peptidek azonosítására alkalmazhatjuk (enterokinázzal hasítva), Pro
- 53 - .-.···: .t .··.
• · « · · · ···· ·· ··· ··
Gly-Ala-Ala-His-t N-terminális Tyr-t tartalmazó fehérjék/peptidek azonosítására (geneázzal hasítva), Leu-ValPro-Arg-t N-terminális Gly-Ser-t; vagy Leu-Val-Pro-Arg-Glyt N-terminális Ser-t tartalmazó fehérjék/peptidek azonosítására (trombinnal hasítva). Más proteázok, mint például a specifikus felismerési helyű MMP-k (mátrix metalloproteinázok) is alkalmazhatók más N-terminális aminosavval rendelkező fehérjék frakcionálására. Különböző proteáz-felismerési helyek alkalmazhatók tehát a proteázokkal együtt fehérjék vagy peptidek frakcionálására az N-terminális függvényében. Más megoldásként peptid szabad N-terminálisához egy vagy több aminosav hozzáadását affinitási reagens kötődésére szolgáló hely kialakítására alkalmazhatjuk, beleértve azt is, ahol az ilyen hely függ a peptid egy vagy több Nterminális aminosavától. Ily módon különböző peptidek vagy csoportok különböztethetők meg az aminosavak N-terminálishoz történő hozzáadásával, ami az N-terminális aminosavaitól függő módon proteázos emésztésre vagy affinitási reagens kötésére szolgáló helyet hoz létre. Ahol - különösen emlős sejtekből származó - fehérjéket alkalmazunk kiindulási anyagként, ahol az N-terminális aminosav metionin, azt adott esetben eltávolíthatjuk például formilálással és terminális formilmetionin eltávolítására specifikus bakteriális proteázzal történő hasítással.
A fehérje-affinitási reagensek a találmány ötödik megvalósítási módjának fontos megvalósítási módjai, és mind fehérjék/peptidek csoportjainak széles frakcionálására, mind egyedi fehérjék/peptidek specifikus frakcionálására
- 54 - -J ··.·„· • · · φ · ···· · · ··· »· alkalmazhatók. Frakcionálás esetén először elő kell állítani az egyedi fehérje-affinitási reagensek frakcióit, amelyek kötődnek a specifikus frakcióhoz vagy specifikus pepiidhez, és nem kötődnek a többi frakcióhoz/peptidhez. Kényelmes eljárás a fehérjék vagy peptidek frakcionálása a fehérje-affinitási reagensek izolálása előtt. Ellenanyagok, mint fehérje-affinitási reagensek esetében az ilyen fehérjéket/peptideket azután akár könyvtárból prezentált ellenanyagok kötésére alkalmazhatjuk, akár állatok immunizálására alkalmazhatjuk antiszérum előállítása céljából. Ahol rekombináns ellenanyag-kötőhelyek, mint például egyláncú Fv-doméneket könyvtárát alkalmazzuk, az ezeket kódoló génklónokat visszanyerhetjük a fehérje/peptid kötődését követően, az affinitás! reagens replikálható forrását biztosítva, a specifikus fehérje/peptid frakció későbbi izolálásának céljára. Az egyedi egyláncú Fv-doméneket párhuzamosan szkrínelhetjük kötőspecifitásra, például a peptidkötődés MALDI-ToF-fal történő elemzésével. Ebben az esetben az olyan egyláncú Fv-doméneket, amelyek egy nagy fehérjekeverék egyetlen peptidjéhez kötődnek, génklónokként megőrizzük a későbbi egyedi alkalmazásra (a gyakorlatban azokat is megőrizzük, amelyek akár három pepiidhez is kötődnek), vagy az Fv-domének keverékében történő alkalmazásra, a fehérje/peptid frakció keverékből történő izolálás céljára. Nyilvánvaló, hogy a fehérjék szabad N-terminálisai gyakran jó célpontok nagyon specifikus ellenanyagok izolálására, és ezáltal egy fehérje N-terminális peptidjeinek befogása és felszabadítása különösen előnyös a későbbi ellenanyag izo
- 55 - .*·.···: .t .··.
• · · · · · • · · f · • · · · ·· ·· · ♦· lálásra. Bizonyos Fv-domének alkalmasak lehetnek nagyon nagy mennyiségben előforduló fehérjék vagy peptidek eliminálására a keverékből. Nyilvánvaló, hogy az egyláncú Fvdomének kötődésének megőrzése és jellemzése biztosíthatja a redundancia csökkentését az olyan Fv-domének eliminálásával, amelyek specifitása megegyezik más Fv-doménekével.
Az találmány szerinti ötödik megvalósítási mód különféle formái fehérje emésztés/hasítás, fehérje-affinitási reagensekkel történő frakcionálás és tömeg szerinti elemzés kombinációit tartalmazzák, fehérjék vagy peptidek szekvenciáira vagy szerkezeteire specifikus affinitási címkékkel történő opcionális frakcionálási lépéssel, és opcionális kémiai címkézéssel és frakcionálással ezen címkék révén. A különböző megvalósítási módok ezen lépések különböző sorozatait tartalmazzák az alábbiak szerint;
- ismételt emésztési/hasítási ciklusok és tömeg szerinti elemzés
- emésztés/hasítás, frakcionálás fehérje-affinitási reagensekkel, tömeg szerinti elemzés
- frakcionálás fehérje-affinitási reagensekkel, emésztés/hasítás, tömeg szerinti elemzés
- terminális kémiai címkézés, emésztés/hasítás, frakcionálás affinitási reagensekkel, tömeg szerinti elemzés
- mint 3, de további címkézési, emésztési/hasítási, frakcionálási ciklusokkal
- mint 4, de ismételt címkézési, emésztési/hasítási ciklusokkal, és tömeg szerinti elemzés.
- 56 - .·*. ···: .! .··.
• · · · · · • · · · J ···· · · ·· · »4
A találmány ötödik megvalósítási módjának tárgyát képezik ezen és rokon fehérje/peptidfeldolgozási lépések, azzal a lényegi céllal, hogy csökkentsük a fehérjekeverék komplexitását annak érdekében, hogy a kapott fehérje/peptid frakciók tömeg szerinti elemzését elérjük.
A találmány jelenlegi általános működési eljárásának része (akár természetes, akár cDNS-könyvtárak által kódolt) fehérjekeverék N- és/vagy C-terminálisainak címkézése, hasítás proteázzal, az N- és/vagy C-terminális peptidfragmensek immobilizálása, és a peptidek felszabadítása és tömeg szerinti elemzése. Más megoldásként az N- vagy C-terminálisokat módosíthatjuk aminosavak hozzáadásával szekvenciaspecifikus proteázzal történő hasítást megelőzően. A tömeg szerinti elemzést megelőzően a peptideket fehérje-affinitási reagensek, mint például ellenanyagok kötésére alkalmazzuk, ahol ezen ellenanyagokat előzetesen szelektáltuk peptidek frakcionálása céljából, vagy affinitási reagensnek megőriztük azokat. A fehérjék keverékét előzetesen frakcionálhatjuk, például méret szerint, vagy cDNS-könyvtárakból állíthatjuk elő azokat, amelyeket kiónok szétválasztásával előzetesen frakcionáltunk. A megtartott fehérje-affinitási reagenseket azután fehérjék komplex mintáinak elemzésére alkalmazzuk, ahol az ellenanyagokat alkalmazzuk peptidek kötésére, amelyeket azután tömeg szerint elemzünk.
Nyilvánvaló, hogy a fehérjék emésztésére/hasítására, frakcionálására és tömeg szerinti elemzésére feltárt elvek közül sok alkalmazható más polimer molekulák, mint például DNS és RNS esetében is. A DNS vagy RNS esetében az 5' és 3' • · · · · ···· ·· ··· *6 végeken lévő szabad foszfát- és hidroxil-csoportok biztosítanak lehetőséget kémiai címkék nagyon specifikus hozzáadására vagy szilárd fázishoz történő kötésre. A szekvenciaspecifikus restrikciós vagy módosító enzimek biztosítják a DNS-molekulák hasítását vagy módosítását. DNS vagy RNS molekulák esetén hasznos affinitási reagensek nukleinsavmolekulák, amelyeket specifikusan hibridizálhatunk egy szilárd fázishoz kapcsolt komplementer DNS- vagy RNS-szekvenciához, akár a hibridizálás előtt vagy utána. Ilyen eljárások alkalmazásával nukleinsavak komplex keverékeit frakcionálhatjuk, és azután tömeg szerinti elemzésnek, előnyösen tömegspektrometriának vethetjük alá.
Az alábbiakban példákkal a találmányt részletesebben is bemutatjuk, azonban az oltalmi kört nem kívánjuk a bemutatott megvalósítási módokra korlátozni.
1. példa
A példában leírt kísérletet egy pár módosított egyláncú ellenanyag-génnel („single-chain antibody, scAb) végeztük. Két módosított, N-terminális epitópcímkét tartalmazó scAb-t állítottunk elő, amely a nehéz lánc variábilis régiójából (VH), egy 14 aminosav hosszúságú kapcsolómolekulából (EGKSSGSGSESKVD), a könnyű lánc variábilis régiójából (VL) állt, mindegyik a c-jun vagy c-fos gének b-zip doménjéhez fuzionálva.
Ezen konstrukciókat a pET 5c vektorba klónoztuk [Rosenberg AH, és mtsai., Gene 56, 125-135. old. (1987)], ami a T7-promótert és az azt követő T7-eredetű 10-es gén riboszóma-kötőhelyét biztosítja. Az scAb-konstrukciókat
Ndel restrikciós helyeken illesztettük a vektorba, oly módon, hogy az epitópcímkét kódoló szekvencia a T7 10-es génjének első ATG-jét követte. Az első konstrukció Pseudomonas aeruginosa elleni scAb-t tartalmazott [Molloy P. és mtsai., Journal of Applied Bacteriology 78, 359-365. old. (1995)] a FLAG-epitópot (MDYKDDDK) [Knappik A és Pluckthun A, BioTechniques 17, 754-761. old. (1994)] az N-terminálishoz adva, és c-fos a b-zip doménjével [Abate C, és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1032-1036. old. (1990)] a fehérje C-terminális régiójában. A másik az anti-fötálisantigén 340-es ellenanyagából konstruált scAb-t [Durrant LG és mtsai., Prenatal Diagnosis 14, 131-140. old. (1994)] tartalmazott polihisztidin címkével az N-terminálison, és a c-jun b-zip doménjével (Abate C, és mtsai, ugyanott) a fehérje C-terminális régiójában.
Az anti-Pseudomonas aeruginosa scAb-t (α-Ps-fos) és a 340-jun scAb-t az alábbiak szerint konstruáltuk:
Az oí-Ps scAb DNS-ét a pPMIHis-vektorban (Molloy P és mtsai., ugyanott) amplifikáltuk az RD 5' FLAG:
5'gcggatcccatatggactacaaagacgatgacgacaaacaggtgcagctgcag3' (Genosys Biotechnologies Europe Ltd., Cambridge, UK) és az RD 3: 5'gcgaattcgtggtggtggtggtggtgtgactctcc3' (Genosys) láncindítókkal, amelyek beépítették az 5' FLAG-epitópcímke szekvenciáját, és eltávolították a 3' stop-kodont. A reakcióelegy tartalmazott 0,1 pg templát-DNS-t, 2,6 egység
Expand™ High Fidelity PCR Enzyme Mix-et (Boehringer Mannheim, Lewes, UK), Expand HF puffért (Boehringer
Mannheim), 1,5 mM MgCl2-t, 200 μΜ deoxinukleotid * · · ··· trifoszfátokat (dNTP-k)(Life Technologies, Paisley, UK) és 25 pmol-t a láncindítók mindegyikéből. A ciklusok az alábbiak voltak: 5 perc 96°C-on, azután [1 perc 95°C-on, 1 perc 50°C-on, 1 perc 72°C-on] ötször, [45 másodperc 95°C-on, 1 perc 50C-on, 1 perc 30 másodperc 72°C-on] nyolcszor, [45 másodperc 95°C-on, 1 perc 50°C-on, 2 perc 72°C-on] ötször, végül 5 perc 72°C-on. A kapott 1123 bázispár hosszúságú terméket BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük, és a pUC19-vektorba (Boehringer mannheim) klónoztuk. A DNSszekvenciát a Thermo Sequenase radiolabeled terminator cycle sequencing kit alkalmazásával igazoltuk [33P]dideoxi-nukleotidokkal (Amersham Life Science, Amersham, UK). A konstrukciót pET5c-vektorba (Promega UK, Ltd., Southampton, UK) klónoztuk Ndel-EcoRI fragmensként [lásd „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, szerk.: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, (1989)]. A plazmid-DNS-t Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega UK Ltd.) alkalmazásával állítottuk elő, vagy nagy léptékben Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen Ltd., Crawley, UK) alkalmazásával. A keletkezett új plazmidot pET5c FLAG-aPs scAb-nak neveztük el.
A .fos-kazettát átfedő oligonukleotidok PCR-jével szereltük össze:
Fos Ifor 5'-atggaattcctcgagaccgacaccctacaggcggaaaccgac cagctgga
Fos 80rev 5'-tcgcgatttcggtttgcagcgcggatttttcgtcttccagc tggtcggtt
·.*·
Fos 71for 5'-aaaccgaaatcgcgaacctgctgaaagaaaaagaaaagctg gagttcatc
Fos 155rev 5'-ggaagcttgaattccgccggacggtgtgccgccaggatga actccagctt.
A fenti oligonukleotidokat 1 pmol mennyiségben alkalmaztuk a reakcióelegyben, és a reakciót 10 pmol láncindító (FoslfS:5'-atggaattcctcgagacc, Fosl55rS 5'-ggaagcttgaattccgcc) alkalmazásával irányítottuk, nagy pontosságú polimerázt és korábbiak szerinti reakciókomponenseket alkalmazva. A kapott 155 bázispár hosszúságú terméket EcoRI restrikciós enzimmel emésztettük, tisztítottuk, és EcoRI enzimmel emésztett pUC19-vektorba klónoztuk, szokásos eljárásokkal történő szekvencia-elemzéshez (lásd „Molecular Cloning, a Laboratory Manual, ugyanott).
A .fos-kazettát a pET5c FLAG-oíPs scAb plazmidba szubklónoztuk XhoI-EcoRI fragmensként, az ott lévő, emberi állandó domént kódoló, 320 bázispár hosszúságú XhoI-EcoRI fragmenst helyettesítve.
A 340 scAb-t a 340-es ellenanyag VH- és VK-doménjének az α-Ps helyére történő behelyettesítésével állítottuk elő a pPMIHis-vektorban. A 340-VH-domént az 5'cagctgcaggagtctgggggaggcttag3' (Genosys) és az 5'tcagtagacggtgaccgaggttccttgaccccgta3' (Genosys) láncindítókkal amplifikáltuk. A reakcióelegy tartalmazott 0,1 pg templát-DNS-t, 2,6 egység Expand™ High Fidelity PCR Enzyme Mix-et, Expand HF puffért, 1,5 mM MgCl2-t, 200 pM dNTP-ket és 25 pmol-t a láncindítók mindegyikéből. A ciklusok az alábbiak voltak: 5 perc 96°C-on, azután [1 perc 95°C-on, 1
·..*· J. y perc 50°C-on, 1 perc 72°C-on] ötször, [45 másodperc 95°Con, 1 perc 50°C-on, 1 perc 30 másodperc 72’C-on] nyolcszor, [45 másodperc 95°C-on, 1 perc 50°C-on, 2 perc 72°C-on] ötször, végül 5 perc 72°C-on. A kapott 357 bázispár hosszúságú terméket PstI és BstEII restrikciós enzimekkel emésztettük, és PstI és BstEII enzimekkel emésztett pPMlHis-vektorba klónoztuk (lásd „Molecular Cloning, a Laboratory Manual, ugyanott). Hasonlóképpen a 340-VK-domént az 5'gtgacattgagctcacacagtctcct3' (Genosys) és az 5'cagcccgttttatctcgagcttggtccg3' (Genosys) láncindítókkal amplifikáltuk. A kapott 339 bázispár hosszúságú terméket SstI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük, és SstI és Xhol enzimekkel emésztett módosított pPMIHis-vektorba klónoztuk (amit fent előállítottunk). A DNS-szekvenciát a Thermo Sequenase radiolabeled terminator cycle sequencing kit alkalmazásával igazoltuk [33P]-dideoxi-nukleotidokkal, mint korábban. Az 340 scAb DNS-ét a pPMIHís-vektorban amplifikáltuk az
RD 5' HIS: 5'gcggatcccatatgcaccatcatcaccatcaccaggtgcagctgca g3' (Genosys) és az RD 3 (mint fent) láncindítókkal, amelyek beépítették az 5' végre a 6 hisztidin-oldalláncot, és eltávolították a 3' stop-kodont. Az amplifikáció reagensei és körülményei pontosan megegyeztek az α-Ps konstrukciónál megadottakkal. A kapott 1114 bázispár hosszúságú terméket BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük, és a pUC19-vektorba klónoztuk (lásd „Molecular Cloning, a Laboratory Manual, ugyanott). A DNS-szekvenciát igazoltuk mint korábban, és a konstrukciót pET5c-vektorba klónoztuk • · · ··· • · · · « ·· · · ·« ·< · «·
Ndel-EcoRI fragmensként, előállítva a pET5c HIS 340 scAb plazmidot.
A jun-kazettát átfedő oligonukleotidok PCR-jével szereltük össze:
Jun lfor 5'-atgagaattctcgagcgtatcgctcgtctggaagaaaaagtt aaaaccct
Jun 85rev 5'-tagcggtggaagccagttcggagttctgagctttcagggtt ttaactttt
Jun 71for 5'-tggcttccaccgctaacatgctgcgtgaacaggttgctcag ctgaaacag
Jun 146rev 5'-catgcgaattcgtggttcataactttcatgtttcagctga gcaacc.
A fenti oligonukleotidokat 1 pmol mennyiségben alkalmaztuk a reakcióelegyben, és a reakciót 10 pmol láncindító (Junlfor-S:5'-atgagaattctcgagcg és
Junl46rev-S 5'-catgcgaattcgtggttc) alkalmazásával irányítottuk, nagy pontosságú polimerázt és korábbiak szerinti reakciókomponenseket alkalmazva. A kapott 146 bázispár hosszúságú terméket EcoRI restrikciós enzimmel emésztettük, tisztítottuk, és EcoRI enzimmel emésztett pUC19-vektorba klónoztuk, szokásos eljárásokkal történő szekvencia-elemzéshez (lásd „Molecular Cloning, a Laboratory Manual, ugyanott). A jun-kazettát a pET5c HIS 340 scAb plazmidba szubklónoztuk XhoI-EcoRI fragmensként, az ott lévő, emberi állandó domént kódoló, 320 bázispár hosszúságú XhoI-EcoRI fragmenst helyettesítve.
A his-340-jun és FLAG-aPs-fos plazmidokat templátként alkalmaztuk
PCR-reakcióban biotinilált • · · · · ·
BioT7: 5'-agatctccgatcccgcaaatta és petrev: 5'-aaataggcgtatcaacgaggcc láncinditók alkalmazásával. A láncindítókat a Genosys szállította (Cambridge, UK), és 1 pmol koncentrációban alkalmaztuk azokat a reakcióban. A PCR komponensei és körülményei megegyeztek a korábbiakkal. A his-340-jun termék 992 bázispár, a FLAG-otPs-fos termék 1002 bázispár hosszúságú volt. A termékeket centrifugás tisztító kazettával (Qiagen, Crawley, UK) tisztítottuk, és 100 ng/ml koncentrációra hígítottuk. A mennyiségi meghatározást UV-abszorpcióval végeztük 260 nm-en. 500 ng, biotinnal jelölt DNS-t reagálhattunk 10 μΐ, sztreptavidinnel bevont mágneses részecskével (Bangs Labs, Fishers, USA) . A reakciót szilikonozott mikrocentrifuga-csövekben végeztük 500 μΐ PBS/1% BSA pufferben, 10 percig szobahőmérsékleten. A kötést követően a részecskéket mágnessel összegyűjtöttük (Dynal, Bromborough, UK) , és háromszor mostuk PBS/1% BSA pufferrel.
Az utolsó mosást követően in vitro transzlációs reakciót (IVTT reakció) kezdtünk 25 μΐ, biotinil-lizin tRNS-sel (Promega, Southampton, UK) kiegészített T7 Quick coupled transcription translation mix (Promega) hozzáadásával. A transzlációs reakciót 60 percig végeztük 30°C-on, majd jégre tettük. A részecskéket mágnessel összegyűjtöttük, és jéghideg PBS/1% BSA pufferrel mostuk.
Néhány kísérletben nemmágneses sztreptavidin részecskéket alkalmaztunk az IVTT reakciókban (Bangs Labs, Fishers, USA) . Ilyen esetekben a részecskéket centrifugálással nyertük vissza a mosási ciklusokban.
Néhány kísérletben színes réscecskéket, mágnesest és nemmágnesest (Bangs Labs) alkalmaztunk az IVTT reakciókban.
Néhány kísérletben a részecskékhez kötött transzlációs termékeket a génkonstrukciókba beépített Flag vagy His6 epitóp elleni ellenanyagokkal detektáltuk. Az ellenanyagokat PBS-ben hígított, mosott részecskékhez adtuk, és 60 percig inkubáltuk 4°C-on óvatos keveréssel. Másodlagos reagenst (anti-egér-HRP-konjugátum) adtunk a reakcióelegyhez a javasolt hígításban PBS-ben hígítva, és további 30 percig inkubáltuk 4<’C-on. A részecskéket háromszor mostuk 200 μΐ PBS alkalmazásával a kromogén szubsztráttal történő színképzés előtt. A reakciókat 492 nm-en olvastuk le.
A fehérje-fehérje kötési reakciókat a részecske felszínéhez kötött IVTT fehérjék alkalmazásával végeztük. Az ilyen kísérletekben nemmágneses részecskéket „fogtunk be a mágneses részecskék felszínén a fehérjék által közvetített (fos·, jun} kötéssel. Fos IVTT terméket hordozó mágneses részecskéket óvatosan összekevertünk olyan nemmágneses részecskékkel, amelyeknek a felszínére jun volt kötve. A reakciót 100 μΐ PBS/BSA pufferben végeztük, és 30 percig engedtük folyni szobahőmérsékleten. A negatív kontroll reakcióban nemmágneses, a felszínen Sca-fehérjét (α-Ps scAb, Molloy és mtsai., ugyanott) hordozó részecskéket kevertünk össze a fos IVTT termékkel bevont mágneses részecskékkel. Az inkubálást követően a részecskéket mágnessel befogtuk, és hatszor mostuk PBS/1% BSA puffer alkalmazásával.
A befogott célfehérje jelenlétét PCR és DNS-szekvenálás alkalmazásával igazoltuk. A jun modellgén detektálására a jun-specifikus Jun 1 for-S és Junl46rev-S láncinditókat alkalmaztuk PCR vizsgálati eljárásban. A vizsgálati eljárást 10% (v/v) részecskének közvetlenül a PCR reakcióelegyhez történő hozzáadásával indítottuk. A reakció komponensei és körülményei megegyeztek a korábbiakkal. A 146 bázispár hosszúságú jun-specifikus terméket gélelektroforézissel detektáltuk. A fos modellgén detektálására a íos-specifikus FoslfS és Fos 155rS láncindítókat alkalmaztuk PCR vizsgálati eljárásban. A reakció komponensei és körülményei és a 155 bázispár hosszúságú fos-specifikus termék detektálása megegyeztek a fentiekkel. A negatív kontroll fehérje detektálására a Seqlscab 5'agatccctactataggta és Seq2scab 5'ggtgagctcgatgtatcc láncindítókat alkalmaztuk a 115 bázispár hosszúságú, cx-Ps scAb fehérje génjéből való termék detektálására.
A fenti kísérletekben jun PCR-termékeket detektáltunk fos mágneses részecskéken történő befogást követően olyan körülmények között, ahol oí-Ps scAb PCR-termékeket nem lehetett detektálni a fos mágneses részecskékkel való kölcsönhatást követően.
2. példa
Ebben a példában egyláncú, egyedi peptid-vonalkódokat tartalmazó ellenanyag-könyvtárat állítottunk elő. Emberi perifériális vér limfocita RNS-t állítottunk elő szokásos eljárásokkal. Röviden, limficitákat preparáltunk 10 ml, 16 egészséges donortól levett heparinizált vérből. A limfocitákat Lymphoprep medium (Sigma, Poole, UK) alkalmazásával végzett sűrűséggradiens centrifugálást követően összegyűj töttük. RNS-t preparáltunk a QuickPrep system és a szállító (Pharmacia, St Albans, UK) által adott utasítások alkalmazásával. A cDNS szintézisét cDNA synthesis kit (Pharmacia, St Albans, UK) és random hexamer láncindítók alkalmazásával végeztük a szállító által javasolt körülmények között. Az immunglobulin nehéz lánc variábilis régiót (Vh) és könnyű lánc variábilis régiót (VI) a cDNS-ből amplifikáltuk különálló PCR-elegyekben, olyan láncindító halmazokkal, amelyeket a Vh és VI repertoár maximalizálására terveztünk, korábbi leírás szerint [Marks JD és mtsai., Eur. J. Immunoi. 21, 985. old. (1991)]. A Vh és VI PCR-reakciókat 2,6 egység Expand™ High Fidelity PCR Enzyme Mix (Boehringer Mannheim, Lewes, UK), Expand HF puffer (Boehringer Mannheim), 1,5 mM MgCl2, 200 μΜ deoxinukleotid-trifoszfátok (dNTP-k)(Life Technologies, Paisley, UK) és minden láncindító-készlet 25 pmol-ének alkalmazásával végeztük. A ciklusok az alábbiak voltak: 5 perc 96°C-on, azután [1 perc 95’C-on, 1 perc 50°C-on, 1 perc 72°C-on] ötször, [45 másodperc 95°C-on, 1 perc 50C-on, 1 perc 30 másodperc 72’C-on] nyolcszor, [45 másodperc 95°C-on, 1 perc 50°C-on, 2 perc 72'C-on] ötször, végül 5 perc 72’C-on.
Egy különálló PCR-ben egy (Gly4Ser)3 kapcsolófragmenst [Huston JS és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 58795883. old. (1988)] amplifikáltunk egy klónozott templátról [pSWl-ScFvDl. 3, McCafferty és mtsai., Nature 348, 522-554. old. (1990)], korábban részletezett láncindító-készletek [Marks JD és mtsai., „Antibody Engineering, szerk.: Borrebaek CAK, kiad.: New York O.U.P. (1995)] alkalmazásé- 6Ί - ··;: .;·.
···· «· ··· ·* val. A 93 bázispár hosszúságú kapcsolófragmenst a Vh és VI PCR-termékek ekvimoláris keverékével együtt anneáltuk. A keveréket tovább amplifikáltuk „puli through reakcióban a szegélyező HuVHBACKsfi és HuFORNot láncindítók [részletezve: Vaughan TJ és mtsai., Nature Biotech. 14, 309-314. old. (1996)] alkalmazásával. A „puli through reakcióban alkalmazott összes fragmenst megtisztítottuk a kezdeti láncinditóiktól a reakcióban való alkalmazást megelőzően. A tisztítást Wizard® PCR Preps System (Promega, Southampton, UK) alkalmazásával végeztük.
A Vh-kapcsolószekvencia-Vl szerkezetű összeszerelt kontigot Sfil és NotI restrikciós enzimekkel (Boehringer Mannheim) emésztettük szokásos körülmények alkalmazásával, és a fentiek szerint tisztítottuk. A tisztított fragmenst olyan kétszálú szintetikus oligonukleotid adapterkeverékkel anneáltuk, amelyet V8-proteáz hasítási helyének a Vl-gén Cterminálisával fázisban lévő randomizált szekvenciaszakasz mellé történő beépítésére terveztünk. Ezen V8/egyedi szekvenciájú vonalkódot az alábbi szintetikus oligonukleotid-készletek anneálásval állítottuk elő: 5' ggccgcgaggaagaggaa[(atg)/(can)/(agn)/(aan)/(gan)/(ttn)] 2gc3' és 5'ggccgc [ (naa) / (ntc) / (ngt) / (net) / (nag) / (cat) ] 2ctccttctcctcgc3' . Ezen kapcsolószekvenciának Notl-gyel kompatíbilis végei vannak (aláhúzva), és ezáltal megkönnyíti a teljes egyláncú ellenanyag-V8/egyedi szekvenciájú vonalkód fragmens beillesztését az Sfil-NotI enzimekkel preparált pCANTAB 5 (Pharmacia) fagemid vektorba.
Az egyedi szekvenciájú vonalkódot úgy terveztük, hogy elkerüljük stop-kodonok beépítését, és továbbá elfogultak oly módon, hogy kizárják azokat az oldalláncokat, amelyeket kettőnél több alternatív kodon kódol. Ezzel a stratégiával az adott dekódolt peptidszekvencia azonosításához szükséges specifikus oligonukleotidok számát minimalizáltuk. Összesen az egyedi szekvenciájú vonalkód a 20 aminosav közül 11-et képes kódolni. A V8-peptidáz hasítási helye mellett (4 glutaminsav-oldalláncból álló lánc) a vonalkód szekvenciája 12 kodon hosszú. Ily módon 11 aminosav repertoárja (amelyből 10-et két kodon bármelyike kódol) 1112/2=~1, 5xl012 különböző peptidet képes kódolni.
Az összeállított scfv-fragmenst (Vh-kapcsolószekvencia-Vl) az Sfil és NotI enzimekkel preparált végekkel a NotI szekvencia-vonalkód adapterrel anneáltuk és ligáltuk, majd újra tisztítottuk. Az emberi scfv-könyvtárat fágprezentációval expresszáló kísérletek céljára a teljes fragmenst Sfil-NotI enzimekkel preparált pCANTAB 5 fagemid vektorba (Pharmacia) ligáltuk, és kompetens E. coli sejtekbe transzformáltuk.
In vitro traszkripciót és transzlációt (IVTT) alkalmazó egyéb kísérletek céljára az scfv-könyvtárat Sfil-NotI enzimekkel preparált pCANTAB5-T7 vektorba szubklónoztuk. Ez a vektor ugyanaz, mint a kereskedelmi forgalomban kapható pCANTAB 5, kivéve, hogy oly módon módosítottuk, hogy tar talmazza a T7-promóter szekvenciáját (ttaatacgactcactata) a 2235. helyen lévő Hindii! helyre beillesztve. A módosítást az 5'-agctaatacgactcactata szekvenciájú kétszálú szinteti kus DNS-kapcsolómolekulának a Hindii! enzimmel emésztett és defoszforilált pCANTAB 5 vektorba történő ligálásával hajtottuk végre. A T7-promótert tartalmazó rekombináns kiónokat diagnosztikus PCR-rel választottuk ki.
A ligálást és kompetens E. coli sejtekbe történő transzformációt követően a sejteket egy órán keresztül tenyésztettük 1 ml SOC tápközegben, és azután 100 pg/ml ampicillint tartalmazó TYE tápközeget tartalmazó csészékre szélesztettük. A kolóniákat 5ml, ampicillint tartalmazó 2xTY tápközegbe kapartuk le a csészékről. A tenyésztett könyvtárat alkalmaztuk IVTT reakciók céljára történő DNS preparáláshoz.
A pCANTAB5-T7 scfv-könyvtár DNS-ét in vitro transzlációs reakcióban alkalmaztuk. Az IVTT-t T7 Quick coupled transcription translation mix (Promega, Southampton, UK) és 10 pg pCANTAB5-T7 scfv-könyvtár DNS alkalmazásával végeztük 50 μΐ össztérfogatban. A transzlációs reakciót 90 percig végeztük 30°C-on, majd jégre tettük. Néhány kísérletben a reakciókat követtük a transzlációs termék jelenlétének meghatározására 35S-metionin beépülési vizsgálati eljárással. A reakciókat -70”C-on tároltuk a kötési és szkrínelési vizsgálati eljárásokat megelőzően.
Az egyláncú ellenanyag könyvtárat alkalmaztuk rekombináns emberi p53-fehérje (Oncogene Research ProductsCalbiochem, Nottingham, UK) kötési reakciójában. Az IVTTelegyet 10-szeresre hígítottuk PBS-ben, és 96-mérőhelyes lemezre immobilizált emberi rekombináns p53-fehérje kötési vizsgálati eljárásában alkalmaztuk. A p53-fehérjét éjszakán
ΊΟ ·· ·4 · · ί · · ♦ át tartó inkubálással immobilizáltuk 100 pg/ml koncentrációban foszfát pufferben 4C-on. A lemezt PBS/0,5% (w/v) BSA puffer alkalmazásával mostuk, és a hígított IVTT-elegyet a mérőhelyekhez adtuk a kötés tesztelésére. A kötési reakciót 37°C-on végeztük 90 percig. A lemezt háromszor mostuk PBS-T pufferrel (PBS + 0,05% Tween-20) , és V8-proteázzal emésztettük (Takara, Workingham, UK) . A fehérjefragmenseket összegyűjtöttük a felülúszóból, és méret szerint frakcionáltuk a V8-proteáz és egyéb nagyméreté anyagok kizárására a MALDI-ToF-fal történő elemzést megelőzően.
A MALDI-ToF fragmens-elemzés számos peptidfragmenst azonosított. A peptidszekvenciákat megfelelő szintetikus oligonukleotidok tervezésére alkalmaztuk. Az oligonukleotidokat az egyláncú könyvtár PCR-alapú szkrínelésére alkalmaztuk. Pfu turbo DNA polymerase-t (Stratagene Europe) alkalmaztunk komplementer szálak szintézisére az emberi egyláncú ellenanyag-könyvtár tagjaiban. 15 termális ciklust követően a terméket DpnI restrikciós enzimmel emésztettük. Ez a lépés elhasználta a szülői plazmid-molekulák keverékét annak biztosítása érdekében, hogy csak az újonnan szintetizált termékek szaporodjanak. A reakció 1 μΐ-ét TG1 kompetens sejtekbe transzformáltuk, és 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-csészékre szélesztettük. Egyedi kiónokat szedtünk ki, szaporítottunk, és DNS-t preparáltunk szokásos eljárások szerint. A DNS-t közvetlenül alkalmaztuk a szkrínelés második menetére, ami IVTT-t, antigénkötést, V8-proteázos emésztést, MALDI-ToF fragmenselemzést tartalmazott.
A szelekció két menete után 6, a rekombináns p53-hoz kötődő scFv-domént izoláltunk.
3. példa
A példában leírt kísérleteket a pC5A8-03 jelű Fab expressziós vektorral végeztük, amit az alábbiak szerint konstruáltunk. A pC5A8-01 vektor a pLITMUS28 vektoron (New England Biolabs, MA, USA) alapul, amely indukálható lacpromótert és M13 replikációs origót tartalmaz. Az ellenanyag Fab-régióját két DNS-fragmensből állítottuk össze, amelyek az 5A8 jelű, CD4 elleni emberiesített monoklonális ellenanyag [Reimann KA és mtsai., Aids research and human retroviruses 13, 933. old. (1997)] nehéz láncának variábilis régióját (VH) és első állandó régióját (CH1), és kappa könnyű láncának variábilis régióját (VK) és állandó régióját (CK) kódolják. Ezen fragmenseket a pelB vezetőszekvenciához [Lei S-P és mtsai., Journal of Bacteriology 169, 4379-4383. old. (1987)] fuzionáltattuk, és a BglII és Bst98I restrikciós helyek közé illesztettük a pLITMUS28 vektorban az alábbiak szerint. Az összes következő molekuláris biológiai eljárás ismert a szakember számára, és megtalálható a „Molecular Cloning, a Laboratory Manual [szerk.: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, kiad.: Cold Spring harbor Laboratory Press, New York, USA, (1989)] című könyvben. Az össze oligonukleotidot a Genosys Biotechnologies Europe Ltd. (Cambridge UK) cég szintetizál ta. Ha másképpen nem mondjuk, az összes restrikciós enzimet a Life Technologies (Paisley, UK) cégtől szereztük be. Az ./. ..· össze polimeráz láncreakciót pfu DNS-polimeráz (Promega, Southampton, UK) alkalmazásával hajtottuk végre.
A könnyű lánc fragmens összeállítása érdekében a pelB vezetőszekvenciát amplifikáltuk polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazásával - Hybaid Touchdown Thermal Cycler alkalmazásával - a pPMl-HIS kiónból, amely Pseudomonas aeruginosa elleni egyláncú ellenanyag („single-chain antibody, scAb) fragmenst tartalmaz [Molloy P. és mtsai., Journal of Applied Bacteriology 78, 359-365. old. (1995)]. Ezt a kezdeti reakciót az OLOOl láncindító alkalmazásával hajtottuk végre, amely a BglII restrikciós helyet, a pelB vezetőszekvencia N-terminális aminosav-oldalláncait és a ShineDalgarno szekvenciát kódolja, valamint az OL002 láncindítóval, amely a pelB vezetőszekvencia C-terminálisát és a pDIVKV3-ból való kappa könnyű lánc N-terminálisát kódolja. Ezen reakció termékét NuSieve GTG agarózból (Flowgen, Lichfield, UK) tisztítottuk Wizard® PCR purification kit (Promega UK Ltd., Southampton, UK) alkalmazásával, denaturáltuk és az OL004 láncindítóval együtt - amely a kappa könnyű lánc variábilis és állandó régiójának a kapcsolódását kódolja - a pDIVKV3 klón kappa láncának amplifikálására alkalmaztuk, szokásos PCR protokollok szerint. A kappa könnyű lánc állandó régióját a pPMl-HIS klónból (Molloy és mtsai.) amplifikáltuk PCR-rel az OL003 láncindító alkalmazásával, amely a variábilis régió C-terminális aminosavoldalláncait és az állandó régió N-terminális aminosavoldalláncait kódolja, valamint az OL005 láncindítóval, amely a kappa lánc állandó régiójának C-terminális amino • · · · · ···· ·· »4 » ·· sav-oldalláncait és az EcoRI restrikciós helyet kódolja. Ezt a két fragmenst azt követően átfedő PCR-rel amplifikáltuk az OLOOl és OL005 láncindítók alkalmazásával, BglII és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük, és pLITMUS28 vektorba klónoztuk a pC5A8-01 vektor előállítása érdekében.
A nehéz láncot a pelB vezetőszekvencia amplifikálásával állítottuk össze az összeállított könnyű láncból az OL006 láncindító alkalmazásával, amely a EcoRI restrikciós helyet és a Shine-Dalgarno szekvenciát kódolja, valamint az OL007 láncindítóval, amely a pelB vezetőszekvencia C-terminális aminosav-oldalláncait és a pDIVHV4-ből való nehéz lánc N-terminális aminosav-oldalláncait kódolja. Ezen reakció termékét alkalmaztuk az OL009 láncindítóval együtt amely a nehéz lánc variábilis és állandó régiójának a kapcsolódását kódolja - a pDIVHV4 klónból való IgGl nehéz lánc variábilis régiójának amplifikálására. A nehéz lánc állandó régiójának az 1-es exonját a pSVgptHuIgGl kiónból amplifikáltuk PCR-rel az OL008 és OLOIO láncindítók alkalmazásával, amelyek a nehéz lánc variábilis régiójának C-terminális aminosav-oldalláncait és az állandó régió N-terminális aminosav-oldalláncait (OL008) és az 1-es exon C-terminális aminosav-oldalláncait és az SstI restrikciós helyet (OLOIO) kódolják. Ezt a két fragmenst azt követően átfedő PCR-rel amplifikáltuk az OL006 és OLOIO láncindítók alkalmazásával, EcoRI és SstI restrikciós enzimekkel emésztettük, és pLITMUS28 vektorba klónoztuk a pC5A8-02 vektor előállítása érdekében.
.t. ..·
A CHI C-terminális aminosav-oldalláncait és egy Cterminális FLAG-cimke szekvenciát (DYKDDDDK) [Knappik A és Pluckthun A, BioTechniques 17, 754-761. old. (1994)] építettünk be az EcolCRI és Bst98I restrikciós helyeket tartalmazó OLOll és OL012 láncinditók alkalmazásával a pC5A803 vektor előállítása érdekében. Más megoldásként ezen címkék a 6HIS vagy MS címkéket is tartalmazhatják (lásd a példát) .
A pC5A8-01, pC5A8-02 és pC5A8-03 előállításában alkalmazott oligonukleotidok az alábbiak soroljuk fel:
OL001: 5' GGGCAGATCTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATAC CTATTGCCTACGG 3'
OL002: 5' GGGTCTGGGTCATAACGATATCGGCCATCGCTGGTTGGGCAGC 3'
OL003: 5' GGTACCAAACTGGAGATCAAACGGACTGTGGCTGCACCATCT 3 z
OL004: 5' AGATGGTGCAGCCACAGTCCGTTTGATCTCCAGTTTGGTACC 3 r
OL005: 5' GATCGAATTCCTAACACTCTCCGCGGTTGAAGCTCTTTG 3'
OL006: 5' GATCGAATTCTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG 3'
OL007: 5' GGACTGAACCAGTTGGACTTCGGCCATCGCTGGTTGGGCAGC 3 r
OL008: 5' ACCCTGGTTACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC 3'
OL009: 5' GATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTAACCAGGGTAC 3'
OLOIO: 5' GATCGAGCTCTGCTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGC 3'
OLOll: 5 ’ CCCAAATCTTGCGCTGCAGACTACAAAGACGACGACGACAAATA
GCTCGAGC 3
OL012: 5' TTAAGCTCGAGCTATTTGTCGTCGTCGTCTTTGTAGTCTGCAGC GCAAGATTTGGG 3'
A működőképes Fab termelődést enzimes immunológiai vizsgálati eljárással (ELISA) demonstráltuk. Összefoglalva, a fenti vektort E. coli DH5a-törzsbe transzformáltuk, és 37°C-on tenyésztettük 100 pg/ml ampicillin és 1% glükóz jelenlétében, amíg 0,5-es OD6oo értéket értünk el. A fehérjetermelést 1 mM izopropiltio-p-D-galaktozid (IPTG) hozzáadásával indukáltuk glükóz távollétében. A periplazmatikus frakciót ozmotikus sokkal szabadítottuk fel 30 mM Tris HC1, 20% szukróz, pH 8,0, 1 mM EDTA alkalmazásával, amit 5 mM MgSO4 követett [Molloy, P. és mtsai., Journal of Applied Bacteriology 78, 359-365. old. (1995)]. A periplazmatikus frakciót közvetlenül Immulon 4 ELISA-lemezhez (Dynex) adtuk, amelyet előzőleg éjszakán át oldható emberi CD4-gyel (Intracel Corp., Issaquah, WA) vontunk be, 1 pg/ml koncentrációban szobahőmérsékleten párásított kamrában. Más megoldásként a periplazmatikus frakciót sejtlízissel is felszabadíthatjuk, vagy 1 mM EDTA hozzáadásával. A nemspecifikus kötődést úgy csökkentettük, hogy a lemezt az oldható Fab hozzáadását megelőzően 1 órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten 0,05% Tween-20-at, 2% marhaszérum-albumint (BSA) és 0,05% timerozált (Sigma) tartalmazó PBS-sel. Az anti-CD4specifikus Fab-t kecske anti-ember-IgG-specifikus Fab tormaperoxidáz-konjugátum (Sigma, UK) alkalmazásával detektáltuk, amelyet 5,5' tetrametilbenzidin-dihidroklorid (TMB)(Sigma, UK) és pH5,0 foszfát/citrát pufferben lévő hidrogén-peroxid alkalmazásával detektáltunk. A szinfejlő- 76 • · · · · · .t. ..· dést 30 perc után 0,2 N H2SO4 alkalmazásával állítottuk le, és az abszorbanciát 450 nm-en olvastuk le. Más megoldásként ABTS/citrát (Sigma, UK) is alkalmazható a detektálásra.
CDR3 szekvenciák könyvtárának előállítása érdekében egyedi restrikciós helyeket építettünk be a pC5A8-03 vektorba oligonukleotid-irányított mutagenezissel [Kunkel TA és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 488-492. old. (1985) és „Current Protocols in Molecular Biology, szerk.: Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore MD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, kiad.: John Wiley & Sons, Inc.] az alább felsorolt oligonukleotidok alkalmazásával. Az AatlI és Hindii! (5' és 3' az LCDR3-hoz képest), illetve a BssHII és SanDI (5' és 3' a HCDR3-hoz képest) restrikciós helyek jelenlétét a kappa könnyű láncban, illetve a nehéz láncban a megfelelő restrikciós enzimekkel történő emésztéssel igazoltuk. Ezen plazmidokat, amelyek egy további restrikciós helyet tartalmaznak, pC5A8-04-től pC5A8-07-ig neveztük el.
OL013: 5' GAAGACGTCGCTGTTTAC 3'
OL014: 5' GGTACCAAGCTTGAGATC 3'
OL015: 5' CTACTGCGCGCGTGAAAAAG 3'
OL016: 5' GGGTCAGGGGACCCTGG 3' a pC5A8-07 vektor AatlI és Hindii! enzimekkel történő emésztését követően a kappa könnyű lánc variábilis régiójának CDR3-jában lévő nagyon változékony oldalláncokat randomizáltuk a horgonyzó oldalláncokat (83.-88. és 97-103. aminosavak) hordozó degenerált oligonukleotidok keverékének, és egy, a Hindii! restrikciós endonukleáz felismerési helyét tartalmazó 10 nukleotid hosszúságú palindrom szekven77
·.? I*1 cia alkalmazásával. Ezen oligonukleotidok hibridizálnak a 3' végükön, és azután a DNS-polimeráz szubsztrátjaként működnek, kétszálú homoduplex termelését eredményezve, amelyet a két restrikciós enzimmel emésztünk, és az emésztett vektorba klónozunk szokásos protokollok alkalmazásával [lásd „Current Protocols in Molecular Biology, szerk.:
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore MD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, kiad.: John Wiley & Sons, Inc.]. Az oligonukleotidokat úgy állítottuk elő, hogy 91., 92., 93., 94., 95A, 95B és 96. oldalláncokat randomizáltuk, az oligonukleotid-szintézis minden egyes lépésénél minden nukleotid egyenlő koncentrációban történő alkalmazásával (Genosys, Cambridge, UK).
A mutagén oligonukleotid szekvenciája a CDR3 10 oldalláncnyi hosszúságú szakaszán alapul. A 89. és 90. oldalláncok viszonylag konzerváltak, és ezért rögzítettek ebben a példában. A randomizálandó nukleotidokat dőlt betűvel jelöljük. További könyvtárak is készíthetők a CDR3 6, 7, 8 vagy 9 oldalláncával a randomizált régió hosszának változtatásával .
Pozitív szál: 5' GAAGACGTCGCTGTTTACTACTGCCAGCAGNNSNNSWSWSWSN NSNNSACCTTCGGTGGTGGTACCAAGCTTGG 3'
Negatív szál: 5' CCTÍAGCTTGGTACCACCACCGAAGGTSWSWSWSWSWSWSN NCTGCTGGCAGTAGTAAACAGCGACGTCTTC 3'
A nehéz lánc CDR3-ját a BssHII és SanDI restrikciós helyek alkalmazásával randomizáltuk, és a mutagén oligonuk • · « ··· • · · a · ·♦·· ·· ··· ·· leotidokat alább soroljuk fel, hasonlóképpen az előző részben leírtakhoz. Ebben az esetben a 95-100D oldalláncokat randomizáltuk. A randomizálandó nukleotidokat dőlt betűvel jelöljük. További könyvtárak is készíthetők a CDR3 9, 11 vagy 12 oldalláncával a randomizált régió hosszának változtatásával .
Pozitív szál: 5' CTACTGCGCGCGTNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSTTC
GCTTACTGGGGTCAGGGGACCCCT 3'
Negatív szál: 5' AGGGGTCCCCCGACCCCAGTAAGCGAASNNSNNSNNSNNSNNSNNS NNSNNSNNSNNACGCGCGCAGTAG 3'
Olyan könyvtárat állítottunk elő, amelyben mind a nehéz, mind a könnyű lánc randomizált CDR3-at tartalmazott, a fent leírt eljárások végrehajtásával a nehéz és a könnyű lánc mutagenezisére.
A magas affinitású kötők szelektálásának hatékonysága növelése érdekében a fent említett FLAG-címkét egy tömegcímkével helyettesítettük, a PstI és Xhol restrikciós enzimek alkalmazásával. A könyvtár méretének növelése érdekében két további címkét is alkalmaztunk. Ebben az esetben a címkék hosszának különböznie kell legalább két aminosav-oldallánccal, annak érdekében, hogy megkülönböztethetők legyenek az 1. és 2. címkék proteázzal, mint például Faktor-Xa-val történő eltávolítását követően. Az oligonukleotidokat palindrom szekvenciával terveztük a 3' végükön, amely az Xhol restrikciós enzim hasítási helyét tartalmazta. Az oligonukleotidok hibridizálnak a 3' végükön, és azután a DNS-poli79 • ♦ · ··« meráz szubsztrátjaként működnek, kétszálú homoduplex termelését eredményezve, amelyet a két restrikciós enzimmel emésztünk (PstI és Xhol), és az emésztett vektorba klónozunk szokásos protokollok alkalmazásával [lásd „Current Protocols in Molecular Biology, szerk.: Ausubel PM, Brent R, Kingston RE, Moore MD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, kiad.: John Wiley & Sons, Inc.].
Példaként egy 8 oldalláncból álló címkét készíthetünk az 5' NAC NCC NGG NTG TKC VÁG GNV CNT 3' oligonukleotid alkalmazásával. Ezen címke hosszát 11 oldalláncra növekszik, ha egy második, szintén 8 oldalláncnyi címkét is alkalmazunk a Faktor-Xa proteáz hasítási helyének beépítése miatt, amelyet dőlt betűvel mutatunk. Ez lehetővé teszi a címkék 1. vagy 2. címkeként történő azonosítását, az eltávolításukat és tömegspektroszkópiás elemzésüket követően.
Egyszeres címke „Forward oligonukleotid : 5' GCG CTG CAG GAY GGN CGN NAC NCC NGG NTG TKC VÁG GNV CNT TAG CTC GAG CTA 3' „Reverse oligonukleotid : 5' TAG CTC GAG CTA ANG BNC CTB GMA CAN CCN GGN GTN CCG CCC GTC CTG CAG CGC 3' Kettős címke „Forward oligonukleotid : 5' GCG CTG CAG GAY GGN CGN NAC NCC NGG NTG TKC VÁG GNV CNT GAY GGN CGN NAC NCC NGG NTG
TKC VÁG GNV CNT TAG CTC GAG CTA 3' „Reverse oligonukleotid : 5' TAG CTC GAG CTA ANG BNC
CTB GMA CAN CCN GGN GTN CCG CCC GTC ANG BNC CTB GMA CAN CCN
GGN GTN CCG CCC GTC CTG CAG CGC 3 • · « ♦ • · « * ·· · · «· η.* # . példa
A magas affinitású kötők kiszelektálása érdekében a kiindulási könyvtárat E. coli DH5oí sejtekbe vittük át elektroporációval (Bio-rad), és 100 pg/ml ampicillint és 1% glükózt tartalmazó L-agar csészékre szélesztettük, és éjszakán át inkubáltuk 37”C-on. A transzformált sejteket begyűjtöttük, és azokat 100 pg/ml ampicillint tartalmazó friss L-tápközeg beoltására alkalmaztuk. A könyvár fennmaradó részét meg kell őrizni és -70°C-on tárolni, és kiindulási anyagként kell alkalmazni a magas affinitású kötők kimentésére, mint ahogy ezt később feltárjuk. Az újonnan beoltott tenyészeteket 2 órán keresztül inkubáltuk 37°C-on a 0,1 mM végkoncentrációjú izopropiltio^-D-galaktozid (IPTG) hozzáadását megelőzően. Azután a tenyészeteket további 3 órán keresztül inkubáltuk 37°C-on.
Az oldható Fab-könyvtárat termelő baktériumok 100 mles tenyészeteit lecentrifugáltuk 4000 rpm-mel 20 percig 4‘C-on, és a kapott csapadékot újra felszuszpendáltuk 1 mM EDTÁ-t tartalmazó foszfát puffereit sóoldatban. 5-20 percig tartó, jégen történő keverést követően az EDTA átjárhatóvá teszi a külső membránt, és lehetővé teszi a periplazmatikus tartalom kiszivárgását. Azután a felülúszót centrifugálással derítettük, és a felülúszót alkalmaztuk az azt követő lépésekben. A periplazmatikus tartalom felszbadítására szolgáló alternatív protokollok is alkalmazhatók [Molloy P. és mtsai., Journal of Applied Bacteriology 78, 359-365. old. (1995) és „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, • · < ·*· • * · · * ··· ·· ** · *· szerk.: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, kiad.: Cold Spring harbor Laboratory Press, New York, USA, (1989)].
Az Fab-könyvtárat tartalmazó periplazmatikus extraktumot Nunc Immunotubes-be osztottuk szét, amelyeket előzőleg éjszakán át oldható emberi CD4-gyel (Intracel Corp., Issaquah, WA) vontunk b, 1 pg/ml koncentrációban foszfát puffereit sóoldatban (pH 7,4, PBS), szobahőmérsékleten, párásított kamrában. A nemspecifikus kötődést úgy csökkentettük, hogy a csöveket az oldható Fab hozzáadását megelőzően 1 órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten 0,05% Tween-20-t, 2% marhaszérum-albumint (BSA) és 0,05% timerozált (Sigma) tartalmazó PBS-sel. Az Fab CD4-hez történő kötődését egy órán keresztül engedtük szobahőmérsékleten, majd a nem kötődött Fab-t a csövek 0,05% Tween-20-at tartalmazó PBS-sel történő 20-szori mosásával távolítottuk el.
Azon aminosav-szekvenciák azonosítása érdeekében, amelyekhez az Fab kötődve maradt, a tömegcímkéket Faktor-Xaval távolítottuk el szokásos eljárások alkalmazásával. Azután a tömegcímkéket MALDI-ToF (MS/MS) spektrometriával elemeztük, amelyben minden egyes címke molekulatömegét meghatároztuk, majd a szekvencia-információt másodlagos ionizációs események elemzésével kaptuk meg. Ezen információ kombinálásával a címkék aminosav-szekvenciáját meghatározhattuk.
Néhány esetben szükséges lehet a proteázos hasítás hatékonyságának a növelése a kötött Fab eluálása, az Fab semlegesítése, és egyéb E. coli fehérjéktől Sepharose-anti-Ck oszlopos (Pierce Warriner, Chesire, UK) affinitás! tiszti * · « ·*· tással - amelyet a gyártó utasításai szerint készítünk történő tisztítása révén. A tömegcímkéket azután eltávolíthatjuk a kötött Fab-ról Faktor-Xa alkalmazásával.
A tömegcímke azonosítását követően két további oligonukleotidot állítottunk elő. A 3' oligonukleotid a tömegcímke szekvenciáját kódolja, míg az 5' oligonukleotid az O1001, amely az Fab N-terminálisának a szekvenciáját kódolja.
Pozitív szál: 5' GG GCA GAT CTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG G
Negatív szál: 5' TAG CTC GAG CTA ANG BNC CTB GMA CAN CCN GGN GTN CCG CCC GTC ANG BNC CTB GMA CAN CCN GGN GTN CCG CCC GTC CTG CAG CGC 3'
A magas affinitású kötőt tartalmazó kiónt az E. coli könyvtár 10 μΐ-ének PCR-reakcióhoz történő hozzáadásával mentettük ki, amely a fenti oligonukleotidokat tartalmazta. A reakcióhoz szükséges körülmények változhatnak alkalmazott oligonukleotidoktól függően. Az amplifikációt követően a PCR-terméket szekvenáltuk, és azt követően alacsony olvadáspontú agarózból tisztítottuk, Aatl - amely a kappa könnyű lánc CDR3 részének a C-terminálisán található - és SanDI - amely a neház lánc CDR3 részének C-terminálisán található a pC5A8-7plazmidban - restrikciós enzimmel emésztettük, és a pC5A8-07 vektorba vittük át, amelyet ugyanezen restrikciós enzimekkel emésztettünk, szokásos eljárások alkalmazásával [lásd „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, szerk.: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, kiad.: Cold Spring harbor Laboratory Press, New York, USA, • w *** J.· J, (1989)]. A kapott plazmidot E. coll DH5a-sejtekbe transzformáltuk elektroporációval szokásos eljárások alkalmazásával, és -70°C-on tároltuk. Más megoldásként a PCR-reakció termékét számos más restrikciós enzimmel is emészthetjük és számos más vektorba is transzformálhatjuk az Fab expreszsziója céljából.
Bizonyos esetekben számos tömegcímke lehet jelen a kezdeti „panning után. Ebben az esetben a kiónok könyvtárát a tárolt könyvtárból amplifikáljuk 3' oligonukleotidok keverékének alkalmazásával. Ezt a limitált könyvtárat azután „panning további meneteinek vethetjük alá, a kötött kiónokat újra elemezhetjük MALDI-ToF-fal, és alkalmazhatjuk a belső címkék szekvenciáját PCR-láncindítók limitált repertoárjának előállítására.
A kiszelektált CD4-specifikus Fab affinitásának igazolásának érdekében periplazmatikus extraktumokat kell előállítani a fenti leírás szerint, és azonnal alkalmazni CD4specifikus ELISA-ban. A látszólagos affinitás az aktuális affinitás és az Fab koncentrációjának a kombinációja, tehát az Fab koncentrációját további befogásos ELISA végrehajtásával kell megállapítani ugyanazon az extraktumon, amely során standard görbét veszünk fel a FLAG-címke vagy az emberi Ck-domén [McGregor DP, Molloy PE, Cunnungham C és Harris WJ, Molecular Immunology 31, 219. old. (1994)] ellen.
. példa
Ebben a példában emberi p53-fehérjét kémiai címkével módosítottunk az N-terminálisán, proteázzal hasítottuk, a kémiailag címkézett pepiidet címkére specifikus monoklonális ellenanyag alkalmazásával visszanyertük, és a pepiidet azután MALDI-ToF-fal elemeztük. A p53-fehérje Dr. Borek Volisek (University of Brno, Czech Republic) ajándéka volt. 100 pg p53-fehérjét módosítottunk (metil-szulfonil)-etilkarbonát szukcinimid-észterével Mikolajczyk és mtsai. [Bioconjugate Chem. 7, 150-158. old. (1996)] eljárása szerint a lizin-oldalláncok blokkolás érdekében. A blokkolt fehérjét 1 mg/ml koncentrációban feloldottuk 0,1 M nátriumbikarbonát, pH 8,5 pufferben, és NHS-SS-biotint (Pierce, Chester, UK) adtunk hozzá 100 pg/ml végkoncentrációban. A reakciót 6 órán át végeztük szobahőmérsékleten, és etanolaminnal állítottuk le. A fehérjekeveréket azután Sephadex G25 oszlopon (Pharmacia, Milton Keynes, UK) engedtük át PBS-ben, és a kizárási térfogatot összegyűjtöttük az eluátum A280 mérésével. 40 μΐ eluátumot (amely 2 pg p53-fehérjét tartalmaz) hővel denaturáltuk (95°C, 5 perc), 37°C-ra hűtöttük, és 1 pg endoproteináz-Arg-C-t (C. hystoliticumból, Calbiochem, Nottingham, UK) adtunk hozzá, és a keveréket 37°C-on inkubáltuk 1 órán keresztül. Azután 10 pl PBSbe szuszpendált sztreptavidin-agarózt (Sigma, Poole, UK) adtunk hozzá, és a keveréket 10 percig ráztuk. Az agarózt lecentrifugáltuk 16000 g-n 1 perc alatt, és háromszor mostuk TSO-pufferrel (75 mM Tris HC1, 200 mM NaCl, 0,5% Noktil-glükozid, pH 8), és háromszor TSMK-puf f erben (10 mM Tris HC1, 200 mM NaCl, 5 mM 2-merkaptoetanol, pH 8) . Végül 10 pl telített alfa-ciano-4-hidroxifahéjsav 1% vizes trifluorecetsav/acetonitri1 (1:1 v/v) elegyben lévő oldatát adtuk a mosott gyöngyökhöz, és 1 μΐ-t vittünk fel a tömegspektrométer „chip-jéré. Az elemzést Perseptive Biosystems Voyager-DE STR Bio spectrometry Workstation (Perseptive Biosystems) készüléken végeztük. A tömegspektrumokat 200 lézerlövés spektrumának összeadásával gyűjtöttük.
Az eredmények egy fő csúcsot mutattak, amely a 65 aminosav hosszúságú N-terminális Arg-C-endoproteináz fragmensnek felel meg, egyéb szignifikáns p53 Arg-C-csúcs nélkül.
6. példa
Az 5. példa eljárását ismételtük meg azzal a kivétellel, hogy az N-terminálisán biotinnal címkézett pepiidet egyláncú Fv-ellenanyag izolálására alkalmaztuk egyláncú Fvdomének fág-prezentációs könyvtárából. Azt követően az egyláncú Fv-domént alkalmaztuk az N-terminális peptidfragmens tesztfehérje proteázos emésztményéből történő izolálására, MALDI-ToF-fal igazolva. Normál emberi agy extraktumát - a 4. példa szerint preparálva - KLH-hoz konjugáltuk Harlow és Lane eljárása szerint [„Antibodies, kiad.: Cold Spring harbor Publications (1988)], és két balb-C egér immunizálására alkalmaztuk. Két dózist adtunk intraperitoneálisan négy héttel a kettő között. 3-4 nappal a második oltás után az egereket feláldoztuk, és a lépeket boncolással eltávolítottuk. Azután lép-RNS-t izoláltunk QuickPrep™ mRNA purification kit (Pharmacia) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint.
A Pharmacia Recombinant Phage Antibody System-et (Pharmacia) alkalmaztuk egér egyláncú Fv-domének (ScFv) könyvtárának előállítására. A cDNS első szálát az mRNS-ből
*.? J. .·” állítottuk elő M-MuLV reverz transzkriptáz és random hexamer láncindítók alkalmazásával. Az ellenanyag nehéz és könnyű láncok génjeit azután specifikus, az ellenanyag variábilis régióit körülvevő konzervált szekvenciákkal komplementer, nehéz és könnyű láncra specifikus láncindítók alkalmazásával amplifikáltuk. A nehéz és könnyű lánc DNS-éből készített, sorrendben 340 és 325 bázispár hosszúságú termékeket agaróz-gélelektroforézist követően külön-külön tisztítottuk. Azután ezeket egyetlen ScFv-konstrukcióvá állítottuk össze egy DNS kapcsolószekvencia/láncindító keverék alkalmazásával, annak érdekében, hogy a VH régiót egy (Gly4Ser) 3-peptiddel a VL régióhoz kapcsoljuk. Az összeállított ScFv-t az 5' és 3' végeken sorrendben az Sfil és NotI restrikciós helyek beillesztésére tervezett láncindítókkal amplifikáltuk, 800 bázispár hosszúságú terméket eredményezve. Ezen fragmenst tisztítottuk, és egymás után emésztettük Sfil és NotI enzimekkel, és újra tisztítottuk. Azután a fragmenst az Sfil és NotI enzimekkel emésztett pCANTAB 5 fagemid vektorba ligáltuk. A pCANTAB 5 vektor tartalmazza a 3-as fágfehérje génjét (g3p), és az ScFv-t a g3p szignálszekvenciája mellé illesztettük be oly módon, hogy g3p fúziós fehérjeként expresszálódjon. Kompetens E. coli TGl-sejteket transzformáltunk a pCANTAB 5/scfv fagemiddel, majd azt követően az M13KO7 segítő fággal fertőztük. A kapott rekombináns fágok tartalmazták az ScFv-géneket kódoló DNS-t, és a rekombináns ellenanyag egy vagy több példányát prezentálta fúziós fehérjeként a csúcsukon.
• · · 9 · ·*·· ·· ··· ··
Azután a peptidekhez kötődő, fág által prezentált ScFv-ket szelektáltunk vagy dúsítottunk „panning révén. Röviden, az 1. példából való, biotinilált és proteázzal kezelt p53-preparátumot sztreptavidinnel bevont üveglemezre (Radius Biosciences, Waltham, USA) vittük fel, és a lemezt négyszer mostuk PBS-sel. 2%-os zsírmentes tejporral való blokkolást követően alkalmaztuk a fágpreparátumot, és 1 órán keresztül inkubáltuk. TBS/0,05% Tween-20 pufferrel történő 10-szeri mosás után a pepiiddel reagáló rekombináns fágokat tormaperoxidázzal konjugált anti-M13 ellenanyaggal detektáltuk, és o-fenilén-diamin kromogén szubsztráttal mutattuk ki. Ezen fágokat azt követően 0,1 M glicin HC1, pH 2,2 és 1 mg/ml BSA pufferrel eluáltuk, és 2 M Trisbázissal semlegesítettük. Az eluált fágokat 25 ml J tápoldatban tenyésztett JM103-sejtben szaporítottuk. Két további „panning menetet hajtottunk végre, és végül 10 tarföltöt izoláltunk, azokat összeöntöttük és felszaporítottuk. Egy 1O10 fágot tartalmazó alikvotot 2 órán keresztül inkubáltunk 4°C-on 0,1 pg biotinilált és endoproteináz-Arg-C-vel emésztett p53-fehérjével TSO-pufferben. Két óra elteltével 0,5 pg anti—M13 (Pharmacia) ellenanyagot adtunk hozzá TSOpufferben, és inkubáltuk 1 órán keresztül, ami után 5 pl Protein A/G agarózt (Sigma) adtunk a keverékhez, és további fél órán kereztl inkubáltuk keveréssel. Azután az agaróz gyöngyöket lecentrifugáltuk, mostuk mint a fenti 1. példában és tömegspektrometriával elemeztük.
• · · · · ·«·· ·« ·· · · *
Az eredmények ugynazt az egy fő csúcsot mutatták, mint az 1. példában, amely a 65 aminosav hosszúságú N-terminális Arg-C-endoproteináz fragmensnek felel meg.
7. példa
Ebben a példában egy tesztfehérjét kódoló génfragmenst írtunk át egy polihisztidin címkét kódoló szintetikus oligonukleotiddal. A cDNS-t in vitro transzkripcióval és transzlációval (IVTT) expresszáltuk, és a címkézett peptidfragmenseket nikkel-kelát oszloppal izoláltuk. Ezen fragmenseket alkalmaztuk azután egyláncú Fv-ellenanyagfragmensek izolálására. Azt követően az egyláncú Fv-domént alkalmaztuk egy peptidfragmens tesztfehérje proteázos emésztményéből történő izolálására, tömegspektrometriával igazolva.
8. példa
A 6. példa eljárását ismételtük meg sejtekből származó totál fehérjepreparátum alkalmazásával, és a kémiailag címkézett peptidet alkalmaztuk egyláncú Fv-ellenanyagfragmensek csoportjának izolálására. Azt követően ezen egyláncú Fv-domének közül 12-nek a keverékét alkalmaztuk peptidfragmensek tesztfehérje proteázos emésztményéből történő izolálására, és tömegspektrometriás elemzésére.

Claims (51)

  1. • · · f · • ·· · ·· ·♦· ··
    Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás fehérjék azonosítására, szkrínelésére és/vagy szekvenálására azzal jellemezve, hogy olyan egyedi fehérjék könyvtárát biztosítjuk, amelyek közül egy vagy több a jelentőséggel bíró célanyaghoz képes kötődni, és minden egyes egyedi fehérje egy „vonalkódot tartalmaz a szekvenciájában, amely alkalmas az egyes egyedi fehérjék azonosítására a könyvtárban.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy egyedi „vonalkód szekvenciákként a könyvtár egyedi fehérjéit kódoló génekbe illesztett egy vagy több nukleinsav-szekvenciát alkalmazunk.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a „vonalkód szekvenciát vagy szekvenciákat egy vagy több endoproteinázos felismerési hellyel szegélyezzük.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy felismerési helyként endopeptidáz, például enterokináz vagy Faktor-Xa felismerési helyét alkalmazzuk.
  5. 5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fehérjék könyvtárát érintkezésbe/kapcsolatba hozzuk egy vagy több cél-molekularésszel, például fehérj ével.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fehérjét és egy vagy több cél-molekularészt úgy hozzunk érintkezésbe/kapcsolatba, hogy azok oldatban kötődhet nek egymáshoz.
    • · · · · ·
  7. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kötődés után a fehérje/peptid molekularészeket izoláljuk, és endoproteázzal emésztjük azokat a „vonalkód szekvencia vagy szekvenciák felszabadítására.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a felszabadított „vonalkód szekvenciát vagy szekvenciákat egy vagy több oligonukleotid, például láncindító tervezésére alkalmazzuk a fehérjéket kódoló egy vagy több gén visszanyerésére vagy amplifikálására, amelyek kötődnek a cél-molekularész(ek)hez.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy tömegspektrometriát alkalmazunk bármely felszabadított „vonalkód szekvencia tömegének meghatározására, miáltal a felszabadított szekvencia vagy szekvenciák azonosíthatók, vagy közvetlenül tömegspektrometriát alkalmazunk bármely felszabadított „vonalkód szekvenciájának meghatározására.
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy fehérjék könyvtáraként ellenanyagok könyvtárát alkalmazzuk.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy fehérjék könyvtáraként ellenanyag-domének, például rekombináns ellenanyag-domének, például ellenanyag variábilis régióit tartalmazó Fv-domének könyvtárát alkalmazzuk.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy két láncból (nehéz és könnyű láncból származó láncokból, VH-ból és VL-ből) álló Fv-doméneket tartalmazó könyvtárat alkalmazunk.
    j. ..·
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan VH és VL láncokat alkalmazunk, amelyek mindegyike saját „vonalkód szekvenciát tartalmaz.
  14. 14. A 10-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a Fv-szekvenciához képes Cterminális helyzetű „vonalkód szekvenciát alkalmazunk.
  15. 15. Fehérjék 1-14. igénypontok bármelyike szerint definiált könyvtára.
  16. 16. Eljárás fehérjekönyvtár szkrinelésére azzal jellemezve, hogy a könyvtárat egy vagy több kívánt tulajdonságra szkrineljük, majd dereplikáljuk egy vagy több, a kívánt tulajdonsággal rendelkező egyedi könyvtár-fehérje azonosítására.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a könyvtárat egy cél-molekularészhez történő kötődésre szkrineljük.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kötődést tömegspektrometriával, előnyösen „matrix-assisted laser desorption/ionisation time-offlight (MALDI-ToF) spektrometriával detektáljuk.
  19. 19. A 16. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a könyvtárat specifikus biológiai aktivitásra szkrineljük.
  20. 20. A 17. vagy 18. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy célanyagként komplex keveréket alkalmazunk, például molekulák, egész sejtek vagy sejtmembránok keverékét.
    • · · ·· · a. .··
  21. 21. Eljárás fehérjék azonosítására és/vagy szekvenálására azzal jellemezve, hogy olyan egyedi fehérjék könyvtárát biztosítjuk, amelyek közül egy vagy több kötődhet a jelentőséggel bíró célanyaghoz, és minden egyes egyedi fehérje a génjével együtt egy „kapcsoló molekularészhez van kötve.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fehérjék könyvtárát érintkezésbe hozzuk az érdeklődés tárgyát képező célanyaggal akár a „kapcsoló molekularész alkalmazása előtt, akár azután.
  23. 23. A 21. vagy 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a célanyaghoz való kötődésre történő szkrínelés után a könyvtárat dereplikáljuk egy vagy több, kívánt tulajdonsággal rendelkező, célanyaghoz kötődő fehérje azonosítására.
  24. 24. A 21-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy „kapcsoló molekularészként részecskét alkalmazunk.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy részecskeként latex gyöngyöt alkalmazunk.
  26. 26. A 21-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy „kapcsoló molekularészként fehérjét vagy fehérjekomplexet alkalmazunk.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy „kapcsoló molekularészként avidint vagy sztreptavidint alkalmazunk, és minden egyes könyvtárbeli fehérje és kapcsolt génjeik biotiniláltak.
    • · « ·· ·
    4. ..·
  28. 28. A 21. vagy 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy „kapcsoló molekularészként mind a fehérjékhez, mind a génekhez kötődni képes bispecifikus kötőmolekulát alkalmazunk.
  29. 29. A 21-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy „kapcsoló molekularészként élő sejtet vagy vírust, például baktériumot vagy bateriofágot alkalmazunk.
  30. 30. A 21-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy egy vagy több olyan molekulát kötünk a „kapcsoló molekularészhez, amelyek megváltoztatják a könyvtárban lévő fehérjék tulajdonságait.
  31. 31. A 21-30. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a könyvtárban lévő fehérjéket kódoló géneket az egyedi fehérjék szintézisét megelőzően kapcsoljuk a „kapcsoló molekularészhez.
  32. 32. A 21-31. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fehérjék könyvtáraként ellenanyag-fehérjék könyvtárát, például ellenanyag-domének, például Fv-domének könyvtárát alkalmazzuk.
  33. 33. Eljárás fehérjék azonosítására és/vagy szekvenálására azzal jellemezve, hogy olyan egyedi fehérjék könyvtárát biztosítjuk, amelyek közül egy vagy több kötődhet a jelentőséggel bíró célanyaghoz, és minden egyes egyedi fehérje egy egyedi „kódoló molekularészhez van kötve.
  34. 34. A 33. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy „kódoló molekularészként egyedi azonosító „kó dokkal rendelkező részecskéket alkalmazunk.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy „kódokként mérhető jel, például floureszcens, kemilumineszcens vagy radioaktív jelzők, vagy fizikai tulajdonság, például egyedi mintázat különböző arányait alkalmazzuk.
  36. 36. Eljárás fehérjék keverékeinek elemzésére azzal jellemezve, hogy:
    a. a fehérjekeveréket emésztjük vagy hasítjuk;
    b. a kapott peptideket frakciónáljuk; és
    c. a kapott peptideket elemezzük azok tömege és/vagy szekvenciája szerint.
  37. 37. A 36. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a (ii) lépésben a frakcionálást fehérjekötő reagensek könyvtárának alkalmazásával hajtjuk végre.
  38. 38. A 36. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kapott peptideket a frakcionálási lépés részeként fizikai úton frakciónáljuk és/vagy kémiailag címkézzük .
  39. 39. A 36. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kapott peptidekhez egy vagy több aminosavat addicionálunk a frakcionálási lépés részeként.
  40. 40. A 37-39. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy fehérjekötő reagensek könyvtáraként ellenanyagok vagy ellenanyag-fragmensek könyvtárát alkalmazzuk .
  41. 41. A 37-39. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy fehérjekötő reagensekként fő
    - 95 - .........
    • « · · · « a ♦ w ···
    4 4*« · »««l · * « hisztokompatibilitási fehérjéket, T-sejt receptorokat és fehérje-fehérje kötési kölcsönhatásban részt vevő fehérjéket vagy fehérjedoméneket, például SHl-doméneket alkalmazunk.
  42. 42. A 40. vagy 41. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy fehérjekötő reagensek könyvtárát előzetesen szelektáljuk az elemzés alatt álló fehérjekeverékből vagy egy rokon fehérjekeverékből származó egy vagy több fehérjéhez vagy peptidhez történő kötődésre.
  43. 43. A 42. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy normalizált rekombináns génkönyvtárból származó fehérjekeveréket alkalmazunk.
  44. 44. A 36-43. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fehérjekeveréket kezdetben szilárd fázishoz kötjük az emésztést vagy hasítást megelőzően, akár az N- vagy C-terminálison keresztül, akár specifikus aminosavakon vagy aminosavak specifikus szekvenciáin keresztül.
  45. 45. A 36-43. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy származtatjuk a fehérjékben található specifikus aminosavakat vagy módosított aminosavakat a szilárd fázishoz történő kötést megelőzően, amely kötés a fehérjekeverékek emésztése vagy hasítása előtt vagy után történik.
  46. 46. A 45. igénypont szerinti eljárás azzal jelle mezve, hogy a specifikus vagy módosított aminosavakat biotinnal származtatjuk avidinhoz vagy sztreptavidinhoz történő kötést megelőzően.
  47. 47. A 45. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a specifikus vagy módosított aminosavakat ligandumokkal származtatjuk ligandum-specifikus affinitási reagensekhez történő kötést megelőzően.
  48. 48. A 36-43. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy specifikus, fehérjékben található természetesen módosított aminosavakat kötünk a szilárd fázishoz módosításra specifikus affinitási reagensek alkalmazásával a fehérjekeverékek emésztése vagy hasítása előtt vagy után.
  49. 49. A 45-48. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy egynél több emésztési/hasítási és származtatási ciklust hajtunk végre.
  50. 50. A 49. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az emésztés vagy hasítás minden ciklusa után tömeg szerint elemzést hajtunk végre.
  51. 51. A 36-50. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az emésztés/hasítás után felszabadított peptideket fizikai eljárásokkal, például HPLC-vel frakcionáljuk a fehérjekötő reagensekkel történő frakcionálás előtt vagy után.
    A meghatalmazott:
    Molnár Imre szabadalmi ügyvivő
HU0200400A 1999-03-23 2000-03-17 Protein isolation and analysis HUP0200400A3 (en)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9906551.8A GB9906551D0 (en) 1999-03-23 1999-03-23 Display of proteins
GBGB9907057.5A GB9907057D0 (en) 1999-03-29 1999-03-29 Protein analysis
GBGB9907641.6A GB9907641D0 (en) 1999-04-06 1999-04-06 Protein analysis
GBGB9914874.4A GB9914874D0 (en) 1999-06-28 1999-06-28 Protein analysis
GBGB9915363.7A GB9915363D0 (en) 1999-07-02 1999-07-02 Protein analysis
GBGB9915677.0A GB9915677D0 (en) 1999-07-06 1999-07-06 Protein analysis
GBGB9916511.0A GB9916511D0 (en) 1999-07-14 1999-07-14 Protein analysis
GBGB9920503.1A GB9920503D0 (en) 1999-08-31 1999-08-31 Protein analysis
GBGB9922285.3A GB9922285D0 (en) 1999-09-21 1999-09-21 Protein analysis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0200400A2 true HUP0200400A2 (hu) 2002-05-29
HUP0200400A3 HUP0200400A3 (en) 2006-06-28

Family

ID=27576378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0200400A HUP0200400A3 (en) 1999-03-23 2000-03-17 Protein isolation and analysis

Country Status (18)

Country Link
EP (1) EP1163519B1 (hu)
JP (1) JP2003536048A (hu)
KR (1) KR20020021779A (hu)
CN (1) CN1344370A (hu)
AT (1) ATE334391T1 (hu)
AU (1) AU772069B2 (hu)
BR (1) BR0009206A (hu)
CA (1) CA2366559C (hu)
CZ (1) CZ20013399A3 (hu)
DE (1) DE60029572T2 (hu)
ES (1) ES2265917T3 (hu)
HK (1) HK1045561A1 (hu)
HU (1) HUP0200400A3 (hu)
MX (1) MXPA01009567A (hu)
NO (1) NO20014584L (hu)
PL (1) PL350318A1 (hu)
SK (1) SK13242001A3 (hu)
WO (1) WO2000057183A1 (hu)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE0001670D0 (sv) * 2000-05-04 2000-05-04 Forskarpatent I Syd Ab Mass-spectrometry-based biosensor
AU2002231339A1 (en) * 2000-10-23 2002-05-06 Altus Biologics Inc. High throughput screening for protein formulations
WO2003052101A1 (en) * 2001-12-14 2003-06-26 Rosetta Inpharmatics, Inc. Sample tracking using molecular barcodes
DE50308797D1 (de) * 2002-05-10 2008-01-24 Proteome Factory Ag Festphasenassisitierte spektroskopische und spektrometrische analyse komplexer biopolymergemische
EP1361438A1 (de) * 2002-05-10 2003-11-12 Proteome Factory AG Festphasenassistierte spektroskopische und spektrometrische Analyse komplexer Peptidgemische
DE10227599B4 (de) * 2002-06-20 2005-04-28 Proteome Factory Ag Verfahren und Reagenz zur spezifischen Identifizierung und Quantifizierung von einem oder mehreren Proteinen in einer Probe
CN1314968C (zh) * 2004-03-11 2007-05-09 复旦大学 痕量多肽或蛋白质富集及其直接分析方法
AU2006273702A1 (en) * 2005-07-28 2007-02-01 Biosystems International Sas Normalization of complex analyte mixtures
US8148085B2 (en) * 2006-05-15 2012-04-03 Sea Lane Biotechnologies, Llc Donor specific antibody libraries
AU2007249160B2 (en) * 2006-05-15 2013-09-12 I2 Pharmaceuticals, Inc. Neutralizing antibodies to influenza viruses
KR100698466B1 (ko) * 2006-11-30 2007-03-21 한국정보통신대학교 산학협력단 질량 변화량 목록을 이용한 상향식 단백질 변형 탐색 방법및 프로그램 저장 매체
EP2232258A4 (en) * 2007-12-05 2011-01-05 Govt Of The U S A As Represented By The Secretary Of The Dept Of Health & Human Services IMPROVED VIRAL PROTEIN QUANTIFICATION AND VACCINE QUALITY CONTROL THEREWITH
CN102203281B (zh) * 2009-08-21 2013-04-17 赛业（广州）生物科技有限公司 复制条码筛选检测
AU2010291498A1 (en) * 2009-09-07 2012-02-02 F. Hoffmann-La Roche Ag ES-MS of glycopeptides for analysis of glycosylation
EP2436766A1 (en) * 2010-09-29 2012-04-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Means and methods for improved protein interaction screening
US20120173153A1 (en) * 2010-12-29 2012-07-05 Dow Agrosciences Llc Data analysis of dna sequences
AU2012249158B2 (en) * 2011-04-28 2017-06-29 Department Of Veterans Affairs Identification of polynucleotides associated with a sample
CN102703442A (zh) * 2012-05-08 2012-10-03 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种检测犬细小病毒的生物条形码及其应用
WO2014071182A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Massachusetts Institute Of Technology Directed evolution of synthetic gene cluster
WO2015163745A1 (ko) * 2014-04-25 2015-10-29 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 바코드 이동 분석을 위한 이중 리포터 시스템을 보유한 효모 균주
EP4270006A3 (en) 2014-06-13 2024-01-10 Immudex ApS General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
CN105277638A (zh) * 2014-07-22 2016-01-27 沈鹤霄 一种单克隆抗体IgG质谱测序方法
CN108602729B (zh) 2015-07-13 2022-07-05 皮沃特生物公司 改良植物性状的方法及组合物
JP2018537119A (ja) 2015-10-05 2018-12-20 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー リファクターされたｎｉｆクラスターを使用する窒素固定
CN106855477A (zh) * 2015-12-09 2017-06-16 中国科学院大连化学物理研究所 基于埃德曼降解的蛋白质c-末端肽富集方法
CN105651852A (zh) * 2016-01-11 2016-06-08 南昌大学 一种利用质谱数据分析蛋白交联位点的方法
DK3452591T5 (da) 2016-05-02 2024-09-09 Encodia Inc Makromolekyleanalyse under anvendelse af nukleinsyrekodning
WO2018078167A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 Universität Zürich Protein screening and detection method
BR112019014378A2 (pt) 2017-01-12 2020-02-11 Pivot Bio, Inc. Métodos e composições para o aprimoramento de traços de plantas
CN120041362A (zh) 2017-10-25 2025-05-27 皮沃特生物股份有限公司 用于改良固氮的工程微生物的方法和组合物
WO2019084342A1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Pivot Bio, Inc. GENETIC TARGETS FOR TARGETING NITROGEN FIXATION FOR IMPROVING PLANT CHARACTERISTICS
CN112272703B (zh) 2017-10-31 2024-12-27 Encodia公司 采用核酸编码和/或标签进行分析的试剂盒
WO2019089851A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Encodia, Inc. Methods and kits using nucleic acid encoding and/or label
SG11202007686VA (en) 2018-02-12 2020-09-29 10X Genomics Inc Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
GB2577150B (en) * 2018-06-06 2022-11-23 Bruker Daltonics Gmbh & Co Kg Targeted protein characterization by mass spectrometry
EP3814302A4 (en) 2018-06-27 2022-06-29 Pivot Bio, Inc. Agricultural compositions comprising remodeled nitrogen fixing microbes
JP2021531750A (ja) 2018-07-12 2021-11-25 ボード オブ リージェンツ, ザ ユニバーシティ オブ テキサス システムBoard Of Regents, The University Of Texas System オリゴヌクレオチドによる分子近傍検出
US12281299B2 (en) 2019-03-19 2025-04-22 Massachusetts Institute Of Technology Control of nitrogen fixation in rhizobia that associate with cereals
AU2020267119A1 (en) 2019-04-30 2021-11-18 Encodia, Inc. Methods for preparing analytes and related kits
US20220334124A1 (en) * 2019-09-03 2022-10-20 Sung Sub Kim Method for ultra-rapidly selecting signal peptide to which individual barcode system for increasing protein productivity is introduced
PH12022551163A1 (en) * 2019-11-13 2023-09-25 Amunix Pharmaceuticals Inc Barcoded xten polypeptides and compositions thereof, and methods for making and using the same
EP4073263A4 (en) 2020-01-07 2023-11-08 Encodia, Inc. METHOD FOR STABLE COMPLEX FORMATION AND CORRESPONDING KITS
CA3172637A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Pivot Bio, Inc. Measurement of nitrogen fixation and incorporation
US20250035639A1 (en) * 2023-07-25 2025-01-30 Quantum-Si Incorporated Protein quantification, tracking, and identification via peptide barcodes

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1545692A (en) * 1991-03-01 1992-10-06 Protein Engineering Corporation Process for the development of binding mini-proteins
WO1995016209A1 (en) * 1993-12-09 1995-06-15 Ciba-Geigy Ag Process for the production of combinatorial compound libraries

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0200400A3 (en) 2006-06-28
AU772069B2 (en) 2004-04-08
WO2000057183A1 (en) 2000-09-28
PL350318A1 (en) 2002-12-02
BR0009206A (pt) 2001-12-26
EP1163519A1 (en) 2001-12-19
CA2366559C (en) 2011-03-08
CA2366559A1 (en) 2000-09-28
CN1344370A (zh) 2002-04-10
EP1163519B1 (en) 2006-07-26
AU3307300A (en) 2000-10-09
ES2265917T3 (es) 2007-03-01
KR20020021779A (ko) 2002-03-22
SK13242001A3 (sk) 2002-09-10
NO20014584L (no) 2001-11-19
NO20014584D0 (no) 2001-09-21
DE60029572T2 (de) 2007-07-26
MXPA01009567A (es) 2003-08-19
HK1045561A1 (zh) 2002-11-29
CZ20013399A3 (cs) 2002-01-16
JP2003536048A (ja) 2003-12-02
DE60029572D1 (de) 2006-09-07
ATE334391T1 (de) 2006-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUP0200400A2 (hu) Fehérjék izolálása és elemzése
JP4870870B2 (ja) Ｒｎａ−タンパク質融合体を用いたタンパク質の選別
AU663055B2 (en) Peptide library and screening systems
US8207093B2 (en) Selection of proteins using RNA-protein fusions
EP0971946B1 (en) Selection of proteins using rna-protein fusions
AU2013300549B2 (en) Peptide library and use thereof
US20090233806A1 (en) Protein isolation and analysis
US7351540B1 (en) Protein isolation and analysis
JP7185929B2 (ja) タンパク質のスクリーニングおよび検出方法
AU2004201047A1 (en) Protein isolation and analysis
JP2008515419A (ja) 抗体ライブラリーをスクリーニングする方法
HK40085650A (en) Protein screening and detection method

Legal Events

Date Code Title Description
FD9A Lapse of provisional protection due to non-payment of fees