HUP0200026A2 - Eljárás terhelés által indukált asztma kezelésére - Google Patents

Abstract

A találmány olyan vegyületekre vonatkozik, amelyek elsődlegesen egy 4-es számmal jelzett foszfodiészteráz izozim (PDE4) egyik formájátgátolják vagy kötik, míg az enzimnek egy második formáját az előbbivelazonos vagy előnyösen annál kisebb mértékben kötik vagy gátolják. Avegyületek a mellékhatások csökkenése mellett alkalmazhatók asztmásbetegekben a terhelés által kiváltott bronchoconstrictio kezelésére. Ó

Description

73.216/DE ’ίχίΥ' közzétételi példány

P0 200 026 · ” -ELJÁRÁS TERHELÉS ÁLTAL INDUKÁLT ASZTMA KEZELÉSÉRE

A találmány olyan vegyületekre vonatkozik, amelyek elsődlegesen egy 4-es számmal jelzett foszfodiészteráz izozim (a továbbiakban PDE4) egyik formáját gátolják vagy kötik, míg az enzimnek egy második formáját az előbbivel azonos vagy előnyösen annál kisebb mértékben kötik vagy gátolják, és amely vegyületek ily módon felhasználhatók asztmás betegekben a terhelés által kiváltott bronchoconstrictio kezelésére. Az említett izoenzim formák — amelyekről feltételhető, hogy ugyanazon enzim neminterkonvertálható konformációinak az eltérő formái — egy archetipusos PDE4 inhibitor, a rolipram iránti kötési affinitás alapján különböztethetők meg egymástól. A rolipram nagy affinitással köti az egyik formának egy helyét, de a másik forma katalitikus helyéhez csak affinitással kötődik. A jelen leírásban az egyik formát a nagy affinitású rolipram kötő helynek, a másik formát pedig a kis affinitású rolipram kötő helynek nevezzük. A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás terhelés által indukált asztma (exercise induced asthma, EIA) szelektív kezelésére, amelynek során elsődlegesen a PDE4 izozimben lévő katalitikus helynek a kis affinitású formáját gátoljuk. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy eljárás terhelés által indukált asztma kezelésére, amelynek során egy elsődlegesen a kis affinitású kötőhelyhez kapcsolódó vegyületet adunk be.

A ciklikus nukleotid foszfodiészterázok (PDE-k) egy olyan enzimcsaládot alkotnak, amelynek tagjai a mindenütt előforduló intracelluláris második messenger adenozin-3¹,5'-monofoszfátot (cAMP) és guanozin-3',5'-monofoszfátot (cGMP) a megfelelő inaktív 5'-monofiszfát metabolittá hidrolizálják. A PDE izozimek legalább kilenc eltérő osztályának a létezését valószínűsítik, amelyek mindegyike egyedi fizikai és kinetikai jellemzőkkel rendelkezik, és amelyek mindegyike egy eltérő géncsaládnak a terméke. Az említett hét osztályt 1-től 9-ig tartó arab számok alkalmazásával különböztetik meg egymástól.

A találmány szerinti megoldással megcélzott (target) enzim a PDE4 izozim, magában foglalva az izozim valamennyi eltérő formáját és eloszlásának teljes tartományát az összes sejtben. Az izozim egy kis K_m értékű cAMP-szelektív enzim (cAMP K_m = 1-5 μΜ), amely a cGMP-vel szemben csak csekély aktivitást mutat (K_m > 100 μΜ) . Az említett izozimosztály tagjainak érdekes jellemzője, hogy két vagy több nem-interkonvertálható vagy egymásba csak lassan átalakítható formában léteznek, amely formák eltérő mértékű hatékonysággal kötik a rolipramot és más PDE4 inhibitorokat. Tehát ugyanaz a géntermék egynél több katalitikusán aktív konformációs állapotban létezhet. Lényeges, hogy az eltérő kötő formák egymáshoz viszonyított részaránya a szöveti sejttípustól függően változhat. Például a gyulladásos sejtek viszonylag nagy részarányban tartalmazhatják azt a formát, amely csak kis affinitással köti a rolipramot, míg az agysejtek és a parietalis sejtek azt a formát tartalmazhatják viszonylag nagy részarányban, amely nagy affinitással köti a rolipramot.

A találmány szempontjából különösen lényeges az izozimek említett osztályának a gyulladásban és a légúti simaizomban játszott szerepe. A vizsgálatok azt mutatják, hogy ez az izo zimosztály különleges szerepet játszik a cAMP szabályozásában különféle gyulladásos sejtekben (például hízósejtekben, bazofilekben, eozinofilekben, neutrofilekben és monocitákban) és a légúti simaizomban. A találmány szerinti megoldás különösen jól alkalmazható gyulladásos sejtek és légúti simaizom esetén; a humán monocitákban expresszált izozim típus különösen jelentős. Ezt az magyarázza, hogy a ciklikus AMP egy, a kemotaxis gátlására és a gyulladásos sejtek aktivációjára szolgáló második messengerként funkcionál. Ezenkívül a cAMP a légúti simaizom relaxációt is médiáija. Az előbbiek, valamint a PDE4-nek a cAMP metabolizációjában játszott jelentős szerepe indokolja a PDE4 inhibitorok további vizsgálatát; annak alapján, hogy a PDE4 inhibitorok fokozni képesek a leukocitákban és a légúti simaizomban a cAMP-tartalmat, a PDE4 inhibitorok gyulladásellenes és bronchodilatator aktivitással rendelkezhetnek.

A gyulladás kezelésére, illetve a bronchodilatatorokként jelenleg alkalmazott PDE inhibitorok, például az olyan hatóanyagok mint a theophylline és a pentoxyfyllin, minden megkülönböztetés nélkül valamennyi szövetben gátolják a PDE izozimeket. Ezeknek a vegyületeknek súlyos mellékhatásaik vannak, valószínűleg azért, mert szelektivitás nélkül gátolják az összes PDE izozimosztályt valamennyi szövetben. Ezt figyelembe kell venni az említett vegyületek terápiás profiljának az értékelésénél. A megcélzott betegség hatékonyan kezelhető az ilyen vegyietekkel, azonban a vegyületek másodlagos hatásokat mutathatnak, amelyek ha elkerülhetők vagy minimalizálhatók lennének, a hatóanyagok jelentősen mértékben növelhetnék bizonyos beteg ségek ily módon történő kezelésének a terápiás hatékonyságát. Összességében a fenti információk arra utalnak, hogy az adott szövetben vagy sejtben lévő elsődleges PDE új izozim-szelektiv inhibitorokkal történő megcélozásával a standard nem-szelektiv PDE inhibitor használatával kapcsolatos mellékhatások csökkenthetők. Bár az izozim-szelektiv PDE inhibitorok elvileg jobbak, mint a nem-szelektiv inhibitorok, az edigiekben tesztelt szelektív inhibitoroknak is vannak mellékhatásaik, mivel a kérdéses izozim gátlása kiterjed más vagy nem célzott szövetekre is. Például az anitdepresszánsként kifejlesztett szelektív PDE4 inhibitor rolipram klinikai vizsgálatai azt mutatják, hogy a hatóanyag pszichotrop aktivitással rendelkezik, valamint gastrointestinalis effektusokat, például gyomorégést, hányást és émelygést vált ki. Egy másik, a multiinfraktusos dementia kezelését célzó PDE4 inhibitor, nevezetesen a denbufylline mellékhatásaiként is gyomorégést, hányást és émelygést figyeltek meg. Feltételezhető, hogy ezeket a mellékhatásokat a PDE4-nek a központi idegrendszer és a gastrointestinalis rendszer specifikus területein történő gátlása okozza.

Schneider és munkatársai 1986-ban beszámoltak arról, hogy patkányagy homogenizátumokban nagy affinitású, sztereoszelektív 3

[ H]-rolipram kötőhelyek vennek, és leírták ezek jellemzőit is. Bár azt feltételezték, hogy ezek a kötőhelyek reprezentálják a patkányagy nem-kalcimodulin-függő, cAMP foszfodiészteráz (azaz PDE4) katalitikus helyét, az adatokban feltűnő anomália látszott. Hasonló, bár nem azonos kísérleti körülmények között nyert adatok azt mutatták, hogy a rolipram K_d = 1 nM értékkel rendelkezett, miközben a rolipram Ki = 1 μΜ aktivitással gátolta a patkányagy PDE4 aktivitást. Tehát ezerszeres eltérés volt a rolipramnak a kötőhely iránti affinitása, illetve a katalitikus aktivitást befolyásoló hatása között. Bár a PDE gátlás és a 3

[ H]-rolipram kötésért folyó versengés között minden részletre kiterjedő szerkezet/aktivitás összefüggést (structure activity relationship; SÁR) nem állapítottak meg, a rolipramnak mint PDE4 inhibitornak a hatékonysága és a kötőhelynél kifejtett hatékonysága közötti lényeges különbség kérdésessé teszi annak a megállapításnak a helytállóságát, miszerint mindkét aktivitást ugyanazon molekuláris hely foglalja magában.

Ennek a rejtélynek a megoldására számos vizsgál indult. Az egyik ilyen vizsgálatban annak az eldöntését tűzték ki célul, hogy a rolipram nagy affinitású kötőhelye ugyanazon a proteinen helyezkedik-e el, mint amelyiken a cAMP katalitikus hely van. Egy másik vizsgálatban azt kívánták meghatározni, hogy a PDE4 gátlása esetén ugyanaz a szerkezet/aktivitás összefüggés (SÁR) áll-e fenn, mint amilyen SÁR a nagy affinitású rolipram kötőhellyel történő versengést jellemzi. Egy harmadik vizsgálatban arra próbáltak magyarázatot találni, hogy — ha van egyáltalán — milyen biológiai szignifikancia lehet a fenti megfigyelések mögött, különös tekintettel ezek új hatóanyag-terápiák kifejlesztésére történő felhasználására.

A nagyszámú vizsgálatból nyert adatok összegzését követően nyilvánvaló vált, hogy a humán monocita rekombináns PDE4-en (hPDE4) legalább két olyan kötőforma van, amelyen az inhibitorok megkötődnek. Ezeknek a megfigyeléseinek az egyik magyará zata az, hogy a hPDE4 két eltérő formában létezik. Az egyik nagy affinitással köti meg a rolipram- és a denbufylline-szerű anyagokat, míg a másik ezeket a vegyületeket kis affinitással köti meg. A jelen leírásban a két formát a nagy (high) affinitású rolipram kötő forma (HPDE4), illetve a kis (low) affinitású rolipram kötő forma (LPDE4) jelöléssel különböztetjük meg egymástól.

Ezeknek a megfigyeléseknek a jelentősége annak felismerésében mutatkozik meg, hogy azok a vegyületek, amelyek hatékonyan versengenek a nagy affinitású rolipram kötő formáért (HPDE4), több mellékhatásuk van vagy intenzívebb mellékhatásaik vannak, mint azokénak, amelyek az LPDE4-gyel (kis affinitású rolipram kötő formával) versengenek. További adatok azt jelzik, hogy a vegyületeket a PDE4 kis affinitású kötő formájához irányíthatjuk, és hogy ez a forma különbözik attól a kötő formától, amelynek esetén a rolipram egy nagy affinitással kötődő anyag. Eltérő szerkezet/aktivitás összefüggés található a hatásukat a nagy affinitású rolipram kötő formánál, illetve a kis affinitású rolipram kötő formánál kifejtő inhibitorok esetén. Ezenkívül az említett két forma funkcionális szerepe is különbözik. Azok a vegyületek, amelyek a kis affinitású rolipram kötő formával lépnek kölcsönhatásba, gyulladásellenes hatásúak, míg azok, amelyek a nagy affinitású rolipram kötő formával lépnek kölcsönhatásba, mellékhatásokkal járnak vagy lényegesen erősebb mellékhatásokat okoznak.

Ezekre a megfigyelésekre nincs egyértelmű magyarázat. Valószínűsíthető azonban, hogy a PDE4 két eltérő tercier vagy kvaterner állaptoban létezhet. Feltételezhető, hogy mindkét forma katalitikusán aktív. A rolipram az egyik forma egyik katalitikus helyéhez nagy affinitással kötődik, ahol a jelen leírásban a nagy affinitást 10 nanomolnál kisebb Kj_ értékkel definiáljuk, és a másik formához kis affinitással kötődik, ahol a jelen leírásban a kis affinitást legalább 100 nanomol Ky értékkel definiáljuk.

Az előbbi megfigyelésekből az a hasznos következtetés vonható le, hogy lehetőség van azoknak a vegyületeknek az azonosítására, amelyek a cAMP katalitikus aktivitást elsődlegesen ott gátolják, ahol az enzim a rolipramot kis affinitással kötő formában van, miáltal mérséklődnek azok a mellékhatások, amelyek a rolipramot nagy affinitással kötő forma gátlásával állnak kapcsolatban.

A jelen találmány célja az, hogy a terhelés által indukált asztma (EIA), illetve a mellékhatások vonatkozásában a korábbiaknál lényegesen jobb terápiás indexet biztosítsunk.

A találmány tárgya tehát eljárás terhelés által indukált asztma kezelésére a gastrointestinalis és pszichotrop effektusok egyidejű minimalizálása mellett, amely eljárás során egy ilyen kezelést igénylő alanynak hatásos mennyiségben beadunk egy olyan vegyületet, amely vegyület legalább körülbelül 0,1 értékű IC50 aránnyal rendelkezik, ahol az arány a rolipramot nagy affinitással kötő PDE4 katalitikus forma IC50 értékének és a rolipramot kis affinitással kötő kötő forma IC50 értékének a hányadosa.

Az asztma egy komplex, többtényezős betegség, amelyet re verzibilis légúti obstrukció, légúti gyulladás és különféle farmakológiai és környezeti provokációk hatására fellépő nem-specifikus légúti hiperreaktivitás jellemez. A gyulladási és immun sejtekből felszabaduló különféle mediátorok tüdőödémát, bronchoconstrictiót és nyálka hiperszekréciót hoznak létre, amelyek a légutak morfológiájának a megváltozásához vezethetnek. Bizonyított tény, hogy az asztma manifesztációjáért felelős patologás folyamat hátterében főként a légutak gyulladása áll.

A terhelés által indukált asztmát (EIA) a légutak ellenállásának intenzív terhelés után néhány perc elteltével előforduló átmeneti növekedéseként definiálhatjuk. Az EIA az asztmás betegek 80-át, míg az allergiás rhinitisben szenvedő betegek 30-40 %-át érinti. A terhelés által indukált asztmában szenvedő betegekben a terhelés hiperventillációhoz, respirációs vízveszteséghez, valamint légúti lehűléshez vezet, amelynek hatására viszont a falósejtek olyan kémiai anyagokat tesznek szabaddá, amelyek a terhelés ideje alatt gyulladást, nyálkaszekréciót, simaizom-kontrakciót és vasodilatatiót váltanak ki.

A terhelésen kívül más tényezők is kiválthatják a légutak ellenálásának az átmeneti növekedését. Ilyen tényezők — egyebek mellett — például a környzeti szennyezőanyagok, például a kén-dioxid, valamint a hőmérsékleti változások, különösen a hideg levegő következtében fellépő hőmérséklet-változások. A szennyezőanyagok által indukált asztma (pollution-induced asthma, PIA) és a hideg levegő által indukált asztma (cold-air induced asthma, CIA) kezelése ugyancsak a találmány oltalmi kö9 rébe tartozik.

Ezekben a betegségekben a PDE4 inhibitorok szerepe a ciklikus adenozin-monofoszfátnak (cAMP) mint második messengernek a szerepén alapul. A cAMP széles körben szuppresszálja az immunsejtek és a gyulladási sejtek aktivitását. Ugyanakkor ismert, hogy a PDE4 a legfőbb cAMP-hidrolizáló izozim a simaizomban, bár úgy tűnik, hogy a PDE4 ilyen szempontból a simaizomban kevésbé domináns, mint a gyulladásos sejtekben.

A jelen leírásban a cAMP-nek azt a katalitikus helyét, amelyik a rolipramot kis affinitással köti, kis (low) affinitású kötőhelyként (LPDE4), míg a katalitikus helynek azt a formáját, amelyik a rolipramot nagy affinitással köti, nagy (high) affinitású kötőhelyként (HPDE4) jelöljük. _z 3

Az első kísérletekben a [ H]-rolipram kötés megállapítása és értékelése érdekében végeztünk vizsgálatokat. Ennek részleteit az alábbi 1. példában ismertetjük.

Annak érdekében, hogy eldönthessük, a nagy affinitású kötési aktivitás és a kis affinitású kötési aktivitás ugyanahhoz a géntermékhez kapcsolódik-e, ismert eljárásokkal élesztőt transzformáltunk, majd a rekombináns PDE4 expresszálását követően hatórás fermentációs periódust alkalmaztunk. Egy PDE4 ellen irányuló antitest alkalmazásával végzett Western-blot analízis azt jelezte, hogy az expresszált PDE4 mennyisége az idő előrehaladásával növekszik, és maximális értékét háromórás tenyésztés után éri el. Ezenkívül az immunoreaktív termék több mint 90 %-a az élesztő lizátumok nagy sebességű (100 000 χ g) felülúszójában volt. A protein expresszió folymata során mind10 végig nyomon követtük a [ H]R-(-)-rolipram kötést és a PDE aktivitást. A PDE4 aktivitás a rolipram kötési aktivitással együttesen expresszálódott, ami azt jelzi, hogy mindkét aktivitás ugyanahhoz a géntermékhez kapcsolódik. Hasonló eredményeket nyertünk a Western-blot analízissel is, ahol a roliprammal gátolható PDE aktivitás es a [ H]-rolipram kötési aktivitás több mint 85 %-a volt megtalálható az élesztő felülúszó frakcióban.

Összeségében a fenti rendszerben expresszálódott rekombináns PDE4 legnagyobb része LPDE4, és csak egy kis töredéke HPDE4. Ebből következően a rekombináns PDE4 katalitikus aktivitás gátlása elsődlegesen a vegyületeknek az LPDE4-nél kifejtett hatását tükrözi vissza. A PDE4 katalitikus aktivitás gátlását ily módon a vegyületek LPDE4-nél kifejtett hatékonyságának az mérőszámaként (indexeként) alkalmazhatjuk. A vegyületeknek a HPDE4-nél kifejtett hatékonyságát úgy értékelhetjük, hogy megvizsgáljuk, milyen mértékben képesek a vegyületek versengeni a 3

[ H]R-(-)-rolipramért. Annak érdekében, hogy mind a kis affinitású, mind pedig a nagy affinitású rolipram kötőhelyek esetén szerkezet/aktivitás összefüggést (SÁR) találjunk, két vizsgálati rendszerben meghatároztuk a kiválasztott vegyületek hatékonyságát. A standard vegyületek alkalmazásával végzett kísérletek eredményeit táblázatban foglaltuk össze. Amint az várható volt, bizonyos vegyületek egyértelműen hatásosabbak voltak a 3

[ H]-roliprammal folytatott versengésben azon a helyen, amelynél a rolipram bizonyítottan nagy affinitással kötődik, mint azon a helyen, amelynél a rolipram kis affinitással kötődik. A nagy affinitású kötés és a kis affinitású kötés közötti szerke zet/aktivitás összefüggés csak igen kevés közös jellemzőt mutat, amiből azt a következtetést vontuk le, hogy a nagy affini3 tású [ H]-rolipram kötés gátlásának szerkezet/aktivitás összefüggése eltér a kis affinitású rolipram kötőhelynél történő kötés szerkezet/aktivitás összefüggésétől. A szerkezet/aktivitás összefüggésre vonatkozó vizsgálat eredményeit az I. táblázatban foglaljuk össze.

I. táblázat

Vegyület	Kis affinitású ic50	Nagy affinitású ic50	Nagy/kicsi arány
1-(5-tetrazolil)-3-[3- - (ciklopentil-oxi)-4-metoxi- -fenil]-ciklopentán	1, 1	0,002	0,0018
cisz-{3-[3-(ciklopentil-oxi)- -4-metoxi-fenil]-1- -ciklopentánkarboxilát}	2,7	0,021	0,0078
N-{2-[3-(ciklopentil-oxi)-4- -metoxi-fenil]-etil}-oxamid	0,89	0, 012	0, 013
R-rolipram	0,31	0,004	0,013
N-{3-[3,4-bisz(difluor-metoxi)-fenil]-etil}-oxamid	1, 6	0,4	0,25
Ro 20-1724	2, 6	0,19	0,07
S-rolipram	Íz 1	0,095	0, 086

I. táblázat (folytatás)

Vegyület	Kis affinitású ic50	Nagy affinitású IC50	Nagy/kicsi arány
(R)-(+)-1-(4-bróm-benzil)-4- -[3-(ciklopentil-oxi)-4- -metoxi-fenil]-2-pirrolidon	4,0	0, 45	0,11
1-(4-amino-benzil)-[3- -(ciklopentil-oxi)-4-metoxi- -fenil]-2-imidazolidinon	1, 4	0,1	0, 07
denbufylline	0,29	0,05	0,17
3-[(ciklopentil-oxi)-4-metoxi- -fenil]-1-[4-N* -(Y-ciano-S- -metil-tioureido)-benzil]-2- -pirrolidon	0,1	0,03	0,30
(.R) - ( + ) -1- (4-bróm-benzil) -4- -[3-(ciklopentil-oxi)-4- -metoxi-fenil]-2-pirrolidon	0, 06	0,02	0,33
IBMX	29,1	20,3	0, 698
(S)-(-)-etil-{4-[3- -(ciklopentil-oxi)-4-metoxi- -fenil]-2-pirrolidinilidén}- -acetát	0,46	0,45	0, 98
Papaverin	10	10	1,0
cisz-{4-ciano-4-[3- -(ciklopentil-oxi)-4-metoxi- -fenil]-1-ciklohexánkarboxilát}	0,095	0,110	1, 1

I. táblázat (folytatás)

Vegyület	Kis affinitású ic50	Nagy affinitású ic50	Nagy/kicsi arány
cisz-{4-ciano-4-[3- -(ciklopropil-metoxi)-4- -(difluor-metoxi)-fenil]-1- -ciklohexanol}	0, 021	0,04	2,0
(R)-(+)-etil-{4-[3- -(ciklopentil-oxi)-4-metoxi- -fenil]-2-pirrolidinilidén}- -acetát	0, 14	0,3	2,143
2-(metoxi-karbonil)-4-ciano-4- -[3-(ciklopropil-metoxi)-4- -(difluor-metoxi)-fenil]-1- -ciklohexanon	0,140	0,5	3,571
trequinsin	1, 6	5, 0	3,125
dipyridamole	5,2	32,5	6,25

A denbufylline-t, azaz a 7-acetonil-l,3-dibutil-xantint a SmithKline Beecham állította elő. A papaverin az 1-[(3,4-dimetoxi-fenil)-metil]-6,7-dimetoxi-izokinolin. A trequinsin kémiai neve 2,3, 6,7-tetrahidro-2-(mezitil-imino)-9,10 dimetoxi-3-metíl-4H-pirimído[6,1-a]izokínolin-4-on. A dipirimadole generikus elnevezése 2,2',2,2'-[(4,8-dipiperidino-pirimido[5,4-d]pirimidin-2,6-diil)-dinitrilo]-tetraetanol.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy bizonyos vegyületek a nagy affinitású formával összehasonlítva szelektíven a kis affinitású formát gátolják, illetve más vegyületek esetén a szelektivitás fordított. Ennek a megfigyelésnek az a jelentősége, hogy lehetővé teszik a mellékhatások oly módon történő minimalizálását, hogy olyan vegyületeket tervezünk vagy választunk ki, amelyek szelektíven (elsődlegesen) az egyik helyet gátolják, miáltal a kívánt reakciót egy másik, nemkívánt válasz kizárásával váltják ki, illetve a nemkívánt választ legalább annyira minimalizálják, amely mértékben a nemkívánt mellékhatás már nem befolyásolja el nem fogadható mértékben a kívánt terápiát .

Az előbbi vizsgálatok ellenére még nem határoztuk meg a PDE4 izozimben lévő nagy affinitású kötés és kis affinitású kötés egymástól eltérő szerkezet/aktivitás összefüggésének az alapját. Felismertük azonban, hogy ha egy vegyület legalább körülbelül 0,1 értékű IC50 arányt mutat, ahol az arány a rolipramot nagy affinitással kötő PDE4 katalitikus forma IC₅₀ értékének és a rolipramot kis affinitással kötő kötő forma IC50 értékének a hányadosa, akkor a vegyületnek elfogadható terápiás indexe lesz. Más szavakkal ez azt jelenti, hogy az ilyen vegyülettel eredményesen kezelhetünk különféle immunológiai és gyulladásos betegségeket, ugyanakkor a vegyülettel egyáltalán nem vagy el nem fogadható mértékben nem okozunk más élettani jelenséget. A legelőnyösebb találmány szerinti megoldás értelmében gyulladásos vagy allergiás betegségek kezeléséhez a kis affinitású rolipram kötő helyet gátoljuk.

Vegyületek

A találmány olyan vegyületekre vonatkozik, amelyek legalább körülbelül 0,1 értékű IC50 aránnyal (nagy/kis kötés) rendelkeznek. Ebbe a körbe tartozik bármely, illetve valamennyi olyan vegyület, amely a jelen leírásban ismertetett teszt alapján PDE4 inhibitor, és amelynek IC50 aránya — a jelen lírásban ismertetett vagy más hasonló vizsgálattal — bizonyítottan a meghatározott tartományba esik. Különösen fontosak azok a vegyületek, amelyek a jelen találmány bejelentési napja előtt nem voltak szabadon felhasználhatók és/vagy amelyek nem voltak ismertek, illetve amelyeket az említett időpont előtt PDE4 inhibitorokként még nem teszteltek.

Az előbbi IC50 arány standardnak megfelelő vegyületek példáit az I. táblázatban ismertetjük, illetve további példák találhatók az 5 448 686., az 5 605 923. és az 5 552 438. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.

A találmány szerinti megoldásban alkalmazható vegyületek kiválasztásának az egyik előnyös módszere értelmében meghatározzuk azokat a vegyületeket, amelyek legalább körülbelül 0,1 értékű IC50 aránnyal rendelkeznek; ahol az arány egyik tagja az 1 nM [³H]R-rolipramnak a rolipramot nagy affinitással kötő PDE4 formához történő kötésének az IC50 értéke, míg másik tagja a rolipramot kis affinitással kötő forma PDE4 katalitikus aktivi, , 3 tasanak 1 μΜ [ H]-cAMP mint szubsztráttal történő gátlásának az IC50 értéke.

Előnyösek azok a vegyületek, amelyek 0,5-nél nagyobb IC50 aránnyal rendelkeznek, és különösen azok a vegyületek, amelyek16 nek IC50 aránya 1,0-nél nagyobb. A túlnyomórészt a kis affinitásé kötési helyhez kötődő és 0,1-nél nagyobb IC50 aránnyal rendelkező vegyületek példái közé tartoznak — egyebek mellett — a következő vegyületek: cisz-{4-ciano-4-[3-(ciklopentil-oxi)-4-metoxi-fenil]-1-ciklohexánkarboxilát}, 2-(metoxi-karbonil)-4-ciano-4- [3-(ciklopropil-metoxi)-4-(difluor-metoxi)-fenil]-1-ciklohexanon és cisz-{4-ciano-4-[3-(ciklopropil-metoxi)-4-(difluor-metoxi)-fenil]-1-ciklohexanol}.

A találmány szerinti vegyületeket és gyógyászatilag elfogadható sóikat a jelzett betegség kezelésére szolgáló szokásos módokon, például orális, parenteralis, sublingualis, transdermalis, rectalis, inhalációs vagy buccalis beadással alkalmazhatjuk. Szabályozott hatóanyag-felszabadítású készítményeket is felhasználhatunk.

Az orális beadáskor aktív találmány szerinti vegyületeket szirupokká, tablettákká, kapszulákká, szabályozott hatóanyag-felszabadítású készítményekké vagy gyógycukorkákká formálhatjuk. A szirupkészítmények általában a vegyületnek vagy sójának egy folyékony hordozóval, például etanollal, mogyoróolajjal, glicerinnel vagy vízzel készített szuszpenziójából vagy oldatából, valamint ízesítő- vagy színezőszerekből állnak. Ahol a kompozíció tablettaformában van, a szilárd készítmények előállítására szokásosan alkalmazott bármilyen gyógyszerészeti hordozót felhasználhatunk. Az ilyen hordozók körébe — egyebek mellett — például a következők tartoznak: magnézium-sztearát, gipsz, talkum, zselatin, akácmézga, sztearinsav, keményítő, laktóz és szacharóz. Ahol a kompozíció kapszulaformában van, bármely szokásos kapszulázási módszert felhasználhatjuk, például az előbbi hordozók alkalmazásával előállított kompozíciót kemény zselatin kapszulahéjba tölthetjük. Ahol a kompozíció lágy zselatin kapszula formájában van, a diszperziók vagy szuszpenziók előállítására szokásosan alkalmazott gyógyszerészeti hordozókat használhatunk, amilyenek — egyebek mellett — például a vizes gumik, cellulózok, szilikátok vagy olajok, majd az így előállított kompozíciókat lágy zselatin kapszulákba építjük be.

A jellegzetes parenteralis kompozíciók egy vegyületnek vagy sójának steril vizes vagy nemvizes horodzóval készített, adott esetben parenteralisan elfogdható olajokat, például polietilénglikolt, poli(vinil-pirrolidon)-t, lecitint, arachiszolajat vagy szezámolajat tartalmazó oldatából vagy szuszpenziójából állnak.

A tipikus inhalációs kompozíciók oldatok, szuszpenziók vagy emulziók formájában vannak, amelyeket száraz porként vagy hagyományos propellánsok, például diklór-difluor-metán vagy triklór-fluor-metán alkalmazásával aeroszol formájában adhatunk be.

A jellegzetes kúpkészítmények a találmány szerinti vegyületet vagy a vegyületnek egy ily módon történő beadáskor aktív gyógyászatilag elfogadható sóját, valamint kötőanyagot és/vagy lubrikánst, például polimer glikolt, zselatint, kakaóvajat vagy más alacsony olvadáspontú növényi viaszokat vagy zsírokat, illetve ezek szintetikus analógjait tartalmazzák.

A jellegzetes dermalis vagy transdermalis készítmények szokásos vizes vagy nemvizes vivőnyagot tartalmazó krémek, kenőcsök, lóciók vagy paszták, illetve a készítmények hatóanyagot tartalmazó tapaszok, flastromok vagy membránok is lehetnek.

A kompozíciók előnyösen egységdózisformában vannak, amilyenek például a tabletták, a kapszulák vagy az adagolt aeroszol dózisok, így a beteg egyszerűen tud egyetlen dózist bevenni .

Az orális beadásra szolgáló dózisegységek egyenként alkalmasan 0,3-60 mg/kg, előnyösen 1-30 mg/kg mennyiségben tartalmazzák a vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját. COPD kezelése esetén az előnyös dózisok 10-15 mg/kg mennyiségű hatóanyagot tartalmaznak. A parenteralis beadásra szolgáló dózisegységek egyenként alkalmasan 0,1-100 mg/kg mennyiségben tartalmazzák a vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját. Az intranasalis beadásra szolgáló dózisegységek egyenként és személyenként alkalmasan 1-400 mg, előnyösen 10-200 mg mennyiségben tartalmazzák a vegyületet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját. A topikális készítmények alkalmasan 0,01-5,0 tömeg% vegyületet tartalmaznak.

A hatóanyagot a kívánt aktivitás eléréséhez elegendő gyakorisággal, például naponta 1-6 alkalommal adhatjuk be. A hatóanyagot előnyösen napont 1-2 alkalommal, még előnyösebben naponta kétszer adjuk be.

A találmány szerinti vegyületeket krónikus állapotokban, valamint időszakosan, az adott stimulust megelőzendő felhasz nálhatjuk EIA, PIA és CIA megelőzésére vagy kezelésére. A találmány szerinti vegyületeket előnyösen hosszan tartó terápiá ban alkalmazzuk.

A találmány szerinti megoldás szerinti alkalmazás esetén nem várhatók el nem fogadható toxikológiai hatások.

A következő példák azt kívánják bemutatni, hogy hogyan valósíthatjuk meg és hogyan alkalmazhatjuk a találmány szerinti megoldást. A példák illusztratív jellegűek, a találmány oltalmi körét, illetve terjedelmét nem korlátozzák. Az oltalmi kört a mellékelt igénypontok határozzák meg.

Példák

Az alábbi, öt speciesre kiterjedő különféle vizsgálatokat alkalmaztuk a legalább körülbelül 0,1 IC50 arányú vegyületek kiválasztásához. A vizsgálatok a következők voltak: az izolált nyúl parietalis mirigyből származó savtermelés sitmulálása; az FMLP-indukált degranuláció (myeloperoxidáz felszabadulás) gátlása humán neutrofilekben; az FMLP-indukált O2 képződés gátlása tengerimalac eizinofilekben; az LPS-indukált TNF_a-termelés gátlása humán monocitákban; a hányás gátlása kutyákban; az antigén-indukált bronchoconstrictio gátlása tengerimalacokban; a reserpine-indukált hypothermia visszafordítása egerekben; és az egerekbe adoptívan transzferált humán monocitákból származó LPS-indukált TNF_a-termelés gátlása. A vizsgálatokat és az adatokat az alábbiakban részletezzük.

Statisztikai analízis

Annak a hipotézisnek a vizsgálatához, miszerint a PDE4 kis affinitású hely gátlása az ebbe az osztályba tartozó vegyületek gyulladásellenes hatásával áll összefüggésben, míg a nagy affinitású hely gátlásához bizonyos mellékhatások kialakulása társul, meghatároztuk különféle PDE4 inhibitoroknak a gyulladásos sejtműködést in vitro és in vivo blokkoló képességét, valamint in vitro és in vivo modellekben a vegyületeknek a mellékhatásokat okozó képességét. Annak összehasonlításához, hogy a PDE4 inhibitorok milyen mértékben képesek egy adott terápiás hatást vagy mellékhatást kiváltani attól függően, hogy a PDE4 kis affinitású kötőhelyét vagy nagy affinitású kötőhelyét gátolják, 2 in vitro vagy in vivo vizsgalatokban (r ) lineáris korrelációval vagy rangsorolási (rank-order) korrelációval (Spearman-féle Rho) összehasonlítottuk a vegyületeknek az izolált enzim katalitikus aktivitással vagy a nagy affinitású hellyel szembeni hatékonyságát. A lineáris korrelációval eldönthető, hogy egy vegyület a kis affinitású helynél vagy a nagy affinitású helynél kifejtett gátló képessége alapján felhasználható-e egy adott gyulladásellenes vagy mellékhatás kiváltására. A rangsorolási korreláció azt vizsgálja, hogy egy adott gyulladásellenes vagy mellékhatást kiváltó hatékonysági rangsor hasonlít-e a kis affinitású vagy a nagy affinitású hely gátlásánál észlelt hatékonysági rangsorhoz. Az r és a Spearman-féle Rho értékeket a STAT View II számítógépes programmal (Macintosh) számítottuk ki.

PDE4 versus rolipram nagy affinitású kötés

1. példa

Foszfodiészteráz és rolipram kötési vizsgálatok

1A. példa

Meghatároztuk, hogy az izolált humán monocita PDE4 és a hrPDE (humán rekombináns PDE4) elsődlegesen a kis affinitású 3 formaban van. így a szubsztrátként 1 μΜ [ H]cAMP alkalmazásával végzett standard PDE4 katalitikus aktivitás vizsgálatok alkalmazásával értékelhetjük a tesztvegyületeknek a PDE4 kis affinitású formájával szembeni aktivitását [Torphy et al., J. of Biol. Chem. , 267 (3), 1798-1804 (1992)].

Proteinforrásként patkányagy nagy sebességű felülúszókat 3 használtunk. 25,6 Ci/mmol fajlagos aktivitású [ H]-rolipram enantiomereket állítottunk elő. Az ismert eljárás [Torphy et al., J. of Biol. Chem., 267 (3), 1798-1804 (1992)] standard vizsgálati körülményeit úgy módosítottuk, hogy azonosak legyenek a PDE vizsgálati körülményeivel, kivéve a cAMP utolsó esetében: 50 mM Tris HC1 (pH 7,5), 5 mM MgC12, és 1 nN [ H]-rolipram. A vizsgálatot egy órán át 30 °C-on végeztük. A reakciót leállítottuk, majd egy Brandel sejtleválasztó alkalmazásával elválasztottuk a kötött ligandot a szabad ligandtól. A nagy affinitású kötőhely esetén a versengést ugyanolyan körülmények között értékeltük, mint amilyeneket a kis affinitású PDE aktivitás mérésére alkal3 3 máztunk, kivéve, hogy [ H]-cAMP és [ H]5'-AMP nem volt jelen.

Az I. táblázatban bemutatott adatokat az 1A. példában ismertetett protokoll alkalmazásával nyertük.

IB. példa

A foszfordiészteráz aktivitás mérése 3

A PDE aktivitást [ H]cAMP szcintillacios közelségi vizsgá3 lattal (scintillation proximity assay, SPA) vagy [ H]cGMP SPA enzim vizsgálattal, a gyártó (Amersham Life Sciences) használati utasításának megfelelően vizsgáltuk. A reakciókat 96-vájatú lemezeken, szobahőmérsékleten, 0,1 ml reakciópufferben hajtottuk végre, ahol a puffer összetétele a következő volt (végkoncentrációk) : 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8,3 mM MgC12, 1,7 mM EGTA, 3 3

[ H]cAMP vagy [ H]cGMP (hozzávetőleg 2000 dpm/pmol), enzim és az inhibitorok változó koncentrációi. A vizsgálatot egy órán keresztül folytattuk, majd 50 μΐ SPA ittrium-szilikát-gyöngy cink-szulfát jelenlétében végzett hozzáadásával leállítottuk a reakciót. A lemezeket összeráztuk, majd 20 percen keresztül szobahőmérsékleten állni hagytuk. A radioizotóppal jelzett termék képződését szcintillációs spektrometriával értékeltük. A 3

PDE3 es PDE7 aktivitást szubsztrátként 0,05 μΜ [ H]cAMP alkal3 mazasaval, míg a PDE4 aktivitást szubsztrátként 1 μΜ [ H] cAMP alkalmazásával mértük. A PDE1B, PDE1C, PDE2 és PDE5 aktivitást 3 μΜ [ H]cGMP mint szubsztrát alkalmazásával mértük. 3

[ H]R-rolipram kötési vizsgálat

A [ H]R-rolipram kötési vizsgálatot a Schneider és munkatársai által kidolgozott vizsgálatnak egy módosított változatával [lásd: Nicholson et al., Trends Pharmacol. Sci., 12, 19-27 (1991); és McHale et al._f Mol. Pharmacol., 39, 109-113 (1991)] hajtottuk végre. Az R-rolipram hozzákötődik a PDE4 katalitikus helyéhez [lásd: Torphy et al., Mol. Pharmacol., 39, 37 6-384 (1991)]. Ebből következően a [ H]R-rolipram kötésért történő versengés a jelzetlen versenytársak PDE4 inhibitor erősségének egy független megerősítését biztosítja. A vizsgálatot 30 °C-on egy órán át, 0,5 μΐ pufferben hajtottuk végre, ahol a puffer összetétele a következő volt (végkoncentrációk): 50 mM TrisHC1, pH 7,5, 5 mM MgC12< 0,05 % bovin-szérumalbumin, 2 nM

[ H]R-rolipram (5,7 χ 104 dpm/pmol) , és a radioizotóppal nem jelzett inhibitorok változó koncentrációi. A reakciót 2,5 ml , 3 jéghideg {[ H]R-rolipramot nem tartalmazó} reakciópuffér hozzáadásával állítottuk le, majd előzetesen 0,3 % poli(etilénimin)-be mártott Whatman GF/B filtereken gyors vákuumszűrést végeztünk (Brandel Cell Harvester). A filtereket további 7,5 ml hideg pufferrel mostuk, szárítottuk, majd folyadékszcintillációs spektrometriával számlálást végeztünk.

2. példa Amino-pirin akkumuláció Bizonyos metil-xantinok és más nem-szelektív PDE inhibitorok különféle speciesekben fokozzák a savszekréciót. Bizonyos PDE4 inhibitorok, amilyen például a rolipram és a Ro 20-1724, patkányokban fokozzák a savkiválasztást, különösen ha az említett inhibitorokat az adenilát-cikláznak egy aktivátorával, például hisztaminnal kombinálva alkalmazzuk. A savszekréciónak ez a növekedése együtt jár a hisztamin-indukált cAMP akkumuláció fokozódásával. A vegyületek savszekréciót indukáló képessége összefüggésben áll (korrelál) a vegyületeknek a kis affinitású hellyel, illetve a nagy affinitású hellyel szembeni képes ségével. A vizsgálat egy gyenge bázis, a radioizotóppal jelzett amino-pirin akkumulációjára irányult. A korábbiakban már beszámoltak arról, hogy az amino-pirin a fokozott savszekréció biológiai markereként funkcionál. A vizsgálatot az alábbiak szerint végeztük.

Gyomormirigy-preparálás

Mindkét nemhez tartozó nyulakat cervicalis dislocatióval euthanizáltunk, majd eltávolítottuk a gyomrot. A corpusról leválasztottuk a nyálkahártyát; a gyomor cranialis és antralis részét félretettük. A gyomormirigyeket a Berghlind és Obrink (1976), valamint a Sack és Spenney által ismertetett eljárások módosított változatával izoláltuk. A gyomormirigyek izolálásához a nyálkahártyát felaprítottuk, majd kollagenázzal emésztettük. A feltárt mirigyeket szűrtük, mostuk, majd 1:15 térfogatarányban a következő összetételű inkubációs közegben szuszpendáltuk: NaCl, 132,4 mM; KC1, 5,4 mM; Na₂HPO₄, 5,0 mM; NaH₂PO₄, 1,0 mM; MgSO₄, 1,2 mM; CaCl₂, 1,0 mM; NaHCO₃, 12,0 mM; nyúl szérumalbumin, 2 mg/ml; dextróz, 2 mg/ml; pH 7,4.

Amino-pirin akkumuláció

A sav szekréció meghatározásához Sack és Spinney (1982) 14 eljarasanak megfelelően a [ C]-amino-pirinnel, szelektív PDE4 inhibitor különböző koncentrációival és küszöbkoncentrációjú (0,3-1,0 μΜ) hisztaminnal kombinált gyomormirigyeket 20 percen keresztül 37 °C-on egy vízszintes rázógépen (110 ciklus/perc) inkubáltuk. A mintákat ezt követően centrifugáltuk, majd a fe lülúszókból és az üledékekből vett részletekben meghatároztuk a radioaktivitást. A Sack és Spinney (1982) által leírtaknak megfelelően kiszámítottuk az amino-pirin arányokat. Az adatokat a maximális koncentrációjú (100 μΜ) hisztamin által kiváltott válasz százalékaként fejeztük ki. Az egyes vegyületek esetén nyert maximális válasz alkalmazásával, lineáris interpolációval határoztuk meg az EC₅₀ értékeket.

3. példa

A szelektív PDE inhibitorok kutyákban kifejtett emeticus potenciáljának az értékelése

Az állattelepről kan és szuka korcs kutyákat szereztünk be (minden egyes vizsgálat esetén n = 5) . Az állatokat egy éjszakán keresztül koplaltattuk, majd a vizsgálat előtt legalább 30 perccel fél konzervdoboznyi kutyaeledelt (Big Bet) adtunk minden egyes kutyának. A hatóanyag beadásához az egyik mellső láb cephalicus vénájába kanült helyzetünk be. A kísérleti vegyület beadása előtt a kanült átöblítettük 1 ml izotóniás sóoldattal (0,9 tömeg%-os, vizes nátrium-klorid-oldattal) . A vegyületeket vagy polietilénglikolból és izotóniás sóoldat elegyében, vagy pedig tiszta polietilénglikolban oldottuk, majd az így nyert oldatokat 1,0-2,0 ml/10 kg térfogatnak megfelelő mennyiségben adtuk be. Annak érdekében, hogy a teljes dózis bekerüljön a vérkeringésbe, a kanült átöblítettük további 0,5-1,0 ml izotóniás sóoldattal. A ketrecbe visszahelyezett állatokat további egy órán keresztül megfigyeltük. Minden egyes kutyánál megfigyeltük az öklendezés és a hányás jeleit, valamint feljegyez tűk, hogy az ilyen jelek a vegyület beadása után mennyi idő elteltével fordulnak elő. A megfigyelési időszak végén az állatokat visszatettük a saját ketrecükbe. Az egyes vizsgálati napokat hét nap választotta el egymástól. Minden egyes vegyületet növekvő dózisban adtunk be a kutyáknak az egymást követő vizsgálati napokon, egészen addig, amíg emeticus effektusokat észleltünk. Ennél az időpontnál az egyedi kutyákat kivettük a vizsgálatból, és a nagyobb dózisokat csak azokban az állatokban értékeltük, amelyek még nem adtak válaszreakciót.

Az adatokat a szakirodalomban a kvantális dózis-válasz függvények esetén ismertetetteknek megfelelően az egyes dózisokra reagáló kutyák kummulatív százalékának formájában fejeztük ki. Probit analízis alkalmazásával szmítottuk ki az EC₅₀ értékét.

4. példa Tengerimalac eozinofil vizsgálat Az eozinofil izolálása és tisztítása

Hím (Hartley, Hazelton Labs) tengerimalacoknak a vizsgálat előtt 4-6 héten keresztül hetente 1 ml lószérumot adtunk be injekcióval. A lószérum injekciója után legalább 24 órával ketamin/xilazin keverékkel (88 mg; 12 mg/ml; 0,4 ml/kg) anesztetizáltuk az állatokat. Az anesztézia megkezdése után a peritonealis üreget kimostuk 50 ml meleg, steril 0,9 tömeg%-os vizes nátrium-klorid-oldattal. A mosófolyadékot egy 14 G katéter alkalmazásával összegyűjtöttük, majd egy 50 ml-es kónikus műanyag centrifugacsőbe helyeztük. Miután magukhoz tértek az altatás ból, a tengerimalacokat egy kéthetes pihenés után ismét felhasználhattuk a kísérletben.

A mosófolyadék 10 percen keresztül 400 χ g értékkel végzett centrifugálásával sejteket izoláltunk, majd a sejteket 35 ml foszfátpuffereit izotóniás sóoldatban (PBS) szuszpendáltuk, végül 10 ml izotóniás Percoll (1,075 g/ml) réteggel fedtük a szuszpenziót. A szuszpenziót 30 percen keresztül 300 χ g értékkel centrifugáltuk. A főként eozinofileket és eritrocitákat tartalmazó üledéket PBS-ben mostuk, majd az eritrocitákat lizáltuk. A sejteket 20 % magzati borjúszérumot (FBS) tartalmazó RPMI 1640 médiumban szuszpendáltuk, majd egy párásított, 5 %-os CO2 inkubátorban egy éjszakán keresztül 37 °C-on ínkubáltuk. Másnap a sejteket mostuk és PBS-ben szuszpendáltuk a sejtek életképességének (tripán-kék kizárás) és tisztaságának a meghatározásához.

Superoxid-anion (0? ) képződés

Tisztított eozinofileket (életképesség > 95 %, tisztaság > 90 %) 20 mM HEPES puffért (pH 7,4) és 0,1 % zselatint tartalma£ zó PBS-ben 1-2 χ 10 sejt/ml koncentrációban szuszpendáltunk. 96-vájatú lemezekre (1 χ 10⁵) eozinofilt helyeztünk, majd körülbelül egy órán át 37 °C-on inkubáltuk a lemezeket. A reakció megindítása előtt 10 perccel PDE4 inhibitorokat adtunk a vájatokba. A reakciót citokróm C (160 μΜ) és formil-Met-Leu-Phe (fMLP) 60 egység szuperoxid-dizmutáz (SÓD) jelenlétében végzett vagy SÓD nélküli hozzáadásával indítottuk meg. A citokróm C redukcióját különböző időperiódusoknál egy Dynatech MR 7000 le mezleolvasóval, 630 nm-es referencia hullámhossz mellett 550 nm-nél követtük nyomon. Az O₂ képződési sebességét lineáris regressziós analízissel határoztuk meg, amelynek során több időpontban, SÓD jelenlétében vagy SÓD nélkül a vájatok nettó abszorbanciáját alkalmaztuk. Az eredményeket az alapfelszabadulásra korrigált kontroll O₂ képződés százalékának a formájában fejeztük ki. A megfigyelt maximális gátlás szinusza 60 % volt, a log IC30 értékeket a koncentráció és az összevont 30 % lineáris interpolációjának az alkalmazásával számítottuk ki.

5. példa

Bronchoconstrictio tengerimalacokban

Hím Hartley tengerimalacokat (200-250 g/négyhetes, Hazelton Research, Denver, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok) oly módon szenzitizáltunk, hogy az 1. és a 4. napon mindkét combba intramuszkuláris injekcióval 0,35 ml izotóniás sóoldattal készített 5 tömeg/térfogat%-os ovalbumin-oldatot adtunk be (összesen 0,7 ml). A 25. nap után a tengerimalacok ismét felhasználhatók voltak.

Kísérleti eljárás

Ovalbuminra aktívan szenzitizált hím Hartley tengerimalacokat (600-800 g, Hazelton) a műtét előtt körülbelül 10-15 perccel nátrium-pentobarbitállal (40 mg/kg i.p.) anesztetizáltunk. A hatóanyag beadásához, a vérnyomás megfigyeléséhez és a lélegeztetéshez a jugularis vénát, a nyaki arétriát és a tracheát kanülláltuk [Deseret Intracath Vialon polimergyanta ra diopak katéterek (Deseret Medical, Inc., Sandy, Utah, Amerikai Egyesült Államok), 22 GA és 19 GA, valamint PE tubing 260]. A kolinerg interferencia minimalizálása érdekében bilaterális vagotomiát végeztünk. Az állatokat paralizáltuk (pancuronium-bromid, 0,1 mg/kg i.v.) és egy Harvard Rodent Respirator (model 683, Harvard Apparatus, South Natick, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával lélegeztettük (45 lélegzet/perc). A trachealis kanülnek egy oldalágában egy Elcomatic transzduktorral (Buxco Electronics, Sharon, Connecticut, Amerikai Egyesült Államok) mértük a légúti nyomásváltozásokat. Az egyszeri belélelegeztetés térfogatát úgy állítottuk be, hogy az oldalkarban a nyomás 8 cm^O értékű legyen (körülbelül 5 cm szobai levegő). A vérnyomást Stathan P23XL Physical Pressure Transducer (Viggo-Spectramed, Oxnard, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával mértük. A nyomásértékeket Grass Model 7D Polygraph (Grass Instrument Co., Quincy, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok) segítségével rögzítettük. A testhőmérséklet fenntartása érdekében a kísérlet ideje alatt az állatokat egy melegítőasztalon tartottuk.

Az antigén beadása előtt 10 perccel intravénásán beadtuk a tezstvegyületeket, illetve a vivőanyagokt. A 0. időpontban intravénásán 0,1 mg/kg ovalbumint adtunk be. Az antigén válasz csúcsértékénél intravénásán további 0,2 mg/kg ovalbumint adtunk be. Az összesen 0,3 mg/kg ovalbuminra adott maximális antigén válasz elérése után intravénás úton 1 ml/kg telített, vizes kálium- klorid-oldatot adtunk be, ami kiváltotta a maximális bron choconstrictiót.

6. példa

Az LPS-indukált TNF_a gátlása humán monocitákban

In vitro vizsgálatok

Annak meghatározásához, hogy a TNF_a gátlás kapcsolatban áll-e az LPDE4 vagy a HPDE4 gátlással, egy egész sorozat, az LPDE4-re és a HPDE4-re nézve különféle hatékonysággal rendelkező PDE4 inhibitort szkrineltünk arra vonatkozóan, hogy az inhibitorok in vitro milyen mértékben képesek gátolni humán monocitákban a lipopoliszacharidok (LPS) által stimulált TNF_a termelést. Rendkívül fontos volt, hogy a vizsgálatban primer humán sejteket alkalmazzunk, mivel a gyulladásos sejtekben zajló cAMP hidrolízisnél az LPDE4 és a HPDE4 relatív eloszlása drámai mértékű eltéréseket mutat a különböző speciesekben.

Módszerek

Normál humán donoroktól levett vér buffy coatjaiból vagy plazmaforézis maradékából frissen tisztított (Collata) humán perifériális vér monocitákban értékeltük a TNF_a gátlást. A monocitákat 1 χ 10 sejt/ml sűrűségben 24-vájatú multilemezekre helyeztük. A sejteket egy órán keresztül hagytuk megtaopadni, amelynek képletében a felülúszót leszívattuk, majd a vájatokba 1 ml firss médiumot (1 % magzati borjúszérumot és 10 E/ml penicillin/streptomicint tartalmazó RPMI-1640) adtunk. A sejteket a 100 ng/ml végkoncentráció eléréséhez szükséges mennyiségű LPS (E. coli 055:B5, Sigma Chemicals) hozzáadása előtt a tesztvegyületek nélkül vagy 1 nM és 1 mM közötti koncentrációjú tesztvegyület jelenlétében 45 percen keresztül inkubáltuk. A teszt vegyületeket 1:1 térfogatarányú dimetil-szulfoxid/etanol oldó szereleggyel szolubilizáltuk, majd oly módon hígítottuk, hogy a monocita tenyésztőközegben a dimetil-szulfoxidnak és az etanolnak is 0,5 % legyen a végkoncentrációja. A tenyészet felülúszókat 14-16 órás, 37 °C-on és 5 %-os CO₂ atmoszférában végzett inkubálás után eltávolítottuk a monocitákról, majd a sejttöredékek eltávolítása érdekében a felülúszókat 100 χ g értékkel centrifugáltuk. A citokin vizsgálatot vagy azonnal elvégeztük, vagy pedig a tenyészet felülúszóket -70 °C-on tároltuk a vizsgálatokig .

A TNF_a koncentrációkat egy ELISA (Winston) alkalmazásával mértük, amelynek során befogó antitestként egy rágcsáló (murine) monoklonális anti-humán TNF_a antitestet, második antitestként pedig egy poliklonális nyúl anti-humán TNF_a antitestet használtunk. A detektáláshoz előbb egy peroxidáz-konjugált kecske anti-nyúl antitestet (Boehringer Mannheim, katalógusszám: 605222), majd egy peroxidáz szubsztrátot (1 mg/ml ortofenilén-diamin 0,1 % karbamid-peroxiddal) adtunk a rendszerhez. A mintákban lévő TNF_a mennyiségeket egy E. coli—ban termelődő rekombináns humán TNF_a alkalmazásával felvett standard görbéből számítottuk ki. A humán TNF_a monoklonális antitesteket Kohler és Millstein eljárásának [Kohler and Millstein, Nature, 256, 495-497 (1975)] egy módosított változatával, rekombináns humán TNF_a-val immunizált BALB/c egerek lépjeiből állítottuk elő. A poliklonális nyúl anit-humán TNF_a antitesteket komplett Freund-adjuvánsban emulgeált rekombináns humán TNF_a-val ismételten immunizált New Zealand fehér nyulakból állítottuk elő.

Humán TNF_a termelés in vivo szuppresszálása adoptált peritonitis modellben Módszerek

Fél egység heparinizált vénás teljes vért vettünk le egészséges, gyógyszerrel nem kezelt önkéntesektől. A vért 25 °C-on 30 percen keresztül 800 χ g értékkel végzett centrifugálással Histopaque-1077-en rétegelve elkülönítettük a polimorfonukleáris leukocitákat. Kinyertük a limfocita/onocita részt, 2+ , 2+ .

majd Ca es Mg iont nem tartalmazó DPBS-sel (Dulbecco foszfátpufferelt fiziológiás sóoldattal) 25 °C-on 10 percen keresztül 1000 fordulat/perc sebességgel kétszer mostuk. Az üledéket 2+ 2 +

Ca es Mg iont nem tartalmazó DPBS-ben (5 ml) szuszpendáltuk, a szuszpenziót 25 °C-on 5 ml (szérummentes RPMI 1640 médiummal készített) Percoll-oldatra rétegeltük, majd 25 °C-on 30 percen át 550 χ g értékkel centrifugáltuk. A monociták felső 2+ 2 + rétégét eltavolitottuk, majd Ca és Mg iont nem tartalmazó DPBS-sel 25 °C-on 10 percen keresztül 1000 fordulat/perc sebességgel kétszer mostuk. A mosott monocita izolátumot 25 °C-on 6-10 x 10⁶ sejt/ml sűrűséggel Ca²⁺ és Mg²⁺ iont nem tartalmazó DPBS-ben szuszpendáltuk. Ugyanezzel az eljárással Source Leukocytes csomagokból is izoláltunk monocitákat. A monocita készítmények 65-90 % monocotát tartalmaztak, és a sejtek életképessége > 97 % volt (tripán-kék kizárás).

BALB/c egereket (Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusettsm Amerikai Egyesült Államok) négyes vagy ötös csoportokba osztottunk. A 18-25 g testtömegű és azonos korú egerek peritoneumába 0,5 ml 6-10 χ 10 monocita/ml monocitát injekci33 óztunk, amelynek során — annak érdekében, hogy minimalizáltjuk a monocitákat érő nyíróerőket és -feszültséget — 23 ga méretű tűt alkalmaztunk és a fecskendőre csak enyhe nyomást gyakoroltunk. A monociták beadását követően két percen belül elkezdtük az egerek vivőanyaggal vagy tesztvegyülettel 15 percen át végzett orális kezelését. Ezt követően az állatokba intraperitone2+ 2 + alis úton 0,2 ml (Ca és Mg iont nem tartalmazó DPBS-sel készített) 125 mg/ml koncentrációjú endotoxin [E. coli, W típus, Difco) oldatot injekcióztunk. Két órával később az állatokat szén-dioxid asphyxiatióval euthanizáltuk, és intraperitonealisan 1,5 ml 4 °C hőmérsékletű, Ca és Mg iont nem tartalmazó DPBS-t injekcióztunk az állatokba. A peritoneumot óvatosan masszíroztuk, majd a mosófolyadékot eltávolítottuk és jégben hűtött polipropilén csövekbe helyeztük. A mintákat 4 °C-on 5 percen keresztül 12 500 χ g értékkel centrifugáltuk, majd a felülúszókat új csövekbe helyzetük, és vagy -20 °C-on tároltuk, vagy pedig ELISA alkalmazásával a humán és egér TNF_a-ra nézve vizsgáltuk. Standard eljárások alkalmazásával kiszámítottuk az ED50 értékeket.

7. példa Humán neutrofil eljárások Izolálás és tisztítás

Heparinizált vérből Ficoll (Histopaque 1077) alkalmazásával végzett gradiens centrifugálás, majd az eritrociták eltávolítása érdekében dextrán szedimentációval neutrofileket (PMN-eket) izoláltunk. A még mindig visszamaradt eritrocitákat 30

2+ 2 + masdopercen keresztül vízzel lizáltuk, majd (Ca és Mg iont nem tartalmazó) 10X DB-PBS alkalmazásával helyreállítottuk az izotonicitást. A PMN-eket centrifugálással izoláltuk, ezt követően további egy alkalommal IX DB-PBS-sel mostuk, majd meghatároztuk a sejtszámot és (tripán kék festék kizárással) az életképességet. Az egyedi donoroktól függően a sejtszámot 0,75-1,5 x 10 sejt/ml értékre állítottuk be.

Degranuláció (myeloperoxidáz felszabadulás)

A fenti sejtszuszpenzió 0,1 ml-es részletét egy rázó vízfürdőben 5 gg/ml cytochalasin B jelenlétében 20 mM HEPES puffért (pH = 7,4) és 0,1 % zselatint tartalmazó Earles kiegyenlített sóoldatban (Earles Balanced Salt Solution) 5 percen keresztül 37 °C-on inkubáltuk. Az fMLP (30 nM) hozzáadása előtt a sejteket a szelektív PDE4 inhibitorok különböző koncentrációival és PGE2~vel (3-10 nM) 5 percen át előkezeltük. Az fMLP hozzáadása után további 30 percen keresztül folytattuk az inkubálást. A reakciót a minták jégre helyezésével és centrifugálásával állítottuk le. A felülúszó frakciót eltávolítottuk, majd a myeloperoxidáz aktivitás vizsgálatáig fagyasztva (-30 °C) tároltuk.

A myeloperoxidáz aktivitás meghatározása

A myeloperoxidázt orto-anizidin szubsztrát és torma-peroxidáz standard alkalmazásával határoztuk meg. A felülúszó 50 μΐ-es részletét 50 mM nátrium-foszfát-pufferben (pH 6,0) 100 μΐ szubsztráttal (orto-anizidin, 0,53 mM; H₂C>2, 0,147 mM; végkoncentráció) inkubáltuk. A reakciót 50 μΐ 4 M kénsavoldat hozzáadásával állítottuk le. A termékképződést a 410 nm hullámhossz nál mért abszorbancia alapján, az aktivitást pedig a torma-peroxidáz alkalmazásával flevett standard görbe alapján határoztuk meg. Az adatokat a kontroll (a csak PGE2 jelenlétében felszabadult myeloperoxidáz-mennyiség) százalékaként fejeztük ki. Mivel a legtöbb vegyület esetén megfigyelt maximális gátlás 30 % volt, a log (IC15) értékeket a 15 %-os koncentrációk lineáris interpolációjával számítottuk ki.

8. példa

A reserpine-indukált hypothermia visszafordítása egerekben

Hím CF-1 vagy BALB/c egereket egyesével drótketrecekbe helyeztünk. A 10 mg/kg intraperitonealis reserpine-nel végzett előzetes kezelést előtt minden egyes egér esetén feljegyeztük a rectalis hőmérsékletet. A reserpine beadása után négy órával ismét feljegyeztük a rectalis hőmérsékletet, majd az egyes állatoknak különböző (orális) dózisban tesztvegyületeket, vivőanyagot vagy rolipramot (10 mg/kg) adtunk be. Ezt követően két órán keresztül 30 percenként feljegyeztük a rectalis hőmérsékleteket. Az adatokat a reserpine beadása után 4 órával megfigyelt értékekhez viszonyított hőmérséklet-változás formájában fejeztük ki (a testhőmérsékletek hozzávetőleg 10-15 °C-kal az alapértékek alá csökkentek). A kezelés utáni 90 és 120 percnél mért hőmérséklet-változások alkalmazásával dózis/válasz görbéket szerkesztettünk. 6-9 állat átlagértékeinek probit analízisével vagy lineáris regressziójával határoztuk meg az ED5Q értékeket. Annak érdekében, hogy összehasonlíthassuk a vegyületeknek a reserpine-indukált hypothermiát viasszafordító ké pességét és a kis affinitású kötést vagy a nagy affinitású kötést gátló képességét, az ED50 és az IC50 értékeket -log (érték) formában fejeztük ki.

9. példa

Összefüggés a bológiai funkció és a PDE4 gátlás között

Annak érdekében, hogy meghatározhassuk, vajon a PDE4 gátlás bizonyos biológiai effektusai az LPDE4 vagy a HPDE4 gátlásával állnak-e kapcsolatban, lineáris vagy rangsor szerinti korreláció alkalmazásával összehasonlítottuk a vegyületek hatást kiváltó képességét és a vegyületeknek az LPDE4-et vagy a HPDE4-et gátló képességét. A korrelációkat számos tényező befolyásolhatja: a) a vegyületek stabilitása; 2) a vegyületek milyen mértékben képesek belépni a sejtekbe; 3) in vivo vizsgálatokban a vegyületek biológiai hasznosíthatósága; 4) a korrelációs értékek, különösen a lineáris korreláció esetén érzékenyek a hatékonyságok eltéréseire: nagyobb potenciaérték-tartományok esetén könnyebben mérhető szignifikáns lineáris korreláció. Ezeket a tényezőket is figyelembe vettük, amikor különféle vizsgálati rendszerekben analizáltuk és összegeztük az LPDE4 vagy a HPDE4 gátlás és a biológiai funkció közötti összefüggést .

Izolált gyulladásos sejtek alkalmazása esetén tengerimalac eozinofilekben a monocita TNF_a-termelés gátlása és a szuperoxid-termelés gátlása az LPDE4 gátlással jobb korrelációt mutatott, mint a HPDE4 gátlással. Ezenkívül az in vivo antigénindukált bronchoconstrictio prevenciója jobb korrelációt muta tott az LPDE4 gátlással, mint a HPDE4 gátlással. Ebben az in vivo modellben a PDE4 inhibitorok a hízósejt-degranuláció megakadályozásával fejtik ki a hatásukat (Underwood et al., nyomdában) . Azonban a gyulladási sejtműködéshez nem mindig az LPDE4 gátlása kapcsolódott, mivel azt tapasztaltuk, hogy a neutrofil degranoláció gátlása jobban korrelált a HPDE4 gátlásával, mint az LPDE4 gátlásával. A gyulladásos sejtaktivitás szuppressziója néhány, de nem az összes esetben az LPDE4 gátlásával járt együtt. Ezzel szemben a savszekréció fokozódása, az emesis kialakulása és a reserpine-indukált hypothermia visszafordítása (a PDE4 inhibitorok pszichotrop potenciáljának a mérése) jobban korrelált a HPDE4 gátlásával, mint az LPDE4 gátlásával. Tehát az ebbe az osztályba tartozó vegyületek potenciális mellékhatásainak a legtöbbje a HPDE4 gátlásával áll kapcsolatban.

Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy az elsődlegesen az LPDE4-et gátló vegyületek kisebb mértékben fejtenek ki nemkívánt mellékhatásokat, és így előnyösebbek a gyulladásellenes hatásaik. így az olyan vegyületek kiválasztásával, amelyeknek az IC5Q aránya, azaz a rolipramot nagy aktivitással kötő PDE4 katalitikus forma IC50 értékének és a rolipramot kis affinitással kötő PDE4 katalitikus forma IC50 értékének a hányadosa (HPDE4/LPDE4) legalább körülbelül 0,1-es értékű, fokozott terápiás indexet érhetünk el, azaz ily módon az előnyös hatást maximalizálhatjuk és a káros hatást minimalizálhatjuk.

Annak eldöntése érdekében, hogy a fenti kiválasztási útmutató valóben alkalmas-e a javított terápiás indexű vegyületek kiválasztására, három olyan modellt értékeltünk, amelyben ősz szehasonlítottuk a terápiás hatást és a mellékhatást. Ezek között in vitro összehasonlítást végeztünk a vegyületeknek az izolált humán monocitákból származó TNF_a termelést szuppresszáló képessége és a vegyületeknek az izolált nyúl gyomormirigyekben történő savszekricót stimuláló képessége között, valamint két in vivo összehasonlítás során tengerimalacokban megvizsgáltuk a vegyületeknek az antigén-indukált bronchoconstrictiót megakadályozó képességét és kutyákban az emesist kiváltó képességét, valamint egerekben egy adoptált transzfer modellben a vegyületeknek a TNF_a termelést szuppresszáló képességét, illetve egerekben a reserpine-indukált hypothermiát reverzáló képességét .

A legalább 0,1 értékű szelektivitási aránnyal (HPDE4/LPDE4) rendelkező PDE4 inhibitorok lényeges javulást mutattak a terápiás indexeikben. Például a cisz-{4-ciano-4-[3-(ciklopentil-oxi)-4-metoxi-fenil]-1-ciklohexánkarboxilát}, a 2-(metoxi-karbonil)-4-ciano-4-[3-(ciklopropil-metoxi)-4-(difluor-metoxi)-fenil]-1-ciklohexanon és a cisz-{4-ciano-4-[3-(ciklopropil-metoxi)-4-(difluor-metoxi)-fenil]-1-ciklohexanol}, amelyek mindegyike > 0,1 szelektivitási arányú, az archetípusos PDE4 inhibitor R-roliprammal összehasonlítva 100-szor jobb terápiás indexszel rendelkezik. Ez azt bizonyítja, hogy a HPDE4 IC5Q/LPDE4 IC50 >0,1 kiválasztási összefüggés alkalmas azoknak a vegyületknek az azonosít ására,amelyek az in vitro összehasonlításban jobb terápiás indexszel rendelkeznek.

Az EIA kezelésével kapcsolatban EIA-ban szenvedő humán betegeknek beadtuk a cisz-{4-ciano-4-[3-(ciklopentil-oxi)-4-meto xi-fenil]-1-ciklohexánkarboxilát}-ot. A betegekben csökkent a gyulladás, a bronchodilatatio és a pulmonalis neuromodulatio.

Terhelési vizsgálat

Annak érdekében, hogy terhelés által indukált asztmában szenvedő betegekben értékeljük a cisz-{4-ciano-4-[3-(ciklopentil-oxi)-4-metoxi-fenil]-1-ciklohexánkarboxilát} hatékonyságát, biztonságosságát és tolerálhatóságát, randomizált, kettős vak, placebo-kontrollált, kétperiódusos cross-over vizsgálatot végeztünk. 27 EIA beteg véletlenszerű eloszlásban 10 mg BID azonnali hatóanyag-felszabaditású tabletta formájában a találmány szerinti vegyületet kapta, illetve placebót kapott 7 napon keresztül, ezt követően hétnapos kimosási (washout) periódust iktattunk be, majd újabb 7 napon ismét kezelést végeztünk. A terhelési teszteket egyetlen dózis után az 1. napon, majd a 7. napon végeztük el (dózis előtti és 3 órával a dózis utáni vizsgálat ) .

A betegpopuláció nemdohányzó, 18 és 60 év közötti, terhelés által indukált asztmában szenvedő férfiakból és nőkből állt, akiknél: a) az egy másodperc alatti erőltetett kilégzési térfogat (forced expiratory volume, FEV^) legalább akkora volt, mint az előre valószínűsített normál érték 70 %-a, b) a szkrínelési vizsgálat során a terhelési tesztre adott válaszban a FEV^ dokumentált esése legalább 15 % volt, és c) nem kaptak inhalált kortokoszteroidokat vagy más, az asztma kezelésére szolgáló gyógyszert.

A terhelési vizsgálat protokollja a következő volt. A betegeket előre meghatározott pulzusszámnál 6 percen keresztül motorizált futószalagon gyakorlatoztattuk. A sebességet és a meredekséget úgy állítottuk be, hogy a pulzusszám mindegyik betegnél elérje a kornak megfelelő várható maximális érték 85 %át. A teszt ideje alatt a betegek arcra illeszthető maszkon keresztül 0 % relatív páratartalmú, szobahőmérsékletű sűrített levegőt lélegeztek be. A teszt befejezése után az 1., 5., 10., 15., 20., 30. és 45 percben tüdőfunkciós teszteket (KoKo pneumotach) végeztünk, illetve a teszteket tovább folytattuk, ha a FEVi még nem tért vissza az alapérték 10 %-os határán belülre .

A primer hatékonysági változó a gyakorlatra adott FEVj maximális százalékos csökkenés (maximum percentage decrease, MPD) volt. Az eredmények azt jelezték, hogy a vegyület egyetlen dózis után szignifikáns mértékben javult az FEV^ MPD: az átlag MPD 32,88 %-ról 23,57 %-ra csökkent. A vegyület hétnapos adagolása után tovább javult (21,8 %-ra) az átlag FEV! MPD. Egyhetes kezelés után a vegyülettel kezelt betegek 40 %-a esetén a terhelés után legfeljebb 15 %-ra mérséklődött a FEVj csökkenése. A vegyület biztonságos és jól tolerálható volt, a kezeléssel kapcsolatban nem észleltünk hátrányos vagy káros jelenségeket [lásd még: Am. J. Resp. Crit. CareMed., 157, A413 (1998)].

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás terhelés által indukált asztma, hideg levegő által indukált asztma vagy szennyezőanyagok által indukált asztma megelőzésére vagy kezelésére ilyen betegségben szenvedő vagy ilyen betegség által veszélyeztetett emlősökben egy olyan PDE4-specifikus inhibitor beadásával, amely elsődlegesen az R-rolipramot kis affinitással kötő PDE4 katalitikus formát gátolja, azzal jellemezve, hogy egy ilyen kezelést igénylő betegnek hatásos mennyiségben egy legalább körülbelül 0,1 IC50 arányú vegyületet adunk be, ahol az IC5Q arány az R-rolipramot nagy aktivitással kötő PDE4 katalitikus forma IC50 értékének és az R-rolipramot kis affinitással kötő PDE4 katalitikus forma IC50 értékének a hányadosa.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az IC50 arány értéke legalább 0,5.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az IC50 arány értéke legalább 1,0.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a beadott vegyület azonnali hatóanyag-felszabaditású vagy szabályozott hatóanyag-felszabaditású orális készítmény formájában beadott cisz-{4-ciano-4-[3-(ciklopentil-oxi)-4-metoxi-fenil]-1-ciklohexánkarboxilát} .
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megelőzendő vagy kezelendő állapot terhelés által indukált asztma.

   5. Egy PDE4-specifikus inhibitor alkalmazása terhelés ál- • ••9

   tál indukált asztma, hideg levegő által indukált asztma vagy szennyezőanyagok által indukált asztma ilyen betegségben szenvedő vagy ilyen betegség által veszélyeztetett emlősökben történő megelőzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására, ahol egy olyan inhibitort alkalmazunk, amely elsődlegesen az R-rolipramot kis affinitással kötő PDE4 katalitikus formát gátolja, amelynek során egy legalább körülbelül 0,1 IC50 arányú inhibitort alkalmazunk, ahol az IC50 arány a rolipramot nagy aktivitással kötő PDE4 katalitikus forma IC50 értékének és a rolipramot kis affinitással kötő PDE4 katalitikus forma IC50 értékének a hányadosa.
6. 7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az IC50 arány értéke legalább 0,5.
7. 8. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az IC50 arány értéke legalább 1,0.
8. 9. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az alkalmazott vegyület cisz-{4-ciano-4-[3-(ciklopentil-oxi)-4-metoxi-fenil]-1-ciklohexánkarboxilát}, és egy orális azonnali hatóanyag-felszabadítású készítményt vagy egy orális szabályozott hatóanyag-felszabadítású készítményt állítunk elő.

   A meghatalmazott: