CZ20013148A3 - Léčivo pro prevenci nebo léčbu tělesným pohybem vyvolaného astmatu, astmatu vyvolaného chladným vzduchem nebo astmatu vyvolaného znečiątěním ľivotního prostředí - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká použití specifického inhibitoru PDE 4 pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčbu tělesným pohybem vyvolaného astmatu, astmatu vyvolaného chladným vzduchem nebo astmatu vyvolaného znečištěním životního prostředí, kde inhibitorem je inhibitor schopný inhibovat katalytickou formu PDE 4, která váže R-rolipram s nízkou afinitou.

Dosavadní stav techniky

Cyklické nukleotidové fosfodiesterázy (PDEs) představují rodinu enzymů, které hydrolyzují všudypřítomné mezibuněčné sekundární přenašeče, adenosin-3', 5'-monofosfát (cAMP) a guanosin-3',5'-monofosfát (cGMP) na jejich odpovídající neaktivní 5'-monofosfátcvé metabolity. Věří se, že existuje nejméně devět odlišných tříd isozymů PDE, z nichž každá má jednotné fyzikální a kinetické vlastnosti a každá představuje produkt různé skupiny genů. Tyto třídy jsou označeny za použití číslovek od 1 do 9.

Cílovým enzymem tohoto vynálezu je isozym PDE 4 ve všech svých různých formách a v plné oblasti své distribuce ve všech buňkách. Je to cAMP s nízkou K_m (cAMP K_m= 1 až 5 μΜ)-selektivní enzym, který je málo aktivní vůči cGMP (K_m>100 μΜ) . Členové této třídy isozymů mají zajímavé vlastnosti spojené s jejich existencí ve dvou nebo více vzájemně nepřeměnítelných nebo pomalu vzájemně přeměnitelných formách, které váží rolipram a ostatní inhibitory PDE 4 s různými pořadími síly. Tak mohou produkty stejných genů existovat ve více než jednom katalyticky aktivním konformačním stavu. Důležité je, že relativní podíly různých vazebných forem mohou velice záviset na typu buněk tkáně. Například, zánětlivé buňky mohou obsahovat relativně vysoký podíl formy, která váže rolipram s nízkou afinitou, zatímco mozkové a temenné buňky mohou obsahovat relativně vysoký podíl formy, která váže rolipram s vysokou afinitou.

Předmětem zvláštního zájmu v tomto vynálezu je úloha, kterou isozymy této třídy hrají při zánětu a v hladkých svalech dýchací cesty. Studie naznačují, že hrají přední úlohu při kontrole cAMP v širokém spektru zánětlivých buněk (tj . žírných buněk, bazofilních granulocitů, eozinofilních leukocytů, neutrofilních leukocytů a monocytů) a hladkých svalech dýchací cesty. Práce podle tohoto vynálezu je zvláště aplikovatelná na zánětlivé buňky a hladké svaly dýchací cesty;

předmětem zvláštního lidských monocytech. druhotný přenašeč zánětlivých buněk.

zájmu je typ To je proto, že pro inhibici Navíc, cAMP isozymu exprimovaný v cyklický AMP slouží jako chemotaxe a aktivaci zprostředkovává uvolnění hladkého svalstva vzduchové cesty.

To ve spojení s hlavní •· · · 4 · 4 4 « ·· 4 ♦ • 4 · · « · · ·) · · • · « 4 4 · · 4 4 4 ·· ·· 4· 444 ·· 4444 úlohou PDE 4 při metabolizaci cAMP poskytuje podporu pro zkoumání inhibitorů PDE 4: pomocí síly jejich schopnosti zvýšit obsah cAMP v leukocytech a hladkém svalstvu dýchací cesty, mohou inhibitory PDE 4 vykazovat protizánětlivé a bronchodilatační působení.

Současné inhibitory PDE používané při léčení zánětu a jako bronchodilatory, léky jako theofylin a pentoxyfylin, inhibují isozymy PDE bez rozdílu ve všech tkáních. Tyto sloučeniny vykazuji vedlejší účinky, zřejmě proto, že neselektivně inhibují všechny nebo většinu tříd isozymů PDE ve všech tkáních. To je úvaha při hodnocení léčebného profilu těchto sloučenin. Cílový stav nemoci může být takovými sloučeninami efektivně léčen, ale mohou se projevit nechtěné sekundární účinky, které jestliže mohou být vyloučeny nebo minimalizovány, by zvýšily celkový léčebný účinek tohoto přístupu při léčení jistých stavů nemoci. Souhrnně vzato tato informace předpokládá, že vedlejší účinky spojené s použitím standardních neselektivních inhibitorů PDE mohou být sníženy použitím cílených nových selektivních inhibitorů pro isozymy PDE převládající v tkáních nebo buňkách, které jsou předmětem zájmu. Ačkoliv teoreticky mohou selektivní inhibitory isozymů PDE představovat zlepšení proti neselektivním inhibitorům, selektivní inhibitory testované do této doby nejsou zbaveny vedlejších účinků vytvářených jako rozšířeni inhibice zájmových isozymů v nevhodné tkáni nebo tkáni, která není cílem. Například klinické studie se selektivním inhibitorem PDE 4 rolipramem, který byl vyvinut jako antidepresivní činidlo, naznačují, že vykazuje psychotropní aktivitu a má gastrointestinální účinky, například pálení žáhy, pocit nevolnosti a zvracení. Existují náznaky, že vedlejší účinky denbufylinu, dalšího inhibitoru PDE 4 určeného pro léčbu demence po mnohočetných infarktech, mohou rovněž zahrnovat pá4

lení žáhy, pocit nevolnosti a zvracení. Uvažuje se, že tyto vedlejší účinky se objevují jako výsledek inhibice PDE 4 v specifických oblastech centrálního nervového systému (CNS) a gastrointestinálního systému.

V roce 1986 Schneider s kolegy popsali přítomnost a vlastnosti vysoké afinity stereoselektivních [³H]-rolipram vážících míst v homogenátech krysího mozku. Ačkoliv se předpokládalo, že tato vazebná místa představují katalytická místa na kalmodulinu nezávislé, cAMP fosfodiesterázy (tj. PDE 4) krysího mozku, projevila se v údajích zřejmá zarážející anomálie. Za podobných ačkoli nikoliv stejných pokusných podmínek, data ukazují, že rolipram má Kd = 1 nM, zatímco inhibuje činnost PDE 4 v krysím mozku při Κι = 1 μΜ. Tak existuje 1000-násobný rozdíl v afinitě rolipramu k vazebným místům proti jeho účinku na katalytické působení. Ačkoliv zevrubná struktura vztahů působení (SARs) na inhibici PDE a kompetici vázání [³H]-rolipram nebyly stanoveny, podstatný rozdíl v síle rolipramu jako inhibitoru PDE 4 ve srovnání s jeho silou ve vazebných místech se zdá být otázkou platnosti předpokladu, že oba druhy působení jsou obsaženy ve stejném molekulárním místě.

Kvůli tomuto hlavolamu, bylo zahájeno několik studií. Jedna se snažila určit zdali místo vysoké afinity vázání rolipramu existuje na stejném proteinu jako katalytické místo cAMP. Druhá studie se pokoušela stanovit zdali je nebo není SAR pro inhibici PDE 4 stejná jako SAR pro kompetici s místem vysoké afinity vázání rolipramu. Třetí studie se pokusila podrobit zkoušce a objasnit jaký biologický význam, pokud je nějaký, mohou mít tato zjištění, zvláště jak se mohou vztahovat k vývoji nových lékových terapií.

·· ···· · ♦ · ·· ♦· « · · · ♦ · · · · » · ·· ·· ·· ··· ·» ····

Jelikož byly údaje shromážděny z několika zkoušek, stalo se zřejmým, že na rekombinantu lidského monocitu PDE 4 (hPDE 4) existují nejméně dvě vazebné formy, ke kterým se váže inhibitor. Jedno vysvětleni těchto pozorováni je, že hPDE 4 existuje ve dvou odlišných formách. Jedna s vysokou afinitou váže molekuly stejného druhu jako rolipram a denbufylin, zatímco druhá váže tyto sloučeniny s nízkou afinitou. Zde původci rozlišují tyto formy pomocí odkazu na ně jako na formu vážící rolipram s vysokou afinitou (HPDE 4) a formu vážící rolipram s nízkou afinitou (LPDE 4).

Důležitost těchto zjištění spočívají v nalezení, že sloučeniny, které silně soutěží o formu vážící rolipram s vysokou afinitou (HPDE 4) mají více vedlejších účinků nebo intenzivnější vedlejší účinky než sloučeniny, které silněji soutěží o LPDE 4 (formu vážící rolipram s nízkou afinitou). Další údaje naznačují, že sloučeniny mohou být zaměřeny na formu PDE 4 vážící s nízkou vazební afinitou a že tato forma je odlišná od vazebné formy, pro kterou je rolipram pojivo s vysokou afinitou. Bylo zjištěno, že pro inhibitory působící ve formě vážící rolipram s vysokou afinitou existují odlišné SAR proti formě vážící rolipram s nízkou afinitou. Navíc se zdá, že tyto dvě formy mají různé funkční úlohy. Tak sloučeniny, které vzájemně reagují s formou vážící rolipram s nízkou afinitou se zdají vykazovat protizánětlivé působení, zatímco sloučeniny, které vzájemně reagují s formou vážící rolipram s vysokou afinitou způsobují vedlejší účinky nebo tyto vedlejší účinky vykazují intenzivněji.

Pro tato zjištění neexistuje jasné vysvětlení. Avšak je navrženo, že PDE 4 může existovat ve dvou odlišných terciárních nebo kvartérních stavech. Věří se, že obě formy jsou katalyticky aktivní. Rolipram se váže k jednomu • · 4 · · · «· · 440444 • · 4 · · ·4

444 4 44444

44*444 4444

4 4 4 44

4 44 4 0 4· · 4

Au :ύ2'·.·	katalytickému místu jedné formy s vysokou afinitou, definovanou zde tak, že má Ki menši než 10 nanomolů a k druhé formě s nízkou afinitou definovanou zde tak, že má Kj. větší než 100 nanomolů. Užitečný důsledek těchto zjištění je, že je nyní možné identifikovat sloučeniny, které přednostně inhibují katalytické působení cAMP, ve kterém je enzym ve formě, která váže rolipram s nízkou afinitou, tím snižují vedlejší účinky, které jsou zřejmě spojeny s inhibici formy, která váže rolipram s vysokou afinitou.
.Η	Tento vynález tak proti vedlejším účinkům poskytuje vyšší léčebný index vůči EIA. Podstata vynálezu Předmětem tohoto vynálezu je použití specifického
a.	inhibitoru PDE 4 pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčbu tělesným pohybem vyvolaného astmatu, astmatu vyvolaného chladným vzduchem nebo astmatu vyvolaného znečištěním životního prostředí, kde inhibitorem je inhibitor schopný inhibovat katalytickou formu PDE 4, která váže R-rolipram s nízkou afinitou. Dále se uvádí podrobnější popis tohoto vynálezu v širších souvislostech.
áSai ů. a.	Při tomto vynálezu se používá sloučenin, které přednostně inhibují nebo váží jednu formu isozymu fosfodiesterázy, označovanou číslem 4 (dále PDE 4), přičemž vykazují stejné nebo výhodně nižší vázání nebo inhibici druhé

• · « ······ ·· ·· • « « · * · · «·« • · < 9 9 9 99 9 9 · ·····«· · · · · · · • · φ · · ♦ · ·

9999 · *· ··· ·♦ ····

6a

ÚÍ4&·

'.•'.'i*-.· siíBx !ί»

-íjÍ ϋ?

formy enzymu a jsou tak užitečné pro léčení tělesným pohybem vyvolaného zúženi průdušnice u pacientů s astmatem. Tyto formy isoenzymů, o kterých se věří, že jsou různými formami vzájemně nepřeměnitelných konformací stejného enzymu, se vyznačují svou vazebnou afinitou k rolipramu, archtypickému inhibitoru PDE 4. Rolipram se s vysokou afinitou váže k vazebnému místu jedné formy, ale s nízkou afinitou ke katalytickému vazebnému místu druhé formy. Zde je jedna forma rozlišena vysokou afinitou místa vážícího rolipram a totožnost druhé formy je určena nízkou afinitou místa vážícího rolipram.

Vynález umožňuje způsob selektivní léčby tělesným pohybem vyvolaného astma (EIA) pomocí přednostní inhibice formy s nízkou afinitou katalytického místa v isozymu PDE 4. Způsob léčby EIA se dosahuje podáváním sloučenin přednostně se vážících k místu s nízkou vazebnou aktivitou.

Způsobu léčby astmatu vyvolaného tělesným pohybem, současně minimalizující gastrointestinální a psychotropní účinky, zahrnuje podávání pacientovi, který to potřebuje, účinného množství sloučeniny, která má podíl IC₅o asi 0,1 nebo vyšší, jenž se vypočítá tím, že se hodnota IC₅o katalytické formy PDE 4, která váže rolipram s vysokou afinitou dělí hodnotou IC50 formy, která váže rolipram s nízkou afinitou.

Astma je komplexní, multifaktoriální onemocnění charakterizované vratnou obstrukcí dýchací cesty, zánětem dýchací cesty a nespecifickou hyperreaktivitou dýchací cesty na řadu farmakologických a životním prostředím vyvolaných odezev. Různí zprostředkovatelé, uvolnění z aktivovaných

Ί zánětlivých a imunitních buněk způsobují plicní edém, zúžení průdušnice a hypersekreci hlenu, které vede ke změnám v tvaru dýchací cesty. To je důkazem, že vyvolává zánět dýchací cesty jako hlavního podpůrného patologického procesu, zodpovědného za projevy astmatu.

Tělesným pohybem vyvolané astma (EIA) je definováno jako dočasné zvýšení odporu dýchací cesty, které se objevuje několik minut po namáhavém cvičení? EIA postihuje 80 % astmatiků a 35 až 40 % pacientů, kteří zažili sennou rýmou vyvolanou EIA. U pacientů s EIA vede tělesný pohyb k hyperventilaci, ztrátě vody dýcháním a ochlazení dýchací cesty, které, naopak, mohou způsobit, že žírné buňky dýchací cesty a cirkulující bazofilní granulocyty začnou uvolňovat chemické látky, které během tělesného pohybu zprostředkovávají zánět, sekreci hlenu, smrštění hladkého svalstva a rozšíření cév.

Navíc k tělesnému pohybu, mohou další činitelé vyvolat přechodné zvýšení odporu dýchací cesty. Tito činitelé zahrnují, ale nejsou na ně omezeni, znečišťující látky, např. SO2, a změny teploty, zvláště způsobené studeným vzduchem. Tak léčba znečištěním vyvolaného astma (PIA) a chladným vzduchem vyvolaného astma (CIA) jsou také zahrnuty v rozsahu tohoto vynálezu.

Základní rozumový princip inhibitorů PDE 4 při této nemoci je založen na úloze cyklického adenosin monofosfátu (cAMP) jako druhotného přenašeče, který zprostředkovává široké potlačení aktivity imunitních a zánětlivých buněk, společně se znalostí, že PDE 4 je hlavní isozym hydrolyzující cAMP v těchto hladkých svalech, ačkoliv se zdá, že je zde méně dominantní než v zánětlivých buňkách.

Pro účely tohoto vynálezu, se katalytická místa cAMP, která váží rolipram s nízkou afinitou označují jako vazebná místa nízké afinity (LPDE 4) a druhá forma tohoto katalytického místa, které váže rolipram s vysokou afinitou se označuje jako vazebné místo vysoké afinity (HPDE 4).

Počáteční pokusy ,se prováděly za účelem stanovení a potvrzeni platnosti zkoušky vazby [³H]-rolipramu. Detaily této práce jsou uvedeny v příkladu 1 níže.

K stanovení zdali jak vazebná aktivita s vysokou afinitou tak vazebná aktivita s nízkou afinitou sídlí v produktu stejného genu, byla kvasinka přeměněna známými způsoby a po expresi rekombinantní PDE 4 následovala více než β-ti hodinová fermentace. Analýza Western blot používající protilátku zaměřenou proti PDE 4 naznačila, že množství exprimovaného PDE 4 se s časem zvýšilo, přičemž dosáhlo maxima po 3 hodinách růstu. Navíc, více než 90 % produktů imunitníreakce se nacházelo v kapalině nad sedlinou kvasinkového lyzátu, získané při vysoké rychlosti odstředění (100 000 x g). Vazba [³H]R-(-)~ -rolipramu a aktivita PDE byly sledovány společně s expresí proteinů. Aktivita PDE 4 byla ko-exprimována s vazebnou aktivitou rolipramu, což naznačuje, že obě funkce existují v tom samém genovém produktu. Podobně k výsledkům analýzy Western blot se zjistilo, že více než 85 % rolipramem řízené aktivity PDE a vazebné aktivity [³H]-rolipramu je obsaženo ve frakci kapaliny nad kvasinkovou sedlinou.

Celkově, většina rekmbinantní PDE 4 exprimované v tomto systému existuje jako LDE 4 a pouze malá frakce jako HPDE 4.

Následně, inhibice katalytické aktivity rekombinantní PDE 4 v prvé řadě odráží chování sloučenin k LPDE 4. Inhibice katalytické aktivity PDE 4 tak může být použita jako index ·· · ·· · ·♦ · ·· • · · 9 9 9· 9 · 9 9 · ·♦· · · · · · · 9 9 9 9 9. · · · · · 99 99 99 ·99 99 99·· sily sloučenin k LPDE 4. Sila sloučenin k HPDE 4 může být odhadnuta pomocí zkoušky jejich schopnosti kompetice o [³H]Rrolipram. K rozvoji struktury vztahů působeni (SARs) jak pro nízko afinní tak pro vysoce afinní vazebná místa rolipramu, byly síly vybraných sloučenin stanoveny dvouzkouš-kovým systémem. Výsledky z pokusů používajících standardní sloučeniny jsou vyneseny do tabulky. Jak se očekávalo, jisté sloučeniny byly jasně silnější v kompetici o [³H]-rolipram v místech, ke kterým rolipram vykazuje vysokou vazebnou afinitu ve srovnání s druhým místem, ve kterém je rolipram vazačem s nízkou afinitou. Korelace SAR mezi vázáním s vysokou afinitou a vázáním s nízkou afinitou byla slabá a byl učiněn závěr, že SAR pro inhibici vysoce afinní vazby [³H]-rolipramu je odlišná od SAR pro vázání k místu vážícímu rolipram s nízkou afinitou. Tabulka I poskytuje výsledky z této práce o SAR.

Tabulka I

Sloučenina	nízká afinita IC50	vysoká afinita IC50	podíl vysoká/nízká afinita
1- (5-tetrazol)-3-(3-	1/1	0,002	0,0018

-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)cyklopentan cis-[3-(3-cyklopenty- 2,7 0,021 0,0078 loxy-4-methoxyfenyl)cyklopentan-l-karboxylát]

N~[2-(3-cyklopentyloxy- 0,89 0,012 0,013

-4-methoxyfenyl)ethyl]oxamid

Pokračováni tabulky I

Sloučenina	nízká afinita IC5o	vysoká afinita IC50	podíl vysoká/nízká afinita
R-rolipram	0,31	0,004	0,013
N-[2-(3,4-bisdifluor- me thoxyfeny1)ethyl]oxamid	1,6	0,4	0,25
Ro 20-1724	2,6	0,19	0,07
S-rolipram	1,1	0,095	0,086
(R)-(+)-1-(4-brombenzyl)-4-[(3-cyklopentyloxy)-4-methoxyfenyl]-2-pyrrolidon	4,0	0,45	0,11
1-(4-aminobenzyl) -4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl) -2-imidazolidinon	1,4	0,1	0,07
Denbufylin	0,29	0, 05	0,17
3-(cyklopentoxy-4-inethoxy- 0,	1	0,03	0,30

fenyl)-1-[4-N’-(N2-kyano-S -methyl-isothioureido)benzyl]-2-pyrrolidon

Pokračování tabulky I

Sloučenina	nízká afinita IC50	vysoká afinita IC50	podíl vysoká/nízká afinita
(R)-(+)-1—(4-brombenzyl)- 4-[(3-cyklopentyloxy)-4-methoxyfenyl]-2-pyrrolidon	0, 06	0,02	0,33
IBMX	29,1	20,3	0, 698
(S)-(-)-ethyl-[4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)pyrrolidin-2-yliden]acetát	0,46	0,45	0,98
Papaverin	10	10	1,0
cis-[4-kyan-4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)cyklohexan-l-karboxylát]	0, 095	0,110	1,1
cis-[4-kyan-4-(3-cyklopropylmethoxy-4-difluormethoxyfenyl)cyklohexan-l-ol]	0,021	0,04	2,0
(R)-( + )-ethyl-[4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)pyrrolidin-2-yliden]acetát	0,14	0,3	2,143

Pokračováni tabulky I

Sloučenina	nízká afinita IC50	vysoká afinita IC50	poměr vysoká/nízk; afinita
2-karbmethoxy-4-kyan-4- -(3-cyklopropylmethoxy-4-difluormethoxyfenyl)cyklohexan-l-on	0,140	0,5	3,571
trechuinsin	1,6	5,0	3,125
dipyrimadol	5,2	32,5	6,25

Denbufylin je 7-acetonyl-l,3-dibutylxanthin vyrobený společnosti SmithKline Beecham. Papaverin je l-[(3,4-dimethoxyfenyl)methyl]-6,7-dimethoxyisochinolin. Trekvinsin je 2,3,6,7-tetrahydro-2-(mesitylimino)-9,10-dimethoxy-3-methyl-4H-primido[6,1-a]isochinolin-4-on. Dipyrimadol je generický název pro 2,2',2’',2'''-[(4,8-dipiperidinopyrimido[5,4-d]pyrimidin-2-6-diyl)dinitrilo]tetraethanol.

Tyto výsledky vysvětluji, že některé sloučeniny mohou selektivně inhibovat tak zvanou formu s nízkou afinitou ve srovnání s formou s vysokou afinitou a naopak. Význam tohoto zjištění je, že je proveditelné minimalizovat vedlejší účinky projektováním nebo výběrem sloučenin, které selektivně (přednostně) inhibují jedno místo a tím ovlivňují žádoucí reakci vedoucí k vyloučení druhé, nechtěné, reakce nebo při nejmenším k minimalizaci nezamýšlené reakce na stupeň, který se v neakceptovatelném stupni neruší se zamýšlenou terapií.

Přes tuto práci původci nedefinovali základ pro nestejné SARs pro vázání rolipramu s vysokou afinitou a vázání rolipramu s nízkou afinitou v isozymu PDE 4. Avšak bylo zjištěno, že když sloučeniny vykazují podíl IC50 kolem asi 0,1 nebo větší, počítaný jako hodnota IC50 pro formu vázání rolipramu s vysokou afinitou dělená hodnotou IC50 pro formu vázání rolipramu s nízkou afinitou, budou mít přijatelný terapeutický index. Což znamená, že mohou nyní úspěšně léčit řadu onemocnění imunity a zánětlivých onemocnění, přičemž neovlivňují ostatní psychologické jevy buď vůbec nebo nikoliv v neakceptovatelném stupni. Zde je nejvýhodnějším ztělesněním inhibice místa vážícího rolipram s nízkou afinitou jako prostředků pro léčbu zánětlivých a alergických onemocnění.

Sloučeniny

Tento vynález kryje ty sloučeniny, které mají podíl IC50 (vysoké/nízké vázání) asi 0,1 nebo větší. To zahrnuje všechny sloučeniny, které jsou podle testu stanoveného zde původci inhibitory PDE 4, a které v nich nebo podobných zkouškách vykazuji podíl v uvedeném rozmezí; předmětem zvláštního zájmu jsou ty sloučeniny, které nejsou ve veřejně známém okruhu a/nebo nejsou testovány jako inhibtory PDE 4 nebo známy, že patří k inhibitorům PDE 4, před datem podání této přihlášky.

Příklady sloučenin, které splňují standard podílu IC50 jsou uvedeny v tabulce I výše, stejně jako v US patentu

448 686: US patentu 5 605 923; a US patentu 5 552 438. Každý z těchto dokumentů je zde plně zahrnut ve formě odkazu jakoby byl vyložen zde.

Výhodnou technikou pro výběr užitečných sloučenin je způsob stanovení sloučeniny, která má podíl IC50 asi 0,1 nebo větší, podíl IC50 1 nM pro kompetici o vázání [³H] R-rolipramu k formě PDE 4, která váže rolipram s vysokou afinitou proti hodnotě IC50 pro inhibici katalyticky aktivní formy PDE 4, která váže rolipram s nízkou afinitou, při použití 1 μΜ [³H]— -cAMP jako substrátu.

Výhodnými sloučeninami jsou podle tohoto vynálezu ty sloučeniny, které mají podíl IC50 větší než 0,5 a zvláště ty sloučeniny, které mají podíl větší než 1,0. Sloučeniny jako jsou cis-[4-kyan-4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)cyklohexan-l-karboxylát], 2-methoxykarbonyl-4-kyan-4-(3-cyklopropylmethoxy-4-difluormethoxyfenyl)cyklohexan-l-on a cis-[4-kyan-4-(3-cyklopropylmethoxy-4-difluormethoxyfenyl)cyklohexan-l-ol] jsou příklady struktur, které se přednostně váží k vazebnému místu s nízkou afinitou a které mají podíl IC50 0,1 nebo větší.

Předkládané sloučeniny a farmaceuticky přijatelné soli mohou být pro léčbu uvedených nemocí podávány standardním způsobem, například orálně, parenterálně, sublinguálně, dermálně, transdermálně, rektálně, cestou inhalace nebo cestou bukálního podávání. Mohou být také použity přípravky s řízeným uvolňováním.

Předkládané sloučeniny a farmaceuticky přijatelné soli, které jsou aktivní, když jsou podány orálně, mohou být utvářeny jako sirupy, tablety, kapsle, přípravky s řízeným uvolňováním nebo pastilky. Sirupové formy se budou obecně skládat ze suspenze nebo roztoku sloučeniny nebo soli v kapalném nosiči, například ethanolu, podzemnicovém oleji, olivovém oleji, glycerinu nebo vodě s příchutí nebo barvicím

4»·4 v »* * 9 činidlem. Když je přípravek ve formě tablet, může být použit jakýkoliv farmaceutický nosič rutinně používaný pro přípravu prostředků ve formě pevné látky. Příklady takových nosičů zahrnují stearát horečnatý, terra albu, mastek, želatinu, arabskou gumu, kyselinu stearovou, škrob, laktózu a sacharózu. Když je kompozice ve formě kapsle, je vhodná jakákoliv rutinná enkapsulace, například za použití výše uvedených nosičů v obalu tvrdé želatinové kapsle. Když je přípravek ve formě kapsle s obalem z měkké želatiny, může být zvažováno použití jakéhokoliv farmaceutického nosiče rutinně používaného pro přípravu disperzí nebo suspenzí, například jsou zakomponovány v kapslích s měkkým želatinovým obalem z vodné gumy, celulóz, silikátů nebo olejů.

Typické parenterální přípravky se skládají z roztoku nebo suspenze sloučeniny nebo soli v sterilním vodném nebo nevodném nosiči popřípadě obsahujícím parenterálně přijatelný olej, například polyethylenglykol, polyvinylpyrrolidon, lecitin, arašídový olej nebo sezamový olej.

Typické přípravky pro inhalaci jsou ve formě roztoku, suspenze nebo emulze, která může být podávána jako suchý prášek nebo ve formě aerosolu používající běžný propelant jako jsou dichlordifluormethan nebo trichlorfluormethan.

Typické přípravky ve formě čípků obsahují prezentovanou sloučeninu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, která je aktivní, když je podávána touto cestou, s pojivém a/nebo lubrikačním činidlem, například polymerními glykoly, želatinami, kakaovým máslem nebo rostlinnými vosky s nízkou teplotou táni nebo tuky nebo jejich syntetickými analogy.

• «

Typické dermální nebo transdermální přípravky obsahují běžné vodné nebo nevodné vehikulum, například krém, mast, pleťovou vodu nebo pastu nebo jsou ve formě medicinální náplasti, nálepky nebo membrány.

Výhodným přípravkem je forma jednotkové dávky, například tableta, kapsle nebo odměřená aerosolová dávka, takže pacientovi může být podána jednotlivá dávka.

Každá dávková jednotka pro orální podávání obsahuje vhodně od 0,3 mg do 60 mg/kg, výhodně od 1 mg do 30 mg/kg sloučeniny nebo její farmaceuticky přijatelné soli. Výhodně dávky obsahují 10 mg a 15 mg/kg. Každá dávková jednotka pro parenterální podávání obsahuje vhodně od 0,1 mg do 100 mg/kg sloučeniny nebo její farmaceuticky přijatelné soli. Každá dávková jednotka pro internasální podávání obsahuje vhodně 1 až 400 mg a výhodně od 10 do 200 mg na osobu. Lokálně aplikované prostředky obsahují vhodně od 0,01 do 5,0 % prezentované sloučeniny.

Aktivní složka může být podávána 1-krát až 6-krát za den, což je dostatečné k vykázání požadovaného účinku. Výhodně je aktivní složka podávána asi jednou nebo dvakrát za den, výhodněji dvakrát za den.

Při očekávání stimulu o který se jedná, jsou prezentované sloučeniny užitečné pro prevenci nebo léčbu EIA, PIA a CIA, jak jako chronických stavů tak jako občasných. Výhodně jsou prezentované sloučeniny požívány pro dlouhodobou léčbu.

Když jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu podávány podle předkládaného vynálezu nejsou očekávány žádné nepřijatelné toxikologické účinky.

• » ♦ · ♦ · • 0

Následující příklady se uvádějí pro vysvětlení jak provádět a používat tento vynález. Nejsou v žádném případě zamýšleny jako omezení rozsahu tohoto vynálezu jakýmkoliv způsobem nebo v jakémkoliv stupni.

Příklady provedení vynálezu

K získání údajů podporujících výběr asi 0,1 nebo větší se používají různé

Zkoušky jsou:

kyseliny z degranulace lidských podílu IC50 v hodnotě následující zkoušky rozšířené stimulace na pět druhů, produkce inhibice temenní králíka; myleoperoxidázy) v inhibice tvorby O2” vyvolané FMLP morčat; inhibice produkce TNF_a monocytech; způsobení zvracení způsobeného zúžení průdušnice vyvolaná hypotermie u myší adaptivně přenesených lidských

Tyto zkoušky a údaje jsou uvedeny níže.

žlázy vyvolané FMLP neutrofilních izolované z (uvolňování leukocytech; leukocytech u vyvolané LPS v lidských psů; inhibice protilátkami morčat;

eozinofilních inhibice monocytů u vratná reserpinem produkce TNF_a z myši vyvolané LPS.

Statistická analýza

K prověření hypotézy, že inhibice místa PDE 4 s nízkou afinitou je spojena s protizánětlivými účinky této třídy sloučenin, zatímco inhibice místa s vysokou afinitou je spojena s vytvářením jistých vedlejších účinků, stanovují původci schopnost různých inhibitorů PDE 4 blokovat funkci zánětlivých buněk jak in vitro tak in vivo a schopnost těchto sloučenin vytvářet vedlejší účinky jak v in vitro tak in vivo modelech. K srovnání schopnosti inhibitorů PDE 4 vyvolat daný léčebný účinek nebo vedlejší účinek s jejich schopností inhibovat vazebné místo s nízkou afinitou proti jejich ·· 4··· 44 * 44 '<·♦

4 44 ·« · · · t

444 » · «4 * ♦ 4 4 4 ¢) * 4444 4

4 4 4 44 4 444

44 »4» · 4 · « · 4 4 4 4 schopnosti inhibovat vazebné místo PDE 4 s vysokou afinitou, původci srovnávají sílu těchto sloučenin při in vitro nebo in vivo zkouškách s jejich silou vůči katalytické aktivitě izolovaného enzymu nebo místu s vysokou afinitou pomocí lineární korelace (r²) nebo korelace pořadí v řadě (Spearman’s Rho) . Lineární korelace vede k otázce zda síla sloučeniny při inhibici buď místa s nízkou afinitou nebo místa s vysokou afinitou může být využita k předpovědi schopnosti vyvolat daný protizánětlivý nebo vedlejší účinek. Korelace pořadí v řadě zkouší zdali řada pořadí podle síly při vytváření daného protizánětlivého nebo vedlejšího účinku je podobná řadě pořadí síly při inhibici místa nízké nebo vysoké afinity. Jak r², tak Spearman Rho se počítají použitím počítačového programu STÁT View II pro počítače Macintosh.

PDE IV versus vázání rolipramu s vysokou afinitou

Příklad 1

Zkoušky vázání fosfodiesterázy a rolipramu

Příklad IA

Izolovaný lidský monocyt PDE 4 a hrPDE 4 jsou určeny k existenci přednostně ve formě s nízkou afinitou. Tudíž, aktivita zkušebních sloučenin vůči formě PDE 4 s nízkou afinitou může být vyhodnocena použitím standardních zkoušek pro katalytické působení PDE 4 využívající 1 μΜ [³H]cAMP jako substrát (Trophy a kol., 1992).

Kapaliny nad usazeninou krysího mozku získané při vysoké rychlosti odstředění se používají jako zdroj proteinů.

Enantiomery [³H]-rolipramu se připraví v specifické aktivitě *· ···· · · * * · · · « * · · · ·« « e · · • l *··· · · ·♦·· • · · · · ι · · ·· ·· φ» ·· *·· «·«···

947,2 ΙΟ⁹ Bq/ml (25,6 Curie/mmol). Podmínky standardní zkoušky jsou od publikovaného postupu upraveny tak, aby byly identické s podmínkami zkoušky PDE, kromě poslední pro cAMP; 50 ml TrisHCl (pH 7,5), 5 mM MgC12 a lnM [³H]-rolipramu (Trophy a kol., The J. of Biol. Chem., sv. 267, č. 3, str. 1798 až 1804 (1992)). Zkouška se provádí po dobu jedné hodiny při 30 °C. Reakce se ukončí a vázané ligandy se oddělí od volných ligandů za použití Brandelova zachytávače buněk. Kompetice o vazebné místo s vysokou afinitou se vyhodnotí za podmínek, které jsou identické s podmínkami používanými pro měření aktivity PDE o nízké afinitě, při čemž se očekává, že [³H]-cAMP není přítomen. Údaje uvedená v tabulce I, str. 9 až 12 se vytváří při použití postupu popsaného v příkladu 1A.

Příklad 1B

Měření aktivity fosfodiesterázy

Aktivita PDE se vyhodnocuje použitím zkoušky scintilační blízkosti [³H]cAMP (SPA) nebo zkoušky SPA enzymu [³H]cGMP jak je popsána dodavatelem (Amersham Life Sciences). Tato reakce se provádí v 96-ti jamkových plotnách při teplotě místnosti, v 0,1 ml reakčního pufru obsahujícího (konečné koncentrace): 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8,3 mM MgCl₂, 1,7 mM EQTA_f [³H]cAMP nebo [³H]cGMP (přibližně 2 000 dpm/pmol) , enzym a různé koncentrace inhibitorů. Zkouška se nechá probíhat po 1 hodinu a ukončí se přidáním 50 μΐ kuliček křemičitanu ytria pro SPA v přítomnosti síranu zinečnatého. Plotnami se třepe a nechají se stát při teplotě místnosti po 20 minut. Radioaktivním izotopem značená forma produktu se vyhodnotí scintilační spektroskopií. Aktivita PDE 3 a PDE 7 se vyhodnotí za použití 0,05 μΜ [³H]cAMP, zatímco PDE 4 se vyhodnocuje za použití 1 μΜ [³H]cAMP

jako substrátu. Aktivity PDE 1B, PDE 1C, PDE 2 a PDE 5 se vyhodnotí použitím 1 μΜ [³H]cGMP jako substrátu.

Zkouška vázání [³H] R-rolipramu

Zkouška vázání [³H] R-rolipramu se provádí > modifikací způsobu Schneidera a spolupracovníků, viz Nicholson a kol., Trends Pharmacol. Sci, sv. 12, str. 19 až 27 (1991) a McHale a kol., Mol. Pharmacol., sv. 39, 109 až 113 (1991). R-Rolipram se váže ke katalytickému místu PDE 4 viz Torphy a kol., Mol. Pharmacol., sv 39, str. 376 až 384 (1991). Následně kompetice o vazbu [³H]R-rolipramu poskytuje nezávislé potvrzení inhibiční síly neoznačených konkurentů inhibitorů PDE 4. Zkouška se provádí při 30 °C po 1 hodinu v 0,5 μΐ pufru obsahujícího (konečné koncentrace): 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgC12,

0,05 % albuminu hovězího séra, 2 nM [³H] R-rolipramu (5,7 x 104 dpm/pmol) a různé koncentrace inhibitorů neznačených radioaktivním izotopem. Reakce se zastaví přidáním 2,5 ml studeného reakčního pufru (bez [³H] R-rolipramu) a rychlou vakuovou filtrací (Brandel Cell Harvester) přes Whatmanovy GF/B filtry, které byly nasáknuty v 0,3 % polyethyleniminu. Filtry se promyjí dodatečnými 7,5 ml studeného pufru, suší se a čítají se cestou kapalné scintilační spektroskopie.

Příklad 2

Akumulace aminopyrinu

Určité methylxanthiny a jiné neselektivní inhibitory PDE zvyšují u řady druhů sekreci kyselin. Určité selektivní inhibitory PDE 4, např. rolipram a Ro 20-1724, zesilují sekreci kyselin u krys, zvláště když jsou podány v kombinaci s aktivátorem adenylátcyklázy, jako je histamin. Toto zvýšení sekrece kyselin je doprovázeno zvýšením histaminem vyvolané akumulace cAMP. Tato uvedená informace se prověřuje za účelem zjištění zda tento jev existuje. Schopnost sloučenin vyvolat sekreci kyseliny se srovnává s jejich schopností vůči místu s nízkou afinitou nebo místu s vysokou afinitou. Zkoušky používané v této práci spočívají na akumulaci slabé báze, radioaktivním izotopem označeného aminopyrinu, o kterém se říká, že slouží pro zvýšenou sekreci kyseliny jako biochemický značkovač. Zkoušky následuji:

Příprava žaludeční žlázy

Králíci libovolného pohlaví se milosrdně utratí zlomením vazu a odejme se žaludek, kranální a antrální části Žaludeční žlázy se izolují a Obrinkem (1976) a Sáčkem pak rozemele a vyluhuje žláz. Vyluhované žlázy

Sliznice se žaludku se modifikací

Berglindhem Sliznice se žaludečních odpitvá od těla; z pokusu vyřadí, způsobů popsaných a Spenneym (1982) .

se kolagenázou pro izolaci se odfiltrují, promyjí a opětovně suspendují 1 : 15 (objem : objem) v inkubačním mediu následujícího složení: NaCl 132,4 mM; KC1 5,4 mM; Na₂HPO₄ 5,0 mM; NaH₂PO₄ 1,0 mM; MgSO₄ 1,2 mM; CaCl₂ 1,0 mM; NaHCOs 12,0 mM; albumin králičího séra 2 mg/ml; dextróza 2 mg/ml; při pH 7,4.

Akumulace aminopyrinu

K stanovení sekrece kyseliny se inkubují žaludeční žlázy v kombinaci s [¹⁴C] -aminopyrinem, různými koncentracemi selektivních inhibitorů PDE 4 a prahovými koncentracemi histaminu (0,3 až 1,0 μΜ) při 37 °C na horizontální třepačce (110 cyklů/min) po 20 minut podle postupu Sacka a Spinneyho (1982). Vzorky se potom odstředí a stanovuje se radioaktivita v podílech frakcí kapaliny nad sedlinou a peletách. Podíly • 4 4 4 · 4 ♦· ♦ 4 4 ^Λ · • · 9 4 · 4 4 ···# «4 4444 4 4 4 4 * *44* · · · · ·· •4 44 ·· ♦·* ··4444 aminopyrinu se počítají podle popisu Sacka a Spenneyho (1982). Data jsou vyjádřena jako procento reakce způsobené maximální koncentrací histaminu (100 μΜ). Hodnoty EC50 se stanoví lineární interpolací využívající maximální reakci získanou pro každou sloučeninu.

Příklad 3

Vyhodnocení dávivé síly selektivních inhibitorů PDE na psech

Psi plemene Mongrel (n=5, pro každou studii) obého pohlaví se získají z chovné stanice. Po hladovění přes noc, se psi nakrmí 1/2 plechovky psí potravy (Big Bet) nejméně 30 minut před studií. K podávání účinné látky se kanyla umístí do cefalické žíly jedné z předních noh. Kanyla se promyje 1 ml isotonického fyziologického roztoku (0,9 %) před podáváním zkoušené sloučeniny. Sloučeniny se rozpustí buď ve směsi polyethylenglykolu a fyziologického roztoku nebo 100% polyethylenglykolu a podávají se v objemu 1,0 až 2,0 ml/10 kg. K zajištění, že celá dávka vstoupí do oběhu, se kanyla promyje dodatečnými 0,5 až 1,0 ml fyziologického roztoku. Zvířata se vrátí do klece na 1-hodinovou dobu pozorování. Každý pes se pozoruje z hlediska příznaků zvedání žaludku nebo zvracení a zaznamenává se doba po podání sloučeniny do výskytu tohoto chování. Na konci doby pozorování se zvířata vrátí do své domovské klece. Doba každé studie se rozdělí na 7 dní. Každá sloučenina se každému psu podává v stupňujících se dávkách v následujících dnech studie dokud není zpozorován dávivý účinek. V tomto okamžiku se jednotliví psi vyloučí ze studie a vyšší dávky jsou podávány pouze těm psům, kteří ještě nereagovali.

Údaje se vyjádři jako kumulativní procento psů reagujících při každé dávce jak je popsáno v literatuře pro kvantově mechanické křivky reakce na dávky. Hodnota EC50 se počítá s využitím pravděpodobnostní analýzy.

Příklad 4

Zkouška eozinofilů (dále eozinofilních leukocytů) u morčat

Izolace a čištění eozinofilních leukocytů

Samci morčat (laboratoře Hartely, Hazelton) se po 4 až 6 týdnů před použitím týdně injektují 1 ml koňského séra. Zvířata se uspí směsí ketamin/xylazin (88 mg; 12 mg/ml; 0,4 ml/kg) nejméně 24 hodin po inijekci koňského séra. Po vyvolání narkózy se pobřišniční dutina vypláchne 50 ml teplého sterilního fyziologického roztoku (0,9 %) . Proplachovací kapalina se jímá pomocí katetru 14 G do 50ml plastových konických odstřeďovacích zkumavek. Morčata se nechají zotavit z narkózy a mohou se znovu použít po době dvoutýdenního odpočinku.

Z proplachovací kapaliny se buňky izolují odstředěním (400 x g, 10 min) a znovu se suspendují v 35 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) a podlijí 10 ml isotonického přípravku Percoll (1,075 g/ml). Tato suspenze se odstřeďuje po 30 minut při 300 x g. Pelety obsahující hlavně eozinofilní leukocyty a erythrocyty se promyjí v PBS a erythrocyty se lýzují. Tyto buňky se znovu suspendují v prostředí RPMI 1640 s 20 % FBS a inkubují se přes noc při 37 °C v zvlhčovaném inkubátoru s 5 % CO2. Příští den se pro stanovení schopnosti samostatné existence (vylučování trypanové modře) a čistoty se buňky promyj! a znovu suspenduji v PBS.

Tvorba superoxidového aniontu (O2’)

Čištěné eozinofilní leukocyty (životaschopnost > 95 % a čistota > 90 %) se suspendují v PBS s 20 mM pufru HEPES (pH 7,4) a 0,1 % želatiny v koncentraci 1 až 2 x 10⁶ buněk/ml. Do 96-jamkové plotny se přidají eozinofilní leukocyty (1 x 10⁵) a inkubují se přibližně po 1 hodinu při 37 °C. 10 minut před zahájením reakce se přidávají inhibitory PDE 4. Reakce se iniciuje přidáním cytochromu C (160 μΜ) a formyIMet-Leu-Phe (fMLP) (30 nM) za nepřítomnosti nebo v přítomnosti 60 jednotek dismutázy superoxidu (SOD). Cytochrom C se v různých časových okamžicích sleduje na odčítacím zařízení ploten Dynatech MR 7000 při 550 nm s referencí při 630 nm. Rychlost tvorby O2” se stanoví v několika časových okamžicích lineární regresní analýzou za použití čisté absorbance jamek za nepřítomnosti nebo v přítomnosti SOD. Výsledky se vyjádří jako procento kontrolní tvorby 0₂” opravené na základní úroveň. Jelikož maximální pozorované inhibice jsou 60 %, log IC30 se počítá za použití lineární interpolace koncentrace a vynesení 30 %.

Příklad 5

Zúžení průdušnice u morčat

Samci morčat kmene Hartley (200 až 250 g za 4 týdny,

Hazelton Research, Denver, PA) se senzitizují nitrosvalovou inijekcí 0,35 ml 5 % (hmota/objem) ovalbumin/fyziologický roztok do každého stehna (0,7 ml) 1-ní a 4-té dny. Morčata jsou připravena pro použití po 25-tém dni.

Postup pokusu

Samci morčat kmene Hartley (600 až 800 g Házelton) , aktivně senzitizovani na ovalbumin se uspí pentobarbitalem sodným (40 mg/kg interoperitoneálně) přibližně 10 až 15 minut před chirurgickým zákrokem. Do hrdelní žíly, krční tepny a průdušnice se pro podávání léků, sledování tlaku a dýchání zavede kanyla (Deseret radiopakní katétry z polymerní pryskyřice Intracath® Vialon® (Deseret Medical, lne., Sandy, UT) , 22 a 19 gA a polyethylenová rourka 260) . K minimalizaci cholinergní poruchy se provede oboustranné protětí bloudivého nervu. Zvířata se paralyzují (pancuronium bromidem, 0,1 mg/kg nitrožilně) a ventilují se (45 dechů/min) prostřednictvím dýchacího přístroje Harvard Rodent Respirátor (model 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA). Změny tlaku dýchací cesty se měří přes odbočku tracheální kanyly transduktérem Elcomatic (Buxco Electronics, Sharon, CT) . Objem ventilačního zdvihu se stanoví k vytvoření tlaku v odbočce 784,25 Pa (cca 5 cm³ objemu vzduchu) . Krevní tlak se měří přístrojem Statham P23XL Physical Pressure Transducer (Viggo-Spectramed, Oxnard, CA) . Tlaky se zaznamenávají na Grass Model 7D Polygraph (Grass Instrument Co., Quincy, MA) . Pro udržení tělesné teploty se zvířata udržují na zahřívacím stolezahříváním.

Zkoušené sloučeniny nebo vehikula se podávají nitrožilní cestou 10 minut před vyvoláním odezvy na protilátku. V časovém

okamžiku 0,

se nitrožilní cestou podává 0,1 mg/kg ovalbuminu.

Ve vrcholu reakce na protilátku se nitrožilně podá další dávka

protilátky,	0,2 mg/kg ovalbuminu. Ve vrcholu reakce na
protilátku	se k dosažené kumulativní dávce 0,3 mg/kg
ovalbuminu,	nitrožilně podá 1 cm3/kg nasyceného roztoku KC1,

který vytváří maximální zúžení průdušnice.

Přiklad 6

Inhibice TNF« vyvolaná LPS v lidských monocytech

Studie in vitro

K určení zdali se inhibice TNF« týká inhibice LPDE 4 nebo HPDE 4 se sleduje řada inhibitorů PDE 4, které mají rozsah sil pro LPDE 4 a HPDE 4 z hlediska jejich schopnosti inhibovat tvorbu TNF_a v lidských monocytech stimulovanou lipopolysacharidy (LPS) in vitro. Použití primárních lidských buněk pro toto sledování se považuje za extrémně důležitý jev, že různé druhy se zdají dramaticky odlišné v relativním příspěvku LPDE 4 a HPDE 4 k hydrolýze cAMP v zánětlivých buňkách.

Metody

Inhibice TNF_a se posuzuje v monocytech lidské periférní krve, které jsou čištěny (Collata) z čerstvě získaných povlaků nebo zbytků po elektroforéze plasmy z krve normálních lidských dárců. Monocyty se plotnují při hustotě 1 x 10⁶ buněk/ml prostředí/jamku v 24-jamkových multi-miskových plotnách. Buňky se nechají přilnout po 1 hodinu, po kterémžto čase se kapalina nad sedlinou odsaje a přidá se 1 ml čerstvého média (RPMI-1640, které obsahuje 1 % plodového telecího séra a penicilin/streptomycin v množství 10 jednotek/ml). Buňky se inkubují po 45 minut za přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaných sloučenin v koncentracích pohybujících se od 1 nM do 1 mM před přidáním LPS (E. coli. 055:B5, Sigma Chemicals) k dosažení konečné koncentrace 100 ng/ml. Zkoušené sloučeniny se rozpouštějí a ředí v koncentracích 50 : 50 dimethylsulfoxid/ethanol, takže konečná koncentrace • 4 · · • 44 · rozpouštědel v médiu kultury monocytů je 0,5 % dimethylsulfoxidu a 0,5 % ethanolu. Kapalina nad kulturou se z monocytů odstraní po 14 až 16 hodinách inkubace při 37 °C/5 % CO2 a odstředí se k odstranění zlomlů buněk při 100 x g. Zkouška cytokinů se provádí buď okamžitě nebo se kapaliny nad kulturou skladují do doby zkoušky při -70 °C.

Hladiny TNFa se měří za použití ELISA (Winston) využívající myší monoklonální protilátku proti lidskému TNF« (viz níže) jako záchytovou protilátku a polyklonální králičí protilátku proti lidskému TNF_a jako druhou protilátku. Pro zjištění, se přidá kozí s peroxidázou spojená protikráličí protilátka (Boehringer Mannheim, katalogové číslo 605222), následované substrátem pro peroxidázu (1 mg/ml orthofenylendiaminu s 0,1 % peroxidu močoviny). Hladiny TNF« ve vzorcích se vypočítají ze standarní křivky vytvořené rekombinantní lidskou TNF« vytvořenou v E. coli. Monoklonální protilátky k lidské TNF« se připraví ze slezin myši BALB/c imunizovaných rekombinantní lidskou TNF« modifikací metody Kohlera a Millsteina (Nátuře, sv. 256, str. 495 až 497, 1975). Polyklonální králičí protilátky antihumánní TNF« se připraví opakovanou imunizací novozélandských bílých králíků rekombinantní TNF_a zcela emulgované v kompletním Freundově adjuvans.

In vivo potlačení tvorby lidské TNF_a v adoptivním modelu zánětu pobřišnice

Metody

Jedna polovina jednotky heparizinované celkové žilní krve se odebere ze zdravých dobrovolníků, kteří neužívají jakýkoliv druh léků. Polymorfonukleární leukocyty se oddělí rozvrstvením •· ···· • 4 krve na Histopaku-1077 odstředěním při 800 x g po 30 minut při 25 °C. Zachytí se lymfocytová/monocytová část a promyje se dvakrát DPBS (Dulbeccovým fosforečnanem pufrovaným fyziologickým roztokem) bez Ca²⁺ a Mg²⁺ při 1000 otáčkách za minutu po 10 minut při 25 °C. Pelety se resuspendují v 5 ml DPBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺, rozvrství se na 5 ml roztoku Percollu připraveného v prostředí RPMI 1640, které je zbavené séra při 25 °C, a odstřeďuje se při 550 x g po 30 minut při 25 °C.

Vrchní vrstva monocytů se odstraní a dvakrát promyje DPBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺ při 1000 otáčkách za minutu při 25 °C. Konečný izolát promytých monocytů se suspenduje na 6 až 10 x 10⁶ buněk/ml v DPBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺ při 25 °C. Monocyty se také stejným postupem izolují ze souprav Source Leukocytes. Monocytové přípravky obsahují od 65 do 90 % monocytů a života schopnost buněk je >97 % (vyloučení trypanové modře).

Myší samci kmene BALB/c (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) ve skupinách po 4 nebo 5, se chovají v zařízení bez bariér. Myši o hmotnosti 18 až 25 g a stejného stáří obdrží injekci 0,5 ml 6 až 10 x 10⁶ monocytů/ml do pobřišnice použitím lehkého tlaku na stříkačku s jehlou kalibru 23 gA, takže jsou monocyty vystaveny minimálním smykovým silám a stresu. Během 2 minut od obdržení monocytů se myši po 15 minut ošetřují vehikulem nebo sloučeninou podávanou orálním dávkováním. Zvířata se potom interperitoneálně injektují 0,2 ml o koncentraci 125 mg/ml endotoxinu (E.coli, typ W. Difco) rozpuštěného v DPBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺. Dvě hodiny později se zvířata usmrtí udušením kysličníkem uhličitým a injektuje se jim interperitoneálně 1,5 ml DPBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺ (4 °C) . Pobřišnice se jemně masíruje a výplach se odstraní a umístí do polypropylenových zkumavek v ledové lázni. Vzorky se vyčeří odstředěním (12 500 x g po 5 minut při 4 °C) . Kapalina nad sedlinou se dekantuje do nových zkumavek (mohou být • · • · skladovány při -20 °C) a testuje se na lidskou a myši TNF_a pomocí ELISA. Hodnoty ED50 se vypočítají pomocí standardních postupů.

Příklad 7

Metoda izolace a čištění lidských neutrofilních leukocytů

Izolace a čištění

Neutrofilní leukocyty (PMNs) se izolují z heparizované krve pomocí stupňovaného odstředění používajícího Ficoll (Histopaque 1077) po kterém následuje sedimentace dextranu k odstranění erytrocytů. Jakékoliv zbytkové erytrocyty se lyžují vodou po 30 s a izotonicita se obnoví použitím 10X DBPBS (hmotnost/objem Ca²⁺ nebo Mg²⁺) . PMNs se izolují pomocí odstředění a ještě jednou se dodatečně promyjí IX DB-PBS před stanovením počtu buněk a životaschopnosti (vyloučení barviva trypanpové modře). Počet buněk se v závislosti na jednotlivém dárci upraví na 0,75 až 1,5 x 10⁶/ml.

Degranulace (uvolnění myeloperoxidázy)

Podíl (0,1 ml) výše uvedené buněčné suspenze se inkubuje v Earlesově vyváženém solném roztoku, který obsahuje 20 mM pufru HEPES (pH = 7,4) a 0,1 % želatiny, za přítomnosti 5 pg/ml cytochalasinu B po 5 minut při 37 °C v protřepávané vodní lázni. Buňky se předem upravují po dalších 5 min různými koncentracemi selektivních inhibitorů PDE 4 a PGE2 (3 až 10 nM) před přidáním fMLP (30 nM). Přidá se fMLP a inkubace pokračuje po dalších 30 minut. Reakce se zastaví umístěním vzorku na led po kterém následuje odstředění. Frakce kapaliny nad sedlinou

se odstraní a skladuje zmrazená (-30 °C) do doby zkoušky na aktivitu myeloperoxidázy.

Stanovení aktivity myeloperoxidázy

Aktivita myeloperoxidázy se stanoví použitím (odianisidinu) jako substrátu a peroxidázy křenu selského jako standardu. Podíl (50 μΐ) kapaliny nad sedlinou se inkubuje se 100 μΐ substrátu (o-dianisidin, 0,53 mM; H2O2, 0,147 mM;

konečné koncentrace) v 50 mM natrium fosforečnanového pufru (pH 6,0). Reakce se ukončí přidáním 50 μΐ 4M H2SO4. Tvorba produktu se stanoví měřením absorbance při 410 nm ) a aktivita se určí srovnáním se standardní křivkou používající peroxidázu křenu selského. Údaje se vynesou jako procenta kontroly (množství myeloperoxidázy uvolněné za přítomnosti samotného PGE2) . Jelikož maximální inhibice pozorovaná pro většinu sloučenin je 30 %, hodnot log(ICis) se vypočítá za použití lineární interpolace koncentrací s 15% vynesením.

Příklad 8

Zvrat reserpinem navozené hypotermie u myší

Samci myší kmene CF-1 nebo BALB/c se jednotlivě izolují v drátěných klecích. Zaznamená se teplota v konečníku každé myši před před běžným ošetřením reserpinem (10 mg/kg, interperitoneálně). Čtyři hodiny po podání reserpinu se zaznamená teplota v konečníku a jednotlivým zvířatům se dají různé dávky (orálně) buď testovaných sloučenin, vehikula nebo rolipramu (10 mg/kg). Teplota v konečníku se pak zaznamenává každých 30 minut po 2 h. Údaje se vyjádří jako změna teploty vůči teplotě pozorované 4 hodiny po podání reserpinu (teploty poklesnou přibližně o 10 až 15 °C pod základní úrovně). Křivky • · · · · · • · závislosti účinku na dávkách se sestrojí za použití teplotních změn zaznamenaných při 90-té nebo 120-té minutě po ošetření. Hodnoty ED50 se určí pravděpodobnostní analýzou nebo lineární regresí průměrů 6 až 9 zvířat. K srovnání schopnosti sloučenin zvrátit reserpinem. navozenou hypotermii s jejich schopností inhibovat vázání s nízkou afinitou nebo vázáni s vysokou afinitou, se hodnoty ED₅₀ a IC₅₀ vyjádří jako záporná logaritmická hodnota.

Příklad 9

Vztah mezi biologickou funkcí a inhibici PDE 4

K stanovení zdali jisté bilogické účinky inhibice PDE 4 jsou spojeny s inhibici buď LPDE 4 nebo HPDE 4 se provede srovnání mezi schopností sloučenin způsobit účinek a schopností sloučenin inhibovat LPDE 4 nebo HPDE 4 za použití lineární a řádové korelace. Tyto korelace mohou být ovlivněny několika faktory:

1) stabilitou sloučenin;

2) schopností sloučenin pronikat do buněk;

3) při in vivo studiích, biologickou dostupností sloučenin;

4) korelací hodnot, obzvláště lineární korelace jsou citlivé k rozdílů v silách, čím větší je rozsah hodnot síly, tím snazší je měřit významnou lineární korelaci.

Tyto výstrahy je potřeba vzít v úvahu, když se analyzuje a počítá korelace mezi inhibici LPDE 4 nebo HPDE 4 a biologickou funkcí při různých systémech zkoušek.

Použití izolovaných zánětlivých buněk, potlačení tvorby

TNF_a monocyty a inhibice tvorby superoxidu v eozinofilních leukocytech morčat se lépe koreluje s inhibici LPDE 4 a nikoliv HPDE 4. Mimoto, prevence protilátkou vyvolaného zúžení • 444 4 4 · ··· • 4 44 44 ··· ·· ···· průdušnice in vivo se lépe koreluje s inhibici LPDE 4 než HPDE 4. V tomto in vivo modelu, inhibitory PDE 4 se zdají působit tím, že zabraňují degranulaci žírných buněk (Underwood a kol., v tisku). Avšak inhibice funkce zánětlivých buněk není vždy spojena s inhibici LPDE 4, protože se zjistilo, že inhibice degranulace neurofilních leukocytů se lépe koreluje s inhibici HPDE 4 než LPDE 4. Tak se zdá, že některá, ale ne všechna potlačení působení zánětlivých buněk jsou spojena s inhibici LPDE 4. Proti tomu, zesílení sekrece kyseliny, navození zvracení a vratná reserpinem vyvolaná hypotermie (míra psychotropní síly inhibitorů PDE 4) se lépe koreluje

s inhibici HPDE 4 a potenciálních vedlejších s inhibici HPDE 4.	nikoliv LPDE 4. účinků této třídy	Tak se sloučenin	většina spojuje
Tak tato zjištění	naznačují, že	sloučeniny,	které

přednostně inhibují LPDE 4 mají příznivé protizánětlivé účinky s potlačeným potenciálem vyvolávat nechtěné vedlejší účinky. Tak výběr sloučenin s podílem IC50 asi 0,1 nebo větším vzhledem k hodnotě IC50 katalytické formy PDE 4, která váže rolipram s vysokou afinitou dělené hodnotou IC50 katalytické formy PDE 4, která váže rolipram s nízkou afinitou (HPDE 4/LPDE 4) má za výsledek zvýšení jejich terapeutických indexů tj. prospěšný účinek se maximalizuje a škodlivý účinek se minimalizuje.

K určení zda toto selekční vodítko skutečně identifikuje sloučeniny se zlepšenými terapeutickými indexy, se vyhodnocují tři modely srovnám! léčebných účinků s vedlejšími účinky. Tyto modely zahrnují in vitro srovnání mezi schopností sloučenin potlačit tvorbu TNF_a v izolovaných lidských monocytech a jejich schopností stimulovat sekreci kyseliny v izolovaných králičích temenních žlázách a dvě in vivo srovnání zkoušky schopnosti sloučenin zabránit protilátkou vyvolanému zúžení průdušnice u ·♦···· ·· · ·· · ♦ • · · ···· · · · · • · · ♦· · · ♦ · • 9 * ♦ 9 9 9 9 9 9

99 99 999 99 9999 morčat a schopnosti vyvolat zvracení u psů a schopnosti sloučeniny potlačit tvorbu TNF_a v adoptivním přenosovém modelu u myši a jejich schopnosti zvrátit reserpinem vyvolanou hypotermii u myší.

Inhibitory PDE 4 s podílem selektivity (HPDE 4/LPDE 4) rovným nebo větším než 0,1 vykazují výrazné zlepšení svých terapeutických indexů. Například cis-[1,4-kyan-4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)cyklohexan-l-karboxylát], 2-methoxykarbonyl-4-kyan-4-(3-cyklopropylmethoxy-4-difluormethoxyfenyl)cyklohexan-l-on a cis-[4-kyan-4-(3-cyklopropylmethoxy-4-difluormethoxyfenyl)cyklohexan-l-ol] všechny s podílem selektivity ů 0,1 vykazují 100-násobné zlepšení svých terapeutických indexů ve srovnání s archetypálním inhibitorem PDE 4, R-rolipramem. Toto ukazuje, že použití selekčního vodítka IC50 HPDE 4/ICso LPDE 4 ž 0,1 vede k identifikaci sloučeniny se zvýšeným terapeutickým indexem při in vivo srovnání.

Pokud se týká léčby EIA, podává se sloučenina cis-[1,4-kyan-4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)cyklohexan-l-karboxylát] lidem trpícím EIA. Tito pacienti zažijí sníženou zánětlivost, snížené zúžení průdušnice a plicní neuromodulaci.

Studie odezvy na tělesný pohyb

Pro vyhodnocení účinnosti, bezpečnosti a snášenlivosti cis-[1,4-kyan-4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)cyklohexan-1-karboxylátu] , se provádí náhodná, dvojnásobná slepá, placebem kontrolovaná dvoudobá křížová celková studie u pacientů s EIA. 27 pacientů trpících EIA se vybralo náhodně pro podávání 10 mg sloučeniny v BID tabletách s okamžitým uvolněním nebo placeba, po 7 dní, po kterých následuje 7 dní • · · · ·♦ · · · · « · · · · ·· · ·-···· ···· · • · · · · · ··· • · ·· ··· · · · · ♦ · vymývání a střídá se se 7-mi denní léčbou. Zkoušky odezvy na tělesný pohyb se provádějí po jednotlivé dávce v den jedna, a opět 7-mý den (před dávkou a tři hodiny po dávce).

Skupina pacientů se skládala z nekouřících mužů nebo žen, starých 18 až 60 let s EIA takovým, že:

a) jejich nucený dýchací objem za jednu sekundu (FEVi) je větší než nebo stejný jako 70 % předpovězeného normálu,

b) doložený pokles FEVi je větší nebo se rovná 15 % při odezvě na zkoušku tělesným pohybem při vyšetřovací vizitě, a

c) neužívají inhalované kortikoidy nebo jiné léky na asthma.

Protokol odezvy na tělesný pohyb je následující. Pacienti se pohybují 6 minut na motorizovaném trenažéru se stanovenou rychlostí tepu srdce. Rychlost a sklon se upraví k dosažení cílové srdeční rychlosti pro každého pacienta v úrovni 85 % vzhledem k stáří z upraveného předpovězeného maxima. Pacienti během testu dýchají stlačený vzduch (0 % vlhkosti při teplotě místnosti) přes tvářovou masku. Zkouška funkce plic (KoKo pneumotach) se provádí 1, 5, 10, 15, 20, 30 a 45 minut po dokončení testu a pokračuje poté dokud se FEVi nevrátí do odchylky 10 % od základní úrovně.

Primární proměnnou účinnosti je maximální procentické snížení (MPD) hodnoty FEVi jako odezva na cvičení. Výsledky naznačují, že významné zlepšení MPD hodnoty FEVi po jedné dávce sloučeniny, z průměru MPD 32,88 % na 23,57 %. Projevuje se zde také přínosný účinek sloučeniny po 7 dnech dávkování s dalším zlepšením průměru MPD hodnoty FEVi na 21,8 %. Po jednom týdnu ošetřování u 40 % pacientů dostávajících sloučeninu poklesla po tělesném pohybu hodnota FEVi o méně než nebo o 15 %.

Sloučenina je bezpečná a dobře se snáší, nepojevuje žádná vážná s léčbou spojená nepříznivá zkušenost nebo zhoršení. Viz také Am. J. Resp. Crit. Care Med., 157, A 413 (1998) zahrnutý zde ve svém celku v odkazech.

Všechny publikace, včetně, patentů a patentových přihlášek, ale neomezené na ně, citované v tomto popisu, jsou zde zahrnuty v odkazech, přičemž je u každé jednotlivé publikace specificky a individuálně naznačeno, že je zahrnuta v odkazech jako by plně byla zde uvedena.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použiti specifického inhibitoru PDE 4 pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčbu tělesným pohybem vyvolaného astmatu, astmatu vyvolaného chladným vzduchem nebo astmatu vyvolaného znečištěním životního prostředí, kde inhibitorem je inhibitor schopný inhibovat katalytickou formu PDE 4, která váže R-rolipram s nízkou afinitou.
2. 2. Použití podle nároku 1, specifického inhibitoru PDE 4, který má podíl IC₅o 0,5 nebo větší, pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčbu tělesným pohybem vyvolaného astmatu, astmatu vyvolaného chladným vzduchem nebo astmatu vyvolaného znečištěním životního prostředí.
3. 3. Použití podle nároku 1, specifického inhibitoru PDE 4, který má podíl IC₅₀ 1,0 nebo větší, pro výrobu léčiva pro prevenci nebo léčbu tělesným pohybem vyvolaného astmatu, astmatu vyvolaného chladným vzduchem nebo astmatu vyvolaného znečištěním životního prostředí.
4. 4. Použiti podle některého z nároků 1 až 3, specifického inhibitoru PDE 4, kterým je cis-[4-kyan-4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)cyklohexan-l-karboxylát], pro výrobu léčiva ve formě orálního přípravku s okamžitým uvolňováním nebo orálního přípravku s řízeným uvolňováním účinné látky, pro prevenci nebo léčbu tělesným pohybem vyvolaného astmatu, astmatu vyvolaného chladným vzduchem nebo astmatu vyvolaného znečištěním životního prostředí.