[go: up one dir, main page]

HUP0101719A2 - Javított immundiagnosztikai vizsgálati eljárások redukáló ágensek alkalmazásával - Google Patents

Javított immundiagnosztikai vizsgálati eljárások redukáló ágensek alkalmazásával Download PDF

Info

Publication number
HUP0101719A2
HUP0101719A2 HU0101719A HUP0101719A HUP0101719A2 HU P0101719 A2 HUP0101719 A2 HU P0101719A2 HU 0101719 A HU0101719 A HU 0101719A HU P0101719 A HUP0101719 A HU P0101719A HU P0101719 A2 HUP0101719 A2 HU P0101719A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
hcv
reducing agent
solid phase
protein
polypeptide
Prior art date
Application number
HU0101719A
Other languages
English (en)
Inventor
Alfons Bosman
Joost Louwagie
Geert Maertens
Erwin Sablon
Maan Zrein
Original Assignee
Innogenetics N.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8237028&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HUP0101719(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Innogenetics N.V. filed Critical Innogenetics N.V.
Publication of HUP0101719A2 publication Critical patent/HUP0101719A2/hu
Publication of HUP0101719A3 publication Critical patent/HUP0101719A3/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

A találmány tárgya a HCV-fertőzés kezelésének és diagnózisánakterületére esik. Közelebbről, a találmány tárgyát a HCV-NS3-helikáz ésannak alkalmazása képezi. A találmány tárgyát képezik továbbá redukálóágensek alkalmazásán alapuló javított immundiagnosztikai vizsgálatieljárások is. Ó

Description

Javított immundiagnosztikai vizsgálati eljárások redukáló ágensek alkalmazásával
A találmány tárgya a HCV-fertőzés kezelésének és diagnózisának területére esik. Közelebbről, a találmány tárgyát a HCV-NS3-helikáz és annak alkalmazása képezi. A találmány tárgyát képezik továbbá redukáló ágensek alkalmazásán alapuló javított immundiagnosztikai vizsgálati eljárások is.
A hepatitisz C vírusok (HCV) a Flaviridae családon belül egy nemzetséget alkotnak, a legközelebbi homológjaik a hepatitisz G és GB vírusok és a Pestivírusok. A pozitívszálú RNS genom legalább 9 fehérjét kódol. Core, El és E2 alkotják a szerkezeti fehérjéket. Az NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A és NS5B nem-szerkezeti (non-structural, NS) fehérjék. A HCV-izolátumok nagymértékű szekvencia heterogenitást mutatnak, amely alapján legalább 11 típusba és 90 altípusba osztályozhatjuk ezeket [Maertens és Stuyver, (1997)]. Az emberi máj HCV-fertőzése klinikailag gyakran jóindulatú, enyhe sárgasággal az akut fázisban. A betegség akár észrevétlen is maradhat az akut rezolválódó hepatitisz C néhány esetében. Az esetek többségében (>70%) azonban a HCV-fertőzés krónikus perzisztens vagy aktív fertőzéshez vezet, gyakran máj cirrhózis és autó-immun rendellenesség komplikációkkal. Hepato-celluláris karcinóma fordulhat elő körülbelül 20-35 évvel később [Saito és mtsai.: (1990)], időnként akár a cirrhózis átmeneti fázisa nélkül. Megelőző ke
Aktaszámunk: 93117-9796/PÁ zelés ma nem áll rendelkezésre és az interferon-alfa (IFNa) kezelés hosszú távú megoldáshoz a kezelt eseteknek csak körülbelül 4-36%-ban vezet, a HCV-genotípustól függő módon [Maertens és Stuyver, (1997)].
Mivel HCV-termelésre alkalmas tenyésztési eljárások jelenleg nem elérhetőek és mivel a fertőzött páciensben a HCV-antigének csak minimális mennyisége található a keringésben, a HCV-részecskék közvetlen kimutatása rutinéijáráskent nem végezhető el, és a közvetett diagnózis csak a HCVRNS kimutatásra szolgáló nehézkes amplifikációs eljárások alkalmazásával lehetséges. Számos más vírusfertőzéssel ellentétben a HCV-részecskék általában fennmaradnak a vérben, májban és a limfocitákban a HCV-fehérj ék többségére adott celluláris és humorális immunválasz ellenére. HCV-antitestek kényelmesen ELISA eljárásokkal mutathatóak ki, amelyek lehetővé teszik vérbankokban és klinikai laboratóriumokban a nagy áteresztő képességű szkrínelést. Szükség van kiegészítő antitest vizsgálatra és ez most a legtöbb országban kötelező. így megkülönböztethetjük az igazi HCV-reaktivitást a hamis reaktivitástól, amelyet a szérum vagy plazma immunglobulinok vagy anti-idiotipusos komponensek nem specifikus kötődése okozhat a bevonásra használt vagy blokkoló reagensekhez, vagy a HCV-antigén készítményekben található szennyeződésekhez vagy akár maguknak a rekombináns antigéneknek a fúziós részeihez vagy nem specifikus régióihoz történő nem specifikus kötődés okozhat [McFarlane és mtsai.: (1990)]. Újabban bevezették a HCV-RNS kimutatását PCR vagy elágazó DNS (bDNS) eljárások segítségével krónikus
HCV-betegség követésére, különösen a kezelés során. Meglepő módon időnként HCV-RNS kimutatást alkalmaznak a HCV-Ab szkrinvizsgálatok megerősítésére, azon tény ellenére, hogy az ismételten HCV-Ab pozitív páciens mintáknak csak körülbelül 70-94%-a bizonyult pozitívnak egymásba ágyazott PCR vizsgálat esetén [Marin és mtsai.: (1994)]. A HCV-Ab pozitív véradók között, akik esetében általában a betegség enyhébb formái és alacsony HCV-RNS szintek jelentkeznek, az egymásba ágyazott PCR eljárással történő megerősítés körülbelül 40%-os mértékű [Waumans és mtsai.: (1993); Stuyver és mtsai.: (1996)]. Ennek következtében a tesztcsík-alapú vizsgálati eljárások biztosítják a HCV-Ab megerősítés egyetlen megbízható alternatíváját. Még a megerősítő vizsgalati eljárásban kapott meghatározatlan eredmény esetében is inkább a páciens szerológiai utóvizsgálata javasolható mint a HCV-RNS kimutatás [Di Bisceglie és mtsai.: (1998)]. Mivel természetesen előforduló HCV-antigének nem állnak rendelkezésre megfelelő mennyiségben, az ilyen megerősítő vizsgalati eljárások során szintetikus peptideket és/vagy HCV-fehérjék rekombináns fragmenseit alkalmazzuk. Az antitestek megerősítése során az egyik legkritikusabb kérdéskört az NS3-fehérje reaktivitása veti fel [Zaaijer és mtsai.: (1994)]. Az NS3-antitestek gyakran elsőként jelennek meg a szerokonverziós sorozatokban és az NS3-fehérje reaktivitása különbözőnek tűnik a különböző, jelenleg hozzáférhető kereskedelemben kapható vizsgálati eljárásokban.
Az Innogenetics vezette be a tesztcsík technológia elvét, amelynek során általában szintetikus peptidek és rekombináns fehérjék kombinációját alkalmazzuk diszkrét vonalak formájában felvitten, rendezett és könnyen leolvasható módon. Az INNO-LIA HÍV Ab vizsgálatok jobbnak bizonyultak a rutinszerűen alkalmazott Western-blottoknál [Pollet és mtsai.: (1990)]. A Line Immuno Assay eljárás több paraméteres vizsgálatot biztosit, és igy lehetővé teszi a levágásos és más értékelő rendszerek beépítését, a minta hozzáadásának szabályozását ugyanúgy, mint a nem-HCV-fehérjékkel szemben mutatott hamis reaktivitásra történő vizsgálatot, amely fehérjéket mint szükséges hordozó vagy fúziós partnert alkalmazzuk néhány antigén esetében az ELISA teszt során. Elvileg a teszt formátuma lehetővé teszi különböző etiológiai ágensek antigénjeinek vagy fenotipusosan kapcsolt körülmények kombinálását egyetlen tesztbe.
Az INNO-LIA HCV-Ab III egy harmadik generációs Line Immuno Assay, amely magába foglal a Core régióból, az E2 hipervariábilis régióból (HVR), az NS3-helikáz régióból és az NS4A, NS4B és NS5A régiókból származó HCV-antigéneket. A harmadik generációs vizsgálati eljárásban a nagymértékben tisztított 1b NS3-fehérje rekombináns altípus és az E2 peptidek lehetővé teszik a nagyobb érzékenységet, míg megőrzik a megbízható specifitást, amely a peptid-alapú tesztek jellemzője [Peeters és mtsai.: (1993)]. Ennek a vizsgálati eljárásnak talán az egyik legfontosabb tulajdonsága az eddig korábban nem tapasztalt korrelációja a HCV-RNS pozitivitással [Claeys és mtsai.: (1992); De Beenhouwer és mtsai.: (1992)].
Az antigéneket mint 6 diszkrét vonalat visszük fel műanyag hátú nylon tesztcsíkra. Továbbá mindegyik tesztcsíkra négy kontroll vonalat viszünk fel: anti-streptavidint, 3 + pozitív kontrollt (anti-humán lg), 1+ pozitív kontrollt (humán IgG) és a ± levágás! vonalat (humán IgG). Hígított vizsgálati mintát inkubálunk a LIA III tesztcsíkkal együtt egy vályúban. Amennyiben a mintában jelen vannak, a HCV— antitestek a tesztcsíkon található HCV-antigén vonalakhoz fognak kötődni. Ezután egy affinitás-tisztított, lúgos foszfátázzál jelölt kecske anti-humán IgG (H+L) konjugátumot adunk hozzá, amely - ha korábban már kialakultak - a specifikus HCV-antigén/antitest komplexekkel reagál. Az enzim szubsztráttal történő inkubálás gesztenyebarnához hasonló színt eredményez, amelynek intenzitása egyenesen arányos bármely adott vonalon a mintából megkötött HCV-specifikus antitest mennyiségével. A szín kifejlődését kénsavval állítjuk le. Amennyiben HCV-specifikus antitestek nincsenek jelen, a konjugátum csak a ±, 1+ és 3+ kontroll vonalakhoz kötődik. Ha kihagyjuk a minta hozzáadását, csak a ± és az 1+ kontroll vonalak fognak megfestődni.
A következő meghatározások a találmány leírása során alkalmazott különböző szakszavak és kifejezések magyarázatára szolgálnak.
A HCV-NS3-fehérje kifejezés egy olyan polipeptidet vagy analógját (mint például mimotópokat) jelenti, amely a HCV-NS3-proteáz vagy helikáz legalább egy HCV-epitópját meghatározó aminosav szekvenciát (és/vagy aminosav analógokat) tartalmazza.
A hepatitisz C virus burokfehérje kifejezés olyan polipeptidet vagy annak analógját (mint például mimotópokat) jelenti, amely az El vagy az E2 régió bármelyikének legalább egy HCV-epitópját meghatározó aminosav szekvenciát (és/vagy aminosav analógokat) tartalmazza (lásd: a WO 96/04385 sorszámú szabadalmi dokumentum, amely teljes egészében a kitanitás részének tekintendő).
Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a leírásban a példák ismertetése során említett izolátumok (biológiai minták) a találmány érvényességi körét nem korlátozzák, és az 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 és 12 típusba vagy bármely új HCV-genotípusba tartozó bármely HCV-izolátum a találmány megvalósítására során alkalmazható megfelelő HCV-szekvencia forrásának tekintendő.
A találmány szerint alkalmazható HCV-antigének lehetnek teljes hosszúságú vírusfehérjék, ezeknek lényegében teljes hosszúságú változatai vagy funkcionális fragmensei (azaz olyan fragmensek, amelyek egy epitóp kialakításához vagy fenntartásához létfontosságú összes szekvenciát tartalmazzák) . Továbbá, a találmány szerinti HCV-antigének tartalmazhatnak más szekvenciákat is, amelyet nem blokkolják vagy akadályozzák bármely kívánt konformációs epitóp kialakulását. Egy konformációs epitóp jelenléte vagy hiánya egyszerűen meghatározható a kívánt antigén antitesttel történő szkrínvizsgálata segítségével (poliklonális szérum vagy monoklonális antitest), amikor összehasonlítjuk a reaktivitását az antigén egy denaturált változatával elvégzett vizsgálat eredményével, amely változat csak a lineáris epitópokat őrzi meg (ha vannak). Amikor egy ilyen vizsgálat során poliklonális antitesteket alkalmazunk, előnyös lehet ha először a poliklonális szérumot a denaturált antigénnel adszorbeáljuk és megvizsgáljuk, hogy megőrzi-e a kívánt antigénnel szembeni antitesteket.
A fúziós polipeptid kifejezés olyan polipeptidet jelent, amelyben az antigén (antigének), közelebbről a HCVantigén (antigének) egyetlen folytonos, a természetben elő nem forduló aminosav lánc részei. A HCV-antigének egymással közvetlenül kapcsolódhatnak peptidkötéssel vagy távtartó aminosav szekvenciák választhatják el ezeket. A fúziós polipeptidek tartalmazhatnak még a HCV-vel összevetve exogén aminosav szekvenciákat is.
A szilárd fázis vagy szilárd hordozó kifejezés olyan szilárd testet jelent, amelyhez az egyes HCV-antigéneket vagy a HCV-antigéneket tartalmazó fúziós polipeptidet kovalens vagy nem-kovalens módon - mint például hidrofób adszorpcióval - hozzákötjük. Az alkalmazható szilárd fázisokra például szolgálhatnak a következők: mikrotiter lemezek, membrán tesztcsíkok mint például nylon vagy nitrocellulóz tesztcsíkok és szilícium felületek chipek.
A leírás során a biológiai minta kifejezés olyan emlős egyedből (mint például emberszabású, ember) származó folyadékot vagy szövetet jelent, amely általánosságban tartalmazza az egyed által termelt antitesteket, közelebbről a HCV-ellenes antitesteket. A folyadék vagy szövet úgyszintén tartalmazhat HCV-antigént is. Az ilyen komponensek a technika állása szerint ismertnek tételezhetők fel és - nem korlátozó értelemben - magukba foglalják a következőket: vér, plazma, szérum, vizelet, gerincfolyadék, nyirokfolyadék; a légúti, bélrendszeri és a genitális-urológiai rendszerek váladékai, könny, nyál, tej, fehérvérsejtek és mielómák. A test komponensek magukba foglalják a biológia folyadékokat is.
A biológiai folyadék kifejezés élő szervezetből nyert folyadékot jelent. Némelyik biológiai folyadékot más termékek forrásaként alkalmazzuk, mint például az alvadási faktorok (mint például faktor-VIII), szérum albumin, növekedési hormon és más hasonlók. Ezekben az esetekben fontos, hogy a biológiai folyadék forrása virus - mint például HCV - szennyeződéstől mentes legyen.
Az immunológiailag reaktív kifejezés azt jelenti, hogy a kérdéses antigén specifikusan fog reagálni egy test komponensben jelen lévő HCV-elleni antitestekkel, amely komponens HCV-fertőzött egyedből vagy immunizált egyedből származik.
Az immun komplex kifejezés alatt a leírás során azt a kombinációt értjük, amely egy antitest egy antigénen található epitóphoz történő kötődése során jön létre.
A leírás során alkalmazott El és E2 kifejezéseket részletesen a WO 96/04385 sorszámú szabadalmi dokumentum írja le, amely teljes egészében a kitanítás részének tekintendő .
A leírás során a fehérjékre alkalmazott tisztított kifejezés alatt olyan készítményt értünk, amelyben a kívánt fehérje a készítmény összes fehérje komponensének legalább
35 százalékát alkotja. Előnyösen a kívánt fehérje az összes fehérje komponens legalább 40 százalékát, előnyösebben legalább körülbelül 50 százalékát, előnyösebben legalább körülbelül 60 százalékát, még előnyösebben legalább körülbelül 70 százalékát, még előnyösebben körülbelül 80 százalékát, még előnyösebben legalább körülbelül 85 százalékát, még előnyösebben legalább körülbelül 90 százalékát és legelőnyösebben legalább körülbelül 95 százalékát alkotja. A készítmény tartalmazhat más vegyületeket is mint például szénhidrátokat, sókat, lipideket, oldószereket és más hasonlókat anélkül, hogy az itt alkalmazott százalékos tisztaság meghatározását befolyásolná. Egy izolált HCV-fehérje olyan HCV-fehérje készítményt jelent, amely legalább 35 százalékos tisztaságú.
A leírás során a lényegében tisztított fehérjék kifejezés alatt olyan tisztított fehérjéket értünk, amelyek ín vitro diagnosztikai eljárásokhoz és terápiás vegyületként alkalmazhatóak. Ezek a fehérjék lényegében mentesek a sejt eredetű fehérjéktől vagy DNS-től, vektorból származó fehérjéktől vagy DNS-től vagy más HCV-víruskomponensektől. Általában ezeket a fehérjéket homogenitásig tisztítjuk (legalább 80 százalékos tisztaság, előnyösen 85 százalékos tisztaság, előnyösebben 90 százalékos tisztaság, előnyösebben 95 százalékos tisztaság, előnyösebben 97 százalékos tisztaság, előnyösebben 98 százalékos tisztaság, előnyösebben 99 százalékos tisztaság, még előnyösebben 99,5 százalékos tisztaság és legelőnyösebben a szennyező fehérjék hagyományos eljárásokkal - mint például SDS-PAGE és ezüst
- 10 festés - kimutatásuk nem lehetséges).
A leírás során a rekombináns módon expresszált kifejezés alatt azt a tény értjük, hogy a találmány szerinti fehérjéket rekombináns expressziós eljárások segítségével akár prokariótákban akár alacsonyabb vagy magasabbrendű eukariótákban állítjuk elő, ahogyan ezt a továbbiakban részleteiben tárgyaljuk.
Az alacsonyabbrendű eukarióta kifejezés alatt olyan gazdasejteket értünk mint például élesztő, gombák és más hasonlók. Az alacsonyabbrendű eukarióták általában (de nem szükségszerűen) egysejtűek. Előnyösen alkalmazható alacsonyabbrendű eukarióták az élesztők, közelebbről a Saccharomyces , Schizosaccharomyces, Klyveromyces , Pichia (mint például Pichia pastoris), Hansenula (mint például Hansenula polymorpha} , Yarowia, Schwanniomyces és Zygosaccharomyces családokon belüli fajok és más hasonlók. A leggyakrabban alkalmazott élesztő gazdaszervezetek a következők: Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis és K. lactis.
A leírás során a prokarióta kifejezés alatt olyan gazdaszervezeteket értünk mint például az E. coli, Lactobacillus , Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis vagy Streptomyces. Ezeket a gazdaszerveket szintén alkalmazhatjuk a találmány megvalósítása során.
A leírás során a magasabbrendű eukarióta kifejezés alatt magasabbrendű állatokból, mint például emlősökből, hüllőkből, rovarokból és más hasonlókból származtatott gazdasejteket értünk. Jelenleg az előnyösen alkalmazható ma
- 11 gasabbrendű eukarióta gazdasejtek a következőkből származhatnak: kínai hörcsög (mint például CHO) , majom (mint például COS és Verő sejtek), újszülött hörcsög vese (BEK), sertés vese (PK15), nyúl vese 13 sejtek (RK13), a humán 143 B csontszarkóma sejtvonal, a HeLa humán sejtvonal és humán hepatóma sejtvonalak mint Hep G2 valamint rovar sejtvonalak (mint például Spodoptera frugiperda) . A gazdasejteket alkalmazhatjuk szuszpenzióban, vagy palack tenyészetekben, szövet tenyészetekben, szervtenyészetekben és más hasonlókban. Egy más módon eljárva a gazdasejtek lehetnek még transzgénikus állatokból is.
A leírás során a polipeptid kifejezés alatt aminosavak polimerét értjük és nem vonatkozik a termék specifikus hosszára, tehát a polipeptid definícióba peptidek, oligopeptidek és fehérjék egyaránt beleértendők. A kifejezés ugyanakkor nem utal rá és nem zárja ki a polipeptid expresszió utáni módosításait, mint például glikozilálásokat, acetilezéseket, foszforilációkat és más hasonlókat. A definíció magába foglalja például a következőket: egy vagy több aminosav analógot tartalmazó polipeptidek (beleértve például természetben elő nem forduló aminosavakat, PNA-t, stb.), szubsztituált kötésekkel rendelkező polipeptideket és hasonlóképpen más, a technika állása szerint ismert, természetben előforduló és a természetben elő nem forduló módosításokat is.
A leírás során a rekombináns polinukleotid vagy nukleinsav kifejezés alatt olyan genomi, cDNS, félszintetikus vagy szintetikus eredetű polinukleotidot vagy nukleinsavat
- 12 értünk, amely az eredete vagy módosítása következtében: (1) nem asszociál azon polinukleotid egészével vagy annak részével, amellyel a természetben asszociál; (2) más polinukleotidhoz kapcsolódik mint amelyhez kapcsoltan a természetben előfordul, vagy; (3) a természetben egyáltalán nem található meg.
A leírás során a rekombináns gazdasejtek, gazdasejtek, sejtek, sejtvonalak, sejt tenyészetek és más ehhez hasonló kifejezések alatt - amelyek egysejtű egyedenként tenyésztett mikroorganizmusokra vagy magasabbrendű eukarióta sejtvonalakra vonatkoznak - olyan sejteket értünk, amelyek alkalmazhatóak, vagy már alkalmazták azokat rekombináns vektor vagy más transzfer polinukleotid befogadására, és a kifejezés magába foglalja az eredetileg transzfektált sejt leszármazottait is. Egyértelmű, hogy egyetlen szülősejt leszármazottai nem szükségszerűen teljes mértékben azonosak az eredeti szülősejt morfológiájával, genomi vagy teljes DNS komplementjével természetes, véletlenszerű vagy szándékos mutációk eredményeképpen.
A leírás során a replikon kifejezés alatt bármely genetikai elemet - mint például plazmid, kromoszóma, vírus, kozmid, stb. — értünk, amely egy sejten belül mint független polinukleotid replikációs egység működik, azaz képes a saját ellenőrzése alatt replikálódni.
A leírás során a vektor kifejezés alatt olyan replikont értünk, amely további szekvenciákat tartalmaz kívánt nyílt leolvasási fázis replikációjához és/vagy expressziój ához.
- 13 A leírás során a szabályozó szekvencia kifejezés alatt olyan polinukleotid szekvenciákat értünk, amelyek szükségesek a hozzájuk ligáit kódoló szekvenciák expreszsziójához. Az ilyen szabályozó szekvenciák természete függ a gazdaszervezettől: prokariótákban az ilyen szabályozó szekvenciák általában tartalmaznak promótert, riboszóma kötőhelyet és terminátorokat; eukariótákban általában az ilyen szabályozó szekvenciák tartalmaznak promótereket és tartalmazhatnak enhanszereket. A szabályozó szekvenciák kifejezés magába foglalja - minimális értelmezés szerint az összes olyan komponenst amelyek jelenléte az expresszióhoz szükséges és magába foglalhat még további komponenseket is amelyek jelenléte előnyös, mint például vezető szekvenciákat amelyek irányítják a kiválasztást.
A leírás során a promoter kifejezés alatt olyan nukleotid szekvenciát értünk, amely konszenzus szekvenciákból áll, amely konszenzus szekvenciák lehetővé teszik az RNS polimeráz kötődését a DNS-templáthoz olyan módon, hogy az mRNS termelése a vele szomszédos struktúrgén normál transzkripciós iniciációs helyén kezdődik.
A leírás során a funkcionálisan kapcsolt kifejezés alatt olyan elrendezést értünk, amelyben az így jellemzett komponensek helyzete lehetővé teszi működésüket az eredeti funkciójuknak megfelelően. Egy kódoló szekvenciához funkcionálisan kapcsolt szabályozó szekvencia úgy van hozzákapcsolva, hogy a kódoló szekvencia expressziója a szabályzó szekvenciákkal kompatibilis körülmények között történik.
· · «***«* Μ» *
A leírás során egy nyílt leolvasási fázis (open reading frame, ORF) kifejezés alatt a polinukleotid szekvencia olyan régióját értjük, amely egy polipeptidet kódol és a kiválasztott leolvasási fázisban nem tartalmaz stop kodonokat; ez a régió jelentheti a kódoló szekvencia egy részét vagy egy teljes kódoló szekvenciát.
A leírás során egy kódoló szekvencia alatt olyan polinukleotid szekvenciát értünk, amely a megfelelő szabályozó szekvenciák irányítása alatt mRNS-be átíródik és/vagy polipeptidbe transzlálódik. A kódoló szekvencia határait az 5'-végen egy transzlációs start kodon és a 3'-végen egy transzlációs stop kodon határozza meg. Egy kódoló szekvencia nem korlátozó értelemben magába foglalhat mRNS, vírus RNS, DNS (beleértve cDNS) és rekombináns polinukleotid szekvenciákat.
A leírás során az epitóp vagy antigén determináns kifejezések alatt immunreaktív aminosav szekvenciát értünk. Általában egy epitóp legalább 3-4 aminosavból áll, általánosabban legalább 5 vagy 6 aminosavból áll, egyes esetekben az epitóp körülbelül 7-8 aminosavból vagy akár körülbelül 10 aminosavból áll. A leírás során egy kijelölt polipeptid epitópja olyan epitópokat jelent, amelyek aminosav szekvenciája megegyezik az kijelölt polipeptid epitópjával és ezek immunológiailag egyenértékű változatai. Ilyen egyenértékű változatok magukba foglalhatnak törzs, altípus (= genotípus) vagy típus(csoport)-specifikus variánsokat, mint például a technika állása szerint ismertnek feltételezhető azon szekvenciák vagy törzsek amelyek a következő genotí- 15 - ,: .··. .··. ;··· ··· ·· ·· ·· · pusokba sorolhatók: la, lb, 1c, Id, le, If, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4f, 4g, 4h, 41, 4j, 4k, 41, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, 11a, 12a vagy bármely más újonnan meghatározott HCV-(al)típus. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy az epitópot alkotó aminosavak nem szükségszerűen képezik egy lineáris szekvencia részét, hanem egy vagy több, bármekkora számú aminosavat tartalmazó aminosav sorozat választhatja el ezeket, így konformációs epitópot alakítva ki.
Az immunogén kifejezés egy anyag azon tulajdonságára vonatkozik, hogy az adott anyag képes humorális és/vagy sejtes válasz kiváltására, akár önmagában, akár hordozóhoz kapcsolva, egy adjuváns jelenlétében vagy annak hiányában. A leírás során a neutralizáció kifejezés alatt olyan immunválaszt értünk, amely részlegesen vagy teljesen blokkolni képes egy fertőző ágens fertőzőképességét. A leírás során a vakcina kifejezés alatt olyan immunogén készítményt értünk amely képes HCV elleni részleges vagy teljes védelmet biztosítani. Vakcina alkalmazható még egy egyed kezelésére is, amely esetben terápiás vakcinának nevezzük.
A leírás során a terápiás kifejezés alatt HCV-fertőzés kezelésére alkalmazható készítményt értünk.
A leírás során a hatásos mennyiség kifejezés alatt olyan mennyiségű epitóp-hordozó polipeptidet értünk, amely elégséges egy immunválasz kiváltására az egyedben, amelybe bejuttatták vagy más eljárás esetén kimutathatóan immunológiailag reagál a kívánt rendszerben (mint például
- 16 immunoassay, azaz immunológiai vizsgálati eljárás). Előnyösen a hatékony mennyiség elégséges kezelés megvalósítására a fenti definíció szerint. A ténylegesen szükséges mennyiség az alkalmazásnak megfelelően változik.
A leírás során az antitest kifejezés alatt poliklonális vagy monoklonális antitesteket értünk. A monoklonális antitest kifejezés alatt olyan antitest készítményt értünk, amelynek antitest populációja homogén. A kifejezés nem korlátozza az antitestet biztosító fajt vagy annak forrását és a kifejezés nem korlátozza az antitest előállításának módját sem. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a találmány érvényességi körén belülinek tekintendők továbbá a humanizált antitestek, egyetlen láncú antitestek vagy ezek bármely további fragmense, amely nagymértékben megőrzi az említett antitest specifitását.
A leírás során a humanizált antitest kifejezés alatt azt értjük, hogy egy immunglobulin vázrégióinak legalább egy része humán immunglobulin szekvenciákból származik.
A leírás során az egyetlen láncú antitest kifejezés alatt olyan antitesteket értünk, amelyeket egy kötő antitest kötést biztosító dóménjeinek (mind nehéz és könnyű láncok) meghatározásával és olyan kapcsoló egység biztosításával hoztunk létre amely, amely lehetővé teszi a kötési funkció megőrzését.
A leírás során a(z) (antitest) fragmensei kifejezés alatt Fab, F(ab)2, Fv és további fragmenseket értünk, amelyek megőrzik az eredeti antitest antigén kötő funkcióját és specifitását.
- 17 A találmány tárgyát javított HCV-diagnosztikai vizsgálati eljárás komponensek és terápiás fehérjék képezik.
Közelebbről a találmány tárgyát javított HCV-NS3-fehérje készítmények képezik HCV-antitest diagnózis és/vagy HCV-kezelés során történő alkalmazásra.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás HCVantitestek reaktivitásának növelésére szilárd fázison megkötött rekombináns vagy szintetikus NS3-helikáz fehérjével vagy annak részével szemben.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy új eljárás ciszteint tartalmazó rekombináns fehérjék, közelebbről rekombináns HCV-fehérjék tisztítására.
A találmány tárgyát képezik továbbá új HCV-NS3fehérjét kódoló szekvenciák.
A találmány tárgyát képezik továbbá új HCV-NS3-fehérjét kódoló szekvenciák, amelyek terméke nem reagál a tévesen pozitív HCV-mintákkal.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti nukleinsavak kimutatására.
A találmány tárgyát képezik továbbá próbák és primerek a találmány szerinti nukleinsavak kimutatására.
A találmány tárgyát képezi továbbá diagnosztikai reagens készlet a találmány szerinti nukleinsavak kimutatására .
A találmány tárgyát képezik továbbá új HCV-NS3-polipeptidek.
A találmány tárgyát képezik továbbá új HCV-NS3-polipeptidek, amelyek nem reagálnak a tévesen pozitív HCV
- 18 mintákkal.
A találmány tárgyát képezi továbbá gyógyhatású készítmény a HCV-fertőzés megelőzésére vagy kezelésére.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a találmány szerinti polipeptidek kimutatására.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti polipeptidekkel szemben kifejlesztett antitestek passzív immunizálás és/vagy terápia során történő alkalmazásra .
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti polipeptidek előállítására.
Úgy tekintjük, hogy a találmány tárgyának megvalósíthatóságát az alább ismertetésre kerülő megvalósítási módok kellő mértékben alátámasztják.
Közelebbről a találmány tárgyát szilárd fázisú immunoassay képezi, amelynek során a szilárd fázison redukáló ágens jelenlétében egy antigén található. Amint ezt a Példák részben bemutatjuk, a feltalálók azt találták, hogy egy redukáló ágens jelenléte - mint például DTT - egy szilárd fázisra felvitt antigén mellett sokkal reaktívabbá teszi a szilárd fázisú immunológiai vizsgálat során a kapcsolt antigént az ellene irányuló antitestekkel szemben. Oldatban hasonlóképpen az antigén a redukálással reaktívabbá válik.
A találmány szerinti redukáló ágens bármely ágens lehet, amely S-S diszulfid hidak redukálását biztosítja. Az S-S diszulfid hidak redukálása egy kémiai reakció, amelynek során a diszulfidokat tiolokká (-SH) redukáljuk. A WO 96/04385 sorszámú szabadalmi dokumentumban ismertetett di
- 19 szulfid hidat felszakító ágensek és eljárások teljes egészükben a kitanítás részének tekintendők. Az S-S redukálást elérhetjük: (1) enzimatikus kaszkád reakció utakkal vagy (2) redukáló vegyületekkel. Ismert, hogy olyan enzimek mint például a tioredoxin, glutaredoxin részt vesznek diszulfidok in vivo redukálásában és kimutatták, hogy hatékonyak SS hidak in vitro redukálásában is. A redukált tioredoxin gyorsan hasítja a diszulfid hidakat pH 7,0 értéknél, olyan látszólagos másodfokú reakció sebességgel, amely körülbelül 104-szer nagyobb mint a DTT-vel végzett reakció megfelelő sebességi állandója. A redukciót jelentősen meggyorsíthatjuk a fehérje oldat 1 mM DTT-vel vagy dihidro-lipoamiddal végzett elő-inkubációjával [Holmgren, 1979].
Tiol vegyületek, amelyek képesek fehérje diszulfid hidakat redukálni például a következők lehetnek: ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), β-merkaptoetanol, tiokarbamátok, bis(2-merkaptoetil)-szulfon, N,N'-bis(merkaptoacetil)hidrazin és nátrium-ditionit.
Tiol csoport nélküli redukáló ágensek - mint például aszkorbát vagy ón-klorid (SnCl2) - amelyekről monoklonális antitestek esetén kimutatták, hogy nagyon hasznosak diszulfid hidak redukálásában [Thakur és mtsai.: 1991] szintén alkalmazhatóak az NS3 redukálására. Kimutatták, hogy a nátrium-borohidrid kezelés peptidek esetében hatékony a diszulfid hidak redukálásában [Gailit, 1993]. A trisz-(2karboxietil)-foszfin (TCEP) képes alacsony pH mellett diszulfidokat redukálni [Burns és mtsai.: 1991], A szelenol katalizálja a diszulfidok tiollá történő redukálását, ami
- 20 kor redukáló szerként DTT-t vagy nátrium-borohidridet alkalmazunk. Szeleno-ciszteamint - egy kereskedelemben beszerezhető diszelenidet - alkalmaztak a katalizátor előanyagaként [Singh és Kats: 1995].
Közelebbről a találmány tárgyát képezi egy eljárás a fentebb meghatározottak szerinti immunoassay megvalósítására, ahol a redukáló ágenst a szilárd fázishoz adjuk mialatt az antigénnel a szilárd fázist bevonjuk, majd a szilárd fázist blokkoljuk és/vagy fixáljuk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a fentebb ismertetett immunoassay elvégzésére, amelynek megvalósítása során a redukáló ágenset az előkezelési lépés során adjuk a szilárd fázishoz.
A bevonás során alkalmazott körülmények a szakember számára egyértelmű módon széles skálán változhatnak és magukba foglalják a fehérje szilárd fázisra juttatását és olyan reakció végrehajtását, amelynek eredményeképpen a fehérje a szilárd fázishoz kötődik. A kötődés nem korlátozó értelemben lehet például kovalens, hidrofób vagy ionos kötés, Van dér Waals erők által biztosított kötések vagy hidrogén híd kötések. A szakember számára ismert, hogy ezen lépés során különböző puffereket alkalmazhatunk, nem korlátozó értelemben például a következőket: karbamát és foszfát pufferek.
A blokkolást bármely, a technika állása szerint ismert eljárással elvégezhetjük, például végezhetjük albumin, szérum fehérjék, polivinil-pirrolidon (PVP), felületaktív
- 21 anyagok, zselatinok, polivinil-alkohol (PVA) vagy kazein alkalmazásával.
A fixálást bármely, a technika állása szerint ismert eljárás szerint végezhetjük.
A blokkolási, fixálási és bevonási körülményekre további példákat a Példák részben ismertetünk.
A találmány tárgyát képezi még közelebbről meghatározva a fentiekben ismertetett eljárás, amelynek megvalósítása során a redukáló ágenst a szilárd fázishoz a szilárd fázis antigénnel történő bevonási lépése során adjuk hozzá. A bevonásra alkalmazható pufferekre a Példák fejezetben adunk meg példákat. A technika állása szerint ismert bármely más további bevonásra alkalmazható puffer is a találmány érvényességi körén belülinek tekintendő.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben ismertetett eljárás, amelynek megvalósítása során a redukáló ágenst a szilárd fázishoz a szilárd fázis blokkolási lépése során adjuk hozzá, ahol az antigén szilárd fázisra történő felvitele redukáló ágens jelenlétében vagy annak hiányában történt. A blokkolásra alkalmazható pufferekre a Példák fejezetben adunk meg példákat. A technika állása szerint ismert bármely más további blokkolásra alkalmazható puffer is a találmány érvényességi körén belülinek tekintendő.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben ismertetett eljárás, amelynek megvalósítása során a redukáló ágenst a szilárd fázishoz a bevonásra használt antigén szilárd fázisra történő fixálási lépése során adjuk hozzá, ahol az antigén szilárd fázisra történő felvitele redukáló
- 22 ágens jelenlétében vagy annak hiányában történt. A fixálási lépést megelőzheti egy blokkolási lépés is redukáló ágens jelenlétében vagy annak hiányában. A fixálásra alkalmazható pufferekre a Példák fejezetben adunk meg példákat. A technika állása szerint ismert bármely más további, fixálásra alkalmazható puffer is a találmány érvényességi körén belülinek tekintendő.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben ismertetett immunoassay végrehajtására alkalmas eljárás, amelynek megvalósítása során a redukáló ágenst a szilárd fázis előkezelési lépése során adjuk hozzá a minta hozzáadását megelőzően. A lemezek előkezelése végrehajtható olyan lemezekkel, amelyeket már kezeltünk redukáló ágenssel a bevonási, blokkolási és/vagy fixálási lépés során vagy olyan lemezekkel, amelyeket korábban nem kezeltünk redukáló ágenssel .
Végül a redukáló ágens hozzáadható bármely további lépés során, amelyet a találmány szerinti enzimes immunológiai vizsgálatok során végrehajtunk, elképzelhető módon egy redukáló ágens alkalmazását követően a bevonás, blokkolás, fixálás és/vagy előkezelés fenti 4 lépéséből egy vagy több lépés során. Az ilyen további lépések nem korlátozó értelemben magukba foglalják az antitestek inkubálásának, a kötött antitestek kimutatásának és a szín kifejlődésének a lépéseit.
A találmány tárgyát képezi előnyösen a fentiekben ismertetett eljárás, amelynek megvalósítása során a redukáló ágens DTT, DTE vagy TCEP.
- 23 A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben ismertetett eljárás, amelynek megvalósítása során a redukáló ágenst a 0,1 mM és 1 M közötti koncentráció tartományban alkalmazzuk, közelebbről meghatározva a 0,5 mM és 500 mM közötti koncentráció tartományban, még közelebbről meghatározva az 1 mM és 250 mM közötti koncentráció tartományban, legközelebbről meghatározva az 1-50 mM közötti koncentráció tartományban alkalmazzuk. Néhány alkalmazáshoz szükséges lehet a 0,5-50 mM, 1-30 mM, 2-20 mM, 5-15 mM koncentráció tartomány vagy körülbelül 10 mM redukáló ágens. Más alkalmazásokhoz szükséges lehet az 50-500 mM, 100-300 mM DTT koncentráció tartomány vagy a 200 mM DTT koncentráció. A DTT különösen jól alkalmazható, mint redukáló ágens.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben ismertetett eljárás, amelynek megvalósítása során az antigén egy HCV-NS3-fehérje. Közelebbről meghatározva egy HCV-NS3-helikáz. Szintén előnyösen alkalmazható egy HCV-burokfehérje, mint például az El és/vagy E2 fehérje. Hasonlóképpen bármely más, a technika állása szerint ismert fehérje esetében létrejöhet erősebb reakció a fehérje elleni antitestekkel, amikor a fehérjét a szilárd fázishoz DTT jelenlétében adjuk hozzá, vagy ezt követően DTT-vel kezeljük.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben ismertetett eljárás, amelynek megvalósítása során
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben ismertetett eljárás, amelynek megvalósítása során a szilárd fázisú immunológiai vizsgálati eljárásban különböző etioló
- 24 giai ágensekből, vagy fenotípusosan kapcsolódó kórképekből származó antigének kombinációját alkalmazzuk.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentebb ismertetett eljárás segítségével létrehozott szilárd fázisú immunoassay. Közelebbről meghatározva a találmány tárgyát képezi olyan reagens készlet, amely legalább egy szilárd fázist - mint például mikrotiter lapot, membrán tesztcsíkot vagy szilícium lapkát - tartalmaz, amely viszont antigént tartalmaz redukáló ágens jelenlétében.
Közelebbről meghatározva a találmány tárgyát képezi egy ELISA eljárás, amelyet a fentebb ismertetett eljárás segítségével hoztunk létre.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint eljárva az ELISA eljárást a fentiekben ismertetett eljárás segítségével hozzuk létre, ahol a redukáló ágenst előnyösen a bevonási és/vagy fixálási lépésben adjuk hozzá. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint eljárva a redukáló ágenst a bevonási lépésben alkalmazzuk. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint eljárva a redukáló ágenst a fixálási lépésben alkalmazzuk. A találmány egy további, különösen előnyös megvalósítási módja szerint eljárva a redukáló ágenst mind a bevonási, mind a fixálási lépésben alkalmazzuk.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint eljárva az ELISA eljárást a fentiekben ismertetett eljárás segítségével hozzuk létre, ahol a redukáló ágenst a lemezek előkezelése során adjuk hozzá a minta hozzáadását megelőzően. A lemezek előkezelése elvégezhető olyan lemeze
- 25 ken, amelyeket a bevonási és/vagy fixálási lépésben kezel tünk redukáló ágenssel vagy olyan lemezekkel, amelyeket korábban nem kezeltünk redukáló ágenssel. A redukáló ágens hozzáadható bármely olyan további lépésben is, amelyet enzim immunológiai vizsgálatok során hajtunk végre. Az ilyen további lépések nem korlátozó értelemben magukba foglalják az antitestek inkubálását, a kötött antitestek kimutatását és a szín kifejlesztését.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben ismertetett eljárás segítségével létrehozott Line Immunoassay (LIA) is.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint eljárva a Line Immunoassay (LIA) eljárást a fentiekben ismertetett eljárás segítségével hozzuk létre, ahol a redukáló ágenst előnyösen a blokkolási és/vagy mosási lépésben adjuk hozzá. A redukáló ágens hozzáadható bármely olyan további lépésben is, amelyet enzim immunológiai vizsgálatok létrehozása vagy végrehajtása során végzünk. Az ilyen további lépések nem korlátozó értelemben magukba foglalják a fixálást, előkezelést, az antitestek inkubálását, a kötött antitestek kimutatását és a szín kifejlesztését.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben ismertetett eljárás segítségével létrehozott QUICK vizsgálati eljárás is.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint eljárva a QUICK vizsgálati eljárást a fentiekben ismertetett eljárás segítségével hozzuk létre, ahol a redukáló ágenst előnyösen az antigén tesztcsíkra történő felviteli
lépése során adjuk hozzá. A QUICK vizsgálati eljárás egy laterális áramlást alkalmazó vizsgálati eljárás, amelynek során az antigéneket a tesztcsíkra permetezve visszük fel. Ebben a vizsgálati eljárásban a redukáló ágenst előnyösen a permetező oldathoz adjuk hozzá. A redukáló ágens hozzáadható bármely olyan további lépésben is, amelyet enzim immuno lógiai vizsgálatok létrehozása vagy végrehajtása során végzünk. Az ilyen további lépések nem korlátozó értelemben ma gukba foglalják a blokkolást, fixálást, előkezelést, az antitestek inkubálását, a kötött antitestek kimutatását és a szín kifejlesztését.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentebb leírt vizsgálati eljárás alkalmazasa a fentebb leírt antigén el len termeltetett antitestek in vitro kimutatására.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy HCV-NS3-fehérje is, amelyet szulfonalasi es azt követő deszulfonálási le pésből álló eljárás segítségével kezelünk.
A szulfonálás és a deszulfonálás olyan reakció, amely segítségével - sorrendben megfeleltetve - -S03 csoportokat viszünk be a fehérjébe vagy távolítunk el a fehérjéről.
A szulfonálás meghatározása szerint olyan folyamat, ahol a fehérjéken (R) található tiolcsoportokat (SH) és diszulfid kötéseket S-szulfonátokká alakítjuk át a következő reakciók szerint:
RSH —> RS-SO3· (1)
RS-SR + 2 -S03 _ + H20 —> 2 RS-SO3~ + 2 OH (2)
A reakciók termékei S-szulfoproteinek, amelyek általában stabilak semleges pH értéknél. Az (1) reakció megváló
- 27 sítható oly módon, hogy a fehérje oldatot tetrationáttal inkubáljuk 7 feletti pH értéknél [Inglis és Liu, 1970] . A (2) reakció teljesen végbemegy réz ionok jelenlétében [Cole, 1967], Chan kimutatta [Chan, 1968], hogy egy fehérje kezelése nátrium-szulfittál és katalitikus mennyiségű ciszteinnel oxigén jelenlétében szulfo-proteinekhez vezet.
A deszulfonálás végrehajtható: (1) kompetitív -SH (tiol) csoportok feleslegével, (2) redukáló ágensekkel vagy (3) inkubálással semlegestől eltérő pH körülmények között.
RS-SO3 + R'SH —> RSH + R'S-SO3·
RS-SO3~ + redukáló ágens —> RSH
Kompetitív tiol csoportokat nyerhetünk alacsony molekulatömegű vegyületekből vagy fehérje-szerű -SH csoportokból .
A mono- vagy ditiolt tartalmazó vegyületekre például szolgálhatnak a következők:
Cisztein, ciszteamin, redukált glutation, N-acetil cisztein, homocisztein, β-merkaptoetanol, tiokarbamátok, bisz(2-merkaptoetil)-szulfon (BMS) és N,N'-bisz(merkaptoacetíl)-hidrazin (BMH), 5,5'-ditio-bisz-(2-nitrobenzoesav) (DTNB vagy Elman-féle reagens), ditio-treitol (DTT) és ditío-eritritiol (DTE).
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiek szerint meghatározott HCV-NS3-fehérje is amelyet továbbá zwitterionos felületaktív anyaggal kezeltünk. Az Empigen a bétáin néven ismert és ez különösen előnyös példája lehet a zwitter-ionos felületaktív anyagnak. További alkalmazható felületaktív anyagok a szakember számára ismertnek tételezhetők
- 28 fel és összefoglalásuk megtalálható a WO 96/04385 sorszámú szabadalmi dokumentumban.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás ciszteint tartalmazó, rekombinás módon expresszált fehérje tisztítására, amelynek során a következő lépésekből legalább 2, előnyösen 3 vagy 4, és még előnyösebben az összes végrehajtásra kerül:
(a) rekombináns gazdasejtekből származó lizátumot szulfonálunk vagy rekombináns gazdasejteket lizálunk guanidínium-klorid (előnyösen 6 M Gu x HC1) jelenlétében és a sejt lizátumot szulfonáljuk;
(b) zwitter-ionos felületaktív anyaggal kezeljük, előnyösen a sejttörmelék eltávolítása után;
(c) a szulfonált rekombináns fehérjét megtisztítjuk, vagy a szulfonált rekombináns fehérjét a zwitter-ionos felületaktív anyag eltávolítását követően tisztítjuk, amikor a tisztítást előnyösen kromatográfia segítségével végezzük, még előnyösebben Ni-IMAC kromatográfia segítségével végezzük, ahol a rekombináns fehérje egy His-jelölővel ellátott rekombináns fehérje;
(d) A szulfonált rekombináns fehérjét deszulfonáljuk, előnyösen redukáló ágens, mint például a DTT moláris feleslegével;
(e) a fehérjét DTT moláris feleslege jelenlétében tároljuk .
Az Empigen a zwitter-ionos felületaktív anyag különösen előnyös példájául szolgálhat. Úgy találtuk, hogy egy ilyen zwitter-ionos felületaktív anyag és a DTT bevitele
- 29 4Μ« · · *< Ί ,ί. —·' javított a tisztítási eljáráson a HCV-NS3-helikáz és a HCVburokfehérjék esetében.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy HCV-NS3-poliproteint kódoló HCV-polinukleinsav is, ahogyan ez az 1. ábrán (3-18. azonosítási szám szerinti szekvenciák) látható vagy egy HCV-polinukleinsav egyedi része, amely a 2-1., 31., 4-1., 5-1., 6-1., 7-1. és 8-1. ábrákon látható szekvenciával rendelkezik (19., 21., 23., 25., 29. és 31. azonosítási szám szerinti szekvenciák).
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentebb leírt, a 2-1., 3-1., 4-1., 5-1., 6-1., 7-1. és 8-1. ábrákkal jellemzett, és továbbá azon ténnyel jellemezhető HCV-polinukleinsav, hogy ennek terméke nem reagál hamis pozitív HCVmintákkal, vagy ennek része, amely olyan NS3-epitópokat kódol, amelyek nem reagálnak hamis pozitív HCV-mintákkal. Különösen meglepő volt, hogy a 19., 21., 23., 25., 29. és 31. azonosítási szám szerinti szekvenciákkal jellemzett kiónok által kódolt fehérjék rendelkeznek azon képességgel, hogy nem lépnek reakcióba hamis pozitív HCV-mintákkal, mégis ezek képesek voltak reakcióba lépni az ismert NS3-antitest pozitív minták legtöbbjével DTT kezelést követően.
A találmány tárgyát képezi továbbá a leírtaknak megfelelő polinukleinsavat tartalmazó rekombináns vektor.
A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti vektort tartalmazó gazdasejt.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti nukleinsav kimutatására. Ez a kimutatási eljárás a technika állása szerinti ismert bármely kimutatá
- 30 • · * * * si eljárás lehet, mint például a Maertens és Stuyver által a WO 96/13590 szabadalmi dokumentumban részletesen leírt élj árás.
Közelebbről meghatározva a találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti nukleinsav kimutatására, amelynek során:
(1) a nukleinsavat próbával érintkeztetjük;
(2) meghatározzuk a komplexet, amely a nukleinsav és a próba között jött létre.
Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi a fentiekben leírt izolált nukleinsav, vagy annak fragmense primerként vagy próbaként történő alkalmazásra.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy diagnosztikai reagens készlet a fentiekben leírt nukleinsav-szekvencia kimutatására, amely reagens készlet a találmány szerinti legalább egy prímért és/vagy legalább egy próbát tartalmaz. Ezen alkalmazások áttekintésének részletes leírásához a WO 96/13590 sorszámú szabadalmi dokumentumra hivatkozunk.
A redukció során nyert reaktivitás mellett az NS3reaktivitást szintén komoly mértékben meghatározza az NS3antigén szekvenciája.
Ezért tehát a találmány tárgyát képezi továbbá olyan HCV-polipeptid, amely az 1., 2-2., 3-2., 4-2., 5-2., 6-2., 7-2. és 8-2. ábrákon bemutatott aminosav szekvenciák egészének vagy részének megfelelő szekvenciával rendelkeznek (20., 22., 24., 26., 28., 30 és 32. azonosítási szám szerinti szekvenciák). A találmány tárgyát képezi továbbá az 1. ábrán feltüntetett (1-18. azonosítási szám szerinti
- 31 szekvenciák) HCV-NS3-helikáz fehérje is vagy annak egyedi része.
A találmány tárgyát képezi továbbá olyan HCV-NS3helikáz fehérje vagy annak része, amely az S1200, A1218, A1384, P1407, V1412, P1424 vagy F1444 aminosavak bármelyikét vagy ezen aminosavak kombinációját tartalmazza a következő aminosavak bármelyikével: L1201, S1222, 11274, S1289, T1321, A1323, T1369, L1382, V1408, A1409 vagy F1410. A számozás az általánosságban elfogadott HCV-aminosavszámozási rendszer szerint történt.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy gyógyhatású készítmény, amely egy találmány szerinti polipeptidet vagy annak bármely funkcionálisan egyenértékű variánsát vagy fragmensét tartalmazza. A leírás során a gyógyhatású készítmény kifejezés alatt olyan készítményt vagy orvosságot (mindkét kifejezés egymással felcserélhető módon alkalmazható) értünk, amely találmány szerinti polipeptidet és gyógyszerészetileg elfogadható hordozót vagy excipienst tartalmaz (mindkét kifejezés egymással felcserélhető módon alkalmazható). Ez a gyógyhatású készítmény orvosságként alkalmazható. Ez a gyógyhatású készítmény orvosságként alkalmazható HCV-fertőzés kezelésére vagy megelőzésére. A szakember számára ismertnek feltételezhető megfelelő hordozók vagy excipiensek a következők lehetnek: fiziológiás sóoldat, Ringer-féle oldat, dextróz oldat, Hank-féle oldat, fixált olajok, etil-oleát, 5% dextróz fiziológiás sóoldatban, olyan anyagok, amelyek növelik az izotónikusságot és a kémiai stabilitást, pufferek és tartósítószerek. További meg- 32 felelő hordozók közé tartozik bármely olyan hordozó, amely önmagában nem indukálja a készítményt kapó egyedre nézve káros antitestek termelését, mint például a fehérjék, poliszacharidok, politejsavak, poliglikol savak, polimerizált aminosavak és aminosav kopolimerek. A gyógyhatású készítmény vagy orvosság a szakember által ismertnek feltételezhető bármely megfelelő módszerrel beadható. A bejuttatás előnyösen parenterálisan vagy vakcina formájában történhet. Parenterális vagy vakcina formájában történő bejuttatás esetében a találmány szerinti orvosságot egység dózis alapú injektálható formában formulázzuk, mint például oldat, szuszpenzió vagy emulzió, a fentebb leírt gyógyszerészetileg elfogadható excipienssel együtt. Vakcina alkalmazásokhoz vagy poliklonális antiszérum/antitestek létrehozásához például a hatásos mennyiség változhat a fajtól, kortól és az egyed általános állapotától függő módon, a kezelendő állapot súlyosságától, az adott kiválasztott polipeptidtől és a bejuttatás módjától, stb. Feltételezhetően a hatásos mennyiség viszonylag széles, nem kritikus tartományon belül található. A megfelelő hatásos mennyiség könnyen meghatározható csupán rutinszerű kísérletek elvégzésével. Az NS3 és/vagy El és/vagy E2 és/vagy E1/E2 önmagában álló vagy specifikus oligomer burokfehérjék esetében a HCVbetegség megelőzése érdekében előnyösen alkalmazható menynyiségek a 0,01-1000 μg/dózis tartományba, előnyösen 0,1100 μρ/όόζίΞ tartományba, még előnyösebben az 1-50 μρ/0όζί5 tartományba esnek. Egyedenként számos dózisra lehet szükség annak érdekében, hogy kellő mértékű immunválaszt érjünk el
- 33 és ezt követően védelmet kapjunk a HCV-betegség ellen. Terápiás vakcina esetében a szükséges dózisok száma meghaladhatja a 10 dózist. Ugyanakkor folyamatos infúzió is alkalmazható. Ebben az esetben az orvosság infúziós dózisa 5 és 20 gg/kg/perc között lehet, előnyösebben 7 és 15 μg/kg/perc között van. Az is egyértelmű, hogy a találmány szerinti gyógyhatású készítmény tartalmazhatja a 3-18., 20., 22., 24., 26., 28., 30., 32. azonosítási szám szerinti szekvenciákban megadott szekvenciák funkcionálisan egyenértékű variánsát vagy fragmensét. Ez utóbbi kifejezés alatt olyan molekulát értünk, amely tartalmazza a találmány szerinti polipeptid teljes fehérje szekvenciáját vagy a találmány szerinti polipeptid fehérje szekvenciájának egy részét, amelyen bizonyos változtatásokat alkalmaztunk és amely megtartja a találmány szerinti polipeptid összes biológiai tulajdonságait vagy azoknak egy részét. Az ilyen módosítások közé tartozhatnak - nem korlátozó jelleggel említve - a poliszacharid láncok hozzáadása, bizonyos kémiai csoportok hozzáadása, lipid részegységek hozzáadása, fúzió más peptid vagy fehérje szekvenciákkal, és az intramolekuláris keresztkötések kialakítása.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fentiekben leírt HCV-polipeptidet tartalmazó immunoassay. Az immunoassay a technika állása szerint ismert bármely formátumtípus lehet (lásd például a WO 96/13590 sorszámú szabadalmi dokumentumot valamint Colligan és munkatársai publikációját, (1992)). Közelebbről meghatározva a találmány tárgyát képe
- 34 zi egy eljárás a találmány szerinti polipeptid kimutatására, amely során:
(1) a polipeptidet a polipeptidhez kötődő liganddal érintkeztetjük;
(2) meghatározzuk a polipeptid és a ligand között létrejött komplexet.
Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti polipeptidet megkötni képes ligand. A leírás során a ligand kifejezés alatt bármely olyan molekulát értünk, amely képes megkötni a találmány szerinti polipeptideket. Ez utóbbi kifejezés közelebbről olyan poliklonális és/vagy monoklonális antitestekre vonatkozik, amelyeket specifikusan a találmány szerinti polipeptidek ellen termeltettünk (a technika állása szerinti ismert bármely módszer segítségével) magába foglal bármely antitest-szerű és további konstrukciót, amelyek részletes leírása megtalálható Lorré és munkatársai EP 97870092.0 lajstromszámú szabadalmában. Az ilyen antitestek nagyon jól alkalmazhatók lehetnek antigén kimutatására biológiai folyadékokban. Az antigén kimutatása a technika állása szerint ismert bármely immunológiai vizsgálati eljárás segítségével megvalósítható, mint például olyan vizsgálati eljárások alkalmazásával, amelyek biotint és avidint vagy streptavidint alkalmaznak, ELISA-val és immun-precipitációval, immun-hisztokémiai technikákkal és agglutinációs vizsgálati eljárások segítségével .
- 35 Ezen vizsgálati eljárások részletes leírása megtalálható a WO 96/13590 sorszámú szabadalmi dokumentumban, amely teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő.
Továbbá az antitestek nagyon jól alkalmazhatók lehetnek a HCV-kezelésében vagy más betegségek kezelésében és ezért humanizálhatok, amennyiben előállításuk nem-humán gazdaszervezetben történik. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezik ezen antitestek készítményei gyógyszerészetileg elfogadható excipiensben, orvosságként történő alkalmazáshoz .
A találmány tárgyát képezi továbbá bármely eljárás a találmány szerinti poliproteinek előállítására és alkalmazására. HCV-poliproteinek előállítására és alkalmazására szolgáló eljárások kerültek leírásra a WO 96/13590 sorszámú szabadalmi dokumentumban. Az alkalmazások nem csak diagnosztikai alkalmazásokat, hanem terápiás és profilaktikus alkalmazásokat is magukba foglalnak. A találmány szerinti NS3-fehérj ék ugyanakkor különösen alkalmasak vakcina készítményekben történő felhasználásokra. A vakcina készítmények az aktív összetevő mellett tartalmazhatnak a technika állása szerint ismert bármely adjuvánst. A WO 96/13590 sorszámú szabadalmi dokumentum teljes egészében a kitanítás részeként tekintendő. A találmány szerinti NS3-fehérjék úgyszintén felhasználhatók bármely olyan alkalmazásban, ahol egy NS3-helikáz alkalmazása szóba jöhet, mint például gyógyszer szkrínelési célokra.
- 36 Az 1. ábra a HCV la és 1b altípusok által fertőzött szérumból izolált HCV NS+ kiónok aminosav szekvenciáit mutatja be.
A 2-1. ábra az mTNFH6NS3 19b-klón fúziós fehérje DNS kódoló szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
A 2-2. ábra az mTNFH6NS3 19b-klón fúziós fehérje aminosav szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia tartalmazza az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
A 3-1. ábra az mTNFH6NS3 B9-klón fúziós fehérje DNS kódoló szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
A 3-2. ábra az mTNFH6NS3 B9-klón fúziós fehérje aminosav szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a egy multilinker részét.
A 4-1. ábra az mTNFH6NS3 3a típusú 21-klón fúziós fehérje DNS kódoló szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
- 37 A 4-2. ábra az mTNFH6NS3 3a típusú 21-klón fúziós fehérje aminosav szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
Az 5-1. ábra az mTNFH6NS3 3a típusú 32-klón fúziós fehérje DNS kódoló szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
Az 5-2. ábra az mTNFH6NS3 3a típusú 32-klón fúziós fehérje aminosav szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
A 6-1. ábra az mTNFH6NS3 2a típusú fúziós fehérje DNS kódoló szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
A 6-2. ábra az mTNFH6NS3 2a típusú fúziós fehérje aminosav szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
A 7-1. ábra az mTNFH6NS3 2b típusú fúziós fehérje DNS kódoló szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az
- 38 mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
A 7-2. ábra az mTNFH6NS3 2b típusú fúziós fehérje aminosav szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
A 8-1. ábra az mTNFH6NS3 2c típusú fúziós fehérje DNS kódoló szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multilinker egy részét.
A 8-2. ábra az mTNFH6NS3 2c típusú fúziós fehérje aminosav szekvenciáját mutatja be. A félkövéren szedett szekvencia a nem-NS3-szekvencia. Ez a szekvencia kódolja az mTNF fúziós partnert, a hexahisztidint jelölést és a multi— linker egy részét.
1. példa
HCV~NS3 1b típusú klón-19b expressziója E. coli-ban
1.1 A HCV-NS3 lb típusú klón-19a és klón-19b gének klónozása:
Az NS3-helikáz domént (1188-1465. aminosavak) RT-PCR reakció segítségével amplifikáltuk HCV lb altípus IG8309 szérumból (Innogenetics, Ghent, Belgium) a következő szintetikus oligonukleotid primerek alkalmazásával: HCPr59 (5'GGG CCC CAC CAT GGG GGT TGC GAA GGC GGT GGA CTT-3' ) (1. azonosítási szám szerinti szekvencia) és HCPröO (5'-CTA TTA
- 39 GCT GAA AGT CGA CTG TCT GGG TGA CAG CA-3' ) (2. azonosítási szám szerinti szekvencia). Ez az eljárás a 19. PCR fragmenst eredményezte, amelyet E. coli—ha klónoztunk. A HCPr59 szensz primer egy Apai restrikciós hasítóhelyet illeszt be, amely mesterséges metionint tartalmaz. A HCPr60 antiszensz oligonukleotid egy stop kodont illeszt be az 14 65. aminosav után. A klónozás után a PCR fragmenst Apai restrikciós enzimmel hasítottuk és az eredményül kapott 833 bp nagyságú Apai fragmenst az Apai restrikciós enzimmel elhasított pmTNFHRP expressziós vektorba (Innogenetics, Ghent, Belgium) klónoztuk. Négy hepatitisz C kiónt (HCC1) szekvenáltunk meg: HCC119a és HCC119b (lásd: az 1. és 2-2. ábrákon bemutatott levezetett aminosav szekvenciák). A HCC119b kiónt (pmTNFHRPHCC119b) további szubklónozásra megőriztük .
1.2 A pEmTNFMPHHCCl19b expressziós plazmid megszerkesztése:
A pmTNFHRPHCC119b vektorból kiindulva az NS3 19b-klón kódoló szekvenciáját 900 bp nagyságú Ncol fragmensként izoláltuk és a fragmenst Ncol restrikciós enzimmel hasított pEmTNFMPH expressziós vektorba (Innogenetics, Ghent, Belgium) illesztettük, ezzel létrehozva a pEmTNFMPHHCCl19b vektort. Ez a plazmid a HCV-NS3 19b-klónt az egér eredetű TNF 25 N-terminális aminosavval N-terminális fúziós fehérjeként expresszálja, amelyet hexahisztidin tisztítási jelölő és hangyasavas hasítási hely követ (19. és 20. azonosítási szám szerinti szekvenciák, 2. ábra).
1.3 A HCV-NS3 klón-19b expressziója E. coli-ban:
Az MC1061(pAcI) E. coli törzs sejteket [Wertman és mtsai., 1986] a pEmTNFMPHHCCll9b plazmiddal transzformáltuk. A pEmTNFMPHHCCll9b plazmidot tartalmazó MC1061(pAcI) sejteket 28 C°-on éjszakán át növesztettük 10 pg/ml tetraciklinnel kiegészített Luria folyékony táptalajban (Luria Broth, LB) . A tenyészeteket 20-szorosára hígítottuk friss LB táptalajban, majd 28 C°-on 0,2 OD60o értékig növesztettük, amely után a hőmérsékletet 42 C°-ra emeltük. Az indukció után 2-3 órával a sejteket begyűjtöttük. A HCV-NS3 klón-19b fúziós fehérje expresszióját specifikus monoklonáhs antitesteket és HCV-pozitív humán szérumot alkalmazva Western-blott segítségével analizáltuk.
2. példa
A HCV-NS3 la típusú klón-B9 expressziója E. coli-ban
2.1 A HCV-NS3 la típusú klón-B9 gén klónozása:
Az NS3-helikáz domént (1188-1465. aminosavak) RT-PCR segítségével amplifikáltuk HCV la altípus IG21054 szérumból (Innogenetics, Ghent, Belgium) a következő szintetikus oligonukleotid primerek alkalmazásával: HCPr59 (5'-GGG CCC CAC CAT GGG GGT TGC GAA GGC GGT GGA CTT-3') (1. azonosítási szám szerinti szekvencia) és HCPr60 (5'-CTA TTA GCT GAA AGT CGA CTG TCT GGG TGA CAG CA-3') (2. azonosítási szám szerinti szekvencia). Ez az eljárás a B PCR fragmenst eredményezte, amelyet E. coli-ba klónoztunk. A HCPr59 szensz primer egy Apai restrikciós hasítóhelyet illeszt be, amely mesterséges metionint tartalmaz. A HCPr60 antiszensz oligonukleo
- 41 tid stop kodont juttatott be az 1465. aminosav után. Ezt követően a PCR fragmenst a pGEM-T vektorba klónoztuk (Promega, Madison, WI, US) . A következő négy kiónt szekvenáltunk meg: B7, B9, B12 és B14 (lásd: a levezetett aminosav szekvenciák a 1. és 3-2. ábrákon). A B9 kiónt (pGEMTNS3B9) további szubklónozásra megőriztük.
2.2 A pIGFHlllNS3B9 expressziós plazmid megszerkesztése:
A pGEMTNS3B9 vektorból kiindulva a klón-B9 kódoló szekvenciáját 900 bp nagyságú Ncol/Spel tompa fragmensként izoláltuk és a fragmenst Ncol/Stul restrikciós enzimekkel hasított pIGFHlll expressziós vektorba (Innogenetics, Ghent, Belgium) illesztettük, ezzel létrehozva a pIGFHl11NS3B9 vektort. Ez a plazmid a HCV-NS3 klón-B9-t az egér eredetű TNF 25 N-terminális aminosavval N-terminális fúziós fehérjeként expresszálja, amelyet hexahisztidin tisztítási jelölő és hangyasavas hasítási hely követ (21. és 22. azonosítási szám szerinti szekvenciák, 3. ábra).
2.3 A HCV-NS3 klón-B9 expressziója E. coli-ban:
MC1061(pAcI) E. coli törzs sejtjeit [Wertman és mtsai., (1986)] a pIGFHlllNS3B9 plazmiddal transzformáltuk. A pIGFHlllNS3B9 plazmidot tartalmazó MC1061(pAcI) sejteket 28 C°-on éjszakán át növesztettük 10 pg/ml tetraciklinnel kiegészítet Luria folyékony táptalajban (Luria Broth, LB) A tenyészeteket 20-szorosára hígítottuk friss LB táptalajban, majd 28 C°-on 0,2 ODgoo értékig növesztettük, amely után a hőmérsékletet 42 C°-ra emeltük. Az indukció után 2—3 órával a sejteket begyűjtöttük. A HCV-NS3 klón-B9 fúziós
- 42 fehérje expresszióját specifikus monoklónális antitesteket és HCV-pozitív humán szérumot alkalmazva Western-blott segítségével analizáltuk.
3. példa
A HCV-NS3 la típusú klón-A26, klón-C16 és klón-D18 expressziója E. coli-ban
Az A26, C16 és D18 kiónokat - sorrendben megfeleltetve - HCV la altípussal fertőzött IG21051, IG17790 és IG21068 szerűmből izoláltuk a klón-B9-nél leírt eljáráshoz hasonló módon, a HCPr59 és HCPr60 primerek alkalmazásával. Elsődlegesen az A5, A26, Cl, C3, C4 ,C12, C16, D17, D18 és D19 kiónokat klónoztuk és szekvenáltuk (lásd: 1. ábrán bemutatott levezetett aminosav szekvenciák) . Az A26, C16 és D18 kiónokat további szubklónozásra megőriztük.
4. példa
A HCV-NS3 3a típusú klón-21 és klón-32 expressziója E. coli-ban
4.1 A HCV-NS3 3a típusú klón-21 és klón-32 gének klónozása:
Az NS3-helikáz domént (1188-1465. aminosavak) RT-PCR reakció segítségével amplifikáltuk HCV 3a altípus IG21349 es IG20014 szérumokból (Innogenetics, Ghent, Belgium) a következő szintetikus oligonukleotid primerek alkalmazásával: 403 (5'-GGG CCC CAC CAT AGG TGT AGC AAA AGC CCT ACA GTT-3r) (33. azonosítási szám szerinti szekvencia) és 404 (5'-CTA TTA GCT GAA GTC AAC GTA CTG TTC AAC AGC-3') (34. azonosítá
- 43 si szám szerinti szekvencia). Az eljárás mindkét esetben egy körülbelül 850 bp nagyságú PCR fragmenst eredményezett, amelyet ezt követően pGEM-T vektorba szubklónoztunk (Promega, Madison, WI, US) . Mindegyik klónozott PCR fragmensből számos kiónt szekvenáltunk meg, de mindegyik szérumból csak egyetlen klónozott fragmens bizonyul teljes mértékig helyesnek a szekvenálás szerint. Ez az IG21349 szérumnál a klón-21 (pGEM-TNS3T3a.21) volt és az IG20014 szérumnál a klón-32 (pGEM-TNS3T3a.32) volt (4. és 5. ábrák) .
4.2 A pIGFHlllNS3T3a.21 és pIGFHlllNS3T3a.32 expreszsziós plazmidok megszerkesztése:
A pGEM-TNS3T3a.21 és PGEM-TNS3T3a.32 vektorokból kiindulva, a klón-21 és a klón-32 kódoló szekvenciákat mint 850 bp nagyságú Ncol/Sáli fragmenseket izoláltuk és a fragmenseket Ncol/Sáli restrikciós enzimekkel hasított pIGFHlll expressziós vektorba (Innogenetics, Ghent, Belgium) illesztettük, ezzel - sorrendben megfeleltetve - a pIGFHlllNS3T3a.21 és pIGFHlllNS3T3a.32 vektorokat létrehozva. Ezek a plazmidok a HCV-NS3 3a típusú klón-21-t és klón32-t az egér eredetű TNF 25 N-terminális aminosavval Nterminális fúziós fehérjeként expresszálják, amelyet hexahisztidin tisztítási jelölő és hangyasavas hasítási hely követ (23-26. azonosítási szám szerinti szekvenciák, 4. és 5. ábrák) .
4.3 A HCV-NS3 3a típusú klón-21 és klón-32 expreszsziója E. coli-ban:
Az MC1061(pAcI) E. coli törzs sejteket [Wertman és mtsai., 1986] - sorrendben megfeleltetve - a pIGFHlllNS3T3a.21 és pIGFHlllNS3T3a.32 plazmidokkal transzformáltuk. A pIGFHlllNS3T3a. 21 vagy pIGFHlllNS3T3a. 32 plazmidot tartalmazó MC1061(pAcI) sejteket 28 C°-on éjszakán át növesztettük 10 pg/ml tetraciklinnel kiegészített Luria folyékony táptalajban (Luria Broth, LB) . A tenyészeteket 20-szorosára hígítottuk friss LB táptalajban, majd 28 C°-on 0,2 OD600 értékig növesztettük, amely után a hőmérsékletet 42 C°-ra emeltük. Az indukció után 2-3 órával a sejteket begyűjtöttük. A HCV-NS3 3a típusú klón-21 és klón-32 fúziós fehérjék expresszióját specifikus monoklonális antitesteket és HCV-pozitív humán szérumot alkalmazva Westernblott segítségével analizáltuk.
5. példa A HCV-NS3 2a típusú klón-3 expressziója E. colí-ban
5.1 A HCV-NS3 2a típusú klón-3 gén klónozása:
Az NS3-helikáz domént (1188-1465. aminosavak) RT-PCR segítségével amplifikáltuk HCV 2a altípus IG21342 szérumból (Innogenetics, Ghent, Belgium) a következő szintetikus oligonukleotid primerek alkalmazásával: 412 (5'-GGG CCC CAC CAT GGG CGT GGC CAA GTC CAT AGA CTT-3' ) (35. azonosítási szám szerinti szekvencia) és 413 (5'-CTA TTA GCT GAA GTC TAC AAC TTG AGT GAC CGC-3') (36. azonosítási szám szerinti szekvencia). Ez az eljárás egy körülbelül 850 bp nagyságú PCR fragmenst eredményezett, amelyet ezt követően a pGEM-T vektorba szubklónoztunk (Promega, Madison, WI, US) . Számos
- 45 kiónt szekvenáltunk meg és a klón-3-t (pGEM-TNS3T2a) további szubklónozásra megőriztük (6. ábra).
5.2 A pIGFHlllNS3T2a expressziós plazmid megszerkesztése :
A pGEM-TNS3T2a vektorból kiindulva, a klón-3 kódoló szekvenciáját mint egy 850 bp nagyságú Ncol fragmens izoláltuk és Ncol restrikciós enzimmel hasított pIGFHlll expressziós vektorba (Innogenetics, Ghent, Belgium) illesztettük be, ezzel a pIGFHlllNS3T2a vektort létrehozva. Ez a plazmid a HCV-NS3 2a típusú klón-3-t az egér eredetű TNF 25 N-terminális aminosavval N-terminális fúziós fehérjeként expresszálja, amelyet hexahisztidin tisztítási jelölő és hangyasavas hasítási hely követ (27. és 28. azonosítási szám szerinti szekvenciák, 6. ábra).
5.3 A HCV-NS3 2a típusú klón-3 expressziója E. coliban :
Az MC1061(pAcI) E. coli törzs sejteket [Wertman és mtsai., 1986] a pIGFHlllNS3T2a plazmiddal transzformáltuk. A pIGFHlllNS3T2a plazmidot tartalmazó MC1061(pAcI) sejteket 28 C°-on éjszakán át növesztettük 10 pg/ml tetraciklinnel kiegészített Luria folyékony táptalajban (Luria Broth, LB) . A tenyészeteket 20-szorosára hígítottuk friss LB táptalajban, majd 28 C°-on 0,2 OD600 értékig növesztettük, amely után a hőmérsékletet 42 C°-ra emeltük. Az indukció után 2-3 órával a sejteket begyűjtöttük. A HCV-NS3 2a típusú klón-3 fúziós fehérje expresszióját specifikus monoklonális antitesteket és HCV-pozitív humán szérumot alkalmazva Westernblott segítségével analizáltuk.
6. példa
A HCV-NS3 2b típusú klón-9 expressziója E. coli-ban
6.1 A HCV-NS3 2b típusú klón-9 gén klónozása:
Az NS3—helikáz domént (1188-1465. aminosavak) RT-PCR segítségével amplifikáltuk HCV 2b altípusú IG20192 szérumból (Innogenetics, Ghent, Belgium) a következő szintetikus oligonukleotid primerek alkalmazásával: 401 (5'-GGG CCC CAC CAT GGG CGT AGC CAA ATC CAT TGA CTT—3F ) (37. azonosítási szám szerinti szekvencia) és 402 (5'-CTA TTA GCT GAA GTC TAC AAT TTG AGA GAC CGC-3') (38. azonosítási szám szerinti szekvencia). Ez az eljárás egy körülbelül 850 bp nagyságú PCR fragmenst eredményezett, amelyet ezt követően a pGEM-T vektorba szubklónoztunk (Promega, Madison, WI, US) . Számos kiónt szekvenáltunk meg és a klón-9-t (pGEM-TNS3T2b) további szubklónozásra megőriztük (7. ábra).
6.2 A pIGFHlllNS3T2b expressziós plazmád megszerkesztése :
A pGEM-TNS3T2b vektorból kiindulva, a klón-9 kódoló szekvenciáját mint egy 850 bp nagyságú Ncol fragmens izoláltuk és Ncol restrikciós enzimmel hasított pIGFHlll expressziós vektorba (Innogenetics, Ghent, Belgium) illesztettük, ezzel a pIGFHlllNS3T2b vektort létrehozva. Ez a plazmid a HCV-NS3 2b típusú klón-9—t az egér eredetű TNF 25 N-terminális aminosavval N-terminális fúziós fehérjeként expresszálja, amelyet hexahisztidin tisztítási jelölő és hangyasavas hasítási hely követ (29. és 30. azonosítási szám szerinti szekvenciák, 7. ábra).
6.3 A HCV-NS3 2b típusú klón-9 expressziója E. coliban :
Az MC1061(pAcI) E. coli törzs sejteket [Wertman és mtsai., 1986] a pIGFHlllNS3T2b plazmiddal transzformáltuk. A pIGFHlllNS3T2b plazmidot tartalmazó MC1061(pAcI) sejteket 28 C°-on éjszakán át növesztettük 10 pg/ml tetraciklinnel kiegészített Luria folyékony táptalajban (Luria Broth, LB) . A tenyészeteket 20-szorosára hígítottuk friss LB táptalajban, majd 28 C°-on 0,2 0D600 értékig növesztettük, amely után a hőmérsékletet 42 C°-ra emeltük. Az indukció után 2-3 órával a sejteket begyűjtöttük. A HCV-NS3 2b típusú klón-9 fúziós fehérje expresszióját specifikus monoklonális antitesteket és HCV-pozitív humán szérumot alkalmazva Westernblott segítségével analizáltuk.
7. példa
A HCV-NS3 2c típusú klón-14 expressziója E. coli-ban
7.1 A HCV-NS3 2c típusú klón-14 gén klónozása
Az NS3-helikáz domént (1188-1465. aminosavak) RT-PCR segítségével amplifikáltuk HCV-2c altípusú IG20031 szérumból (Innogenetics, Ghent, Belgium) a következő szintetikus oligonukleotid primerek alkalmazásával: 401 (5'-GGG CCC CAC CAT GGG CGT AGC CAA ATC CAT TGA CTT-3') (37. azonosítási szám szerinti szekvencia) és 402 (5'-CTA TTA GCT GAA GTC TAC AAT TTG AGA GAC CGC-3') (38. azonosítási szám szerinti szekvencia). Ez az eljárás egy körülbelül 850 bp nagyságú PCR fragmenst eredményezett, amelyet a pGEM-T vektorba szubklónoztuk (Promega, Madison, WI, US) . Számos kiónt
- 48 szekvenáltunk meg és a klón-14-t (pGEM-TNS3T2c) további szubklónozásra megőriztük (8. ábra).
7.2 A pIGFHl11NS3T2C expressziós plazmid megszerkesztése :
A pGEM-TNS3T2c vektorból kiindulva, a klón-14 kódoló szekvenciáját mint 850 bp nagyságú Ncol fragmens izoláltuk és Ncol restrikciós enzimmel hasított pIGFHlll expressziós vektorba (Innogenetics, Ghent, Belgium) illesztettük, ezzel a pIGFHlllNS3T2c vektort létrehozva. Ez a plazmid a HCV-NS3 2c típusú klón-14-t az egér eredetű TNF 25 N-terminális aminosavval N-terminális fúziós fehérjeként expresszálja, amelyet hexahisztidin tisztítási jelölő és hangyasavas hasítási hely követ (31. és 32. azonosítási szám szerinti szekvenciák, 8. ábra).
7.3 A HCV-NS3 2c típusú klón-14 expressziója E. coliban:
MC1061(pAcI) E. coli törzs sejteket [Wertman és mtsai., 1986] a pIGFHlllNS3T2c plazmiddal transzformáltuk. A pIGFHlllNS3T2c plazmidot tartalmazó MC1061(pAcI) sejteket 28 C°-on éjszakán át növesztettük 10 pg/ml tetraciklinnel kiegészített Luria folyékony táptalajban (Luria Broth, LB). A tenyészeteket 20-szorosára hígítottuk friss LB táptalajban, majd 28 C°-on 0,2 OD6oo értékig növesztettük, amely után a hőmérsékletet 42 C°-ra emeltük. Az indukció után 2-3 órával a sejteket begyűjtöttük. A HCV-NS3 2c típusú klón-14 fúziós fehérje expresszióját specifikus monoklonális antitesteket és HCV-pozitív humán szérumot alkalmazva Westernblott segítségével analizáltuk.
8. példa.
Az NS3-helikáz fehérje dómén tisztítása
Kilenc térfogat 8M guanidínium-hidrokloridot (Gu x HC1) és egy térfogat 0,2 M NaHP04-ot adtunk minden grammegyenértéknyi nedves E. coli sejtmasszához és az oldatot folyamatos vortexezéssel homogenizáltuk. Az oldathoz szilárd Na2S4O6-ot és Na2SO3-ot adtunk - sorrendben megfeleltetve - 65 és 360 mM végső koncentrációig. CuSO4-ot (törzsoldat: 0,1 M 25 % NH3-ban) adtunk még hozzá 100 μΜ végső koncentrációig. Az oldatot sötétben és szobahőmérsékleten éjszakán át kevertettük, majd -70 C°-on végzett inkubáció után 4 C°-on végzett centrifugálással (30 perc, 20.000 ford/min, JA20 rotor) megtisztítottuk.
Empigen BB™-t (Albright & Wilson Ltd., Okibury, Egyesült Királyság) és imidazolt adtunk a felülúszóhoz - sorrendben megfeleltetve - 1% (tömeg/térf) és 20 mM végső koncentrációig. A pH-t 1 N HC1 segítségével 7,2-re állítottuk be. 3 1 sejttenyészetnek megfelelő minta mennyiséget 2 ml/perc sebességgel vittünk fel 25 ml Ni-IDA Sepharose FF oszlopra (XK 16/20 oszlopméret, Pharmacia, Uppsala, Svédország) , amelyet 20 mM imidazolt tartalmazó puffer A-val (puffer A: 50 mM foszfát, 6 M Gu x HC1, 1% Empingen, pH 7,2) ekvilibráltunk. A Ni-IDA Sepharose oszlopot egymás után a következőkkel mostuk:
mM imidazolt tartalmazó puffer A mM imidazolt tartalmazó puffer A mM imidazolt tartalmazó puffer A
- 50 50 mM imidazolt tartalmazó puffer B (puffer B: 50 mM foszfát, 6 M Gu x HC1, pH 7,2)
200 mM imidazolt tartalmazó puffer B.
A kromatográfia során mindegyik mosási lépést addig folytattuk, amíg 280 nm-nél mérve az abszorbancia el nem érte az alapvonal értékét. Az oszlopot 50 mM EDTA, 500 mM NaCl pH 7,0 oldatával regeneráltuk.
A frakciókat SDS-PAGE eljárás segítségével analizáltuk nem redukáló körülmények között, ezüst festéssel. Az mTNFNS3 B9 fúziós fehérjét a 200 mM imidazolos elúcióban találtuk meg. Nyúl eredetű anti-humán TNF (1 pg NS3/sáv) és nyúl eredetű anti-E. coli ellenanyagok (10 pg NS3/sáv) alkalmazásával végzett Western-blott kimutatta, hogy az NS3 99% feletti tisztaságot mutat ezen egyetlen kromatográfiás lépés után.
A 200 mM imidazolos elúció frakcióit összeöntöttük és sómentesítettük.
ml Ni-IDA eluátum mintát vittünk fel 10 ml/perc sebességgel 300 ml Sephadex G25 oszlopra (XK 50, Pharmacia, Uppsala, Svédország), amelyet 50 mM foszfát, 6 M karbamid, 1 mM EDTA, pH 7,2 oldatával ekvilibráltunk. 10 ml-es frakciókat szedtünk és a fehérje koncentrációt a mikro-BCA eljárással (Pierce, Rockford, IL, USA) határoztuk meg. A fehérje koncentrációt 500 pg/ml értékre állítottuk be a sómentesítő pufferrel a deszulfonálás és redukálás előtt. A végső kitermelés 50-55 mg tisztított NS3 fúziós fehérje volt a tenyészet minden ekvivalens literére.
- 51 Végül DTT-t (törzsoldat: 100 mM, desztillált vízben) adtunk 100-szoros moláris feleslegben az NS3-antigén cisztein tartalmához viszonyítva (például az NS3 19b 7 ciszteint tartalmaz). Az oldatot nitrogénnel átöblítettük és 28 C°-on 1 órán keresztül inkubáltuk. Az NS3-mintát ezt követően a megfelelő pufferben hígítottuk ELISA és LIA vizsgálatokhoz történő bevonásra.
9. példa
NS3-helikáz antitest reaktivitásának vizsgálata LIAban
Az NS3-helikáz antitest reaktivitásának vizsgálata céljából foszfát pufferolt fiziológiás sóoldatban 50 pg/ml koncentrációjú NS3-antigénoldatból egy vonalat vittünk fel nylon membrán tesztcsíkokra. A tesztcsíkokat legalább 1 órán keresztül szárítottuk 18-24 C° közötti hőmérsékleten, majd ezt követően PBS/kazein oldattal blokkoltuk DTT redukáló ágens jelenlétében (10 mM) vagy hiányában. A tesztcsíkokat ezt követően Tween 20-t tartalmazó és DTT-t nem tartalmazó vagy 10 mM DTT-t tartalmazó PBS-sel mostuk, majd 1 mM EDTA-t tartalmazó és DTT-t nem tartalmazó vagy 10 mM DTT-t tartalmazó vízzel mostuk. A membránokat 30 percig szárítottuk, majd tesztcsíkokra vágtuk a különböző páciensekből származó minták vizsgálatához.
Egy kísérlet eredményeit, amelyben a tesztcsíkokat a PHV903 anti-HCV szerokonverziós panellel () inkubáltuk, az 1. táblázatban mutatjuk be.
10. példa
NS3-helikáz antitest reaktivitásának vizsgálata ELISAban
Az NS3-helikáz antitest reaktivitásának vizsgálata céljából ELISA lemezeket vontunk be a 4. példa szerint tisztított NS3-antigénekkel a következők szerint.
Mikrotiter lemez lyukakat vontunk be az NS3-fehérjével 0,3 pg/ml koncentrációjú NS3-fehérjét alkalmazva bevonó pufferben, amely puffer a következőket tartalmazta: 50 mM karbonát puffer, 1 mM EDTA és amely tartalmazott még 200 mM DTT-t vagy a DTT-t kihagytuk. A mikrotiter lemezeket 18 órán keresztül inkubáltuk 20 C°-on és lyukanként 300 μΐ PBS/kazein pufferrel blokkoltuk. A lemezeket 2 órán keresztül inkubáltuk 20 C°-on és ezt követően 20 C°-on 2 órán keresztül 300 μΐ fixáló pufferrel fixáltuk, amely puffer a következőket tartalmazta: 1 mM EDTA és 200 mM DTT vagy a DTT-t kihagytuk.
Az eredményeket a 2. és 3. táblázatokban mutatjuk be. A 2. táblázat adja meg a vizsgálatok jel/zaj értékeit amelyek során az NS3-fehérjét DTT jelenlétében vagy DTT hiányában vittük fel és fixáltuk, a vizsgálatokat a PHV901 PHV912 BBI szerokonverziós panelekkel végezve. A 3. táblázat mutatja meg azon napok számának összegzését, amennyivel korábban kimutathatók a HCV-antitestek a DTT-t is tartalmazó vizsgálatok esetében. Világosan látható, hogy összességében 34 napos korábbi kimutatás érhető el 12 HCVszerokonverzió esetében azzal, hogy a vizsgálati eljárás során DTT-t alkalmazunk.
1. táblázat. HCV-NS3-bevont BBI panelek LIA segítségével vizsgálva, ahogyan ez leírásra került a 9. példában.
PHV +DTT1 -DTT1
903-01 - —
903-02 - —
903-03 + —
903-04 2 —
903-05 2 ±
903-06 2 +
903-07 4 2
903-08 ..... 4 2
1_: nincs reakció; + pozitív reakció; az intenzitás értékeket ugyanazon tesztcsíkra felvitt különböző levágás! vonalak összehasonlítása szerint adjuk meg
2. táblázat. HCV-NS3-bevont BBI panelek ELISA segítségével vizsgálva, ahogyan ez leírásra került a 10. példában.
MEMBER ID# BLEED DATE + DTT (OD450) -DTT (OD450)
PHV901-O1 09/23/93 0.1 0.3
PHV901-02 11/27/93 0.1 0.3
PHV901-03 12/29/93 2.0 2.9
PHV901-04 12/31/93 2.1 3.0
PHV901-OS 01/05/94 2.2 3.1
PHV90I-06 01/07/94 2.4 3.2
PHV901-07 02/01/94 4.1 6.0
- 54 • ./ ·*«· ·** ·· · ·♦ ’
PHV901-08 02/09/94 3.9 S. 9
PHV901-09 03/01/94 4.0 7.9
PHV901-10 03/08/94 4.1 7.8
PHV901-11 04/ 14/94 4.2 8.3
PHV903-O1 02/07/92 0.2 0.2
PHV903-02 02/12/92 0.9 0.9
PHV903-03 02/14/92 1.3 1.6
PHV903-04 02119/92 2.5 2.7
PHV903-O5 02/21/92 2.8 2.8
PHV903-06 02/26/92 3.2 4.6
PHV903-07 02/28/92 3.5 5.4
PHV903-08 03/04/92 3.5 4.1
PHV904-O1 04/18/95 0.1 0.2
PHV904-O2 04/20/95 0.1 0.3
PHV904-03 04/25/95 0.1 0.2
PHV904-04 04/27/95 0.1 0.2
PHV904-OS 05/02/95 0.4 0.4
PHV904-06 05/09/95 0.8 0.5
PHV904-07 05/11/95 0.8 o.s
PHV905-01 11/17/9S 0.1 0.2
PHV905-02 11/21/95 0.1 0.3
PHV905-03 11/24/95 0.1 0.3
PHV90S-04 11/28/95 0.2 0.3
PHV905-O5 J 12/01/9- 0.5 ______0^3
PHV905-06 12/05/95 1.0 0.4
PHV905-07 12/08/95 2.5 0.8
PHV905-08 12/12/95 3.5 2.2
PHV905-09 12/15/95 3.5 3.2
MEMBER ID# BLEED DATE +DTT (OD45o) -DTT (OD45o)
PHV 907-01 04/06/96 0.1 0.2
PHV907-02 04/10/96 0.1 0.2
PHV907-03 04/13/96 0.1 0.2
PHV907-04 04/19/96 3.0 2.2
PHV907-05 04/24/96 3.7 4.1
PHV907-06 04/27/96 3.6 4.1
PHV907-07 09/17/96 3.9 7.6
PHV908-O1 01/26/96 0.1 0.1
PHV908-02 01/29/96 0.1 0.1
PHV908-03 01/31/96 0.1 0.1
PHV908-04 02/06/96 0.1 0.1
PHV908-05 02/08/96 0.1 0.1
PHV908-06 02/14/96 0.2 0.1
PHV908-07 02/20/96 1.4 0.2
PHV908-08 02/22/96 1.6 0.2
PHV908-09 02/27/96 1.9 0.2
PHV908-10 03/01/96 2.3 0.2
PHV908-11 03/07/96 2.3 0.4
PHV908-12 03/11/96 2.8 0.5
PHV908-13 03/14/96 2.8 0.5
PHV909-01 01/28/96 0.1 0.4
PHV909-02 02/15/96 2.3 5.4
PHV909-03 02/17196 2.4 5.3
PHV910-O1 08/26/96 0.1 0.2
PHV910-02 08/30/96 0.4 0.2
PHV910-03 09/03/96 2. 7 3.1
PHV910-04 09/06/96 3.6 6.4
PHV910-05 09/10/96 3.9 8.1
PHV911-01 10/30/96 0.1 0.2
PHV911-02 11/02/96 0.1 0.2
PHV911-03 11/13/96 2.1 4.0
PHV911-04 11/20/96 3.6 7.8
PHV911-05 11/23/96 3.7 7.7
PHV912-O1 01/06/96 0.2 0.3
PHV912-02 01/10/96 0.2 0.2
PHV912-03 01/13/96 4.5 9,9
MEMBER ID# BLEED DATE + DTT -DTT
PHV902-01 02/10/92 0.1 0.2
PHV902-02 02/12/92 0.1 0,2
PHV902-03 02/17/92 0.1 0.3
PHV902-04 02/19/92 0.3 0.6
PHV902-05 02/24/92 2.6 3.9
PHV902-06 02/26/92 3.1 5.9
PHV902-07 03/02/92 3.4 6.5
PHV906-O1 10/07/95 0.5 0, 3
PHV906-02 10/09/95 0.5 0.4
PHV906-03 10/14/95 1.6 0.6
PHV906-04 10/17/95 1.5 1.2
PHV906-05 10/21/95 2.2 3.0
PHV906-06 10/24/95 2.5 4.5
PHV906-07 10/28/95 2.9 _______5.7
3. táblázat. A BBI panelek áttekintése - napok száma korábbi kimutatással.
PHV +DTT -DTT
901 0 0
902 0 0
903 0 0
904 0 0
905 7 0
906 3 0
907 0 0
908 24 0
910 0 0
911 0 0
912 0 0
- 58 Irodalomj egyzék:
Burns, J., Butler, J., Moran, J., and Whitesides, G. (1991) Selective reduction of disulfides by tris(2carboxyethyl) phosphine . J. Org. Chem. 56, 2 64 8-2 650.
Chan, W. (1968) A method for the complete S sutfonation of cysteine residues in proteins. Biochemistry 7, 4247-4254.
Claeys, H., Volkaerts, A., Verhaert, H., De Beenhouwer, H., and Vermylen, C. (1992) Evaluation of anti-HCV capsid indeterminate samples. The Lancet 340, 249.
Cole, R. (1967) Sulfitolysis. Meth. Enzymol. 11, 206.
Coligan, J., Kruisbeek, A., Margulis, D., Shevach, E. and Strober, W. (1992) Current protocols in immunology. Wiley Interscience .
De Beenhouwer, H., Verhaert, H., Ciaeys, H., and Vermylen, C. (1992) Confirmation of hepatitis C virus positive blood donors by immunoblotting and polymerase chain reaction. Vox. Sang. 63, 198-203.
Di Bisceglie, AM, Carithers, RL Jr, Gores, GJ (1998)
Hepatocellular carcinoma. Hepatology. 28, 1161-1165.
- 59 Gailit, J. (1993) Restoring free sulfhydryl groups in synthetic peptides. Anal. Biochem., 214, 334-335.
Holmgren, A. (1979) Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide. J. Biol. Chern. 254, 9627-9632.
Inglis, A., and Liu, T. (1970) The stability of cysteine and cystine durrog acid hydrolysis of proteins and peptides. J. Biol. Chern. 245, 112-116.
McFarlane, L, Smith. H., Johnson, P., Bray, G., Vergani, D., and Williams, R. (1990) Hepatitis C virus antibodies in chronic active hepatitis: pathogenic factor or falsepositive result? The Lancet 335, 754-757.
Maertens, G. and Stuyver, L. (1997) Genotypes and Genetic variabon of hepatitis C virus. In: Molecular Medicine of Hepatitis (Eds. Zuckerman, A. and Hamison, T.), Molecular Medical Science Series (Eds. James, K. and Morris A) John Wiley and Sons Ltd., Chichester, England, Chapter 13, pp. 183-233.
Marin, M., Bresciani, S., Puoti, M. , Rodella, A., Gussago, A., Ravaggi, A., Pizzocolo, G., Albertini, A., and Cariani, E. (1994) Clinical significance of serem HCV RNA as marker of
- 60 HCV infection. J. Clin. Microbiol. 32, 3008-3012.
Peeters, D., Dekeyser, F., DeLeys, R., Maertens, G., and Pollet, D. (1993) Confirmation of anti-hepatitis C virus antibodies using the INNO-LIA HCV Ab III including Core, E2/NSI, NS3, NS4, and NSS epitopes. International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, Tokyo, abstract 413.
Pollet, D., Saman, E., Peeters, D., Warmenbol, H., Heyndricks, L., Wouters, C., Beelaert, G., van der Groen, G., and Van Heuverswyn, H. (1990) Confirmation and differentiation of antibodies to human immunodeficiency virus 1 and 2 with a strip-based assay including recombinant antigens and synthetic peptides. Clin. Chern. 37, 1700-1707.
Saito, L, Miyamura, T., Ohbayashi, A., Harada, H., Katayama, T., Kikuchi, S., Watanabe, Y., Koi, S., Onji, M., Ohta, Y., Choo, Q.-L., Houghton, M., and Kuo, G. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6547-6549.
Singh, R., and Kats, L. (1995) Catalysis of reduction of disulfide by selenol. Anal. Biochem., 232, 86-91.
Stuyver, L., Fretz, C., Esquivel, C., Boudifa, A., Jaulmes, D., Azar, N., Lunel, F., Leroux Roels, G., Maeztens, G., and Fournel, J. (1996) HCV genotype analysis in apparently
- 61 healthy anti-HCV positive Parisian blood donors. Transfusion 36, SS2-SSB.
Thakur, M., DeFulvio, J., Richard, M., and Park, C. (1991) Technetium-99m labeled monoclonal antibodies: evaluation of reducing agents. Nucl. Med, Biol. , 18, 227- 233.
Waumans, L., Claeys, H., Verhaert, H., Mertens, W., and Vermylen, C. (1993) Hepatitis C virus confirmation in blood donor screening. Vox. Sang. 64, 14S-149.
Wertman K.F., Wyman A.R. and Botstein D. (1986) Host/vector interactions which affect the viability of recombinant phage lambda clones. Gene 49: 2S3-262.
Zaaijer, H., Vrielink, H., van Exel-Oehlers, P., Cuypers, H., and Lelie, P. (1994) Confirmation of hepatitis C infection: a comparison of five immunoblot assays. Transfusion 34, 603-607.

Claims (35)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Szilárd fázisú immunoassay, amely az antigént redukáló ágens jelenlétében hordozó szilárd fázist tartalmaz.
  2. 2. Eljárás az 1. igénypont szerinti immunoassay előállítására vagy végrehajtására, azzal jellemezve, hogy a redukáló ágenst a szilárd fázishoz a szilárd fázisnak az antigénnel történő bevonási, blokkolási és/vagy fixálási lépése során, vagy a szilárd fázis előkezelése során adjuk hozzá.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukáló ágenst a szilárd fázishoz a szilárd fázisnak az antigénnel történő bevonási lépése során adjuk hozzá .
  4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukáló ágenst a szilárd fázishoz a szilárd fázis blokkolási lépése során adjuk hozzá és az alkalmazott antigént redukáló ágens jelenlétében vagy hiányában adjuk a szilárd fázishoz.
  5. 5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukáló ágenst a szilárd fázishoz a szilárd fázis fixálási lépése során adjuk hozzá és az alkalmazott antigént redukáló ágens jelenlétében vagy hiányában adjuk a szilárd fázishoz.
  6. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukáló ágenst a szilárd fázis előkezelése során adjuk hozzá és az alkalmazott antigént redukáló ágens jelenlétében vagy hiányában adjuk a szilárd fázishoz.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy redukáló ágensként DTT-t, DTE-t vagy TCEP-t alkalmazunk.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukáló ágenst 0,1 mM és 1 M közötti koncentráció tartományban, előnyösen 0,5 mM és 500 mM közötti tartományban, előnyösebben 1 mM és 250 mM közötti tartományban alkalmazzuk, néhány alkalmazás esetén a tartomány 0,5-50 mM közötti, 1-30 mM közötti, 2-20 mM közötti vagy 5-15 mM közötti lehet, vagy az alkalmazott koncentráció mintegy 10 mM lehet.
  9. 9. A 2-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antigénként HCV-NS3-fehérjét alkalmazunk.
  10. 10. Szilárd fázisú immunoassay, amely a 2-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazásával lett előállítva .
  11. 11. ELISA, amely a 2-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazásával lett előállítva.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti ELISA, amelyben a redukáló ágens a bevonási és/vagy fixálási lépésben lett hozzáadva .
  13. 13. QUICK-teszt, amely a 2-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazásával lett előállítva.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti QUICK-teszt, amelyben a redukáló ágens a blokkolási lépésben lett hozzáadva.
  15. 15. Vonal-immunoassay, amelyet a 2-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazásával lett előállítva.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti vonal-immunoassay, amelyben a redukáló ágens a blokkolási lépésben lett hozzáadva.
  17. 17. A 10-16. igénypontok bármelyike szerinti teszt alkalmazása az 1. igénypontban említett antigén ellen termelődött antitestek in vitro kimutatására.
  18. 18. HCV-NS3-fehérje, amely szulfonálási és azt követően deszulfonálási lépést tartalmazó eljárással lett kezelve .
  19. 19. A 18. igénypont szerinti HCV-NS3-fehérje amely zwitter-ionos felületaktív anyaggal, előnyösen Empigen-nel is kezelve lett.
  20. 20. Eljárás ciszteint tartalmazó, rekombináns módon expresszált fehérje tisztítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépések közül legalább kettőt, előnyösen hármat vagy négyet és még előnyösebben az összesét végrehajtjuk:
    (a) rekombináns gazdasejtekből származó lizátumot szulfonálunk vagy rekombináns gazdasejtek lízisét hajtjuk végre guanidínium-klorid jelenlétében, amelyet a sejt lizátum szulfonálása követ;
    (b) zwitter-ionos felületaktív anyaggal kezeljük, előnyösen a sejttörmelék eltávolítása után;
    (c) a rekombináns fehérje szulfonált változatát megtisztítjuk vagy a rekombináns fehérje szulfonált változatát megtisztítjuk, és ezt követően a zwitter-ionos felületaktív anyagot eltávolítjuk; a tisztításhoz előnyösen kromatográ— fiát alkalmazunk, előnyösebben az alkalmazott kromatográfia Ni-IMAC-kromatográfia, ahol a rekombináns fehérje egy Hisjelölt rekombináns fehérje;
    - 65 «·· ·♦* ·*<* ·** (d) a rekombináns fehérje szulfonált változatát deszulfonáljuk, előnyösen a deszulfonálást DTT moláris feleslegével végezzük;
    (e) a fehérjét DTT moláris feleslege jelenlétében tároljuk vagy egy vizsgálati eljárásban azonnal felhasználjuk.
  21. 21. HCV-polinukleinsav, amely egy 1. ábrán feltüntetett polipeptidet (3-18. azonosítási szám szerinti szekvenciák) kódol, vagy egy HCV-polinukleinsav egyedi része, közelebbről olyan polinukleinsav, amely a 2-1., 3-1., 4-1., 5-1., 6-1., 7-1. vagy 8-1. ábrákon látható szekvenciával rendelkezik (19., 21., 23., 25., 27., 29. és 31. azonosítási szám szerinti szekvenciák).
  22. 22. A 21. igénypont szerinti HCV-polinukleinsav, amelyet a 2-1., 3-1., 4-1., 5-1., 6-1., 7-1. vagy 8-1. ábrákon tüntettünk fel, és terméke nem reagál hamis pozitív HCVmintákkal, vagy a polinukleinsav olyan része, amely hamis pozitív HCV-mintákkal nem reagáló NS3-epitópot kódol.
  23. 23. Rekombináns vektor, amely 21. vagy 22. igénypont szerinti polinukleinsavat tartalmaz.
  24. 24. Gazdasejt, amely 23. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
  25. 25. Eljárás 21. vagy 22. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia kimutatására, azzal jellemezve, hogy:
    (a) a nukleinsavat próbával érintkeztetjük;
    (b) a nukleinsav és a próba között kialakuló komplexet meghatározzuk.
  26. 26. A 21. vagy 22. igénypont szerinti izolált nukleinsavnak megfelelő szekvenciájú nukleinsav vagy annak frag— mense, a 21. vagy 22. igénypont szerinti nukleinsav kimutatása során próbaként vagy primerként történő alkalmazásra.
  27. 27. Diagnosztikai reagenskészlet a 21. vagy 22. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia kimutatására, amely a 26. igénypont szerinti legalább egy prímért és/vagy legalább egy próbát tartalmaz.
  28. 28. HCV-polipeptid, amely a 21. vagy 22. igénypont szerinti polinukleinsav által kódolt polipeptid aminosav szekvenciájának egy részével vagy egészével rendelkezik.
  29. 29. HCV-NS3-helikáz fehérje vagy annak része, amely az S1200, A1218, A1384, P1407, V1412, P1424 vagy F1444 aminosavak bármelyikét vagy ezen aminosavak bármelyikének kombinációját tartalmazza a következő aminosavak bármelyikével: L1201, S1222, 11274, S1289, T1321, A1323, T1369, L1382, V1408, A1409 vagy F1410.
  30. 30. Gyógyhatású készítmény, amely a 28. vagy 29. igénypont szerinti polipeptidet vagy annak bármely funkcionálisan egyenértékű variánsát vagy fragmensét tartalmazza.
  31. 31. A 28. vagy 29. igénypont szerinti polipeptidet vagy annak bármely funkcionálisan egyenértékű variánsát vagy fragmensét tartalmazó gyógyhatású készítmény, HCVfertőzés megelőzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszerként történő alkalmazásra.
  32. 32. Eljárás a 28. vagy 29. igénypont szerinti polipeptid kimutatására, azzal jellemezve, hogy:
    - 67 - .
    ·: :
    (a) a polipeptidet a polipeptidhez kötődő ligandummal érintkezhetjük;
    (b) a polipeptid és a ligandum között kialakuló komplexet meghatározzuk.
  33. 33. Ligandum, amely képes kötődni 28. vagy 29. igénypont szerinti polipeptidhez.
  34. 34. Legalább egy, 33. igénypont szerinti ligandumot gyógyszerészetileg elfogadható excipiensben tartalmazó készítmény, orvosságként történő alkalmazásra.
  35. 35. Eljárás 28. vagy 29. igénypont szerinti polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet diagnosztikai vagy terápiás célra alkalmas formában állítjuk elő.
    A meghatalmazott:
    DANUBLA
    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
    dr. Pethő Árpád
    szabadalmi ügyvivő
HU0101719A 1998-04-17 1999-04-15 Improved immunodiagnostic assays using reducing agents HUP0101719A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98870087 1998-04-17
PCT/EP1999/002547 WO1999054735A1 (en) 1998-04-17 1999-04-15 Improved immunodiagnostic assays using reducing agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0101719A2 true HUP0101719A2 (hu) 2001-09-28
HUP0101719A3 HUP0101719A3 (en) 2006-05-29

Family

ID=8237028

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0101719A HUP0101719A3 (en) 1998-04-17 1999-04-15 Improved immunodiagnostic assays using reducing agents

Country Status (21)

Country Link
US (1) US7935490B2 (hu)
EP (2) EP1471074B1 (hu)
JP (2) JP2002512370A (hu)
KR (1) KR20010042807A (hu)
CN (1) CN1305589A (hu)
AT (2) ATE401340T1 (hu)
AU (1) AU751362B2 (hu)
BR (1) BRPI9909678B8 (hu)
CA (2) CA2658218C (hu)
CY (1) CY1108424T1 (hu)
CZ (1) CZ298268B6 (hu)
DE (2) DE69920895T3 (hu)
DK (2) DK1071955T4 (hu)
ES (2) ES2310701T3 (hu)
HU (1) HUP0101719A3 (hu)
IL (1) IL138791A0 (hu)
PL (1) PL343469A1 (hu)
PT (2) PT1471074E (hu)
TR (4) TR200202213T2 (hu)
WO (1) WO1999054735A1 (hu)
ZA (1) ZA200005445B (hu)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1090033T4 (da) * 1998-06-24 2008-03-31 Innogenetics Nv Partikler af HCV-kappeproteiner: Anvendelse til vaccination
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
JP5175417B2 (ja) * 2000-08-17 2013-04-03 トリペップ アクチ ボラゲット リバビリンを含むワクチンおよびその使用方法
JP4261195B2 (ja) 2001-04-24 2009-04-30 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 酵母のコア−グリコシル化されたｈｃｖエンベロープタンパク質の発現
JP2004108914A (ja) * 2002-09-18 2004-04-08 Kudo Norio コラーゲンの測定方法
WO2004041853A2 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Innogenetics N.V. Hcv vaccine compositions comprising e1 and ns3 peptides
US20050014136A1 (en) * 2003-05-28 2005-01-20 Innogenetics N.V. Modified HCV NS5
ATE485519T1 (de) * 2003-10-28 2010-11-15 Advanced Life Science Inst Inc Verfahren zum nachweis von hepatitis-c-virus
CA2657223A1 (en) * 2006-07-07 2008-01-10 Pall Corporation Use of denaturing agents during affinity capture
CA2693941A1 (en) * 2007-07-16 2009-01-22 Pfizer Inc. Methods of improving a genomic marker index of dairy animals and products
CA2698379A1 (en) * 2007-09-12 2009-03-19 Pfizer Inc. Methods of using genetic markers and related epistatic interactions
AU2008307732A1 (en) * 2007-10-03 2009-04-09 Zoetis Llc Genetic markers for horned and polled cattle and related methods
US20100324356A1 (en) * 2007-12-17 2010-12-23 Pfizer, Inc. Methods for improving genetic profiles of dairy animals and products
WO2010006604A1 (en) * 2008-07-16 2010-01-21 Radiometer Medical Aps High capacity solid phase
CN102081018A (zh) * 2009-11-30 2011-06-01 希森美康株式会社 样品的预处理方法及hcv的免疫测定方法
FR2984328B1 (fr) 2011-12-20 2016-12-30 Bio-Rad Innovations Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c
ES2828713T3 (es) 2014-10-29 2021-05-27 Abbott Lab Ensayos de detección de anticuerpos anti-VHC objeto usando péptidos de captura NS3
CN109870581B (zh) * 2017-12-04 2021-05-04 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司 一种定量检测HBsAg的试剂盒及方法
CN109678954B (zh) * 2018-12-29 2022-01-07 山东莱博生物科技有限公司 一对能够特异性识别hcv ns3蛋白的单克隆抗体及其应用
CN110988362B (zh) * 2019-12-20 2023-11-14 迈克生物股份有限公司 抗组蛋白抗体测定试剂、试剂盒及其使用方法
CN112225783B (zh) * 2020-09-16 2021-08-31 东莞市朋志生物科技有限公司 Hcv重组抗原及其突变体
CN112285361B (zh) * 2020-09-27 2023-12-05 中国人民解放军空军军医大学 排除抗-cd38单克隆抗体药物对抗人球蛋白检测干扰的试剂
CN113219169B (zh) * 2021-05-22 2021-12-17 北京金诺百泰生物技术有限公司 生物检测用封闭剂及其制备方法、包被板及应用该包被板的试剂盒
CN115112897B (zh) * 2021-12-10 2024-11-01 中山大学附属第八医院（深圳福田） 一种用于鉴别抗体检测生物学假阳性的方法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0139526A2 (en) * 1983-10-20 1985-05-02 Warner-Lambert Company An insolubilized stable specific binding protein
US4616078A (en) * 1985-04-08 1986-10-07 Eli Lilly And Company Process for purifying proinsulin-like materials
CA1340877C (en) * 1987-12-28 2000-01-18 Takashi Sugiyama Elastase inhibitory polypeptide and process for production thereof by recombinant gene technology
EP0341439B1 (en) * 1988-05-11 1993-08-04 Abbott Laboratories Method for increasing specificity in competitive immunoassays
US4923967A (en) * 1988-09-26 1990-05-08 Eli Lilly And Company Purification and refolding of recombinant proteins
US6194140B1 (en) * 1990-04-04 2001-02-27 Chiron Corporation HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility
PL169273B1 (pl) 1990-04-04 1996-06-28 Chiron Corp skierowanej przeciw wirusowi zapalenia watroby C PL
US5606031A (en) * 1990-04-06 1997-02-25 Lile; Jack Production and purification of biologically active recombinant neurotrophic protein in bacteria
RO117329B1 (ro) * 1991-06-24 2002-01-30 Chiron Corp Emeryville Polipeptide care contin o secventa a virusului hepatitei c
JP3225468B2 (ja) 1992-08-28 2001-11-05 ダイナボット株式会社 抗体測定用試薬
ATE551423T1 (de) 1993-04-27 2012-04-15 Innogenetics Nv Sequenzen von hepatitis c virus-genotypen sowie ihre verwendungen als therapeutika und diagnostika
DE69434295T2 (de) 1993-11-04 2006-02-16 Innogenetics N.V. Von menschlichen T-Zellen immunodominante Epitopen des Virus der C-Hepatitis
DE69429017T2 (de) 1994-06-23 2002-07-04 Energy Answers Corp., Albany Anlage zur erzeugung von asche enthaltenden produkten und energie aus abfällen
EP1211315A1 (en) * 1994-07-29 2002-06-05 Innogenetics N.V. Recombinant vectors for producing HCV envelope proteins
DE4428705A1 (de) * 1994-08-12 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus
JPH0862219A (ja) 1994-08-19 1996-03-08 Dainabotsuto Kk 還元型抗原に対する抗体アッセイ試薬及びそれを使用した測定方法
EP0804584B2 (en) 1994-10-21 2008-07-09 Innogenetics N.V. Sequences of hepatitis c virus genotype 7 and their use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agents
US5705330A (en) 1995-04-14 1998-01-06 Abbott Laboratories Chemiluminescent immunoassay for antibody detection
US5616460A (en) * 1995-06-07 1997-04-01 Abbott Laboratories Buffer composition for reagents for immunoassay
DK0935662T3 (da) 1996-05-24 2006-03-06 Chiron Corp Fusionsprotein med multiple epitoper
EP0984846B1 (en) * 1997-01-13 2004-11-24 Rodel, Inc. Method of manufacturing a polymeric polishing pad having photolithographically induced surface pattern

Also Published As

Publication number Publication date
DE69920895D1 (de) 2004-11-11
ES2230851T3 (es) 2005-05-01
CA2324970C (en) 2009-06-30
CZ20003819A3 (cs) 2001-10-17
ZA200005445B (en) 2003-01-06
JP3974620B2 (ja) 2007-09-12
US7935490B2 (en) 2011-05-03
TR200202213T2 (tr) 2002-11-21
DE69920895T3 (de) 2009-09-03
CY1108424T1 (el) 2014-04-09
US20060263854A1 (en) 2006-11-23
EP1471074A2 (en) 2004-10-27
JP2005185285A (ja) 2005-07-14
PL343469A1 (en) 2001-08-13
HUP0101719A3 (en) 2006-05-29
DE69920895T2 (de) 2005-10-13
ES2230851T5 (es) 2009-06-25
CN1305589A (zh) 2001-07-25
ES2310701T3 (es) 2009-01-16
CZ298268B6 (cs) 2007-08-08
AU3817199A (en) 1999-11-08
HK1036653A1 (en) 2002-01-11
EP1471074B1 (en) 2008-07-16
DK1471074T3 (da) 2008-11-17
PT1071955E (pt) 2005-02-28
TR200101647T2 (tr) 2002-06-21
EP1071955B2 (en) 2009-02-18
DE69939132D1 (de) 2008-08-28
BR9909678B1 (pt) 2013-11-12
KR20010042807A (ko) 2001-05-25
BRPI9909678B8 (pt) 2021-05-25
BR9909678A (pt) 2000-12-19
CA2658218C (en) 2014-10-28
ATE278960T1 (de) 2004-10-15
CA2658218A1 (en) 1999-10-28
DK1071955T4 (da) 2009-06-15
CA2324970A1 (en) 1999-10-28
ATE401340T1 (de) 2008-08-15
EP1071955A1 (en) 2001-01-31
TR200003024T2 (tr) 2000-12-21
EP1471074A3 (en) 2004-11-10
DK1071955T3 (da) 2005-02-07
PT1471074E (pt) 2008-10-23
WO1999054735A1 (en) 1999-10-28
AU751362B2 (en) 2002-08-15
EP1071955B1 (en) 2004-10-06
JP2002512370A (ja) 2002-04-23
TR200101648T2 (tr) 2002-06-21
IL138791A0 (en) 2001-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7935490B2 (en) Immunodiagnostic assays using reducing agents
US6312889B1 (en) Combinations of hepatitis c virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
KR0181343B1 (ko) 간염 씨 바이러스에 대한 항체 검출용 합성 항원
JP4351153B2 (ja) 感染性微生物の抗原及び抗体を同時に検出するための方法
PL172133B1 (pl) Sposób tworzenia kombinacji antygenów wirusowego zapalenia watroby typu C (HCV) i sposób wykrywania przeciwcial przeciw wirusowemu zapaleniu watroby typu C (HCV)
Tsutsumi et al. Detection of antigens related to hepatitis C virus RNA encoding the NS5 region in the livers of patients with chronic type C hepatitis
EP0471356B1 (en) Antigenic peptide for detecting anti-hepatitis C virus antibodies and use thereof
EP0485209A1 (en) Non A, non B hepatitis virus related antigen, antibody detection systems, polynucleotides and polypeptides
US5582968A (en) Branched hybrid and cluster peptides effective in diagnosing and detecting non-A, non-B hepatitis
US20060234214A1 (en) Methods of detecting hepatitis C virus
AU2002301931B2 (en) Improved immunodiagnostic assays using reducing agents
NL194971C (nl) Peptiden werkzaam bij het aantonen en de diagnose van hepatitis C.
US6447992B1 (en) Method for serological typing using type-specific antigens
MXPA00009956A (en) Improved immunodiagnostic assays using reducing agents
Bosman Maertens et al.(43) Pub. Date: Nov. 23, 2006
MXPA02004052A (es) Proteinas de hcv reversibles por redox con conformacion pseudo-nativa.
HK1036653B (en) Improved immunodiagnostic assays using reducing agents
US20040185061A1 (en) Redox reversible HCV proteins with native-like conformation
JPH04305156A (ja) Ｃ型肝炎ウイルス関連抗体および抗原の測定法
JPH05262792A (ja) ペプチドおよびその用途

Legal Events

Date Code Title Description
FD9A Lapse of provisional protection due to non-payment of fees