HUP0002760A2 - CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok termelődését kiváltó immunogén készítmények, és alkalmazásuk tumorok kezelésére - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát képezik gasztrindependens tumorok kezelésérealkalmas immunogének és immunogénkészítmények, valamint alkalmazásaik.Az immunogének CCK-B/gasztrin receptorból származó peptidettartalmaznak távtartó szekvenciához és immunogénhordozóhoz kapcsoltan.Az immunogének képesek olyan ellenanyagok termelődését kiváltani invivo, amelyek a CCK-B/gasztrin receptorokhoz kötődnek tumorsejtekben,ezáltal megakadályozzák növekedésstimuláló peptidhormonok kötődését areceptorokhoz, és gátolják a tumorsejtek szaporodását. Az immunogéneklehetnek továbbá CCK-B/gasztrin receptor elleni ellenanyagok, passzívimmunizálásra. A találmány tárgyát képezik továbbá diagnosztikaieljárások gasztrindependens tumorok in vivo kimutatásáraszövetbiopsziás mintából, amelyek szerint a kimutatást a találmányszerinti ellenanyagok alkalmazásával végzik. A találmány szerintimegoldás gasztrindependens tumorok kezelésére és diagnózisa területénalkalmazható. Ó

Description

'φόο Ν7Ν)

Képviselő:

Danubia

KÖ ZZÉ TÉ TE El PÉLDÁNY Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

Budapest

CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok termelődését kiváltó immunogén készítmények, és alkalmazásuk tumorok kezelésére

A találmány tárgyát képezik gasztrindependens tumorok kezelésére alkalmas immunogének és immunogén készítmények, valamint alkalmazásaik.

A gasztrinhormon öt karboxi-terminális aminosavja révén nagy affinitással kötődik egy gasztrin/kolecisztokinin (CCK)-B receptorhoz. A CCK-B/gasztrin-receptor egy citoplazmamembrán-protein, amely G-proteinen keresztül kapcsolódik intracelluláris szignáltranszdukciós utakhoz, amelyek viszont különféle gének expresszióját szabályozzák.

A gasztrin egy peptidhormon, amely két formában fordul elő, tetratriakonta—gasztrin (G34) és heptadekagasztrin G17) formájában, amelyeket erre specializálódott, a gyomorüreg falában található G-sejtek szintetizálnak és szekretálnak. A hormon a véráramba szekretálódik, és a gyomor specifikus sejtjeihez kötődik, nevezetesen az enterokromaffin-szerű (ECL), valamint a parietális sejtekhez,

Aktaszámunk: 90957-5853/SG

- 2 amelyek közvetve vagy közvetlenül befolyásolják a gyomorsav-szekréciót. Történetileg, a gasztrinhormonokat összefüggésbe hozták a gyomorsav-szekréció stimulálásával [Edkins, J.S.: (1905)]. (A leírásunkban idézett szakirodalmi helyek teljes címét a szabadalmi igénypontok előtti Hivatkozások fejezetben adjuk meg). Az utóbbi években bizonyítékok halmozódtak fel arra vonatkozólag, hogy a gasztrin az emésztő traktusban trófikus faktorként hat [Johnson, L.: (1997)], és hogy elősegítheti mind a gasztrointesztinális [Watson és munkatársai: (1989); Dickinson, C.J.: (1995)], mind a nem gasztrointesztinális eredetű rákok, mint például a kissejtes tüdőkarcinóma növekedését [Rehfeld és munkatársai: (1989)]. A gasztrin poszttranszlációs érését követően, az érett, karboxi-amidált forma az, amely a karboxi-terminális végénél fogva a CCKB/gasztrin-receptorhoz kötődik [Kopin és munkatársai: (1992)] .

Kimutatták, hogy számos tumortípus, például kolorektális, gyomor-, hasnyálmirigy- és hepatocelluláris eredetű adenokarcinómák plazmamembránja rendelkezik CCKB/gasztrin-receptorokkal, és ezek sejtjei gasztrin jelenlétére erőteljes sejtes proliferációval válaszolnak [Rehfeld, J.F.: (1972); Upp és munkatársai: (1989); Watson és munkatársai: (1993) . Ezen túl, újabban felfedezték, hogy sok ilyen ráksejt maga is szekretál gasztrint, és ezáltal autonóm proliferatív rakcióutat hoz létre [Van-Solinge és munkatársai: (1993); Nemeth és munkatársai: (1993); Seva és munkatársai: (1994)].

- 3 A CCK-B/gasztrin-receptor a G-proteinnel kapcsolt receptorok egyik családjába tartozik, és hét, a CCK és a gasztrin vonatkozásában azonos affinitással rendelkező transzmembrán-domént tartalmaz [Soil és munkatársai: (1984)]. Ezt a receptort azért nevezték el B-típusú CCKreceptornak, mert elsősorban az agyban (brain) fordul elő [Wank és munkatársai: (1992)]. A receptort később azonosnak találták a gyomor parietális és ECL-sejtjeiben található perifériás CCK/gasztrin-receptorral [Nakata és munkatársai: (1992)] . Ezt a receptort alaposan jellemezték számos normál [Fourmy és munkatársai: (1984); Grider és munkatársai: (1990)], valamint tumoros szövetben [Singh és munkatársai: (1990); Watson és munkatársai: (1993)], továbbá kiterjedten tanulmányozták az AR42J-elnevezésű, patkányeredetű hasnyálmirigy-adenokarcinóma sejtvonal alkalmazásával [Scemama és munkatársai: (1987). Az AR42J-eredetű CCK-B/gasztrinreceptor cDNS-ét klónozták és szekvenálták, és annak szekvenciája több, mint 90%-ban homológnak bizonyult a patkány és az ember agyából származó CCK-B/gasztrin-receptor szekvenciájával, továbbá, annak szekvenciája több, mint 84% homológiát mutat a kutya parietális sejtjein található CCKB/gasztrin-receptornak megfelelő cDNS-sel [Wank, S .A. : (1995)], ami arra utal, még a fajok közt is nagymérvű szekvencia-homológia áll fenn.

A G17- és G34-elnevezésű peptidhormonok kötődnek a normál sejtek sejtmembránján található CCK-B/gasztrinreceptorokhoz. Kimutatták azonban, hogy a G17-peptidhormon az, amely stimulálja a gasztrindependens ráksejtek szaporo

- 4 dását, és nem a G34 forma. Különösen a szérumeredetű G17peptidhormon rendelkezik olyan tulajdonsággal, hogy stimulálja kolorektális tumorok növekedését a tumorsejtekben található CCK-B/gasztrin-receptorok [Watson és munkatársai: (1993)] által közvetített endokrin módon. Úgy tűnik, hogy a G17-peptidhormon különösen kolorektális adenokarcinómák növekedésének stimulálásában vesz részt, a tumorsejteken található CCK-B/gasztrin-receptor iránti, más gasztrinhormonfajtákhoz viszonyított megnövekedett affinitása miatt [Rehfeld, (1972) és (1993)]. Nagy affinitású formában expresszált CCK-B/gasztrin-receptorokat az emberi primer kolorektális tumorok 56,7%-ában mutattak ki [Upp és munkatársai: (1989)]. Feltételezhető egy potenciális autokrin hurok kialakulása is, mivel ezek a tumorok endogén módon prekurzor gasztrinpeptideket állítanak elő [Van-Solinge és munkatársai: (1993); Nemeth és munkatársai: (1993)]. A kialakuló G17-ligandum/receptor-komplex sejtfunkció szabályozására alkalmas szekunder hírvivő-molekulákon keresztül stimulálja a sejtszaporodást [Ulrich és munkatársai: (1990)]. A G17-proteinhormon CCK-B/gasztrin-receptorhoz történő kötődése a foszfatidil-inozitol lebomlásához, majd proteinkináz-C-aktiváláshoz vezet, ennek következtében megnövekszik a sejten belüli kalciumion-koncentráció, va1 awi nt mitogén által aktivált proteinkináz révén indukálódnak a cfos és c-jun gének, amelyek szerepet játszanak a sejtproliferációban [Tadisco és munkatársai: (1990)]. Ezen felül, a gasztrinnak a CCK-B/gasztrin-receptorhoz történő kötődését összefüggésbe hozzák a foszforiláció tirozinkináz

- 5 általi, következményes növekedésével, amelynek szintén szerepe lehet a mitogén szignálok transzmissziójában [Tanaguchi és munkatársai: (1994)].

Számos, nagy affinitású CCK-B/gasztrinreceptorantagonistát vizsgáltak terápiás hatásra nézve in vitro és in vivo, több kísérletes gasztrointesztinális rák modellen. Például a proglumid, amely egy glutaminsav-származék [Seva és munkatársai: (1994); Harrison és munkatársai: (1990); valamint Watson és munkatársai: (1991a)]; a Benzotript, amely a triptofán N-acilezett származéka, az L-365,260, amely egy Aspercillin-származék [Book és munkatársai: (1989)], valamint a CI-988-molekula, amely a kolecisztokinin C-terminális pentapeptidjének szekvenciáját utánozza [Hughes és munkatársai: (1990)] hatékonyan neutralizálja az exogén gasztrin gasztrointesztinális tumorok növekedésére kifejtett hatását, in vitro és in vivo egyaránt [Watson 'és munkatársai: Romani és munkatársai (1994)]. Ezeknek az antagonistáknak azonban súlyos toxikus mellékhatásaik vannak, és nem specifikusak, mivel a receptor minden potenciális ligandumának - mint például a G34-peptidhormonnak és a CCK-molekulának - hatását gátolják normál sejtekben. A közelmúltban erős hatású és szelektív CCK/gasztrinreceptor-antagonistákat ismertettek; ilyenek például az YM022 [Yuki és munkatársai: (1997)] és az YF476 [Takinami és munkatársai: (1997)].

A proglumid- és Benzotript-molekulákat széles körben vizsgálták pre-klinikai vizsgálatokban. Ezeknek a vegyületeknek a fő hátránya a hatékonyság hiánya, azaz viszonylag

- 6 magas koncentráció szükséges a G17-peptid kiszorításához [Watson és munkatársai: (1992a); Watson és munkatársai: (1992b)]. Ennek ellenére, a proglumid és a benzotript gátolta számos sejtvonal alap- és gasztrinstimulált proliferációját [Seva és munkatársai: (1990) ; Watson és munkatársai: (1991a)]. Ráadásul, a proglumid a kezelt csoportban 39 napra hosszabbította az MC26-jelű, gasztrinérzékeny, egéreredetű vastagbéltumor-xenograftot hordozó egerek túlélési idejét, szemben a kontroll állatok 25 napos túlélési idejével.

A CCK/gasztrin-receptorhoz kötődő, gasztrinnal antagonizáló vegyületek ezen családjának alacsony specificitása miatt, gasztrin-antagonistákkal a tumornövekedés gátlása nem irányítható hatékonyan. Ráadásul, a sejtfelszíni receptorok, amelyek felismerik és megkötik a gasztrinokat, nem mindegyik vizsgált gátlószert kötik meg [Seva és munkatársai: (1994)]. Ennek megfelelően, ha az autokrin növekedési kaszkád során a gasztrin és a receptor kötődése nem gátlódik teljesen, a gasztrinantagonisták esetleg képesek blokkolni ezt a tumornövekedést elősegítő mechanizmust.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmány szerinti megoldás lényegét.

A találmány tárgyát képezik immunogén készítmények, valamint immunológiai eljárások gasztrindependens tumorok kezelésére. Az eljárás szerint egy pácienst aktivan, vagy passzívan immunizálunk CCK-B/gasztrin-receptor elleni immunogénnel, vagy CCK-B/gasztrin elleni ellenanyaggal. Az immunogének hatására termelt ellenanyagok specifikusak a tumorsejteken található CCK-B/gasztrin-receptorra, és blokkolják a gasztrin növekedést elősegítő hatását a receptoron. Az ellenanyagok megakadályozzák a peptidhormonok kötődését a gasztrindependens tumorsejteken található CCKB/gasztrin-receptorokhoz, így a tumor növekedése megáll. Ráadásul, meglepő módon, a receptor NH₂-terminális végére specifikus ellenanyagok a receptorhoz való kötődést követően internalizálódnak, és gyorsan transzlokálódnak a tumorsejtek citoplazmájába és magjába. Ez az internalizálódás a sejtek és az ellenanyagok érintkeztetését követően már 10 másodperc múlva megtörténhet. Az ellenanyag/receptor-komplexnek ez a gyors internalizálódása viszont az érintett tumorsejtek apoptózisához, illetve ahhoz vezet, hogy a sejtek elpusztítsák magukat.

A találmány szerinti immunogének humán CCKB/gasztrin-receptor eredetű, természetes, vagy szintetikus peptideket tartalmaznak az immunogén immunomimetikus hatású részeként. Az immunogének tartalmazhatnak továbbá távtartó ('spacer) peptidszekvenciákat az immunomimetikum peptid egyik végéhez kapcsoltan. Az immunogént konjugálhatjuk hordozóproteinhez, például diftériatoxoidhoz, tetanusztoxoidhoz, szarvasmarha-eredetű szérumalbuminhoz és hasonlókhoz .

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás a CCK-B/gasztrinreceptor elleni immunizálásra, amely szerint a pácienst a találmány szerinti immunogénnel immunizáljuk. Az immunogén stimulálja a tumorsejteken található CCK-B/gasztrinreceptor elleni ellenanyagok termelődését.

A CCK-B/gasztrin-receptor elleni immunogénekre adott válaszként termelődött ellenanyagok hozzákötődnek a tumorsejteken található CCK-B/gasztrin-receptorokhoz, és hatékonyan gátolják a peptidhormonok receptorhoz történő kötődését, ezáltal gátolják a tumorsejtosztódáshoz vezető autokrin növekedés-stimuláló utat, végsősoron gátolják a tumor növekedését.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a kezelési eljárás során passzív immunizálást végzünk, amely szerint a páciensnek CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagokat adunk be, elegendő koncentrációban ahhoz, hogy a tumorsejteken található CCK-B/gasztrinreceptorokhoz kötődjenek, és blokkolják a peptidhormonok receptorhoz történő kötődését. A hormonok receptorukhoz történő kötődésének megakadályozása gátolja a tumorsejtek növekedést stimuláló anyagcsereútját, ezáltal gátolva a hormondependens tumorok növekedését. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, humán terápiás célra ellenanyagokként alkalmazhatunk kiméra, humanizált, vagy humán monoklonális ellenanyagokat, amelyek szakember számára ismert eljárásokkal állíthatók elő. A CCK-B/gasztrinreceptor elleni ellenanyagokat konjugálhatjuk továbbá citotoxikus molekulákkal, például koleratoxinnal, vagy radionukliddal, például ¹²⁵I- vagy ¹³¹I-radionukliddal jelölt radioaktív molekulákkal, hogy elősegítsük a tumorsejtek elpusztítását .

- 9 A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás gasztrinra reagáló tumorok diagnosztizálására, amely szerint szöveti biopsziás mintából gasztrindependens (CCK-B/gasztrinreceptort hordozó) tumor jelenlétét mutatjuk ki immunkémiai eljárásokkal, a találmány szerinti ellenanyagok alkalmazásával. A találmány szerinti, specifikus, CCK-B/gasztrinreceptor elleni ellenanyagokat jelölhetjük valamilyen kimutatási rendszerrel, például biotin, tormaperoxidáz vagy fluoreszcein alkalmazásán alapuló kimutatási rendszerrel, miáltal a CCK-B/gasztrin-receptorokat szokásos immunkémiai eljárásokkal kimutathatjuk tumorszövetben.

A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás gasztrindependens tumor diagnosztizálására, amely szerint in vivo mutatunk ki gasztrindependens (CCK-B/gasztrin-receptort hordozó) tumorokat a CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok alkalmazásával. Az eljárás szerint, kolorektális tumort hordozó egyénnek radionukliddal jelölt, CCKB/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok hatásos adagját injektáljuk intravénásán, majd szokásos szcintigráfiás pásztázó eljárásokkal láthatóvá tesszük vagy más módon kimutatjuk azokat a tumorsejteket, amelyek sejtmembránjához CCKB/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok kötődtek. A találmány ezen megvalósítási módja szerint, a CCK-B/gasztrinreceptor elleni ellenanyagot jelölhetjük például ^lilIndium-, ⁹⁰Yttrium- vagy ¹³¹I-radionukliddal.

- 10 Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az l.A és l.B ábrákon a CCK-B/gasztrin-receptort és annak hét transzmembrán-doménját ábrázoltuk vázlatosan.

A 2. ábrán a CCK-B/gasztrin-receptor 1-es peptidje elleni ellenanyagok termelődését kiváltó immunogénnel immunizált nyulakban termelt ellenanyagok ELISA-vizsgálatának eredményeit mutatjuk be.

A 3. ábrán a CCK-B/gasztrin-receptor 4-es peptidje elleni ellenanyagok termelődését kiváltó immunogénnel immunizált nyulakban termelt ellenanyagok ELISA-vizsgálatának eredményeit mutatjuk be.

A 4. ábra GRPl-DT-immunogén ellen előállított, affinitásos eljárással tisztított ellenanyagok specificitását mutatja ELISA-gátlási vizsgálattal.

Az 5. ábrán ¹²⁵I-radionukliddal jelölt humán G17peptid AR42J-sejbekhez kötődésének peptid-inhibitorokkal történő gátolhatóságát mutatjuk be, oszlopdiagram formájában.

A 6. ábra AR42J-sejtek megoszlását mutatja GRP1immunogold- (immunogoid-) részecskékkel történt jelölést követően.

A 7. ábrán bemutatott fényképen adenokarcinóma-sejtek sejtmagmembrán-eredetű protein-extraktumának Western-blot vizsgálatával kapott eredményeinket mutatjuk be, 1-es peptid ellen előállított ellenanyagok alkalmazásával.

A 8. ábrán bemutatott fényképen adenokarcinóma-sejtek extranukleáris- és plazma-membráneredetű protein

- 11 extraktumának Western-blot vizsgálatával kapott eredményeinket mutatjuk be, 1-es peptid ellen előállított ellenanyagok alkalmazásával.

A 9. ábra C170HM2-tumorok tömegét mutatja kontroll és CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagokkal kezelt állatokban, plotdiagramon.

A 10. ábra C170HM2-tumorok keresztmetszetének a területét mutatja kontroll és CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagokkal kezelt állatokban, plotdiagramon.

A 11. ábra C170HM2-tumorok tömegének számtani középértékét mutatja kontroll és CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyaggal kezelt állatokban, oszlopdiagramon.

A 12. ábra C170HM2-tumorok keresztmetszete területének számtani középértékét mutatja kontroll és CCKB/gasztrin-receptor elleni ellenanyaggal kezelt állatokban, oszlopdiagramon.

A 13. ábra C170HM2-tumorok számának számtani középértékét mutatja kontroll és CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyaggal kezelt állatokban, oszlopdiagramon.

A 14. ábra C170HM2-tumor májmetasztázisok tömegének mediánértékét mutatja kontroll és CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyaggal kezelt állatokban, oszlopdiagramon.

A 15. ábra C170HM2-tumorok keresztmetszete területének mediánértékét mutatja kontroll és CCK-B/gasztrinreceptor elleni ellenanyaggal kezelt állatokban, oszlopdiagramon.

- 12 A 16. ábra C170HM2-tumorok számának mediánértékét mutatja kontroll és CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyaggal kezelt állatokban, oszlopdiagramon.

A 17. ábra a májban talált C170HM2-tumorok számtani középértékét és mediánértékét mutatja kontroll és CCKB/gasztrin-receptor elleni ellenanyaggal kezelt állatokban, oszlopdiagramon.

A 18. ábra a májban talált Cl70HM2-tumorok tömegének számtani középértékét és mediánértékét mutatja kontroll és CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyaggal kezelt állatokban, oszlopdiagramon.

A 19. ábra C170HM2-májtumor-metasztázisok keresztmetszete területének számtani középértékét és mediánértékét mutatja kontroll és CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyaggal kezelt állatokban, oszlopdiagramon.

A 20. ábrán látható grafikonon ¹²⁵I-radionukliddal jelölt ellenanyagok koncentrációját ábrázoltuk C170HM2májtumor-xenograftokban, kontroll (normál nyúlszérummal kezelt) és GRPl-elleni ellenanyaggal kezelt timuszhiányos kopasz (’nude ) egerekben.

A 21. ábra egy oszlopdiagram, amely a C170HM2májtumorok számának májanként észlelt számtani középértékét mutatja xenograftot kapott kontroll és GRPl-elleni ellenanyaggal kezelt nude-egerekben.

A 22. ábrán látható oszlopdiagramon C170HM2-májtumorxenograftok tömegének számtani középértékét ábrázoltuk kontroll és GRPl-elleni ellenanyaggal kezelt nude egerekben.

- 13 A 23. ábra kontroll és GRPl-elleni ellenanyaggal kezelt nude-egerek C170HM2-májtumor-xenograft eredetű proteinjeinek Western-blot vizsgálatát mutatja.

A 24. ábra fénymikroszkóppal készített szövettani metszet fényképe, amely kontroll egér Cl70HM2-májtumorxenograft jának hematoxilin/eozinnal festett metszetét mutatja.

A 25. ábra fénymikroszkóppal készített szövettani metszet fényképe, amely nyúlban termelt GRPl-elleni ellenanyaggal kezelt egér Cl70HM2-májtumor-xenograftjának hematoxilin/eozinnal festett metszetét mutatja.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmánylényegét .

A találmány szerinti eljárások gasztrinhormondependens tumorok kezelésére vonatkoznak, állatokban és emberben. Ezen eljárások szerint, a páciensnek CCKB/gasztrin-receptor elleni immunogént (azaz CCK-B/gasztrinreceptor elleni ellenanyagok termelődését kiváltó immunogént) adunk be, amely az immunizált páciensben ellenanyagok termelődését váltja ki. Ezek az ellenanyagok hozzákötődnek a tumorsejteken található CCK-B/gasztrinreceptorokhoz, ezáltal megakadályozzák a hormon kötődését a receptorhoz, így gátolják a hormon növekedést stimuláló hatásait. Klinikai szempontból még lényegesebb, hogy a receptor és a GRPl-elleni ellenanyag által képzett komplex rövid idő alatt internalizálódik, áthatol a citoplazmán, majd a sejtmagba jut. Ez szemmel láthatólag arra készteti az érin

- 14 tett tumorsejteket, hogy elpusztítsák magukat (apoptózis következzék be).

Az immunogének lehetnek a humán CCK-B/gasztrinreceptor természetes vagy szintetikus peptidjei, amelyek immunomimetikumként funkcionálnak. Közelebbről, két szintetikus pepiidet fejlesztettünk ki immunomimetikumként. Ezek a peptidek, amelyeket a CCK-B/gasztrin-receptor aminosavszekvenciájából fejlesztettünk ki, immunogének, és mind in vivo, mind in vitro keresztreagálnak a tumorsejtek endogén CCK-B/gasztrin-receptoraival. Az 1-es peptid tartalmazza a CCK-B/gasztrin-receptor szekvencia 5.-től a 21. aminosavig terjedő szakaszát: KLNRSVQGTGPGPGASL (1-es peptid; a csatolt szekvencialistában 1. azonosítószámú szekvencia). Az 1-es peptid a receptor amino-terminális végét alkotja, és a sejtmembrán külső felszínén helyezkedik el (lásd az 1. ábrát) .

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, az immunogén a 4-es peptidet tartalmazza, amely a CCK-B/gasztrin-receptor GPGAHRALSGAPISF (4-es peptid; a csatolt szekvencialistában 2. azonosítószámú szekvencia) aminosav-szekvenciáját foglalja magában. A 4-es peptid a receptor negyedik extracelluláris doménjának részét képezi, és szintén a plazmamembrán külső felszínén helyezkedik el (lásd az 1. ábrát).

Az immunogének tartalmazhatnak továbbá egy toldalék, vagy távtartó peptidet, amely alkalmas arra, hogy az immunomimetikum peptidet távol tartsa a hordozóproteintől·, és fokozza annak limfocita-receptorokhoz kötődési tulajdon

- 15 ságát. Távtartó peptidszekvenciaként alkalmazhatjuk például a SSPPPPC aminosav-szekvenciát [szerin (Ser) távtartó szekvencia; a csatolt szekvencialistában 3. azonosítószámú szekvencia]. Alkalmazhatunk azonban más távtartó peptideket is. Az immunomimetikum peptideket - távtartó peptiddel vagy anélkül -, proteinhordozóhoz, például diftériatoxinhoz konjugáltuk, a karboxi-terminális végen található ciszteincsoporton keresztül. A távtartó peptidek immunológiailag nem rokonok a CCK-B/gasztrin-receptor eredetű peptidekkel, ennek megfelelően fokozniuk kell, de nem meghatározniuk a receptoreredetű peptidek specifikus immunogenitását.

A CCK-B/gasztrin-receptorok jelenléte és denzitása a páciens tumorsejtjein meghatározható oly módon, hogy jelölt, receptor elleni ellenanyagokat reagáltatunk tumorbiopsziából származó mintával. A receptor elleni ellenanyagokat jelölhetjük radioaktív nyomjelzőanyaggal, festékkel, vagy fluoreszcens jelölőanyaggal. Ezen túl, a tumorsejtek gasztrinra reagáló tulajdonságát meghatározhatjuk in vitro a páciens tumorbiopsziás mintájából, szokásos eljárásokkal. Olyan tumort hordozó betegek, amelyekből a CCK-B/gasztrinreceptor elleni ellenanyaggal történt vizsgálattal pozitív eredményt adó biopsziaminta származott, jellemzően alkalmasak a találmány szerinti eljárásokkal történő kezelésre.

Gasztrointesztinális rák kezelése céljából az immunogén készítmény hatásos, 0,001 mg-tól 2 mg-ig terjedő adagját adjuk be a betegnek. Az immunogén készítmény hatásos adagját úgy állapítjuk meg, hogy az képes kell legyen a páciensben immunválasz kiváltására, azaz a CCK-B/gasztrin

- 16 receptor elleni hatásos szintű ellenanyagtiter kialakulásához vezessen az immunizálást követő 1-3 hónappal. A páciens immunizálását követően az immunogének hatékonyságát szokásos klinikai vizsgálatokkal követhetjük, például ultrahang eljárással és mágneses rezonancia leképezéssel (^magnetic resonance imaging MRI), miáltal kimutatjuk a tumorok jelenlétét és méretét. Követhetjük továbbá a receptor elleni ellenanyagtiter-szinteket a betegtől vett vérminták vizsgálatával. Szükség szerint, emlékeztető oltást kell adnunk a hatásos ellenanyagtiter fenntartásához. Gasztrindependens tumorok, mint például a gyomor-, máj- és hasnyálmirigyeredetű, valamint kolorektális adenokarcinómák találmány szerinti eljárással történő hatásos kezelésének a tumor növekedésének gátlását és a tumorméret csökkenését kell eredményeznie.

A találmány szerinti, CCK-B/gasztrin-receptor elleni immunogének által kiváltott ellenanyagok három lehetséges mechanizmus alapján fejthetnek ki anti-trófikus hatást gasztrindependens tumorokra: (i) gátolva a gasztrin kötődését annak receptorához; (ii) a tumorsejt-proliferáció szignáltranszdukciós útjának degradálásával vagy megszakításával; (iii) apoptózis (vagy sejt-öngyilkosság) indukálásával olyan sejtekben, amelyekben receptor/ellenanyagkomplexek internalizálódtak, és a sejtmagba vándoroltak.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, gasztrinra reagáló, CCK-B/gasztrin-receptorral rendelkező tumort hordozó betegnek CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagokat adunk be. Az ellenanyagok specifiku

- 17 san kötődnek a CCK-B/gasztrin-receptorokhoz a tumorsejteken. Az ellenanyagok receptorokhoz történő kötődése megakadályozza a gasztrin kapcsolódását annak ligandumához a sejtek membránjában, ezáltal gátlódik azt a szignál, amely a gasztrindependens tumorsejteket szaporodásra készteti, és a tumor növekedése megáll. Az ellenanyagok előnyösen kiméra, vagy humanizált ellenanyagok, vagy azok fragmensei, amelyek hatékonyan kötődnek a célreceptorhoz, és ismert eljárásokkal előállíthatok, például az 5 023 077, 5 468 494, 5 607 676, 5 609 870, 5 688 506 és 5 662 702 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismerttettek szerint. Ezek, az exogén forrásból származó ellenanyagok szintén alkalmasak lehetnek plazmamembránjukon CCK-B/gasztrin-receptort hordozó tumorsejtek elpusztítására, tumorsejtek növekedését gátló tulajdonságuk révén, vagy úgy, hogy toxikus anyagokat szállítanak a tumorsejtekhez. Terápiás célra, előnyösen, a receptorprotein 1-es és 4-es extracelluláris doménjával (az 1. ábrán GRP1 és GRP4) reagáló CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagokat alkalmazunk. Különösen előnyösen alkalmazhatók azok az ellenanyagok, amelyek az 1-es és 4-es pepiidnek megfelelő aminosavszekvenciákat ismerik fel, és kötik meg specifikusan. A tumornövekedés gátlását ezen immunizálási eljárás során szintén ultrahangos és MRI-vizsgálatokkal követjük, és kívánt esetben a pácienst ismételten immunizáljuk.

Az ellenanyagok tumorsejt-növekedést gátló és tumorsejtpusztító hatékonyságát fokozhatjuk azzal, hogy citotoxikus molekulákat konjugálunk a CCK-B/gasztrin

- 18 receptor elleni ellenanyagokhoz. A citotoxikus molekula lehet toxin, például koleratoxin, ricin, α-amanitin, vagy radioaktív molekula, amelyet ¹²⁵I- vagy ¹³¹I-radionukliddal jelöltünk; vagy kemoterápiás ágens, például citozinarabinozid vagy 5-fluoruridin.

A ¹²⁵I-és ¹³¹I-radionukliddal történő jelölésen felül, a CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok jelölhetjük továbbá olyan radionuklidokkal, mint például az ^Indium és az ⁹⁰Yttrium. A találmány ezen megvalósítási módja szerint, az ellenanyagokat alkalmazhatjuk CCK-B/gasztrin-receptort hordozó tumorok kimutatására és diagnosztizálására ín vivo, oly módon, hogy ezeket az ellenanyagokat beadjuk a betegnek, és a CCK-B/gasztrin-receptort hordozó tumorsejtekhez kötődő jelölt ellenanyagokat kimutatjuk. Miután hagytuk, hogy az izotóppal jelölt, CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok elérjék a tumort, azaz körülbelül 1-2 órával az injektálást követően, a radioaktív forró pontokat (hot spots) ismert szcintigráfiás eljárásokkal leképezzük, a korábbiakban már ismertetettek szerint [Harrison's Principles of Internal Medicine, szerk.: Isselbacher és munkatársai: 13. kiadás (1994)].

A készítmény, amelyben az immunogéneket gasztrindependens tumor kezelése céljából beadjuk a páciensnek, számos különböző formában előállíthatjuk. Ezek lehetnek például szilárd, félszilárd és folyadék kiszerelési formák, például porok, folyékony oldatok, szuszpenziók, kúpok és injektálható, valamint infundálható oldatok. Az előnyös forma függ a beadás tervezett módjától és a terápiás alkal

- 19 mazástól. A készítmények találmány szerinti immunogénékét, valamint megfelelő, a gyógyászatban elfogadott összetevőket tartalmazna; tartalmazhatnak továbbá egyéb, az gyógyászati gyakorlatban elfogadott anyagokat, hordozóanyagokat, adjuvánsokat, vivőanyagokat stb. Adjuvánsként alkalmazhatunk például nor-muramil-dipeptidet (nor-MDP, Peninsula Labs., CA, USA) és olajokat, például Montanide ISA 703-t (Seppic Inc., Párizs, Franciaország), amelyeket szokásos eljárások szerint elegyíthetünk az immunogénné1. Előnyösen, a készítmények egységnyi adagolási formában vannak kiszerelve. Az aktív hatóanyag azon mennyisége, amelyet egyszerre, vagy adott időtartam alatt immunizálás céljából vagy terápiás célból beadunk, függ a kezelt pácienstől, a beadás módjától és formájától, valamint a kezelőorvos megítélésétől. A találmány szerinti, passzív immunizálásra alkalmazott CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagokat előnyösen intravénásán adjuk be a betegnek, gyógyászatban elfogadott vivőanyagban, például fiziológiás konyhasóoldatban, például foszfáttal puffereit fiziológiás konyhasóoldatban. A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség céljából a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

- 20 - : ::../..

• · « · · · ·· *♦· I

1. példa

GRP1-DT- és GRP4-DT-konjugátumok előállítása

CCK-B/gasztrin-receptorpeptideket szokásos, szilárd fázisú peptidszintézissel állítottunk elő. Ahhoz, hogy az immunogének képesek legyenek specifikus immunválaszt kiváltani, az 1-es és 4-es peptideket olyan formában szintetizáltuk, hogy azok C-terminális végükön az SSPPPPC (a csatolt szekvencialistában a 3. azonosítószámú szekvencia szerinti) távtartó (^spacer} szekvenciát tartalmazzák. Ezeket a peptideket a hordozón - a Diftériatoxoidon (’DT) - jelen lévő amino-csoportokkal konjugáltuk a távtartó szekvencia terminális peptid-aminosaván, ciszteinen keresztül, egy heterobifunkcionális, egyik végén szukcinimidil-észetert, másik végén maleimidet tartalmazó kapcsoló vegyület alkalmazásával, az alább ismertetett A— vagy B—eljárás szerint.

A-eljárás: Az 5 023 077 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint, ^az 1-es és 4-es peptideket és a hordozót a következőképp kapcsoltuk össze. Szárított peptidet oldottunk 0,1 mol/1 nátrium-foszfát pufferben (pH=8,0), dithiothreitol (DTT) harmincszoros moláris feleslegének jelenlétében. Az oldatot vízpárával telített nitrogéngáz-atmoszféra alatt kevertük, négy órán át. A redukált ciszteint tartalmazó peptidet úgy választottuk szét az egyéb komponensektől, hogy azt 0,2 mol/1 ecetsavval ekvilibrált G10-Sephadex-oszlopon kromatografáltuk. A peptidet liofilizáltuk, és felhasználásig vákuum alatt tároltuk. A hordozót a hetero bifunkcionális kapcsoló vegyülettel, például epszilon- 21 maleimidokapronsav-N-hidroxiszukcinimid-észterrel (EMCSsel) kezeltük, olyan arányok alkalmazása mellett, amelyek elégségesek voltak ahhoz, hogy mintegy 25 szabad aminocsoport aktiválódjon a hordozó 10⁵ Dalton molekulatömegnyi egységének megfelelően. A diftériatoxoid konkrét példája esetében, ez 6,18 mg EMCS (75% tisztaságú vegyület) hozzáadását eredményezte a diftériatoxoid 20-20 mg mennyiségéhez .

A diftériatoxoid aktiválását úgy végeztük, hogy a diftériatoxoid 20 mg mennyiségét 1 ml, 0,2 mol/1 nátriumfoszfát pufferben (pH=6,45) oldottuk. 6,18 mg EMCS-reagens adagokat oldottunk 0,2 ml dimetil-formamidban ('DMF). Az EMCS-t sötétben, cseppenként, 50 mikroliteres (’μΙ) adagokban a DT-hez adtuk, állandó keverés közben. Miután az oldatot 2 órán át, sötétben inkubáltuk, az elegyet 0,1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó 0,1 mol/1 nátrium-citrát pufferrel (pH=6,0) ekvilibrált G50-Sephadex-oszlopon kromatografáltuk.

Az EMCS-aktivált diftériatoxoidot tartalmazó frakciókat PM10 ultrafiltrációs membránon koncentráltuk, sötétben. A koncentrátum proteintartalmát Lowry vagy Bradford eljárásával határoztuk meg. A hordozó EMCS-tartalmát úgy határoztuk meg, hogy az aktivált hordozót cisztein-HCl-el inkubáltuk, majd 10 mmol/1 Ellman-reagenssel - 5,5'ditiobisz(2-nitro-benzoesavval) - reagálhattuk. Cisztein-HCl-t tartalmazó kontrollcső és cisztein-HCl-t, valamint hordozót tartalmazó tesztcső optikai denzitása közti eltérés alapján, az 5-tio-2-nitro-benzoesav 412 nm hullámhosszon

- 22 13,6xl0³ értékű moláris extinkciós koefficiensének alkalmazásával kiszámítottuk az EMCS-csoport-tartalmat.

A peptid redukált ciszteintartalmát (-SH) is meghatároztuk, Ellman-reagens alkalmazásával. Körülbelül 1 mg peptidet oldottunk 1 ml, nitrogéngázzal szaturált vízben, és ennek az oldatnak 0,1 ml térfogatú mintáit Ellmanreagenssel reagáltattuk. Az 5-tio-2-nitro-benzoesavra jellemző moláris extinkciós koefficiens (13,6xl0³) alkalmazásával kiszámítottuk a szabad cisztein-SH-tartalmat. A peptid olyan mennyiségét, amely elegendő szabad (-SH)csoportot tartalmazott ahhoz, hogy a hordozó mind a 25 EMCS-aktivált szabad amino-csoportjával reagáljon, 0,1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó 0,1 mol/1 nátrium-citrát pufferben (pH=6,0) oldottuk, majd cseppenként az EMCS-aktivált hordozóhoz adtuk, sötét helységben.

Miután a peptidoldatot a hordozóhoz adtuk, az elegyet egy éjszakán át, sötétben inkubáltuk, vízpárával telített nitrogéngáz atmoszférában.

az EMCS-en keresztül hordozóhoz kötött peptidkonjugátumot úgy választottuk szét az egyéb komponensektől, hogy az elegyet 0,2 mol/1 ammónium-bikarbonáttal ekvilibrált G50Sephadex-oszlopon kromatografáltuk. Az oszlopról a kizárásos térfogatban eluálódott konjugátumot liofilizáltuk, és felhasználásig 20°C-on, szárított állapotban tároltuk.

A kapott konjugátum jellemezhető annak peptidtartalma alapján, amely meghatározható szakember számára ismert számos eljárással, például a tömegnövekedés meghatározásával, aminosav-analízissel, stb. Az 1-es és 4-es peptidek távtar

- 23 tó szekvenciával és diftériatoxoiddal alkotott, fenti módon előállított konjugátumaiban a tulajdonképpeni peptid és hordozó aránya olyan volt, hogy 5-35 mól peptid jutott 100 KD molekulatömegű hordozóra, és mindegyiket alkalmasnak tekintettük arra, hogy tesztállatok immunizálására alkalmazzuk immunogénként. Hatékony immunválasz kiváltásához előnyösen, 100 KD DT-re legalább 10-30 mól pepiidnek kell jutnia.

B-eljárás: Egy előnyös eljárás szerint, GRPl-et DThez kapcsoltan tartalmazó és GRP4-peptidet DT-hez kapcsoltan tartalmazó konjugátumokat állítottunk elő szobahőmérsékleten, a következőkben ismertetettek szerint. Tisztított DT-t (400 mg) oldottunk 20 ml térfogatú, nitrogéngázzal telített 0,5 mol/1 foszfát-pufferben (pH=6,6), miáltal 20 mg/ml DT-oldatot kaptunk. A DT-oldatot 60 ml térfogatú, sötétfalú üvegedénybe vittük át (amely reakcióedényként és szűrlettartályként is szolgált), EMCS kapcsoló reagenst (123,6 mg) oldottunk 2,0 ml dimetil-formamidban. Az EMCS-oldatot 15 perces időtartam alatt, cseppenként a DT-oldathoz adtuk, állandó keverés mellett. Az edényt lezártuk, és az elegyet további 1 óra 45 percen át szobahőmérsékleten kevertük, miáltal aktivált DT (M-DT) képződött. Ezt követően, az M-DT-t 1-113-G gépkönyv szerint, *ΧΜ50 diaflotf' ultrafiltrációs membránnal ellátott ^Amicon Model TFC10 Thin-Chanel Ultrafiltration Systenf' alkalmazásával, diafiltrálással tisztítottuk. Az M-DT-t 420-420 ml térfogatú foszfát-pufferrel szemben kétszer mostuk úgy, hogy az oldatot mindegyik alkalommal 20 ml-re koncentrál- 24 -

tűk, majd 420 ml térfogatú, 0,1 mol/1 EDTA-t tartalmazó 0,1 mol/1 citrát-pufferrel (pH=6,0) szemben ismét mostuk, és az oldatot 20 ml-re koncentráltuk.

GRPl-DT-konjugátumot úgy kaptunk, hogy 2,02 ml M-DToldatot (amely 22,3 mg M-DT-t tartalmazott) 10 ml térfogatú sötétfalú üvegedénybe vittünk át, majd 13 mg GRPl-peptidet oldottunk a citrát-pufferben, miáltal 40 mg/ml peptidoldatot kaptunk, és azt cseppenként az M-DT-oldathoz adtuk, keverés mellett. GRP4-DT-konjugátumot úgy kaptunk, hogy 2,21 ml M-DT-oldatot (amely 24,4 mg M-DT-t tartalmazott) 10 ml térfogatú sötétfalú üvegedénybe vittünk át, majd 13 mg GRP4-peptidet oldottunk a citrát-pufferben, miáltal 40 mg/ml peptidoldatot kaptunk, és azt cseppenként az M-DToldathoz adtuk, keverés mellett.

A reakciókat egy éjszakán át, sötétben hagytuk végbemenni. Az egyes konjugátumokat a reakcióedényekből eltávolítottuk, és azokat külön-külön, 12 000-14 000 molekulatömegig áteresztő dializiscsőben, 500 ml térfogatú, 0,1 mol/1 ammónium-bikarbonát oldattal szemben dializáltuk, a dializáló oldatot ötször cserélve. A konjugátumokat liofilizáltuk. Ezután, a konjugátumokat aminosav-analízisnek vetettük alá, és meghatároztuk azokban a peptid és DTszubsztitúció arányát, amely szerint, a GRP1-DTkonjugátumban 21,8 peptid jutott 10⁵ molekulatömegű DT-re, és a GRP4-DT-konjugátumban 21,1 peptid jutott 10⁵ molekulatömegű DT-re.

Az 1-es és 4-es peptidek távtartó szekvenciával és DT-vel alkotott, fenti módon előállított konjugátumaiban a

- 25 tulajdonképpeni peptid és hordozó aránya olyan volt, hogy 5-35 mól peptid jutott 100 KD molekulatömegű (MW) hordozóra, és mindegyiket alkalmasnak tekintettük immunogénként történő alkalmazásra. Hatékony immunválasz kiváltásához előnyösen, 100 KD DT-re legalább 10-25 mól peptidnek kell jutnia.

Immunogének előállítása:

Az 1-es vagy 4-es peptidek távtartó szekvenciával és DT-vel alkotott, fent ismertetettek szerint előállított konjugátumait tartalmazó találmány szerinti immunogénekkel nyulakat immunizáltunk. Immunogéneket a következők szerint állítottunk elő: konjugátumot 0,15 mol/1 koncentrációjú, nátrium-foszfáttal pufferolt sóoldatban (pH=7,3) oldottunk, 3,79 mg/ml koncentrációban. A konjugátum-oldatot Montanide ISA (703) adjuvánshoz (Seppic, Inc.) adtuk úgy, hogy az elegyben a konjugátumoldat és Montanide ISA 703 adjuváns aránya 30:70 (tömeg:tömeg) legyen, majd azt 3 percig * Silverson Homogenizer készülékkel homogenizáltuk,

000 fordulat/perc-cel; a fenti módon eljárva 1 mg/ml konjugátumot tartalmazó emulziót kaptunk. Immunizácíó és mintavétel

Nyulakat injektáltunk intramuszkulárisan 0,1 ml immunogénnel, amely 0,1 mg GRP1-DT vagy GRP4-DTkonjugátumot tartalmazott. Minden nyulat a 0. és a 4. héten injektáltunk az immunogénnel. A nyulaktól vért vettünk a kísérlet 6. és 8. hetében. Az egyes vérmintákból szérumot nyertünk, és azokat -20°C-on tároltuk a későbbi felhasználásig, amikor is azokat CCK-B/gasztrin-receptor elleni el

- 26 lenanyagok jelenlétének kimutatására alkalmas vizsgálati eljárásokban alkalmaztuk.

Enzimes immunológiai vizsgálati eljárás (ELI5A)

Szilárd fázisú ELISA-eljárást alkalmaztunk az 1-es és 4-es peptidek ellen immunizált nyulakban termeltetett antiszérumok reaktivitásának és kereszt-reaktivitásának kimutatására. Az ELISA-vizsgálot úgy végeztük, hogy 96 lyukú polisztirén-lemezek (IMMUNOLON II, Dynatech) egyes lyukait lyukanként 25 μΐ, 10 μg/ml koncentrációjú, 0, 1 mol/1 glicin-HCl pufferben (pH=9,5) oldott, szarvasmarha-eredetű szérumalbuminhoz kapcsolt 1-es peptid antigénnel (CRPlBSA), vagy szarvasmarha-eredetű szérumalbuminhoz {bovine serum albumirí', BSA) kapcsolt 4-es peptid antigénnel (’GRP4-BSA ) vontuk be. A lemezeket egy éjszakán át, 4°C-on inkubáltuk, majd pufferrel mostuk.

Az immunizált nyulaktól származó antiszérumokból 1%os BSA-FTA hemagglutinációs pufferben (pH=7,2) sorozathígításokat készítettünk úgy, hogy 10^_1-10-^θ -szoros hígításokat kapjunk. Lyukanként 25 μΐ teszt-antiszérumot inkubáltunk az egyes tesztpeptidekkel 1 órán át, szobahőmérsékleten. Az inkubációt követően, a lemezeket pufferrel alaposan mostuk, miáltal a nem kötődött ellenanyagokat eltávolítottuk. Mindegyik lyukba 25 μΐ biotinezett, kecskében termelt anti-nyúl IgG(H+L)-ellenanyagot mértünk, amelyet előzőleg 1% BSA-FTA-hígítópufferben hígítottunk 1:1000 arányban, és a lemezeket egy órán át, szobahőmérsékleten inkubáltuk. Miután a lemezeket a nem kötődött, nyúl-Ig elleni reagens eltávolítása céljából mostuk, az egyes lyuka

- 27 kát 1 órán át, szobahőmérsékleten, 25 μΐ térfogatú [avidin - alkalikus foszfatáz] konjugátummal inkubáltuk, amelyet előzőleg 1% BSA-FTA-pufferben hígítottunk 1:1 000 arányban. A lemezeket a nem kötődött [avidin - alkalikus foszfatáz] reagens eltávolítása céljából alaposan mostuk, és 25 μΐ, 1 mg/ml p-nitrofenil-foszfát C'PNPP) reagenssel inkubáltuk, amelyet előzőleg 0,01% MgC12.6H₂O -val kiegészített 10% dietanolamin-pufferben (pH=9,8) oldottunk. A színreakciót hagytuk előhívódni, amíg a reakcióelegyek 490 nm hullámhosszon mért fényelnyelése 0,8 és 1,5 közti értéket ért el. A nyulakban termelt antiszérumok specifitásának tesztelésére nyulakat immunizáltunk DT-vel is, és ELISA-vizsgálat céljára lemezeket vontunk be DT-vel, mint antigénnel, hogy meghatározhassuk az előállított antiszérumok hordozóval szemben mutatott reaktivitását.

A 2. ábrán a Peptid-1/GRP1 antigénként történő alkalmazásával kapott ELISA-eredményeket, a 3. ábrán pedig a Peptid-4/GRP4 antigénként történő alkalmazásával kapott ELISA-eredményeket szemléltetjük. Amint az a 2. ábrán bemutatott ELISA-eredmények alapján látható, az [1-es peptid távtartó szekvencia - DT] konjugátummal immunizált nyulakban 1-es peptidhez specifikus módon kötődő ellenanyagok voltak kimutathatók magas titerben; az ellenanyag még az antiszérum magas hígításai (1:100 000) mellett is kötődött 1-es peptidhez. Hasonlóképp, a 3. ábrán bemutatott eredmények szerint, a [4-es peptid - távtartó szekvencia - DT] konjugátummal immunizált nyulakban 4-es peptid elleni ellenanyagok termelődtek magas titerben. Amint az a 2. és 3.

- 2 8 - j S J ábrán látható, az egyes peptidekkel immunizált nyulakban az egyes peptidekhez specifikus módon kötődő ellenanyagok voltak kimutathatók, alacsony antiszérum-koncentrációk mellett is. Az adatok szerint, az 1-es peptid elleni ellenanyagok és 4-es peptid elleni ellenanyagok nagymértékben képesnek bizonyultak a CCK-B/gasztrin-receptor 1-es és 4-es peptidjéhez kötődni. Az adatok alapján az is világos, hogy nyulak immunizálása a találmány szerinti konjugátumokkal hatékony immunválaszt vált ki az 1-es és 4-es peptidekkel szemben. Továbbá, az 1-es peptidkonjugátummal vagy 4-es peptidkonjugátummal immunizált nyulak viselkedése normálisnak tűnt, és azoknál a kísérlet folyamán nem tapasztaltuk semmilyen betegség vagy kóros elváltozás tüneteit.

2. példa

Az alábbi kísérletet az 1. példában ismertetett Beljárás szerint előállított, ’Ser távtartó szekvenciát tartalmazó GRPl-DT-peptiddel szemben előállított ellenanyagok specifitásának meghatározására végeztük. Tesztsorozatot végeztünk a GRPl-DT-peptiddel történő immunizációval előállított, GRPl-Ser-Sepharose-oszlopon affinitásos eljárással tisztított nyúleredetű ellenanyagok specifitásának meghatározására.

A GRPl-Ser-peptid elleni, affinitásos eljárással tisztított ellenanyagok specifitásának meghatározára ELISA gátlási vizsgálatot végeztünk. A vizsgálati eljárás kivitelezése a következőképp történt: 96 lyukú lemezeket (Immunion, U-fenekű) be GRPl-Ser-BSA-konjugátumokkal von-

tünk be úgy, hogy a lyukakat egy éjszakán át, 50 μΐ, 2 μg/ml konjugátum-oldattal inkubáltuk, glicin-pufferben (0,1 mol/1 , pH=9,5) , 4°C-on. Affinitásos eljárással tisztított, GRPl-peptid elleni ellenanyagot elegyítettünk (10 ng/ml végkoncentrációban) különböző inhibitorokkal (az inhibitorok 1:10 léptékű hígítási sorával), és azokat 1 órán át, szobahőmérsékleten inkubáltuk. A következő inhibitorokat alkalmaztuk: GRPl-Ser; GRP1-EPT; Ser; [humán gasztrin 17(1-9) - Ser távtartó szekvencia] [hG17(9)-Ser]; GRPl-EPT+Ser; és puffer (inhibitor nélkül). Az alábbi összetételű inkubációs puffért alkalmaztuk: PBS+0,5% BSA+0,05% Tween-20+0, 02% NaN₃. A további lépesekben ugyanezt a puffért alkalmaztuk, BSA nélkül. A 96 lyukú lemezekről a nem kötődött GRPl-Ser-BSA-konjugátumot mosással eltávolitottuk, és azokhoz hozzáadtuk az ellenanyag és inhibitor elegyét (50 μΐ/lyuk). Egy óra elteltével, a lemezeket mostuk, és azokhoz kecskében termelt, anti-nyúl-Ig(H+L) alkalikus foszfatáz konjugátumot (Zymed) adtunk. (1:2000 hígításban) . Egy órás inkubációt követően, a lemezeket a nem kötődött reagensek eltávolítása céljából mostuk, és azokhoz 50 μΐ/lyuk NPP-szubsztrátot (Sigma) (1 mg/ml) adtunk szubsztrátpufferben (PBS; 0,01 mg/ml MgCl₂; 10% dietanolamin; 0,02% NaN₃) . Hatvan (60) perces inkubációt követően, MRX-készülékkel (Dynatech Laboratories) mértük a fényelnyelést. Mintákat duplikátumokban értékeltünk, és mindegyik koncentrációnál átlagértékeket számítottunk. Valamennyi értékből kivontuk a háttérkötődést (amelyet affinitásos eljárással tisztított, nyúlban termelt, GnHR-peptid

- 30 elleni ellenanyagok alkalmazásával állapítottunk meg); és mindegyik tesztelt inhibitorra vonatkoztatva kiszámítottuk a gátlást, százalékban kifejezve, az inhibitort nem tartalmazó minta (anti-GRP-ellenanyag + puffer) alkalmazásával kapott értékhez viszonyítva: % gátlás = (100) (l-[(Ag_átiás néiwi-Agátiás mellett)/Agátiás nélküli; ahol A jelentése fényelnyelés

Absorbance'') .

A 4. ábrán ellenanyagkötődés gátlását ábrázoltuk százalékban kifejezve, az inhibitor koncentrációjának függvényében. Amit az ábrán látható, a GRPl-Ser-peptid teljesen gátolta az ellenanyag kötődését a GRPl-Ser-BSAkonjugátumhoz. Mintegy 60%-os gátlás volt elérhető a GRP1EPT-peptid alkalmazásával, amely nem tartalmazza a ’Ser távtartó szekvenciát, és hasonló gátlást értünk el GRP1EPT-peptid és Ser távtartó szekvencia ekvimoláris elegyének alkalmazásával. Annak alapján, hogy ezekkel a peptidekkel nem érhető el teljes gátlás, arra következtethetünk, hogy az ellenanyagok egy része a GRPl-peptid és a Ser távtartó szekvencia elemeit egyaránt tartalmazó epitópra (epitópokra) specifikus. Nem volt gátlás megfigyelhető a Ser távtartó szekvencia önmagában történő alkalmazásával, vagy egy Ser távtartó szekvenciát tartalmazó, a GRPl-peptiddel rokonságot nem mutató peptid alkalmazásával [hG17(9)-Ser; amely a hGH17 kilenc aminoterminális aminosavát, és ezt követően, a Ser távtartó szekvenciát tartalmazta]. Az ELISA-eredmények azt mutatják, hogy az affinitásos eljárással tisztított ellenanyagkészítmény specifikus volt a GRPl-Ser-peptidre, és a kötő

- 31 aktivitás 60%-a a peptid gasztrinreceptor-epitóp komponense ellen irányult.

3. pél da

Az AR42J-tumorsejtek (European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, UK) patkányeredetű hasnyálmirigy-adenokarcinómából származnak, és azokról ismert, hogy alaposan jellemzett CCK-B/gasztrin-receptorokat hordoznak. AR42J-sejteket teszteltünk tehát radioligandum-gátlási eljárással annak igazolására, hogy a sejtek expresszálják a CCK-B/gasztrin-receptort, és a receptor hG17-re specifikus. AR42J-sejteket tenyésztettünk 37°C-on, 7% C0₂ jelenlétében, 10% FCS-sel (Gemini Bioproducts), 2 mmol/1 glutaminnal (JRH Biosciences), 1 mm nátrium-piruváttal (JRH B) , valamint gg/ml gentamicinnel (Gemini Bioproducts) kiegészített komplett RPMI-1640-tápközegben (Sigma). A sejteket 175 cm2 alapterületű T-palackokból (Falcon Plastics), 0,25% EDTA-t tartalmazó PBS-pufferrel összegyűjtöttük, majd PBS-sel (EDTA nélkül) kétszer mostuk, a sejteket centrifugálással ülepítve (400Xg, 10 percig). A sejteket valamennyi művelet közben 0-4°C-on tartottuk. Különálló sejteket tartalmazó szuszpenziót készítettünk pufferben, és a sejtkoncentrációt 10⁶ sejt/ml -re állítottuk be. Egy (1) ml térfogatú sejtszuszpenzió-mintákat adtunk 12X75 mm csövekhez, majd a sejteket centrifugáltuk, és a felülúszót eltávolítottuk. A sejteket humán G17-peptidet (hG17), gonadotropin felszabadulását előidéző hormont ('gonadotropin releasing hormone; GnRH) tartalmazó PBS-ben, vagy peptidet nem tartalmazó PBS- 32 ben szuszpendáltuk (0,1 ml/cső). A következő peptidkoncentrációkat alkalmaztuk: 1,0 ng/ml; 100 ng/ml; és 10 μg/ml. Mindegyik csőhöz 0,1 ml ¹²⁵I-jelölt hG17-peptidet (NEN) adtunk, amely mintegy 23 300 cpm-nek felelt meg (specifikus aktivitás: 2200 Ci/ml) A csöveket vortexkészülékkel kevertük, majd 15 percig inkubáltuk. A sejteket PBS-sel kétszer mostuk, majd γ-számlálóban (Wallac) értékeltük. Mintákat duplikátumokban teszteltünk. A háttárértékeket kivontuk, majd százalékban megadva kiszámítottuk, hogy az egyes inhibitorok milyen mértékben gátolták a ¹²⁵IhG17-kötődést, a következő egyenlet alapján: % gátlás = (100) (I^- [ (CPMgátlás nélkül^-CPMgátlás mellett) /CPMgátlás nélkül] ·

A radioligandumkötődés-gátlási tesztek eredményeit az 5. ábrán mutatjuk be, amelyen az adatok az egyes értékek számtani középértékit képviselik (+/-SE). Amint az ábrán látható, a hG17 gátolta a ¹²⁵I-hG17-kötődését az AR42Jsejtekehez. A gátlás mértéke a hozzáadott inhibitor mennyiségével arányosan nőtt; a legmagasabb tesztelt peptidkoncentráció - csövenként 1 μg hG17-peptid - alkalmazásakor 32% gátlást értünk el. Ezzel szemben, a GnRH-peptid a két legmagasabb tesztelt koncentrációban sem gátolt (a 100 mg GnRH-peptid alkalmazásával elért 6%-os gátlást nem tekintettük specifikusnak), ami azt jelenti, hogy a hGH17 alkalmazásával elért gátlás specifikus volt gasztrinra. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az AR42J-tumorsejtek felszínén gasztrinreceptor expresszálódott.

4. példa

A GRPl-Ser-specifikus ellenanyagok AR42J-sejtekhez történő kötődését immunfuloreszcens eljárással vizsgáltuk. AR42J-sejteket az 3. példában ismertetettek szerint tenyésztettünk, és 175 cm² alapterületű T-palackokról sejtkaparóval gyűjtöttünk össze, majd pufferrel (0,02% NaN₃-at tartalmazó PBS-sel), centrifugálással (400Xg mellett, 7 percig) mostunk. A sejteket valamennyi művelet közben 04°C-on tartottuk. Különálló sejteket tartalmazó szuszpenziót készítettünk pufferben, és a sejtkoncentrációt

10⁶ sejt/ml -re állítottuk be. A sejtszuszpenziót 1,5 ml mikrocentrifuga-csövekhez adtuk (1 ml/cső). A sejteket centrifugálással kiülepítettük, és a felülúszót leszívással eltávolítottuk. A sejteket peptidinhibitorokat (1,0 mg/ml) tartalmazó pufferben (0,1 ml/cső) szuszpendáltuk. A következő inhibitorokat alkalmaztuk: GRPl-Ser; GnRH, hG17(9)Ser; és puffer (inhibitor nélkül). Ellenanyagokat, azaz a nyúleredetű, GRPl-Ser-peptid elleni ellenanyagot 8100 μg/ml, affinitásos eljárással tisztított nyúleredetű, DT elleni ellenanyagot (negatív kontrollként; 100 μg/ml); egéreredetű anti-AR42 J-antiszérumot (pozitív kontrollként, 1:100 hígításban, hővel inaktivált formában) vagy normál egérszérumot adtunk a megfelelő csövekhez, és azok tartalmát összekevertük. A sejteket 1 órán át inkubáltuk, azok tartalmát időnként megkeverve. Ezután, a sejteket pufferrel háromszor mostuk, és 0,1 ml fluoreszceinnel jelölt, kecskeeredetű anti-nyúl-IgG-t (Antibodies Incorporated) adtunk az egyes csövekhez (1:50 arányban hígítva). Az egérszérummal

- 34 kezelt sejteket fluoreszceinnel jelölt anti-egér-IgGreagenssel (Zymed) reagálhattuk. A sejteket vortexeléssel ismét szuszpendáltuk, majd 1 órán át inkubáltuk. A sejteket megint háromszor mostuk, majd glicerin és PBS elegyében (1:1; térfogat:térfogat) ismét szuszpendáltuk (50 μΐ/cső).

Nedves keneteket készítettünk az egyes csövek tartalmából, és a sejteket Laborlux 12 fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk (Leitz). A fluoreszcencia mértékét 0-4 pontszámmal értékeltük, ahol 0 a háttérfluoreszcenciát (azaz, a normál egérszérummal kapott fluoreszcenciát) képviselte, a 4-es érték pedig a maximális fluoreszcenciának (azaz az egéreredetű anti-AR42J pozitív kontroll antiszérummal kapott fluoreszcenciának) felelt meg.

Az immunfluoreszcens tesztek eredményeit az 1. táblázatban összegeztük. Amint az a táblázatban közölt adatok alapján látható, GRPl-Ser-peptid elleni ellenanyagokkal kezelt AR42J-sejtek peptidinhibitor jelenléte nélkül erősen fluoreszkáltak, ami azt jelenti, hogy az ellenanyag kötődött a sejtekhez. Nyúleredetű, DT elleni ellenanyagok nem eredményeztek fluoreszcens festődést, minek alapján arra következtethetünk, hogy az GRPl-Ser-peptid elleni ellenanyagok alkalmazásával megfigyelhető festődés nem a nyúleredetű immunglobulin nem-specifikus sejtfelszíni kötődésének volt a következménye. Továbbá, a kötődésről kimutattuk, hogy az specifikus a GRPl-Ser-peptidre. GRPl-Ser-peptid hozzáadása a kötődést teljesen gátolta, míg GRPl-peptiddel rokonságot nem mutató peptid, például a hG17(9)-Ser- és GnRH-peptideknek nem volt gátló hatása. Mivel a GRPl-epitóp

- 35 a gasztrinreceptor 5-21. aminosavát tartalmazza, arra következtettünk, hogy az GRPl-Ser-peptid elleni ellenanyagok az AR42J-sejtek által expresszált gasztrinreceptorra specifikusak.

1. táblázat

Ellenanyag- készítmény		Inhibitor
	GRPl-Ser	hG17(9)-Ser	GnRH	Puffer
Nyúleredetű anti- GRPl-Ser	0	3+	2 +	3 +
Nyúleredetű anti-DT	0, 5+	0, 5+	0, 5+	0, 5+
Egéreredetű anti- AR42J				4 +
Normál egérszérum				0 1

5. példa

A 16-18. passzálásból származó AR42J-sejteket 10% FCS-t és 2 mmol/1 glutamint tartalmazó RPMI-1640tápközegben tenyésztettünk. Valamennyi sejtet 37°C-on, 100% páratartalmú 5% CO2 -ot tartalmazó levegőatmoszférában tartottunk fenn, és 80%-ban összefüggő tenyészet kialakulásáig szaporítottunk T75-palackokban (Falcon, London, UK), és 0,02% EDTA-val végzett kezeléssel passzáltunk, amellyel a letapadt sejteket szuszpenzióba vittük. Sejteket 10 másodpercig, 30 másodpercig, 30 percig és 1 óráig CCK

- 36 B/gasztrin-receptor elleni ellenanyaggal (aGR) inkubáltunk, amelyet nyúlban termeltettünk a találmány szerinti, CCKB/gasztrinreceptor 1-es peptidjéből előállított immunogén alkalmazásával az 1. példában ismertetettek szerint, és amelyet affinitásos eljárással tisztítottunk 1-es peptidet tartalmazó oszlopon.

A sejteket egy órán át 1% glutáraldehiddel fixáltuk, és ismert technológiákkal immunelektronmikrőszkópiás (ImmunoEM) vizsgálatokra előkészítettük. A sejtszuszpenziót kétszer, 2000 fordulat/perc -cél, 2-2 percig centrifugáltuk, majd a sejtüledéket foszfátpufferos sóoldatban (PBSben) szuszpendáltuk. A sejtüledéket LRwhite műanyaggyantával átitattuk. Hetven-kilencven (70-90) nanométer (nm) ultravékony metszeteket készítettünk, és Pioloforinm.a.1 bevont nikkelrácsokra vittünk. A rácsokat 0,1% szarvasmarha-eredetű szérumalbumint (BSA) (Sigma, Poole, Dorset) tartalmazó normál kecskeszérumba helyeztük (Dako, High Wycombe, UK) , és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A rácsokat PBS-sel mostuk, majd 1 órán át, szobahőmérsékleten második ellenanyaggal - biotin-konjugált kecskeeredetű, nyúl-Ig elleni (arannyal jelölt) ellenanyaggal - inkubáltuk; a második ellenanyagot 1:50 arányban hígítottuk 1% BSA-ban. Kontrollkisérleteket második ellenanyag alkalmazása nélkül végeztünk. Egy utolsó PBSpufferrel történő mosást követően, a rácsokat telített vizes uranil-acetát oldatban 3 percig, és Reynold-féle ólomcitrát oldatban 3 percig utánfestettük. Megszámoltuk a sejtmembránon, a citoplazmában, a magmembránon és a magban

- 37 megfigyelhető aranyrészecskéket. Rácsonként 25 sejtet értékeltünk a fenti módon, az értékelést független vizsgáló végezte. Kontrollokként, AR42J-sejteket érintkeztettünk ellenanyagokkal 1 másodpercnél kevesebb ideig, és CCKB/gasztrin-receptorokat nem hordozó máj sejteket alkalmaztunk. További kontrollként, normál IgG-vel érintkeztetett AR42J-sejteket alkalmaztunk, hogy a CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok nem-specifikus kötődését meghatározhassuk. A kísérlet eredményeit a 2. táblázatban és a 6. ábrán foglaltuk össze.

2. táblázat

CCK-B/gasztrin-receptorhoz kapcsolódó immunogoldellenanyag-részecskék megoszlása AR42J-sejtekben

	Sej tmembrán	Sejtmátrix	Magmembrán	Magmátrix
Aranyrés zecskék száma	14,2 ( + /- 0,97)	43,3 (+/- 2,32)	9,3(+/- 0,81)	51,4 (+/- 3, 32)
Aranyrészecskék megoszlása a sejtben, százalékban	12%	36, 6%	7,9%	43, 5%

(számtani középérték+/-SEM, 25 sejt értékelése alapján, n=5 ismétlés).

- 38 Amint az a 2. táblázatból és a 6. ábrából kitűnik, CCK-B/gasztrin-receptorhoz kapcsolódó immunogoldellenanyag-részecskék voltak kimutathatók az adenokarcimóma-sejtek plazmamembránján, citoplazmájába, magmembránján és magmátrixában, további bizonyítékát szolgáltatva annak, hogy az ellenanyag/receptor-komplex a sejtekbe jutott.

Amint a 2 <, táblázatból látható, a CCK-B/gasztrinreceptor amino-terminális vége ellen irányuló antiszérum alkalmazásával végzett immunoEM-vizsgálatok azt mutatták, hogy az immunogoiddal jelölt, CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok gyorsan bejutottak a sejtekbe, hiszen egy órás inkubációt követő az ellenanyag/receptor-komplex 12%-a a sejtmembránnal asszociálódva, 36, 6%-a a citoplazmában, 7,9%-a a magmembránban, és eléggé meglepő módon, 43,5%-a a sejt magjában volt megfigyelhető. A magon belül, erős CCKB/gasztrin-receptor immunreaktivitást mutató területeket találtunk a kromatinban, ami azt jelentheti, hogy ott a DNS-szabályozást szolgáló specifikus kötőhelyek találhatók. Aranyszemcsékkel konjugált, immunglobulin elleni ellenanyag (' inanunogold ) alkalmazásával végzett elektronmikroszkópos vizsgálatok szerint, a tumorsejtekben az antireceptor/receptor-komplex rendkívül gyorsan továbbkerül; a 6. ábrán látható, hogy már 10 másodperccel az ellenanyaggal történő érintkezést követően komplexek mutathatók ki a sejt magjában.

- 39 - ·; : ::.. ’ • * * * *

6. példa

Adenokarcinóma-sejvonalakat, közelebbről AR42J-, HCT116-, C170HM2-, L0V0-, ST16- és MGLVAl-sejtvonalakat tenyészettünk in vitro, és a sejteket a 3. példában ismertetettek szerint összegyűjtöttük. Harminc T75-palackból összegyűjtött sejteket 5 ml homogenizáló pufferben szuszpendáltunk [1 mmol/1 nátrium-hidrogénkarbonát; 2 mmol/1 magnézium-klorid; 1 nmol/1 fenilmetil-szulfonil-fluorid; 40 mmol/1 nátrium-klorid; 10 μΐ leupeptin; 1 μπιοί/ΐ pepsztatin; 5 mmol/1 EDTA (Sigma)]. Homogenizálását homogenizátor készülékben végeztünk, öt, egyenként 5-5 másodperces impulzussal. Extranukleáris membránok esetében, a szövettörmeléket 500 g mellett, 7 percig, 4°C-on végzett centrifugálással kiülepítettük. Az üledéket kidobtuk, és a felülúszót 500 g mellett, 4°C-on centrifugáltuk, miáltal a még visszamaradt törmelékeket eltávolítottuk. A felülúszót 48 OOOxg mellett, egy órán át centrifugáltuk. Az extranukleáris membránkészítményt tartalmazó üledéket Tris/NP-40-oldatban szuszpendáltuk [0,1 mol/1 TRIZMA; 0,5% NONIDET P40 (Sigma Chemical)].

Ahhoz, hogy nukleáris membránkészítményt (magmembránkészítményt) kapjunk, egy második homogenizációs pufferben [25 mmol/1 Tris-HCl (pH=7,4); 0,1% Triton-100; 0,32 mol/1 szacharóz; 3 mmol/1 MgCl₂; 2 mmol/1 EGTA, 0,1 mmol/1 spermin-tertrahidroklorid, 2 mmol/1 PMSF; 10 mmol/1 benzomidin-hidroklorid, 3 mmol/1 EGTA-aminoacetonitril hidroklorid (Sigma)] végzett homogenizációt követően a szövettörmelékeket 400xg mellett, 10 percig, 4°C-on végzett

centrifugálással kiülepítettük. Az üledéket 55%-os (0,2 mol/1), HPLC-vízben oldott szacharózban szuszpendáltuk. Az elegyet 60 OOOxg mellett, 1 órán át, 4°C-on centrifugáltuk. Az üledéket 0,4 % NONIDET-P40-et tartalmazó, de TRITON-lOO-detergenst nem tartalmazó homogenizációs pufferrel mostuk. Az üledéket 700 g -n, 15 percig, 4°C-on centrifugáltuk, és TRITON-lOO-detergenst nem tartalmazó homogenizációs pufferben szuszpendáltuk.

A proteintartalmat Lowry eljárásával határoztuk meg (a Pierce egy reagenskészletének alkalmazásával). Tíztizenöt (10-15) pg proteint tartalmazó mintákat vittünk fel 8-16%-os Tris/glicin gradiens poliakrilamidgélelektroforézis-PAGE-re (Novex R és D rendszerek) Tris/glicinpufferben, és a gélt 90 percig, 125 Volt állandó feszültség és 36 mA mellett futtattuk. A gélt 10% jégecetben fixáltuk 1 óráig, és mintákat nitrocellulóz-membránra blöfföltünk. A membránokat 1% BSA-ban inkubáltuk egy órán át, majd GRP1antiszérummal inkubáltuk (előzetes abszorbciót követően vagy anélkül) 1 órán át. Az ellenanyagkötődést avidin:biotin-peroxidáz-komplex eljárással mutattuk ki, diamino-benzidén szubsztrátként történő alkalmazásával. A 1-es peptid elleni nyúleredetű antiszérum (nyúleredetű, GRPl-peptid elleni antiszérum) alkalmazásával végzett Western-blot-analizis eredményeit a 7. és 8. ábrán mutatjuk be.

A 7. ábrán látható, hogy a protein molekulatömegmarkerek 116, 66, 45, és 29 kDa molekulatömegűek voltak. A bloton, egy kivételével (AP5LV) valamennyi vizsgált adeno-

karcinóma-sejt esetében, azaz a HCT116-, C170HM2-, L0V0-, ST16- és MGLVAl-sejtek esetében egy szembetűnő, 1-es peptid elleni immunreaktív csík látható, amely mintegy 45 kDa molekulatömegnek megfelelően vándorolt. Ez a protein a CCKB/gasztrin-receptor csonka formájának felel meg. Egyes sejtvonalak esetében (HCT116 és C170HM2) legalább 3 további csík figyelhető meg, amelyek molekula-tömege 60 és 100 kDa közé esett. Eredményeink szerint, a CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok képesek a CCK-B/gasztrin-receptor különböző izoformjait tumorsejteken felismerni, és azokhoz kötődni.

A 8. ábrán C170HM2- és HCT116-elnevezésű adenokarcinóma-sejtek extranukleáris membránjának (ENM) és plazmamembránjának Western-blot-analízisével kapott eredményeinket mutatjuk be. Amint az a 8. ábrán látható, ENM CCKB/gasztrin-receptorok jelenlétére tesztelt adenokarcinómasejtvonalak esetében két erősen festődött csík figyelhető meg: az egyik mintegy 43 kDa, a másik mintegy 66 kDa molekulatömegnek megfelelően. Amikor csak a plazmamembránt festettük meg, egyetlen, mintegy 66 KDa csík volt kimutatható. A Western-blot vizsgálatok tehát alátámasztják az immunoEMvizsgálattal kapott eredményeket, amelyek szerint a CCKB/gasztrin-receptor jelen van adenokarcinóma-tumorsejteken, bár az immunoEM-vizsgálát nem képes különbséget tenni a CCK-B/gasztrin-receptor izoformjai közt. Az eredmények szerint, a találmány szerinti immunogének CCK-B/gasztrinreceptor elleni ellenanyagok termelődését váltják ki, amelyek képesek felismerni a receptor különböző izoformjait.

- 42 és képesek azokhoz kötődni, ami előnyösen kihasználható a fenti tumorok kezelésében.

7. példa

C170HM2 adenokarcinóma-sejteket injektáltunk intraperitoneálisan nude-egerekbe, és a tumorokat hagytuk növekedni a májban. A kontroll egerek foszfáttal puffereit fiziológiás konyhasóoldat (PBS) infúziót kaptak, míg a kísérleti egerek egy CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagokat tartalmazó infúziót kaptak. Az 1-es kísérleti csoportba tartozó egereket naponta infundáltuk 0,5 mg nyúlban termelt, 1-es peptid (nyúleredetű, 1-es peptid elleni ellenanyag; Rbt@GRPl) ellen készített CCK-B/gasztrinreceptor elleni ellenanyaggal. A 2-es kísérleti csoportba tartozó egerek naponta 0,5 mg, nyúlban termelt 4-es peptid ellen készített CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagot (nyúleredetű ,4-es peptid elleni ellenanyag; Rbt@GRP4) kaptak. Az egereket az ellenanyag-infúziót követően 40 napon át megfigyeltük, leöltük, és a tumorokat vizsgálat céljából kivettük. A tumorok tömegét, méretét és keresztmetszetét ismert eljárásokkal értékeltük Eredményeinket a 9. és 10. ábrákon összegeztük.

Amint azt a 9. és 10. ábra mutatja, a C170HM2elnevezésű kolorektális adenokarcinóma ráksejtvonal implantálása egerekbe kezelés nélkül nagy tumortömegek gyors növekedését eredményezte, amint azt a tumortömeg vagy tumorméret és a tumorok keresztmetszeti felszíne területének vizsgálata mutatta. Amennyiben azonban a nyulakat nyúl

- 43 eredetű 1-es peptid elleni vagy nyúleredetű 4-es peptid elleni ellenanyagokkal infundáltuk, jelentősen csökkent azon állatok száma, amelyeknél egyáltalán tumor volt kimutatható, továbbá, a tumort hordozó állatok esetében, a kontrollokhoz képest csökkent a tumorok tömege és mérete. Ugyanez a hatás volt megfigyelhető, amikor a tumortömeg, tumorméret vagy a tumorszám számtani középértékét számítottuk ki. Az erre vonatkozó adatokat a 11., 12. és 13. ábrán mutatjuk be.

További ismereteket szerezhetünk a populáción belüli megoszlásról a tumorszám, tumortömeg és -méret mediánértékeinek kiszámításával. Eredményeinket a 14., 15. és 16. ábrán mutatjuk be. Amint az ábrákon látható, a nyúleredetű, 1-es peptid immunogén elleni ellenanyag következetesen hatékonyabban gátolta a tumornövekedést mint a nyúleredetű, 4-es peptid immunogén elleni ellenanyag. A kontrollkezelés hatásához képest azonban mind a nyúleredetű, 1-es peptid. immunogén elleni ellenanyag, mind a nyúleredetű, 4-es peptid immunogén elleni ellenanyag erős tumornövekedésgátló aktivitást mutatott.

8. pél da

Nagyobb tumortömeg keletkezését idéztük elő nudeegerekben a C170HM2-elnevezésű kolonkarcinóma-sejtvonal alkalmazásával, a 7. példában leírtak szerint eljárva, de nagyobb kiindulási sejtinokulumot alkalmazva. A C170HM2 egy máj invazív xenograft modell. Kontroll és kísérleti egereket ugyancsak a 7. példában ismertetettek szerint kezeltünk.

Az ellenanyag-infúziót követően negyven nappal az egereket leöltük, és azokból máj tumorokat távolítottunk el és vizsgáltunk. A fenti kísérlet eredményeit a 17. 18. és 19. ábrákon mutatjuk be. A 17. ábrán kontroll, és CCKB/gasztrin-receptor elleni ellenanyaggal kezelt állatokban megfigyelt máj tumorszámok számtani középértékeit és mediánértékeit ábrázoltuk. Az adatok szerint, a CCK-B/gasztrinreceptor elleni ellenanyagok ('Rabbit@GRP) hatékonyan gátolták a metasztatikus tumorok növekedését a májban. A nyúleredetű, 1-es peptid elleni ellenanyagok alkalmazásával a kontrollokhoz képest statisztikailag szignifikáns módon csökkent a máj tumorszámok számtani középértéke az egerek májában (Student T-teszt) (P=0,0084), valamint a májtumorszámok mediánértéke (p=0,0016) (Mann Whitney). A 4-es peptid elleni ellenanyagokkal kezelt egerekben is csökkent a máj tumorszámok számtani középértéke; ezeknél az állatoknál nem volt azonban különbség kimutatható a máj tumorszámok mediánértékében a kontrollokhoz képest.

A 18. ábrán látható, hogy az 1-es peptid elleni ellenanyagok és a 4-es peptid elleni ellenanyagok képesek voltak a májmetasztázis-tumortömegek számtani középértékeinek és mediánértékeinek csökkentésére is a kontroll állatokban tapasztalt értékekhez képest. A 19. ábrán bemutatott eredmények szerint, CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagokkal kezelt egerekben szignifikánsan csökkent a májtumorok keresztmetszeti területének számtani középértéke és mediánértéke is a kontroll állatokhoz képest.

- 45 - .: ·’*· ·’’* ·*,·: : ··· »· ·«· ··· · ··

Eredményeink szerint, a CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok hatékonyan korlátozzák egy gasztrindependens kolonkarcinóma terjedését és növekedését a májban, amely szerv a fenti karcinóma metasztatikus terjedésének fő helye.

9. példa

Ezeket a vizsgálatokat annak igazolására végeztük, hogy GRPl-immunreaktivitás van jelen C170HM2-sejteken. A vizsgálattal GRP1 ellen termelt antiszérum tumorlokalizációját kívántuk értékelni, valamint annak terápiás hatását kívántuk megállapítani C170HM2-sejtek szaporodására, nude-egerek májában. C170HM2-sejteket injektáltunk intraperitoneálisan nude-egerekbe, a 7. példában ismertetettek szerint. GRP1-antiszérumot nyulakban termeltettünk. Az antiszérumot ¹²⁵I-dal jelöltük, és olyan nude-egereknek adtuk be, amelyekben C170HM2-xenograftokat hoztunk létre a farokvénán keresztül végzett injektálással. Kontroll egereknek csak ^lz5I-dal radiokatívan jelölt normál nyúlszérumot adtunk be. Egereket, egyetlen ¹²⁵I-ellenanyagdózis beadásnak időpontjához képest egyre távolabbi időpontokban leöltünk. A radioaktivitást percenkénti beütésszámként (’counts per minute CPM) határoztuk meg, egy gramm szövetre vonatkoztatva (CPM/g), és kiszámítottuk a máj/májtumor arányt.

A 20. ábrán látható grafikon radioaktívan jelölt, nyúlban előállított GRP1 elleni ellenanyagok kötődését mutatja máj tumorokhoz, a kontrollokhoz viszonyítva. Amint az ábrán látszik, nagyobb mennyiségű, nyúlban termelt GRP1 el- 46 leni ellenanyag kötődött a máj tumorszövethez, mint a kontroll szövetekhez. A 20. ábra mutatja továbbá a májtumor/máj arányt az y-tengelyen, míg az x-tengelyen az eltelt időt jelöltük, mind az izotóppal jelölt normál nyúlszérum, mind a GRP1 elleni antiszérum esetében. A normál nyúlszérum az első naptól fogva 1:1 arányt mutatott, ami így maradt az ötödik napig. Ez arra utal, hogy a radioaktivitás szintje a máj tumorban és a normál májban egyforma volt. A GRP1 elleni antiszérum esetében az arány exponenciálisan növekedett, az 5. napra megközelítette a 2-es értéket. Ez arra utal, hogy az izotóppal jelölt, GRP1 elleni antiszérum specifikusan a C17 0HM2-májtumorokba lokalizálódik.

10. példa

A GRP1 elleni antiszérum terápiás hatása C170HM2xenograftokra

C170HM2-tumorxenograftok megeredését váltottuk ki tumorsejtek intraperitoneális befecskendezésével. Három különböző sejtszámot adtunk be, amely három különböző szintű tumorterhelést jelentett. A GRP1 elleni antiszérumot passzív módon alkalmaztuk, naponta farokvénába fecskendeztük, a 0. naptól kezdve. A kezelést a 40. napon fejeztük be.

A GRP1 elleni antiszérum hatása a tumor terjedésének mértékére (take rate)

Kezdeti paraméterként a májban kialakuló átlagos tumorszámot értékeltük, ezt a 21. ábra mutatja. A normál nyúlszérummal kezelt kontroll egereket növekvő sejtinokulum

- 47 szerint csoportosítottuk. Amint a 21. ábra mutatja, a kontroll csoportban, a májban talált tumorok számának számtani középértéke 1 és 3 között volt. A GRP1 elleni antiszérummal kezelt csoportban a májanként észlelt tumorok számának számtani középértéke kevesebb volt egynél, mindhárom sejtdózis esetében, ami mindhárom vizsgálat esetében szignifikánsnak bizonyult (egy inokulum, n=18, p=0,003; 2 inokulum, n=12, p=0,0001 és 3 inokulum, n=20, p=0,0068, Mann Whitney analízis)

A GRP1 elleni antiszérum hatása megeredt tumorok tömegére

A 22. ábra bal oldalon a normál nyúlszérummal kezelt kontroll egerek tumortömegének számtani középértékét mutatja a három, növekvő sejtdózis mellett. Az ábra mutatja továbbá nude-egerek tumortömegének számtani középértékét GRP1 elleni antiszérummal történt kezelést követően. A tumortömegek számtani középértéke mindhárom sejtdózis esetében 60%-kal csökkent, és ez mindhárom vizsgálatban szignifikánsnak bizonyult (egy inokulum, p=0,0016; 2 inokulum, p=0,0084 és 3 inokulum, p=0,0001, Mann Whitney analízis).

A GRP1 elleni antiszérum immunreaktivitásának kimutatása C170HM2-xenograftokban Western-blot vizsgálattal

Extranukleáris membránfehérjéket állítottunk elő - a 2/3 kísérletekből származó - C170HM2-xenograftokból. Ezeket Western-blot eljárással vizsgáltuk, a GRP1 elleni antiszérum alkalmazásával. A 23. ábán Western-blot vizsgálat fényképe látható, amely a normál nyúlszérummal kezelt xenograftok esetében két immunreaktív csíkot mutat, 74 és 50 kDa molekulatömegnél, az előbbi mutatja a legerősebb re

- 48 aktivitást. A GRP1 elleni antiszérummal kezelt xenograftok esetében a két immunreaktív csík mellett egy közbülső csík is látszik, amely nem mutatható ki a kontroll xenograftkészítményben, vagy az in vitro tenyésztett sejtekben. Itt az 50 kDa csík mutatja a legerősebb immunreaktivitást. Ez arra utal, hogy a GRP1 elleni antiszérummal kezelt xenograftokban a CCK-B/gasztrin-receptorok nagyobb hányada van jelen internalizált formában.

C170HM2-xenograftok szövettani vizsgálata

A 24. ábra nude-egér máját megtámadó C170HM2xenograft mikroszkópos képét mutatja. A tumor általában nekrotikus középpontból áll, amelyet élő terjedő szél határol, amely terjedése során roncsolja a hepatocitákat a májban. Az apoptózis mértékét a C170HM2 tumorok élő, terjedő szélében mértük, Tűnél eljárással, a pozitív sejteket in situ hibridizálással tettük láthatóvá. A 25. ábra azt mutatja, hogy apoptózist mutató sejteket észleltünk a GRP1 elleni antiszérummal kezelt xenograftok élő hmorsejtjeiben, míg a normál nyúlszérummal kezelt sejtekben ilyet nem észleltünk.

Az adatok azt mutatják, hogy a CCK-B/gasztrinreceptor amino-terminális epitópja ellen termelt antiszérum szelektív módon lokalizálódik a máj invazív C170HM2tumorokban. A GRPl-epitópok neutralizálása szignifikánsan befolyásolta mind a tumorok terjedésének (szóródásának) mértékét {take rate}, mind a megeredt tumorok össztömegét. Ezt a tumorgátló hatást (a) a CCK-B/gasztrinreceptor blokkolásával indukált általános citosztatikus ha- 49 -

tásnak tulajdonítjuk, és/vagy (b) a tumorsejt magját megcélzó ellenanyag indirekt hatásának, amely feltehetően apoptózist eredményez.

- 50 HIVATKOZÁSOK

1. Bock, M.G., DiPardio, KM., Evans, B.E., Rittle, K.E., Whitter, A., Veber, D, Anderson, E., and Freidinger, A. Benzodiazepine, gastrin and brain cholecystokinin receptor ligands: L-365,260. J. Med. Chem., 32:13-17, 1989.

2. Curtis, B.M., Widmer, M.B., de Roos, P., Qwamstrom, E.E. IL-1 and its receptor are translocated to the nucleus. J. Immunol. 1990; 144:1295-1303.

3. Dickinson C.J. Relationship of gastrin processing to colon cancer (editorial). Gastroenterology 1995; 109:1384-1388.

4. Edkins, J.S.. On the chemical mechanism of gastric secretion. Proc. Soc. Lond. 1905; 76:376.

5. Fourmy, D., Zahidi, A, Pradayrol, I., Vay ssette, J., Ribet, A. Relationship of CCK/gastrin-receptor binding to amylase release in dog pancreatic acini. Regül. Pept. 1984; 10:57-68.

6. Grider, J.R., Malchlouf, G.M. Distinct receptors for cholecystokinin and gastrin on muscle cells of stomach and gallbladder. Am. J. Physiol. 1990; 259:G184-G190.

7. Harrison’s Principles of Internal Medicine, Isselbacher et al. Eds. 13^Λ Ed. Pages

1690-1691, 1994.

8. Holt, S.J., Alexander, Ρ.» Inman, C., Davies, D. Epidermal growth factor induced tyrosine phosphorylating of nuclear protons associated with translocation of epidermal growth factor receptor into the nucleus. Biochem. Phann. 1994; 43:117126.

9. Hughes, J., Boden, P., Costall, B., Domeney, A., Kelly, E., Horwell, D.C., Hunter, J.C., Pinnock, R.D., and Woodruff, G.N. Development of a class of selective

- si - ·; ; :

*· · · · ·♦♦ *** · ·* cholecystokinin type B receptor antagonists having potent anxiolytic activity. Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 6728-6732, 1990.

10. Johnson L. New aspects of the trophic actin of gastrointestinal hormones. Gastroenterology 1997; 72:788-792.

11. Kopin, A.S., Lee, Y.M., McBride, E.W., Miller, L.J., Lu, M., T in, Η.Y., Kolakowski, L.F., Beinbom, M. Expression cloning and characterization of the canine parietal cell gastrin-receptor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1992; 89:36053609.

12. Laudron P.M. From receptor internalization to nuclear translocation: new targets for long-term pharmacology. Biochem. Pharm. 1994; 47:3-13.

13. Le Meuth, V., Philouz-Rome, V., LeHuerou-Luron, L., Formal, M., Vaysse, N., Gespach, C., Guilloteau, P., Fourmy, D. Diffemtial expression of A- and Bsubtypes of cholecystokinin/gastrin-receptors in the developing calf pancreas. Endocrinology 1993; 133:1182-1191.

14. Matsumoto, M., Park, J., Yamada, T. Gastrin-receptor characterization: affinity cross-linking of the gastrin-receptor on canine gastric parietal cells. Am. J. Physiol. 1987; 252:G143-147.

15. Nakata, H., Matsui, T., Ito, M., Taniguchi, T., Naribayashi, Y., Arima, N., Nakamura, A., Kinoshita, Y., Chihara, K., Hosoda, S., Chiba, T. Cloning and characterization of gastrin-receptor from ECL carcinoid tumor of Mastomys natalensis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992; 187:1151-1157.

16. Narayan, S., Chicone, L., Singh, P. Characterization of gastrin binding to colonic mucosal membranes of guinea pigs. Mol. Cell. Biochem. 1992; 112:163-171.

- 52 -r

17. Painaes, Hansen C., Stadil, F.. Rehfeld, J.F. Metabolism and influence of glycineextended gastrin on gastric acid secretion in man. Digestion 1996; 57:22-29.

18. Podlecki, D.A., Smith. R.M., Kao, M., Tsai, P., Huecksteadt, T., Brandenburg, D., Lasher, R.S., Jarett, L., Olefsky, J.M. Nuclear translocation of the insulin receptor. J. Biol. Chem. 1987; 262:3362-3368.

19. Rehfeld, J.F., Bardram, L., Hilsted, L. Gastrin in human bronchogenic carcinomas: constant expression but variable processing of prograstrin. Cancer Res. 1989; 49:2840-2843.

20. Romani, R., Howes, L.G., and Morris, D.L. Potent new family of gastrin-receptor antagonists (GRAs) produces in vitro and in vivo inhibition of human colorectal cancer cell lines. Procs. AACR, 35: 397 (Abstract), 1994.

21. Scemma, J.L., Fourmy, A., Zahidi, L., Praydayrol, L., Susini, C., Ribet, A. Characterization of gastrin-receptors on a rat pancreatic acinar cell line (AR4-2J). A possible model for studying gastrin mediated cell growth and proliferation. Gut 1987; 28:233-236.

22. Seva, C., Dickinson, C.J., Yamada, T. Growth-promoting effects of glycineextended prograstrin. Science 1994; 265:410-412.

23. Singh, P., Owlia, A, Espeijo, R., Dai, B. Novel gastrin-receptors mediate mitogenic effects of gastrin and processing intermediates of gastrin on Swiss 3T3 fibroblasts. Absence of detectable cholecystokinin (CCK)-A and CCK-B receptors. J. Biol. Chem. 1995; 270:8429-8438.

24. Singh, P., Townsend, Jr. C.M., Thompson, J.C., Narayan, S., Guo, Y.S. Hormones in colon cancer: past and prospective studies. Cancer J. 1990; 3:28-33.

25. Sall, A.H., Amiran, L.P., Thomas, T„ Reedy, T.J., Elashoff, J.D. Gastrinreceptors on isolated canine parietal cells. J. Clin. Invet. 1984; 73:1434-1447.

26. Taniguchi, T„ Matsui, T., Ito, M., Marayama, T., Tsukamota, T., Katakami, Y„ Chiba, T., Chihara, K. Cholecystokinin-B/gastrin-receptor signaling pathway involve styrosine phosphorylatins ofpl25FAK and p42MAP. Oncogene 1994; 9:861-867.

27. Todisco, A., Takeuchi, Y„ Seva, C., Dickinson, C.J., Yamada, T. Gastrin and glycine-extended progastrin processing intermediates induce different programs of _e early gene activation. J. Biol. Chem. 1995; 279:28337-28341.

28. Ulrich, A., Schlessinger, J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell 1990;61:203-212.

29. Wank, S.A. Cholecystokinin receptors (editorial). Am. J. Physiol. 1995; 269:G628-G646.

30. Wank, S.A, Pisegna, J.R., de Weerth, A. Brain and gastrointestinal cholecystokinin receptor family: structure and functional expression. Proc. Nat. Acad. Sd. USA 1992; 89:8691-8695.

Watson, S.A., Durrant, L.G., Crosbie, J.D, Morris D.L. The in vitro growth response of primary human colorectal and gastric cancer cells to gastrin. Int J. Cancer 1989; 43:692-696.

32. Watson, S.A., Durrant, L.G., Elston, P., and Morris D.L. Inhibitory effects of the gastrin-receptor antagonist (L-365,260) on gastrointestinal tumor cells Cancer,

33. Watson, S.A., Steele, R. Gastrin-receptors on gastrointestinal tumor cells. In: Gastrin-receptors inGI Tumors. R.G. Landes Co., Austin TX:CRC 1993 p. 20-

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: HOSSZA: 17 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: nem releváns TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid HIPOTETIKUS: nem ANTISZENSZ: nem FRAGMENSTÍPUS: N-terminális AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Lys Len Asn Arg Ser Val Gin Gly Thr Gly Pro Gly Pro Gly Alá Ser 15 10 15

Leu

A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 15 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid HIPOTETIKUS: nem FRAGMENSTíPUS: terminális

A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly Pro Gly Ala His Arg Alá Leu Ser Gly Ala Pro He Ser Phe 1 5 10 15

- 55 A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 7 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys

-

Claims (26)

1. -

   SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Immunogén, amely immunogén tulajdonságú hordozóhoz konjugált, CCK-B/gasztrin-receptor-eredetű peptidet tartalmaz .
2. 2. Az 1. igénypont szerinti immunogén, amely KLNRSVQGTGPGPGASL (a szekvencialistában az 1. azonosítószámú szekvencia) vagy GPGAHRALSGAPISF (a szekvencialistában a 2. azonosítószámú szekvencia) aminosavszekvenciájú peptidet tartalmaz.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti immunogén, amely távtartó peptidszekvenciát is tartalmaz.
4. 4. A3, igénypont szerinti immunogén, amely távtartó peptidszekvenciaként SSPPPPC szekvenciájú (a szekvencialistában a 3. azonosítószámú szekvencia) távtartó peptidszekvenciát tartalmaz.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti immunogén, amp! y immunogén hordozóként diftériatoxoidot, tetanusztoxoidot vagy szarvasmarha-eredetű szérumalbumint tartalmaz.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti immunogén alkalmazása, ahol immunogénként CCK-B/gasztrin-receptor elleni immunogén hatásos mennyiségét adjuk be.
7. 7. A 6. igénypont szerinti immunogén alkalmazása, amely immunogén CCK-B/gasztrin-receptor-eredetű peptidet tartalmaz.
8. 8. A 7. igénypont szerinti immunogén alkalmazása, amely immunogén KLNRSVQGTGPGPGASL (a szekvencialistában az

   1. azonosítószámú szekvencia) vagy GPGAHRALSGAPISF (a

   - ⁵⁷ - j :

   szekvencialistában a 2. azonosítószámú szekvencia) aminosav-szekvenciájú peptidet tartalmaz.
9. 9. A 8. igénypont szerinti immunogén alkalmazása, amely immunogén távtartó peptidszekvenciát is tartalmaz.
10. 10. A 9. igénypont szerinti immunogén alkalmazása, amely immunogén SSPPPPC szekvenciájú (a szekvencialistában a 3. azonosítószámú szekvencia) távtartó peptidszekvenciát tartalmaz.
11. 11. A 10. igénypont szerinti immunogén alkalmazása, amely egy immunogén hordozót is tartalmaz, amely diftériatoxoid, tetanusztoxoid vagy szarvasmarha-eredetű szérumalbumin.
12. 12. CCK-B/gasztrin-receptor elleni, a tumorsejteken található CCK-B/gasztrin-receptorokat felismerő, és azokhoz kötődő ellenanyagok hatásos mennyiségének alkalmazása, amely alkalmazás szerint az ellenanyagokat ilyen kezelésre szoruló állatnak adjuk be.
13. 13. A 12. igénypont szerinti ellenanyagok alkalmazása, amelyek kiméra, monoklonális vagy humanizált ellenanyagok.
14. 14. A 12. igénypont szerinti ellenanyagok alkalmazása, amely CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok felismerik a receptor KLNRSVQGTGPGPGASL (1. azonosítószámú szekvencia) vagy GPGAHRALSGAPISF (2. azonosítószámú szekvencia) aminosav-szekvenciáját, és ahhoz kötődnek.
15. 15. A 12. vagy 14. igénypont szerinti ellenanyagok alkalmazása, amely ellenanyagok citotoxikus molekulához vannak konjugálva.
16. 16. A 15. igénypont szerinti ellenanyagok alkalmazása, amelyek citotoxikus molekulaként toxinhoz vagy radioaktív molekulához vannak konjugálva.
17. 17. A 16. igénypont szerinti ellenanyagok alkalmazása, amelyek toxinként koleratoxinhoz vannak konjugálva.
18. 18. A 16. igénypont szerinti ellenanyagok alkalmazása, amelyek ¹²⁵i- vagy ¹³¹I-radionukliddal jelölt radioaktív molekulához vannak konjugálva.
19. 19. A 12. vagy 14. igénypont szerinti ellenanyagok alkalmazása CCK-B/gasztrin-receptorokat tartalmazó, gasztrinra reagáló tumor kimutatására, amely szerint gasztrin-receptor elleni ellenanyagot tumorbiopsziás mintából izolált sejtekkel reagáltatunk, és a mintában kimutatjuk a CCK-B/gasztrin-receptor jelenlétét.
20. 20. A 19. igénypont szerinti ellenanyagok alkalmazása, amely gasztrinreceptor elleni ellenanyagok egy, a CCKB/gasztrin-receptor amino-terminális végén található peptidre specifikusak.
21. 21. A 20. igénypont szerinti ellenanyagok alkalmazása, amelyek a CCK-B/gasztrin-receptor amino-terminális régiójában található, 5-21. aminosavaknak megfelelő peptidre specifikusak.
22. 22. Immunogén készítmény, amely CCK-B/gasztrinreceptor elleni immunogént tartalmaz.
23. 23. A 22. igénypont szerinti készítmény, amely immunogénként a CCK-B/gasztrinreceptorból származó pepiidet tartalmaz.
24. 24. Készítmény, amely CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagot, valamint gyógyászatban elfogadott hordozót tartalmaz.
25. 25. A 12. igénypont szerinti, CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok alkalmazása gasztrindependens tumorok diagnosztizálására, amely szerint kolorektális tumort hordozó páciensnek izotóppal jelölt, CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagokat adunk be, majd a tumorról szcintigráfiás pásztázással képet alkotunk.
26. 26. A 25. igénypont szerinti CCK-B/gasztrin-receptor elleni ellenanyagok alkalmazása, amely CCK-B/gasztrinreceptor elleni ellenanyagok ⁱⁿIndium- vagy ⁹⁰Yttriumradionukliddal vannak jelölve.

    A meghatalmazott:

    Danubia

    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

    Svingor Ádám