HU228821B1 - Cosmetic composition containing a compound with activity stimulating interleukin-6 - Google Patents

Description

(57) Kivonat

A találmány egy olyan kozmetikai készítményre vonatkozik, amely legalább egy, a keratinociták IL-6 termelését stimuláló aktivitással rendelkező vegyületet tartalmaz kozmetikai készítményeknél használatos segédanyaggal keverve.

··'* »♦** »♦ · • * » ·. ♦ »*· ** • * » « ♦ ·» « * ♦ *» ♦ »»« ♦ »«♦

A jelen találmány tárgya egy olyan aktív vegyületet tartalmazó kozmetikai készítmény, amely a humán keratinociták infetleukm-6 (IL-6) termelését íw viw stimulálni képes,

A kozmetikai felhasználás szempontjából a sejtek által termelt számos citokin közül az ÍL6 szintézisének specifikus stímuíálása bír különös jelentőséggel. A celluláris és Immorális immunitásra gyakorolt aktiváló hatások mellett az IL--6 aktív szerepet játszik az epidermisz regenerációjának mechanizmusában. Jn νότο, az IL-ó stimulálja a kollagén szintézist, valamint a keratinociták és a fíbroblaszt pro! iterációi ár. 7n vivő, IL-ő-ot a bőrben fokozottan termelő transzgén. egerekben a szaruréteg megvastagodása figyelhető meg. Az epidermisz felszíni rétegének ez a megnövekedése gyulladáskeltés nélkül következik be, és a vélemények szerint a bőr lokális sérülésekkel szembeni védekező készségének javulását tükrözi. Ezek a szakirodalomból eredő adatok azt matatják, hogy az IL-6 elősegíti az epidermiszen okozott sérülés kijavítását és lassítja .a bőr öregedését,

A következőkre hivatkozhatunk: K. Yoshisaki ei α/., Cytokine, 1990 2, 381-387; R.M. Grossman et no, Proc. Natl. Aead. Sci. USA, 1989, öő, 6367-63 7T; Klrhaner et η/.., I. immunok, 1989, 742, 1922-1928; K. Torken fe to., Proc. Natl. Aead, Sci. USA, 1992, 69, 5068-5072; I. Tavi or-Papad ime trión fe tol, Coll. Difién, 1982, 77, 169-180; L. Aarden fe fo., tymphokmes, 1985, /9, 175-182. Ismeretes, hogy a bőr öregedésekor először is megvastagodik az epidermiszben a szaruréteg, ugyanakkor csökken az epiderrnopolesls és módosul a celluláris kohézió a hazáits membránnál. Azért, hogy segítsük a bőr öregedés elleni harcát, fontos, hogy olyan aktív hatóanyagot biztosítsunk számára, amely képes a keratinociták prohferáciőját stimulálni, és így az epidermisz megvastagodásút elősegíteni. Másodszor, a dernüszben azon sejtek, amelyek a bőr szerkezetének létrehozásáért felelősek, tehát a fíbroblasztok aktivitása erősen lecsökken, aminek következménye a kollagén-, elasztin- és giűkőzammogkkán-szimézis csökkenése. Ezzel párhuzamosan fény hatására a meglévő hörrostok lebomlása felgyorsul (fotokémiai öregedés). Ezek a hatások együttesen dezorgamzált bőrszerkezethez vezetnek, amely megfosztja a bőrt olyan mechanikai tulajdonságaitól, mint a rugalmasság, tömöttség, feszesség, és igy elősegíti a ráncok megjelenését.

Az öregedés hutásainak kivédése végett fontos a bőr ellátása egy olyan aktív anyaggal, amely stimulálja a fíbrobiasztokat és elősegíti a környezetük helyreállítását. A használhatósághoz szükséges, hogy ezt a hatást ne kísérje párhuzamosan a rostok degradáciös enzimjeinek, különösen a koHagenázpak az aktivstásnövekedése, és a bőr természetes funkciói se módosuljanak.

Azt találták, hogy a humán. kemimoeiíák It~ó termelését m vívó stimulálni képes komponensek vagy extraktumok kozmetikai készítményekben. alkalmazható „aktív ágenseket” képeznek; pontosabban észrevették, hogy a humán keratinoeiták 1I..-6 termelését ín vöm stimulálni képes vegyületet tartalmazó kozmetikai készítmények felhasználhatók a bőr szövetének átalakítására anélkül, hogy annak természetes funkcióit megzavarnák. A humán keratínocitákon az. IL-ő-ra stimuláló hatású,, a továbbiakban „aktív ágensnek” [laeunaj Is nevezett vegyöletekrő.l kimutatták, hogy képesek a keratinocita proliferácio stimulálására önmagukban (az.IL-ó-nak a keratinoeitákra kifejtett autokrin hatása, amint azt a szakirodalom ís leírja).

Kimutatták továbbá, hogy a humán keratínocitákon 1 L-6-οί stimuláló vegyületek képesek a. fíbroblasztra gyakorolt hatás révén e sejt dermálís· környezetének tónusát növelni. Ezek a vegyületek még: a kollagén rostok számának kismértékű növekedését is indukálják, anélkül, hogy a kollagenáz aktivitását növelnék.

Így a. jelen találmány első tárgya egy olyan kozmetikai készítmény, amely a humán keratinoeiták interleukin-6 termelését X vívó stimulálni képes vegyületet tartalmaz kozmetikai segédanyaggal keverve.

A kozmetikai készítményben lévő, IL-6 termelést stimuláló vegyület, vagyis az „aktív ágens” lehet egy nem peptid vegyület, egy peptid, növényi eredetű sejtek vagy szövetek extraktuma vagy egy mikroorganizmus (például baktérium vagy gomba, pontosabban: élesztő) fermentációjával nyert termék.

A továbbiakban az SEBR 2002 törzs sajátosságait lógjuk leírni, a keratinoeiták Interieukin6 termelését stimuláló hatású extraktum kinyerésének módszerével együtt.

Törzs felfedezés

A jelen találmány szempontjából az az organizmus, amelyből a humán keratinoeiták. Í1..-6 termelését stimuláló extraktumok kinyerhetők voltak, egy élesztőgomba-törzs; a törzset egy Loíret-i (Franciaország) olajmező vízmintájából izoláltuk, és az SEBR 2002 nemzetközi számmal jelöltök. A mikroorganizmus mintáját 1997. február 11-én letétbe helyeztük a Pasteur Intézet C.N.C.M.-nél, ahol az! 1844 hivatkozási számon regisztrálták..

V * ♦«/

A mikroorganizmus biokémiai tulajdonságait a cukrokra jellemző API 5Ö CH rendszereken határoztuk meg (forgalmazó: BiöMérleux), élesztőgombákra specifikus YT biológiai teszttel (forgalmazó' öioíog Inc. CSA). A meghatározás szerint ez a mikroorganizmus a &?sü/fowuc?ex családhoz. a ftfodotaru/a törzshöz tartozik.

Ez egy polimorf, mezőül élesztőgomba. 28 C°-os hőmérsékleten, YPG (elesztö-pepionglükóz-agar) tenyésztő médiumon növekszik jól; a telepek narancssárgás: rózsaszínűek.

Ez a szervezet olyan tulajdonságokat mutat, amelyek alapján a. Minuía fejhoz sorolható.

A Pasteur Intézet C.N.C.M..-nél az I 1844 szám alatt letétbe helyezett AAoíferornfe sp élesztőgomba törzs és termelő mutánsai képezik a jelen találmány tárgyát.

Az új törzs izolálása a szokásos módszerrel történt, amely abból ált hogy vízmintából kis mennyiséget különböző koncentrációkra hígítunk és mindegyik hígításból egy keveset Peírícsészében lévő agar táptalaj felületére szélesztűnk, Néhány napos, 28 €°-on történő inkubáció után, aminek során a mikroorganizmus kifejlődik, a különböző telepeket egyedileg megmintázzuk és tovább tenyésztjük tápagaroa, hogy nagyobb mennyiségű kultúrát nyerjünk.

Agar táptalajon végzett kitenyésztést és több egymás utáni továbhtenyésztést kővetően, amelyek során a kérdéses törzs kultúrája nagy mennyiségben és tisztán nyerhető ki, a törzstenyészet egy fönntartó nulladik sarzsát, majd első és második generációs sarasokat állítunk elő.

Ehhez a Petri-csészében, agar táptalajon nyert tenyészetből kiindulva, regeneráló táptalaj fölhasználásával élesztőgomba szuszpenziót készítünk: ez a táptalaj védőanyagot tartalmaz a hideg ellen, igy a mikroorganizmusnak jó életképességet biztosit a lefogy asztással történő konzerválás során.

A kapott élesztőgomba szüszpenzíöt fegyasztócsövekbe szétosztva, -80 C’-os tároljak: ezek a csövek képezik a nulladik sarzsot

Ugyanezen protokollt köveivé, de a nulladik sarzsbol kiindulva készítjük az első generácl ős sarzsot.

Majd, ugyanezen protokollnak megfelelően, az első generációs sarzsot tartalmazó fegyasztócsőből kiindulva készül a második, generációs sarzs.

A nulladik, első és második generációs sarzs előállítása biztosítja a törzs és igy a kívánt aktivitás hosszú ideig tartó hozzáförbetőségét.

* -ί

Módszer

A humán keratinociták IL-6 termelését stimuláló extrafctumok készítésének módszere az áj I 1844 törzsnek vagy termelő- mutánsainak táptalajon, megfelelő körülmények között történő tenyésztésén, majd az aktív frakció kíextrahálásán alapszik.

Az aktív frakció a biomasszában vagy a felölószóban lehet.

Fermentáció

Az 1 1S44 törzs tenyésztése valamilyen aeroh módszerrel történhet. E célra a fermentációs iparban általánosan alkalmazott különféle típusú gépek használatosak. A következő megoldás különösen alkalmas az eljárás végrehajtásához.

Lom b iktény esze i

Második generációs sarzsot felhasználva, leoltást végzünk Fetri-cs-észékbe, amelyekből 2-3 napos- inkubáció után élesztőgomba-szuszpeuziőt nyerünk, ezt kevert Erlenmeyeriombikokban lévő megfelelő médiumba oltjuk. A kevert lombik közvetlenül is beoltható egy oltó sarzs csövével. A kevertlombák-tenyésztés 1-3 napig tarthat.

A szűréssel vagy centriíhgálással kapott, biomasszát szerves oldószerrel extrahálva megfigyelhető az aktivitás létrejötte.

Rögtön a lombikokban folyó tenyésztés első lépésétől előnyős lehet két egymást követő tenyésztési lépés elvégzése: az első lépés a sejtek szaporítására és a biomassza mennyiségének növelésére, a második a termelésre szolgái. Ez utóbbi esetben 1-2 napos Időtartam elegendő az első lépésre.

A tenyészetek biomassza-extraktumaiban lévő. a humán keratinociták IL~6 -termelését stimuláló aktivitást az SI-i-s (Si)-vel jelölt stimulác-iós Index, vagy faktor fejezi ki. amely az extraktummal. történő Indukáiással termeit IL-6 mennyiség és a mért (nem indukált) alapérték hányadosa:

Indukált IL-6 termelés Shí,c ^:::: .........................................................

Alap IL-ő termelés *♦* 4 >« fc extraktumra

Egy biomassza-extraktumot akkor tekintünk aktívnak, ha a száraz vonatkoztatott 1. ezrelékes végkoocentráeíónál vizsgálva, SVK. Í4 keratinoeitán 1,2 és 6 (lehetőleg 1,5 és 4,5) közötti Sí érteket eredményez.

Egy liter tenyészetből körülbelül 10-50· ml extraktum nyerhető, amelynek síimuláclós indexe 1,5 és 4,5 között van löö-szoros hígításnál (1/100).

A kívánt aktivitás a lombiktenyészet biomasszájának extrahálásával. nyerhető, de ahhoz, hogy a kívánt aktivitás nagyobb mennyiségben, legyen kinyerhető, előnyösnek tűnik iermemortenyészetet készíteni, majd annak biomasszáját extrah.áln.1.

FermíUííozfönyAzeí

A ferraenton 1-2 napos kevertlombik-tsnyészettei. oltjuk be; előnyös , ha a tenyészet még az exponenciális fázisban van.

A fermentorban az alkalmazott tenyésztési körülményektől függően az aktivitás rögtön a tenyésztés első óráitól megfigyelhető, de előnyős· megvárni a stacionárius növekedési fázis elérését, mielőtt az extrakeiót végrehajtanánk. Áz 1 1 S44 fennentoros tenyésztésével az alább leirt tenyésztési körülmények, például a pH és a levegőztetés jobban ellenőrizhetők.

A fermentorban nyert keradnecifa siimulációs aktivitás változhat az alkalmazott tenyésztési feltételektől függően. Egy liter tenyészetből a biomassza exfrakclöja után mintegy 50 ml extraktum nyerhető 1,5 és 4,5 közötti Sl értékkel 100-szoros hígításnál (1/100).

rrmjAz/Asi/b/fe/efek

Á .fermentációs eljárásnál alkalmazott tenyésztő médiámnak legalább egy asszimilálható szénforrást és egy asszimilálható nitrogénfotrásó valamint ásványi elemeket kell tartalmaznia. Asszimilálható szénforrásként szolgálhatnak például a szénhidrátok, mim a glükóz, matmóz, maitőz, a dextrinek, a gHcerol, az aminosavak és a fehérjék,

Asszimilálható széníorrásként alkalmazható még az eceísav, parafasav, eítromsav, propionsav, borostyánkősav és a 2-ketogiutársav, illetve az állati vagy növényi olajok.

Az asszimilálható· nitrogén legjobb forrásai a fehérjék, peptonok és az aminosavak. Ezek közé tartozik például a kazein, a Iaktalbumln, a glutén. és ezek hidrokzátumal, valamint a. halliszt, az élesztőextraktumok és a peptonok.

»9 * «

* « *♦·♦ «.« •ί ‘“ί:

• . · · ♦

*. ♦»*

A biomassza termelése növelhető, to a tenyésztés alatt e két fő szubsztrátum egyikét vagy másikát hozzáadjuk a kultúrához,

A mikroorganizmus növekedésének biztosítása és sejtjeiben a szén- és nitrogénforrások asszimilációjának optimalizálása végett a tenyésztő médiumhoz adott ásványi elemek között megemlithetők a kálium-, nátrium-, vas-, magnézium-, kalcium- vagy mangánsók és a foszforvegyületek, például a foszfátok, valamint a nyomelemek.

A tenyészetet a kedvező eredmények elérése érdekében lö és 60 óra között változó időtartamon keresztül kell bevehetni és levegőztetni.

A tenyésztő közeg pH-ja lehetőség szerint enyhén savas értéken legyen; az optimális inkubációs hőmérséklet '23 és 38 C° között van, a legkedvezőbb a 25-33 C *-os tartomány.

A tenyésztés körülményei, igy a médium összetétele és pH-ja, az inkubációs hőmérséklet, a keverés sebessége és a fermentáeiő levegőztetése széles határok között változhat, úgy keli megválasztani ezeket, hogy a lehető legjobb eredmények legyenek elérhetők.

A keratinociták 11,-6 termelését stimuláló aktív extraktum előállítása több extrakciós lépest igényel.

Az első lépés a biomassza elválasztása a fermentlé többi részétől; e célra használható a eeutritugásás, a tangeneiáks míkroklírálás, a forgódobos szűrés, vagy bármi más szokásos módszer, amit a biomassza és fermentlé elválasztási, technikájában járatos szentélyek, általában alkalmaznak. Ezután a biomasszát néhány órán át oldószerkeverékkel tartják érintkezésben, anti lehetővé teszi a hidrofob természetű molekulák kivonását.

Legkedvezőbb, ha az érintkeztetés egy éjszakán keresztül, azaz mintegy 15 órán át tart.

Ezután a biomasszát és a szerves fázist frontális szűréssel elválasztjuk és a biomasszát eldobjuk.

Végül a szerves fázist vákuumban, szobahőmérséklet és 50 C* közötti hőmérsékleten szárazra pároljuk,

Αχ úszó' em/zuátum el&dlldésa

A kapott száraz extraktum a kozmetikai iparban szokásos különféle oldószerekben oldható fél.

A felvételi koncentrációt úgy kell megválasztani, hogy az lehetővé tegye az extraktum teljes feloldódását és megfeleljen a későbbi felhasználásnak.

* ♦· < * κ * χ χ ν

Á keratinoeiták í.L-6 termelését stimuláló extraktumot a találmánynak megfelelő oldószerbe, 50/50 (v/v) -etannl/viz elegybe- visszük be az aktivitásnak megfelelően 5-10 %-os arányban a száraz, extraktmnra számítva. 'Ha oldat helyett -port kívánunk előállítani, ágy az extraktumot egyszerűen líofiiizáljuk,

A keratinoeiták JL-6 termelését stimuláló aktivitást a kapott extraktumok aliqoot mennyiségeiben határozzuk meg; ez lehetővé teszi, az aktivitás értékelését és a módszer reprodukál hatóságának igazol ását.

A maradék biomassza-nyomok eltávolítása és a mikrobiológiai stabilitás biztosítása érdekében az extraktumot egy 0,2 pm visszatartásű membránon. szűrjük át és aszeptikus körülmények között. steril lombikokba osztjuk szét. Ezen oldatok aszeptikus készítésével elkerülhető a konzerválószer hozzáadása. Különböző biokémiai vizsgálatok révén lehetővé vált annak demonstrálása,, hogy az új I 1844 mikroorganizmusból nyert extraktumok nagyon értékes, a keratinoeiták It-6 termelését stimulálő aktivitással rendelkeznek. Az erőteljes aktivitásukat demonstráló sokféle vizsgálat azt jósolja, hogy az extraktumok képesek az epidermisz különböző károsodásainak kijavítására és a bőr öregedésének lassítására.

Az 1 1844 extraktumának a humán keratinoeiták Ϊ1.--6 szintézisére gyakorolt b; vűro stimulációs hatását az alábbiak szerint jellemezzük, í 844 extraktum és az alkalmazott termékek

Azonos körülmények között tenyésztett különböző térmentor kultúrákból nyert 1 1844 extraktumok mintáit használtuk. A mintákat 4 C^ö-on, 50/50 (v/v) etanol/víz keverékben tartottuk, 0/1 g/g száraz extrákban koncentrációban, majd a felhasználáskor hígítottuk a kívánt végkoneentrációra.

IL-6 szintézist indukáló referencia termék, az LPS (// co/i 055:B5), Sigma volt. amelyet 20 C°-on, 10 mg/rnl 'koncentrációban, PBS-ben tároltunk. Az LPS inhibitorát, a Poiymíxín B-t a Sigma szállította..

Á termékek hígítása

A termékeket keratinocífa inkubáló- médiummal hígítottuk (1. alább). A fent leírt módon előállítod 1 1844 extrakíumokat a száraz extrakluntra vonatkoztatod 1 ezrelékes végkoncentrációban értékeltük, ahol nem igy történt, azt külön jeleztük. Az LPS-t 10 pg/mles koncentrációban vizsgáltuk.

Értékelési modell

Se/reá

Az alkalmazott humán keratínocita vonal az SVK 14 sejtvonal volt (J. TaylorFapadimetóou ef aL, Céh. Difién., 1982, //, 169-180), amelyet 4,5 g/l glükózt, 100 mmoi .nátríumpiruvátot, 50 U/ml penicillint, 50 pg/ml streptomycint és 10 % magzati borjú szérumot (FCS) tartalmazó DMEM médbmos tenyészetben tartottunk lenn. Az összehasonlításhoz egészséges önkéntesektől nyert, Ficoh* .gradiensen tisztított normál humán limfochákat (PBMNC), valamint az A 431 sejtvonalbói eredő keratmoeitákaí (ATCC CRL 1555) és mellből plasztikai sebészeti beavatkozás során nyert normái humán keratinoehákaí (Biopreülc, Rennes) tenyésztettünk a fent leírt médiumban, amely még 10 rugóul EGF-t és 50 ftg szarvasmarha hipofizisextrakfumot is tartalmazott, /«áiiádeúi n ZermóW.Áí'/

Az IL-ö indukcióhoz a sejteket egy 96 lyukú tenyésztő mikrolemezre oltjuk le hármasával 200 pl-es végtérfogatban, 5xKr sejtóyuk sűrűségben. A médiumot 24 órán át tartó, 37 C^c'~on, 95 % levegőt és 5 % Cö₂-t tartalmazó atmoszférában végzett inkubáció után ugyanilyen térfogatú, de 1 % FCS-t és a termékeket a megadott koncentrációban tartalmazó médiumra cseréljük ie. További 18-24 órás tenyésztés után a három párhuzamos sejtkultúra felülúszóit összegyűjti ük, egyesítjük és -20 C°~ra fagyasztjuk ie a eitokín tartalom meghatározásáig.

Az it-6, IL-Ιβ, THFö és 1L-S mennyiségi mérését ELISA készlet (R.&D., Abinglon, ÜK) segítségévei végeztük. Mindegyik felüiúszót két párhuzamos méréssel értékeltük a gyártó utasításának megfelelően. Ezen meghatározások kimutatási határa 3 pg/ml. A fehérjék ELISA technikával végzett immunológiai meghatározásán felül még az 11,-6 aktív formájának biológiai meghatározását Is elvégeztük R9 murine. hybndoma sejteken (L. Aarden ez «/., Lymphokmes, 1985, 10, 175-182).

,4z eredW/ryeá RüAfeu

Az eredményeket vagy a keletkezett citokinek mennyiségének abszolút értékében fejezzük ki (az ELISA vizsgálatnál a fehérje pg/ml?ben; az IL.-6 B9 biológiai vizsgálatánál ü/m'l-ben: egy egység olyan oítoklnmennyisegnek felel meg, amennyi a B9 sejt maximális proliferativ hatásának 50 %-át indukálja), vagy pedig az előbbiek során meghatározott Sí stimolációs '* * X * Ϊ V

N ,5 χ t . - -*r indexben, amelyet úgy számítunk ki, hogy az indukált citokintermelés és az alapérték hányadosát képezzük:

Indukált 1L~6 termelés SIjb-6 ~ ------------------------------Alap IL-Ő termelés

Eredménye#

Áz ÍL-6 termelést stimuláló extraktumot a továbbiakban egyszerűen „I 1844 extrakturnnak”' fogjuk nevezni. Az. egyes kísérleteknél használt exlrakturnok számát és· koncentrációját feltüntetjük.

ζίΐ / /#94 cwdw defo.va a &eretifi&eífá stimulációra

Az 1 1844 extraktüm a koncentrációtól függően stimulálja az SVK 14 keratinochák 1L-6 szintézisét. A termelt alap IL-ú középértékét, véve a pozitivitás! küszöbérték: *3 SD (//,.# * -fouxft#/ ^:::: 13,6 pg/mi), az 1 1844 extraktüm jelentősen stimulálja az 11,-6 szintézist a 0,12 %-os es az azt meghaladó koncen.trádóknáI(Sl ^::: 1,23), ECso egyenlő 0,25 %~kak és a maximális hatás 2 %~oa koncentrációnál érhető el, amelynél az U,-ö szintézist stimuláló faktor ~ 2,3.

A tanulmányt kiterjesztettük más humán keratinocita vonalra (A 431 sejtvonal) es normál humán keratinod tákra is. Az SYK sejtvonal esetén megfigyeltektől -eltérően, az í 1844 extraktüm képes az l.L-ő termelést 2-nél nagyobb faktorral stimulálni mind a másik keratinocita vonalban (A 431), mind a normál keratinocíták primer tenyészetében.

Az 1 18-44 extraktüm hatása tehát nem korlátozódik a sejtvonalakra, hanem a normál sejtekre is.ki terjed.

zíz / /944 /ícíásdmí# 5pec///#ímdgt7

Az 1 1844 extraktüm hatásának specifikusságát különböző szinteken igazoltuk, bemutatva, hogy a hatás nem a bakteriális LP'S .szennyezés következménye (amelynek ismert az 11,-6 termelést stimuláló képessége) és hogy a timföld eredetű sejtek, amelyek szintén képesek ΓΟΟ termelésére, érzéketlenek voltak az 1 1844 extrsktomra;

a chokinek közül, amelyeket a keratinocíták szintetizálhatnak, csak az 1L-& termelés sumulálása következett be az ϊ 1844 extraktüm hatására.

Egy LPS gátló, a poiymixin jelenléte nem módosítja az I 1844 extrakíumnak az SVK-14 keratinocíta IL-6 termelésére gyakorolt induktív hatását, jóllehet az LPS indukálta stimulációt érthetően gátolja ez a vegyűlet. Ez az eredmény azt jelzi, hogy az 1 1844 extrakíummal megfigyelt hatást nem bakteriális endotoxín-szennyezés okozza. A 89 bioesszével végzett értékelés, továbbá azt is jelzi, hogy az 1 1844 által stimulált IL-ő termelés biológiailag aktiv.

A különböző célsejtek összehasonlító vizsgálata azt mutatja, hogy a vér íimíbcitáí tPBMWC), eltérően a keratinocitáktől, érzéketlenek az 1 1844 extraktum 11,-6 termelést stimuláló háláséval szemben. Viszont az LPS, amely mindkét sejttípus, stimulálására képes, hatékony mindkét esetben. Ez a tanulmány tehát azt mutatja, hogy az I 1844 extraktum anélkül stimulálja a keratínocítákat, hogy hatna a limfoid eredetű sejtekre.

Végül, a 1844 extraktum anélkül stimulálja azlt~ő -szintézist, hogy egyidejűleg növelné az IL-1, lt-8 vagy TNP«. szintjét. A eitoki.nek közöd az 1L-8 sajátossága, hogy kemotaktikus tulajdonságai révén a töhbmagvű neutrofil sejtek lokális összegyűjtésére képes. Így fontos szerepet játszik a gyulladásban. Az 1 1844 extraktum a többi vizsgált ci tokin termelésének növelése nélkül stimulálja az IL-6 termelést.

Ezen adatsor: az LPS Latás hiánya, csak a keratinocíták megcelzása és az IL-6-ra korlátozott stimuláció alapján levonható, az a következtetés, hogy az 1 1844 extraktum akciója specifikus és nincs gyulladáskeltő hatása,

Tehát az 1 1844 extraktum reprodukáíhatőan stimulálja a keratinocíták 11.-6 termelését. Ez a hatás mind a humán keratinodra vonalakon, mind a primer tenyészetből nyert normál humán kemtinoeitákou megfigyelhető. Az 1 1844 extraktumnak. a keratinocíták 11.,-6 szintézisét stimuláló sajátossága specifikus·. Ez az I 1844 extraktum belső tulajdonságának és nem egy külső szennyezésnek, például bakteriális endotoxinnak a következménye; nem hat a timföld eredetű sejtekre, és a vizsgált cltokinek közül csak az 11,-ő-ra figyeltek meg: az I 1844 extraktum. specifikussága kettős: eeliuláris és molekuláris, Az I 1844 extraktum keratinodra IL-ő-ra gyakorolt stimuláló hatásának jellemzése lehetővé teszi, hogy meghatározzuk az 1,5 - 4,5 közötti IL-6 stimulá-ciós indexeket mint aktivitási kritériumot az SVK 1.4 sejteken értékelt bármelyik minta számára.

Az 1 1844 extraktum kollagén rostok összehúzódására gyakorolt hatásának jellemzését a következők szerint végeztük el.

* Λ* 9 99 Λ 9 * * » ♦ V 9

1>

A tanulmány célja az, hogy teszteljük az 1 1844 extráktum hatását a. kollagén rostok összehúzódására, A felhasznált kollagén gélt fihrohlasztok és kollagén összekeverésével ál dijuk elő·. Á sejtek által kifejtett nyomás hatására a kollagén rostokba szerveződik. Ez a jelenség a gél Összehúzódásával mennyiségileg mérhető.

Az alkalmazott sejtvonal az MRC5 törzs, amely humán embrionális tüdőből származik. Tenyésztése BME médiumban (Basa! Eagle Médium) történik 10 % FCS, 1 % penicilHn/streptomyeín, I % fengizone és I % NEAA, öibco® (nem esszenciális aminosav) tartalmú Glutamnx I jelenlétében.

Az alkalmazott kollagén patkány íárok-inbői származó 1 típusú kollagén, eeetsavhan oldva 2 mg/ml-es koncentrációban.

A gélek előállításának módszere ,4 készítése

Egy 75 cm²-es Petri-csészéhen kapott MRC5 tenyészet tripszlncs kezelése után Ixl 0^fí sejh'ml-es sejlszuszpenziót készítünk lö % FCS-t és antibiotikumokat tartalmazó DMEMben, úgy, hogy egy-egy gél 500 Ö0Ö sejtet tartalmazzon.

A keverék elkészítése jégen történik a gélesedés késleltetése végett.

A különböző összetevőket a következő sorrendben és arányokban adagoljuk be keverés közben;

E7Ó x DMEM	2,3 ml
1 típusú kollagén	1,5 ml
0,1 N NaOH	0,25 ml
FCS	'0,4.5 ml
Sejtszaszpenzíő	0,5 ml

Ezt a jól homogenizált keveréket 5 cm átmérőjű (bakteriológiai típusú, NIJNÜ) Petricsészéhe tesszük és 37 C^c-on inkubáljuk. A gél IÖ percen belül kialakul. A gélt kb. 2 óra múlva egy szike pengéjével elválasztjuk a fáltóh A gél átmérőiét elkészülte után 24, 48 és 72 óra múlva lemérjük egy tntn-cs beosztású vonalzóval.

♦ *«

A gél előállítása alatt az ϊ 1844 extrakíumhel hígításokat készítünk 1,76 x DMEM médiummal úgy, hogy 0,1 %-os, 0,2 %-os és 0,5 %-os végkonoentrácíót kapjunk. Az összehúzódás gátlásának kontrolljaként 6,4 g/1 végkoncentrációjú fenol oldatot használunk.

Kvan ti tat iv an a lizis

Az I 1844 extraktum a (5,1 %-os és az ennél nagyobb koncentrációkban az összehúzódást jelentősen növeli. Az összehúzódás gátlásának kontrolljaként használt fenol 0 %-os összehúzódást ad. A kvantitatív analízis, amelyet 72 óra múlva, 1 1844 extraktum jelenlétében és hiányában, az összehúzódott gél elektronmikroszkópos megfigyelésével végzünk el, fehérje szintézis fázisában lévő aktív sejteket mutat. Az í 1844 extrakturnos kezelés ···· úgy tűnik-- nem módosítja figyelemre méltóan a rostok számát vagy méretét.

Az. 1 1844· extraktum hatékony a 0,1 %-os és· az ennél nagyobb dózisokban.. Növeli a fibroblaszt-aktívítást, ami a kollagén összehúzódásának, fokozódásában és. (csak a legmagasabb koncentrációnál) a rostok számának növekedésében nyilvánul meg.

Az Ι 1844 extraktum koliagenázaktiválásra gyakorolt hatásának jellemzését a következőkben ismertetett módon végeztük.

A. tanulmány célja az, hogy teszteljük sz 1 1844 extraktum. hatását a kollagenázakfiváláora. E célból fibrohlasztok és tricíált kollagén összekeverésével készült kollagén gélt használunk. Ebben a környezetben a fibrohlasztok újraszervezik, újramodellezik és összehúzzák a kollagént, hogy egy bőrtípusú struktúrát hozzanak létre. Ehhez a fibrohlasztok kollagenázt termelnek, amit látens· tormában a tenyésztő médiumba bocsátanak ki, ez aktiválódhat a proteinázok hatására. A kolíagenáz aktivitás mérése az enzim azon képességének a meghatározásával történik, amellyel az a tricíált kollagén szubsztrátot oldható radioaktív peptidekké bontja le. A látens kollagenázt az 1 J-tozllamid-2-íemletíl klórmetilketonnal (TPCK) kezelt tripszln aktiválja. Az alkalmazott sejtvonal az MR.C5 fíbroblaszt törzs, amely humán, embrionális tüdőből származik. Tenyésztése BME médiumban (Sasai Eagle Médium) történik 10% FCS, 1 % penicííhnZstreptomyein, 1 fungizone és 1 % NBA.A, Gíbco® (nem esszenciális· aminosav) tartalmú Glutamax I jelenlétében.

Az alkalmazott kollagén pafkányfarok-inból származó 1 típusú kollagén, ecetsavban oldva 2 mg/ml-es koncentrációban, A trielnmmal jelölt kollagén 0,3 mg/ml koncentrációjú ecetsavas oldat, aktivitása 0,06 mCí/ml (Duporü Net-őőO).

«,,,

A gélek előállításának módszere ,4 tódhőm

Egy 75 cnrt-es Peírí-csészében kapott MRC5 tenyészet trípszínes kezelése után 1x1 ö^ö sejt/ml-es sejtszuszpenziőt készítünk 1.0 % .FCS-t és antibiotikumokat tartalmazó DMEMben,

A keverék elkészítése jégen történik a gélesedés késleltetése végett.

A különböző Összetevőket a kővetkező sorrendben és arányokban adagoljuk be keverés közben:

2 \ DMEM	400 μί
Trioláit 1 típusú kollagén	300 μί
0..1 N Naöli	100 ul
FCS	100 μ I
Segszoszpenziő	iOÖui

Ebből a jól homogenizált keverékből 200 μί-t osztunk szét egy 24 lyukú lemezre és 37 ϋ°~ on inkubáljuk. A radioaktivitás 0,4 pCI/lvuk volt.

Egy órával később 500 μί ÖMEM médiumot + 3 % FCS-t adagolunk minden lyukba.

napon keresztül minden 24 órában lemérjük az aktivált és latens kollagenáz aktivitását, E célból 500 μΐ médiumot kiveszünk minden egyes lyukból és folyadékszeintiiiáeiós módszerrel megmerjük, Mindegyik lyukba bemérünk 300 μΐ trlpszin/TFCK 25 mg/mi-es koncentrációjú DMEM-es oldatát és 37 C°-on inkubáljuk 15 percig, A trlpszin működését 200 ul 100 mg/rnl koncentrációjú desztillált vizes trlpszin inhibitor oldat hozzáadásával állítjuk le, A. íolyadékszcintiltádös méréshez 500 μ! médiumot veszünk ki. 'Ezután minden lyukba bemérünk 500 μΐ médiumot v 3 % FCS-t, majd további 24 órán keresztül mkubáljúk a lemezt.

A gél előállítása alatt az I 1844 extraktnmhól hígításokat készítünk 2 x DMEM médiummal úgy, hogy QJ %-os és 0,5 %-os végkcnceníráeiöt kapjunk.

Az 1' 1.844 extraktum nem módosítja a teljes kollagenázakdvlfást Egy adott időben a látens és -aktiválf kollagenáz viszonylagos arányai nem változnak a kontrolihoz képest, bár a látens kollagenáz időbeli növekedése figyelhető meg mind a kontroliban, mind a kezelt mintákban, A termék nem aktiválja a kollagenázt.,

A jelen találmány szerinti kozmetikai készítmények készítésekor az így előállított 1.1844 extraktumokat a szokásos hígító-szerekkel és vizes vagy nem vizes oldószerekkel keverjük, amelyek összeegyeztethetők a topikálls alkalmazással és a tényleges összetétel aktív komponensei vet Az alkalmas oldószerek, és/vagy hígitószerek kiválasztása azon képességük szerint történik, amellyel a találmányban szereplő extraktum aktív komponensét az epidermálls és dermális börszerkezetekbe szállítják,

A találmány 1 1844 extraktumáről azt is bemutattuk, hogy az teljesen mentes a. geuoíoxi oltástól az Ames teszt és a DNS helyreállítás vizsgálata szerint.

Stabilitásuk megfelelő a kozmetikai készítményekben történő felhasználáshoz.

A jelen találmány kozmetikai készítményei 0,00001 %-5 % közötti súlyarányban tartalmazzák az 1 1844 extraktumot a készítmény teljes súlyára vonatkoztatva, a bőrön alkalmazott kozmetikumok készítésénél általában hasznák segédanyagokkal keverve.

Az említett százalékos arány a fent jelzett tartományon belül változhat a készítményben lévő 1' 1844 extraktum saját aktivitásának függvényében.

Előnyös, ha a szóban forgó 1 1844 extraktum a készítmény teljes súlyára vonatkoztatva 0,0001 % - 2 % közötti súlyarányban van jelen,

A jelen találmány szerinti készítmény előállításakor az 1 1844 extraktnmoí összekeverik a szokásos hígítószerekkel és vizes vagy nem vizes oldószerekkel, amelyek összeegyeztethetők a bőrön való alkainmzássai és a készítmény többi összetevőiével. Az alkalmas oldószerek és/vagy hígitószerek kiválasztása azon képességük szerint történik, amellyel a találmányban szereplő 1 I.844 aktív extraktumot a bőrbe juttatják,

Ezek a készítmények általában tartalmaznak a lokális alkalmazásra szánt készítmények szokásos összetevői közöl kiválasztott segédanyagokat és adalékokat, az egyes tervezett készítmények szükségletének megfelelően.

Tartalmazhatnak például sürítoket, lágyítókat, puhlíókak stabil izálókat, konzerv a ló kát, habzásgátlókat. félületaktiv anyagokat, antíoxídánsokat, festékeket és/vagy színezékeket és/vagy egyéb típusú töltőanyagokat, iilatanyagokat, szilikonokat és különféle zsíranyagokat.

Az ϊ 1.844 extraktum a készítmény teljes súlyára vonatkoztatva mindig 0,00001 s%-5s% között, lehetőleg 0,0001 s % - 2 s % között legyen, a száraz extraktum súlyára számítva.

A jelen találmány szerinti készítmények lehetőleg az I 1844 új törzs ferrnentlevének extraktumát tartalmazzák súly/súly százalékos alapon olyan arányban, amely az alkalmazott extraktum aktivitási fokától, igy a száraz anyag koncentrációjától és ezen anyag specifikus aktivitásától fögg.

A találmány szerinti kozmetikai készítmény előállításához megfelelő lehet a fermentációból közvetlenül nyert nyers extraktum felhasználása bármiféle tisztítási lépés nélkül, 0,00001 s % - 5 s % közötti arányokban, előnyösen 0,0001 s %-2 s % közötti, még jobb 0,001 s% -2 s % közötti, de inkább 0,01 s %. - 2 s % közötti arányokban a készítmény teljes sólyára vonatkoztatva.

Ezeket a súlyszázalékos arányokat természetesen az előállított száraz extraktum súlya alapján számítjuk.

'Pontosabban, a jelen találmány készítményei többé vagy kevésbé tisztított, oldott állapotú extraktumokat'tartalmaznak, amelyek a Pasteur Intézet C.N.C.M.-nél az l 1844 szám alatt elhelyezett AEödn&vwfo törzsnek vagy termelő- mutánsainak a fermentációjával nyerhetők; az Ilyen jellegű készítményekben általában használt, korábban említett segédanyagokkal kiegészítve.

A jelen találmány szerinti készítmények formája lehet emulzió, amelyben a lényegi alkotórészt vagy az alkotórészek keverékét egy tetszés- szerinti stabilizálóval együtt elegyítik a kozmetikai készítményekben. jelenleg használatos- és az említett alkotórészekkel kompatibilis segédanyagokkal, mint amilyen a lanolin, illetve a növényi, ásványi vagy szintetikus olajok.

A találmányban szereplő készítmények gél formában Is előállíthatok megfelelő kötőanyagokban, mint amilyenek, a. cellulóz-észterek vagy más géíképzö szerek, például az akriiszármazékok; az .aktív hatóanyagot oldva vagy mikrogranulákhan szuszpendálva tartalmazhatják.

A találmánynak megfelelő készítmények „loílotfe vagy oldat tormájában is megjelenhetnek* amelyekben az alkotórészek keveréke oldott vagy mikríxliszpergált állapotban van.

A találmánynak megfelelő készítmények tehát mikrodiszperzíót is képezhetnek egy vizet és egy vagy több kompatibilis felületaktív anyagot tartalmazó folyadékban. A diszperzió mikroemalziós tulajdonságokkal rendelkezik, különösen ami az átlátszóságot és az alacsony viszkozitást Illeti, és gyakorlatilag valódi oldatnak tűnik. Ezek a készítmények alkalomszerűen is előállíthatok.

A találmány szerinti készítmény egyik előnyös formája sgy olyan folyadék, amelyet helyileg alkalmaznak egy tapadás hordozó segítségével Ez a továbbiakban „tapasznak” nevezett hordozó lehetővé teszi, az aktív komponens kontrollált diffúzióját; a komponens tetszés, szerint aktiválható bizonyos fizikai jelenségekkel, például mikroáramokkah

A jelen találmány szerinti kozmetikai készítmények egyéb aktív komponenseket is tartalmazhatnak, amelyek akár ugyanolyan hatásúak, mint a kollagénszintézis siimolátorai, a kollagenáz vagy elasztáz inhibitorok, a vazoprotektorok, akár olyan termékek, amelyek közreműködnek a keratlnocíta proliferácló stimulálásában vagy az extracellulárís mátrix összetevői (kollagén, elasztin, glükózaminoglykanok) szintézisének stimulálásában, de lehetnek olyan termékek is, amelyek hasznosak az Ilyen típusú topikális készítményeknél, például a seítmegújulást gyorsítók, kollagenáz vagy elasztáz inhibitorok, vazoprotektorok, gyökmegkötök, a bőr barríer-fonkciőját visszaállító aktív hatóanyagok íceramidok, esszenciális zsírsavak) vagy a hidratálok.

A jelen találmány szerinti készítmények jó stabilitással rendelkeznek és konzerválhatok a kívánt felhasználási idd tartamára -10 C° és 60 közötti hőmérsékleten az összetevők kiülepedése vagy a fázisok szétválása, illetve az aktivitás csökkenése nélkül, ami a készítmény használhatóságát rontaná.

Ezek a készítmények nagyon jól tolerálhatok, nem mutatnak fototoxíeitást, és a bőrön, hosszú ideig alkalmazva sem okoznak semmilyen mellékhatást,

A jelen találmány szerinti készítmények különböző megjelenési formájukban, célzottan a bőr belső vagy külső természetű - ez esetben alapvetően fotokémiai ··· öregedésének megelőzésére vagy leküzdésére használhatók.

A jelen találmánynak az öregedés ellen tervezett, kozmetikai készítményei felvihetők az epidermiszre, a hajra vagy a szőrrel fedett területre azért, hogy módosítsák azok megjelenési formáját és védjék azokat.

# *4 * X.

♦ * X * * * * * * * * «·-«* *·«»'♦ *

Ismeretes, hogy a tőmőttség a bőr fiatalságának alapvető jellemzője. A sejt életerejének igazi mutatója ez és eltűnése elősegíti az öregedés más jeleinek kifejlődését így a ráncok kialakulását vagy a fényesség elvesztését.

Mindaddig, amíg a dermisz megtartja eredeti sűrűségét és rugalmas simulékonyságát, az epidermisz szintén sírna, rugalmas és nagyon friss marad. A bőr öregedése komplex jelenség, ami az ifjúság teljében kezdődik. Sok, különféle oka van ennek: ide tartoznak a szabad gyökök, a genetikus faktorok és a nap. Ez a hatás a bőr minden szerkezetén és minden szintjén érvényesül. A sejtek száma az idő előrehaladtával csökken; ezek gyengébb minőségű, szövetet hoznak létre, amely elveszíti eredeti tömöttségéí és rugalmas természetét.

Leírták, hogy az epiöermáhs sejtek metabolízomsa lelássuk a bazális réteg elveszti hullámos formáját és egyenes vonalúvá válik. A teljes keraíinocita populáció visszafej lődik és a szaruréteg elveszti hatékonyságát, mi több, alig kontrollálja a viz elpárolgását. Azt is leirták, hogy a dermisz kulcssejtjeit, képező fíbrohlasztok aktivitása az évek múlásával csökken. A '.keletkezett kollagén rostossá és merevvé válik. Az elasztinszintézis még korábban lecsökken. A dermisz szerkezete megváltozik, vékonyabbá válik, összeesik és kevésbé ellenálló lesz az. Izmok összehúzódásával szemben. A fellazulás töréseket hoz létre.

ezek okozzák a ráncokat

A találmány szerinti kozmetikai készítmények kisimító, átformáló hatóanyaga helyreállítja a tőmöttseg természetes alapjait a bőr minden szintjén.

E készítmények a bőr észrevehetetlen nrikroírarsszíormációira reagálnak, amelyek a bőr tömörségének, rugalmasságának és fiatalságának elvesztését eredményezik,

A találmány szerinti kozmetikai készítményeket az érett bőr számára az öregedéssel szembeni védelemül is szánták. Áz. I 1.844 extrakium a bőr rekonstrukciós .faktorára hat, helyreállítva mind a szerkezeti (tömöttseg és tónasossá-g), mind a felszíni (jó közérzet és fényesség) élettani egyensúlyt, másképpen a mély rétegek (tömöttsé-g és tónusosság) és a felszín (.fényesség és jő közérzet) egyensúlyát. A találmány szerinti élénkítő vagy átalakító kozmetikai készítmények napközben és/vagy éjszaka is -alkalmazhatók.

A kozmetikai készítmények más, kiegészítő aktív hatóanyagokat Is tartalmazhatnak. Ilyenek lehetnek például a vitaminok vagy a feliesökkemő szerek.

... $ ,

Páratlan átformáló tulajdonságaik felerősödnek és megsokszorozódnak egy tengeri plankton kivonattal való kombináció szinergikus hatása révén, A tengeri planktonból származó extraktum új hói kiváltja a bőr hidratáltságát és tömötíségét

Növényi stimuláló anyagok, gyűmöfeskívouatok, például alma-fitosthnulinok is alkalmazhatók, amelyeket gyökmegkötő· tulajdonságaik miatt használnak. Ezek új, különösen .aktív gyökmegkötő anyagok, nagy mennyiségben tartalmaznak fíavonokat, szterolokat, esszenciális zsírsavakat és vitaminokat, beleértve az E vitamint is. A bőr így maximálisan védett lesz a szabad gyökök okozta veszéllyel szemben, amit főleg az ultraibolya sugarak és a stressz okoznak.

A perfínor-ofoj-ok is -alkalmazhatók a találmány szerinti kozmetikai készítményekben;, a perli uor-ol aj oknak egyik tulajdonsága az, hogy kisimítják, a bőr durva felületének apró egyenetlenségein az érdes .részeket és barázdákat. Kivasalják az arc redöit és szemmel láthatóan megszépítik a bőr foíüietéi, mintha valóságos fiatalság formálná azt,

A találmány szerinti kozmetikai készítmények stimulálják az epidermáiis sejmiegújulásh a kollagén- és elasztintermelési, biztosítják a hidraíálódás természetes folyamatának felélesztését, és még teljesebben védik a bőrt a szabad gyökökkel szemben, amelyek .az öregedés egyik legfontosabb faktorát képezik. Az óira dinamizált, epidermisz igy jobban, hidratálódik, a bor fiatalabbnak, simábbnak és tömö-ttebbnek tűnik. Különösen az arc vonalai rajzolódnak ki élesebben és a bor szemlátomást tömöttebbé válva belülről tűnik átformáltunk.

A fenti kozmetikai készátményefcben levő I 1844 extraktum egységesítő aktív anyagként hat a bőrre.

Á klinikai vizsgálatokban 120 nő vett részi, életkoruk 30--60 év között volt. A találmány szerinti kozmetikai készítmények tulajdonságait 4 héten keresztül tesztelték.

A vizsgálatban résztvevők 87 %-ánál megállapítható volt a termék szembetűnő hatékonysága a bőr tomőtíségére, simaságára és hídra iái tságára, 82 % tanúsította a jelentős kozmetikai előnyöket, például a könnyű, alkalmazhatóságot, gyors- felszívódást, a zsíros fomréteg teljes hiányát, valamint a jő közérzet és kényelem érzését.

Más klinikai, vizsgálatok annak demonstrálására irányultak, hogy a találmány szerinti kozmetikai készítmények a bőr barázdáltságára, beeseííségére, biomecbanikai: sajátosságaira és fényességére balnak.

β.*· *· ♦

4 • > 4 <

A kifejezetten .az érett bőrnek szánt termékvonal alapján kimondható, hogy az érzékeny és száraz bőr nappali kezelésével elérhető volt a finom ráncok és barázdák statisztikusan szignifikáns csökkenése, a beesettség megjelenésének és élességének, valamint a bőr tőmöttségének. j avulása.

A normál és kevert típusú bőr nappali kezelése a finom barázdák statisztikusan szignifikáns csökkenését, a beesettség élességének és a bőr tömő őségének javulását, eredményezte.

Az éjszakai ráaetalanttóÁonizálö kezelés, a. mély ráncok, a finom redők és a barázdák statisztikusan szignifikáns csökkenésével, a beesettség megjelenésének és élességének javulásával, és a bor tömöttségének és rugalmasságának javulásával járt.

A regeneráló intenzív kezelés a ráncok és a barázdák statisztikusan szignifikáns csökkenését és a beesettség megjelenésének és élességének javulását eredményezte.

Ezeket a klinikai eredményeket különféle, a kozmetolögiában járatos személyek előtt jól ismert módszerekkel igazolták, mint például a feidratáltság mérését lehetővé tevő mágneses rezonancia ábrázolás (MRI) mikmtechmkája; a transzmissziós mikroszkópia a bőr helyreállításának értékelésére; a nagyfelbontású echográfia a bőr vastagságának mérésére vagy a ibszfór-3.1 spektrornetría a celluláris aktivitás mérésére.

A találmány tárgyát képezi egy kozmetikai kezelési módszer is, amely azzal jellemezhető, hogy az I 1844 extraktumnak egy kozmetikailag hatékony mennyiségét kozmetikai hordozóanyagban az epidermisznél és/vagy a hajas-szőrös bőrön alkalmazzák.

A következő PÉLDÁK illusztrálják a találmányt annak korlátozása nélkül.

1. PÉLDA

A I 1844 Lhoíánorfen törzsből származtatott extraktum előállítása.

1.1. Fermentáció

Az 1 1844 Ehod&t&ru/a törzs fermentációját különböző tenyésztő médiumokban végeztük.

L L L

A törzs tenyésztése Fetri-osészében, szubkultúra médiumban történik.

**

Sacefetretxyces curemfee autoBzába	H)g
Tripton	lé g
Glukóz	20 g
Agár	15g
Tisztított víz ............ .... ...........................................	I 1,

A tenyészetet 48 órán keresztül Inkubáljuk 30 C°-on. Mindegyik Petri-csészébe 10 mi~t adunk a kővetkező összeállítású megfelelő regeneráló médiumbői. majd élesztő szuszpenziőt nyerünk.

NaCl	9,00 g
KC1	0,42 g
CaCE	0,48 g
NaHCOj	0,20·. g
Glyceroi	150,00 g
3-[N-MorlbÍin]-ptopánssilfonsav	3,00 g
Tisztított, víz <?, χ,	1 L

b.) Ebből a szuszpenzíőhői 5 ml-t oltunk le egy 2 L-es Erlenmeyer-Iombikban lévő, 5^:ÖO ml. tenyésztő médiumba, amelynek összetétele a következő:

ő’net'fernmyees’· cermste autoBzába	10 g
Pepíonizált tej	20 g
Kukorica áztatólé	10 g
Glükóz	30 g
Nyomelem oldat	10 ml
Tisztított víz g.,?.	1 I,

♦** ·>·)

A. nyomelem oldat a következő vegyületeket tartalmazza:

EeSO, - 7 %ö	1 g
MnSíA · 4 H2O	1 g
CnCb · 2 M2O	0,025 g
Lati? · 2 H?O	0,1 g
I'b.BO·.	0,5 ő g
(ΝΗ4}δΜθ24 · 4 i-bO	0,02 g
ZnSO,< 7 H>0	0,2 g
Tisztított víz p. s,	1 L

A tenyésztést percenként ISO fordulattal kevert 2 literes Erlenmeyerdombikokbao végezzük 30 C^c'-os hőmérsékleten, 48 órán keresztük

1. L2«.

A. második generációs sarzsból 0,2 ml élesztő szuszpenziót oltunk le 500 ml-es lombikban levő 100 ml tenyésztő médiumba, amelynek összetétele a következő:

fencőnvomvot eerevAíoe autollzátja	20 g
Inpton	20 g
Glükóz	20 g
Nyomelem oldat	10 ml
Tisztított víz p.s.	1 I...

A nyomelem oldat összetétele azonos az 1J J példában megadottak A tenyésztést 30 C^ö~o:s hőmérsékleten, 24 órán keresztül végezzük 200 fordulat/perc keverés mellett.

A fenti tenyészetből 100 ml-t oltunk le egv 20 literes íermentorhan lévő 12 liter médiumba, amelynek összetétele azonos az 1.1.1.b példában megadottal, kiegészítve 1 ml/1 StruktoU'-lai.

* #

-ί

A tenyésztést 30 C°~os hőmérsékleten, I vvm levegőztetés mellett, változó keveréssel végezzük ágy, hogy a beoldott oxigén nyomása 3Ő % legyen. A pH-t 5,0-s értékre áhítink be ammóniával.

óra elteltével koncentrált glukóz oldatot adunk hozzá a növekedés fenntartása végett,

A tenyésztést 32 óra után, a növekedési platón állítjuk le.

L 1, 3. -v löö ml kevertlomhik-tenyészetet készítünk az 1.1.2. példában megadott módon, ezt oltjuk le egy 20 literes fennen torban lévő 12 liter tenyésztő médiumba, amelynek az összetétele a következő:

Sííceféízowae.^ cerewsfoe autolizáíia	20 g
Inpton	20 g
Glükóz	50 g
Nyomelem oldat	10 ml
S makrói''’	1 ml.
Tisztítóit víz g,x.	1 L

A nyomelem oldat azonos az 1.1.1. példában leírttal.

A tenyésztést az 1.1 .z.b példában megadott fettételek mellett végezzük.

óra elteltével koncentrált glükóz oldatot adunk hozzá a növekedés fenntartása, végett.

A tenyésztést 34 óra után, a növekedési platón állítjuk le,

1. 1.4,

Négy darab 2 literes kevertlomhik-tenyészetet készítünk elő, amelyek 500-500 ml, az 1.1,2,a példában megadott összetételű médiumot tartalmaznak.

Mindegyik lombikba 0,75 ml élesztő szuszpenziót oltunk le a második generációs sarasból. A tenyésztést 24 órán kérésztől, 30 C^ö-os hőmérsékleten, 2ÖÖ fordulat/perc keverés mellett végezzük. Ezután a 4 lombik tartalmát összekeverve, azt egy 450 literes formentorbsn lévő 230 liter médiumba oltják le. A médium összetétele a következő.:

« < <· « »

óboebuzonmees cerevmne autolizátja	30 g
Tripton	20 g
Rofcrose	30 g
Nyomelemek	10 ml
StruktoU	1 ml
Tisztított víz g.s.	1 k

A nyomelem oldat azonos az 1.1,1. példában leírttal.

A tenyésztést 30 C°-os hőmérsékleten, 1 vvnt levegőztetés mellett, változó keveréssel végezzük úgy, hogy a beoldott oxigén nyomása közei 30 % legyen..

Á pH-i ammóniával S,5~os értékre állítjuk. és 30 óra elteltével koncentrált glükóz oldatot adunk hozzá a növekedés fenntartása végett,

A tenyésztést 37 óra után, a növekedést piaion állítjuk ie. í. LS.

A második generációs sarasból 0,75 ml élesztő szuszpenzíőt oltunk le 6 darab 2 literes lombik mindegyikébe, amelyek 500-500 mi tenyésztő médiumot tartalmaznak az alábbi összetételben:

őra'.v'.:.őiz.''uun.''ee.í cermjiae autolizátls	20 g
Kazein hídrolízátam	20 a ...
Olükóz	20 g
Nyomelemek	i 0 ml
ΐ iszt itott víz p. V	1 L

A nyomelem oldat azonos az L1,1. példában leírttal,

A tenyésztést 24 órán keresztül, 30 €*~os hőmérsékleten, 220 fordulat/perc keverés mellett végezzük.

Ezután a ő lombik tartalmát összekeverve, azt egy 450 literes fénnentorban lévő 300 L médiumba oltjuk le. Á médium összetétele a következő:

* A

cerevifoue autolizátja	30 g
Kazein hldrolizáínm	20 g
Glükóz	20 g
Nyomelemek	10 ml
Str üktől	1 ml
Tisztított viz g. s.	1 L

A nyomelem oldat azonos az LEL példában leírttal.

A tenyésztést 30 C°-ós hőmérsékleten, l vvtn levegőztetés mellett, változó keveréssel végezzük ügy, hogy a beoldott oxigén nyomása közel 30 % legyen,

A pl-Et ammóniával 5,5-ös értékre állítjuk be, és 35 óra elteltével koncentrált glükóz oldatot adunk hozzá a növekedés fenntartása végett.

A tenyésztést 40 óra után, a növekedési platón állítjuk le.

E 2. Extrákéin

E 2, E

Az extmkciót 9 liter fermentléböl végezzük, amelyet az l.i.E példa szerint nyerünk í'18 darab, egyenként 500 ml fermendét tartalmazó 2 literes lombikból).

Percenként 9 000-es fordulattal (14 000 g) centrifugálunk 10 percen keresztül, és 154 g nedves biomasszát kapunk.

Ezt a biomasszát 6 Iker diklórmetán/metanol ív/v) elegyével kevertetjük szoba hőmérsékleten, éjszakán át.

Ezután a biomasszát kiszűrjük és a szerves lazist vákuumban, 50 C°-on szárazra pároljuk..

A lepárlási maradék (9,8 g) képezi a száraz extraktumot, amit azután 112 mi metanolban oldunk fel.

Az igy kapott frakciót 0,2 pm-es szűrön átszűrjük és elvégezzük a keratinoeita stimuláció: biológiai vizsgálatát; ez a 200-szorosra hígított (1/200) anyagban 1,9-es keratinoeita sthnnládós indexet (Sí) .mutat.

» * * *· fc fc ♦ » * fc fcfcfc « fc ]f ri «

5.2.2,

Az extrakciőt az 1.1.2. példa szerint előállított, 12 liter tenyésztő fermentlével végezzük.

Ugyanazt a protokollt követjük, mint az 1.2.1. példában, de az extrakciöhoz 1 90(5 g nedves biomasszát és SO liter díklórmetán/metanol (50/50) elegyet használunk fel; azaz az alkalmazott oldószer kevefék/nedves biomassza arány közel 40 liter/kg.

Miután éjszakán át érintkeztek a fázisok, a biomasszát kiszűrjük, és a szerves fázist vákuumban, 50 <U-on szárazra pároljak.

93,8 g száraz extraktumot kapunk, amit 375 g 50/5(5 (v/v) eíznöl/vlz eíegyben veszünk fel.

A 0,2 pm-es szűrőn átszűrt, 0,2 g/g száraz extraktumot tartalmazó oldat 2,Ί-es stímuláeios indexet (Sl) mutat l/2öö-as hígításban.

2. 3.

Az extrakciőt az 1.1.3. példában megadott tenyészetből, '11 11 térrel végezzük. Ugyanazt a protokollt követjük, mint ami az 1.2.2. példában szerepelt, majd a kinyert 2,2 kg nedves biomasszát 80 liter 5(5/50 (v/v) dlklórraetán/metanol eleggyel extraháljnk,

Ezután a biomasszát kiszűrjük, és a szerves fázist vákuumban, 5(5 C°-on szárazra parolink, g száraz extrakmmoí kapunk, amit 392 g 50/5(5 (v/v) etasel/víz eíegyben veszünk lel ügy, hogy 0,2 g/g-os oldatot nyerjünk.

Az oldatot 0,2 pm-es szűrőn átszűrve, elvégezzük belőle a keraíinoelía stimuláció biológiai vizsgálatát; ez 1 /209-as hígításban 2,8-as keratinoeha stimulációé indexet (Sí) mutat.

1. 2, 4.

Az extrakciőt 12 liter tenyészettel végezzük, amelyet az 1.1.3. példában megadott módon készítettünk, de ebben az esetben a biomassza elválasztása folyamatos centrifugálással történik., 1,6 kg nedves biomasszát nyerünk, ezt a biomasszát S0 liter 5(5/50 (v/v) diklőrmetán/metanol eleggyel kezeljük.

Miután éjszakán át érintkeztek a lázi sok, a biomasszát kiszűrjük, és a szerves fázist vákuumban, 50 C°-on szárazra pároljuk.

g száraz extrakmmoí kapunk, amit 747 g 50/5(5 (v/v) etanoi/viz eíegyben veszünk lel ügy, hogy 0,1 g/g száraz extraktum tartalmú oldatot nyerjünk.

A kapott oldatot 0,2 μηι-es szűrőn szűrjük át, a sűmuláelös index (Sl) 1/100-as hígításban 3,5-es értéket mutat.

ί·

1.2, 5,

Az 1,1.3. példában Ismertetett tenyészetből 230 litert extrahálunk; a biomassza folyamatos centrifugálissal végzett leválasztása után 29 kg nedves biomasszát 'kapunk. Ebből a biomasszából 8 kg-t 80 liter 50/50 (v/v) dtklónnetán/metaoul eieggyeí kezelőnk, azaz az oldószer keverék/nedves biomassza aránya közel 10 líter/1 kg.

Miután éjszakán át érintkeztek a fázisok, a biomasszát kiszűrjük, és a szerves fázist vákuumban, 59 G^c-on szárazra pároljuk.

A szerves fázis bepárlása után 314 g száraz extraktumot kapunk, amit 2826 g 59/50 (v/v) etanol/viz elegy ben veszünk fel.

Az igy kapott oldat (9,1 g/g száraz extráktum) 2,S~as stímulációs indexei tSl) mutat l/löüas hígításban.

I, 2. 6.

Az 1.1.5, példában megadott tenyészetből 330 litert extrahálunk. Folyamatos centrifugálissal 54,4 kg nedves biomasszát nyerünk. Ebből a biomasszából 2.7,7 kg-t 272 liter 50/50 (v/v) diklórmetán/metanol eieggyeí kezelünk, azaz az oldószer keverék/nedves biomassza arány közel 5 liter/1 kg.

Miután éjszakán át érintkeztek, a fázisok, a biomasszát kiszűrjük, és a szerves tézist vákuumban, 50 CE-on szárazra pároljuk.

A szemes fázis bepárlása után 1447 g száraz extraktumot kapunk, amit 13 023 g 50/50 (v/v) etanol/víz degyben veszünk fel úgy, hogy (hl g/g száraz extráktum tartalmú oldatot nyerjünk. Miután az oldatot 0,2 pm-es szűrőn átszűrtük, elvégezzük belőle a keratinodta stimuláció biológiai vizsgálatát; ez 2,ő-os kemtmoeita síimuiácios indexet (SÍ) mutat I/I0Oas hígításra.

A. következő példákban a mennyiségek súly százalékban vannak megadva..

PÉLDA: NAPPALI ARCKRÉM

CARBOMER	0,15
TRÍETANOLAMIN	ÜJ
PROFI LÉNGLÍKÖL	5
X AKTÁN GUMI	0,2
OLICEROL	3
GLICERIL SZTEARÁT	3
PEG SZTEARÁT	7
STEARETH-20	!
OKTIL PALMITÁT	10
CETIL ALKOHOL	?
SZTEARiL ALKOHOL	0,25
PERPLUOR OLAJ	0.2
KOLESZTEROL	0,5
SZINTETIKUS MÉHVIASZ	5
DIMETHICONE	5
TENGERI PLANKTONEXTRAKTUM	0,5
ALMAEXTRAKTUM	3
BISABOLOL	0,5
TOKOFERIL ACÉLÁT	1
SZŐLŐMÁGEXTRAKTUM	0,5
KON ZER VALÓSZER.	0,8
ÍLLATANYAG	0.5
I 1M4 EXTRAKTUM	Ö,1
j DEMINERALÍZÁLT VÍZ ys.	100

φφ ·♦<

BÖTILÉNGLÍKOL	5
CARBOMER	0,2
TRJETANO LAKÚN	1
POLiSZORBÁT-60	0,8
SZÖRBG'ÁN SZTEARÁT	0,6
FOLYÉKONY VAZELIN	'/
LANOLIN	03
ÍLesO D1PELARGONÁT	5
[bernaj TRIGLICERJD	5
CETIL ALKOHOL	035
[íacuna] DIRÁPRÍLÁT/DIKÁPRÁI'	5
GLICERÍL SZTEARÁT	3,00
NÖVÉNYI SZTÉRÖL	0,5
DIMETHICONE	0,5
SZEARÍNSAV	> .M,
PANTENOL	0,5
NÁTRHUM HYALURONAT	0,05
BISABOLOL	0,1
TOKOFERIL ACETÁT	1
SZÓJABABEXTRAKTÖM	0,5
KONZERVÁLÓSZER	0,8
ILLATANYAG	0,5
I 1844 EXTRAKTUM	0,25
DEMINERALIZÁLT VÍZ «.s.	100

Β ÚTI LENG L IKOL	5
KANTÁN GUMI	0,2
GLICL1GL SZTEARÁT	1
PEG SZTEARÁT	1
[Iscuna] TRIGI. ICERl D	5
CETIL ALKOHOL	0,5
TÍTÁNOXID	I
D1METH1CONE	3
POLIAKRILAMÍD	5
CERáMIDÖK	i
PÁNTÉRÓL	1
NÁTR1U Μ ΗYALURi)\ M	0,05
8ISABOLOL	0,1
TOKOFERIL ACBTÁT	1
KONZERVÁLŐSZER	0,7
ÍLLáTANYAG	0,5
I 1844 EXTRAKTUM	0,15
DEMINERALIZALT VÍZ </ 5.	100

> ♦ ••ί

PEG-32	5
FOSZFÁT PUFFER	0/1
Dl METIEGONE CÖPOLIOL	5
POLISZORBÁT-20	ÖJ.
PŐLIPRÖPl LENGE ÍR <>L	10
TENGERIPLÁNKTONEXTBAKTÓM	1
ALMAEXTRAKTUM	5
BISABOLOL	0,5
TOKOPTRÍL. ACETÁT	0,5
BÚZAFEHBRJE-EXTRÁRTUM	2
KONZERVÁLÓSZER	1
ILLATANYAG	0.3
I 1844 EXTRAKTUM	02
DEMINER ALIZ ALT VÍZ mv	100

♦ * ó, PÉLDA: GÉL

CARBOMER	1
SEMLEGESÍTŐ AN YAG	0,25
PROPÖSmKCÜ,	5
PANTENOL	1
ALOE VERA EXTRAKTUM	I
KÜKÖRICxAVÍRAGEXTRAKTUM	5
ÉLÉSZrŐEXi'RÁKTLAf	0.5
BÖZAEXTRAKTUM	0,25
NÁTRIUM HYALURONÁI	0,01
XONZBRVÁLŐSZER	0,7
1 1844 EXTRAKTUM	0,05
DEMÍNERALIZÁÉI VÍZ ö.s.	100

► * ♦ *·* * * ««4 * μα χ ♦ * * * ♦ * »:♦. ·?

CARBOMEK	0,5
TRIETANOLAMIN	0,5
SÖRBE ÁN SZÍBARÁT	L5
FEGSZTEAILAT	3
CETH, ALKOHOL	5
NÖyWVi OLAJ	20
TÍTÁNOXID	0,7
GLICEROL	7
TÖKÖELRÖE	0,75
almaextraktum	3
BíSABOLOL	0,5
RETINA. PALMITAT	0,5
NÁTRIUM HYALURÖNÁT	0,02
KOXZBRVALÖSZER	1
ILLATANYÁG	0,3
I IA44 EXTRAKTUM	OJ
FESTÉKEK,
OEMÍNERALIZÁLT VÍZ ex.	100

«* · *** * .i y <

: AKRÍL KOPOLIMER	1
' TRI ETANOL AMIN	Ϊ i
: GÚCEROL	15
C14~C 16 OLEFIN SZUEFONÁTOK	5
PEG ÉTER és (lacwsaj: COCOÁT	?
TENGERIPLÁNKTÖN-	1
EXTRAKTUM
ALMABXTRAKTUM	5
SZÖJABÁBÉXTRAKTUM	(U
[laeuna] ASZKORBÍL FOSZFÁT	3
SELYEMPROTEIN-EXTRAKTÜM	5 -X·
“konzerválöszer	0,8
ILLATANYAG·	0.5
1 1844 EXTRAKTUM	0,15
DEMINERzXtrZÁLT VÍZ q.s.	í 00

jl· ♦ ·»

Claims (15)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTI OK

   1. Kozmetikai készítmény, amely egy, a keratinociták 1E-6 termelését stimuláló, egy mikroorganizmus fermentációjából származó exlraktumot tartalmaz egy kozmetikai készítményeknél használatos hordozóanyaggal keverve.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a keratinociták IL-6 termelését stimuláló extraktum egy élesztő fermentációs terméke.
3. 3. A 2. igénypont szerinti készítmény. azzal jellemezve, hogy a keratinociták IL-6 termelését stimuláló extraktum előállítása egy Rhodolorula törzs fermentációjával történt.
4. 4. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve,' hogy a keratinociták IL-6 termelését stimuláló extraktum a Rhodolorula SEBR2002 törzs - amely a Pasteur Intézet C.N.C.M-nél 1 1844 számon lett letétbe helyezve - vagy annak termelő mutánsai fermentációjával állítható elő.
5. 5. A Rhodolorula SEBR2002 törzs, amely a Pasteur Intézet C.N.C.M-nél 1 1844 számon lett letétbe helyezve és annak termelő mutánsai.
6. 6. Eljárás keratinociták IL-6 termelését stimuláló extraktum előállítására, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerinti törzs tenyésztése egy fermentációs közegben a szokásos körülmények között történik mindaddig, amíg a ferméntlében a keratinociták IL-6 termelését stimuláló aktivitás létrejön.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárással előállított, keratinociták IL-6 termelését stimuláló hatású készítmény,
8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárással kapott, 7. igénypont szerinti készítmény, amelyben a biomassza felhasználása változatlan, vagy koncentrált formában történik.

   ♦ ♦ ♦ ·

   ·. * ··:

   ·· *
9. 9. Α 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan keratinociták 11-6 termelését stimuláló hatást mutat, amelynek SÍ stimuláeiós indexe 1,2 és 6 között van.
10. 10. A 7-9, igénypontok valamelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy előállítása a biomassza extrakciójávaí, az oldószerek és víz bepárlásával, és a száraz extraktum kozmetikai használatra alkalmas oldószemei való híeításával történik.
11. 11. A keratinociták IL-6 termelését stimuláló aktivitással rendelkező egy mikroorganizmus fermentációjából származó vegyület alkalmazása egy, a bőr öregedésének leküzdésére szánt kozmetikai készítmény gyártására.
12. 12. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, azza! jellemezve, hogy a vegyület előállítása egy élesztő fermentációjával történik.
13. 13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a vegyület előállítása egy Rhodotorula törzzsel, konkrétan a Pasteur Intézet C.N.C.M.-nél az 1 1844 számon letétbe helyezett Rh&d&tonda -SEBR- 2002 törzzsel vagy termelő mutánsaival történik.
14. 14. Egy Rhadotorula törzsnek, konkrétan a Pasteur intézet C.N.C.M.-nél az I 1844 számon letétbe helyezett Rhódotorula SEBR 2002 törzsnek vagy termelő mutánsainak az alkalmazása a keratinociták IL-6 termelését stimuláló aktivitással rendelkező vegyület előállítására.
15. 15. Kozmetikai kezelési eljárás, azzal jellemezve, hogy az IL-6 termelést stimuláló, egy mikroorganizmus fermentációjából származó vegyület kozmetikailag hatékony mennyisége egy kozmetikai hordozóanyagban kerül alkalmazásra az epidermiszen.