HU220530B1 - Daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló DNS-molekula és eljárás doxorubicin előállítására - Google Patents
Daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló DNS-molekula és eljárás doxorubicin előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU220530B1 HU220530B1 HU9603259A HUP9603259A HU220530B1 HU 220530 B1 HU220530 B1 HU 220530B1 HU 9603259 A HU9603259 A HU 9603259A HU P9603259 A HUP9603259 A HU P9603259A HU 220530 B1 HU220530 B1 HU 220530B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- daunorubicin
- doxorubicin
- leu
- hydroxylase
- arg
- Prior art date
Links
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 title claims abstract description 112
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 title claims abstract description 71
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 70
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 title claims abstract description 70
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 title claims abstract description 55
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 27
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 20
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 101000617808 Homo sapiens Synphilin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100021997 Synphilin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 16
- 101100224336 Neisseria gonorrhoeae dnrN gene Proteins 0.000 description 9
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 7
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 5
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 5
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 5
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 5
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 4
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GLEOIKLQBZNKJZ-WDSKDSINSA-N Pro-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GLEOIKLQBZNKJZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N Thr-Asp Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O IOWJRKAVLALBQB-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N apramycin Chemical compound O([C@H]1O[C@@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O[C@H]2C[C@H]1N)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](N)[C@@H](CO)O1)O)NC)[C@@H]1[C@@H](N)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O XZNUGFQTQHRASN-XQENGBIVSA-N 0.000 description 3
- 229950006334 apramycin Drugs 0.000 description 3
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 3
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 3
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 3
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 3
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 2
- JEOCWTUOMKEEMF-RHYQMDGZSA-N Arg-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JEOCWTUOMKEEMF-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- NGTYEHIRESTSRX-UWVGGRQHSA-N Arg-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N NGTYEHIRESTSRX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N Glu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 2
- UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N Ile-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O UCGDDTHMMVWVMV-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N L-Prolyl-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N Ser-Gly-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000187081 Streptomyces peucetius Species 0.000 description 2
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- AIISTODACBDQLW-WDSOQIARSA-N Trp-Leu-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 AIISTODACBDQLW-WDSOQIARSA-N 0.000 description 2
- GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N Val-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N Valyl-Serine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(O)=O STTYIMSDIYISRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 229930188550 carminomycin Natural products 0.000 description 2
- XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N carminomycin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N 0.000 description 2
- XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N carminomycin I Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950001725 carubicin Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150059643 dnrN gene Proteins 0.000 description 2
- HTRPPTAOBPKNBX-UHFFFAOYSA-N epsilon-Rhodomycinone Natural products CCC1(O)CC(O)c2c(O)c3C(=O)C4C(C=CC=C4O)C(=O)c3c(O)c2C1C(=O)OC HTRPPTAOBPKNBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PYFOXRACBORDCT-GOSXWKPOSA-N epsilon-rhodomycinone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1C(O)=C1[C@@H](O)C[C@@](CC)(O)[C@H](C(=O)OC)C1=C2O PYFOXRACBORDCT-GOSXWKPOSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 2
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N glycylvaline Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.O=C([C@@H]1O2)CC[C@H]3[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 description 1
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N Arg-Asn Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JSLGXODUIAFWCF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NMRHDSAOIURTNT-RWMBFGLXSA-N Arg-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N NMRHDSAOIURTNT-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- GRRXPUAICOGISM-RWMBFGLXSA-N Arg-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O GRRXPUAICOGISM-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- LXMKTIZAGIBQRX-HRCADAONSA-N Arg-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O LXMKTIZAGIBQRX-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YFHATWYGAAXQCF-JYJNAYRXSA-N Arg-Pro-Phe Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YFHATWYGAAXQCF-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QADCERNTBWTXFV-JSGCOSHPSA-N Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 QADCERNTBWTXFV-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- XQQVCUIBGYFKDC-OLHMAJIHSA-N Asn-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XQQVCUIBGYFKDC-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N Asp-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Asp-Ile Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010048610 Cardiotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- VBIIZCXWOZDIHS-ACZMJKKPSA-N Cys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS VBIIZCXWOZDIHS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N Glu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N Glu-Asn Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O TUTIHHSZKFBMHM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N Glu-Leu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YRMZCZIRHYCNHX-RYUDHWBXSA-N Glu-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O YRMZCZIRHYCNHX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N Gly-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N His-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N His-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N His-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CN=CN1 LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N His-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N His-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 HTOOKGDPMXSJSY-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N Idarubicin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N Idarubicin Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JSZMKEYEVLDPDO-ACZMJKKPSA-N Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O JSZMKEYEVLDPDO-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- LDRALPZEVHVXEK-KBIXCLLPSA-N Ile-Cys-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N LDRALPZEVHVXEK-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- QNBYCZTZNOVDMI-HGNGGELXSA-N Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 QNBYCZTZNOVDMI-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DRCKHKZYDLJYFQ-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- IDGRADDMTTWOQC-WDSOQIARSA-N Leu-Trp-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O IDGRADDMTTWOQC-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N Lys-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- WWPAHTZOWURIMR-ULQDDVLXSA-N Phe-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WWPAHTZOWURIMR-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- LNLNHXIQPGKRJQ-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 LNLNHXIQPGKRJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N Pro-Glu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BEPSGCXDIVACBU-IUCAKERBSA-N Pro-His Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CN=CN1 BEPSGCXDIVACBU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XSXABUHLKPUVLX-JYJNAYRXSA-N Pro-Ser-Trp Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O XSXABUHLKPUVLX-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- OIDKVWTWGDWMHY-RYUDHWBXSA-N Pro-Tyr Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=C(O)C=C1 OIDKVWTWGDWMHY-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- CWZUFLWPEFHWEI-IHRRRGAJSA-N Pro-Tyr-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CWZUFLWPEFHWEI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QKWYXRPICJEQAJ-KJEVXHAQSA-N Pro-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O QKWYXRPICJEQAJ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- AWJGUZSYVIVZGP-YUMQZZPRSA-N Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AWJGUZSYVIVZGP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000861269 Sarima bifurca Species 0.000 description 1
- 101100397226 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) isp4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000015473 Schizothorax griseus Species 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QGMLKFGTGXWAHF-IHRRRGAJSA-N Ser-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O QGMLKFGTGXWAHF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N Ser-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000011347 Stirtonanthus insignis Species 0.000 description 1
- 241001467544 Streptomyces galilaeus Species 0.000 description 1
- 241000187217 Streptomyces griseoruber Species 0.000 description 1
- 241000555752 Streptomyces peucetius subsp. caesius Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000187191 Streptomyces viridochromogenes Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N Thr-Asn Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- PQLXHSACXPGWPD-GSSVUCPTSA-N Thr-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PQLXHSACXPGWPD-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- JXKMXEBNZCKSDY-JIOCBJNQSA-N Thr-Asp-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O JXKMXEBNZCKSDY-JIOCBJNQSA-N 0.000 description 1
- DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N Thr-Gly-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- APIDTRXFGYOLLH-VQVTYTSYSA-N Thr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O APIDTRXFGYOLLH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- LCPVBXOHXMBLFW-JSGCOSHPSA-N Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)=CNC2=C1 LCPVBXOHXMBLFW-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- SCQBNMKLZVCXNX-ZFWWWQNUSA-N Trp-Arg-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)O)N SCQBNMKLZVCXNX-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- XQYHLZNPOTXRMQ-KKUMJFAQSA-N Tyr-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O XQYHLZNPOTXRMQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N Tyr-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000259 cardiotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical group 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000908 idarubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- CTMCWCONSULRHO-UHQPFXKFSA-N nemorubicin Chemical compound C1CO[C@H](OC)CN1[C@@H]1[C@H](O)[C@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2C3=C(O)C=4C(=O)C5=C(OC)C=CC=C5C(=O)C=4C(O)=C3C[C@](O)(C2)C(=O)CO)C1 CTMCWCONSULRHO-UHQPFXKFSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- -1 one Chemical class 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
A találmány tárgya egy daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló, 1. számúszekvenciával rendelkező izolált DNS-- molekula. A találmány szerintimegoldás értelmében továbbá egy daunorubicin-14-hidroxilázt kódolóDNS-t tartalmazó rekombináns vektorral végzett transzformációval egygazdasejt alkalmassá tehető a daunorubicin doxorubicinné történőátalakítására. A transzformációt követően a gazdasejt felhasználhatódoxorubicin termelésére. ŕ
Description
A találmány tárgya daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló DNS-molekula, és eljárás doxorubicin előállítására daunorubicinből, rekombináns DNS-sel transzformált gazdasejtből nyert enzim alkalmazásával.
A tumorellenes gyógyászatban a daunorubicin csoport antraciklinjei, például a doxorubicin, a karminomicin és az alkacinomicin a legszélesebb körben alkalmazott hatóanyagok közé tartoznak [F. Arcamone, Doxorubicin, Academic Press, New York, pp. 12-25 (1981); A. Grein, Process Biochem., 16, 34 (1981); T. Kaneko, Chimicaoggi, (5), 11 (1988); C. E. Myers et al., „Biochemical mechanisms of tumor cell kill”, in: Anthracycline and Antracenedione-Based Anti-Cancer Agents (Lown, J. W., ed.), Elsevier, Amsterdam, pp. 527-569 (1988); J. W. Lown, Pharmac. Ther., 60, 185-214 (1993)]. A különösen az orális úton végzett kezelés esetén kifejtett tumorellenes aktivitás fokozása, valamint a rák kezelésében történő alkalmazással együtt járó akut toxicitás és krónikus kardiotoxicitás csökkentése érdekében kémiai szintézissel már előállítottak javított daunorubicin- és doxorubicin-származékokat [Penco, Process Biochem., 75, 12 (1980); T. Kaneko, Chimicaoggi, (5), 11 (1988)]. Az ilyen analógok példái közé tartoznak - egyebek mellett - a következő vegyületek: 4’epi-doxorubicin (epirubicin), 4dimetoxi-daunorubicin (idarubicin), valamint metoximorfolino-doxorubicin.
Az antraciklinek a természetben előforduló vegyületek, amelyeket az Actinomyces carminata, valamint különféle Streptomyces törzsek (S. peucetius, S. coeruleobidus, S. galilaeus, S. griseus, S. griseoruber, S. insignis, S. viridochromogenes, S. bifurcus és a Streptomyces sp. C5 törzs) termelnek. A doxorubicint elsősorban a Streptomyces peucetius subsp. caesius termeli, míg a daunorubicint a Streptomyces peucetius, valamint a fentiekben ismertetett egyéb Streptomycesek állítják elő. A következő típustörzsek bárki számára hozzáférhetők: S. peuceticus subsp. caesius IMRU 3920 (azonos az ATCC 27952-vel; a továbbiakban alkalmazott rövidítése: „S. peuceticus 3920”), S. peuceticus ATCC 29050 („S. peuceticus 29050”), S. peuceticus subsp. caesius ATCC 27952 („S. peuceticus 27952”), valamint a daunorubicint nem termelő S. peuceticus dnrN:: aphll mutáns [,,S. peuceticus dnrN”; S. L. Otten, J. Ferguson, and C. R. Hutchinson, J. Bacteriol., 177, 1216-1224 (1995)]. Közelebbről az S. peuceticus 27952 a 3 590 028. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és az S. peuceticus 29050 a 4 012 284 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban került ismertetésre, míg az S. peuceticus dnrN már letétbe van helyezve a következő helyen : American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok (deponálási szám: ATCC 55607). Az S. peuceticus ATCC 55607 az S. peuceticus ATCC 29050 származtatható oly módon, hogy a dnrN gént egy olyan mutáns dnrN génnel helyettesítik, amelybe a dnrN funkció megszüntetése érdekében előzetesen a Sáli helynél a Tn5-ből [J. M. Ward et al., Mól. Gén. Génét., 203, 468-475 (1986)] származó aphll gént inszertálták. Az S. peuceticus ATCC 55607 törzs - az 50 pg/ml kanamicint tartalmazó ISP4 médiumon (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, Amerikai Egyesült Államok) végzett tenyésztéssel meghatározva - neomicinnel vagy kanamicinnel szemben rezisztens, és nem termel doxorubicint, daunorubicint, illetve olyan anyagokat sem, amelyek a doxorubicin vagy a daunorubicin bioszintézisének intermedierei (S. L. Otten et al., közlésre elfogadva). Az antraciklin doxorubicint az S. peuceticus 27952 malonsavból, propionsavból és glükózból azon az úton keresztül állítja elő, amely a következő szakirodalmi helyeken került összefoglalásra: Grein, Adván. Appl. Microbiol., 32, 203 (1987); valamint Eckardt and Wagner, J. Basic Microbiol., 28, 137 (1988). Az ε-rodomicinon, a karminomicin és a daunorubicin bizonyítottan ennek az eljárásnak az intermediere. Az eljárás utolsó lépése során a daunorubicin doxorubicinné hidroxileződik, amelyről azt írják, hogy csak az S. peuceticus 27952-ben történik meg [F. Arcamone etal., Biotechnoi. Bioing., 77, 1101 (1969)]. A 61 737 számú európai szabadalmi bejelentésben a daunorubicin doxorubicinné történő biokonverziójára egy olyan eljárást ismertetnek, amely körülbelül 30%-os kitermeléssel eredményezi a kívánt terméket; az eljárás során a daunorubicint nem termelő mutáns S. peuceticus ATCC 31847 mutánst alkalmazzák, amelyet úgy nyertek, hogy az ATCC 27952 törzset A-metil-TV'nitro-Y-nitrozo-guanidinnel reagáltatták. Ugyanakkor azonban ipari méretekben a daunorubicin doxorubicinné történő átalakítását szokásosan - a 3 803 124 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárásnak megfelelően - kémiai úton hajtják végre.
A daunorubicin-bioszintézishez és a daunorubicinrezisztenciához felhasználható géneket nyertek klónozási kísérletekkel S. peuceticus 29050-ből és S. peuceticus 27952-ből [Stutzman-Engwall and Hutchinson, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 86, 3135 (1988); Otten et al., J. Bacteriol., 172, 3427 (1990)]. Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy ha a Sterptomycesbe 1326 lividánst visznek be, a klónozott gének a gazdaszervezetet alkalmassá teszik ε-rodomicinon termelésére, illetve klónozott gének hatására a gazdaszervezet a daunorubicinnel és a doxorubicinnel szemben rezisztenssé válik.
A jelen találmány egy daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló, izolált DNS-molekulára vonatkozik, a daunorubicin-14-hidroxiláz alakítja át a daunorubicint doxorubicinné. A DNS-molekula jellegzetesen lényegében az 1. számú szekvenciából épül fel (az 1. számú szekvenciát a továbbiakban „dxrA” szekvenciaként is hivatkozzuk). Az 1. számú szekvencia által kódolt daunorubicin-14-hidroxiláz aminosavszekvenciáját a 2. számú szekvencia mutatja be.
A találmány szerinti DNS-molekula magában foglalhatja az 1. ábra szerinti 3,4 kb Sphl fragmentum egy részét vagy egészét. A daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló szekvencia az Sphl fragmentumnak a KpnI és BamHI helyei között van. A találmány szerinti DNSmolekula tartalmazhatja a 2. ábra szerinti Ndel-BamHI fragmentum egy részét vagy egészét is. A 2. ábra szerinti Ndel-BamHI fragmentum az 1. ábra szerinti,
HU 220 530 Bl valamivel nagyobb KpnI-BamHI fragmentumból származott.
Amennyiben a találmány szerinti DNS-molekula a
3,4 kb Sphl fragmentumnak vagy az Nde-BamHI fragmentumnak csak egy részét tartalmazza, akkor ennek a résznek daunorubicin-14-hidroxilázként kell funkcionálnia (azaz ennek a résznek át kell alakítania a daunorubicint doxorubicinné). A rész jellegzetesen legalább 1,2 kb hosszúságú, előnyösen 1,2-3,4 kb hosszúságú, még előnyösebben 1,2-1,4 kb hosszúságú. A rész lehet egy restrikciós enzimfragmentum, például az 1. ábra szerinti KpnI-BamHI fragmentum.
A találmány kiterjed az olyan DNS-molekulára is, amely egy, a 2. számú szekvenciával legalább 60%-ban azonos szekvenciával rendelkező daunorubicin-14-hidroxilázt kódol. A találmány magában foglal egy olyan daunorubicin-14-hidroxilázt is, amelynek aminosavszekvenciája legalább 60%-ban azonos a 2. számú szekvenciával. A szekvencia legalább 80%-ban, legalább 90%ban, legalább 95%-ban, legalább 98%-ban vagy legalább 99%-ban lehet azonos a 2. számú szekvenciával.
A 2. számú szekvencia szubsztitúcióval, delécióval, inszercióval, extenzióval, fúnkcionalizálással vagy kémiai módosítással módosítható. Egy szubsztitúció, deléció, inszerció vagy extenzió egy vagy több aminosavat, például egy, kettő, három, négy, öt, nyolc, tizenöt vagy húsz aminosavat érinthet. A 2. számú szekvencia fizikai-kémiai jellegének általában meg kell maradnia a módosított szekvenciákban. A módosított szekvencia töltésének, hidrofób/hidrofil jellegének és méretének általában hasonlónak kell lennie. Felhasználhatók azok a szubsztitúciók, amelyek a következő csoport aminosavából egy olyan aminosavat eredményeznek, amelyet ugyanazon csoportnak egy másik aminosava szubsztituál:
H, R és K
I, L, V és M
A, G, S és T
D, E, P és N
A módosított szekvenciákat kódoló DNS-molekulákat szokásos módszerekkel, így például hagyományos DNS-szintézis, helyre irányuló mutagenezis és rekombináns RNS-technikák alkalmazásával állíthatjuk elő. Alkalmas módszereket ismertetnek például a következő kézikönyben: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, Amerikai Egyesült Államok. A daunorubicin-14-hidroxiláz-aktivitásra nézve a származtatott szekvenciákkal rendelkező proteineket egyszerűen tesztelhetjük, például az alábbi példákban ismertetett eljárás alkalmazásával.
Az expresszálandó találmány szerinti DNS-molekulák által kódolt daunorubicin-14-hidroxiláz esetén a DNS a saját transzkripciós kontrollszekvenciáját, és különösen a saját promoterszekvenciáját hordozhatja, amely szekvencia működőképesen a kódolószekvenciához kapcsolódik, és amely szekvenciát egy gazdasejtRNS-polimeráz felismer. Alternatív módon a DNS-t megfelelőképpen egy heterológ transzkripciós kontroliszekvenciához ligálhatjuk, illetve egy vektorba klónozhatjuk egy olyan restrikciós helynél, amely restrikciós hely megfelelő módon a vektor transzkripciós kontroliszekvenciájának szomszédságában helyezkedik el.
A daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló DNS-molekula egy rekombináns DNS-t klónozó vagy expresszáló vektor lehet. Bármely olyan, autonóm módon replikáié és/vagy integráló szer felhasználható, amely egy olyan DNS-molekulát tartalmaz, amely DNS-molekulához egy vagy több további DNS-szegmens hozzáadható. Jellegzetesen azonban a vektor egy plazmid. Előnyös plazmid a nagy másolatszámú pWHM3 vagy pIJ702 plazmid [Katz et al., J. Gén. Microbiol., 129, 2703 (1983)]. Alkalmas plazmidok a következők is: pIJ385 [Mayeri et al., J. Bacteriol., 172, 6061 (1990)]; pIJ680 [Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Nagy-Britannia (1985)]; pWHM601 [Guilfoile and Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8553 (1991)]; vagy pSET152 [Bierman et al., Gene, 116, 43-49 (1992)]. A DNS-nek a vektorba történő inszertálásához bármely alkalmas módszer felhasználható. Az inszerciót végrehajthatjuk például úgy, hogy a DNS-t egy megfelelő restrikciós helynél egy linearizált vektorba ligáljuk. Ehhez felhasználhatjuk a tapadó- vagy tompavégek közvetlen kombinálását, a homopolimer átfordítást (tailing), illetve alkalmazhatunk egy kötő- vagy adaptermolekulát.
A rekombináns vektort felhasználhatjuk egy alkalmas gazdasejt transzformálására vagy transzfektálására. A gazdasejtek daunorubicin- vagy doxorubicin-érzékeny gazdasejtek lehetnek, azaz olyan gazdasejtek, amelyek a daunorubicin vagy a doxorubicin bizonyos mennyiségének a jelenlétében nem képesek növekedni, illetve daunorubicin- vagy doxorubicin-rezisztens gazdasejtek lehetnek. A gazdaszervezet egy mikroorganizmus, például egy baktérium lehet. Az S. peuceticus törzsek, különösen az S. peuceticus dnrN vagy a Streptomyces species egyéb törzsei, amelyek nem termelnek, illetve amelyek termelnek antaciklineket, ennek megfelelően transzformálhatok. A Streptomyces törzsek transzformánsait jellegzetesen protoplaszttranszformációval nyerjük. A vektorokat nem Streptomycesekben, például E. coliban expresszálhatjuk.
A transzformált gazdaszervezet útján nyert daunorubicin-14-hidroxilázt felhasználhatjuk a daunorubicinnek doxorubicinné történő biokonvertálásához. A módszer lehetőséget nyújt arra, hogy egy fermentációs eljárással előállított és daunorubicint tartalmazó sejtextraktumból kiindulva nagy tisztaságú doxorubicint állíthassunk elő.
A biokonverziós eljárást végrehajthatjuk úgy, hogy közvetlenül a szabad vagy immobilizált transzformált sejteket alkalmazzuk, illetve eljárhatunk úgy is, hogy izoláljuk a daunorubicin-14-hidroxiláz proteint, majd ezt használjuk szabad formában, vagy pedig ismert módszerek szerint gyantákhoz, üveghez, cellulózhoz vagy ezekhez hasonló más anyagokhoz, ionos vagy kovalens kötésekkel rögzített formában, illetve a szubsztrát számára permeábilis szálakhoz graftolt formában vagy tér3
HU 220 530 Β1 hálósítással oldhatatlanná tett formában. A daunorubicin-14-hidroxiláz proteint felhasználhatjuk továbbá a nyers celluláris extraktum formájában is. A daunorubicin doxorubicinné történő biokonverziójának fokozása érdekében a találmány szerinti rekombináns vektort is felhasználhatjuk egy alkalmas, daunorubicint termelő gazdasejt transzformálására. A gazdasejtek olyanok lehetnek, amelyek daunorubicin- vagy doxorubicin-rezisztensek, azaz amelyek a daunorubicin vagy a doxorubicin bármilyen mennyiségének a jelenlétében is képesek növekedni. Az S. peuceticus törzsek, különösen az S. peuceticus 29050, valamint a Streptomyces species antraciklineket termelő egyéb törzsei ennek megfelelően transzformálhatok. A Streptomyces törzsek transzformánsait jellegzetesen protoplaszttranszformáció útján nyerjük.
A találmány magában foglal egy eljárást doxorubicin előállítására, amelynek során
i) egy találmány szerinti vektorral transzformált vagy transzfektált gazdasejtet daunorubicin jelenlétében olyan körülmények között tenyésztünk, amely körülmények között a daunorubicin doxorubicinné alakul át, és ii) a doxorubicint elkülönítjük a tenyészetből.
Ebben az eljárásban a gazdasejtet 20 °C és 40 °C közötti hőmérséklet-tartományban, például 30 °C és 37 °C közötti hőmérsékleteken tenyészthetjük. A daunorubicin jelenlétében végzett tenyésztés időtartama 6-96 óra, például 12-72 óra lehet. A tenyésztést előnyösen mozgatás mellett hajtjuk végre. A tenyészetben a daunorubicin koncentrációja 2-200 pg/ml, például 10-100 pg/ml lehet. A daunorubicint hozzáadhatjuk a tenyésztőmédiumhoz a tenyésztés kezdetekor, illetve a daunorubicint a tenyésztés ideje alatt a gazdasejt termeli.
A találmány szerinti DNS-molekulákat az S. peuceticus 29050 genom-DNS-éből nyerhetjük. Az S. peuceticus 29050 már letétbe van helyezve a következő helyen: American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok (deponálási szám: ATCC 29050). Felhasználhatjuk továbbá például az S. peuceticus 29050-ből származó S. peuceticus 27952 törzset is, amely szintén alkalmas a daunorubicin doxorubicinné történő átalakítására. Ennek megfelelően a DNS-molekulákat úgy állíthatjuk elő, hogy
a) előállítjuk az S. peuceticus 29050 vagy egy ebből származó törzs genom-DNS-ének egy könyvtárát;
b) a könyvtárból kiválasztunk egy olyan kiónt, amely alkalmas a daunorubicin doxorubicinné történő átalakítására; és
c) a kiválasztott kiónból izolálunk egy találmány szerinti DNS-molekulát.
Az a) lépésben a könyvtárat például úgy állíthatjuk elő, hogy az S. peuceticus 29050 vagy egy ebből származó törzs genom-DNS-ét részlegesen emésztjük; vagy úgy, hogy kiszűrjük (szkríneljük) az S. peuceticus genom-DNS-nek egy olyan könyvtárát, amelyben feldúsult a daunorubicinbioszintézis-gének csoportja (cluster), illetve amely specifikusan csak a daunorubicinbioszintézis-gének csoportját tartalmazza. A genom-DNS esetén előnyösen az Mbol restrikciós enzimet használjuk, de a daunorubicinbioszintézis-gének csoportját tartalmazó könyvtár esetén előnyösen a BamHl vagy az Sphl restrikciós enzimet alkalmazzuk. Az így nyert DNS-fragmentumokat méret szerint ffakcionálhatjuk; a genom-DNS számára a 3-5 kb méretű fragmentumok az előnyösek, míg a daunorubicinbioszintézis-gének csoportját tartalmazó könyvtárból származó DNSfragmentumokhoz a 13,5 kb méretű BamHl vagy a 3,4-4,9 kb Sphl az előnyös. Ezeket a fragmentumokat egy linearizált vektorba, például pWHM3, pIJ702 vagy pKC505 vektorba [M. A. Richardson et al., Gene, 61, 231 (1987)] ligáljuk. A gazdasejteket a ligálási keverékkel transzformáljuk. Jellegzetesen a gazdasejtek nem képesek daunorubicint termelni, valamint daunorubicinés doxorubicin-érzékenyek lehetnek; például a gazdasejtek 10 pg/ml vagy ennél kisebb koncentrációjú daunorubicinre vagy doxorubicinre érzékenyek, így például a S. lividans JI1326 protoplasztok [Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Nagy-Britannia (1985)] transzformálhatok.
A b) lépésben az így nyert transzformánsokat annak alapján válogatjuk (szkríneljük), hogy milyen mértékben képesek felvenni a daunorubicint, átalakítani azt doxorubicinné, valamint kiválasztani a doxorubicint. A daunorubicint doxorubicinné átalakítani képes kiónokat úgy azonosítjuk, hogy egy daunorubicint tartalmazó tenyésztőközeg extraktumait a doxorubicin jelenlétére nézve kromatográfiás úton analizáljuk. Az ilyen kiónokat izoláljuk, és a bennük lévő rekombináns vektorokat extraháljuk. A rekombináns vektoroknak a c) lépésben alkalmas restrikciós enzimekkel végzett emésztése során az egyes vektorokba inszertált S. peuceticus 29050 DNS-t azonosíthatjuk, meghatározhatjuk a méretét és genetikai térképét. Ily módon ellenőrizhető, hogy a vektor tartalmazza-e a találmány szerinti DNS-molekulát.
Ezen túlmenően két vagy több olyan, átlapolóinszert is izolálható, amelyeket a találmány szerinti DNS teljesen vagy részlegesen átölel. Egy találmány szerinti DNS előállításához ezeket az inszerteket egy közös restrikciós helyen végzett hasítással, majd ezt követő ligálással összeilleszthetjük, kívánt esetben megfelelő restrikciós enzimekkel végzett hosszrövidítés alkalmazása mellett. Egy, a daunorubicin-14-hidroxiláz proteint kódoló gént tartalmazó inszert-DNS restrikciós fragmentumait a c) lépésben megkaphatjuk úgy is, hogy egy inszert-DNS-t egy megfelelő restrikciós enzimmel hasítunk.
A következő példák a találmány illusztrálására szolgálnak.
Az ábrák rövid ismertetése
Az 1. ábra egy találmány szerinti DNS restrikciós térképét mutatja be. Ez egy, a pIS70 rekombináns plazmidban lévő inszert, amelyet úgy állítottunk elő, hogy egy Escherichia coli-Streptomyces ingázó (shuttle)vektor, nevezetesen a pWHM3 plazmid [Vara et al., J. Bacteriol., 171, 5872 (1989)] Sphl helyébe egy olyan, a daunorubicin-14-hidroxiláz (dxrA) gént tartalmazó 3,4 kb Sphl DNS-fragmentumot inszertáltunk, amelyet pIS62 rekombináns plazmidból, a pIS62 re4
HU 220 530 Bl kombináns plazmid SphI-gyel végzett részleges emésztésével nyertünk. Az 1. ábrán látható térkép nem tartalmazza szükségszerűen a DNS-szegmensben lévő összes restrikciós hely teljes felsorolását. Ugyanakkor azonban az ott feltüntetett helyek elegendőek a szegmensek egyértelmű felismeréséhez.
A 2. ábra ugyancsak egy találmány szerinti DNS restrikciós térképét ábrázolja. Ez egy, a pWHM969 rekombináns plazmidban lévő inszert, amelyet úgy állítottunk elő, hogy a pET14B E. coli expressziós plazmidvektor [Novagen, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok] Ndel és BamHI helyeibe egy olyan, 1,33 kb Ndel/BamHI DNS-fragmentumot inszertáltunk, amelyet a pIS70 1,36 kb KpnI/BamHI DNS-fragmentumból helyre irányuló mutagenezissel nyertünk. Közelebbről, egy Ndel restrikciós helyet (5’-CAT ATG/3’) inszertáltunk az 1,36 kb KpnI/BamHI DNSfragmentumba, mégpedig oly módon, hogy a daunorubicin-14-hidroxiláz gén GTG startkodonját, valamint a két nukleotidot közvetlenül a startkodont megelőzően mutagenizáltuk, és így reprodukáltuk az Ndel restrikciós enzim által felismert targetszekvenciát. Annak érdekében, hogy a daunorubicin-14-hidroxiláz gén E. coliban megfelelő hatékonysággal expresszálódjon, az 1. számú szekvencia esetén látható eredeti (wild) típusú szekvenciát az E. coli esetén szokásos kodonnak megfelelően mutagenizáltuk. A 2. ábrán látható térkép nem tartalmazza szükségszerűen a DNS-szegmensben lévő összes restrikciós hely teljes felsorolását. Ugyanakkor azonban az ott feltüntetett helyek elegendőek a szegmensek egyértelmű felismeréséhez.
A 3. ábra dxrA expressziós vektorokkal transzformáit és IPTG-vel négy órán keresztül indukált Escherichia coliból származó sejtextraktumok Comassie-festéses SDS-poliakrilamid-géljét ábrázolja.
Az ábrán az egyes oszlopok a következőket mutatják: 1. oszlop=pWHM969 expressziós vektorral transzformáit E. coli (a dxrA molekulatömege 42 280); 2. oszlop=pET-14b-vel transzformált E. coli (negatív kontroll); 3. oszlop=molekulatömeg-standardok.
Anyagok és módszerek
Bakteriális törzsek és plazmidok
A DNS-fragmentumok szubklónozására az ampicillinre és aprimicinre érzékeny DH5a E. coli törzset használjuk. A dxrA gén expresszálására a következőket alkalmazzuk: S. lividans ZX1 (Zhou et al., Nucleic Acids Rés., Vol. 16, No. 10., 4341 (1988)] és S. peuceticus dnrN [S. L. Otten, J. Ferguson, and C. R. Hutchinson, J. Bacteriol., 177, 1216-1224 (1995)]. A plazmidklónozó vektor pUC18/19 [Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103 (1985)] és pWHM3 [Vara et al., J. Bacteriol., 171, 5872(1989)] volt.
Médiumok és pufferek
Az E. coli DH5a törzs fenntartását LB agaron [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, Amerikai Egyesült Államok (1989)] végezzük. A transzformánsok szelektálásához 100 pg/ml koncentrációban ampicillint vagy 50 pg/ml koncentrációban apramicint alkalmaztunk. A spórák előállításához, valamint a protoplasztok regenerálásához az S. lividans törzs fenntartását R2YE agaron [Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation,
Norwich, Nagy-Britannia (1985)] végezzük.
A DNS-fragmentumok szubklónozása Megfelelő restrikciós enzimekkel DNS-mintákat emésztünk, majd standard módszerek [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, Amerikai Egyesült Államok (1989)] alkalmazásával agarózgéleken elválasztást hajtunk végre. A lényeges DNS-fragmentumokat tartalmazó agarózszeleteket kivágjuk a gélből, majd GENECLEAN berendezés (BiolOl, La Jolla, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) vagy egy ezzel ekvivalens eszköz alkalmazásával a kimetszett szeletekből izoláljuk a DNS-t. Standard módszerek [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed,, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, Amerikai Egyesült Államok (1989)] alkalmazásával az izolált DNS-fragmentumokat az expressziós és a biotranszformációs kísérletekhez - az előbbi sorrendnek megfelelően - E. coli vektorokba és E. coli-Streptomyces ingázó vektorokba szubklónozzuk.
A Streptomyces species és az E. coli transzformációja A kalcium-kloridos módszerrel [Sambrook et al.,
Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, Amerikai Egyesült Államok (1989)] kompetens E. coli-sejteket állítunk elő, majd a sejteket standard módszerek [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, Amerikai Egyesült Államok (1989)] alkalmazásával transzformáljuk. S. lividans ZX1 micéliumot tenyésztünk YEME médiumban [Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Nagy-Britannia (1985)], majd a micéliumot 48 óra elteltével kinyerjük. A micéliumpelletet 10,3%-os szacharózoldattal kétszer mossuk, majd a Hopwood-féle kézikönyvben [Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Nagy-Britannia (1985)] ismertetett eljárás szerint protoplasztok előállítására használjuk fel. A protoplasztpelletet körülbelül 300 μΐ P. pufferben [Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Nagy-Britannia (1985)] szuszpendáljuk, majd az egyes transzformációkhoz ennek a szuszpenziónak az 50 μΐ-es részleteit használjuk. A protoplasztokat a kis mennyiségekre vonatkozó Hopwood-féle transzformációs eljárás [Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Nagy-Britannia (1985)] szerint plazmid-DNS-sel transzformáljuk. Az R2YE médiumon 37 °C hőmérsékleten 17 órán keresztül végzett regenerálás után a lemezeket 50 pg/ml tiostreptonnal fedjük be, majd a tenyésztést 30 °C hőmérsékleten spórásodásig végezzük.
HU 220 530 Β1
A daunorubicin biokonverziója doxorubicinné
A találmány szerinti plazmidot tartalmazó S. lividans ZX1 és S. peuceticus dnrN transzformánst 10 pg/ml tiostreptont tartalmazó folyékony R2YE médiumba inokulálunk. Harminc °C hőmérsékleten két napon keresztül végzett tenyésztés után a tenyészet
2,5 ml-ét 25 ml olyan termelőközeghez [McGuire et al., Process Biochem., 14, 2-5 (1979)] adjuk, amely 20 pg/ml tiostreptont tartalmaz. A tenyészeteket forgó rázógépen elhelyezett Erlenmeyer-lombikokban 280 fordulat/perc mellett 30 °C hőmérsékleten 72 órán keresztül növesztjük, majd ezt követően a tenyészetek 10 ml-es részleteihez 5 mg/ml koncentrációjú vizes daunorubicin-oldatot adunk olyan mennyiségben, amelynek eredményeként a daunorubicinre nézve 20 pg/ml végkoncentrációt hozunk létre. A rázógépen 24 órán keresztül további inkubálást végzünk, majd az inkubációt 60 percen át 55 °C hőmérsékletű vízfürdőn folytatjuk. Az antraciklin metabolitok glikozides formáinak hidrolízise érdekében ezt követően 25 mg/ml koncentrációjú oxálsavat adunk a keverékekhez.
A tenyészetekből 10 ml 1:1 térfogatarányú acetonitril/metanol oldószereleggyel extraháljuk a metabolitokat; az extrakciót forgó rázógépen, 280 fordulat/perc mellett, 30 °C hőmérsékleten és 30 percen keresztül végezzük. Az extraktumot szűrjük, majd a szűrletet fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia (reversed-phase high pressure liquid chromatography; RPHPLC) alkalmazásával analizáltuk. Az RP-HPLC-t 4,6x250 mm-es, 5 pm részecskeméretű Vydac C18 kolonna alkalmazásával, 0,385 ml/perc áramlási sebesség mellett hajtjuk végre. Az A mozgó fázis trifluor-ecetsav (TFA, Pierce Chemical Co.) 0,1%-os vizes oldata, míg a B mozgó fázis trifluor-ecetsav 0,078%-os acetonitriles (J. T. Baker Chemical Co.) oldata. Az elúciót lineáris gradienssel hajtjuk végre, amelynek során a 20% A fázis a B fázisban összetételű kiindulási eluenst 33 perc alatt 60% A fázis a B fázisban összetételű oldószereleggyé módosítjuk. A folyamatos detektálást egy diódaelrendezésű detektorral 488 nm hullámhosszon (12 pm-es sávszélesség mellett) végezzük. Külső standardként 10 pg/ml metanolos daunorubicinoldatot és doxorubicin-oldatot alkalmazunk a tenyészetekből izolált daunorubicin és doxorubicin metabolitok mennyiségének a meghatározásához.
1. példa
A daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló dxrA gén klónozása
Stutzman-Engwall és Hutchinson számos kozmidklónt ismertettek [Stutzman-Engwall and Hutchinson, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 86, 3135 (1988)], amilyenek például a pWHM337 és a pWHM338, valamint az ekvivalens törzsekből nyert hasonló kiónok, amelyek hozzávetőleg 20-90 kb S. peuceticus29050 genomDNS-t reprezentálnak. A BamHI-vel végzett részleges emésztés után a DNS-eket kombináljuk és ismételten ligáljuk, majd a plazmidok így nyert keverékét (amely az E. coli DH5-ben és a Streptomyces spp-ben replikálódni képes pKC505 vektort tartalmazza, illetve egy ezzel ekvivalens vektort tartalmaz) használjuk fel az E. coli DH5nek az apramicinrezisztencia (illetve az alkalmazott vektor szelekciójához megfelelő rezisztencia) kialakítására szolgáló transzformálására. Tizenhat apramicinrezisztens E. coli-klónból származó plazmid-DNS-eket vezetünk be S. lividans ZXl-be, majd a transzformánsokat a daunorubicin doxorubicinné történő biokonverziójára nézve analizáljuk, annak megfelelően, ahogyan azt az „Anyagok és módszerek” című fejezetben ismertettük. Egy transzformánsból izoláljuk a pIS23 plazmidot, amely a hozzáadott daunorubicint legfeljebb 3%-os konverzióval alakítja át doxorubicinné, és amely egy olyan
13,5 kb inszertet tartalmaz, amely magában foglalja az
1. ábrán látható restrikciós térkép régióját. A pIS23-ban lévő inszertet használjuk fel egy 4,9 kb BglIII/Clal DNS-szegmensnek egy pUC18-cal emésztett BamHI-be és Accl-be történő szubklónozására. Az így nyert plazmidból egy 4,9 kb EcoRI/HindlII szegmenst nyerünk, amelyet a pIS62 plazmid előállításához pWHM3-mal emésztett Eci-RI-be és HindlII-ba szubklónozunk. S. lividans ZX1 (pIS62) transzformánsokat állítunk elő annak megfelelően, ahogyan azt az ,Anyagok és módszerek” című fejezetben ismertettük, majd ezeket a daunorubicin -> doxorubicin biokonverziós képességükre nézve teszteljük. Ezek a transzformánsok legfeljebb 16%-os konverzió mellett képesek átalakítani a daunorubicint doxorubicinné. A pIS62-ból egy 3,4 kb Sphl DNS-szegmenst klónozunk a pWHM3 Sphl helyébe, és így pIS70 plazmidot nyerünk (1. ábra). S. lividans ZX1 (pIS62) transzformánsokat állítunk elő annak megfelelően, ahogyan azt az , Anyagok és módszerek” című fejezetben ismertettük, majd ezeket a daunorubicin->doxorubicin biokonveiziós képességükre nézve teszteljük. Ezek a transzformánsok legfeljebb 22%-os konverzió mellett képesek átalakítani a daunorubicint doxorubicinné.
2. példa
A daunorubicin átalakítása doxorubicinné egy olyan sejt alkalmazásával, amely tartalmazza a daunorubicin- 14-hidroxiláz gént, de amelyben más daunorubicin gének termékei nincsenek jelen A tiostreptonrezisztencia esetén végzett szelekcióval végrehajtott transzformáció útján pIS62 és pIS70 plazmidokat vezetünk be az S. peuceticus dnrN törzsbe az .Anyagok és módszerek” című fejezetben ismertetett eljárásoknak megfelelően. Az így nyert S. peuceticus dnrN(pIS62) transzformánsokat a daunorubicin -> doxorubicin biokonverziós képességükre nézve teszteljük. Ezek a transzformánsok akár legfeljebb 58%-os konverzió mellett képesek átalakítani a daunorubicint doxorubicinné. A kapott S. peuceticus dnrN(pIS70) transzformánsokat a daunorubicin -+ doxorubicin biokonverziós képességükre nézve teszteljük. Ezek a transzformánsok akár 100%-os konverzió mellett képesek átalakítani a daunorubicint doxorubicinné.
3. példa
A dxrA expresszálása Escherichia coliban A kereskedelmi forgalomban megvásárolható pET14b expressziós vektor (Novagen, Madison, Wisconsin,
HU 220 530 Bl
Amerikai Egyesült Államok) a T7 promoter által irányított rendszeren alapul. Amennyiben az Ndel restrikciós helyet használjuk, a pET-14b lehetővé teszi egy, az Nterminálisnál egy His-Tag-gal fuzionált klónozott protein expresszióját. 5
Egy, a pIS70 vektorból (1. ábra) származó, a teljes dxrA gént tartalmazó 1373 bp KpnI-BamHI fragmentumot klónoztunk pUC 19-be [Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103 (1985)]. A kapott plazmidból eltávolítottunk egy Sall-BamHI fragmentumot, amelyet egy 10 KpnI-Sall linkerhez ligáltunk. A KpnI-Sall linkért két oligonukleotid (az 51 tagú 3. számú szekvencia és az 59 tagú 4. számú szekvencia) alkalmazásával állítottuk elő. Az említett két oligonukleotidot úgy szintetizáltuk, hogy dxrA első kodonját ATG-re cseréltük, 15 ami egy Ndel helyet hozott létre, valamint a negyedik, hatodik és hetedik kodon harmadik pozícióját úgy változtattuk meg, hogy az visszatükrözze a nagymértékben expresszált E. coli-génekben leggyakrabban alkalmazott kodont, és így fokozzuk a dxrA expresszióját. 20 A kapott Ndel-BamHI fragmentumot pEZ-14b-be klónoztuk.
A dxrA gén expressziójához alkalmazott E. coli gazdaszervezet a kereskedelmi forgalomban megvásárolható (Novagen, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok) BL21 törzsnek egy XDE3 lizogénje volt. A dxrA expresszióját IPTG-nek a következő eljárásnak megfelelő hozzáadásával indukáltuk.
Egy frissen csíkozott pWHM969 (2. ábra) lemezről nyert egyetlen teleppel 100 ml 2xYT-t és 50 pg/ml ampicillint inokuláltunk. A sejteket 37 °C hőmérsékleten 00^=0,4-1,0 érték eléréséig tenyésztettük.
A dxrA expresszióját 4 mM IPTG hozzáadásával indukáltuk, majd az inkubációt 3-4 órán keresztül folytattuk.
A tenyészet 0,5 ml-ét mikrocentrifugában egy percen keresztül 14 000 fordulat/perc mellett centrifugáltuk, a felülúszót félretettük, míg a pelletet 50 pl Laemmli-pufferben [Laemmli, Natúré (London), 227, 680 (1970)] szuszpendáltuk és a szuszpenziót 5 percen keresztül forraltuk. A forralt mintában lévő proteineket standard módszerek [Laemmli, Natúré (London), 227, 680 (1970)] alkalmazásával 10% SDS-poliakrilamidgélen analizáltuk, amelynek során összehasonlító anyagként az olyan pET-14b vektort használtuk, amely nem tartalmazott sxrA gént.
A daunorubicin-14-hidroxiláz protein Mr 42 280 értéknél vándorol.
SZEKVENCIAJEGYZÉK (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓK:
(i) BEJELENTŐ:
(A) NÉV: PHARMACIA S. P. A.
(B) UTCA: VIA KOCH 1.2 (C) VÁROS: MILÁNÓ (E) ORSZÁG: OLASZORSZÁG (F) POSTAI IRÁNYÍTÓSZÁM: 20152 (G) TELEFON: *39-2-48385045 (H) TELEFAX: *39-2-48300578 (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: ELJÁRÁS DOXORUBICIN ELŐÁLLÍTÁSÁRA (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 4 (iv) SZÁMÍTÓGÉP SZÁMÁRA OLVASHATÓ FORMA:
(A) HORDOZÓTÍPUS: Floppy disk (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version#1.30 (EPO) (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 1269 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kétszálas (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ix) JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) LOKÁCIÓ: 1...1269 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
| GTG | AGC | GGC | GAG | GCG | CCC | CGG | GTG | GCC | GTC | GAC | CCG | TTC | GCG | TGT | CCC |
| Val 1 | Ser | Gly | Glu | Al a 5 | Pro | Arg | Val | Al a | Val 10 | As p | Pro | Phe | Al a | Cys 15 | Pro |
| ATG | ATG | ACC | ATG | CAG | CGC | AAG | CCC | GAG | GTG | CAC | GAC | GCC | TTC | CGG | GAG |
| Me t | Me t | Thr | Me t 20 | Gin | Arg | Ly s | Pro | Glu 25 | Val | Hi s | Asp | Al a | Phe 30 | Arg | Glu |
HU 220 530 BI
| GCG GGC CCG | GTC Val | GTC GAG | GTG Val | AAC GCC CCC GCG GGC GGA CCC GCC TGG | 144 | |||||||||||
| Alá | Gly | Pro 35 | Val | Glu | Asn 40 | Alá | Pro | Al a | Gly | Gly 45 | Pro | Al a | Trp | |||
| GTC | ATC | ACC | GAT | GAC | GCC | CTC | GCC | CGC | GAG | GTG | CTG | GCC | GAT | CCC | CGG | 192 |
| Val | Ile 50 | Thr | Asp | As p | Al a | Leu 55 | Al a | Arg | Glu | Va 1 | Leu 60 | Al a | As p | Pro | Arg | |
| TTC | GTG | AAG | GAC | CCC | GAC | CTC | GCC | CCC | GCC | GCC | TGG | CGG | GGG | GTG | GAC | 240 |
| Phe 65 | Val | Lys | Asp | Pro | Asp 70 | Leu | Al a | Pro | Al a | Al a 75 | Trp | Arg | Gly | Val | Asp 80 | |
| GAC | GGT | CTC | GAC | ATC | CCC | GTT | CCG | GAG | CTG | CGT | CCG | TTC | ACG | CTC | ATC | 288 |
| Asp | Gly | Leu | As p | Ile 85 | Pro | Val | Pro | Glu | Leu 90 | Arg | Pro | Phe | Thr | Leu 95 | Ile | |
| GCC | GTG | GAC | GGC | GAG | GCC | CAC | CGG | CGC | CTG | CGC | CGC | ATC | CAC | GCA | CCT | 336 |
| Alá | Va 1 | As p | Gly 100 | Glu | Al a | Hi s | Arg | Arg 105 | Leu | Arg | Arg | Ile | Hi s 110 | Al a | Pro | |
| GCG | TTC | AAC | CCG | CGC | CGG | CTG | GCC | GAG | CGG | ACG | GAT | CGC | ATC | GCC | GCG | 384 |
| Alá | Phe | Asn 115 | Pro | Arg | Arg | Leu | Al a 120 | Glu | Arg | Thr | As p | Arg 125 | Ile | Al a | Al a | |
| ATC | GCC | GGC | CGG | CTG | CTC | ACC | GAA | CTC | GCC | GAC | GCC | TCC | GGC | CGG | TCG | 432 |
| Ile | Al a 130 | Gly | Arg | Leu | Leu | Thr 135 | Glu | Leu | Al a | As p | Al a 140 | Ser | Gly | Arg | Ser | |
| GGC | AAA | CCG | GCC | GAG | CTG | ATC | GGC | GGC | TTC | GCG | TAC | CAC | TTC | CCG | CTG | 480 |
| Gly 145 | Ly s | Pro | Al a | Glu | Leu 150 | Ile | Gly | Gly | Phe | Al a 155 | Tyr | Hi s | Phe | Pro | Leu 160 | |
| TTG | GTC | ATC | TGC | GAG | CTG | CTC | GGT | GTG | CCG | GTC | ACC | GAT | CCG | GCG | ATG | 528 |
| Leu | Val | Ile | Cys | Glu 165 | Leu | Leu | Gly | Val | Pro 170 | Va 1 | Thr | Asp | Pro | Al a 175 | Me t | |
| GCC | CGC | GAG | GCC | GTC | AGC | GTT | CTC | AAG | GCA | CTC | GGC | CTC | GGC | GGC | CCG | 576 |
| Al a | Arg | Glu | Al a 180 | Val | Ser | Val | Leu | Lys 185 | Al a | Leu | Gly | Leu | Gly 190 | Gly | Pro | |
| CAG | AGC | GGC | GGG | GGT | GAC | GGC | ACG | GAC | CCT | GCC | GGG | GGC | GTG | CCG | GAC | 624 |
| Gin | Ser | Gly 195 | Gly | Gly | As p | Gly | Thr 200 | Asp | Pr o | Al a | Gly | Gly 205 | Val | Pro | Asp | |
| ACC | TCG | GCC | CTG | GAG | AGC | CTG | CTC | CTC | GAA | GCC | GTG | CAC | TCA | GCC | CGG | 672 |
| Thr | Ser 210 | Al a | Leu | Glu | Ser | Leu 215 | Leu | Leu | Glu | Al a | Val 220 | Hi s | Ser | Al a | Arg | |
| CGG | AAC | GAC | ACC | CCG | ACC | ATG | ACC | CGC | GTG | CTG | TAC | GAG | CGC | GCG | CAG | 720 |
| Arg 225 | Asn | Asp | Thr | Pro | Thr 230 | Me t | Thr | Arg | Val | Leu 235 | Tyr | Glu | Arg | Al a | Gin 240 | |
| GCC | GAG | TTC | GGC | TCG | GTC | TCC | GAC | GAC | CAG | CTC | GTC | TAC | ATG | ATC | ACC | 768 |
| Alá | Glu | Phe | Gly | Ser 245 | Val | Ser | As p | Asp | Gin 250 | Leu | Val | Tyr | Me t | Ile 255 | Thr | |
| GGG | CTC | ATC | TTC | GCC | GGC | CAC | GAC | ACC | ACC | GGC | TCC | TTC | CTG | GGC | TTC | 816 |
| Gly | Leu | Ile | Phe 260 | Al a | Gly | Hi s | Asp | Thr 265 | Thr | Gly | Ser | Phe | Leu 270 | Gly | Phe |
HU 220 530 Bl
| CTG CTC GCG GAG GTC | CTG GCG | GGC Gly 280 | CGC CTC GCG | GCG Al a | GAT Asp 285 | GCC GAC GAG | |||||||||
| Leu | Leu | Al a 275 | Glu | Val | Leu | Al a | Arg | Leu | Al a | Al a | Asp | Glu | |||
| GAC | GCC | GTC | TCC | CGG | TTC | GTG | GAG | GAG | GCG | CTG | CGC | TAC | CAC | CCG | CCG |
| Asp | Al a | Val | Ser | Arg | Phe | Val | G1 u | Glu | Al a | Leu | Arg | Tyr | Hi s | Pro | Pro |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| GTG | CCC | TAC | ACG | TTG | TGG | AGG | TTC | GCT | GCC | ACG | GAG | GTG | ACC | ATC | GGC |
| Val | Pro | Tyr | Thr | Leu | Trp | Arg | Phe | Al a | Al a | Thr | Glu | Val | Thr | I le | Gly |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| GGC | GTC | CGG | CTG | CCC | CGC | GGA | GCG | CCG | GTG | CTG | GTG | GAC | ATC | GAG | GGC |
| Gly | Val | Arg | Leu | Pro | Arg | Gly | Al a | Pro | Val | Leu | Val | Asp | I le | Glu | Gly |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| ACC | AAC | ACC | GAC | GGC | CGC | CAT | CAC | GAC | GCC | CCG | CAC | GCC | TTC | CAC | CCG |
| Thr | Asn | Thr | As p | Gly | Arg | Hi s | Hi s | Asp | Al a | Pro | Hi s | Al a | Phe | Hi s | Pro |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| GAC | CGT | CCC | TCG | TGG | CGG | CGG | CTC | ACC | TTC | GGC | GAC | GGG | CCG | CAC | TAC |
| Asp | Arg | Pro | Ser | Trp | Arg | Arg | Leu | Thr | Phe | Gly | As p | Gly | Pro | Hi s | Tyr |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| TGC | ATC | GGG | GAG | CAG | CTC | GCC | CAG | CTG | GAG | TCG | CGC | ACG | ATG | ATC | GGC |
| Cys | I 1 e | Gly | Glu | Gin | Leu | Al a | Gin | Leu | Glu | Ser | Arg | Thr | Me t | I le | Gly |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| GTA | CTG | CGC | AGC | AGG | TTC | CCC | GAG | GCC | CGA | CTG | GCC | GTG | CCG | TAC | GAC |
| Val | Leu | Arg | Ser | Arg | Phe | Pro | Glu | Al a | Arg | Leu | Al a | Val | Pro | Tyr | Asp |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| GAG | TTG | CGG | TGG | TGC | CGG | AAG | GGG | GCC | CAG | ACG | GCG | CGG | CTC | ACC | GAA |
| Glu | Le u | Arg | Trp | Cy s | Arg | Lys | Gly | Al a | Gin | Thr | Al a | Arg | Le u | Thr | Glu |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| CTG | CCC | GTC | TGG | CTG | CGC | TGA | |||||||||
| Leu | Pro | Val | Trp | Leu | Arg | * |
420
864
912
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248
1269 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 423 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
| Val 1 | Ser | Gly | Glu | Al a 5 | Pro | Arg | Val | Al a | Val 10 | As p | Pro | Phe | Al a | Cys 1 5 | Pro |
| Me t | Me t | Thr | Me t 20 | Gin | Arg | Lys | Pro | Glu 25 | Val | Hi s | Asp | Alá | Phe 30 | Arg | Glu |
| Al a | Gly | Pro 35 | Va 1 | Val | Glu | Val | As n 40 | Al a | Pro | Al a | Gly | Gly 45 | Pro | Al a | Trp |
| Val | I le | Thr | As p | As p | Al a | Leu | Alá | Arg | Glu | Va 1 | Leu | Al a | As p | Pro | Arg |
55 60
HU 220 530 Bl
Phe Val 65
Asp Gly
Alá Val
Alá Phe
Ile Alá 130
Gly Lys 145
Leu Val
Alá Arg
Gin Ser
Thr Ser 210
Arg Asn 225
Alá Glu
Gly Leu
Leu Leu
Asp Alá 290
Val Pro 305
Gly Val
Thr Asn
Asp Arg
Cys Ile 370
Lys Asp
Leu Asp
Asp Gly 100
Asn Pro 115
Gly Arg
Pro Alá
Ile Cys
Glu Alá 180
Gly Gly 195
Alá Leu
Asp Thr
Phe Gly
Ile Phe 260
Alá Glu 275
Val Ser
Tyr Thr
Arg Leu
Thr Asp 340
Pro Ser 355
Gly Glu
Pro Asp 70
Ile Pro 85
Glu Alá
Arg Arg
Leu Leu
Glu Leu 150
Glu Leu 165
Val Ser
Gly Asp
Glu Ser
Pro Thr 230
Ser Val 245
Alá Gly
Val Leu
Arg Phe
Leu Trp 310
Pro Arg 325
Gly Arg
Trp Arg
Gin Leu
Leu Alá
Val Pro
His Arg
Leu Alá 120
Thr Glu 135
He Gly
Leu Gly
Val Leu
Gly Thr 200
Leu Leu 215
Me t Th r
Ser Asp
His Asp
Alá Gly 280
Val Glu 295
Arg Phe
Gly Alá
His His
Arg Leu 360
Alá Gin 375
Pro Alá
Glu Leu 90
Arg Leu 105
Glu Arg
Leu Alá
Gly Phe
Val Pro 170
Lys Alá 185
Asp Pro
Leu Glu
Arg Val
Asp Gin 250
Thr Thr 265
Arg Leu
Glu Alá
Alá Alá
Pro Val 330
Asp Alá 345
Thr Phe
Leu Glu
Alá Trp 75
Arg Pro
Arg Arg
Thr Asp
Asp Alá 140
Alá Tyr 155
Val Thr
Leu Gly
Alá Gly
Alá Val 220
Leu Tyr 235
Leu Val
Gly Ser
Alá Alá
Leu Arg 300
Thr Glu 315
Leu Val
Pro His
Gly Asp
Ser Arg 380
Arg Gly
Phe Thr
Ile His 110
Arg Ile 125
Ser Gly
His Phe
Asp Pro
Leu Gly 190
Gly Val 205
His Ser
Glu Arg
Tyr Me t
Phe Leu 270
Asp Alá 285
Tyr His
Val Thr
Asp Ile
Alá Phe 350
Gly Pro 365
Thr Met
Val Asp 80
Leu Ile 95
Alá Pro
Alá Alá
Arg Ser
Pro Leu 160
A1 a Me t 175
Gly Pro
Pro Asp
Alá Arg
Alá Gin 240
Ile Thr 255
Gly Phe
Asp Glu
Pro Pro
Ile Gly 320
Glu Gly 335
His Pro
His Tyr
Ile Gly
HU 220 530 Bl
| Val 385 | Leu | Arg | Ser | Arg | Phe 390 | Pro | Glu | Al a | Arg | Leu 395 | Al a | Val | Pro | Tyr | As p 400 |
| Glu | Leu | Arg | TrP | Cy s | Arg | Lys | Gly | Al a | Gin | Thr | Al a | Arg | Leu | Thr | Glu |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Leu | Pro | Val | Trp | Leu | Arg | * |
420 (2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 51 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálas (D) TOPOLÓGA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCCGCGGCGG CGGGCGGTGC CATATGAGCG GCGAAGCGCC GCGTGTGGCC G 51 (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZÚSÁG: 59 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálas (D) TOPOLÓGA: lineáris (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TCGACGGCCA CACGCGGCGC TTCGCCGCTC ATATGGCACC GCCCGCCGCC GCGCCCTAC 59
Claims (11)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Egy daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló, 1. számú szekvenciával rendelkező izolált DNS-molekula.
- 2. Egy 1. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal 35 jellemezve, hogy az 1. ábra szerinti 3,4 kb Sphl fragmentum egészét vagy annak egy részét tartalmazza.
- 3. Egy 1. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy egy olyan daunorubicin-14-hidroxilázt kódol, amely a 2. számú szekvenciával rendelkezik. 40
- 4. Egy daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló vektor, azzal jellemezve, hogy a vektor egy plazmid.
- 5. Egy daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló vektorral transzformált vagy transzfektált gazdasejt.
- 6. Egy 5. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jelle- 45 mezve, hogy a gazdasejt egy daunorubicint termelő bakteriális sejt.
- 7. Eljárás doxorubicin előállítására, azzal jellemezve, hogyi) egy 5. igénypont szerinti gazdasejtet daunorubi- 50 cin jelenlétében olyan körülmények között tenyésztünk, amely körülmények között a daunorubicin doxorubicinné alakul át, és ii) a doxorubicmt elkülönítjük a tenyészetből.
- 8. Eljárás doxorubicin előállítására, azzal jellemezve, hogyi) egy 6. igénypont szerinti gazdasejtet daunorubicin jelenlétében olyan körülmények között tenyésztünk, amely körülmények között a daunorubicin doxorubicinné alakul át, és ii) a doxorubicmt elkülönítjük a tenyészetből.
- 9. A 2. számú szekvenciájú aminosavszekvenciával rendelkező daunorubicin-14-hidroxiláz.
- 10. Daunorubicin-14-hidroxilázt tartalmazó sejtextraktum, azzal jellemezve, hogy a daunorubicin-14-hidroxiláz olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely legalább 60%-ban azonos a 2. számú szekvenciának megfelelő aminosavszekvenciával.
- 11. Egy daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló, izolált DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az 1. ábra szerinti 3,4 kb Sphl fragmentum egészét vagy annak egy részét tartalmazza, vagy egy olyan fragmentumot tartalmaz, amely egy olyan, 1. ábra szerinti 3,4 kb Sphl fragmentumnak felel meg, amelyben a genetikai kód degenerált.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/396,218 US5695966A (en) | 1995-02-27 | 1995-02-27 | DNA encoding daunorubicin 14-hyroxylase and method for preparing doxorubicin |
| PCT/EP1996/000692 WO1996027014A1 (en) | 1995-02-27 | 1996-02-20 | Process for preparing doxorubicin |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP9603259A2 HUP9603259A2 (en) | 1997-05-28 |
| HUP9603259A3 HUP9603259A3 (en) | 2000-04-28 |
| HU220530B1 true HU220530B1 (hu) | 2002-03-28 |
Family
ID=23566340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9603259A HU220530B1 (hu) | 1995-02-27 | 1996-02-20 | Daunorubicin-14-hidroxilázt kódoló DNS-molekula és eljárás doxorubicin előállítására |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5695966A (hu) |
| EP (1) | EP0763112B1 (hu) |
| JP (1) | JPH10505506A (hu) |
| KR (1) | KR100414999B1 (hu) |
| CN (1) | CN1118574C (hu) |
| AR (1) | AR001014A1 (hu) |
| AT (1) | ATE178653T1 (hu) |
| AU (1) | AU711706B2 (hu) |
| CA (1) | CA2188571A1 (hu) |
| DE (1) | DE69601993T2 (hu) |
| ES (1) | ES2132891T3 (hu) |
| FI (1) | FI112251B (hu) |
| HU (1) | HU220530B1 (hu) |
| IL (1) | IL117246A0 (hu) |
| NO (1) | NO964482L (hu) |
| RU (1) | RU2205222C2 (hu) |
| TW (1) | TW419521B (hu) |
| WO (1) | WO1996027014A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA961555B (hu) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5695966A (en) * | 1995-02-27 | 1997-12-09 | Pharmacia & Upjohn S.P.A. | DNA encoding daunorubicin 14-hyroxylase and method for preparing doxorubicin |
| US5976830A (en) * | 1996-05-24 | 1999-11-02 | The Ohio State University Research Foundation | Methods of producing doxorubicin |
| CA2256318A1 (en) * | 1997-03-06 | 1998-09-11 | Pharmacia & Upjohn S.P.A. | Process for preparing doxorubicin |
| WO1999055829A2 (en) * | 1998-04-24 | 1999-11-04 | Pharmacia & Upjohn S.P.A. | Process for preparing doxorubicin |
| EP2392581A3 (en) * | 2003-04-25 | 2012-03-07 | North Carolina State University | Lactobacillus acidophilus nucleic acid sequences encoding cell surface protein homologues and uses therefore |
| WO2006111561A1 (en) * | 2005-04-21 | 2006-10-26 | Dsm Ip Assets B.V. | Improved microbial production of anthracyclins |
| KR100629896B1 (ko) * | 2005-04-28 | 2006-09-29 | 인하대학교 산학협력단 | 방선균 독소루비신 고생산 균주 및 독소루비신 생합성유전자군의 발현양상 분석을 위한 마이크로어레이칩 |
| CN101016533B (zh) * | 2005-11-09 | 2010-05-19 | 上海医药工业研究院 | 一种蒽环类抗生素产生工程菌及其应用 |
| CN103087124B (zh) * | 2012-11-21 | 2016-01-13 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种制备阿霉素的方法 |
| CN104059892A (zh) * | 2013-03-18 | 2014-09-24 | 江苏禾昌生物科技有限公司 | 柔红霉素c-14羟化酶突变体及其基因工程菌的生产方法 |
| CN105861455B (zh) * | 2016-05-16 | 2018-10-26 | 浙江海正药业股份有限公司 | DoxA蛋白突变体及其编码基因与应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57159496A (en) * | 1981-03-28 | 1982-10-01 | Sanraku Inc | Preparation of adriamycin |
| US5695966A (en) * | 1995-02-27 | 1997-12-09 | Pharmacia & Upjohn S.P.A. | DNA encoding daunorubicin 14-hyroxylase and method for preparing doxorubicin |
| US5976830A (en) * | 1996-05-24 | 1999-11-02 | The Ohio State University Research Foundation | Methods of producing doxorubicin |
-
1995
- 1995-02-27 US US08/396,218 patent/US5695966A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-02-20 HU HU9603259A patent/HU220530B1/hu unknown
- 1996-02-20 EP EP96904823A patent/EP0763112B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-20 CN CN96190128A patent/CN1118574C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-20 AU AU48784/96A patent/AU711706B2/en not_active Ceased
- 1996-02-20 KR KR1019960706026A patent/KR100414999B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 WO PCT/EP1996/000692 patent/WO1996027014A1/en active IP Right Grant
- 1996-02-20 RU RU96122866/13A patent/RU2205222C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 CA CA002188571A patent/CA2188571A1/en not_active Abandoned
- 1996-02-20 JP JP8525989A patent/JPH10505506A/ja not_active Ceased
- 1996-02-20 AT AT96904823T patent/ATE178653T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-20 DE DE69601993T patent/DE69601993T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-20 ES ES96904823T patent/ES2132891T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-23 IL IL11724696A patent/IL117246A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-02-23 AR ARP960101492A patent/AR001014A1/es unknown
- 1996-02-27 TW TW085102208A patent/TW419521B/zh active
- 1996-02-27 ZA ZA961555A patent/ZA961555B/xx unknown
- 1996-10-21 FI FI964229A patent/FI112251B/fi active
- 1996-10-22 NO NO964482A patent/NO964482L/no unknown
- 1996-12-03 US US08/760,116 patent/US5786190A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100414999B1 (ko) | 2004-04-28 |
| HUP9603259A3 (en) | 2000-04-28 |
| FI112251B (fi) | 2003-11-14 |
| EP0763112A1 (en) | 1997-03-19 |
| AU711706B2 (en) | 1999-10-21 |
| AU4878496A (en) | 1996-09-18 |
| EP0763112B1 (en) | 1999-04-07 |
| MX9605018A (es) | 1998-05-31 |
| ES2132891T3 (es) | 1999-08-16 |
| FI964229A0 (fi) | 1996-10-21 |
| ATE178653T1 (de) | 1999-04-15 |
| IL117246A0 (en) | 1996-06-18 |
| DE69601993D1 (de) | 1999-05-12 |
| DE69601993T2 (de) | 1999-11-04 |
| NO964482L (no) | 1996-12-23 |
| KR970702922A (ko) | 1997-06-10 |
| AR001014A1 (es) | 1997-08-27 |
| RU2205222C2 (ru) | 2003-05-27 |
| TW419521B (en) | 2001-01-21 |
| US5786190A (en) | 1998-07-28 |
| CA2188571A1 (en) | 1996-09-06 |
| CN1118574C (zh) | 2003-08-20 |
| CN1147835A (zh) | 1997-04-16 |
| JPH10505506A (ja) | 1998-06-02 |
| HUP9603259A2 (en) | 1997-05-28 |
| ZA961555B (en) | 1996-08-19 |
| FI964229A (fi) | 1996-10-21 |
| WO1996027014A1 (en) | 1996-09-06 |
| US5695966A (en) | 1997-12-09 |
| NO964482D0 (no) | 1996-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0763112B1 (en) | Process for preparing doxorubicin | |
| EP0567630B1 (en) | Dna-sequence coding for carminomycin 4-o-methyltransferase | |
| US5364781A (en) | Process for preparing daunorubicin | |
| EP0915983B1 (en) | Process for preparing doxorubicin | |
| EP1071746A2 (en) | Process for preparing doxorubicin | |
| EP0846175B1 (en) | Process for preparing daunorubicin | |
| US5955319A (en) | Process for preparing doxorubicin | |
| US5989869A (en) | Process for preparing daunorubicin and doxorubicin | |
| MXPA96005018A (en) | Process for the preparation of doxorrubic | |
| WO1996010581A1 (en) | Process for producing anthracyclines and intermediates thereof |