CN1147835A - 制备阿霉素的方法 - Google Patents

Abstract

通过含有编码柔红霉素14-羟化酶的DNA的一重组载体的转化作用，赋予宿主细胞把柔红霉素转化为阿霉素的能力。该宿主细胞可用来生产阿霉素。

Description

制备阿霉素的方法

本发明涉及从柔红霉素中产生阿霉素(doxorubicin)的方法，使用的是经重组DNA转化的宿主细胞中得到的一种酶。

柔红霉素类的anthracyclines(例如阿霉素、洋红霉素和阿克拉霉素)是抗癌治疗中最广泛应用的药剂[F.Arcamone，Doxorubicin，A-cademic Press，New York，1981，pp.12-25；A.Grein，ProcessBiochem.16：34(1981)；T.Kaneko，Chimicaoggi May：11(1988)；C.E.Myers et al.，”Biochemical mechanisms of tumor cell kill”.见：An-thracycline and Anthracenedione-Based Anti-Cancer Agents(Lown，J.W.，ed.)，Elsevier，Amsterdam，pp.527-569，1988；J.W.Lown，pharmac.Ther.60：185-214(1993)]。已通过化学合成方法生产出柔红霉素及阿霉素的改良性衍生物以提高其抗癌活性(特别是可通过口服途径)，并可在癌症治疗中抵抗与使用这些药物有关的急性毒性及慢性心脏毒力[Penco，Process Biochem，15：12(1980)；T.Kaneko，Chimicaoggi May：11(1980)]。这些类似物的实例有4′-表阿霉素(Epirubicin)、4-脱甲氧柔红霉素(Idarubicin)以及甲氧基-吗啉代阿霉素。

anthracyclines为自然发生的化合物。可由链霉菌属的多种菌株产生(如波赛链霉菌、浅兰浅红链霉菌、加利利链霉菌、灰色链霉菌、灰浅红链霉菌、S.insignis、绿色产色链霉菌、S.bifurcus以及链霉菌属菌种C5)和放线菌属A.carminata产生。阿霉素主要由波赛链霉菌caesius亚菌种产生，而柔红霉素则由波赛链霉菌以及上述链霉菌菌种产生。可公开使用模式菌株波赛链霉素亚菌种caesius IM-RU 3920(其与ATCC 27952相同，因而下文中简写为波赛链霉菌3920”)、波赛链霉菌ATCC 29050(“波赛链霉菌29050”)、波赛链霉菌亚菌种caesius ATCC 27952(“波赛链霉菌27952”)和不生产柔红霉素的波赛链霉菌dnrN：aph II突变体[“波赛链霉菌dnrN”；S.L.Otten，J.Ferguson和C.R.Hutchinson，J.Bacteriol.177：1216-1224(1995)]。特别是描述于US-A-3,590,028中的波赛链霉菌ATCC 27952，US-A-4,012,284中的波赛链霉菌29050以及保藏于美国标准培养物收藏所(美国马里兰州Rockville)的波赛链霉菌dnrN，序号为ATCC 55607。波赛链霉菌ATCC 55607是从波赛链霉菌ATCC 29050菌株中衍生得到，方法是用突变体dnrN基因来置换dnrN基因，使来自Tn5的aph II基因[J.M.Ward等.，Mol.Gen.Genet.203：468-475(1986)]插入到突变体dnrN基因中SalI位点以破坏dnrN的功能。如在ISP4培养基(Difco实验室，Detroit，MI，含50μg/ml的卡那霉素)上的生长所确定，波赛链霉菌ATCC 55607菌株对新霉素或卡那霉素具抗性，且并不产生阿霉素、柔红霉素或其生物合成中的任何中间体(S.L.Otten等，待发表)。可通过波赛链霉菌27952从丙二酸、丙酸及葡糖中制成anthracyclines阿霉素，途径如Grein[Advan.Appl.Microbiol.32：203(1987)]和Eckardt及Wagner[J.Basic Microbiol.28：137(1988)]所述。在这个过程中ε-紫红霉酮、洋红霉素及柔红霉素为确定的中间体。该途径中的最后步骤涉及到柔红霉素向阿霉素的羟基化作用，这仅在波赛链霉菌27952中有过报导[F.Arcamone等.，Biotechnol.Bioeng.11：1101(1969)]。在EP-A-61737中描述过柔红霉素向阿霉素生物转化的方法(产率为30％)，使用的是波赛链霉菌ATCC 31847的不产生柔红霉素的突变株，该突变株是用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理菌株ATCC 27952而得到的。不过，依据US-A-3,803,124，这种转化通常是以化学法以工业规模进行的。

柔红霉素生物合成及柔红霉素抗性的基因已得自波赛链霉菌29050及波赛链霉菌27952中，方法是通过克隆实验[Stutzman-Engwalland Hutchinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3135(1988)；Otten等.，J.Bacteriol.172：3427(1990)]。这些研究表明，当引入进变铅青链霉菌1326时，克隆化基因就使宿主具有了产生紫红霉酮和对柔红霉素及阿霉素具抗性的能力。

本发明提供一种编码柔红霉素14-羟化酶的分离性DNA分子。柔红霉素14-羟化酶可将柔红霉素转变为阿霉素。DNA分子主要由SEQ ID No：1的序列构成，该序列将被称为“dxrA”序列。由SEQ ID No：1编码的柔红霉素14-羟化酶的推断氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

本发明的DNA分子可含有图1中3.4kbSphI片断的全部或部分。编码柔红霉素14-羟化酶的序列界于SphI片断的KpnI和BamHI位点之间。本发明的DNA分子可含有图2中NdeI-BamHI片断的全部或部分。图2中NdeI-BamHI片断衍生自图1中略大的KpnI-BamHI片断。

当本发明的DNA分子仅含有3.4kbSphI片断的一部分或Nde-BamHI片断的一部分时，该部分必须具有柔红霉素14-羟化酶的功能(即其必须能把柔红霉素转化为阿霉素)。该部分长度一般至少为1.2kb，优选为1.2-3.4kb，更优选为1.2-1.4kb。该部分可以是限制性内切酶片断，如图1中的KpnI-BamHI片断。

本发明包括一种DNA分子，其可以编码柔红霉素14-羟化酶，后者的序列至少有60％与SEQ ID No：2的序列相同。本发明还可包括柔红霉素14-羟化酶，其氨基酸序列至少有60％与SEQ IDNo：2的序列相同。该序列至少有80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％与SEQ ID No：2序列相同。

SEQ ID No：2序列可通过取代、缺失、插入、扩展、功能化或化学修饰来加以修饰。取代、缺失、插入或扩展可涉及一个或多个氨基酸，例如一、二、三、四、五、八、十五或二十个氨基酸。一般而言，SEQID No：2的物化特性可以保留在修饰后的序列之中。通常，修饰后的序列在电荷、疏水/亲水性及大小方面是相似的。候选的取代作用为：可引起下列组中之一的氨基酸被同组中不同氨基酸所取代：

H、R和K

I、L、V和M

A、G、S和T

D、E、P和N

可使用常规技术来制备编码修饰序列的DNA分子。例如，可利用常规的DNA合成、定点诱变和重组DNA技术予以制备。合适的技术如Sambrook等所述(1989)：Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborNY。可以用含衍生性序列的蛋白质很容易地检验柔红霉素14-羟化酶的活性，例如可利用下列实施例中的方法。

为了使本发明的DNA分子编码的柔红霉素14-羟化酶得到表达，DNA可携带其自身的转录控制序列，特别是其自身的启动子，后者可操作性联接在编码序列上并被宿主细胞RNA聚合酶所识别。另外，DNA可以正确的方式联接到异源转录控制序列上，或在适当靠近载体的转录控制序列的限制性位点处克隆入载体。

编码柔红霉素14-羟化酶的DNA分子可以是一重组DNA克隆或表达载体。可以使用含有可加入一或多个其它DNA片断的DNA分子的任何自复制和/或整合剂。不过，载体通常为质粒。优选质粒为高拷贝数质粒pWHM3或pIJ702[Katz等.，J.Gen.Micro-biol.129：2703(1983)]。其它适宜的质粒为pIJ385[Mayeri等，J.Bacteriol.172：6061(1990)]、pIJ680[Hopwood等，Genetic Manipu-lation of streptomyces.A Laboratory Manual，John Innes Foundation，Norwich，UK，1985]、pWHM 601[Guilfoile and Hufchinson，Proc.Natl，Acad，Sci，USA 88：8553(991)]或pSET 152[Bierman等，Gene 116：43-49(1992)]。可使用任何适宜的技术把DNA插入到载体中。可通过把DNA在适当的限制性位点处联接至线性载体中而实现插入。为此，可使用粘性或钝末端、均聚体加尾直接配合，或利用接头或街接分子。

重组载体可用来转化或转染适宜的宿主细胞。宿主细胞可以是柔红霉素或阿霉素敏感性细胞(即在有一定数量柔红霉素或阿霉素的条件下不能生长)，或者是柔红霉素或阿霉素抗性细胞。宿主可以是微生物，如细菌。因而可使波赛链霉菌、特别是波赛链霉菌dnrN及其它链霉菌菌株(其可以或不产生anthracyclines)分别得到转化。链霉菌菌株的转化体一般由原生质体转化而得到。载体可表达在非链霉菌中，如在大肠杆菌之中。

可使用由转化宿主得到的柔红霉素14-羟化酶蛋白质来把柔红霉素生物转化为阿霉素。该方法使得制备高纯度阿霉素成为可能，其起始于由发酵方法产生并含有柔红霉素的一种细胞提取物。

可直接使用游离式固定化转化细胞或通过分离柔红霉素14-羟化酶蛋白质来实施生物转化过程，蛋白质可以游离态使用或按已有技术利用离子键或共价键固定在于树脂、玻璃、纤维素上，或相似物质上，或嫁接在可渗透至底物的纤维或通过交联而使其不溶。柔红霉素14-羟化酶蛋白质可用于粗细胞抽取物中。本发明中的重组载体也可用于转化能产生柔红霉素的适当的宿主细胞，以便能加强柔红霉素向阿霉素的生物转化。宿主细胞可以是柔红霉素或阿霉素抗性细胞，即在任意量的柔红霉素或阿霉素条件下其可以生长。因而波赛链霉菌菌株、特别是波赛链霉菌29050及其它可产生an-thracyclines的链霉菌菌株可得到转化。通常可通过原生质体转化作用而得到链霉菌菌株的转化体。

本发明包括产生阿霉素的方法，该方法包括：

(i)在柔红霉素存在的条件下，对用本发明载体所转化或转染的宿主细胞进行培养，培养条件为能使柔红霉素转化为阿霉素，以及

(ii)从培养物中分离出阿霉素。

在该方法中，在20-40℃下(如30-37℃)对宿主细胞进行培养。在柔红霉素存在的条件下培养持续时间为6-96小时，如12-72小时。最好在搅拌条件下进行培养。培养物中柔红霉素的浓度为2-200μg/ml，如10-100μg/ml。可在培养开始时向培养基中加入柔红霉素或在培养期间由宿主细胞生产出柔红霉素。

本发明的DNA分子可得自波赛链霉菌29050的基因组DNA。该菌株已保藏在the American Type Culture Couection，Rockville，MD，USA，保藏号为ATCC 29050。还可以使用得自波赛链霉菌29050的菌株(如波赛链霉菌27952)，其通常也可把柔红霉素转化为阿霉素。DNA分子因而可通过下述方法得到：

(a)制备出波赛链霉菌29050或其衍生菌株的基因组DNA文库；

(b)从文库中选择出有能力把柔红霉素转化为阿霉素的克隆；

(c)从选择出的克隆中分离出本发明的DNA分子。

在步骤(a)中可通过部分消化波赛链霉菌29050或其衍生菌株的基因组DNA来制备出文库；或者通过筛选已富集化或专门含有柔红霉素生物合成基因族的波赛链霉菌基因组DNA文库来制备文库。限制性内切酶MboI优选用于基因组DNA，而对于含柔红霉素生物合成基因族的文库来说，优选使用限制性内切酶BamHI或SphI。如此得到的DNA片断可进行大小分级；大小在3-5kb的片断最好用于基因组DNA，而13.5kb的BamHI或3.4-4.9kb的SphI则用于得自含柔红霉素生物合成基因族的文库的DNA片断。把这些片断联接至线性化载体中，例如pWHM3、pIJ702或pKC505[M.A.Richardson等，Gene 61：231(1987)]。用联接混合物来转化宿主细胞。通常，宿主细胞不能产生柔红霉素，并可以是柔红霉素及阿霉素敏感性的；例如，对每ml中的10微克或以下的柔红霉素或阿霉素为敏感性的。比如，可转化变铅青链霉菌JI 1326原生质体(Hopwood等，Genetic Manipulation of Streptomyces.A LaboratoryManual，John Innes Foundation，Norwich，UK，1985)。

在步骤(b)中，对所得转化体进行吸收柔红霉素、将其转化成阿霉素和分泌阿霉素能力的筛选。通过对含柔红霉素的培养基提取物中阿霉素存在的色谱分析，来检验能将柔红霉素转化为阿霉素的克隆。对这种克隆进行分离，对其中含有的重组载体进行提取。步骤(c)中，在用适宜的限制性内切酶消化重组载体时，可对插入每一载体的波赛链霉菌29050 DNA进行鉴定、测量大小及图谱测定。这样，就可核对出该载体含有本发明的DNA分子。

另外，还可分离出两种或多种重叠插入子，其全部或部分地属于本发明的DNA。它们可通过在一共同限制性位点的裂解及随后的联接而相互融合，以得到本发明的DNA，如果需要的话则使用适宜的限制性内切酶进行长度配对。也可以用适宜的限制性内切酶来裂解插入DNA，在步骤c中得到一插入DNA的限制性片断，所述插入DNA含有编码柔红霉素14-羟化酶蛋白质的基因。

下列实施例可阐述本发明。

在附图中：

图1表示本发明的DNA的限制性图谱。这是重组质粒pIS70中的一个插入子，其构建方法是通过将一个含柔红霉素14-羟化酶(dxrA)基因的3.4kbSphI DNA片断(通过用SphI对其部分消化而从重组质粒pIS62中得到)插入到pWHM3质粒(一个大肠杆菌—链霉菌穿梭载体的SphI位点而构造成的[Vara等，J.Bacteriol，171：5872(1989)]。图1中的图谱并不必提供DNA片断中所有限制性位点的详细目录。不过，所报导的位点已足以清晰识别这些片断。

图2也显示出本发明的DNA的限制性图谱。这是一个重组质粒pWHM 969中的插入子，其构建方法是将一个1.33kb的NdeI/BamHI DNA片断(经定点诱变而得自pIS 70的1.36kb KpnI/BamHI DNA片断)插入pET14B大肠杆菌表达质粒载体的NdeI及BamHI位点[Novagen，Madison，WI]。特别是，通过对柔红霉素-14-羟化酶基因的GTG启动密码子以及紧靠在该启始密码子之前的两个核苷酸进行诱变，把NdeI限制性位点(5′-CAT ATG-3′)插入到1.36kb KpnI/BamHI DNA片断之中，以便能再生出NdeI限制性内切酶所识别的靶序列。为了能使柔红霉素-14-羟化酶基因在大肠杆菌中有效表达，根据大肠杆菌的密码子使用对SEQID No：1中所示野生型序列适宜地进行诱变。图2所示的图谱不必提供DNA片断中所有限制性位点的详细目录。不过，所报导的位点已足以清晰识别这些片断。

图3是经dxr A表达载体的转化并由IPTG诱发4小时的大肠杆菌中得到的细胞提取物的Comassie色SDS-聚丙烯酰胺凝胶。巷1，经表达载体pWHM 969转化的大肠杆菌(DxrA分子量：42，280)；巷2，经pET-14b转化的大肠杆菌(阴性对照)；巷3，分子量标准。材料与方法

细菌菌种及质粒：把对氨苄青霉素及阿泊拉霉素敏感的大肠杆菌菌株DH5α用于DNA片断的亚克隆化。把变铅青链霉素ZX1[Zhou等，Nucleic Acids Res、16：4341(1988)]及波赛链霉菌dnrN[S.L.Otten，J.Ferguson and C.R.Hutchinson，J.Bacteriol.，177：1216-1224(1995)]用于dxrA基因的表达。质粒克隆载体为pUC18/19[(Yansch-Perron等，Gene 33：103(1985)]及pWHM3[Vara等，J.Bacteriol.171：5872(1989)]。

培养基及缓冲液：把大肠杆菌DH5α保持在LB琼脂上(Sam-brook等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，2nd ed.ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。当选择转化体时，将氨苄青霉素或阿泊拉霉素加入，浓度分别为100μg/ml及50μg/ml。把变铅青链霉菌保持在R2YE琼脂上(Hopwood等，Ge-netic Manipulation of Streptomyces.A Laboratory Manual，John InnesFoundation，Norwich，UK，1985)，用于孢子的制备以及原生质体的再生。

亚克隆化DNA片断：用适宜的限制性内切酶消化DNA样品，并以标准法在琼脂糖凝胶上分离(Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor NY，1989)。从凝胶上把含欲研究物的DNA片断的琼脂糖切片剪下，利用GENECLEAN设备(Bio101，La Jolla，CA)或相当设备从这些切片中分离出DNA。运用标准技术(Sambrook等，Molec-ular Cloning.A Laboratory Manual 2nd ed.Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)把所分离的DNA片断分别亚克隆入大肠杆菌中和用于表达及生物转化试验的大肠杆菌/链霉菌穿梭载体中。

链霉菌菌种及大肠杆菌的转化作用：利用CaCl₂方法制备大肠杆菌的感受态细胞(Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，并用标准技术进行转化(Sambrook等，Molecular Cloning.ALaboratory Manual，2nd ed，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)。变铅青链霉菌ZX1菌丝体在YEME培养基上生长(Hopwood等，Genetrc Manipulation of Streptomyces.A Labora-tory Manual，John，Innes Foundation，Norwich，UK，1985)，48小时后进行收获。用10.3％的蔗糖溶液将菌丝体粒状沉淀物冲洗两次，并根据Hopwood手册中描述的方法来制备原生质体(Hopwood等，Genettc Manipulation of Streptomyces.A Laboratory Manual，JohnInnes Foundation，Norwich，UK，1985)。把原生质体粒状沉淀物悬浮在约300μl的P缓冲液中(Hopwood等，Genetic Manipulation ofStreptomyces.A Laboratory  Manual，John Innes Foundation，Nor-wich，UK，1985)，将50μl该悬浮液的等分试样用于每一次转化作用。根据Hopwood等人的小规模转化方法，用质粒DNA对原生质体进行转化(Hopwood等，Genetic Manipulation of Streptomyces.ALaboratory Manual，John Innes Foundation，Norwich，UK，1985)。在R2YE培养上再生培养(温度30℃)17小时之后，用50μg/ml的硫链丝菌肽覆盖平板，任其在30℃下生长直至孢子形成。

柔红霉素向阿霉素的生物转化

将含有本发明质粒的变铅青链霉菌ZX1及波赛链霉菌dnrN转化体接种至含10μg/ml硫链丝菌肽的液体R2YE培养基中。在30℃下生长两天之后，将2.5ml该培养物转移至含25μg/ml硫链丝菌肽的25ml生产培养基中[MC Gurire等，Process Biochem.14：2-5(1979)]。30℃下将培养物在置于旋转振荡器(280rmp)上的锥形瓶中生长72小时，其后，把柔红霉素(5mg/ml水溶液)加入10ml该培养物中以达到终浓度为20μg/ml。在振荡器上进一步培养24小时之后，加入25mg/ml草酸以水解anthracyclines代谢物的糖苷形式，之后，把培养物在水浴中培养60分钟，温度条件为55℃。把培养物置于旋转振荡器上(280rpm)，在30℃条件下用10ml乙腈∶甲醇(1∶1)从其中提取代谢物30分钟。将提取物过滤，用反相高压液相色谱法(RP-HPLC)来分析过滤物。使用Vydac C18柱(4.6×250mm；5μM颗粒大小)来实施反相高压液相色谱法，流速为0.385ml/分钟。流动相A为在水中的0.1％三氟乙酸(TFA，来自Pierce ChemicalCo.)，流动相B为乙腈中的0.078％TFA(来自J.T.Baker ChemicalCo.)。用相A中20-60％相B的线性梯度进行洗脱，时间为33分钟，用488nm二极管阵列检测装置进行监测(带宽12μm)。用柔红霉素及阿霉素(10μg/ml甲醇液)做为外标来定量测定分离自培养物的这些代谢物的量。实施例1

编码柔红霉素14-羟化酶的dxrA基因的克隆化

对Stutzman-Engwall及Hutchison所述的多种粘粒克隆[(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3135(1989)]例如pWHM337及pWHM338，或者类似菌种中得到的相似克隆(分别代表波赛链霉菌29050基因组DNA的约20-90kb)，用BamHI部分消化，结合DNAs并再联接，把所生成的质粒混合物(含pKC505载体或等同载体，其在大肠杆菌及链霉菌菌种中都具复制能力)用于转化大肠杆菌DH5达到阿泊拉霉素抗性(或达到适于选择所用载体的抗性)。把来自16种阿泊拉霉素抗性大肠杆菌克隆的质粒DNAs引入变铅青链霉菌ZX1中，依据材料及方法部分中所述的方法来分析转化体的柔红霉素向阿霉素的生物转化。从将所加入的柔红霉素的3％转变为阿霉素的转化体中分离出质粒pIS23，发现其含有包括图1所示的限制性图谱区域的一段13.5kb插入子。将pIS23中的插入子用于亚克隆一段4.9kb Bgll II/ClaIDNA片断至BamHI及AccI肖化过的pUC18中。从所生成的质粒中得到4.9kb EcoRI/HindIII片断，并亚克隆入EcoRI及HindIII消化过的pWHM3中以得到质粒pIS62。如材料与方法部分所述来制备变铅青链霉素ZX1(pIS62)转化体，并检测其柔红霉素向阿霉素的生物转化能力。其可以把所加入柔红霉素的高达16％转化为阿霉素。把pIS62中3.4kb SphIDNA片断克隆至pWHM3的SphI位点以得到质粒pIS70(图1)。依据材料与方法部分所述来制备变铅青链霉菌ZX1(pIS70)转化体，并检测其柔红霉素向阿霉素的生物转化能力。其可以把所加入的柔红霉素的高达22％转化为阿霉素。实施例2

利用含柔红霉素14-羟化酶但缺少其它柔红霉素基因产物的细胞来把柔红霉素转化为阿霉素

依据材料与方法部分所述的方法，利用硫链丝菌肽抗性的选择，以转化作用把pIS62及pIS70质粒导入波赛链霉素dnrN菌种中。检测所生成的波赛链霉素dnrN(pIS62)转化体把柔红霉素生物转化为阿霉素的能力。其可以把所加入的柔红霉素的高达58％转变为阿霉素。检测所生成的波赛链霉素dnrN(pIS70)转化体把柔红霉素生物转化为阿霉素的活力。其可以把所加入的柔红霉素的100％转化为阿霉素。实施例3大肠杆菌中DxrA的表达

表达载体pET-14b(商业来源Novagen-Madison，WI)依据的是T7启动子驱动系统。当使用限制性位点NaeI时，pET-14b使在N末端与His-Tag相融合的克隆蛋白质得以表达。

来自含有整体dxrA基因的载体pIS70(图1)的1373bp KpnI-BamHI片断克隆入pUC19中[Yanish-Perron C等，(1985)Gene：33，103-119]。从所生成的质粒中去除Sal I-BamHI片断并联接到利用两个合成的寡核苷酸(51-mer Seq.ID NO.3及59-merseq.ID.No.4)制备的KpnI-SalI接头上，以使dxrA的第一个密码子转变为ATG(其产生Nde I位点)，而使第4、第6及第7密码子的第3部位转变为能在高度表达的大肠杆菌基因中反映最常用的密码子，做为一种提高dxrA表达之手段。把所生成的NdeI-BamHI片断克隆入pET-14b中。

用于dxrA基因表达的大肠杆菌宿主是菌种BL21的入DE3溶源菌(商用来源Novagen-Madison WI)。依据下列程序，通过加入IPTG来诱导dxrA的表达。从新近划线的平板pWHM 969(图2)中简单菌落性地接种100ml 2xYT及氨苄青霉素(50μg/ml)。细胞在30℃条件下生长直至OD₆₀₀＝0.4-1.0。加入4mM IPTG来诱导dxrA的表达，连续培养3-4小时。

在微离心机中以14,000rpm离心0.5ml培养物，时间1分钟，弃置上清液，将粒状沉淀物再悬浮于50μl的Laemmli缓冲液中[Laemmli，Nature(London)，227：680(1970)]，并煮沸5分钟。在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上对煮沸样品中含有的蛋白质进行分析(图3)，方法为标准法[Laemmli，Nature(London)，227：680(1970)]，是通过与不含dxrA基因的pET14b载体相比较而进行的。

柔红霉素14-羟化酶蛋白质在Mr42,280处发生移动。

                                        序列一览表

(1)一般资料

  (i)申请人：

    (A)姓名：PHARMACIA S.P.A.

    (B)街道：VIA KOCH 1.2

    (C)城市：米兰

    (E)国家：意大利

    (F)邮编(ZIP)：20152

    (G)电话)NE：*39-2-48385045

    (H)电传：*9-2-48300578

  (ii)发明标题：制备阿霉素的方法

  (iii)序列数目：4

  (iv)计算机可读形式

    (A)媒介类型：软盘

    (B)计算机：：IBM  兼容机

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)

(2)SEQ ID NO：1资料

  (i)序列特性

    (A)长度：1269个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)性况：双链

    (D)拓扑：线性

  (ix)特点：

    (A)名称/检索：CDS

    (B)位置：1..1269

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GTG AGC GGC GAG GCG CCC CGG GTG GCC GTC GAC CCG TTC GCG TGT CCC    48Val Ser Gly Glu Ala Pro Arg Val Ala Val Asp Pro Phe Ala Cys Pro1               5                  10                  15ATG ATG ACC ATG CAG CGC AAG CCC GAG GTG CAC GAC GCC TTC CGG GAG        96Met Met Thr Met Gln Arg Lys Pro Glu Val His Asp Ala Phe Arg Glu

         20                  25                  30GCG GGC CCG GTC GTC GAG GTG AAC GCC CCC GCG GGC GGA CCC GCC TGG       144Ala Gly Pro Val Val Glu Val Asn Ala Pro Ala Gly Gly Pro Ala Trp

     35                  40                  45GTC ATC ACC GAT GAC GCC CTC GCC CGC GAG GTG CTG GCC GAT CCC CGG       192Val Ile Thr Asp Asp Ala Leu Ala Arg Glu Val Leu Ala Asp Pro Arg

 50                  55                  60TTC GTG AAG GAC CCC GAC CTC GCC CCC GCC GCC TGG CGG GGG GTG GAC       240Phe Val Lys Asp Pro Asp Leu Ala Pro Ala Ala Trp Arg Gly Val Asp65                  70                  75                  80GAC GGT CTC GAC ATC CCC GTT CCG GAG CTG CGT CCG TTC ACG CTC ATC       288Asp Gly Leu Asp Ile Pro Val Pro Glu Leu Arg Pro Phe Thr Leu Ile

             85                  90                  95GCC GTG GAC GGC GAG GCC CAC CGG CGC CTG CGC CGC ATC CAC GCA CCT       336Ala Val Asp Gly Glu Ala His Arg Arg Leu Arg Arg Ile His Ala Pro

        100                 105                 110GCG TTC AAC CCG CGC CGG CTG GCC GAG CGG ACG GAT CGC ATC GCC GCG       384Ala Phe Asn Pro Arg Arg Leu Ala Glu Arg Thr Asp Arg Ile Ala Ala

    115                 120                 125ATC GCC GGC CGG CTG CTC ACC GAA CTC GCC GAC GCC TCC GGC CGG TCG       432Ile Ala Gly Arg Leu Leu Thr Glu Leu Ala Asp Ala Ser Gly Arg Ser

130                 135                 140GGC AAA CCG GCC GAG CTG ATC GGC GGC TTC GCG TAC CAC TTC CCG CTG       480Gly Lys Pro Ala Glu Leu Ile Gly Gly Phe Ala Tyr His Phe Pro Leu145                 150                 155                 160TTG GTC ATC TGC GAG CTG CTC GGT GTG CCG GTC ACC GAT CCG GCG ATG       528Leu Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Val Thr Asp Pro Ala Met

            165                 170                 175GCC CGC GAG GCC GTC AGC GTT CTC AAG GCA CTC GGC CTC GGC GGC CCG       576Ala Arg Glu Ala Val Ser Val Leu Lys Ala Leu Gly Leu Gly Gly Pro

        180                 185                 190CAG AGC GGC GGG GGT GAC GGC ACG GAC CCT GCC GGG GGC GTG CCG GAC        624Gln Ser Gly Gly Gly Asp Gly Thr Asp Pro Ala Gly Gly Val Pro Asp

    195                 200                 205ACC TCG GCC CTG GAG AGC CTG CTC CTC GAA GCC GTG CAC TCA GCC CGG        672Thr Ser Ala Leu Glu Ser Leu Leu Leu Glu Ala Val His Ser Ala Arg

210                 215                 220CGG AAC GAC ACC CCG ACC ATG ACC CGC GTG CTG TAC GAG CGC GCG CAG        720Arg Asn Asp Thr Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Tyr Glu Arg Ala Gln225                 230                 235                 240GCC GAG TTC GGC TCG GTC TCC GAC GAC CAG CTC GTC TAC ATG ATC ACC        768Ala Glu Phe Gly Ser Val Ser Asp Asp Gln Leu Val Tyr Met Ile Thr

            245                 250                 255GGG CTC ATC TTC GCC GGC CAC GAC ACC ACC GGC TCC TTC CTG GGC TTC        816Gly Leu Ile Phe Ala Gly His Asp Thr Thr Gly Ser Phe Leu Gly Phe

        260                 265                 270CTG CTC GCG GAG GTC CTG GCG GGC CGC CTC GCG GCG GAT GCC GAC GAG        864Leu Leu Ala Glu Val Leu Ala Gly Arg Leu Ala Ala Asp Ala Asp Glu

    275                 280                 285GAC GCC GTC TCC CGG TTC GTG GAG GAG GCG CTG CGC TAC CAC CCG CCG        912Asp Ala Val Ser Arg Phe Val Glu Glu Ala Leu Arg Tyr His Pro Pro

290                 295                 300GTG CCC TAC ACG TTG TGG AGG TTC GCT GCC ACG GAG GTG ACC ATC GGC        960Val Pro Tyr Thr Leu Trp Arg Phe Ala Ala Thr Glu Val Thr Ile Gly305                 310                 315                 320GGC GTC CGG CTG CCC CGC GGA GCG CCG GTG CTG GTG GAC ATC GAG GGC       1008Gly Val Arg Leu Pro Arg Gly Ala Pro Val Leu Val Asp Ile Glu Gly

            325                 330                 335ACC AAC ACC GAC GGC CGC CAT CAC GAC GCC CCG CAC GCC TTC CAC CCG       1056Thr Asn Thr Asp Gly Arg His His Asp Ala Pro His Ala Phe His Pro

        340                 345                 350GAC CGT CCC TCG TGG CGG CGG CTC ACC TTC GGC GAC GGG CCG CAC TAC       1104Asp Arg Pro Ser Trp Arg Arg Leu Thr Phe Gly Asp Gly Pro His Tyr

    355                 360                 365TGC ATC GGG GAG CAG CTC GCC CAG CTG GAG TCG CGC ACG ATG ATC GGC       1152Cys Ile Gly Glu Gln Leu Ala Gln Leu Glu Ser Arg Thr Met Ile Gly

370                 375                 380GTA CTG CGC AGC AGG TTC CCC GAG GCC CGA CTG GCC GTG CCG TAC GAC       1200Val Leu Arg Ser Arg Phe Pro Glu Ala Arg Leu Ala Val Pro Tyr Asp385                 390                 395                 400GAG TTG CGG TGG TGC CGG AAG GGG GCC CAG ACG GCG CGG CTC ACC GAA       1248Glu Leu Arg Trp Cys Arg Lys Gly Ala Gln Thr Ala Arg Leu Thr Glu

            405                 410                 415CTG CCC GTC TGG CTG CGC TGA                                           1269Leu Pro Val Trp Leu Arg  *

        420(2)SEQ ID NO：2资料

(i)序列特性

   (A)长度：423个氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (D)拓扑：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：：SEQ ID NO：2：Val Ser Gly Glu Ala Pro Arg Val Ala Val Asp Pro Phe Ala Cys Pro1               5                  10                  15Met Met Thr Met Gln Arg Lys Pro Glu Val His Asp Ala Phe Arg Glu

         20                  25                  30Ala Gly Pro Val Val Glu Val Asn Ala Pro Ala Gly Gly Pro Ala Trp

     35                  40                  45Val Ile Thr Asp Asp Ala Leu Ala Arg Glu Val Leu Ala Asp Pro Arg

 50                  55                  60Phe Val Lys Asp Pro Asp Leu Ala Pro Ala Ala Trp Arg Gly Val Asp65                  70                  75                  80Asp Gly Leu Asp Ile Pro Val Pro Glu Leu Arg Pro Phe Thr Leu Ile

             85                  90                  95Ala Val Asp Gly Glu Ala His Arg Arg Leu Arg Arg Ile His Ala Pro

        100                 105                 110Ala Phe Asn Pro Arg Arg Leu Ala Glu Arg Thr Asp Arg Ile Ala Ala

    115                 120                 125Ile Ala Gly Arg Leu Leu Thr Glu Leu Ala Asp Ala Ser Gly Arg Ser

130                 135                 140Gly Lys Pro Ala Glu Leu Ile Gly Gly Phe Ala Tyr His Phe Pro Leu145                 150                 155                 160Leu Val Ile Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Val Thr Asp Pro Ala Met

            165                 170                 175Ala Arg Glu Ala Val Ser Val Leu Lys Ala Leu Gly Leu Gly Gly Pro

        180                 185                 190Gln Ser Gly Gly Gly Asp Gly Thr Asp Pro Ala Gly Gly Val Pro Asp

    195                 200                 205Thr Ser Ala Leu Glu Ser Leu Leu Leu Glu Ala Val His Ser Ala Arg

210                 215                 220Arg Asn Asp Thr Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Tyr Glu Arg Ala Gln225                 230                 235                 240Ala Glu Phe Gly Ser Val Ser Asp Asp Gln Leu Val Tyr Met Ile Thr

            245                 250                 255Gly Leu Ile Phe Ala Gly His Asp Thr Thr Gly Ser Phe Leu Gly Phe

        260                 265                 270Leu Leu Ala Glu Val Leu Ala Gly Arg Leu Ala Ala Asp Ala Asp Glu

    275                 280                 285Asp Ala Val Ser Arg Phe Val Glu Glu Ala Leu Arg Tyr His Pro Pro

290                 295                 300Val Pro Tyr Thr Leu Trp Arg Phe Ala Ala Thr Glu Val Thr Ile Gly305                 310                 315                 320Gly Val Arg Leu Pro Arg Gly Ala Pro Val Leu Val Asp Ile Glu Gly

            325                 330                 335Thr Asn Thr Asp Gly Arg His His Asp Ala Pro His Ala Phe His Pro

        340                 345                 350Asp Arg Pro Ser Trp Arg Arg Leu Thr Phe Gly Asp Gly Pro His Tyr

    355                 360                 365Cys Ile Gly Glu Gln Leu Ala Gln Leu Glu Ser Arg Thr Met Ile Gly

370                 375                 380Val Leu Arg Ser Arg Phe Pro Glu Ala Arg Leu Ala Val Pro Tyr Asp385                 390                 395                 400Glu Leu Arg Trp Cys Arg Lys Gly Ala Gln Thr Ala Arg Leu Thr Glu

            405                 410                 415Leu Pro Val Trp Leu Arg  *

        420

(2)SEQ ID NO：3资料

  (i)序列特性

    (A)长度：51个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链况：单链

    (D)拓扑：线性

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CCCGCGGCGG CGGGCGGTGC CATATGAGCG GCGAAGCGCC GCGTGTGGCC G            51(2)SEQ  ID  NO：4资料

(i)序列特性

   (A)长度：59个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链况：单链  ：

(xi)序列描述SEQ ID NO：4：TCGACGGCCA CACGCGGCGC TTCGCCGCTC ATATGGCACC GCCCGCCGCC GCGGGGTAC    59

Claims (27)

1.编码柔红霉素14-羟化酶的一种分离性DNA分子。

2.依据权利要求1的一种DNA分子，含有图1中全部或部分3.4kbSphI片段。

3.依据权利要求1的一种DNA分子，含有图2中全部或部分NdeI-BamHI片段。

4.依据权利要求1的一种DNA分子，其编码具有SEQ ID No：2序列的柔红霉素14-羟化酶。

5.依据权利要求1的一种DNA分子，其编码与SEQ ID No：2序列至少有60％相同序列的柔红霉素14-羟化酶。

6.依据权利要求1的一种DNA分子，主要含SEQ ID No：1的序列。

7.一种编码柔红霉素14-羟化酶的载体。

8.依据权利要求7的一种载体，含有图1中全部或部分3.4kbSphI片段。

9.依据权利要求7的一种载体，含有图2中全部或部分NdeI-BamHI片段。

10.依据权利要求7的一种载体，其编码具有SEQ ID No：2序列的柔红霉素14-羟化酶。

11.依据权利要求7的一种载体，其编码具有与SEQ ID No：2序列至少60％相同的序列的柔红霉素14-羟化酶。

12.依据权利要求7的一种载体，含有基本由SEQ ID No：1序列组成的序列。

13.依据权利要求7的一种载体，其为一种质粒。

14.依据权利要求13的一种质粒，其为pIS23、pIS62或pIS70。

15.由权利要求7中要求的载体所转化或转染的一种宿主细胞。

16.依据权利要求15的一种宿主细胞，其为一种产生柔红霉素的细菌细胞。

17.依据权利要求16的一种宿主细胞，其为一种链霉菌细胞。

18.产生阿霉素的一种方法，其包括

(i)在柔红霉素存在的条件下培养权利要求15中所要求的宿主细胞，培养条件为使柔红霉素转化为阿霉素，以及

(ii)从培养物中分离出阿霉素。

19.产生阿霉素的一种方法，其包括

(i)培养权利要求16中所要求的宿主细胞，培养条件为使柔红霉素转化为阿霉素，以及

(ii)从培养物中分离出阿霉素。

20.一种柔红霉素14-羟化酶，其具有与SEQ ID No：2序列至少60％相同的氨基酸序列。

21.依据权利要求20的柔红霉素14-羟化酶，其具有SEQ IDNo：2的氨基酸序列。

22.含有柔红霉素14-羟化酶的一种细胞抽提物，其中所述柔红霉素14-羟化酶含有与SEQ ID No：2所示氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列。

23.依据权利要求2的DNA分子，其中所述DNA分子的长度至少为1.2kb。

24.依据权利要求23的DNA分子，其中所述DNA分子长度在1.2-2.4kb之间。

25.依据权利要求20的柔红霉素14-羟化酶，其中所述氨基酸序列具有与SEQ ID No：2相同的疏水性/亲水性及大小。

26.编码柔红霉素14-羟化酶的一种DNA分子，其中所述DNA分子含有如图1的3.4kb SphI片断或者在遗传密码简并性范围内与如图1的3.4kb SphI片段相当的一段片段。

27.产生权利要求1的分离性DNA分子的一种方法，该方法包括

(a)制备波赛链霉菌29050或其衍生菌种的基因组DNA文库；

(b)从文库中选择出一种能将柔红霉素转化为阿霉素的克隆；

(c)从所选择出的克隆中分离出本发明的DNA分子。

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