HU220080B - Eljárás gyengített Varicella zoster vírus vakcina előállítására - Google Patents

Abstract

Élő, gyengített varicella zoster vírus vakcinát állítanak elő magashozammal oly módon, hogy a) humán diploid sejtek közül választott VZV-fertőzésre érzékeny sejteket egybefolyó egyrétegű sejttenyészetkialakulásáig tenyésztenek megfelelően jó tápanyagellátás mellett, ésegy nem metabolizálódó diszacharid jelenlété- ben; b) az a) lépésszerint előállított sejttenyészetet a sejtek egybefolyásáhozlegközelebb eső időpontban fertőzik VZV-- vel fertőzött sejttel alehető legnagyobb fertőzési faktort biztosítva; c) a VZV-vel fertőzötttenyészetnek 22–96 órán keresztül jó tápanyagellátást biztosítanak, ésa VZV-termelés tetőpontjának elérésekor összegyűjtik a sejteket; d) aVZV-fertőzött sejtek összegyűjtése előtt a VZV-vel fertőzötttenyészetet fiziológiás oldattal mossák, amely adott esetbenlizoszomotróp szert, például ammónium-kloridot vagy klorokvinttartalmaz; e) a VZV-vel fertőzött sejteket minimális térfogatústabilizáló oldatban összegyűjtik, és a sejteket vagy azonnalszétroncsolják, vagy lefagyasztják egy későbbi roncsolásig; f) a VZV-vel fertőzött sejteket szétroncsolva optimális mértékben szabaddáteszik a sejthez kapcsolódó VZV-t, és eltávolítják a sejttörmeléket,ezáltal sejtmentes VZV-készítményt kapnak. Ezenkívül optimáliskompozíciót ismertetnek egyrétegű sejttenyészetek előállítására,amellyel maximális sejtsűrűség érhető el az egysejtrétegben, és ígyalkalmas a virális vakcinatermelés fokozására. ŕ

Description

(54) Eljárás gyengített Varicella zoster vírus vakcina előállítására

KIVONAT

Élő, gyengített varicella zoster vírus vakcinát állítanak elő magas hozammal oly módon, hogy

a) humán diploid sejtek közül választott VZV-fertőzésre érzékeny sejteket egybefolyó egyrétegű sejttenyészet kialakulásáig tenyésztenek megfelelően jó tápanyagellátás mellett, és egy nem metabolizálódó diszacharid jelenlétében;

b) az a) lépés szerint előállított sejttenyészetet a sejtek egybefolyásához legközelebb eső időpontban fertőzik VZV-vel fertőzött sejttel a lehető legnagyobb fertőzési faktort biztosítva;

c) a VZV-vel fertőzött tenyészetnek 22-96 órán keresztül jó tápanyagellátást biztosítanak, és a VZV-termelés tetőpontjának elérésekor összegyűjtik a sejteket;

d) a VZV-fertőzött sejtek összegyűjtése előtt a VZV-vel fertőzött tenyészetet fiziológiás oldattal mossák, amely adott esetben lizoszomotróp szert, például ammónium-kloridot vagy klorokvint tartalmaz;

e) a VZV-vel fertőzött sejteket minimális térfogatú stabilizáló oldatban összegyűjtik, és a sejteket vagy azonnal szétroncsolják, vagy lefagyasztják egy későbbi roncsolásig;

f) a VZV-vel fertőzött sejteket szétroncsolva optimális mértékben szabaddá teszik a sejthez kapcsolódó VZV-t, és eltávolítják a sejttörmeléket, ezáltal sejtmentes VZV-készítményt kapnak.

Ezenkívül optimális kompozíciót ismertetnek egyrétegű sejttenyészetek előállítására, amellyel maximális sejtsűrűség érhető el az egysejtrétegben, és így alkalmas a virális vakcinatermelés fokozására.

A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 5 lap ábra)

HU 220 080 B

HU 220 080 Β

A találmány tárgya eljárás élő, gyengített, sejtmentes Varicella zoster vakcina előállítására nagy hozammal, továbbá egy kompozíció, amely sejtek egyrétegű tenyészetben való szaporítására alkalmas.

A varicella zoster vírus (VZV) bárányhimlőt és övsömört okoz. A bárányhimlő olyan fertőző betegség, amely VZV-vel szembeni immunitással nem rendelkező személyekben alakul ki. Életének első két évtizedében a népességnek több mint 90%-a ki van téve ilyen fertőzésnek. A betegség súlyos problémát jelent immunszupresszált egyéneknek és felnőtteknek. Sok esetben a VZV latenssé válik a hátsó/érző ideggyök ganglion sejtekben. Az övsömör egy nagyon fájdalmas, krónikus állapot, amely akkor jelenik meg, ha a N7N latens állapotából reaktiválódik.

Célul tűzték ki a bárányhimlő megelőzését vakcinálással, és az általános gyermekkori vakcinálás intézményét élő, gyengített varicellavakcinával. A szakirodalomban leírták a VZV szaporítását különféle sejttenyésztő rendszerekben, és az élő, gyengített, sejtmentes VZV vakcinakénti alkalmazását. Az US 3 985 615 számú szabadalmi leírásban ismertetik a VZV gyengített Oka-törzsének tenyésztését tengerimalacból származó, primer embrionális sejtekben, amely vakcinakénti alkalmazásra megfelel. Az US 4 008 317 számú szabadalmi leírásban ismertetik a N7N egy hőmérséklet-érzékeny mutánsának tenyésztését WI-38 sejtekben vakcina stabilizátorkénti alkalmazás céljára. A szakirodalomból ismertek az életképes VZV fenntartására alkalmazható készítmények, például az SPGA.

A VZV-vakcina ipari léptékű előállításának fő korlátja az ismert sejttenyésztő rendszerekből kapható sejtmentes VZV hozama. A sejtmentes VZV hozama körülbelül 5-20-szorosára növelhető a találmány szerinti új eljárás alkalmazásával.

Ennek megfelelően a találmány tárgya egy eljárás élő, gyengített, sejtmentes VZV-vakcina előállítására nagy hozammal.

A szakirodalomból ismert egyrétegű sejttenyésztő eljárások cm²-enként körülbelül 80 000-160 000 sejtet eredményeznek [Mann, Dev. Bioi. Stand., 37, 149-152 (1977); Wood and Minor, Biologi-cals 18, 143-146 (1990)]. Az egyrétegű sejttenyészetek virális antigének előállítására való alkalmazásának az a korlátozott sűrűség szab határt, amelyig ezek az egyrétegű sejttenyészetek szaporíthatok.

A sejttenyészetek sűrűségének növelésére irányuló próbálkozások eredményeként speciális perfúziós tenyésztőedények alkalmazásával a telítési sűrűséget körülbelül lxlO⁶ sejt/cm²-re növelték [Mann, Dev. Bioi. Stand., 37, 149-152 (1977)]. A találmány szerinti megoldás egyedülálló módszert jelent a sejthozam növelésére a már ismert sejttenyésztő rendszerek alkalmazásával.

A találmány szerinti eljárással a tapadó sejtek sokkal nagyobb sűrűségig szaporíthatok, mint ami ezidáig lehetséges volt, ezáltal az egysejtrétegeken vakcina előállítása céljából tenyésztett vírusok hozama magasabb lesz.

A találmány további tárgya egyrétegű sejttenyészetek előállítására alkalmas új kompozíció. Az egyrétegű sejttenyészetek előállítására gazdag tenyésztőközeget kell alkalmazni szemben a minimális tápközeggel, és a gazdag tápközeget egy optimalizált koncentrációjú lipiddel kell kiegészíteni. A találmány szerinti új tenyésztőközeg alkalmazásával - amely egy körülbelül 0,02-0,4 g/ml szójabablipiddel kiegészített SRFE-2 tápközeg - lényeges növekedés érhető el az egyrétegű sejttenyészet sűrűségében. Az így elért, megnövekedett egyrétegű sejttenyészet-sűrűség az antivirális vakcinák gyártására alkalmazható virális antigének fokozott termelésére alkalmazható.

Egy adott vakcina előállítására alkalmazva a találmány eljárást jelent nagy mennyiségű, élő, gyengített, sejtmentes VZV-vakcina előállítására, amely vakcina bárányhimlő megelőzésére alkalmas, és amely eljárás értelmében a VZV-t optimális körülmények között tenyésztjük egy sejttenyészetben, majd a vírust olyan körülmények között gyűjtjük össze, amelyek a VZV hozamát és stabilitását maximalizálják. Az optimalizált eljárás lépései az alábbiak:

a) VZV-fertőzésre érzékeny, humán diploid sejtek közül választott sejteket, például az MRC-5-öt egybefolyó egyrétegű sejttenyészet kialakulásáig tenyésztünk nagy térfogatú vagy gazdag tenyésztőközeget alkalmazva, amely egy nem metabolizálódó diszacharidot, például szacharózt tartalmaz;

b) az a) lépés szerint előállított sejttenyészetet a sejtek egybefolyásához lehetőleg legközelebb eső időpontban fertőzzük a gyakorlatilag lehető legnagyobb fertőzési faktoré VZV-vel fertőzött sejtekkel;

c) a VZV-vel fertőzött tenyészetet 22-96 órán keresztül a jóltápláltság állapotában tartjuk, és a VZV-termelés tetőpontjának elérésekor összegyűjtjük a sejteket;

d) a VZV-fertőzött sejtek összegyűjtése előtt a VZV-fertőzött tenyészetet fiziológiás oldattal mossuk, amely adott esetben lizoszomotróp szert, például ammónium-kloridot vagy klorokvint tartalmaz;

e) a VZV-fertőzött sejteket minimális térfogatú stabilizáló oldatban összegyűjtjük, és a sejteket vagy azonnal feltáijuk, vagy a sejteket lefagyasztjuk egy későbbi feltárásig;

f) a VZV-fertőzött sejtek feltárásával optimális mértékben szabaddá tesszük a sejthez kapcsolódó VZV-t, és a sejttörmeléket eltávolitva sejtmentes VZV-készítményt kapunk.

Az ábrákat röviden az alábbiakban ismertetjük.

1. ábra: VZV PFU-hozamok szacharózzal kiegészített tápközegben;

2. ábra: Sejtmentes VZV-antigén-hozamok;

3. ábra: N7N stabilitása SPGA-stabilizátorban

-20 °C-on vagy 4 °C-on;

4. ábra: VZV PFU-hozamok, amelyeket különböző tenyészközegek alkalmazásával értünk el;

5. ábra: Betáplált sejthez kötött MOI hatása a sejtmentes VZV hozamára;

6. ábra: VZV virális antigénhozamok a bevitt MOI függvényében.

A találmány szerinti eljárásban a sejteket egyrétegű sejttenyészetben szaporítjuk. A találmány célja a megtapadó sejttenyészetben fokozott sejtsűrűség elérése volt.

HU 220 080 Β

Ezt a célt egy dúsított tenyésztőközeg alkalmazásával értük el, amely lipiddel van kiegészítve optimalizált koncentrációkban. A találmány szerinti egyrétegű sejttenyészeteket a találmány szerinti új lipidtartalmú tápközegben tenyésztve jelentősen fokozódik a virális plakk-képző egységek (PFU-k) hozama, vagy a virális antigén termelés. A találmány szerinti sejttenyésztési eljárás alkalmas hepatitis A vírus, varicella zoster vírus, rubeola, rotavírus, kanyaró, polio, mumpsz és egyéb virális vakcinák előállítására.

Ebben az eljárásban előnyösen alkalmazható gazdag közeg az SRFE-2 [kereskedelmi forgalomban hozzáférhető a SIGMA Chemical Co.-tól, (St. Louis, MO, S2138) vagy a Serva Fine Chemicals-től (Heildelberg, NSZK 47523)]. Ezt a tápközeget Weiss és munkatársai ismertették [In Vitro 16(7), 616-628 (1980)]. A találmány értelmében alkalmazhatók, ezzel ekvivalens egyéb közegek vagy olyan közegek, amelyekben az SRFE-2 összetételét kis mértékben megváltoztattuk.

Számos ismert lipidadalék alkalmazható a találmány értelmében. így például felnőtt marha szérumából származó, koleszterinben gazdag lipidek (SIGMA Chemical Co., katalógusszám L-4646), az EX-CYTE lipid I vagy a nagyon alacsony endotoxin (VLE) lipid (MILES Inc., katalógusszám 82-004-7-től 82-004-8 és 82-019-1) megfelelően alkalmazhatók a (tápanyagokban) gazdag közeg adalékaként. Egy előnyös lipid-adalékanyag a kereskedelmi forgalomban kapható szójabablipid extraktum, amely a Boehringer Mannheim Biochemicals-től (Indianapolis IN, katalógusszám 1074 482) szerezhető be. Ezt az anyagot és egy hasonló anyagot Iscove és Melchers [J. al. Exp. Medicine, 147, 923-933 (1979)] ismertettek B-limfocita tenyészetekben a szérum helyettesítőjeként. Ebben a cikkben nem említik, és a Boehringer Mannheim katalógus termékismertetőjében sem említik azt, hogy a szójabablipid-adalék alkalmazható lenne gazdag tápközegek kiegészítőjeként. A fenti irodalmi helyek szerint ezt a lipidet minimál tenyésztőközegekben a szérum helyettesítőjeként alkalmazzák. A találmány értelmében ez a lipid viszont egy gazdag tápközeg kiegészítője. Ezenkívül, a fenti irodalmi helyek szerint a lipidet körülbelül 10-100 pg/ml koncentrációban alkalmazzák. A találmány értelmében a lipidet olyan koncentrációkban alkalmazzuk optimálisan, amely 2-3-szor nagyobb, mint a szakirodalomban vagy a gyártó által javasolt koncentráció. Ezenkívül a találmány értelmében a lipidadalékot nem a szérumadalék helyett, hanem amellett alkalmazhatjuk.

A találmány szerinti eljárásban az MRC-5 sejteket, a WI-38 sejteket, a verosejteket vagy a vírus szaporítására alkalmas egyéb sejttípusokat sejttenyésztő edénybe oltjuk le. A kezdeti sejttelepítési fázist vagy egy minimáltápközegben, például EMEM-ben vagy EMBE-ben, vagy egy gazdag tápközegben, például SRFE-2 közegben hajtjuk végre lipidadalék nélkül. Előnyösen alkalmazhatunk körülbelül 10% borjúembrió-szérumot (FCS-t), egy antibiotikumot, például neomicint (körülbelül 50 pg/ml koncentráció megfelelő) és L-glutamint (körülbelül 2 mmol/1 koncentrációban). A sejteket a sejt és a vírus szaporodását megengedő hőmérsékleten, rendszerint körülbelül 34-37 °C-on, előnyösen körülbelül °C-on tenyésztjük az előállítandó vírustól függően, néhány napon keresztül.

Miután a sejtek már nyilvánvalóan megtapadtak, és egyrétegű sejttenyészetet képeztek, a minimálközeget vagy a gazdag közeget eltávolítjuk, és friss, gazdag közeggel helyettesítjük, amelyet optimális koncentrációban lipiddel egészítettünk ki.

Egy további tenyésztési periódus után a közeget ismét eltávolíthatjuk, és friss, lipidkiegészítés nélküli gazdag közeggel helyettesíthetjük. A lipid jelenléte azután, hogy az összefolyó sejttenyészet kialakult, tapasztalataink szerint ellentétes hatást vált ki, és csökkenti a maximális sejthozamokat.

Ha az egyrétegű sejttenyészetet egy virális inokulummal kell fertőzni, a lipidkiegészítőt elimináljuk, és a virustörzstenyészetet egy adag friss gazdag közegbe visszük be. A lipid hiánya ebben az új tápközegben elősegíti a nagyobb sejtszaporodást anélkül, hogy a lipid által indukált sejtcsökkenés fent említett problémája felmerülne.

A fentiekben ismertetett eljárással lényeges növekedést lehetett elérni a sejt- és vírushozamban. így például MRC-5 sejteken szaporított varicella vírus esetén jelentős növekedést értünk el a VZV PFU-hozamban ahhoz képest, amikor az MRC-5 sejteket minimálközegben vagy SRFE-2 közegben tenyésztettük. Hasonlóképpen varicellatermelésre vagy rubeolavírus-termelésre alkalmazható WI-38 sejtekkel is lényegesen nagyobb denzitást lehetett elérni, ha a találmány szerinti új eljárás szerint szaporítottuk azokat.

Egy adott vakcina előállítására alkalmazva, a találmány szerinti új eljárás abból áll, hogy a VZV-t sejttenyészetben szaporítjuk, és a kapott VZV-t olyan körülmények között gyűjtjük össze, amelyekkel a vírushozam és stabilitás optimalizálható. A N7N előállítására ismertetett előnyök elérhetők egyéb tokos vírusok termelésében is, beleértve a VZV-től eltérő herpeszvírusokat, a kanyarót, mumpszot és rubeolát.

A találmány végső célja az volt, hogy olyan eljárást dolgozzunk ki, amely lehetővé teszi a VZV hatékony előállítását vakcinakénti alkalmazásra. Az eljárás sikere a sejtmentes N2N végső hozamával mérhető, amelyet az eljárás egyes lépéseinek optimalizálásával értünk el. A hozamot a végső, sejtmentes VZV-készítmény infektív titerével határoztuk meg. A varicella zoster vírus (VZV) készítmények infektív titereit agaróz-felülrétegző vagy folyékony felülrétegző eljárással határoztuk meg Krah és munkatársai módszere szerint [J. Virol. Methods, 27, 319-326 (1990)]. Röviden, ebben az eljárásban az MRC-5 sejteket - amelyek VZV-fertőzésre érzékenyek - aktívan szaporodó állapotig tenyésztjük, azaz addig a pontig, amikor a sejtek körülbelül 50-80%-ban egybefolyóak. Ezután az egyrétegű sejttenyészetre minimális térfogatban feiülrétegezzük a vírust, hagyjuk, hogy azok a sejtekhez kötődjenek, majd újabb tenyésztőközeget adunk hozzá. Néhány napos szaporítás után a sejteket egy proteinfestékkel hozzuk érintkezésbe, és a tarfoltokat, azaz a plakkokat összeszá3

HU 220 080 Β móljuk. így egy ismert térfogatú vírusinokulumra, a milliliterenként! plakk-képző egységek száma (PFU) a vírushozam jó mértékét jelenti. A bármely víruskészítményből kapott sejtmentes vírus teljes térfogatával megszorozva kiszámíthatjuk a PFU összes számát.

Magának a vizsgálatnak a változékonysága miatt az egy adott, optimalizálással kapott PFU-növekedést egy kevésbé optimalizált eljárási lépéssel összehasonlítva, arányként adjuk meg. A vírushozam növekedésének szorzószámkénti megadásával így kiküszöbölhető magának a PFU-vizsgálatnak a változékonysága. Végső soron a találmány szerinti eljárási lépések összegzett eredménye körülbelül 16-20-szoros növekedést eredményez a VZV-hozamokban az ismert eljárásokkal elérhető hozamokhoz képest. Ilyen nagymértékű hozamfokozódást az irodalomban nem ismertetnek, ezért a találmány szerinti eljárás jelentős előrelépést jelent a N7Nvakcina-termelésben.

Mivel a VZV-plakk-vizsgálat időigényes, nem különösebben alkalmas az eljárás kontrollálására. Egy gyors, VZV antigén ELISA vizsgálat alkalmas a VZVantigén mennyiségeinek mérésére, és így a vírusszaporodás nyomonkövetésére az élő varicellavakcina gyártása során. Ezenkívül, ez a teszt alkalmazható a VZV antigénmennyiségének meghatározására is a derített, szonikált vakcinatömegben, és potenciálisan alkalmas az antigén mérésére a letöltött, liofilizált vakcinafiolákban is. Röviden, ebben a vizsgálatban a vizsgált mintákból származó VZV-antigént egy anti-VZV-szérummal inkubáljuk oldatban. A maradék szabad antitestet ELISA miktrotitráló lemezeken immobilizált VZV-antigénhez hagyjuk kötődni. A lemezekhez kötődni képes antitest mennyisége fordítottan arányos a vizsgált mintában lévő antigén mennyiségével. A lemezekhez kötődött antitest mennyiségét egy enzimkötött antihumán antitesttel és megfelelő szubsztráttal reagáltatva határozzuk meg, amely egy spektrofotometriásán mérhető színes terméket eredményez.

A VZV-antigén ELISA és a VZV plakk vizsgálatoknak általában egymással korrelációban lévő adatokat kell szolgáltatnia, de figyelembe kell venni azt is, hogy a VZV-antigén-vizsgálat a nem életképes VZV-t is kimutatja az életképes VZV mellett. Mivel az elpusztult VZV elleni immunválaszról nem mutatták ki, hogy olyan hatásos lenne, mint az élő, gyengített vírusra adott válasz, a VZV-vakcinák vírusinokulum dózisának meghatározására a plakkvizsgálat a mérvadó. Azonban az antigénvizsgálat is értékes, amennyiben ezzel mérhető az összes antigénterhelés, amelyet a VZV-vakcina recipiensnek adtunk, gyorsabb, mint a PFU-vizsgálat, és ezért lehetővé teszi a VZV-termelés folyamatának nyomonkövetését, legalábbis korrelációban van a N7N PFU-termelés tetőpontjával, azáltal lehetővé teszi vírusösszegyűjtés optimális idejének meghatározását.

A találmány szerinti eljárás eredményessége erősen fokozható az alábbi kritikus paraméterek bármelyikével, amelyek mindegyike a találmány oltalmi körébe tartozik:

a) VZV-fertőzésre érzékeny humán diploid sejtek közül választott, például az MRC-5 sejtek tenyésztése egybefolyó tenyészet kialakulásáig egyrétegű tenyészetben, nagy tenyésztőtérfogatok vagy gazdag tenyésztőközegek alkalmazásával, nagy fokú sejtosztódás eléréséig, és egy nem metabolizálódó diszacharid, például szacharóz beadagolása:

Különböző sejttenyésztő rendszerek bármelyike alkalmazható, amely a szakirodalom szerint alkalmas VZV-termelésre. így például verosejteket, WI-38 sejteket, MRC-5 sejteket és különféle egyéb sejttípusokat alkalmazhatunk erre a célra. Mi következetesen MRC-5 sejteket alkalmaztunk, amelyek humán alkalmazásra szánt vakcinák termelésére elfogadhatók. Nem elképzelhetetlen azonban, hogy a leírásban ismertetett hozamoknál magasabb sejtmentes hozamok érhetők el, hogyha egy MRC-5-től eltérő, különösen produktív sejtvonalat alkalmazunk. Amennyiben egy ilyen sejtvonal alkalmazható a találmány szerinti eljárásban, a találmány magában foglalja az eljárás alkalmazását ilyen sejtekre is.

A sejtmentes, élő vírushozamok összehasonlítására még nem egybefolyó, vagy egybefolyó MRC-5 egyrétegű sejttenyészetekben, amelyeket 35 °C-on, 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában Eagles-féle minimáltáptalajban (EMEM) inkubáltunk 2% vagy 10% boíjúembrió-szérum (FCS) jelenlétében, kimutatható, hogy a sejtek egybefolyásának hatása van a sejtmentes VZV plakk-képző egység (PFU) hozamra (lásd 2. példa,

1. táblázat).

Az egybefolyó egysejtrétegek alkalmazása körülbelül 2-3-szoros növekedést eredményez milliliterenként, a sejtmentes PFU-számban, a még nem egybefolyó egysejtrétegek fertőzésével elért hozamhoz képest, akár aktívan szaporodnak a még nem egybefolyó tenyészetek (10% szérum jelenlétében), akár nem (2% szérum jelenlétében). Ezért úgy tűnik, hogy vakcinatermelési eljárásban a VZV hozamának fokozására egybefolyó, de nem aktívan szaporodó sejtek szükségesek.

Úgy tűnik, hogy a vírusszaporodás során a jelen lévő borjúembrió-szérum százalékos mennyisége nem befolyásolja jelentősen a sejtmentes PFU-hozamokat. így a sejtek szaporodási fázisában az FCS rendszerint körülbelül 10% mennyiségben van jelen, míg a vírus szaporodási fázisában az FCS körülbelül 2% mennyiségben van jelen akár a minimáltápközegben, például EMEM-ben vagy EBME-ben, akár a gazdag közegben, például SRFE-2-ben, amelyet a sejt szaporítására és a vírus tenyésztésére alkalmazunk.

Az FCS-en és a tápközegen kívül rendszerint egy antibiotikumot, például 50 pg/ml neomicint és glutamint (körülbelül 2 mmol/1) is adunk a sejttenyésztő és vírusszaporító közeghez.

1. Sejttelepítési fázis

A sejttenyésztő edényeket (lombikokat, forgólombikokat vagy az ilyen tenyésztőedények funkcionális ekvivalenseit) beoltjuk az MRC-5-tel vagy egyéb diploid sejttel úgy, hogy a sejtek kiindulási koncentrációja körülbelül 10 000-40 000 sejt/cm². A sejteket körülbelül 10% borjúembrió-szérummal kiegészített tenyésztőközeggel tápláljuk, 5% szén-dioxid-tartalmat biztosítunk, és 30-37 °C-on, előnyösen körülbelül 35 °C-on inkubáljuk.

HU 220 080 Β

A sejteket olyan kis térfogatokban telepíthetjük, amely ahhoz szükséges, hogy a stacioner tenyészetben szaporodó sejtek tökéletesen befedjék a felületet. A térfogat felülethez viszonyított aránya például körülbelül 0,5 ml tenyésztőközeg/cm² tenyésztőfelület. Ha a sejteket forgó lombikokban tenyésztjük, már 125 ml térfogat is elegendő 850 cm² felületre, de körülbelül 425 ml/cm² az előnyös mennyiség.

A sejttenyésztésre ismerten alkalmazható, kereskedelmi forgalomból beszerezhető minimáltápközegeket, például Eagles minimál esszenciális közeget (EMEM) vagy Earle-féle sókkal kiegészített Eagles alapközeget (EBME) alkalmazhatunk körülbelül 10% FCS-sel kiegészítve a sejttelepítési fázisban. E fázisban előnyösen egy gazdagabb közeget is alkalmazhatunk. Az SRFEközeg [Weiss és munkatársai, In Vitro 16(1), 616-628 (1980)], amelyet a Sigma cégtől lehet beszerezni, egy gazdag közeg, amelyet előnyösen alkalmazhatunk ebben a fázisban, de a gazdag tápközeg nem kritikus a találmány szerinti eljárás e fázisában.

2. Sejtszaporítási fázis

Az eljárás ezen fázisában kritikus a megfelelő tápanyag biztosítása, hogy a sejtek szaporodását az erős egybefolyásig biztosítsuk. Ennek elérésére nagy térfogatban adjuk a minimálközeget, vagy kisebb térfogatban a gazdag közeget. A sejteket körülbelül 30-37 °Con, és előnyösen körülbelül 32-35 °C-on szaporítjuk.

Miután a sejteket meghatározott időn át hagytuk megtapadni és szaporodni, a sejteknek újabb tápanyagot biztosíthatunk oly módon, hogy eltávolítjuk a tápközeget és friss tápközeggel helyettesítjük, majd folytatjuk az inkubálást. A tápközeget leszívatással vagy dekantálással, vagy egyéb módszerrel távolíthatjuk el, amennyiben azzal az egysejtréteg integritását nem bontjuk meg. A fenti módon telepített MRC-5 sejtek esetén a tápközegek cseréjét körülbelül 72 órával azután végezhetjük, hogy a tenyésztőedénybe a sejteket bevezettük.

A cserére alkalmazott tenyészközeg térfogata azonos lehet a sejttelepítési fázisban alkalmazott térfogattal. Előnyösen azonban egy nagyobb térfogatot alkalmazunk a sejtszaporítási fázisban, mint amelyet a telepítési fázisban alkalmaztunk. Ez különösen jelentős abban az esetben, ha a sejteket minimáltápközegben, például EMEM vagy EBME+FCS közegben tenyésztettük. Nagy tenyésztőtérfogat az egyik módja annak, hogy a sejteket megfelelően tápláljuk.

A nagy térfogatigényt csökkenthetjük, ha a szaporodási fázisban alkalmazott tápközeg egy gazdag tápközeg. Egy különösen előnyös tápközeg erre a célra az SRFE-2 (SIGMA). Ebben a fázisban egy gazdag tápközeg alkalmazása minimáltápközeg helyett jelentősen fokozza az egybefolyáskor az egysejtréteg denzitását. A megnövekedett sejtdenzitás biztosítja a tápközegben tenyésztett fertőzött sejtekből nyerhető VZV hozamának növekedését. így a sejtszaporodási fázisban a dúsított tápközeg alkalmazása körülbelül 2-4-szeres növekedést eredményez a végső VZV-hozamban ahhoz képest, amikor a sejteket minimáltápközegben tenyésztjük ebben a szakaszban.

Egy előnyös kiviteli mód szerint az SRFE-2-t lipiddel egészítjük ki. A különféle lipidadalékok bármelyike alkalmazható. így például felnőtt szarvasmarhaszérumból származó, koleszterinben gazdag lipidek (SIGMA Chemical Co.), az EXCYTE lipid I vagy igen alacsony endotoxin (VLE) lipid (MILES) tapasztalataink szerint alkalmazható gazdagtápközeg- vagy minimáltápközeg-kiegészítőként. A kereskedelmi forgalomból beszerezhető szójabablipid [Boehringer Mannheim, lásd még Iscove és munkatársai, J. Exp. Med., 147, 923-933 (1978)] nagyon előnyös kiegészítőnek bizonyult, hogyha körülbelül 0,2 mg/ml koncentrációban alkalmaztuk. SRFE-2 plusz lipid és FCS alkalmazásával körülbelül 500 000/cm² sejtdenzitásokat értünk el. Nagyobb VZV-hozamokat kaptunk, ha lipideket alkalmaztunk, függetlenül attól, hogy a sejt szaporítását minimáltápközegben vagy dúsított tápközegben végeztük. Kereskedelmi forgalomban kapható anyagot alkalmaztunk, amely 20 mg/ml lipidet és 100 mg/ml szarvasmarha-szérumalbum int tartalmazó törzsoldatként állt rendelkezésre. Ezt az anyagot szokásosan 1:100 véghígításban alkalmaztuk. A végső VZV-hozam körülbelül 9-szeresére növekedett a csak EMEM alkalmazása esetén kapott hozamnak, és körülbelül 3,3-szeresére a csak SRFE-2 közeg alkalmazása esetén kapott hozamnak, ha az SRFE-2-t körülbelül 0,2 mg/ml szójabablipiddel egészítettük ki a sejtszaporítási fázisban.

3. Fertőzést megelőző fázis

Felismertük, hogy a N7N végső hozama tovább növelhető, ha a tenyésztett sejteket egy nem metabolizálható, nem toxikus diszachariddal hozzuk össze optimális koncentrációban a VZV-fertőzést megelőzően. Egy nagyon eredményes kiviteli alakban körülbelül 20-68 mmol/1 szacharózt adunk körülbelül 72 órával a sejtek bevezetése után a tenyésztőedénybe, és előnyösen körülbelül 24-96 órával a tenyészet VZV-vel való fertőzése előtt. Gyakorlatilag körülbelül 50 mmol/1 szacharóz jelenléte a 2. lépésben alkalmazott friss tápközegben megfelel ezeknek a kritériumoknak, és a szükséges steril műveletek számát csökkenti, ezáltal ezt és a megelőző lépéseket gazdaságossá teszi.

Egyéb diszacharidok, például a laktóz, cellobióz és maltóz szintén növelik a végső VZV-hozamot, de előnyös a szacharóz. A vizsgált monoszacharidok, például a fruktóz és a ribóz nem fokozzák a VZV-hozamot (a ribóz még toxikus is lehet). Úgy tűnik, hogy a diszacharidok a szaporodó sejtek lizoszómáiban koncentrálódnak, és így vakuolákat képeznek [DeCourcy and Storrie, Exp. Cell Rés., 192, 52-60 (1991)], A diszacharid VZV-hozamra kifejtett fenti hatása a VZV lizoszomális károsodása gyengülésének következménye lehet. A diszacharidokon kívül a tri- és tetraszacharidok is várhatólag előnyös hatást fejtenek ki, mivel Cohn és Ehrenreich [J. Exp. Med., 129, 201-222 (1969)] hasonló vakuolaképződést figyeltek meg, amikor ezeket a nagyobb polimerizációs fokú cukrokat vagy szacharózt adtak makrofágoknak, ha a cukrokat a sejtek nem metabolizálták.

b) Az a) lépés szerint tenyésztett sejtek fertőzése az egybefolyási ponthoz lehető legközelebb eső fázis5

HU 220 080 Β bán a gyakorlatilag lehető legnagyobb mértékben fertőzött VZV-vel fertőzött sejtekkel:

A megismételt kísérletekben azt tapasztaltuk, hogy általában azok a sejtek, amelyeket az egybefolyó tenyészet kialakulása után 48 órán keresztül állni hagytunk, csak körülbelül 50%-át eredményezték annak a VZV PFU/ml hozamnak, amelyet akkor kaptunk, ha frissen egybefolyó sejteket fertőztünk VZV-vel. Ezért fontos, hogy a VZV-inokulumot lehetőleg abban az időpontban vezessük be a tenyészetbe, amikor az egybefolyóvá válik. Sajnos a tenyészet egybefolyása egy olyan paraméter, amely a tenyésztőközeg típusától, a tenyésztendő sejt típusától és az egyéb tenyésztési körülményektől függően változik. A fenti a) lépés 1) részében leírtak szerint telepített MRC-5 sejtek esetén a sejteket általában az egybefolyás elérésének pontjában fertőztük.

A varicella zoster vírus (VZV) előnyösen az US 3 985 615 számú szabadalmi leírásban ismertetett gyengített vírus Oka törzse, amely az ATCC-ben van letétbe helyezve. Ezt a vírust tengerimalac-embrió sejttenyészetben és humán diploid tüdő-fibroblast sejttenyészetben (MRC-5 sejtekben) való szaporodáshoz szoktatták.

A fertőző, életképes, varicellával fertőzött sejtek törzstenyészetét úgy állíthatjuk elő, hogy MRC-5 sejteket körülbelül 1:125 MOI-vel fertőzünk, a fertőzött sejteket olyan körülmények között tartjuk, amelyek lehetővé teszik a vírus szaporodását, a sejteket tripszinezzük, és a roncsolt sejteket azonnal felhasználjuk oltóanyagként, vagy későbbi alkalmazás vagy PFU-meghatározás céljából egy krioprotektív anyaggal, például DMSO-val vagy glicerinnel körülbelül 10⁷ sejt/ml koncentrációban lassan lefagyasztva tároljuk. A \7Nfertőzés létrehozására a fagyasztott, VZV-vel fertőzött sejttörzstenyészetet felolvaszthatjuk, és az egybefolyó sejttenyészethez adhatjuk.

Alternatív módon a VZV-vel fertőzött sejteket liofilizálhatjuk Hondo és munkatársai módszerével [Archív für die gesamte Virusforschung 40, 397-399 (1973)], így a liofilizált inokulum 4 °C-on hosszú időn keresztül tárolható. Sejtmentes VZV-t is alkalmazhatunk inokulumként, de az összegyűjtés során bekövetkező vírushozam-veszteség miatt előnyös a sejthez kötött inokulum alkalmazása.

A vírussal fertőzött, oltó törzstenyészet előállításának egy másik lehetséges módja az, hogy a vírus-oltóanyag termeléséhez a sejt szaporodását a vírustermelésre használt sejtek telepítése előtt megindítjuk. A termelősejtek telepítését abban az időpontban kezdhetjük meg, amikor a VZV-vel fertőzött sejtekkel megfertőzzük az oltósejteket, ezáltal az egybefolyó tenyészet ugyanabban az időpontban alakul ki, amikor a vírusoltóanyag eléri a VZV-titer tetőpontját. Kevésbé optimális, de kényelmesebb módon az oltósejteket és a termelősejteket azonos időpontban lehet telepíteni, a tenyésztőközeg kis térfogatában (körülbelül 125 ml/850 cm² forgólombik). Körülbelül 2-3 napos tenyésztés után a VZV-oltóanyag-termelésre szolgáló lombikokban a térfogatot körülbelül 425 ml-re növeljük, vagy gazdag közeggel újabb tápanyagot viszünk be, hogy a sejtek szaporodását egybefolyásig biztosítsuk. A termelősejteket viszonylag nyugvó állapotban hagyjuk kis térfogatú minimálközegben (amely 10% FCS-t tartalmaz), azon időpont előtt körülbelül 2 napig, amikor az oltósejteket VZV-vel fertőzött sejtekkel fertőzzük. Ebben a pontban a termelősejtek térfogatát körülbelül 425 ml-re növeljük, vagy gazdag közeggel, például SRFE2-vel plusz optimális mennyiségű szójabablipiddel és botjúembriószérummal újabb tápanyagot biztosítunk. A termelősejteket ezután erős egybefolyásig tenyésztjük. 2 nappal azután, hogy a termelősejteknek újabb tápanyagot adtunk, a működő oltósejteket - amelyek már összefolyó tenyészetet képeznek - VZV-vel fertőzött sejtekkel fertőzzük 1:125 vagy annál nagyobb MOI-vel, és a VZV-t körülbelül 2-3 napon keresztül hagyjuk tovább szaporodni. Mire az oltótenyészetben a VZV-termelés tetőpontját eléqük, a termelősejtek is elérik az egybefolyást. Ekkor az oltósejteket összegyűjtjük, és a termelősejtekhez adjuk.

Akármilyen is az oltósejttermelés időzítése, a N7Nfertőzés után megfelelő időpontban a VZV-vel fertőzött oltótenyészetről leszívatjuk a tenyésztőközeget, és a VZV-vel fertőzött oltósejteket tripszinezéssel (körülbelül 0,25% tripszin) vagy egyéb nem roncsoló módszerrel összegyűjtjük, és a termelő sejttenyészetet ismert MOI-vel fertőzzük.

Schmidt N. S. és Lennette Ε. H. [Infection and Immunity 14, 709-715 (1976)] leírták a magas MOI jelentőségét a magas VZV-hozamhoz, de nem tettek szigorú összehasonlítást az alacsony MOI-fertőzéssel. Találmányunkban ezt az összehasonlítást pontosan elvégeztük.

A sejteket VZV-vel fertőztük oly módon, hogy a sejttenyészetből eltávolítottuk a tenyésztőközeget, és ismert mennyiségű VZV-vel fertőzött sejtet tartalmazó friss közeggel helyettesítettük, amelyet a fentiek szerint állítottunk elő. A vírus-törzstenyészetet előnyösen varicella plakk-képző egységre (PFU) titráltuk, és megszámoltuk a recipiens sejteket, hogy kiszámíthassuk a fertőzési faktort (multiplicity of infection MOI). Az MOIket az inokulumban lévő VZV-vel fertőzött sejteknek az egyrétegű sejttenyészetben lévő, nem fertőzött sejtek számához viszonyított arányában fejezzük ki. így egy 1:10 MOI-érték magas, míg egy 1:625 érték alacsony. Kívánatos a magas MOI, de gyakorlatilag jó VZV-hozamok érhetők el már alacsonyabb, például 1:125 MOI-vel is.

1:7 és 1:625 közötti MOI-vel a hozamok a magas MOI-vel kapott 500 000 PFU/ml-től körülbelül 100 000 PFU/ml-ig változnak, amelyet alacsony MOIvel kapunk (lásd 3. táblázatot az 5. példában). Minél nagyobb az MOI, annál rövidebb a PFU tetőpontjának eléréséhez szükséges inkubációs idő, és annál nagyobb a hozam. így körülbelül 5-szörös hozamot lehet elérni a végső PFU-ban az MOI-től és a sejtösszegyűjtés idejétől függően.

c) A VZV-vel fertőzött tenyészetben a jóltápláltsági állapot fenntartása körülbelül 22-96 órán keresztül, és összegyűjtés a VZV-termelés tetőpontjának elérésekor:

A VZV-vel fertőzött sejtek tenyésztését a fertőzés után körülbelül 22-96 órán keresztül tovább folytatjuk.

HU 220 080 Β

A vírusszaporodás ezen fázisában kritikus a megfelelő táplálás fenntartása. Ezt vagy nagy térfogatú minimáltápközeg, például EMEM plusz körülbelül 2-10% FCS, vagy kisebb térfogatú gazdag közeg biztosításával étjük el. Legelőnyösebben SRFE-2 plusz 2-10% FCS-t alkalmazunk lipidkiegészítés nélkül. Megfigyeltük, hogy a lipid csökkentette a VZV-hozamot, hogyha ebben a fázisban adtuk a közeghez.

A tenyészet fertőzése után 22-96 órán keresztül a N7N a megfertőzött sejtekben szaporodik, és szóródva fertőzi a szomszédos sejteket. Azonban az öreg, fertőzött sejtekből nem kapunk ki nyerhető sejtmentes PFUkat. A VZV szaporodási görbéje, majd a letörés nagyon éles lehet. Ezért az összegyűjtés helyes időzítése kritikus paraméter lehet a fertőzőképes VZV hozamának maximalizálására, és pontosan reprodukálható, ha az MOI-bevitelt, a táplálást és az inkubációs időt pontosan szabályozzuk az egyes sarzsokban. Ezenkívül gyors VZV-antigén ELISA-t alkalmazhatunk az összegyűjtés időpontjának optimalizálására, mivel a fertőzőképes VZV-termelés összefüggésben van a VZV-antigéntermeléssel, legalábbis addig a pontig, amikor a víruspusztulás megindul (lásd 5. és 6. ábrát).

VZV-fertőzött MRC-5 sejtek esetén, amelyeket körülbelül 72 órával a fertőzés után gyűjtöttünk össze, amikor is az összes fenti lépést optimalizáltuk (azaz a tenyésztést gazdag közegben végeztük, és a fertőzést megelőzően a sejteket 50 mmol/ml szacharózzal 72 órán keresztül kezeltük), a sejtmentes VZV végső hozama körülbelül 16-szorosára nőtt ahhoz képest, amelyet minimáltápközegben kaptunk, amikor a vírust 48 óra elteltével gyűjtöttük össze, és még nagyobb volt a különbség, ha az összegyűjtést a 96. órában végeztük (lásd 8. példát, 1. ábrát). Ugyanezen optimalizált körülmények között a VZV-hozam csak körülbelül négyszerese volt annak, mint amelyet minimálközegben kaptunk, ha a vírust a fertőzés után 48 órával gyűjtöttük össze, de még mindig sokkal nagyobb volt, mint a minimálközegben 96 órás összegyűjtéssel kapott hozam. így a vírushozam sokkal nagyobb, és a víruspusztulás sokkal kisebb gazdag közegben, és nincs olyan meredek csökkenés a vírushozamban az idő függvényében. Az MOI is kevésbé kritikus gazdag közegben.

d) VZV-fertőzött tenyészet mosása adott esetben liposzomotróp szert, például ammónium-kloridot vagy klorokvint tartalmazó fiziológiás oldattal a VZVfertőzött sejtek összegyűjtése előtt:

A tenyészetből szérum, lipid és sejttörmelék eltávolítására az egyrétegű tenyészetet fiziológiás pufferrel mossuk, amely a sejteket nem lizálja. A fenti célra tökéletesen megfelel a foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS). A sejteket többször moshatjuk, és a mosóoldatot dekantáljuk, leszívatjuk, vagy egyéb olyan módszerrel távolítjuk el, amely az egysejtréteg integritását nem rombolja le.

Ha a sejteket kémiailag választjuk le a tenyésztőedényről, akkor azokat centrifugálással kell koncentrálni, és a fiziológiás puffért egy stabilizáló oldattal kell helyettesíteni.

Ammónium-klorid vagy klorokvin alkalmazása a sejt összegyűjtése előtt javította a végső VZV-hozamokat. Kielian és munkatársai [EMBO J. 5, 3103-3109 (1986)] ammónium-kloridot alkalmaztak a celluláris endoszómák belső pH-jának szabályozására, ahol a fertőző vírusok intracelluláris életüknek bizonyos részét töltik. Valószínű, hogy a sejtekben a lizoszomotróp szerek hatására a VZV-hozam növekedésének mechanizmusa kapcsolatban van a kevésbé durva endoszomális környezet kialakításával. A fertőzés előtt a sejtek terhelése nem toxikus, nem metabolizálható diszacharidokkal, például szacharózzal, és a sejtek kezelése ammónium-kloriddal vagy klorokvinnel hasonló mechanizmus szerint hathat. Mindenesetre empirikusan megerősítést nyert az a megfigyelés, hogy a végső VZV-hozamok növekednek, ha ammónium-kloridot adagolunk 1-100 mmol/1 végkoncentrációban, és legelőnyösebben 20-50 mmol/1 végkoncentrációban, előnyösen körülbelül 4 °C-on (25-50 percen keresztül) a sejt szétroncsolása előtt. Egy másik lizoszomotróp szer, a klorokvin körülbelül 230 pmol/l koncentrációban hasonló módon növeli a VZV PFU/ml hozamot.

e) VZV-fertőzött sejtek összegyűjtése minimális térfogatú stabilizáló oldatban, és a sejtek azonnali feltárása, vagy a sejtek fagyasztása későbbi feltárásig: Miután a VZV-fertőzött sejteket mostuk, azokat

- ha a tenyésztőedény ezt lehetővé teszi - lekaparással gyűjthetjük össze, vagy a sejteket kémiailag választhatjuk el. A sejtek enzimatikus felszabadítása kevésbé kívánatos, mivel a maradék enzim csökkentheti a vírushozamot, amikor a sejteket roncsoljuk. Mint azt fent említettük, ha a sejteket fiziológiás sóoldatban gyűjtjük össze, a sejteket centrifugálással koncentráljuk, és a fiziológiás sóoldatot minimális térfogatú VZV-stabilizáló oldattal helyettesítjük. Megfelelő térfogat a sejtszaporító felülethez viszonyítva a körülbelül 40 ml stabilizálószer/850 cm² felület.

A vírusstabilizátorok a szakirodalomból ismertek, így például az US 3 985 615 számú szabadalmi leírásban a stabilizálásra 5% szacharózt tartalmazó, foszfáttal pufferolt sóoldatot javasoltak, míg más szakirodalmakban komplexebb stabilizátorokat, például SPGA-t javasoltak.

Miután a VZV-fertőzött sejteket stabilizáló oldatban újraszuszpendáltuk, a sejteket azonnal roncsolhatjuk, vagy abban az esetben, hogyha nagy mennyiségű VZV-t állítunk elő, -70 °C-ra lefagyasztjuk későbbi feldolgozásig. A sejttenyészet cm²-ére számítva a VZVhozam kicsit nagyobb lesz, ha a sejteket azonnal roncsoljuk, de a fagyasztási lépés rendszerint nem okoz 10%-nál nagyobb veszteséget az azonnali feldolgozással kapott hozamban.

f) VZV-fertőzött sejtek roncsolása a sejthez kapcsolódó VZV optimális felszabadítására, és a sejtmentes VZV-készítmény előállítására a sejttörmelék eltávolítása:

Mint azt fent említettük, a sejtek feltárása előtt a tenyésztőközeget előnyösen elválasztjuk a sejtektől, és minimális térfogatú VZV-stabilizátorral helyettesítjük, amelybe a sejteket lekaparjuk, vagy egyéb módon felszabadítjuk. A sejtszuszpenziót 0-4 °C-ra hűtjük, majd a sejteket megfelelő eszközzel, például szonikálással,

HU 220 080 Β

DOUNCE-homogenizálással vagy a DOUNCE-homogenizálásnál nagyobb méretekben használható egyéb típusú nyírással, vagy a fenti módszerek kombinálásával roncsoljuk.

Kimutattuk, hogy a szonikálás önmaga nem biztosítja a sejtmentes VZV legmagasabb hozamát. Ténylegesen DOUNCE-homogenizálást alkalmaztunk kezdeti feltárási lépésként, majd centrifugáltunk, megtartottuk a felülúszót mint I. felülúszót, majd az üledéket szonikáltuk és újracentrifugáltuk, és így kaptuk a II. felülúszót, így a roncsolással kapott VZV-hozam jelentősen nőtt. Az I. és II. felülúszó kombinált hozama 4szerese is lehet annak a hozamnak, amelyet akkor kapunk, hogyha feltárási módszerként csak magát a szonikálást alkalmazzuk.

A sejtek szétroncsolása után a sejttörmeléket centrifugálással, szűréssel vagy egyéb olyan módszenei távolítjuk el, amely a szakirodalomból ismerten alkalmazható sejttörmelék eltávolítására, miközben a VZV sértetlen marad. A sejtmentes víruspreparátumot ezután stabilizáló oldattal hígítjuk, és több részre osztjuk vakcinaként! alkalmazásra. Hosszú távú tárolásra a VZV-t előnyösen liofilizáljuk az ismert módszerek valamelyikének alkalmazásával.

Összefoglalóan az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti eljárás optimalizált lépéseivel kapott lehetséges hozamnövekedéseket azzal a VZV-hozammal szemben, amelyet akkor kapunk, ha a sejteket minimálközegben tenyésztjük.

Eljárási lépés PFU-növekedés szorzószáma

Közeg/kiegészítők:

1. MOI 2-5

2. Sejtek egybefolyása 2-3

3. SRFE-2 közeg+lipid 2-3

4. Szacharóz a fertőzés előtti fázisban 2-5

5. Optimális közegtérfogat 1-2

Tiszta potenciális növekedés a közeg/stabilizátor kiegészítők és optimalizált fertőzési körülmények kombinációja esetén >8

Megfigyelt növekedés a 3., 4., 5. paraméter kombinációja esetén forgólombikban 16

6. Kombinált nyírás/szonikálás a sejthez kötött VZV felszabadítására 1,5 Összes potenciális növekedés a nem optimalizált eljáráshoz képest >18

A találmány szerinti eljárás használhatósága vakcina előállítására

A gyengített, sejtmentes VZV felhasználhatósága vakcinaként bárányhimlő megelőzésére kimutatott. Több klinikai vizsgálatban bizonyították ezt a felhasználhatóságot, és ez a bizonyíték ma már a technika állásának része [lásd például Pediatrics 88(3), 604-607 (1991); Pediatrics 87(5), 604-610 (1991)]. így a találmány jelentősége a technika állásához képest az, hogy nagy hatékonyságú eljárást biztosít élő, gyengített VZV előállítására nagy hozamokkal. A találmány szerinti eljárással előállított vírust a szakirodalomból ismert eljárásokkal vakcinává formálhatjuk, és a már ismert dózisokban adagolhatjuk. így például a találmány szerinti eljárással előállított élő, gyengített, sejtmentes VZV-terméket stabilizátorral hígíthatjuk, fiolákba tölthetjük, és egységdózisokban liofilizálhatjuk úgy, hogy 4 °C-on vagy annál alacsonyabb hőmérsékleten történő tárolással körülbelül 1000 PFU-dózis legyen elérhető az alkalmazás időpontjában. A találmány szerinti eljárással előállított VZV-vakcina-készítményt egységdózis készítmény formájában alkalmazhatjuk emberek oltására virulens VZV-törzsek által okozott fertőzés elleni védő immunválasz indukálására. Előnyösen legalább körülbelül 2000 PFU/ml (1000 PFU/0,5 ml) dózist adunk szubkután módon vagy intramuszkulárisan. Magasabb, öszszesen 15 000-20 000 PFU-t tartalmazó dózisok is alkalmazhatók és elfogadhatók.

A gyengített VZV-vírus előállítására alkalmas optimalizált eljárással a találmány lehetővé teszi a vakcina készítmény előállítását anti-VZV immunválaszok megerősítésére bárányhimlő megelőzése céljából.

A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni.

]. példa

VZV-hozam meghatározására szolgáló eljárás

A varicella zoster vírus (VZV) készítmények infektív titereit agaróz fedőréteg és/vagy folyékony fedőréteg eljárás alkalmazásával határoztuk meg Krah és munkatársai módszere szerint [J. Virol. Methods, 27, 319-326 (1990)]. A vizsgálatot az alábbiak szerint végezzük.

MRC-5 sejteket 60 mm-es szövettenyésztő lemezekre oltunk le 6xl0⁵ sejt/5 ml BME (Eagle-alapközeg Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldattal) közegbe, amely 100 mg/1 galaktózt, 50 pg/ml neomicint és 2 mmol/1 Lglutamint tartalmaz, és 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában 35 °C-on inkubáljuk. 24-48 órás inkubálás után a sejtek 50-80%-os egybefolyást émek el. A tápközeget leszívatjuk, és a sejteket 100 pl VZVoldattal fertőzzük, amelyet megfelelő vírushígítóval, például SPGA-pufferrel vagy cseppfolyós fenntartó közeggel (LMM) hígítottunk. Az SPGA-puffer 7,5 vegyes% szacharózt, 11 mmol/1 kálium-foszfátot, 0,1 vegyes% nátrium-glutamátot és 1% humán szérumalbumint tartalmaz. A vírust 35 °C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában >1 órán keresztül hagyjuk megtapadni. A VZV-vel fertőzött sejttenyészetet ezután 5 ml agaróz fedőrétegközeggel (AOM) vagy folyékony fenntartóközeggel (LMM) felülrétegezzük. Az agaróz fedőréteg közeg két oldat, a folyékony fedőrétegközeg (LOM) és agarózoldat elegye. Az LOM minimáleszszenciális-közeget tartalmaz Earle-féle sókkal (MEM), továbbá 2% hővel inaktivált borjúembrió-szérumot, 50 pg/ml neomicin-szulfátot és 2 mmol/1 L-glutamint. Az agarózoldatot úgy állítjuk elő, hogy 4,5 g alacsony gélesedési hőmérsékletű agarózt 100 ml MEM-ben 15 percen keresztül 121 °C-on melegítünk, majd az oldatot 45 °C-ra hagyjuk hülni. Az AOM-et úgy állítjuk elő, hogy 1 térfogat agarózoldatot 4 térfogat 1,25szörös koncentrált LOM-mal keverünk 45 °C-on. A lemezeket 23-25 °C-ra hűtjük, ezzel az AOM-ot hagy8

HU 220 080 Β juk megszilárdulni. A tenyészeteket inkubálva hagyjuk a plakkokat kifejlődni. 6-7 nap elteltével a lemezeket, amelyek LOM-ot kaptak, 5 ml foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) felülrétegezzük, és egy üveg Pasteur-pipettával fellazítjuk és eltávolítjuk az agarózt. A közeget leszívatjuk azokról a lemezekről, amelyek LMM-et kaptak, és a plakkokat 0,2 vegyes%-os Coomassie Blue R-250-t tartalmazó etanol/1% ecetsavoldattal megfestve vizualizáljuk. A plakkszámok 4-5 párhuzamos lemez átlagát jelentik, és plakk-képző-egység/ml-ben vannak kifejezve (PFU/ml).

A vizsgálat potenciális változékonysága miatt a VZV-hozamok növekedését a nem optimalizált körülmények között kapott azonos vizsgálattal meghatározott hozamokkal összehasonlítva adjuk meg.

2. példa

VZV-hozam a sejtek egybefolyásának függvényében a fertőzés időpontjában

MRC-5 sejteket 4 χ 10^{3 * * 6} sejt/150 cm² sűrűségben lemezre szélesztünk, és 3 napon keresztül szaporítjuk Earle-féle sókkal kiegészített Eagles alapközegben (EBME), 10% borjúembrió-szérum (FCS) jelenlétében. 12 χ 10⁶ sejt/150 cm² még nem egybefolyó sejtsűrűség elérésekor a sejtek tápközegét friss EBME-re cseréljük, amely vagy 2% FCS-vel, vagy 10% FCS-vel van kiegészítve. Az ebben a pontban még nem egybefolyó sejteket tovább szaporítjuk VZV-fertőzés (MOI=1:125) jelenlétében vagy anélkül, és a sejtsűrűség növekedését és a vírushozamokat 48 óra múlva meghatározzuk. Azt találtuk, hogy a nem fertőzött sejtek sűrűsége 2% FCSben csak 33%-kal növekedett, míg a 10% FCS-ben 92%-kal. A fertőzött tenyészetekben a sejtek száma nem növekedett. Az 1. táblázatból látható, hogy a még nem egybefolyó sejtekből kapott vírushozamokat nem befolyásolta a sejtek szaporodási képessége a tenyészetekben, sem minimális (2% FCS), sem maximális (10% FCS) FCS-kiegészítés mellett.

Más sejttenyészeteket további 2 napon keresztül szaporítottunk 10% FCS-ben körülbelül 20xl0⁶ sejt/150 cm² lombikfelület sűrűségig (egybefolyás feltétele), majd vagy 2% FCS-vel vagy 10% FCS-vel kiegészített friss EBME-tápközeget adtunk a sejteknek, és vagy VZV-vel fertőztük (MOI 1:125), vagy fertőzetlenül hagytuk. 48 óra elteltével meghatároztuk a sejtsűrűség növekedését és a vírushozamokat. Azt tapasztaltuk, hogy a 2% FCS-ben lévő fertőzetlen sejtek sűrűsége nem növekedett, míg a 10% FCS-ben szaporodó sejtek sűrűsége csak körülbelül 15%-kal növekedett. Tehát egyik feltétel mellett sem tudtak a sejtek nagymértékben szaporodni. A vírushozamok a 2% FCS és 10% FCS mellett hasonlóak voltak, és mindkét esetben körülbelül 3szorosára növekedtek annak a hozamnak, amelyet a még nem egybefolyó állapotban fertőzött sejtekből kaptunk (lásd 1. táblázatot). Ezáltal bizonyítottuk a sejtmentes NZN optimális hozama szempontjából a frissen egybefolyó egysejtrétegek előnyös alkalmazását, szemben az aktívan szaporodó, még nem egybefolyó egysejtrétegekkel.

1. táblázat

Egysejtréteg állapota fertőzéskor	% FCS a vírusszaporodás alatt	Sejtmentes PFU/ml	Sejtszaporodási képesség a vírusszaporodás alatt
A kísérlet	B kísérlet
Még nem egybefolyó	2	44 000	30 000	33%
	10	33 000	27 000	92%
Frissen egybefolyó	2	119 000	117 000	0%
	10	123 000	100 000	15%

3. példa

Frissen egybefolyó és elöregedett, egybefolyó sejttenyészetekből kapott VZV-hozamok összehasonlítása Forgólombikokat (850 cm²) körülbelül

500 sejt/cm² sűrűségben leoltunk MRC-5 sejtekkel. 45 Az összes sejtet 10 térfogat% borjúembrió-szérumot (FCS₁₀) tartalmazó EBME közegben szaporítjuk 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában, 35 °C-on.

A lombikokat két csoportra osztjuk, a VZV-vel végzett fertőzés idejének alapján. Az I. csoportba tartozó sejte- 50 két 5 napon keresztül tenyésztjük, amikor az egysejtrétegek egybefolyóvá válnak. Ekkor a tápközeget eltávolítjuk, és a sejteket sejthez kötött VZV-vel (MOI 1:125) fertőzzük, EMEM+2% FCS-ben szuszpendálva. További tápközeg hozzáadása után a sejteket még 55 48 órán keresztül inkubáljuk. AII. csoportba tartozó sejteket a fertőzés előtt (MOI = 1:125) további 48 órán keresztül szaporítottuk.

Az I. és II. csoportba tartozó sejtekben a VZV-termelést az alábbiak szerint határozzuk meg. A tápköze- 60 get a forgó lombikokból eltávolítjuk, és a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal öblítjük, azonos térfogatú stabilizátorba kapaijuk üveggyöngyökkel, és 4 °C-ra hűtjük. A hideg sejtszuszpenziókat szonikálással roncsoljuk. A sejttörmeléket a vírustól alacsony fordulatszámú centrifugálással távolítjuk el (325 xg 10 percen át), és a vírus-felülúszókat megtartjuk. A VZV-termelést plakkvizsgálattal méljük. A 2. táblázatból látható, hogy körülbelül kétszeres növekedést érünk el a hozamban, ha frissen egybefolyó egysejtrétegeket fertőzünk VZV-vel.

2. táblázat

Körülmény	PFU /ml
1. kísérlet	2. kísérlet
Frissen egybefolyó	121 000	190 000
Elöregedett egybefolyó	82 000	85 000

HU 220 080 Β

4. példa

A tenyészet térfogatának hatása a VZV PFU/ml hozamra millió MRC-5 sejtet oltunk 125 ml EBME-tápközegbe, amely 10% FCS-t, 50 pg/ml neomicint 5 és 2 mmol/1 L-glutamint tartalmaz, és a tenyészetet 850 cm² felületű forgólombikban 35 °C-on 3 napon keresztül inkubáljuk. A tenyészethez ezután 300 ml friss közeget adunk, és 35 °C-on 4 napon keresztül tovább inkubáljuk. A közeget ezután eltávolítjuk, és 125 vagy 10 425 ml EMEM-mel helyettesítjük, amely 2% hővel inaktivált FCS-t, 50 pg/ml neomicint és 2 mmol/1 L-glutamint tartalmaz. Hozzáadjuk a VZV-vel fertőzött MRC-5 sejteket (MOI körülbelül 1:125), a tenyészetet 5% szén-dioxiddal gázosítjuk, és 35 °C-on 46 órán ke- 15 resztül tovább inkubáljuk. A tápközeget eltávolítjuk, a sejteket 4x 100 ml PBS-sel mossuk, és üveggyöngyök segítségével 43 ml stabilizátorba kaparjuk. A sejteket -70 °C-on megfagyasztjuk. A sejtmentes vírust szonikálással állítjuk elő. A fertőző vírus mennyiségét a cent- 20 rifugálással derített szonikált tenyészetben VZV-plakkvizsgálattal határozzuk meg. Eredmények:

Közeg térfogata (ml)	VZV PFU/ml*
125	55 000; 45 000
425	153 000; 103 000

*Duplikát tenyészetekből kapott eredmények

5. példa

VZV MOI hatása a VZV PFU/ml hozamra Forgólombikokat MRC-5 sejtekkel beoltunk, és egybefolyásig szaporítjuk. A tápközeget eltávolítjuk, és a sejteket VZV-vel fertőzzük különböző MOI-kkel. A VZV-termelést a fertőzött sejttenyészetben plakkvizsgálattal határozzuk meg oly módon, hogy a sejteket periodikusan összegyűjtjük, és az 1. példában leírtak szerint vizsgáljuk. A 3. táblázatból és az 5. ábrából látható, hogy a sejtmentes, fertőző VZV hozama nagyobb, és rövidebb inkubálási idő alatt éljük el, ha magasabb MOI-t alkalmazunk. Az antigén maximális szintjét is gyorsabban értük el magasabb MOI-vel. Alacsony MOI-nél, például 1:125-nél az antigéntermelés késleltetett, és nem éri el az optimumot (lásd 6. ábrát).

3. táblázat

Betáplált sejthez kapcsolódó MOI hatása az MRC-5 egyrétegű sejttenyészetekből kapott sejtmentes VZV-hozamokra

MOI	Sejtmentes VZV-titer (PFU/ml) χ 10-3 Összegyűjtés ideje
22 óra	37 óra	42 óra	60 óra
1:25	100	450	50	nd
1:125	nd	150	325	100
1:625	nd	nd	100	90

nd=nem vizsgált

6. példa

VZV megnövekedett stabilitása egy stabilizátorban,

-20 °C-on

A fertőzött sejttenyészeteket SPGA-ban szonikáljuk és foszfáttal pufferolt sóoldattal mossuk. A sejthez kötődő vírust ezután szonikálással felszabadítjuk, és a sejttörmeléket centrifúgálással eltávolítjuk. A sejtmentes vírus koncentrációját ismert PFU/ml koncentrációra állítjuk, és a vírus alikvotjait stabilizátorban liofilizáljuk, és 4 °C-on vagy -20 °C-on tároljuk. 1 hónapos időközönként, összesen 14 hónapon keresztül a mintákat rekonstituáljuk, és a maradék PFU/ml titert meghatározzuk. A fenti kísérlet eredményeit a 3. ábra mutatja.

Lényegesen előnyösebb stabilitást kaptunk a VZVre, ha a tárolást -20 °C-on végeztük a szokásos 4 °C helyett.

7. példa

A sejtszaporodás előinkubálási fázisában a szacharózadagolás időzítésének és a szacharóz mennyiségének hatása a végső VZV-hozamra

1. Sejttelepítési fázis ml MRC-5 sejtet (120 000 sejt/ml, összesen 600 000 sejt) 60 mm-es lemezekre telepítünk 10% FCS-t, pg/ml neomicint, 2 mmol/1 L-glutamint tartalmazó EBME-közegbe, és 35 °C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáljuk.

2. Sejtszaporodási/fertőzés előtti fázis

A telepítést követő 3. napon a sejtek egybefolyóak. A telepítőközeget 48 lemezről leszívatjuk, és 8 ml tápközeggel helyettesítjük, amely vagy EBME-t vagy SRFE-2-t tartalmaz 10% FCS-sel, 50 pg/ml neomicinnel, 2 mmol/1 L-glutaminnal és 0,2 mg/ml szójabablipid/1 mg/ml BSA-val kiegészítve, 50 mmol/1 szacharózzal vagy anélkül. A friss tápközeg hozzáadása után a sejteket 3 napon keresztül tovább inkubáljuk 35 °C-on, 5% szén-dioxid-tartalom mellett.

3. VZV-fertőzés

Mindegyik lemezről eltávolítjuk a közeget, és 8 ml EMEM-mel helyettesítjük EBME helyett, és SRFE-2vel SRFE-2 plusz szójabablipidek helyett. Az FCS-t 2%-ra csökkentjük mindegyik lemezen, de az egyéb kiegészítőket, azaz a neomicint, glutamint és szacharózt ugyanolyan mennyiségben alkalmazzuk, mint a szaporodási fázisban. Mindegyik lemezt 333 pl VZVvel fertőzött sejtek 1:16 hígításával 47000 PFU/ml fertőzzük 2% FCS-t, neomicint és glutamint tartalmazó EMEM-ben.

HU 220 080 Β

A VZV-t 35 °C-on, 5% szén-dioxid-tartalom mellett 2 napon keresztül hagyjuk szaporodni, majd mindegyike változó feltétel esetén két-két lemezről eltávolítjuk a tápközeget. A sejteket négyszer mossuk PFS-sel. A sejteket 1,2 ml jéghideg stabilizátorba kaparjuk lemezenként. A duplikát lemezekről kapott, összegyűjtött sejteket 50 ml-es kúpos centrifugacsőben gyűjtjük össze, és -70 °C-on megfagyasztjuk.

A fenti bekezdésben ismertetett eljárást két-két lemezzel megismételjük minden egyes feltétel esetén a fertőzés utáni 3., 4. és 5. napon, és a két-két lemezről összegyűjtött sejteket -70 °C-on tároljuk.

A fentiek szerint elkészített, összegyűjtött sejteket később felolvasztjuk, csövenként 30 másodpercen keresztül jégen szonikáljuk egy cup-hom szonikátorban, és 1000 gvel 10 percen keresztül 4 °C-on centrifugálva derítjük. A felülúszóból alikvotokat veszünk plakkvizsgálathoz. Az 1. példában leírtak szerint végrehajtott plakkvizsgálat eredményeit az 1. ábrán mutatjuk be. Az 1. ábrán bemutatott adatok számos következtetést támasztanak alá:

1. A sejtek inkubálása a fertőzést megelőzően 50 mmol/1 szacharózzal nagyon előnyös a végső VZV-hozamra. Mindkét közegben, az EMEM-ben vagy SRFE-2-ben a VZV-hozamok magasabbak, ha a sejteket a fertőzés előtt szacharózzal kezeljük. 72 órával a fertőzés után a VZV-hozam SRFE-2-ben tenyésztett sejtekben, amelyeket szacharózzal kezeltünk, körülbelül 16-szorosa volt annak a PFU-ban kifejezett VZV-hozamnak, amelyet akkor kaptunk, hogyha a sejteket minimáltápközegben, szacharóz nélkül tenyésztettük.

2. Gazdag közeg (SRFE-2 plusz szójalipidek a sejtszaporodási fázisban, és SRFE-2 a vírusszaporodás során) biztosítása előnyös a VZV-hozamra, de a szacharóz hatásával együtt egy nagyságrenddel több VZV állítható elő. Ezért úgy tűnik, hogy a gazdag közeg és a szacharóz hatása egymást szinergetikusan fokozza.

3. A VZV összegyűjtésének időzítése nagyon jelentős. Még optimalizált tenyésztési körülmények között is (SRFE-2 és szacharóz, stb.) a N2N maximális hozama nem érhető el 48 órával a fertőzés után. Ebben a pontban csak egy négyszeres növekedés érhető el a minimális közegben kapott hozamhoz képest. Azonban a fertőzés után 72 órával a VZV-hozam növekedése körülbelül 16-szoros.

Egy másik kísérletsorozatban a VZV-hozam nem növekedett ilyen mértékben, ha az 50 mmol/ml szacharózt a fertőzés időpontjában adtuk a közeghez, nem 72 órával a fertőzés előtt, és ez jelzi a hosszú fertőzést megelőző fázis jelentőségét a szacharóz intracelluláris felhalmozódásához. Azt is kimutattuk, hogy 25 mmol/1 vagy 100 mmol/1 szacharóz hozzáadása kevésbé előnyös, mint 50 mmol/1 szacharózé. Közelítőleg ugyanezek a koncentrációk alkalmazhatók laktóz, cellobióz és maltóz esetén is.

8. példa

Vírushozamot fokozó eljárási paraméterek kombinált hatása a VZV-hozamra

Forgólombikos kísérletet végeztünk annak meghatározására, hogy a különféle paraméterek (tenyésztőközeg, szacharóz kiegészítés, ammónium-klorid hozzáadása a stabilizátorhoz, a vírussejtekből való felszabadítására szonikálás vagy Douncing alkalmazása) változtatása hogyan hat a sejtmentes VZV PFU-hozamokra. A tenyészetek telepítését 8xl0³ sejt/mlxl25 ml EBME, 10% FCS-sel végezzük forgólombikonként. A tenyészeteket 420 ml-re állítjuk EBME-vel, vagy a közeget SRFE plusz szójalipidközegre cserélve adunk újabb tápanyagot, és N7N oltótenyészettel fertőzzük 125 ml (kis térfogat) vagy 425 ml (nagy térfogat) EMEM- vagy SRFE-közegben (szójalipid nélkül). A fenti közegcseréket/fertőzéseket a 7. példában ismertetett időzítéssel végezzük. A fertőzés előtt különböző időpontokban (96 vagy 24 órával a fertőzés előtt, vagy a fertőzés időpontjában) szacharózt (suc) adunk 50 mmol/1 koncentrációban. Azok a tenyészetek, amelyekhez a fertőzést megelőzően szacharózt adtunk, a vírust tartalmazó fertőző közegben is kaptak szacharózt. Az összes tenyészetet körülbelül MOI=1:15 arányban fertőztük VZV-fertőzött sejtekkel EMEM-ben, a tenyészeteket a fertőzés után 46 órával 20 mmol/1 ammónium-kloridot (N) tartalmazó, vagy adalék nélküli stabilizátorba gyűjtöttük össze. Az összes mintát -70 °C-on fagyasztottuk, majd a sejtekből a vírust vagy szonikálással vagy DOUNCE-homogenizálással felszabadítottuk. Az öszszes mintát 1000 g-vel 10 percen keresztül centrifugálva derítettük.

A szonikált mintákból kapott PFU-eredményekből az alábbi következtetéseket vonhatjuk le:

1. Az EMEM nagy térfogatban való alkalmazása a VZV PFU-t kétszeresére növelte. SRFE esetén a fenti, és egyéb kísérletekből is úgy tűnik, hogy az optimális PFU-hozamok akkor érhetők el, ha a közeg térfogata az alacsonyhoz közeli. Bizonyos esetekben nagy közegtérfogatok esetén a hozamok csökkentek.

2. Az ammónium-klorid nem kritikus a nagy PFU-kinyerésekhez.

3. A szacharóz kétszeresére növelte a PFU-hozamokat az EBME/EMEM tenyészetekben, és ötszörösre az SRFEtenyészetekben. Úgy tűnik, hogy a szacharóz-hozzáadás időzítése is hatással van a PFU-ra. Egy másik kísérleti sorozatban a PFU-hozam 94xl0³ volt olyan SRFE plusz szója/SRFE tenyészetekben, amelyek nem kaptak szacharózt és 296 χ 10³,427 χ 10³, illetve 671 χ 10³ azokban a tenyészetekben, amelyek szacharózt kaptak a fertőzés időpontjában, 24 órával a fertőzés előtt, illetve 96 órával a fertőzés előtt.

4. A szacharózzal kezelt tenyészetek jelentősen kisebb citopatikus hatást mutattak, mint a szacharóztól mentes megfelelőik. Egy másik kísérletben a szacharózzal kezelt tenyészetekben még a fertőzés után 1 héttel sem látszott degeneratív citopatikus hatás, míg szacharózmentes kontrolijaik teljesen lizálódtak. Ezért lehetséges, hogy a szacharózzal kezelt sejtek több VZV-t halmoznak fel (antigént, és különösen PFU-t) hosszabb inkubációs idők alatt (a forgólombikos kísérletben alkalmazott 46 órás összegyűjtésen túl).

5. Az MOI-t nem állítottuk be ebben a kísérletben magasabb sejtkoncentrációra a fertőzés időpontjában, mivel a sejteket SRFE-közegben tenyésztettük. Azonban

HU 220 080 Β még nagyobb PFU-hozamokat lehetett volna kapni, ha ezt a paramétert is optimalizáltuk volna.

9. példa

Mechanikus nyírással, szonikálással és ezek kombinációjával elérhető sejtmentes VZV-hozamok Üzemi méretű kísérletet hajtottunk végre több körülmény változtatásával a VZV-termelésben, a 8. példában leírt kísérlethez hasonlóan. Ebben a kísérletben egy új paramétert, a sejtfeltárás módját vizsgáltuk. Az alább ismertetjük a csak DOUNCE-homogenizálással, a csak szonikálással, és a DOUNCE-homogenizálás és szonikálás kombinációjával kapott sejtmentes VZV-hozamok összehasonlítását. A N7N tenyésztési körülmények a minimáltápközegben (EBME/EMEM) vagy gazdag táp5 közegben (SRFE-2 plusz szójabablipidek/SRFE-2 plusz 50 mmol/1 szacharóz fertőzést megelőző fázisban) történt sejttenyésztésre vonatkoznak. A sejteket a 8. példában ismertetett módon szaporítjuk és gyűjtjük össze, és az 1. példában leírtak szerint határozzuk meg a VZV

PFU/ml hozamot.

4. táblázat

Sejtmentes PFU/ml (x 10~³)

Körülmények	Douncc	Szonikált Dounce-üledék	Összes hozam	Csak szonikált
EBME/EMEM	42	7	49	38
EBME/EMEM	64	4	66	46
SRFE-2+szacharóz	154	47	201	42

A fenti adatokból kitűnik, hogy a VZV-hozam lényegesen növekedik, ha a mechanikus nyírást a sejtek ultrahangos szétroncsolásával kombináljuk.

10. példa

SRFE-2 közeg és szójabablipid-adalék alkalmazása élővaricella-vakcina visszanyerésének fokozására MRC-5 sejtekből

MRC-5 sejteket 25 cm²-es T-lombikokba oltunk EBME-be, és 35 °C-on 3 napon át inkubáljuk. A tápközeget eltávolítjuk, 12,5 ml friss EMEM-közeggel vagy SRFE-2 közeggel helyettesítjük, amely 10% FCS-t, neomicint, glutamint és 1:200 hígítású szójabablipidet tartalmaz, vagy nem tartalmaz lipidet. A tenyészeteket 3 napon keresztül 35 °C-on tovább inkubáljuk. A közeget ezután eltávolítjuk, a sejtekhez VZV-vel fertőzött MRC5 sejteket adunk, és 12,5 ml térfogatban 2% boíjúembrió-szérumot, neomicint, glutamint EMEM-ben vagy SRFE-2-ben. Az SRFE-2 jelölésű tenyésztési körülmény azt jelenti, hogy a sejt tenyésztése és a vírus tenyésztése alatt SRFE-2-t alkalmaztunk. Az SRFE+szója azt jelzi, hogy a mintákhoz SRFE-2 közeget és 1:200-szoros hígításban szójabablipidet adtunk a sejttenyésztés során, de csak SRFE-2 közeget a vírustenyésztés során. 48 órán keresztüli tenyésztés után a tápközeget eltávolítottuk, és a sejteket 4 χ 5 ml PBS-sel öblítettük, és 1,2 ml stabilizátorba gyűjtöttük össze. A duplikát lombikokból származó mintákat egyesítjük, és -70 °C-on fagyasztjuk. Felolvasztás után a sejteket szonikálással roncsoljuk, 1000 gvel 10 percen keresztül centrifügálva derítjük, és a felülúszókat -70 °C-on fagyasztjuk a vírus infektív titerének meghatározásáig. Az eredményeket a 4. ábrán ismertetjük. Az eredményekből arra következtethetünk, hogy az SRFE-2 alkalmazása EMEM helyett 2,5-szeres növekedést eredményezett az élő varicella visszanyerésében. A szójabablipiddel kiegészített SRFE-2 alkalmazása a sejttenyésztési fázisban további 2,7-szeres növekedést eredményezett a vírusvisszanyerésben, és tisztán 7-szeres növekedést értünk el ezen felül, ha a vírustenyésztési fázisban EMEM-et alkalmaztunk.

11. példa

VZV-antigén meghatározása kompetitív ELISA módszerrel

Mivel a VZV-plakkvizsgálat időigényes, nem különösebben alkalmas a gyártási eljárás közbeni kontrollra. A gyors VZV antigén ELISA lehetővé teszi a VZV-antigén mennyiségének mérését, amivel a vírus szaporodása az élővaricella-vakcina gyártása során nyomonkövethető. Ezenkívül ezt a tesztet lehet alkalmazni a VZVantigén mennyiségének meghatározására a derített, szonikált vakcinatömegben, és potenciálisan alkalmas az antigén meghatározására a letöltött liofilizált vakcinafiolákban. Röviden, ezt a vizsgálatot úgy végezzük, hogy a vizsgált mintából származó VZV-antigént antiVZV-szérummal inkubáljuk oldatban. A fennmaradó, szabad antitesteket ELISA mikrotitráló lemezeken immobilizált VZV-antigénhez hagyjuk kötődni. A lemezhez kötődni képes antitest mennyisége fordítottan arányos a vizsgálati mintában lévő antigén mennyiségével. A lemezekhez kötődött antitestek mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy enzimkötött antihumán antitesttel és egy megfelelő szubsztráttal reagáltatjuk, és a reakció termékeként keletkezett színes terméket spektrofotometriásán meghatározzuk.

A VZV antigén ELISA és a VZV-plakkvizsgálat általában egymással korrelációban lévő adatokat szolgáltat, de nem szabad elfeledkezni arról, hogy a VZV-antigénvizsgálattal a nem élő sejtek is kimutathatók az élő VZV mellett. Mivel az elölt VZV által kiváltott immunválaszról kimutatták, hogy nem olyan hatásos, mint az élő, gyengített vírusra adott válasz, a plakkvizsgálat a kritikus módszer a VZV-vakcinák vírusinokulum dózisának meghatározására. Azonban az antigénvizsgálat is értékes, mivel lehetőséget ad a VZV-vakcina recipiensének beadott összes antigénterhelés meghatározására.

HU 220 080 Β

Vizsgálati eljárás:

1. ELISA-lemezeket VZV-vel fertőzött vagy fertőzetlen MRC-5 sejtekből származó glikoproteinekkel (gps) vonunk be, és 1% marha-szérumalbuminnal [V. frakció (A-9647 Sigma), 0,1% NaN₃] újra bevonjuk az antitestek lemezekhez való nem specifikus adszorpciójának csökkentése céljából. A váltakozó sorokat N7Nvel vagy kontrollantigénnel vonjuk be (azaz az A, C, E és G sorokba N7N gp-t, a B, D, F és H sorokba fertőzetlen MRC-5 gp antigént adunk).

2. A derített (3250g-min) vizsgált antigént stabilizátorral hígítjuk 12 χ 75 mm-es csövekben vagy mikrocsövekben. Egy standard vírusantigén készítményt (26 egység/ml VZV-antigén dót biot vizsgálat szerint) 1:10 arányban hígítunk, majd sorozathígítjuk l:l,25-szörö- 15 sére, ily módon 2,6, 2,1, 1,7, 1,3, 1,1 és 0,9 egység/ml antigén-koncentrációkat kapunk. További hígításokat is végezhetünk, amelyekkel 0,7 és 0,5 egység/ml antigénkoncentrációt állítunk elő. Ezt a hígítási sorozatot alkalmazzuk a vizsgált mintákban lévő antigén mennyiségé- 20 nek mérésére szolgáló standard görbe meghatározására.

3. A humán anti-VZV-szérumot stabilizátorral hígítjuk a kívánt véghígítás kétszeresére.

4. A mikrocsövekbe 300 μΐ hígított antigénmintákat mérünk, 300 μΐ hígított anti-VZV-szérummal elegyítjük, és 35 °C-on 15-22 percen keresztül inkubáljuk.

A kontroliban humán anti-VZV és hígítószer van (antigén nélkül).

5. Az egyes szérum-antigén elegyekből 100 μΐ alikvotokat adunk két párhuzamos VZV glikoprotein (VZV gp) bevonatú rezervoárba, és két párhuzamos MRC5 gp bevonatú rezervoárba (4 rezervoár/minta) (például 1. minta az 1. oszlop A, B, C és D sorában, 2. minta a 2. oszlop A, B, C és D sorában stb.).

6. A lemezeket 15 ±1 percen keresztül 35 °C-on inkubálva a szabad (az oldatban lévő antigénnel nem komplexált) antitestet hagyjuk a lemezen immobilizált vírus-antigénhez kötődni.

7. A kötődő antitestet mosással eltávolítjuk, és a rezervoárokba kecske anti-humán IgG-vel konjugált lú- 40 gos foszfatázt mérünk a kötött humán antitest meghatározása céljából.

8. 15±1 percen keresztül 35 °C-on végzett inkubálás után a meg nem kötött konjugátumot mosással el5 távolítjuk. A kötött konjugátum detektálására dietanolamin pufferben oldott p-nitro-fenil-foszfát szubsztráttal 15 percen keresztül inkubálást végzünk.

9. A szubsztrát reakciót 50 μΐ/rezervoár mennyiségben 3 mol/1 nátrium-hidroxid hozzáadásával leállítjuk, és a szín kifejlődését (OD 405 nm-en) mikrolemez spektrofotométer alkalmazásával határozzuk meg.

Vizsgálati eredmények kiszámítása és kiértékelése

1. A VZV-vel és MRC-5 sejtekkel bevont párhuzamos rezervoárokból kapott OD értékeket átlagoljuk. Kísérleteink szerint az MRC-5 OD értékek a különböző minták és hígítások között következetesek. Ezért az MRC-5 értékeket a teljes lemezre átlagoltuk, és a primer antitest vagy konjugátum fertőzetlen sejtextraktumokhoz való nem specifikus kötődésének korrigálására alkalmaztuk. A VZV-specifikus OD értékek (AOD) meghatározására az átlagolt MRC-5 OD értékeket levontuk a megfelelő, átlagolt VZV OD értékekből.

2. Standard görbe felvétele az antigén mennyiségének meghatározására. A standard görbe felvételére a

AOD értékeket ábrázoltuk az ismert antigén-koncentrációk (VZV egység/ml) függvényében. Az adatokat megfelelő grafikus programba (például Cricket Graph 1.3 verzió, Cricket Software, Maivem, PA) tápláltuk be, és meghatároztuk a görbe lineáris részét (legalább 4 pon30 tót kell tartalmaznia), és meghatároztuk az egyenes egyenletét (y=a+bx).

3. Vizsgálati mintákban lévő antigén mennyiségének kiszámítása. Az a és b értékek az egyenes egyenletéből megkaphatok, és y (AOD) ismert. A fennmaradó ismeretlen érték az x - amely az antigén egység/ml koncentrációját jelenti - kiszámítható, és a mintahígítást figyelembe véve megkapjuk a hígítatlan mintában az antigén koncentrációját. A számításra egy példát az alábbiakban közlünk:

Antigénminta	Hígítás	AOD	Egység/ml antigén egyenes egyenletéből	Egység/ml antigén A hígításra korrigált
A hígítás	1:2	y	x=(y a)/b	(x) (hígítási faktor)

A megadott antigén-koncentráció az, amely a legkevésbé hígított mintával olyan AOD értéket ad, amely a standard görbe lineáris részébe esik.

12. példa

VZV antigén ELISA és összehasonlítása a VZV

PFU-hozammal

A 7. példa szerint előállított sejtmentes VZV-mintákat, amelyekre a PFU/ml hozamot az 1. ábrán adtuk meg, all. példa szerinti VZV-antigén ELISA-val vizsgáltuk. Az eredményeket a 2. ábrán közöljük.

Látható, hogy a VZV-antigén folyamatosan növekedik 96 órán keresztül, noha az 1. ábra adatai szerint a PFU/ml érték csökken. Figyelemreméltó az is, hogy a

VZV-antigén szintje az SRFE-2 plusz szója plusz szacharóz tápközegben sehol sem közel 16-szorosa az antigén szintjének EMEM-ben (2. ábra), mégis az élő, sejtmentes VZV PFU/ml értéke annyi (1. ábra). Ebből az összehasonlításból kitűnik, hogy a szacharóz hatása játssza a főszerepet az életképes VZV fennmaradásában a fertőzés után 72 órával.

13. példa

MRC-5 sejtek szaporodásának fokozása SRFE-2 közegben szójabablipid-adalékkal MRC-5 sejteket oltunk le 25 cm²-es T-lombikokba,

000 sejt/ml koncentrációban, 10% FCS-t, 50 pg/ml neomicint és 2 mmol/1 L-glutamint tartalmazó 12,5 ml

HU 220 080 Β resztül, majd a közeget eltávolítjuk, a sejteket a lombikról tripszines kezeléssel leválasztjuk, és hemacitométerben megszámoljuk. A lombikokat további 3 napon keresztül inkubáljuk, és megszámoljuk a sejteket. Az eredményeket az alábbiakban ismertetjük.

EMBE-tápközegbe, és 35 °C-on inkubáljuk. 2-3 nap elteltével a tápközeget eltávolítjuk, és 12,5 ml friss tápközeggel vagy 10% FCS-t, 50 pg/ml neomicint, 2 mmol/1 L-glutamint és különböző mennyiségű szójalipidet tartalmazó SRFE-2 tápközeggel helyettesítjük. A hígítatlan szójalipid 20 mg/1 lipid és 100 mg/ml marha-szérumalbumint tartalmaz.

A kezdeti sejttelepítés után 6 nappal eltávolítjuk a tápközeget, és 12,5 ml, 2% FCS-t, 50 pg/ml neomicint és 2 mmol/1 L-glutamint tartalmazó EMEM-mel, vagy különböző mennyiségű szójabablipiddel kiegészített SRFE-2 közeggel helyettesítjük. A sejteket a kiválasztott lombikokról tripszines kezeléssel választjuk le, és hemacitométerben meghatározzuk a sejtszámot. A fennmaradó tenyészetekben 35 °C-on további 2 napos inkubálás után megszámoljuk a sejteket, és az eredményeket az 5. táblázatban ismertetjük.

5. táblázat

SRFE-2 közeg és szójalipidek alkalmazása MRC-5 sejtek denzitásának fokozására

Közeg	1. kísérlet	2. kísérlet
EMEM (E)	2,3	1,5
SRFE (S)	4,0	3,8
S+l: 100 szója	ND	7,6
S+l :200 szója	7,9	7,6
S+l: 500 szója	5,9	3,7
S+l :2000 szója	5,0	3,8

1. közegcsere =a sejttelepítés után 2-3 nappal a közeget a megadott, 10% FCS-sel kiegészített közeggel helyettesítjük;

2. közegcsere =a sejttelepítés után 6 nappal a közeget a megadott, 2% FCS-sel kiegészített közeggel helyettesítjük.

ND=nem vizsgált.

Kiértékelés:

SRFE-2 közeg alkalmazása lipidkiegészítés nélkül közelítőleg kétszeres növekedést eredményezett a sejtszámban, ahhoz képest, amikor az EMEM-et önmagában alkalmaztuk. A sejthozamok tovább növekedtek dózisfüggő módon, ha a közeget szójalipiddel egészítettük ki. A maximális sejthozamokat SRFE-2 közeg és körülbelül 200-400 pg/ml lipid kombinációjának alkalmazásával értük el.

14. példa

WI-38 sejtek tenyésztése a találmány szerinti eljárással

WI-38 sejteket 25 cm²-es T-lombikba oltjuk 53 000 sejt/ml koncentrációban, 12,5 ml, 10% FCS-t, 50 mg/ml neomicint és 2 mmol/1 L-glutamint tartalmazó EBME-be, és 35 °C-on inkubáljuk. 2 nap elteltével a közeget eltávolítjuk, és 12,5 ml SRFE-2 közeggel helyettesítjük, amely 50 mg/ml neomicinnel, 2 mmol/1 Lglutaminnal és 1:200 hígítású szójabablipiddel van kiegészítve. A kontrolloknak lipidkiegészítő nélküli közeget adunk. A tenyészetet 35 °C-on tartjuk 5 napon ke6. táblázat

Sejtvonal	Lipid- kiegészítés	Sejt/lombik xlO-6
5 nap elteltével	8 nap elteltével
1	-	4,2	4,8
	+	9,5	10,2
3	-	4,1	4,9
	+	9,3	12,5

Kiértékelés:

A gazdag közeg kiegészítése szójabablipiddel körülbelül kétszeresére emeli a WI-38 sejthozamokat. Ezen sejtvonal alkalmazása VZV termelésére várhatólag hasonló eredményeket fog hozni, mint az MRC-5 sejtek alkalmazása.

15. példa

Eljárás MRC-5 sejtek fokozott szaporodásának kiértékelésére

MRC-5 sejteket 25 cm²-es T-lombikokba telepítünk körülbelül 53 000 sejt/ml koncentrációban, 12,5 ml Eagle-alapközegbe, amely Earle-féle sókat (EBME), 10% FCS-t, 50 pg/ml neomicinszulfátot (neo) és 2 mmol/1 glutamint (Gin) tartalmaz. A tenyészeteket 35 °C-on 3 napon keresztül inkubáljuk, amikorra az egyrétegű sejttenyészet rendszerint körülbelül 50-75%ban egybefolyó. A közeget eltávolítjuk, és 10-12,5 ml SRFE-2 közeggel helyettesítjük, amely 10% FCS-t, 50 pg/ml neo-t és 2 mmol/1 Gln-t tartalmaz szójabab vagy egyéb lipidekkel együtt vagy anélkül, és a tenyészeteket 35 °C-on tovább inkubáljuk. A sejtszámokat különböző időpontokban meghatározzuk a sejtek tripszinezésével (2,5 ml 0,25% citrátot tartalmazó tripszinoldat), és hemacitométerben végzett számlálással. A sejtek életképességét 0,2% tripánkék sejtek általi kizárásával követjük nyomon. A sejtszámokból meghatározzuk a sejtkoncentrációt, amelyet a sejtszuszpenzió teljes térfogatára korrigálva kapjuk a lombikonkénti sejthozamot. Néhány kísérletben a tenyészeteket 2% FCS-t tartalmazó közegbe visszük át 3-4 nappal a közeg kicserélése után, és a sejtszámokat további 2 napon keresztül végzett inkubálás után határozzuk meg.

16. példa

Tenyésztett sejtek lipidadalékokkal való hosszabb kezelésének hatása

MRC-5 sejteket T25-lombikokba telepítünk, 3 nap elteltével táptalajt adunk a sejteknek (első tápanyagpótlás), és további 3 napon keresztül végzett tenyésztés után meghatározzuk a sejtszámokat. Újabb T25-lombikokban a szaporítást tovább folytatjuk tápanyagpótlás14

HU 220 080 Β sál, lipid jelenlétében vagy anélkül (második tápanyagpótlás), és további 2 napon keresztül hagyjuk szaporodni. A sejteket tripszinezéssel nyerjük ki. A sejthozam 2,6 xlO⁶ azokra a sejtekre nézve, amelyeket EBMEben telepítettünk és EMEM-ben szaporítottunk, míg az SRFE-2 plusz 1:100 hígítású szójabablipideket tartalmazó tápközegben tenyésztett sejtek elérték a 6,6 χ 10⁶ és 7,7 χ 10⁶ hozamokat. További 2 napon keresztül végzett sejttenyésztés hozama 2,76 χ 10⁶ az EBME/EMEM tápközegben tenyésztett sejtekre, míg az EBME/SRFE2 tápközeg alkalmazása esetén szójabablipid-kiegészítés nélkül a hozam 9,2 χ 10⁶ és 7,88 χ 10⁶ sejt/T25-lombik. Az EBME/SRFE-2 plusz 1:100 szójabablipid tápközegben tenyésztett sejtek hozama csak 2,48 χ 10⁶ és 2,28 χ 10⁶ sejt. Ezek az adatok azt jelzik, hogy ha magas lipidkoncentrációknak hosszabb időn keresztül tesszük ki a sejteket (körülbelül 5 nap a második tápanyagpótlás után), a sejthozamok csökkenhetnek, feltehetőleg a sejtpusztulás következtében. Ezért általában a sejtek újratáplálását gazdag közeggel végezzük lipidkiegészítés nélkül. Ez az átváltás lipidmentes, gazdag közegre különösen jelentős akkor, ha a vírusszaporítás fázisát kezdjük el, mivel a lipid toxikus lehet a vírusszaporodásra vagy a sejt további életben maradására a virális támadás jelenlétében.

17. példa

Különböző lipidkoncentrációk hatása a sejtszaporodásra gazdag és minimálközegekben A 16. példában az MRC-5 sejttenyészetre ismertetett eljárást és tápanyagpótlás/sejtszámlálás menetrendet követve, az alábbi sejthozamokat kaptuk [a + és jelek a közeg neve után a szójabablipid (sl.) jelenlétét vagy annak hiányát jelentik a megadott mennyiségben (mg/ml), a második tápanyagpótlásra alkalmazott közeg kiegészítőjeként].

Közeg	MRC-5 sejthozam χ IO-6/ teljes T25-lombik
Második tápanyagpótlás utáni idő (nap)
3	5
EBME/EMEM (3 kísérlet)	4,3; 2,46; 1,52	2,94; 3,50
EBME/SRFE-2	3,80
EBME/SRFE-2-0,4 sl.		13,69; 11,09
EBME/SRFE-2+0,4 sl.	11,7	11,65
EBME/SRFE-2-0,2 sl.	5,10	8,51; 6,27
EMBE/SRFE-2+0,2 sl.	7,62; 9,7	9,66
EBME/SRFE-2-0,1 sl.	3,52
EBME/SRFE-2+0,1 sl.	4,94
EBME/SRFE-2-0,04 sl.	3,10
EBME/SRFE-2+0,04 sl.	3,16
EBME/SRFE-2-0,01 sl.	2,90
EBME/SRFE-2+l:01 sl.	3,82

A fenti adatok általában konzisztensek a 16. példában megfigyeltekkel, vagyis ha a sejteket magas lipidkoncentrációknak túl hosszú ideig tesszük ki, ez nem túl előnyös, noha a 16. példában megfigyelt toxikus hatást ezek az adatok kevésbé fejezik ki. Alacsonyabb lipid-koncentrációknál kevésbé káros, ha a sejteket hosszabb ideig tesszük ki a lipidnek, és hozzá is járulhat a megnövekedett sejt/cm² tenyésztőfelület-hozamhoz.

18. példa

Borjúembrió-szérum koncentrációjának hatása a sejthozamokra

Ebben a kísérletben 2% vagy 10% boíjúembrió-szérum hozzáadásának hatását vizsgáltuk lipidkiegészítő jelenlétében. MRC-5 sejteket EBME-be telepítettünk, 3 nappal később különböző mennyiségben szójabablipidet tartalmazó SRFE-2-vel cseréltük le a tápközeget, és 2 nap elteltével a lipidet azonos koncentrációban tartalmazó SRFE-2-vel cseréltük le a tápközeget. A sejthozam 10% FCS jelenlétében 9,5, 11,3, illetve 12,2 χ 10⁶ volt 0,1,0,2, illetve 0,4 mg/ml lipiddel kiegészített tenyészetekben. Ha 2% FCS-t biztosítottunk, a sejtek hozama 6,5, 8,8, illetve 3,2 χ 10⁶ volt. Ezzel a kísérlettel bizonyítottuk az FCS kiegészítő, valamint a lipidadalék előnyös hatását a sejtszaporodásra. A magasabb lipidkoncentrációk sejtekre kifejtett toxikus hatásai gyengülnek megfelelő FCS-kiegészítéssel.

19. példa

Különböző lipidadalék hatása MRC-5 sejtek szaporodására

MRC-5 sejteket T25-lombikokba telepítettünk EBME-ben. A 3. napon a tápközeget 10% FCS-t tartalmazó SRFE-2 közeggel cseréltük ki, amelyet különböző lipidszármazékokkal egészítettünk ki. Boehringer Mannheim által gyártott szójabablipidet, Sigma által gyártott koleszterinben gazdag lipideket (felnőtt szarvasmarha szérumából) vagy Miles/Pentex EX-CYTE I vagy nagyon alacsony endotoxintartalmú (VLE) marhalipoproteint alkalmaztunk a jelzett koncentrációkban. Az első tápanyagcserénél a sejtszám 1,19 χ 10⁶ volt. 5 nap elteltével a sejteket megszámoltuk. EMEM-ben a sejtszám 2,97 χ 10⁶; SRFE-2-ben vagy SRFE-2 plusz 0,4 mg/ml, 0,2 mg/ml vagy 0,1 mg/ml szójabablipid esetén a sejtszám 4,83,10,47, 8,67, illetve 8,04 χ 10⁶. Az EX-CYTE I 1:50, 1:100, 1:200 hígításban 5,37, 4,80, illetve 4,74 xlO⁶ sejtet eredményezett. Az EX-CYTE VLE 1:25, 1:50, 1:100 hígításban 5,49, 7,23, illetve 7,92 χ 10⁶ sejtet adott. A Sigma által gyártott magas koleszterintartalmú lipidek 1:25, 1:50, 1:100 hígításban 6,87, 7,56 és 7,65 x1ο⁶ sejtszámot eredményeztek. A Boehringer Mannheim-féle szójabablipidek adták a legnagyobb sejthozam-növekedést, noha az EX-CYTE VLE és Sigma lipidek is majdnem olyan hatásosak voltak. A hozamot fokozó hatás ezért nem kizárólag a szójabablipideknek tulajdonítható.

20. példa

MRC-5 sejtek szaporodásának fokozása szójabablipid nagy koncentrációkban való alkalmazásával

HU 220 080 Β

Az MRC-5 sejteket 25 cm²-es lombikokba oltottuk, és a 13. példában leírtakhoz hasonlóan a 3. és 6. napon cseréltük a tápközeget. A lombikonkénti sejthozam a 6. napon EBME/EMEM, SRFE-2 plusz 1:100 szójabablipid vagy SRFE-2 plusz 1:50 szójabablipid tenyészetekben 4,3 xlO⁶, 9,7 xlO⁶, illetve ll,7xl0⁶ volt. A sejtek életképessége >99% (tripánkék kizárás alapján becsülve) az összes tenyészetben. A tenyésztőközeget tápközegiszójabablipiddel cseréltük ki újra, és további 2 napon keresztül inkubáltuk, majd meghatároztuk a sejthozamokat. A lombikonkénti sejthozam ezekben a tenyészetekben 2,9 és 3,5 χ 10⁶ volt duplikát EBME/EMEM tenyészetekben; ll,65xl0⁶ SRFE-2 plusz 1:50 szójabablipid esetén ugyanezzel a közeggel újratáplálva, míg SRFE-2 plusz 1:50 szójabablipid tenyészetekben (duplikát), amely tápközegét SRFE-2 közeggel helyettesítjük szójabablipid-adalék nélkül, 13,69 és 11,09 χ 10⁶ sejtet kaptunk; 9,66xlO⁶ sejtet kaptunk SRFE-2 plusz 1:100 szójabablipid esetén ugyanezzel a közeggel végzett cserével, míg lipid nélküli SRFE-2-vel végezve a tápközegcserét, 8,51 és 6,27 χ 10⁶ volt a sejtszám a dupla tenyészetekben.

Ezekből a kísérletekből kitűnik, hogy az MRC-5 sejtek hozama növekedett a szójabablipid mennyiségének növelésével. Maximális sejthozamokat kaptunk l:50-szeres hígítású szójabablipidek alkalmazásával (a vizsgált legmagasabb koncentráció). A lipid jelenléte a második újratápláló közegben csekélyebb növekedést okozott a sejthozamban. Azonban az adatok azt mutatják, hogy maximális sejthozamot lehet elérni 1:50 hígítású lipid alkalmazásával a tápközegcserére alkalmazott első közegben. A lipidadalékot a cserére alkalmazott második közegben elhagyhatjuk. Mivel a lipid magas koncentrációja káros lehet a vírustermelésre, kívánatos lehet a lipid elhagyása a vírusszaporítás során.

Claims (10)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás élő varicella zoster vírus (VZV) vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy

   a) humán diploid sejtek közül választott VZV-fertőzésre érzékeny sejteket egybefolyó egyrétegű sejttenyészet kialakulásáig tenyésztünk megfelelően jó tápanyagellátás mellett, és egy nem metabolizálódó diszacharid jelenlétében;

   b) az a) lépés szerint előállított sejttenyészetet a sejtek egybefolyásához legközelebb eső időpontban fertőzzük VZV-vel fertőzött sejttel a lehető legnagyobb fertőzési faktort biztosítva;

   c) a VZV-vel fertőzött tenyészetnek 22-96 órán keresztül jó tápanyagellátást biztosítunk, és a VZV-termelés tetőpontjának elérésekor összegyűjtjük a sejteket;

   d) a VZV fertőzött sejtek összegyűjtése előtt a VZV-vel fertőzött tenyészetet fiziológiás oldattal mossuk, amely adott esetben lizoszomotróp szert, például ammónium-kloridot vagy klorokvint tartalmaz;

   e) a VZV-vel fertőzött sejteket minimális térfogatú stabilizáló oldatban összegyűjtjük, és a sejteket vagy azonnal szétroncsoljuk, vagy lefagyasztjuk egy későbbi roncsolásig;

   f) a VZV-vel fertőzött sejteket szétroncsolva optimális mértékben szabaddá tesszük a sejthez kapcsolódó VZV-t, és eltávolítjuk a sejttörmeléket, ezáltal sejtmentes VZV-készítményt kapunk.
2. 2. Eljárás élő, gyengített, sejtmentes varicella zoster vírus (VZV) vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy

   a) VZV-fertőzésre érzékeny sejteket egybefolyásig tenyésztünk, a tenyésztés az alábbi lépésekből áll:

   1. sejttelepítés fázisa,

   2. sejtszaporítás fázisa, vagy nagy térfogatú minimálközegben, vagy kisebb térfogatú, de tápanyagban gazdag közegben, és
3. 3. fertőzést megelőző fázis, amelynek során a sejteket nem toxikus, nem metabolizálódó diszacharid hatásának tesszük ki;

   b) az a) lépés szerint kapott sejttenyészetet a sejtek egybefolyásához lehető legközelebb eső időpontban fertőzzük a lehető legnagyobb fertőzési faktor biztosításával gyengített, VZV-vel fertőzött sejtekkel;

   c) A VZV-vel fertőzött tenyészetet nagy térfogatú minimálközegben, vagy kisebb térfogatú gazdag közegben tartjuk fenn 22-96 órán keresztül a VZV-termelés tetőpontjának eléréséig;

   d) az összegyűjtés előtt a VZV-vel fertőzött tenyészetet adott esetben lizoszomotróp szert tartalmazó fiziológiás oldattal mossuk;

   e) a VZV-vel fertőzött tenyészetet összegyűjtjük úgy, hogy

   1. a folyadékot eltávolítjuk,

   2. minimális térfogatú stabilizáló oldatot adunk hozzá,

   3. a VZV-vel fertőzött sejteket lekaparjuk vagy kémiailag felszabadítjuk, és
4. 4. adott esetben a szabaddá tett, VZV-vel fertőzött sejteket fagyasztjuk körülbelül -70 °C-on;

   f) a szabaddá tett, VZV-vel fertőzött sejteket szétroncsoljuk a sejthez kötődő VZV optimális felszabadítása érdekében, és a sejttörmeléket eltávolítjuk, és adott esetben liofilizáljuk a sejtmentes VZV-t, vagy folyékony formában fagyasztva tároljuk.

   3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a VZV-fertőzésre érzékeny sejtek az MRC-5 sejtek, a gyengített N7N a varicella zoster vírus Oka-törzse, a tenyésztési hőmérséklet körülbelül 30-37 °C.

   4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a diszacharid a szacharóz, amelyet 20-60 mmol/1 koncentrációban alkalmazunk, és a tenyésztési hőmérséklet körülbelül 35 °C.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az MOI körülbelül 1:25 és 1:625 közötti.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott lizoszomotróp szer az ammóniumklorid körülbelül 20-50 mmol/1 koncentrációban, vagy a korokvin körülbelül 230 pmol/l koncentrációban alkalmazva.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tápanyagban gazdag közegként SRFE-2-t alkalma16

   HU 220 080 Β zunk adott esetben körülbelül 0,02-0,4 mg/ml szójalipiddel kiegészítve.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírust a sejtekből szonikálással vagy DOUNCEhomogenizálással vagy a kettő együttes alkalmazásával szabadítjuk fel.
9. 9. Eljárás élő, gyengített, sejtmentes varicella zoster vírus (VZV) vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy

   a) MRC-5 sejteket egybefolyásig tenyésztünk, a tenyésztés az alábbi lépésekből áll:

   1. sejttelepítés fázisa EBME-ben,

   2. sejtszaporítás fázisa körülbelül 0,2 mg/ml szójalipiddel kiegészített SRFE-2-ben, amelyet körülbelül 3 nappal a sejttelepítés után kezdünk el, és

   3. fertőzést megelőző fázis, amelynek során az MRC-5 sejteket a fertőzés előtt körülbelül 24-96 órával 20-50 mmol/1 szacharóz hatásának tesszük ki;

   b) az a) lépés szerint kapott sejttenyészetet az egybefolyás pontjához lehető legközelebb eső időpontban fertőzzük a gyakorlatilag legnagyobb fertőzési faktoré gyengített, VZV-vel fertőzött MRC-5 sejttel;

   c) A VZV-vel fertőzött sejteket körülbelül 37-96 órán keresztül tenyésztjük, és a VZV-termelés tetőpontjának elérésekor összegyűjtjük;

   d) a VZV-vel fertőzött tenyészetet adott esetben 1-100 mmol/1 NH₄Cl-dal, vagy klorokvinnal kiegészített, foszfáttal pufferolt sóoldattal mossuk;

   e) a VZV-vel fertőzött MRC-5 sejteket összegyűjtjük úgy, hogy

   1. a folyadékot eltávolítjuk,

   2. minimális térfogatú stabilizáló oldatot adunk hozzá, amely adott esetben körülbelül 1-100 mmol/1 NH₄Cl-ot vagy körülbelül 230 pmol/l klorokvint tartalmaz,

   3. a sejteket lekaparjuk vagy kémiai úton felszabadítjuk,

   4. adott esetben szabaddá tett, VZV-vel fertőzött sejteket -70 °C-on fagyasztjuk;

   f) a szabaddá tett, VZV-vel fertőzött sejteket szétroncsoljuk úgy, hogy

   1. a sejteket Dounce homogenizálásnak vetjük alá,

   2. a sejttörmeléket ülepítjük, és e felülúszót megtartjuk,

   3. az üledéket szonizáljuk, és újra ülepítjük, és az f-2. és f-3. lépésekből kapott felülúszókat egyesítjük;

   g) az f) lépésben kapott terméket stabilizátorral hígítjuk, egységdózisokban letöltjük liofilizáláshoz, és legfeljebb 4 °C-on tároljuk, hogy a felhasználás időpontjában a dózis legalább 1000 PFU legyen.
10. 10. Kompozíció MRC-5, WI-38 és verosejtek egyrétegű tenyészetben való szaporítására, amely körülbelül 0,02-0,4 mg/ml szójalipiddel kiegészített SRFE-2 tápközegből áll.

    HU 220 080 Β Int. Cl.⁷: C 12 Ν 7/00

    1. ábra

    HU 220 080 Β

    IntCl.⁷: C 12N 7/00

    HU 220 080 B

    IntCl.⁷: C 12N 7/00

    LOG PFU/ml

    3. ábra

    HU 220 080 B

    Int.Cl.⁷: C 12N 7/00

    VZV PFU HOZAMOK (j< EMEM ÉRTÉK)

    4. ábra

    HU 220 080 B