[go: up one dir, main page]

HU212518B - Method for producing primate il-3-like hematopoietic growth factors, the cells expressing thereof, and the pharmaceutical compositions containing thereof - Google Patents

Method for producing primate il-3-like hematopoietic growth factors, the cells expressing thereof, and the pharmaceutical compositions containing thereof Download PDF

Info

Publication number
HU212518B
HU212518B HU874240A HU424087A HU212518B HU 212518 B HU212518 B HU 212518B HU 874240 A HU874240 A HU 874240A HU 424087 A HU424087 A HU 424087A HU 212518 B HU212518 B HU 212518B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequence
cells
human
expression
cell
Prior art date
Application number
HU874240A
Other languages
English (en)
Inventor
Agnes B Ciarletta
Steven C Clark
Yu-Chung Yang
Original Assignee
Genetics Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27487045&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU212518(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US06/916,335 external-priority patent/US4877729A/en
Priority claimed from US07/021,865 external-priority patent/US4959455A/en
Application filed by Genetics Inst filed Critical Genetics Inst
Publication of HU212518B publication Critical patent/HU212518B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5403—IL-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Glass Compositions (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Gas Separation By Absorption (AREA)
  • Treating Waste Gases (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás főemlős IL-3-szerű hematopoietikus növekedési faktorok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.
A hematopoietinek, vagyis a hematopoietikus növekedési faktorok olyan fehéijék, amelyek elősegítik a hematopoietikus sejtek túlélését, növekedését és differenciálódását. A telepstimuláló faktorok (CSF) ezeknek a hematopoietikus növekedési faktoroknak alcsoportját jelentik, amelyek in vitro támogatják a csontvelő, embriómáj és más hematopoietikus szervek progenitor (ős) sejtjeiből kialakuló hematopoietikus sejtek növekedését.
Bizonyos hematopoietinek biokémiai és biológiai azonosítását és jellemzését bonyolulttá teszi az, hogy a természetes módon előforduló faktoroknak csak kis mennyisége áll rendelkezésre természetes forrásokból, pl. vérből vagy vizeletből. Ezek közül a hematopoietinek közül máig már néhányat molekulárisán klónoztak, heterológ módon kifejeztek, és homogenitásig tisztítottak [Metcalf D. The Molecular Biology and Functions of the Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factors, Blood 67, (2) 257-267 (1986)]. Ilyen hematopoietinek például a humán és rágcsáló GM-CSF, humán G-CSF, humán CSF-11 és rágcsáló IL-3. Kimutatták hogy a humán G-CSF [Donahue R. és munkatársai: Natúré 321, 872-875 (1986)], rágcsáló IL-3 [Kindler J. és munkatársai: Proe. Natl. Acad. Sci USA 83, 1001-1005 (1986): Metcalf és munkatársai: Blood 68, 46-50 (1986)] és humán G-CSF [Welte K. és munkatársai: J. Exp. Med. 165, 941-948 (1987)] in vivő hatnak a hematopoiézisre. A rágcsáló IL-3 fehérjével folytatott kiterjedt kutatás ellenére eddig ennek emberi megfelelőjét nem találták meg [Cohen D. R. és munkatársai: Nucl. Acids. Rés. 14, 3641 (1986)].
A National Biomedical Services (Nemzeti Orvosbiológiai Szolgálat, Washington D. C.) számítógépes kutatása feltárta, hogy a gibbon és a humán IL-3-szerű szekvenciák az aminosavak esetén mintegy 29%, míg a nukleotidok esetén 45% homológiát mutatnak a rágcsáló IL-3 DNS szekvenciával, amint ezt Fung M. C. és munkatársai publikálták [Natúré 307, 233-237 (1984)]. A humán IL-3-szerű gén exon szerkezetei hasonló módon vethetők össze a rágcsáló IL-3 kódoló területeivel.
A találmány főemlős IL-3-szerű növekedési faktorok előállítására vonatkozik, más főemlős fehéijéktől mentesen, amelyek az I. és II. táblázatban bemutatott aminosav-szekvenciákkal vagy lényegében homológ peptid-szekvenciákkal jellemezhetők. Ezeket a főemlős-fehérjéket, ideértve különösen a humán fehérjéket, ezután egyszerűen csak IL-3-nak nevezzük. Ezeket a fehérjéket az olyan DNS szekvenciák kódolják, amelyeket a nevezett táblázatokban ábrázoltunk és azok, amelyek ezekhez hibridizálni képesek. A találmány tárgykörébe tartoznak azok a polipeptidek is, amelyeket az előbbi DNS szekvenciához hibridizálni képes DNS-szekvenciák kódolnak, de a genetikai kód degenerációja folytán némileg eltérő szekvenciával rendelkeznek, azonban IL-3-szerű biológiai tulajdonságokkal rendelkező polipeptideket kódolnak.
A találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítási módja szerint olyan humán polipeptidet állítunk elő, amely lényegében mentes más humán polipeptidektől, és a peptid szekvenciája azonos vagy lényegében azonos a Π. táblázatban bemutatott szekvenciával, és legalább egy IL-3-szerű biológiai tulajdonságot mutat. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint gibbon polipeptidet állítunk elő, amely lényegében mentes más főemlős polipeptidektől, és peptidszekvenciája azonos vagy lényegében azonos az I. táblázatban bemutatott szekvenciával, és legalább egy IL3-szerű biológiai tulajdonságot mutat.
A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid 10-100 pikomőlos koncentrációban különböző eredetű hematopoietikus telepek sokféle típusának képződését képesek stimulálni a standard humán csontvelő vizsgálatban. További IL-3-szerű tulajdonságok, amelyeket a találmány szerinti eljárással előállított fehérjék mutathatnak az alábbiak:
a) 14 és 35 kilodalton közti látszólagos molekulatömeg, amint ezt redukáló SDS poliakrilamid gélelektroforézissel meghatározzuk;
b) képesség CML sejtburjánzás stimulálására 10-100 pikomőlos koncentrációban a CML vizsgálatban;
c) izoelektromos pont pH 6,0 és 7,6 között;
d) egyedi, előnyösen éles csúcs 43 kD-nél Superose 6 gélszűrő oszlopon;
e) egyedi csík 20,5 kD-nél gélen, N-glikanázos kezelés után; és
f) 2% alatti szennyezőanyag-tartalom az Edman-lebontást alkalmazó N-terminális elemzés szerint.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan gyógyászati kompozíciók előállítására, amelyek a találmány szerinti eljárással előállított egy vagy több polipeptid gyógyászatilag hatékony mennyiségét tartalmazzák. Ezeket a kompozíciókat egy sor olyan betegség kezelésében alkalmazhatjuk, amelyek a hematopoietikus sejtek alacsony szintjének következtében alakulnak ki.
A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények különböző olyan patológiás állapotok kezelésére alkalmazhatók, amelyek betegségek vagy sugárzás és/vagy gyógyszerek hatására alakulnak ki, ilyenek pl. a leukopénia, trombocitopénia, anémia, B sejt hiányosság, T sejt hiányosság, bakteriális és vírusfertőzés, és ide tartoznak a csontvelőátültetést követő immunsejt- vagy hematopoietikus sejt hiányosságot. Az ilyen kezelések során az IL-3-szerű polipeptidekkel együtt, másik hematopoietin, interleukin vagy növekedési faktor is. Ilyen hematopoietinek például a GM-CSF, G-CSF, CSF-1 vagy az eritropoietin. Interleukinok például az IL-1, IL-2, IL-4 vagy IL-6. A kezelési eljárásban alkalmazhatók növekedési faktorok is, pl. B sejt növekedési faktor, B sejt differenciás faktor vagy eozinofil differenciáló faktor.
A találmány tárgykörébe tartozik továbbá az olyan DNS szekvenciák előállítása, beleértve a cDNS szekvenciákat, amelyek legalább egy IL-3-szerű biológiai tulajdonsággal bíró főemlős polipeptid kifejezését kódolják. Ilyen szekvenciák például az I. vagy II. táblázatban az 5'-től a 3'-irányban ábrázolt nukleotid-szekvenciák. A találmány tárgykörbe tartoznak még azok a
HU 212 518 Β
DNS szekvenciák, amelyek szigorú körülmények között az I. vagy II. táblázat DNS szekvenciájával hibridizálnak, és azok a DNS szekvenciák, amelyek nem szigorú körülmények között hibridizálnak az ábrázolt DNS szekvenciákkal, és amelyek legalább egy IL-3szerű biológiai tulajdonsággal bíró fehérjét kódolnak. Az I. táblázat és II. táblázat szekvenciáinak alléi variációi, a nukleotidváltozások akár okoznak változásokat a peptidszekvenciában, akár nem, szintén a találmány tárgykörébe tartoznak, akárcsak ennek más analógjai és származékai.
A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá az olyan vektorok, amelyek egy fentebb leírt DNS szekvenciát tartalmaznak operatív kapcsolatban egy kifejezést szabályozó szekvenciával, valamint azok a sejtek, amelyek az ilyen vektorokkal vannak transzformálva. Az ilyen vektorok és transzformált sejtek egy új eljárásban főemlős IL-3-szerű polipeptidek előállítására alkalmazhatók, amely eljárásban egy IL-3-szerű polipeptid kifejezését kódoló, egy a kifejezést szabályozó szekvenciával operatív kapcsolatban lévő DNS szekvenciával transzformált sejtvonalat tenyésztünk. Ezekben az eljárásokban gazdasejtként egy sor ismert sejtet alkalmazhatunk a polipeptid kifejezésére. Jelenleg előnyösen emlős sejtvonalakat és bakteriális sejteket használunk.
A találmány szerinti eljárással főemlős IL-3-szerű növekedési faktorokat állítunk elő, amelyek lényegében mentesek más főemlős-eredetű, fehérje jellegű anyagoktól és aminosav szekvenciájuk azonos vagy lényegében homológ az alábbi I. és II. táblázatban bemutatott szekvenicákkal. Ezek a növekedési faktorok a későbbiekben ismertetett IL-3-szerű növekedési faktor legalább egy biológiai tulajdonságával rendelkeznek. A találmány szerinti eljárással előállított növekedési faktorok azonban előnyösen több mint egy IL3-szerű biológiai tulajdonságot mutatnak.
Az IL-3-szerű biológiai tulajdonság kifejezés egy vagy több alábbi biológiai jellemzőt és in vivő, valamint in vitro aktivitást jelöl. Az egyik ilyen tulajdonság az eritroid, limfoid és mieloid eredetű őssejtek növekedésének és differenciálódásának elősegítése. így pl. standard humán csontvelő vizsgálatban IL-3-szerű biológiai tulajdonság a granulocita-típusú telepeknek és az eritroidok sarjadzásának a stimulálása. Egy másik ilyen tulajdonság a korai multipotenciális őssejtekkel való kölcsönhatás.
További IL-3-szerű biológiai tulajdonság pluripotens prekurzorsejtek növekedésének elősegítése. Egy még további tulajdonság az a képesség, hogy az IL-3-szerű anyagok stimulálni képesek a krónikus mielogén leukémia (CML) sejtek burjánzását. A hízósejtek burjánzásának stimulálása szintén IL-3-szerű biológiai tulajdonság. Az IL-3-szerű növekedési faktorok elősegíthetik a különböző faktoroktól függő sejtvonalak növekedését is és/vagy indukálhatják a 20-a-szteroid dehidrogenáz (20α-SPH) és Thy-1 antigén kifejeződését. További IL-3szerű biológiai tulajdonságok a telepképzés stimulálása KG-1 sejteken és/vagy megnövekedett hisztamin-szintézis stimulálása lép- és csontvelő tenyészetekben. Még további IL-3-szerű tulajdonság a 14 kD és 35 kD közti látszólagos molekulatömeg redukáló nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel mérve. Az IL-3szerű fehérjék további biológiai tulajdonságait ismerteti a rágcsáló IL-3-ra vonatkozó szakirodalom.
Az I. és II. táblázatban bemutatott két peptidszekvencia a találmány szerinti növekedési faktorok példaként megadott tajgai. Az I. táblázat 865 bp-os DNS szekvenciáját a gibbon majom leukémia vírussal fertőzött UCD-144-MLA gibbon T-sejtvonal cDNS kifejező könyvtárából izolálták [Kuwakami T. G. és munkatársai: Natúré 235, 170 (1972)]. Ez a szekvencia egy egyedi, 456 nukleotid hosszúságú nyitott leolvasó keretet tartalmaz, amely mintegy 152 aminosavas fehérjét kódol, amelyet CSF-80-nak neveznek, és magában foglal egy hagyományos vezető kiválasztó szekvenciát, amelyet a nagyon hidrofób szekvencia (Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu) jelöl. Az érett fehérje a 20. aminosavnál, az alaninnál kezdődik az I. táblázatban. A kódoló terület három ciszteint tartalmaz, kettőt az érett fehérjében, ami egy diszulfit híd jelenlétére utal. Két lehetséges aszparaginhoz kötött glikozilező hely is van, amelyet az Asn-X-Ser és Asn-X-Thr jellemző szekvenicák mutatnak. Mind a méret, mind a glikozilezés eloszlása, amelyet a kódoló szekvencia mutat, tipikus a limfokinszerű fehéijékre. A 865 bp-s terület megmaradó nem-kódoló területei szabályozó szereppel bírhatnak az átírásban a természetes gazdaszervezetben. A szekvencia 3' vége szintén tartalmaz egy AT-ban dús szegmenst, beleértve az Al l JA szekvencia számos ismétlését, amelyről úgy vélik, hogy az RNS üzenet stabilitásával kapcsolatos [lásd Shaw G. és Kamen R.: Cell46, (5), 659-677(1986)].
I. táblázat
20 30
CTCGAGCTAC GTCAACGAAA AATAAAATCC
AAAC ATG AGC TGC MET Ser Cys
CTG CCC GTC Leu Pro Val
CTG CTC Leu Leu
64 79
CTG CTC CAA CTC CTG GTC AGC CCC GGA
Leu Leu Gin Leu Leu Val Ser Pro Gly
124 139
TCC TTG AAG ACA AGC TGG GTT AAC TGT
Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys
CTC CAA 94 GCT CCC ATG ACC CAG 109 ACA ACG
Leu Gin Alá Pro MET Thr Gin Thr Thr
TCT AAC ATG ATC 154 GAT GAA ATT ATA ACA
Ser Asn MET Ile Asp Glu Ile Ile Thr
HU 212 518 Β
169 CAC His TTA Leu AAG Lys CAG Gin CCA Pro 184 CCT Pro TTG Leu CCC Pro TTG Leu CTG Leu 199 GAC Asp TTC Phe AAC Asn AAC Asn 214 CTC AAT Leu Asn GGG Gly GAA Glu
229 244 259 274
GAC CAA GAC ATT CTG ATG GAA AAT AAC CTT CGA AGG CCA AAC CTG GAG GCA TTC
Asp Gin Asp Ile Leu MET Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Alá Phe
289 304 319
AAC AAG GCT GTC AAG AGT TTA CAG AAT GCA TCA GCA ATC GAG AGC ATT CTT AAG
Asn Lys Alá Val Lys Ser Leu Gin Asn Alá Ser Alá Ile Glu Ser Ile Leu Lys
334 349 364 379
AAT CTC CCC GCA TGC CTG CCC ATG GCC ACA GCC GCA CCC ACG CGA CAT CCA ATC
Asn Leu Pro Pro Cys Leu Pro MET Alá Thr Alá Alá Pro Thr Arg His Pro Ile
394 409 424
CGT ATC AAG GAC GGT GAC TGG AAT GAA TTC CGG AGG AAA CTG AAG TTC TAT CTG
Arg Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Lys Phe Tyr Leu
439 454 469 484
AAA ACC CTT GAG AAT GAG CAA GCT CAA CAG ATG ACT TTG AGC CTT GAG ATC TCT
Lys Thr Leu Glu Asn Glu Gin Alá Gin Gin MET Thr Leu Ser Leu Glu Ile Ser
500 TGAGTCCAAC 510 GTCCAGCTCT 520 CTCTCTGGGC 530 CGTCTCACCG 540 CAGAGCCTCA 550 GGACATCAAA 560 AACAGCAGAA
570 580 590 600 610 620 630
CTTCTGAAAC CTCTGGGTCG TCTCTCACAC AGTCCAGGAC CAGAAGCATT TCACCTTTTC CTGCGGCATC
640 650 660 670 680 690 700
AGATGAATTG TTAATTATCT AATTTCTGAA ATGTGCAGCT CCCATTTGGC CTTGTGTGGT TGTGTTCTCA
710 720 730 740 750 760 770
TTTTTATCCC ATTGAGACTA TTTATGTATG TCTGTATTTA TTTATTTATT TATTTATTGC CTTCTGGAGC
780 790 800 810 820 830 840
GTGAAGTGTA TTTATTTCAG CAGAGGAGCC ATGTCATGCT GCTTCTGCAA AAAACTCAAG AGTGGGGTGG
850 860
GGAGCATGTT CATTTGTACC TCGAG
A II. táblázat 674 bp-s DNS szekvenciája egy humán genomiális könyvtárból származik [Toole J. J. és munkatársai: Natúré 312, 342-346 (1984)], vizsgáló mintaként az I. táblázat szekvenciáját alkalmazva. AII. táblázat DNS szekvenciáját kezdetben úgy alkotjuk meg, hogy összetoldjuk a humán genomiális szekvencia exonjait, amelyeket az I. táblázat gibbon IL-3-szerű polipeptidjének DNS szekvenciájával való összehasonlítás alapján azonosítunk. Ez a humán szekvencia, amelyet a humán cDNS klón mRNS elemzésével igazolunk, egy olyan, mintegy 152 aminosavas polipeptidet is kódol, amely a főemlős fehérjék ezen családjának tagja. Ez a humán polipeptid magában foglal egy hagyományos vezető kiválasztó szekvenciát, amelyet a nagy mértékben hidrofób szekvencia (Leu Leu Leu Gin Leu Leu) jelöl. Az érett polipeptid a 20. számú aminosavnál, az alaninnál kezdődik. A kódoló terület két ciszteint tartalmaz az érett fehérjében, ami egy diszulfidkötés jelenlétére utal. Két lehetséges, aszparaginnal kapcsolt glikozilező hely van jelen, amelyeket a jellegzetes Asn-X-Ser szekvencia mutat. A 674 bp-s szekvencia további, nem kódoló része szabályozó szerepet tölthet be az átírásban a természetes gazdaszervezetben.
A humán genomiális gén exonjainak nukleotid szekvenciája (II. táblázat) több, mint 96%-ban homológ a gibbon gén DNS szekvenciájával (I. táblázat). A nukleotid szekvenciában 11 kodonban való változás aminosav-különbségeket eredményez a gibbon- és humán fehérjékben. Azok a nukleotidok, amelyeket a II. táblázat szekvenciája fölött tüntettünk fel, jelzik azokat a helyeket, ahol a gibbon szekvencia különbözik a megfelelő humán szekvenciától. Hasonlóképpen, azok az aminosavak, amelyeket a humán aminosavszekvencia alatt tüntettünk fel, jelzik, hogy hol tér el a gibbon szekvencia.
HU 212 518 Β
II. táblázat
A 9 T 24 39 A54
GATCCAAAC ATG AGC CGC CTG CCC GTC CTG CTC CTG CTC CAA CTC CTG GTC CGC
MET Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu Val Arg
Cys Ser
20 (27)
84 [C] 99
CCC GGA CTC CAA GCT CCC ATG ACC CAG ACA ACG TCC TTG AAG ACA AGC TGG GTT
Pro Gly Leu Gin Alá Pro MET Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val
114
T 129 144 159
AAC TGC TCT AAC ATG ATC GAT GAA ATT ATA ACA CAC TTA AAG CAG CCA CCT TTG
Asn Cys Ser Asn MET Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gin Pro Pro Leu
50
C 174 189 204
CCT TTG CTG GAC TTC AAC AAC CTC AAT GGG GAA GAC CAA GAC ATT CTG ATG GAA
Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gin Asp Ile Leu MET Glu
219 234 249 A 264
AAT AAC CTT CGA AGG CCA AAC CTG GAG GCA TTC AAC AGG GCT GTC AAG AGT TTA
Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Alá Phe Asn Arg Alá Val Lys Ser Leu
Lys
T 279 C 294 G 309 CC C 324
CAG AAC GCA TCA GCA ATT GAG AGC ATT CTT AAA AAT CTC CTG CCA TGT CTG CCC
Gin Asn Alá Ser Alá Ile Glu Ser Ile Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro
100 Pro
A A 339 354 G 369
CTG GCC ACG GCC GCA CCC ACG CGA CAT CCA ATC CAT ATC AAG GAC GGT GAC TGG
Leu Alá Thr Alá Alá Pro Thr Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp
MET Arg 429
384 399 A 414 A A
AAT GAA TTC CGG AGG AAA CTG ACG TTC TAT CTG AAA ACC CTT GAG AAT GCG CAG
Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Alá Gin
130 Lys Glu
444 459 485
T T A C G 475 TC 495
GCT CAA CAG ACG ACT TTG AGC CTC GCC ATC TTT T-AGTCCAACG TCCAGCTCGT TCTCTGGGCC
Alá Gin Gin Thr Thr Leu Ser Leu Alá Ile Phe
MET 147 Glu Ser
505 515 555
C G A A 525 535 545 G 565
TTCTCACCAC AGCGCTCGG GACATCAAAA ACAGCAGAAC TTCTGAAACC TCTGGGTCAT CTCTCACACA
G 575 585 595 605 615 625 635
TTCCAGGACC AGAAGCATTT CACCTTTTCC TGCGGCATCA GATGAATGT TAATTATCTA ATTTCTGAAA
645 655 T 665
TGTGCAGCTC CCATTTGGCC TTGTGCGGTT GTGTTCTCA
HU 212 518 Β
Az I. táblázatban bemutatott új 865 bp-s cDNS szekvenciát egy E. coli HB 101-ben levő plazmidba foglalva deponáltuk az American Type Culture Collection-nál (ATCC, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) 1986. július 11-én, ATCC 67 154 számon. Az új genoimális szekvenciát, amelyhez tartozó cDNS szekvenciát a II. táblázat tartalmazza, lambda bakteriofágba foglalva hasonlóképpen deponáltuk 1986. augusztus 7-én ATCC 40 246 deponálási számon. A humán IL-3 DNS-t a pSHIL-3-1 plazmidba foglalva E. coli HB101 törzsben deponáltuk 1987. február 24-én ATCC 67 326 deponálási számon.
A humán és gibbon IL-3-szerű polipeptideket tovább jellemeztük az átfertőzött COS sejtekből kapott 35S-jelzett fehérjék SDS-poliakrilamid gélelemzésével, amint ezt később a példákban leírjuk. Méretét tekintve mindkét polipeptid heterogén, látszólagos molekulatömege 14 kD és 35 kD közti, különösen 18 kD és 30 kD közü.
Az IL-3-szerű faktorok molekulatömegének széles tartománya feltételezhetően a tisztított COS sejtek által termelt molekulák különböző méretű glikozilezéséből adódik. A tisztított fehérjék 10-100 pikomólos koncentrációkban kis, granulocita típusú telepek képződését idézik elő in vitro humán csontvelővizsgálatokban. Ezen kívül eritropoietin jelenlétében ezekben a humán csontvelő vizsgálatokban a két polipeptid hasonló aktivitással segíti elő az eritroid és mieloid progenitor sejtek növekedését. így ezek az IL-3-szerű faktorok multi-CSF-ek. Ezek az IL-3-szerű faktorok előidézhetik a CML-ben szenvedő betegekből származó leukémiás blaszt sejtek buijánzását is. Ezek a polipeptidek képesek stimulálni járulékos és érett sejteket, pl. monicitákat is, hogy más hematopoietikus jellegű faktorokat termeljenek, amelyek viszont más hematopoietikus sejtek telepeinek képződését, valamint más hematopoietikus jellegű aktivitásokat stimulálnak.
A találmány tárgykörébe tartoznak azok a szintetikus polipeptidek is, amelyek egészben vagy részben megegyeznek az I. és II. táblázat aminosavgyökei folyamatos szekvencáival. Azok a módszerek, amelyek a jelen találmány polipeptidjeinek szintetikus úton történő megalkotásához szükségesek, ismeretesek azok számára, akik a szakterületen járatosak. A szintetikusan megalkotott szekvenciák, az I. és II. táblázat IL-3-szerű polipeptidjeivel való primer, szekunder, vagy tercier szerkezeti egyezés és megfelelő jellemzők következtében IL-3-szerű biológiai tulajdonságokkal bírnak. így ezeket biológiailag aktív vagy immunológiai helyettesítőként alkalmazhatjuk a természetes eredetű, tisztított főemlős IL-3-szerű polipeptidek helyett gyógyászati és immunológiai eljárásokban.
A találmány tárgykörébe tartoznak az olyan faktorok is, amelyeket az I. és Π. táblázatok szekvenciáihoz hasonló szekvenciák kódolnak, azonban természetes vagy mesterséges módosításokat tartalmaznak. így pl. egy ilyen módosított humán fehérje azzal az érett peptidszekvenciával bír, mint amelyet a II. táblázatban bemutattunk, azzal az eltéréssel, hogy a Ser 27-et prolin helyettesíti. Ezt a fehérjét olyan humán cDNS szekvencia kódolja, amelyet a II. táblázatban mutattunk be, azzal a különbséggel, hogy a CCC prolin kodon van jelen a 27. aminosavhelynél a TCC szerin kodon helyett, amely a táblázatban ennél a helynél fel van tüntetve. Ezt a módosított IL-3-szerű DNS szekvenciát, amely aktív humán IL-3-szerű faktort termel, E. coli HB101 törzsben pHucIL3-2 vektorként deponáltuk az ATCC-nél 1987. február 13-án, ATCC 67 319 számon.
Szakterületen jártas szakember a pepiidben vagy a szekvenciákban egyéb módosításokat is végre tud hajtani. Ilyen módosítások lehetnek például, ha ezekben az IL-3-szerű szekvenciákban a két cisztein gyök egyikét vagy mindkettőt bármelyik kódoló szekvenciában más aminosavakkal cseréljük ki. Előnyösen mindkét ciszteint helyettesítjük más aminosavval, pl. szerinnel, hogy a diszulfid hidat eltüntessük. Az ilyen helyettesítésekhez a mutagén technikák jól ismertek azok számára, akik a szakterületen járatosak (lásd pl. a 4 518 584 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).
Az IL-3-szerű faktorok szekvenciáinak egy másik speciális módosítása a glikozilező helyek egyikének vagy mindkettőnek a módosítása. A glikozilezés teljes hiánya vagy részleges glikozilezés úgy élhető el, hogy az I. és II. táblázatokban bemutatott IL-3-szerű faktorok szekvenciáiban jelen levő aszparaginnal kapcsolt glikozilezés felismerő helyek egyikénél vagy mindkettőnél aminosav-helyettesítést vagy kiiktatást végzünk. Az aszparaginnal kapcsolt glikozilezés felismerő helyek olyan tripeptid szekvenciából állnak, amelyet megfelelő celluláris glikozilező enzimek fajlagosan felismernek. Ezek a tripeptid szekvenciák vagy aszparagin-X-treonin, vagy aszparagin-X-szerin, ahol X bármely aminosav lehet. A glikozilezés felismerő hely első vagy harmadik aminosav-helyének egyikénél vagy mindkettőnél végzett aminosav-helyettesítés vagy kiiktatás (és/vagy aminosav-kiiktatás a második helynél) azt eredményezi, hogy nem történik glikozilezés a módosított tripeptid szekvenciánál.
így pl. az I. táblázatban az Asn^-et glutaminnal lehet helyettesíteni egy ilyen módosított IL-3-szerű faktorban. Az így létrejött faktor (Gln^) csak egy aszparaginnal kapcsolt szénhidrát-maradékot tartalmaz (az Asn89-nél), két ilyen maradék helyett. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy ugyanígy Asn89-monoglikozilezett glikoproteinek nyerhetők, ha a 34. helyzetnél más aminosav-helyettesítést végzünk, és/vagy a glikozilezést felismerő hely másik helyzeténél valamely más aminosav-helyettesítést hajtunk végre, pl. valint iktatunk be a Ser36 helyére. Hasonlóképpen a 89. helynek megfelelő Asn kodont és/vagy a 91. helynek megfelelő szerin kodont mutagén technikával meg lehet változtatni más aminosavakhoz tartozó kodonokra. Az ilyen megváltozott nukleotid szekvenciák kifejezése olyan variánsokat termel, amelyek nem glikozileződnek ezen a helyen. Eljárhatunk úgy is, hogy mindkét helyet megváltoztatjuk a fentiek szerint. A glikozilező helyek ilyen módosítását a II. táblázat szekvenciájában is végre lehet hajtani [Lásd pl.: Miyajima és munkatársai: EMBO J. 5, (6),
HU 212 518 Β
1193-1197 (1986), és az alábbi IV. példát]. Az I. és II. táblázatok szekvenciáinak más analógjai és származékai, amelyek részben vagy egészben megőrzik az IL-3szerű aktivitást, könnyen elkészíthetők az itt megadott ismertetések segítségével. Az ilyen nyilvánvaló módosítások bennefoglaltaknak a jelen találmány oltalmi körében.
A találmány tárgykörébe tartoznak azok az új DNS szekvenciák is, amelyek mentesek más főemlős fehérjéket kódoló DNS szekvenciáktól, és amelyek főemlős IL-3-szerű polipeptidek vagy növekedési faktorok kifejeződését kódolják. Ezek a DNS szekvenciák magukban foglalják azokat a szekvenciákat, amelyeket az I. táblázatban és a II. táblázatban ábrázoltunk 5'-től 3'irányban, és azokat a szekvenciákat, amelyek szigorú körülmények között hibridizálnak [lásd Maniatis T. és munkatársai: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 387-389 (1982)] az I. táblázat vagy a II. táblázat DNS szekvenciáihoz. Az ilyen szigorú hibridizációs körülményekre példa a hibridizálás 4xSSC-ben 65 ’C hőmérsékleten, amelyet O,lxSSC-ben 65 ’C hőmérsékleten 1 órán át végzett mosás követ. Egy másik példa a szigorú hibridizálási körülményekre a hibridizálás 50%-os formamidban, 4xSSC-ben, 42 ’C hőmérsékleten.
Azok a DNS szekvenciák, amelyek az I. táblázat vagy II. táblázat szekvenciáihoz enyhébb hibridizációs körülmények között hibridizálnak, és amelyek kifejeződéskor főemlős IL-3-szerű biológiai tulajdonságokkal bíró növekedési faktorokat kódolnak, szintén új növekedési faktorokat kódolnak. Az ilyen nem szigorú hibridizálási körülményekre példák a hibridizálás 4xSSC-ben 50 C hőmérsékleten, vagy a hibridizálás 30-40% formamidban 42 ’C hőmérsékleten. így pl. egy olyan DNS szekvencia, amely az I. táblázat és/vagy a Π. táblázat szekvenciáival szignifikáns homológ területeket tartalmaz, pl. a glikozilezés vagy a díszülfit-hidak helyeinél, és egy vagy több IL-3-szerű biológiai tulajdonsággal rendelkező főemlős fehérjét kódol, nyilvánvaló, hogy a növekedési faktorok ezen új családjának egy tagját kódolja, még ha az ilyen DNS szekvencia szigorúan nem is hibridizál az I. táblázat vagy a Π. táblázat szekvenciáihoz.
Hasonlóképpen azok a DNS szekvenciák, amelyek az I. táblázat vagy II. táblázat szekvenciái által kódolt főemlős IL-3-szerű polipeptideket kódolják, de a genetikai kód degenerációja következtében vagy alléi változatok következtében (természetben előforduló bázisváltozatok az adott populációban, amelyek vagy eredményeznek aminosavváltozást, vagy nem) eltérő kodon-szekvénei ával rendelkeznek, szintén az itt leírt család új növekedési faktoijait kódolják.
Az új főemlős IL-3-szerű növekedési faktorokat a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy megfelelő sejtet vagy sejtvonalat tenyésztünk, amely sejtet vagy sejtvonalat egy új főemlős IL-3-szerű polipeptidet kódoló DNS szekvencia kifejezése érdekében transzformáltuk, ahol a kifejeződés ismert szabályozó szekvenciák ellenőrzése mellett történik. Alkalmas sejtek vagy sejtvonalak lehetnek emlős sejtek, mint pl. a kínai hörcsög petefészek sejtek (CHO) vagy 3T3 sejtek. A megfelelő emlős gazdasejtek kiválasztása és a transzformálás, tenyésztés, sokszorozás, átvizsgálás és termék-előállítás eljárásai ismertek a szakterületen [lásd pl. Gething és Sambrook: Natúré 293, 620-625 (1981); vagy egy más módszer szerint, Kaufman és munkatársai: Mól. Cell. Bioi. 5, (7), 1750-1759 (1985); vagy Howley és munkatársai: 4 419 446 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. További alkalmas emlős sejtvonal, amelyet a példákban ismertetünk, a majom COS-1 sejtvonal. Hasonlóképpen alkalmas emlős sejt vonal aCV-1 sejtvonal.
A találmány szerinti eljárásban gazdasejtként hasonlóképpen előnyösen alkalmazhatunk baktériumsejteket. így pl. az E. coli különböző törzsei (pl. HB101, MC1061, és azok a törzsek, amelyeket az alábbi példákban alkalmazunk) jól ismertek gazdasejtként a biotechnológia területén. A B. subtilis, Pseudomonas és más bacillusok különböző törzsei szintén alkalmazhatók ebben az eljárásban.
Számos, szakemberek által ismert élesztősejt szintén rendelkezésre áll gazdasejtként a találmány szerinti polipeptidek kifejezésére. Ezeken kívül, ahol kívánatos, rovarsejtek is hasznosíthatók gazdasejtekként a találmány szerinti eljárásban [lásd pl. Miller és munkatársai: Genetic Engineering 8, 277-298 (Plenum Press, 1986), és az ebben idézett irodalmi helyeket].
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan vektorok előállítására, amelyek ezen új főemlős polipeptidek kifejezésének eljárásában felhasználhatók. Ezek a vektorok a fentebb leírt olyan DNS szekvenciákat tartalmazzák, amelyek a találmány szerinti új főemlős polipeptideket kódolják. Hasonlóképpen azok a vektorok, amelyekbe a fentebb leírtak szerinti módosított szekvenciák vannak beépítve, szintén a találmány tárgykörébe tartoznak és alkalmasak ezeknek az IL-3-szerű polipeptideknek a termelésére. Az eljárásban alkalmazott vektorok megfelelő szabályozó szekvenciákat is tartalmaznak, operatív kapcsolatban a találmány szerinti DNS kódoló szekvenciákkal, amelyek képesek irányítani ezek replikációját és kifejeződését a kiválasztott gazdasejtekben.
A humán IL-3-szerű polipeptidet kódoló, II. táblázat szerinti cDNS szekvenciát kémiai úton is szintetizálhatjuk. Az egyik ilyen kémiai szintézishez módszer szerint a gibbon IL-3 gént rekonstruáljuk a humán EL—3 kódoló szekvencia kialakítása céljából. Az első aminosavkülönbség a gibbon és humán IL-3 fehérje érett formái között a 82. aminosavnál fordul elő. A gibbon IL-3 gén 82. aminosavától kezdődően a gén 3'-végéig a kódoló szekvencia humán IL-3-at kódoló, kémiailag szintetizált DNS szekvenciákkal helyettesíthető, ezáltal olyan funkcionális gént alakítunk ki, amely megfelelő kifejező rendszerben humán IL-3 termelésére képes.
A gibbon szekvenciában két egyedi restrikciós helyet alkalmazhatunk a DNS szintetikus részeinek a klónozásához: egy AsuII helyet a 73. aminosavnál és egy EcoRI helyet a 125. aminosavnál. A gibbon génbe az AsuII helytől az EcoRI helyig való beiktatáshoz egy
HU 212 518 Β
DNS kazettát szintetizálunk úgy, hogy enzimatikusan egy kb. 160 bp-s DNS duplexet állítunk elő két olyan oligonukleotidból, amelyek egymással több, mint 21 bázispárban komplementerek. A teljes duplexet úgy állítjuk elő, hogy a komplementer területet az oligonukleotidok végéig kiterjesszük dezoxinukleozid-trifoszfátok és DNS polimeráz I Klenow fragmentum segítségével. A teljes duplexet AsuII-vel és/vagy EcoRJ-gyel emésztjük, hogy kohezív végeket alakítsunk ki az ezt követő klónozáshoz.
Egy második szintetikus DNS kazetta két oligonukleotidból áll, amelyek egész hosszukban komplementerek egymással a 125. aminosavnál lévő EcoRI helytől a terminációs kodont (ezt is beleértve) követő, a gén végénél levő 152. aminosav mentén. Ezeket az oligonukleotidokat úgy tervezzük, hogy EcoRI kohezív végük és megfelelő restrikciós helyeik vagy kohezív végeik legyenek a terminációs kodonnál vagy közvetlenül azután, hogy a különböző kifejező vektorokba klónozhatók legyenek.
Ezeknek a kazettáknak két készletét szintetizáljuk, egy készletet az emlős kifejeződéshez, a másikat bakteriális kifejezéshez, tekintettel arra, hogy az eukarioták és prokarioták esetén eltérő a kodonfelhasználás, a CpG duplettek eukariota génekben ritkán fordulnak elő, és a klónozáshoz különböző restrikciós helyekre van szükség. A kodonokkal kapcsolatos ilyen ismeretek a szakterületen jártas szakemberek számára ismeretesek [Lásd pl. Maruyama T. és munkatársai: Nucl. Acids. Rés. 14, rl51 (1986)]. Dyen kodonváltozásokat és ezekhez a kazettákhoz szintetizált kohezív végeket tüntetünk fel az alábbi ΙΠ. táblázatban példaképpen. A kazettákat azután a pCSF-MLA vektorba klónozzuk, hogy ezt olyan vektorrá alakítsuk, amely a humán IL-3-szerű faktort kódoló gént hordozza. Ezt az így létrejött vektort alkalmazzuk azután a humán faktor kifejezésére.
III. táblázat I. Kodon változások
Aminosav sorszáma Bakteriális kifejezés Emlős kifejezés
73 CGT
74 CGT
75 CCG
82 CGT
86 AGC
87 CTG CTG
88 CAA CAA
89 AAT
91 AGC
97 CTG CTG
100 CTG CTG
102 CCG
105 CCG
108 ACC ACA
109 GCT
Aminosav sorszáma Bakteriális kifejezés Emlős kifejezés
111 CCG
112 ACC ACC
113 CGT AGG
115 CCG
120 GAT
127 CGC AGG
128 CGC
131 ACC ACC
137 CTG CTG
140 GCT GCT
143 CAG CAG
145 ACC ACC
146 ACC ACC
147 CTG CTG
152 TTC TTC
II. Kazetta terminálisok
Kazetta sorszám Bakteriális kifejeződés
I 73 125 arg arg ... glu phe arg T CGT ... GAA TTC CGT A GCA ... CTT AAG GCA
Kazetta sorszám Emlős kifejeződés
1 71 125 asn leu arg arg ... glu phe arg AAC CTT CGA AGG ... GAA TCC CGTC TTG GAA GCT TCC ... CTT AGG GCAG
Kazetta sorszám Bakteriális kifejeződés
II 126 152 phe arg phe AA TTC CGC ... TTC TAG AACTCGAGACTG- CA G GCG ... AAG ATC TTGAGCTCTG
Kazetta sorszám Emlős kifejeződés
II 126 152 phe arg ... phe AA TTC AGG ... TTC TAG AACTCGAGA G TCC ... AAG ATC TTGAGCTCTTTAA
Egy másik módszer szerint humán IL-3-szerű növekedési faktor cDNS szekvenciáját úgy kaphatjuk meg, hogy valamely szöveti forrásból származó cDNS-t klónozunk. Az I. táblázat gibbon cDNS szekvenciáját alkalmazzuk vizsgáló mintaként Maniatis T. és munkatársai fentebb idézett munkája szerint, és perifériás vér limfocitákat használunk humán forrásként a humán IL-3-szerű polipeptidet kódoló mRNS izolálásához. Poli A+ RNS-t készítünk perifériás vér limfocita forrásból, átalakítjuk cDNS-sé és klónozzuk mint vagy fág, vagy plazmid cDNS könyvtárat. A
HU 212518 Β humán cDNS kiónt úgy azonosíthatjuk, hogy az I. táblázat gibbon kódoló szekvenciájával mint DNS vizsgáló mintával hibridizáljuk és az IL-3-szerű biológiai tulajdonságokat meghatározzuk. További szöveti források, amelyeket szintén át lehet vizsgálni humán IL-3-szerű cDNS-re, a lép, máj, csecsemőmirigy, mandulák, vese és más friss szöveteket, amelyek biopsziából vagy hullákból rendelkezésre állnak. Különösen érdekesek azok az esetek, ahol tumor pl. leukémia következtében megnövekedett hematopoietikus sejtszám fordul elő. További források a deponálási helyeken, pl. az ATCC-nél a köz rendelkezésére álló, deponált sejtvonalak, vagy azok a sejtvonalak, amelyek kormányzati szerveknél és bizonyos magán forrásoknál rendelkezésre állnak. Ilyen sejtvonalak például a transzformált T és B sejtvonalak, és azok a sejtvonalak, amelyek nem hematopoietikus eredetűek, de hematopoietint temjeinek.
A humán IL-3-szerű polipeptid kifejezésére az ezt kódoló cDNS-t egy megfelelő kifejező vektorba, pl. pCD-be vagy pXM-be visszük át, és hagyományos genetikai manipulációs technikákkal egy kiválasztott gazdaszervezetbe iktatjuk be, amint ezt fentebb leírtuk. Az egyik emlős kifejező rendszer biológiailag aktív rekombináns humán IL-3-szerű polipeptidekhez a stabilan transzformált CHO sejt. Aktív polipeptidet lehet azonban termelni intracellulárisan vagy extracellulárisan E. coli-ban és más baktériumokban is. Élesztővagy rovarsejteket szintén lehet alkalmazni kifejező rendszerekként.
Egy plazmidot, a pCSF-MLA-t alkotunk meg egyszerűen olyan módon, hogy az I. táblázat gibbon szekvenciáját beiktatjuk Xhol-gyel emésztett pXM-be, amint ezt fentebb leírtuk. Egy humán szekvenciával rendelkező plazmidot, a pSHIL-3-l-et (ATCC 67 326) szintetikusan alkotunk meg emlős kifejeződéshez, amint ezt fentebb leírtuk. Egy másik plazmidot, a pY3at is elkészítünk, amint ezt fentebb leírtuk. Ezeknek a plazmidoknak, amelyek főemlős IL-3-szerű növekedési faktort hordoznak, bármelyikét ezután hagyományos technikákkal egy kiválasztott gazdasejtbe transzformáljuk egy polipeptid kifejezéséhez.
A. Kifejezés emlős sejtekben
Az IL-3-szerű faktorok kifejeződéséhez az alább leírt vizsgálatokban való felhasználás céljából pSHIL3-1-et és pCSF-MLA-t COS sejtekbe fertőzünk át. Az átfertőzött COS sejtekhez tartozó kondicionált tápközeg magas növekedési faktor aktivitást mutat.
Az itt leírt emlős sejt kifejező vektorokat jól ismert technikákkal lehet szintetizálni. A vektorok komponenseit, pl. replikációs origókat, szelekciós géneket, enhancer régiókat, promotorokat és hasonlókat természetes forrásokból szerezhetjük be, vagy ismert eljárásokkal szintetizálhatjuk. [Lásd pl. Kaufman és munkatársai: J. Mól. Bioi. 159, 511-521 (1982); és Kaufman: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 689-693 (1985)]. Emlős gazdasejtek lehetnek elsősorban a főemlős sejtvonalak és rágcsáló sejtvonalak, beleértve a transzformált sejtvonalakat is. A normál diploid sejtek, elsődleges szövetek in vitro tenyészetéből származó sejt-törzsek, valamint primer explantátumok szintén megfelelnek erre a célra. Az alkalmazott sejteknek nem szükséges genotípusosan hiányosnak lenni a szelekciós génben, feltéve, hogy a szelekciós gén dominánsan tevékenykedik. A vektor DNS stabil integrációja és az integrált vektor DNS ezt követő sokszorozása céljából, mindkettőt hagyományos módon végezve, CHO sejteket alkalmazhatunk. Egy másik módszer szerint a vektor DNS magában foglalhatja a szarvasmarha papillóma vírus genomiális részét vagy egészét [Lusky és munkatársai: Cell 36, 311-401 (1984)], és a műveleteket sejtvonalakban lehet végezni, mint pl. Cl27 egér sejtek, a fenti genomot stabil episzomális elemként alkalmazva. Más alkalmas emlős sejtvonalak lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak) a HeLa, COS-1 majomsejtek, L-929 egérsejtek, Swiss, Balb-c vagy NIH egerekből származó 3T3 vonalak, BHK vagy HaK hörcsög sejtvonalak.
Ezután a stabil transzformánsokat a termék kifejezésére standard immunológiai vagy enzimes vizsgálatokkal vizsgáljuk át. A különböző fehérjéket kódoló DNS jelenlétét standard eljárásokkal, pl. Southern foltképzéssel lehet kimutatni. A kifejező vektor DNS-nek a megfelelő gazdasejtbe, pl. COS-1 majomsejtekbe való beiktatása után néhány napon át a variánsokat kódoló DNS kifejeződését a táptalajban a fehérjék aktivitás vagy más immunológiai tulajdonságok alapján történő megkülönböztetése nélkül mérjük.
A szakterületen jártas szakemberek képesek más olyan emlős kifejező vektorokat is alkotni, amelyek a pCSF-MLA-hoz és pSHIL-3-l-hez hasonlók, pl. olyan módon, hogy az I. táblázat vagy II. táblázat DNS szekvenciáját kihasítják a megfelelő plazmidokból Xhol-gyel, és jól ismert rekombináns genetikai manipulációs technikákat és más vektorokat, pl. pJL3-at és pJL4-et [Gough és munkatársai: EMBO J. 4, 645-653 (1985)] és pMT2-t alkalmaznak [pMT2-VWF-ből (ATCC 67 122) kiindulva]. Ezeknek a vektoroknak a transzformálása megfelelő gazdasejtekbe az IL-3-szerű növekedési faktorokat eredményezheti.
Főemlős IL-3-szerű növekedési faktort magas szinten kifejező CHO sejtvonalak megalkotása A találmány szerinti eljárással, főemlős IL-3 polipeptidek magas szintű termelését emlős sejtekben úgy végezzük, hogy olyan sejteket alkotunk, amelyek a heterológ IL-3-szerű gének többszörös másolatát foglalják magukban. A heterológ gént hozzá lehet kapcsolni valamely sokszorozható markerhez, pl. a dihidrofolát reduktáz (DHFR) génhez, e célból azokat a sejteket, amelyek megnövekedett számú gén-másolatot tartalmaznak, metotrexát (MTX) fokozatosan növekvő koncentrációin történő szaporítás alapján lehet kiválogatni Kaufman és Sharp eljárása szerint [J. Mól. Bioi. (1982), fentebb idézett munka]. Ezt a megközelítést egy sor különböző sejttípusnál lehet alkalmazni.
így pl. a pY3 egy humán IL-3-szerű gént tartalmaz, operatív kapcsolatban más olyan plazmid szekvenciákkal, amelyek lehetővé teszik ennek kifejeződését. A
HU 212 518 B pY3-at és a pAdA265V(A)3 DHFR-kifejező plazmidot [Kaufrnan és Sharp, Mól. Cell. Bioi. 3, (9), 1598-1608 (1983)] együtt iktathatjuk be a DUKX-BII DHFR-hiányos CHO sejtekbe kalcium-foszfátos együttkicsapással és át fertőzéssel. Egy másik módszer szerint a gént a fenti módon pMT2-be iktatjuk be, és az így létrejött vektort alkalmazzuk pY3 és pAdA265V(A)3 helyett. DHFR kifejező transzformánsokat választunk ki dializált borjúembriószérummal kiegészített alfa tápközegben (összetétel: lásd ATCC Catalogue of Cell Lines and Hybridomas) való növekedés alapján, majd ezt követően sokszorozásra szelektálunk MTX növekvő koncentrációban (egymás utáni lépések 0,02; 0,2; 1,0 és 5gmól/l MtX-ben) való növesztésben, amint ezt Kaufrnan és munkatársai leírták [Mól. Cell. Bioi. 5, 1750 (1983)]. A transzformánsokat klónozzuk, és a biológiailag aktív IL-3-szerű polipeptid kifejeződést CML vizsgálatokkal követjük. Az IL-3-szerű polipeptid kifejeződésnek növekednie kell az MTX rezisztencia megnövekedett szintjeivel. Hasonló eljárások követhetők az IL-3-szerű polipeptidek családja más tagjainak előállításánál is, beleértve a gibbon IL-3-szerű polipeptidek előállítását is.
A humán EL-3-szerű polipeptid kifejezésének egy másik módszere szerint a teljes humán genomi gént tartalmazó lambda CSF-16-ból származó BglII fragmentumot alkalmazzuk, olyan emlős sejtvonal készítésére, amely a polipeptidet kifejezi, ilyet írtak le pl. a WO 85/02610 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben humán eritropoietinre. Ezen kívül ezt a humán genomi gént megfelelő promotorral és feldolgozó szignálokkal bizonyos más heterológ rendszerekben való kifejezéshez lehet alakítani, pl. rovar promotorokkal rovar sejttenyészet vonalak kialakítására. Hasonlóképpen ezt a genomi gént ki lehet fejezni élesztőben vagy más eukariota rendszerekben is.
B. Bakteriális kifejező rendszerek
Hasonlóképpen a szakterületen jártas szakemberek képesek úgy manipulálni az I. és II. táblázat szekvenciáit, hogy a kódoló szekvenciákat szegélyező emlős szabályozó szekvenciákat eltüntetik vagy helyettesítik bakteriális szekvenciákkal, hogy bakteriális vektorokat alkossanak meg a találmány szerinti IL-3-szerű faktorok intracelluláris vagy extracelluláris kifejezéséhez baktérium sejtek révén. A faktort kódoló DNS-t tovább módosíthatjuk, mint pl. a 3. példában, hogy a bakteriális kifejezéshez eltérő kodonokat tartalmazzon, amint ez a szakterületen ismeretes. A szekvencia előnyösen operatívan, a kereten belül kapcsolódik egy kiválasztó vezető polipeptidhez, amely lehetővé teszi az érett variáns fehérje bakteriális kifejeződését, kiválasztását és feldolgozását, amint ez a szakterületen ismeretes. A baktérium gazdaszervezetben kifejezett anyagokat azután ki lehet nyerni, tisztítani és/vagy jellemezni fiziko-kémiai, biokémiai és/vagy klinikai paramétereik tekintetében, ismert módszerekkel.
Egy ilyen bakteriális vektor bakteriális kifejezés céljára történő megalkotásához egy részben szintetikus humán IL-3-szerű DNS szekvenciát alkotunk meg a gibbon cDNS-ből és a fent leírt szintetikus bakteriális kazettákból. Ezt a szekvenciát Ndel-gyel és Xbal-gyel emésztett pAL181 vektorba iktatjuk be, amely vektor az ATCC-nél 40 134 számon van deponálva. Az így létrejött pPLHIL-3-181 vektort E. coli GL400-ba fertőzzük át, és olyan körülmények között tenyésztjük, amelyet a W086/00639 számon közzétett nemzetközi bejelentésben GM-CSF-re leírtak.
Hasonlóképpen az I. táblázat kódoló szekvenciáját vagy a II. táblázat kódoló szekvenciáját kihasíthatjuk pCSF-MLA-ból vagy pSHIL-3-1-ból Xhol-gyel, és tovább manipulálhatjuk (pl. ligálhatjuk más ismert kapcsolókhoz vagy a nem kódoló szekvenciákat belőlük kiiktatva vagy a nukleotidjaik más ismert technikákkal végzett megváltoztatásával módosítjuk). A módosított IL-3-szerű kódoló szekvenciát azután beiktathatjuk valamely ismert bakteriális vektorba olyan munkameneteket alkalmazva, mint amelyet Taniguchi T. és munkatársai leírtak [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5230-5233 (1980)]. Ezt a bakteriális vektort transzformálhatjuk azután baktérium gazdasejtekbe, és az IL-3szerű faktort azután ezzel kifejezhetjük. IL-3-szerű faktorok extracelluláris kifejezését baktérium sejtekben kialakító stratégiával kapcsolatban lásd pl. az 1986. 04. 09-én közzétett 177 343 számú európai szabadalmi bejelentést.
C. Kifejezés rovarsejtekben
Hasonló manipulációkat végezhetünk egy rovarvektor megalkotásánál (lásd. pl. a 155 476 számú közrebocsátott európai szabadalmi bejelentést) rovarsejtekben való kifejeződéshez. Élesztő vektort is alkothatunk, élesztő szabályozó szekvenciákat alkalmazva a találmány fehérjéinek intracelluláris vagy extracelluláris kifejeződéséhez élesztősejtekkel (lásd pl. azokat az eljárásokat, amelyeket a WÓ86/00639 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentésben és az
1984. 10. 31-én közrebocsátott EP 123 289 számú európai szabadalmi bejelentésben írnak le).
A találmány szerinti eljárással előállított főemlős IL-3-szerű növekedési faktorok egy sor patológiás vagy megbetegedés következtében kialakult állapot kezelésére alkalmazhatók, főként azok kezelésére, amelyeket mieloid, eritroid és limfoid sejtek vagy a hematopoietikus rendszer megakariocita sejtjeinek, vagy ezek kombinációinak csökkent szintje jellemez. Ezen kívül alkalmazhatók érett mieloid és/vagy limfoid sejtek aktiválására. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidekkel történő kezelésre fogékony állapotok például a leukopénia, a cirkuláló leukociták (fehér vérsejtek) számának csökkenése a perifériás vérben. Leukopénia bizonyos vírusok vagy besugárzás hatására alakulhat ki. Ez különböző rák-terápiáknak, pl. a kemoterápiás kezelésnek gyakran mellékhatása. A leukopénia ezen IL-3-szerű polipeptid-kompozíciókkal végzett kezelése kiküszöbölheti a jelenleg rendelkezésre álló gyógyszerek által okozott nemkívánatos mellékhatásokat.
A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek különböző immunhiányosságok, pl. T és/vagy B
HU 212 518 Β limfociták hiánya vagy immun-rendellenességek, pl. reumatoid artritisz kezelésére szintén alkalmazhatók. Ezek a faktorok önmagukban vagy más kezelőszerekkel kombinálva hasznosak lehetnek olyan immunhiányosságok kezelésére vagy helyreállítására, amelyeket vírusfertőzés, pl. HTLVI, HTLVII, HÍV, erős sugárzás vagy rákterápia vagy más orvosi kezelések okoznak. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek alkalmazhatók önmagukban vagy más hematopoietinekkel kombinálva, más vörösvérsejt hiányosságok kezelésében, ideértve a trombocitopéniát (vérlemezke-hiányosság) vagy a vérszegénységet (vörösvérsejt-hiány). Ezek az új polipeptidek alkalmazhatók továbbá olyan betegeknek a kezelésére, akik csontvelő-átültetésen estek át, valamint alkalmazhatók standard módszerekkel kialakított monoklonális és poliklonális antitestek kifejlesztésére diagnosztikus vagy terápiás felhasználás céljára.
Ennek megfelelően a találmány tárgya továbbá eljárás a fentebb ismertetett betegségi állapotok kezelésére alkalmas gyógyászati kompozíciók előállítására. Az ilyen kompozíciók a találmány szerinti eljárással előállított főemlős IL-3-szerű polipeptidek közül egynek vagy többnek a hatékony mennyiségét tartalmazzák gyógyászatilag elfogadható hordozóval összekeverve. A kompozíciók adagolhatók parenterálisan vagy intravénásán. Ha kívánatos, a kompozíciókat szubkután is be lehet adni. Parenterális adagoláshoz a gyógyászati kompozíciókat pirogén-mentes, parenterálisan elfogadható vizes oldat formájában készítjük el. Egy ilyen gyógyászatilag elfogadható fehérjeoldat előállítása, amely a pH, izotonicitás, stabilitás tekintetében megfelelő, a szakterületen jártas szakember számára egyszerűen megoldható feladat.
A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények adagolása számos tényezőtől függ, ilyenek lehetnek pl. a beteg állapota, testtömege, neme, a beteg étrendje, bármiféle fertőzés súlyossága, a beadás ideje és más klinikai tényezők. A napi adag általában 2001000 pg polipeptid vagy 50-5000 egység testtömeg-kilogrammonként (ahol egy egység a polipeptidnek az a koncentrációja, amely a maximális stimulálás feléhez vezet standard humán csontvelő vizsgálatban).
A találmány szerinti eljárással előállított kompozíciók tartalmazhatnak más humán faktorokat vagy azokkal együtt adagolhatók. Más megfelelő hematopoietinek, CSF-ek és interleukinok, amelyek a találmány szerinti polipeptidekkel együtt vagy egymás után beadhatók, például GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Meg-CSF, eritropoietin (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, B-sejt növekedési faktor, B-sejt differenciációs faktor, és eozinofil differenciációs faktor. Különösen érdekes a hematopoietikus progenitor sejtek és utódaik in vivő sokszorozásához IL-3 kombinálása IL-6-tal (amely a szakirodalomban 2.B-sejt stimuláló faktorként is ismeretes), amely a humán blaszt sejt vizsgálatokban előidézi a korai őssejt telepek burjánzását. Ezen kívül az IL-3-szerű polipeptideket be lehet adni monoklonális vagy poliklonális antitestekkel együtt, vagy kémiailag hozzá lehet kötni ezekhez. Egy másik módszer szerint ezeket a faktorokat bizonyos toxinokhoz, pl. ricinhez lehet kötni. Az adagolást ilyenkor úgy kell beállítani, hogy ezeket a további komponenseket kompenzálja a gyógyászati kompozícióban. A kezelt beteg állapotának fejlődését a hematológiai profil periodikus mérésével, pl. fehérvérsejt-számlálással és hasonlókkal követhetjük.
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül. Az enzimeket a gyártó cég előírásai szerint alkalmaztuk, hacsak másképpen nem jelezzük. A klónozásokat, szubklónozásokat, ligálásokat, szekvenciameghatározásokat, hibridizációs eljárásokat, DNS-izolálást, átvizsgálási eljárásokat, Northem-folt elemzést a laboratóriumi kézikönyvekben, pl. a Molecular Cloning, A Laboratory Manual (J. Sambrook és munkatársai, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) c. munkában ismertetett módon végeztük.
1. példa
Gibbon IL-3-szerű gén izolálása
UCD-144-MLA gibbon majom leukémia vírussal fertőzött gibbon T-sejt vonalat, amely a National Institute of Health Laboratories-nél HB 8370 számon rendelkezésre áll, indukálunk fitohemagglutininnel és forbol-mirisztát acetáttal (PHA/PMA) [Yang Y. C. és munkatársai: Cell 47, 3-10 (1986)]. Teljes RNS-t készítünk ezekből a sejtekből Chirgwin J. M. és munkatársai eljárásai szerint [Biochem. 18, 5294 (1979)]. A poli A+ mRNS-t 10%-tól 30%-ig terjedő szacharóz gradiensen elválasztjuk és frakcionáljuk. Az új hematopoietikus faktort kódoló mRNS azonosítása céljából az UDC-144-MLA-sejtvonalból származó szacharóz gradiensen frakcionált mRNS 16 alikvotját mikroinjektáljuk Xenopus laevis oocitákba, és az így létrejött kondicionált közeget megvizsgáljuk arra a képességére, hogy stimulálja leukémiás blaszt sejtek burjánzását humán GM-CSF elleni antitest jelenlétében, amint ezt a 4. példa CML vizsgálatában bemutatjuk. A szacharóz gradiensen frakcionált mRNS-ek közül azt, amelyik tartalmazza az IL-3-szerű növekedési faktor aktivitást kódoló üzenetet, átalakítjuk kettősszálú cDNS-sé Gubler U. és Hoffman B. J. eljárása szerint [Gene, 25, 263 (1983)].
Egy COS sejt kifejező vektort, a pXM-et [készítését Yang és munkatársai ismertetik a Cell 47; 3-10 (1986) 8. oldal irodalmi helyen], amely az SV40 enhancert, nagyobb adenovírus késői promotort, DHFR kódoló szekvenciát, SV40 késői poli A hozzáadó helyet és Val (Adenovírussal kapcsolatos gén I) gént tartalmazza, linearizáljuk Xhol endonukleáz enzimmel, kezeljük DNS polimeráz I nagy fragmentummal dTTP jelenlétében, és ligáljuk ekvimoláris mennyiségű cDNS-hez 100 pg/ml végső DNS koncentrációnál. A pXM Xhol-emésztéséből és az Xhol-hez adaptált cDNS szekvencia beiktatásából eredő ligálási termékeket transzformáljuk E. coli HBlOl-be és L + Amp lemezekre (összetétel: 10 g/1 tripton, 2,5 g/1 NaCl, 10 g/1 agar, 50 pg/ml Ampicillinnel kiegészítve) szélesztjük, hogy mintegy 30x103 telepből álló könyvtárat alakítsunk ki. (A szakterületen ismert más, működés11
HU 212 518 Β ben hasonló kifejező vektorok is alkalmazhatók ebben az eljárásban, a pXM alternatívájaként).
A pXM-ben levő cDNS könyvtárat nitrocellulóz szűrőkre másoljuk. Az egyes szűrőkről a telepeket folyékony L-tápközegbe (összetétel: 10 g/1 tripton,
2,5 g/1 NaCl) oltjuk át, és a plazmid DNS-t izoláljuk. A DNS mintákat 200-300 baktériumtelepből álló gyűjteményből készítjük. A DNS-t Meyers J. A. eljárásával tisztítjuk [J. Bacteriol. 127, 1529 (1976)]. Majom COS sejteket (ATCC CRL 1650) fertőzünk át, mintegy 5 pg plazmid DNS-sel 106 COS sejtre számítva, DEAE-vel közvetített DNS átfertőzéssel, és klorokinnal kezeljük Wong G. G. és munkatársai [Science 228, 810-815 (1985)] és Kaufman R. J. és munkatársai [Mól. Cell. Bioi. 2, 1304 (1982)] által leírt eljárások szerint.
órával az átfertőzés után a tápközeget kinyerjük és megvizsgáljuk humán CML vizsgálatban, amint ez később a 4. példában leírjuk. Az egyik gyűjteményt, amely olyan kondicionált tápközeget termel, amely telepstimuláló aktivitással és CML proliferációt elősegítő aktivitással rendelkezik, és az utóbbi aktivitást a GM-CSF elleni antiszérum semlegesítő hatása ellen teljesen rezisztens, kiválasztjuk további elemzésre. Az eredeti aktív gyűjtemény egyedi telepeiből plazmid DNS-t készítünk és átfertőzzük, hogy a kondicionált tápközeget CSF- és CML proliferációt elősegítő aktivitásra vizsgáljuk. Egy egyedi kiónt izolálunk, amely felelős az ilyen aktivitásokért. Ennek a kiónnak a cDNS beiktatását Ml3-ba szubklónozzuk és szekvenciaelemzésnek vetjük alá a Sanger-féle didezoxi-láncterminációs módszerrel (lásd az I. táblázatot).
2. példa
Humán IL-3-szerű gén izolálása
Vizsgáló mintaként az I. táblázat szekvenciáját alkalmazva egy humán genomi könyvtárból [humán DNS-nek a J1 lambda vektor BamHI helyébe klónozott Sau3AI részleges emésztménye (Toole J. J. és munkatársai fentebb idézett munkája)] lxlO6 kiónt vizsgálunk át. Három tarfoltot azonosítunk, amelyek olyan szekvenciákat tartalmaznak, amelyek erősen hibridizálnak a cDNS vizsgáló mintához. Ezek közül a fágok közül kettőből DNS-t emésztünk teljességig Sau3AI endonukleáz enzimmel a gyártó cég előírásai szerint, és szubklónozzuk az mp9 lambda Ml3 bakteriofát BamHI helyébe. Az exon szekvenciát tartalmazó szubklónokat gibbon cDNS-sel végzett hibridizálással azonosítjuk. Az egyik szubklónt, a lambda CSF-16-ot, amely mintegy 10 kb-s BglII fragmentumként humán genomi DNS szekvenciát tartalmaz, az ATCC-nél deponáltuk, amint fentebb leírtuk. A humán gén mindegyik exonjának teljes szekvenciáját meghatározzuk, a didezoxi-láncterminációs DNS szekvenciaelemzéssel oligonukleotid primerek sorozatával, amely primerek szekvenciája az 1. példában leírt gibbon gén szekvenciáján alapul. Mivel a humán gén exonjainak nukleotid szekvenciái 96%-nál nagyobb mértékben homológok a gibbon cDNS szekvenciájával, a megfelelő humán cDNS nukleotid szekvenciáját rekonstruáljuk. A változások a nukleotid szekvenciában 11 kodonban aminosavkülönbségeket is eredményeznek a polipeptidekben e két fajtából (lásd a II. táblázatot).
A humán genomi szekvenciát ki lehet metszeni a lambda CSF-16-ból és beiktatni valamely kifejező vektorba, amelyekből sokféle ismeretes a szakterületen az emlős-, rovar-, élesztő-, gomba- és baktérium-kifejezéshez. így pl. a deponált baktriofágból a humán genomi szekvenciát Smal és Xhol endonukleázokkal végzett emésztéssel kimetszettük. Ezek az enzimek a humán gén területet a 629., illetve 3183. nukleotidoknál hasítják. Az így létrejött 2,5 kb tartalmazza a teljes humán IL-3 gén kódoló szekvenciát és magában foglalja a TATAA-rokon szekvenciát a promotor területben, viszont hiányoznak belőle a CAT-rokon szekvenciák és a poliadenilező szignál a gén 3'-végénél. Ennek a fragmentumnak Smal végét átalakítjuk Xhol-gyé kereskedelmi forgalomban kapható kapcsoló (linker) szekvenciával. Ezt a fragmentumot szubklónozzuk standard molekulárbiológiai technikákkal [lásd pl. Yang Y. C. és munkatársai: Cell 47, 3-10 (1986)] Xhol-gyel emésztett pXM kifejező plazmidba, így alakítva ki a pY3 plazmidot.
A pY3-at azután baktériumokban amplifikáljuk és átfertőzzük majom COS-1 sejtekbe, ahol a humán gén átíródik és megtörténik az RNS szerkesztése. Az átfertőzött sejtekből származó tápközegek pozitívak az IL3-szerű biológiai aktivitásra vizsgálva, a vizsgálatot a humán csontvelő vizsgálattal és a CML vizsgálattal végezve, amint ezeket a későbbiekben leírjuk. Gibbon cDNS vizsgáló mintával végzett Northem-folt elemzés egy egyedi, 1 kb-s mRNS jelenlétét jelzi, amelyet ezekből a sejtekből kapunk, és amely azonos méretű azzal az RNS-sel, amelyet perifériális vér limfocitákból kapunk, amint ezt később leírjuk. A cDNS-t az mRNS-ből standard eljárásokkal szintetizáljuk és egy kiónt CML aktivitás alapján azonosítjuk. Ebből cDNS-t izolálunk egy új IL-3-szerű növekedési faktorhoz.
3. példa
IL-3-szerű növekedési faktorok kinyerése
Az IL-3-szerű faktor az E. coliban oldhatatlan zárványtestekben termelődik. Abból a célból, hogy a fehérjét ebből oldhatóvá tegyük és kinyerjük, az alábbi munkamenetet követjük. Mintegy 50 mg, fagyasztott sejtmasszában lévő sejtet szuszpendálunk 120 ml 50 mmól/l-es trisz-HCl-t (pH = 7,5), 0,1 mmól/1 ditiotreitolt (DTT) tartalmazó oldatban (A puffer). A sejteket szétzúzzuk francia présen vagy Matin Gaulin szelepen való átengedéssel 6,8x107 Pa vagy nagyobb nyomáson. Ezeket a szétzúzott sejteket ezután centrifugáljuk 20 000 g-nél 30 percen át, hogy a sejttörmeléket, amely a zárványtesteket tartalmazza, üledékbe vigyük.
Az üledéket újra szuszpendáljuk A pufferben lévő 55% szacharóz oldatban, majd francia présen újra átengedjük, újból centrifugáljuk 3000 g-nél 30 percig. Az IL-3-szerű faktort magában foglaló zárványtesteket tartalmazó üledéket újra szuszpendáljuk A pufferben lévő 55%-os szacharózban, és rárétegezzük 60, 65 és 70%-os szacharóz lépcsős gradiensre. A gradienst 150 000 g-nél centrifugáljuk 2 órán át. Az IL-3-szerű
HU 212 518 Β faktort magában foglaló zárványtestek a 65%-os rétegben ülepednek ki, amelyet összegyűjtünk.
Abból a célból, hogy helyreállítsuk és újra hajtogassuk a most mintegy 80% tisztaságú IL-3-szerű faktort, ezeket a zárványtesteket újra szuszpendáljuk 2-3 mg fehérje/ml koncentrációban 8 mól/l-es karbamidoldatban. Ezt a fehéijét tartalmazó karbamid-oldatot hígítjuk olyan oldatul, amely 50 mmól/1 trisz HCl-t (pH = 8,0), 0,1 mmól/1 PMSF-et, 2 mmól/1 DTT-t és 0,1 mmól/I etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) tartalmaz (B puffer), 3 mól/1 karbamid végső koncentrációra (amelyben az IL-3 koncentráció mintegy 1 μg/ml). Egy redukáló/oxidáló puffért, amely 6 mmól/1 redukált gluUtiont és 6 mmól/1 oxidált gluUtiont tartalmaz, adunk a karbamid oldathoz és indukáljuk 20 ‘C hőmérsékleten 2 órán át. A 3 mól/l-es karbamidos oldat B pufferrel szemben egy éjszakán át végzett dializálásával a karbamidot eltávolítjuk. Az IL-3 fehérje oldatot azután centrifugáljuk, hogy eltávolítsunk mindenféle csapadékot. Ennél a stádiumnál az IL-3-szerű faktor már újra van hajtogatva és mintegy 85% tiszUságú.
Az újra hajtogatott IL-3-szerű faktort dializáljuk 50 mmól/1 2-(N-morfolino)-etánszulfonsav puferrel szemben (pH 6,0-nál), amely 0,1 mmól/1 EDTA-t is tartalmaz, azonos puferrel kiegyensúlyozott DEAESepharose oszlopra töltjük. Az IL-3-szerű faktor a DEAE átmenő folyadékjában van mintegy 99% tisztasággal. Ez a lépés eltávolítja az összes pirogén anyagot is. A DEAE átáramló folyadékjából kapott IL-3 pH-ját 5,0-ra állítjuk be 200 mmól/1 nátriumacetát puferrel (pH = 4,0). Az IL-3-szerű faktort szulfonil-propil-Sepharose oszlopra visszük fel, ekkor az IL-3-szerű faktor az SP-Sepharose-hoz kötődik és nátrium-acetát puferrel eluálódik. Ennél a stádiumnál az IL-3-szerű faktor tiszta, és korrektül van hajtogatva. A CML vizsgálatban ennek a humán IL-3-szerű faktornak l-3xl07 CMLegység/mg fajlagos aktivitása van.
4. példa lL-3-szerűpolipeptidek biológiai aktivitásai
Az alábbi vizsgálatokat végezzük el mind a gibbon polipeptidet, mind a humán polipeptidet mint a találmány szerinti főemlős IL-3-szerű polipeptidek új családjának reprezenutív tagjait alkalmazva.
A. CML vizsgálat
A CML vizsgálatot lényegében úgy végezzük el, amint ez a következő irodalmi helyen le van írva: Blood 63, (4), 904-111 (1984). Sejttömeget kapunk subil fázisban lévő CML betegből vett, lefagyasztott perifériás vérből. A vért felengedtetjük és újra fagyasztjuk 500 db, egyenként 15xl06 sejt/cső tartalmú alikvotban. Ezeket a sejteket, amelyeket CML 8-3-nak nevezünk, alkalmazzuk az IL-3-szerű polipeptidek IL3-szerű aktivitásának vizsgálatára. Egy csövet gyorsan felengedtetünk 37 ’C hőmérsékleten egy nappal azelőtt, mielőtt a vizsgálatot elvégezzük. A cső tartalmát azután átvisszük egy 15 ml-es kémcsőbe, és kétszer mossuk RPMI-ben lévő 5% Hi Humán AB Serum-mal (Gibco, RPMI 1640) (HAB/RPMI). A sejteket egy éjszakán át inkubáljuk 5% HAB/RPMI-ben 5% CO2-nél és 37 'C hőmérsékleten. A következő napon a sejteket a tenyészetből eltávolítjuk, Ficollal kezeljük, mossuk, újra számláljuk és félretesszük.
100 μΐ 10%-os HFCS2/RPMI tápközeget (hővel inaktivált szarvasmarha-embrió szérum RPMI tápközegben), amely a vizsgálandó anyagot tartalmazza, egy mikrotitráló lemez egyes üregeibe helyezzük. A fentebb készített sejteket centrifugáljuk és újra szuszpendáljuk l,3-2xl05 sejt/μΐ koncentrációban 10%-os HIFCS/RPMI-ben. 100-100 μΐ sejtet helyezünk az egyes üregekbe és inkubáljuk anti-humán GMCSF antitestek (Genzyme Co. Cambridge, USA, Katalógusszám: LP-714) jelenlétében vagy távollétében 37 ’C hőmérsékleten 5% CO2-ben 48 vagy 72 órán át. Ezután 0,5 μΟ3Η-ύπύόΐηΙ adagolunk üregenként, és 6 órán át inkubáljuk 37 ’C hőmérsékleten. A sejteket GFC típusú C szűrőn (Schleicher and Schuell) nyeljük ki, foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal mossuk és szárítjuk. A szűrőket ezután szcintillációs folyadékba merítjük, és mérjük3H felvételre.
A timidin felvételi mérésre alapozva mind a gibbon IL-3-szerű növekedési faktor, mind a humán IL-3-szerű növekedési faktor aktív ebben a vizsgálatban, stimulálva a leukémiás blaszt sejtek burjánzását.
B. Csontvelő vizsgálat
Humán csontvelő vizsgálatokat végzünk, nem tapadó csontvelősejteket alkalmazva, amint ezt Wong G. G. és munkatársai fentebb idézett munkájukban leírják. Mind a gibbon, mind a humán faktorokhoz tartozó kondicionált tápközeget aktívaknak találtuk ebben a mérésben, amelynek során láthatóan granulocita típusú vonal kis telepeit hoztuk létre. A festett agar tenyészetek morfológiai vizsgálatai alapján keletkeznek makrofág, granulocitamakrofág és eozinofil telepek is. Amikor ezt a vizsgálatot eritropoietin jelenlétében végezzük, a kondicionált tápközegnek azt a képességét mutatjuk be vörösvérsejt telepek termelésével, hogy elősegíti az eritroid progenitor sejtek növekedését. Amikor a GM-CSF-et az IL-3-szerű polipeptiddel a humán csontvelő vizsgálatban hasonlítjuk össze, az IL-3-szerű polipeptid több telep képződését eredményezi, mint a GM-CSF, amikor mindkét polipeptid eritropoietin jelenlétében van. A GM-CSF hatására képződött telepek többsége egyedi vonal, míg a találmány polipeptidje többvonalas telepek képződését segíti elő. Hasonlóképpen a blaszt sejt telepformálási vizsgálatokban az IL-3-szerű polipeptid többszörös vonalak nagyobb számú blaszt-sejt telepeit termeli. A GM-CSF ugyanebben a vizsgálatban csak nagyon kevés szekunder telepet termel.
C. KG-1 sejt vizsgálat
A KG-1 vizsgálatot úgy végezzük, amint ezt G. G. Wong és munkatársai fentebb idézett munkájukban leírták. A találmány szerinti előállított IL-3-szerű faktorok új főemlős családja gibbon IL-3-szerű polipeptidje aktív ebben a vizsgálatban.
HU 212 518 Β
D. További vizsgálatok
Egy antitest-függő, sejt által közvetített citotoxicitási vizsgálatban a találmány szerinti IL-3-szerű polipeptid eozinofileket antitesttel fedett tumor célsejtek elpusztítására stimulál dózis-függő módon. A polipeptid továbbá az eozinofilokat stimulálja szérummal opszonizált sütőélesztő fagocitózisára és az eozinofilok által történő szuperoxid-anion termelés közvetlen stimulálására. Előzetes tanulmányokban, amelyekben a találmány szerinti IL-3-szerű faktorokat infúzióban egészséges majmoknak adjuk be és a fehérvérsejt-számot megszámláljuk, reprodukálható növekedést figyelünk meg mind a vérlemezke-számban, mind az eozinofilok számában. Ezeket az előzetes eredményeket mind a humán, mind a gibbon IL-3-szerű faktoroknál megfigyeljük.
5. példa
IL-3-szerű polipeptid tisztítása COS sejt kondicionált tápközegből
Az alábbi munkamenetet alkalmazzuk, hogy a fent leírt COS sejtekből homogén IL-3-szerű fehéijét kapjunk.
A. Ioncsere
A COS sejttel kondicionált tápközeg (DMEM, 0,5% FBS gördülő palackokban 200 gg/ml összfehéije-koncentrációnál) tartalmazza a humán IL-3-szerű polipeptidet mintegy 2-3 pg/ml koncentrációban. A tápközeget vízzel hígítjuk, amíg a vezetőképesség kisebb lesz, mint 8 mS/cm2. Ioncserélő töltetet (QAE Zeta Prep) kiegyensúlyozunk 4 ’C hőmérsékleten mintegy 500 ml 0,1 mmól/l-es trisz.HCl-lel (pH = 8,0), majd két liter 40 mmól/l-es trisz.HCl-lel (pH = 7,4). A közeget 40 ml/perc sebességgel öntjük fel, és a nem kötött frakciót összegyűjtjük. A töltetet 40 mmól/l-es trisz.HCl-lel mossuk, amíg további aktivitás már nem mosódik ki. Abból a célból, hogy IL-3-szerű fehérje további munkához elegendő mennyiségét megkapjuk, a nem kötött frakciót diaszűrő membránon koncentráljuk (Amicon YM-10).
Nagyobb mennyiségű IL-3-szerű fehérje tisztításához a QAE-Zeta Prep nem kötött frakciót 1 mól/les ecetsavval pH = 4,5 értékre savanyítjuk. A közeget 40 ml/perc sebességgel szulfonil-propil (SP)-Zeta Prep-re öntjük amelyet előzőleg 4 ’C hőmérsékleten mintegy 500 ml 20 mmól/l-es nátrium-acetáttal (pH = 4,5) egyensúlyoztunk ki. A töltetet 20 mmól/l-es nátrium-acetáttal mossuk és a kötött frakciót 20 mmól/1 nátrium-acetátot és 0,25-0,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó oldattal eluáljuk. Ezt a frakciót 1 mól/l-es trisz.HCl-lel (pH = 8,0) semlegesítjük pH = 7,4-re, és Tween-20-at adunk hozzá 0,05% végső koncentrációig·
B. Lencse lektin oszlop
Lencse lektin oszlopot egyensúlyozunk ki 20 mmól/1 trisz.HCl-t (pH = 7,4) és 0,05% Tween-20at tartalmazó oldattal (I. puffer) 4 ’C hőmérsékleten, és az oldatot 1 oszloptérfogat/óra sebességgel öntjük fel. Az oszlopot I. pufferral mossuk, hogy eltávolítsuk a nem fajlagosan kötött fehérjét, majd a kötött fehérjét I.
puffért és 0,2 mól/la-mannopiranozidot tartalmazó oldattal eluáljuk. Az eluciós frakciókat gyűjtjük.
Fordított fázisú HPLC
Az IL-3-szerű polipeptidnek ezt a készítményét fordított fázisú HPLC-nek vetjük alá a szobahőmérsékleten, amint ezt a későbbiekben lettjük. Az IL-3-szerű polipeptid készítményt 100% A pufferral kiegyensúlyozott RP HPLC oszlopra (C4 Vydac) injektáljuk. Az A puffer: 0,1 % trifluor-ecetsav (TEA) vízben, míg a B puffer: 0,1% TFA 95% acetonitrilben. A gradiens 0,2%/perc 45%-tól 70% B pufféiig. Az ebből a gradiensből gyűjtött frakciók a 46,8% B és 47,5% B puffer közötti tartományból valók. Ezeket a frakciókat gyors vákuumbepárlásnak vetjük alá, hogy eltávolítsuk az acetonitrilt Egy második fordított fázisú HPLC lépésben az A puffer 0,15% HFBA vízben és a B puffer 0,15% heptafluorvajsav (HFBA) 95% acetonitrilben. A gradiens B puffer 0,2%/perc 45%-tól 70%-ig. Az ebből a lépésből gyűjtött frakciók a 49% és 51% B puffer közötti tartományból valók. EzaHPLC-ből eluált frakció pirogénmentes.
6. példa
A. SDS gélelektroforézis
Kaufman R. J. és Sharp P. A. eljárását követve [J. Mól. Bioi. 159, 601-621 (1982)] 35S-metionint építünk be metabolikusan a pCSF-MLA-val átfertőzött COS sejtekkel és pY3-mal átfertőzött COS sejtekkel készített polipeptidekbe. Az átfertőzött COS-1 sejtek által kiválasztott jelzett fehérjék SDS poliakrilamid gélelektroforézise (redukáló körülmények) [Laemlli U. K., Natúré 227, 680-685 (1970)] 14 kD és 35 kD közti látszólagos molekulatömeg-tartományt mutat mind a gibbon, mint a humán faktoroknál. Pontosabban a CHO által termelt IL-3szerű faktor esetén a molekulatömeg 21 és 32 kD közti tartományba esik, ami a nagyobb arányú glikozilezésre utal, mint a COS sejt által termelt humán faktor esetén, amely főleg a 21 és 28 kD közti tartományba esik.
A 4. példa tisztítási eljárása utáni ezüst-festéssel két, 21 000 és 25 000 átlag molekulatömegű főbb csík látható közel azonos mennyiségben mindkét faktornál. A két csík közötti különbségeket az N-kötött glikozilezésben mutatkozó különbségeknek tulajdonítjuk.
B. Izoelektromos fokuszálás
Az 5. példa tisztított polipeptidjeinek natív izoelektromos fokuszálása 4 fajtát tár fel mind a gibbon, mind a humán polipeptideknél, amelyek pl értéke a pH = 6,0 és pH = 7,6 közötti tartományban van.
C. Superose 6 gyors fehérje jolyadékkromatográfia (Fást Protein Liquid Chromatography)
A HPLC-ből kapott tisztított frakciót gélszűrő oszlopban (Superose 6) futtatjuk 20 mmól/1 triszt (pH = 7,4), 200 mmól/I NaCI-t és 0,05% Tween-20-at tartalmazó oldatban. Az oszlopon a futtatás egy éles csúcsot tár fel 43 kD molekulatömeggel mindkét faktornál.
D. Fajlagos aktivitás CML vizsgálatban
Egy gibbon IL-3-szerű faktor fajlagos aktivitása a fentebb leírt CML vizsgálatban a 2x106 és IxlO7 hígí14
HU 212518 Β tási egység/mg polipeptid tartományon belülre esik, 8xlO6 hfgítási egység/mg átlaggal. A 3. példában leírt, baktériumok által termelt humán peptidről úgy találjuk, hogy l-3xlO7 hfgítási egység/mg polipeptid fajlagos aktivitással bír. A CHO által termelt humán IL-3-szerű faktornak mintegy 2-2x106 egység/mg fehérje fajlagos aktivitása van ebben a vizsgálatban. A COS által termelt humán IL-3-szerű faktornak mintegy l-2xl07 egység/mg fajlagos aktivitása van. Egy hfgítási egység (vagy CML egység) a faktornak azt a hígításág jelenti, amely a maximális stimulálás felét adja a CML vizsgálatban.
E. N-terminális elemzés
A gibbon polipeptid N-terminális szekvenciájának elemzését automatizált Edman-lebontást alkalmazva végezzük, amely szerint a faktor 98%-os tisztaságú.
E N-glikanáz kezelés
A COS sejtekben termelt humán és gibbon faktorokat N-glikanáz enzimmel kezeljük, amely az N-kapcsolt szénhidrát részeket emészti. Mindegyik faktorról kimutatjuk, hogy tisztítható ezzel az eljárással. Az egyes faktorok 14-35 kD-s elnyúlt, elkent foltjai a gélen egyetlen csíkká redukálódnak, 15 kD-nél a gibbon faktornál és 20,5 kD-nél a humán faktornál.
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (5)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás főemlős IL-3 fehérje előállítására, amely a II. táblázatban ábrázolt szekvenciával vagy alléljeinek szekvenciájával, valamint az alább felsorolt tulajdonságokkal rendelkezik:
    a) 14 és 35 kD közti látszólagos molekulatömeg redukáló SDS poliakrilamid gélelektroforézissel meghatározva;
    b) a CML sejtburjánzás stimulálásának képessége ΙΟΙ 00 pikomólos koncentrációtartományban CML vizsgálatban;
    c) izoelektromos pont pH 6,0 és 7,6 között;
    d) éles csúcs 43 kD-nél gélszűrő oszlopon;
    e) egyetlen csúcs 20,5 kD-nél gélen, N-glikanáz kezelést követően; és
    f) a szennyezések mennyisége legfeljebb 2% Edmanlebomlást alkalmazó N-terminális elemzéssel, azzal jellemezve, hogy a kifejeződést szabályozó szekvenciával operatív kapcsolatban levő, a tárgyi kör szerinti IL-3 fehérjét kódoló DNS szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált gazdasejteket tenyésztünk, és a fehérjét a tenyészközegből vagy a sejtekből kívánt esetben kinyerjük. (Elsőbbsége: 1986.07. 14).
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként emlős sejtvonalat tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1986.08.06.)
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként baktérium sejteket tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1986. 08. 06.)
  4. 4. Eljárás IL-3 fehérjét kódoló cDNS-t magában foglaló transzformált sejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy 5'—» 3' irányban egy,
    a) az I. táblázat szerinti szekvenciát; vagy
    b) a Π. táblázat szerinti szekvenciát; vagy
    c) ezek allél-változatait tartalmazó cDNS szekvenciát és egy ehhez operatívan kapcsolódó, kifejeződést szabályozó szekvenciát tartalmazó vektort baktérium vagy emlős sejtbe transzformálunk. (Elsőbbsége: 1986. 07. 14.)
  5. 5. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított IL-3 fehérjét gyógyászatilag elfogadható hordozóval összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk. (Elsőbbsége: 1986. 08. 06.)
HU874240A 1986-07-14 1987-07-13 Method for producing primate il-3-like hematopoietic growth factors, the cells expressing thereof, and the pharmaceutical compositions containing thereof HU212518B (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US88506086A 1986-07-14 1986-07-14
US89376486A 1986-08-06 1986-08-06
US06/916,335 US4877729A (en) 1986-07-14 1986-10-07 Recombinant DNA encoding novel family of primate hematopoietic growth factors
US07/021,865 US4959455A (en) 1986-07-14 1987-03-04 Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU212518B true HU212518B (en) 1996-07-29

Family

ID=27487045

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU874240A HU212518B (en) 1986-07-14 1987-07-13 Method for producing primate il-3-like hematopoietic growth factors, the cells expressing thereof, and the pharmaceutical compositions containing thereof

Country Status (23)

Country Link
US (1) US5639453A (hu)
EP (2) EP0691403B1 (hu)
JP (2) JP2642942B2 (hu)
KR (1) KR970003518B1 (hu)
CN (1) CN1023901C (hu)
AT (2) ATE133182T1 (hu)
AU (1) AU606881B2 (hu)
CA (1) CA1341489C (hu)
CZ (1) CZ531387A3 (hu)
DE (2) DE3752394D1 (hu)
DK (1) DK173278B1 (hu)
ES (1) ES2007642A6 (hu)
FI (1) FI104903B (hu)
GR (1) GR871029B (hu)
HU (1) HU212518B (hu)
MY (1) MY101578A (hu)
NO (1) NO175825C (hu)
NZ (1) NZ221046A (hu)
OA (1) OA09226A (hu)
PH (1) PH26757A (hu)
PL (1) PL159183B1 (hu)
PT (1) PT85323B (hu)
WO (1) WO1988000598A1 (hu)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0275598B1 (en) * 1986-12-16 1998-01-07 Gist-Brocades N.V. Molecular cloning and expression of human IL-3
IL84852A (en) * 1986-12-16 1994-06-24 Gist Brocades Nv Molecular cloning and expression of human IL-3
US6238889B1 (en) 1986-12-16 2001-05-29 Dsm N.V. Molecular cloning and expression of the Pro8 isoform of human IL-3
OA09736A (en) * 1987-02-18 1993-11-30 Schering Biotech Corp "Human interleukin-3 and muteins thereof".
US5304637A (en) * 1987-07-13 1994-04-19 Gist-Brocades N.V. Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof
GB2210883B (en) * 1987-10-08 1992-01-02 British Bio Technology Synthetic interleukin-3 gene
EP0400015A4 (en) * 1987-12-02 1991-01-16 Tyndale Plains-Hunter, Ltd. Hydrophilic polyurethanes of improved strength
US6384194B1 (en) 1987-12-16 2002-05-07 Dsm N.V. Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof
NZ232913A (en) * 1989-03-15 1992-08-26 Gist Brocades Nv Il-3 produced recombinantly and purified to homogeneity; vectors and pharmaceutical preparations
US5516512A (en) 1989-08-14 1996-05-14 Gist-Brocades, N.V. N- and C-terminal truncation and deletion mutants of human interleukin-3
DK0413383T3 (da) 1989-08-14 1997-07-07 Gist Brocades Nv Mutanter af humant interleukin-3.
US5738849A (en) * 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US6361976B1 (en) 1992-11-24 2002-03-26 S. Christopher Bauer Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF'S for multi-lineage hematopoietic cell production
US6153183A (en) 1992-11-24 2000-11-28 G. D. Searle & Company Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF's or cytokines for multi-lineage hematopoietic cell production
US6403076B1 (en) 1992-11-24 2002-06-11 S. Christopher Bauer Compositions for increasing hematopoiesis with interleukin-3 mutants
ATE251669T1 (de) * 1992-11-24 2003-10-15 Searle & Co Mutierte polypeptide des interleukin-3(il-3)
US5772992A (en) * 1992-11-24 1998-06-30 G.D. Searle & Co. Compositions for co-administration of interleukin-3 mutants and other cytokines and hematopoietic factors
AU675506B2 (en) * 1993-01-15 1997-02-06 Genetics Institute, Llc Cloning of enterokinase and method of use
US6746859B1 (en) 1993-01-15 2004-06-08 Genetics Institute, Llc Cloning of enterokinase and method of use
US5501962A (en) * 1993-06-21 1996-03-26 G. D. Searle & Co. Interleuken-3 (IL-3) human/murine hybrid polypeptides and recombinant production of the same
US6017523A (en) * 1995-06-06 2000-01-25 G.D. Searle & Co. Therapeutic methods employing mutant human interleukin-3 (IL-3) polypeptides
WO2000038705A1 (en) * 1998-12-23 2000-07-06 Korkut Edib M D Ph D Protection of hematopoietic cells by the induction of post-mitotic quiescence
WO2002044410A1 (en) * 2000-11-28 2002-06-06 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Drug target isogenes: polymorphisms in the interleukin 3 (colony-stimulating factor, multiple) gene
JP2007531702A (ja) * 2003-05-09 2007-11-08 キュラジェン コーポレイション 放射線防護におけるｇ５３１３５−０５（ｆｇｆ−２０）の治療的使用
US7597884B2 (en) 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
JP6087506B2 (ja) * 2012-01-31 2017-03-01 キヤノン株式会社 描画方法及び物品の製造方法

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US21865A (en) * 1858-10-19 moeison
US885060A (en) * 1907-04-13 1908-04-21 Alfred Leatherman Ratchet-cylinder pulley.
US893764A (en) * 1907-05-20 1908-07-21 Cable Co Supporting means for swinging parts of musical instruments.
US916335A (en) * 1908-05-08 1909-03-23 Klamath River Gold Mining Co Aerial tramway.
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
IN159327B (hu) * 1982-09-02 1987-05-02 Smidth & Co As F L
JPS5962335A (ja) * 1982-09-30 1984-04-09 Kawasaki Steel Corp グレ−トキルン法によるｅｐダストの予備焼成法
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4588684A (en) 1983-04-26 1986-05-13 Chiron Corporation a-Factor and its processing signals
US4695542A (en) * 1983-10-04 1987-09-22 Dnax Research Institute Of Molecular And Cellular Biology, Inc. cDNA clones coding for polypeptides exhibiting multi-lineage cellular growth factor activity
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
WO1985002863A1 (en) * 1983-12-23 1985-07-04 The Australian National University CLONING OF cDNA AND EXPRESSION OF MURINE-INTERLEUKIN-3
DK518384A (da) 1984-01-31 1985-07-01 Idaho Res Found Vektor til fremstilling af et gen-produkt i insektceller, fremgangsmaade til dens fremstilling samt dens anvendelse
US4658018A (en) * 1984-03-13 1987-04-14 Immunex Corporation Process for producing homogeneous colony stimulating factor
JPS60207594A (ja) * 1984-03-30 1985-10-19 Ajinomoto Co Inc ヒトインタ−ロイキン３の製造方法
JPS60207595A (ja) * 1984-03-30 1985-10-19 Ajinomoto Co Inc ヒトインタ−ロイキン３の製造法
WO1986000639A1 (en) 1984-07-06 1986-01-30 Sandoz Ag Lymphokine production and purification
DE3586386T2 (de) 1984-10-05 1993-01-14 Genentech Inc Dna, zellkulturen und verfahren zur sekretion von heterologen proteinen und periplasmische proteinrueckgewinnung.
JP2525022B2 (ja) 1986-01-03 1996-08-14 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド ▲ＶＩＩＩ▼：ｃ因子型タンパク質の改良生産方法
US4877729A (en) * 1986-07-14 1989-10-31 Genetics Institute, Inc. Recombinant DNA encoding novel family of primate hematopoietic growth factors
IL84852A (en) * 1986-12-16 1994-06-24 Gist Brocades Nv Molecular cloning and expression of human IL-3
EP0275598B1 (en) * 1986-12-16 1998-01-07 Gist-Brocades N.V. Molecular cloning and expression of human IL-3
WO1988005469A1 (en) * 1987-01-20 1988-07-28 Immunex Corporation Human interleukin-3 proteins
OA09736A (en) * 1987-02-18 1993-11-30 Schering Biotech Corp "Human interleukin-3 and muteins thereof".

Also Published As

Publication number Publication date
EP0314705B1 (en) 1996-01-17
ES2007642A6 (es) 1989-07-01
OA09226A (en) 1992-06-30
DK135488A (da) 1988-03-11
EP0314705B2 (en) 2006-08-16
NO175825B (no) 1994-09-05
EP0314705A4 (en) 1990-02-26
NO175825C (no) 1994-12-14
CN87104815A (zh) 1988-07-20
DE3751677T3 (de) 2007-03-15
US5639453A (en) 1997-06-17
CZ531387A3 (en) 1997-10-15
JPH01503298A (ja) 1989-11-09
KR880701737A (ko) 1988-11-04
CA1341489C (en) 2005-08-30
AU7759387A (en) 1988-02-10
PT85323A (en) 1987-08-01
GR871029B (en) 1987-11-02
ATE433487T1 (de) 2009-06-15
WO1988000598A1 (en) 1988-01-28
EP0691403B1 (en) 2009-06-10
PH26757A (en) 1992-09-28
FI890153A (fi) 1989-01-12
AU606881B2 (en) 1991-02-21
JPH07203967A (ja) 1995-08-08
ATE133182T1 (de) 1996-02-15
DK173278B1 (da) 2000-06-05
FI890153A0 (fi) 1989-01-12
MY101578A (en) 1991-12-17
FI104903B (fi) 2000-04-28
KR970003518B1 (ko) 1997-03-18
CN1023901C (zh) 1994-03-02
EP0314705A1 (en) 1989-05-10
PL159183B1 (pl) 1992-11-30
PT85323B (pt) 1990-04-30
JP2655591B2 (ja) 1997-09-24
PL266802A1 (en) 1988-06-09
DE3751677T2 (de) 1996-08-08
EP0691403A1 (en) 1996-01-10
JP2642942B2 (ja) 1997-08-20
DE3751677D1 (de) 1996-02-29
DE3752394D1 (de) 2009-07-23
NZ221046A (en) 1991-02-26
NO881073L (no) 1988-03-10
NO881073D0 (no) 1988-03-10
DK135488D0 (da) 1988-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4959455A (en) Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
HU212518B (en) Method for producing primate il-3-like hematopoietic growth factors, the cells expressing thereof, and the pharmaceutical compositions containing thereof
US4877729A (en) Recombinant DNA encoding novel family of primate hematopoietic growth factors
JP2579981B2 (ja) Ｍ―ｃｓｆの生産方法
US5457038A (en) Natural killer stimulatory factor
US6066317A (en) Method of using IL-11 for treating deficiencies in hematopoietic progenitor or stem cells
AU637620B2 (en) A human cytokine, interleukin-9
US4868119A (en) Hematopoietic growth factors
AU615630B2 (en) Production and use of il-6
US20070104680A1 (en) Antibodies to natural killer stimulatory factor
KR970004941B1 (ko) 신규 영장류 조혈 성장 인자족(family) 발현용 벡터 및 형질전환체
IE70605B1 (en) A novel family of primate hematopoietic growth factors

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: GENETICS INSTITUTE, LLC, US